2 - Fizjologia bakterii

ĆWICZENIE II
DZIAŁANIE ANTYBIOTYKÓW -LAKTAMOWYCH NA BAKTERIE
Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak
Wstęp
Ostatni etap biosyntezy mureiny katalizowany jest przez enzymy, które wiążą penicylinę i
inne antybiotyki -laktamowe. Enzymy te zwane białkami wiążącymi penicylin (ang.
penicillin binding proteins) zlokalizowane są w błonie cytoplazmatycznej wszystkich bakterii
syntetyzujących peptydoglikan, a także u pozbawionych mureiny chlamydii i mikoplazm,
które wrażliwe są na -laktamy.
Poszczególne gatunki bakterii posiadają charakterystyczny wzór białek PBP. Białka te
oznacza się cyframi arabskimi od największego (PBP1) do najmniejszego. Taksonomicznie
pokrewne bakterie mają podobny zestaw PBPs, natomiast białka wiążące penicylinę
pochodzące z niespokrewnionych taksonów, choć mają te same numery, nie muszą pełnić
tych samych funkcji fizjologicznych.
Liczba i rodzaj PBP jest różna u różnych bakterii i wynosi od 3, np. u Chlamydia
trachomatis, do kilkunastu, np. 10 u E. coli czy 16 u tworzącego endospory gramdodatniego
gatunku Bacillus subtilis. Liczba kopii wszystkich białek wiążących penicylinę, zależnie od
gatunku, waha się od kilkuset do kilku tysięcy. Powinowactwo poszczególnych białek PBP do
antybiotyków -laktamowych jest bardzo różne. -laktamy mogą wiązać się selektywnie z
jednym lub kilkoma PBP danego szczepu. Różna jest też rola poszczególnych PBP w
komórce. Niektóre z nich są tzw. celami letalnymi dla -laktamów, inne zaś mogą być
inaktywowane (np. przez delecję genu strukturalnego czy selektywne zablokowanie przez
określony antybiotyk -laktamowy) bez widocznych zmian fenotypowych. Co najmniej jedno
z PBP jest niezbędne do wzrostu bakterii.
Białka wiążące penicylinę odgrywają istotną rolę w procesach fizjologicznych,
związanych zarówno ze wzrostem komórki bakteryjnej, jej podziałem, jak i ze zmianą jej
wrażliwości na antybiotyki -laktamowe. Wszystkie dotychczas scharakteryzowane mają
aktywność DD-peptydaz. Enzymy zaliczane do PBP o aktywności DD-peptydaz zostały
podzielone na dwie główne grupy: wielkocząsteczkowe PBP (ang. hmw PBP) i
drobnocząsteczkowe PBP (ang. lmw PBP).
Wielkocząsteczkowe białka PBP klasy A (np. u E. coli są to PBP1A, PBP1B i PBP1C) i B
(E. coli: PBP2 i PBP3) są głównymi enzymami odpowiedzialnymi za syntezę peptydoglikanu.
Posiadając bowiem aktywność transpeptydazy i/lub transglikozylazy, katalizują zarówno
reakcję włączania prekursora do istniejącej mureiny, powodując tym samym wydłużanie
łańcucha cukrowego, jak i wytwarzanie wiązań peptydowych pomiędzy peptydami sąsiednich
łańcuchów cukrowych. Enzymy te odgrywają więc kluczową rolę we wzroście komórki
bakteryjnej, determinowaniu jej prawidłowego kształtu, a także formowaniu septy i podziale
komórkowym.
U E. coli brak któregokolwiek z białek tej klasy tzn. albo PBP1A, albo PBP1B lub
PBP1C, nie wpływa na przeżywalność tej bakterii. Jednak, pomimo tego, że wszystkie te
białka mają domenę transglikozylazy i transpeptydazy, to obecność albo PBP1A albo PBP1B
jest absolutnie niezbędna do zainicjowania i kontynuowania wydłużania łańcucha cukrowego,
a także tworzenia wiązań peptydowych. Inaktywacja genów kodujących PBP1A i PBP1B jest
mutacją letalną dla komórki, bowiem białko PBP1C samo nie jest w stanie zrekompensować
utraty tych dwóch białek.
W komórkach E. coli, w wyniku zablokowania aktywności enzymatycznej PBP2 przez
selektywnie wiążący się z tym białkiem antybiotyk -laktamowy następuje zahamowanie
procesu elongacji, co objawia się zmianą kształtu komórki z pałeczki w formę kulistą. Białko
to odgrywa bowiem zasadniczą rolę w syntezie mureiny tworzącej cylindryczną część
komórki tzw. mureinę elongacyjną. PBP2 zlokalizowane jest w tej części komórki, chociaż
znajdowane jest również w tworzonej przegrodzie podziałowej. Jednak bezpośrednio po
podziale jest ono usuwane z biegunów komórek, które powstały w wyniku podziału. Inny laktam wybiórczo acyluje PBP3 E. coli. Inaktywacja tego białka prowadzi z kolei do
zahamowania podziału komórek. W wyniku tego komórki rosną w postaci długich
filamentów. Filamentacja świadczy o uczestnictwie tego enzymu w syntezie mureiny
tworzącej przegrodę (septę) w dzielących się komórkach Białko to znajduje się wyłącznie w
przegrodzie, a po podziale na biegunach komórki.
Drobnocząsteczkowe białka PBP nie uczestniczą w syntezie mureiny, ale modyfikują ją,
ponieważ determinują długość łańcuchów peptydowych. Od ich aktywności zależy bowiem,
ile peptydów w prekursorze będzie pełnić funkcje akceptorowe w reakcji transpeptydacji, a
tym samym jaki będzie stopień usieciowania mureiny. Regulując stopień usieciowania mogą
powodować zmiany kształtu komórek.
1. Celem ćwiczenia jest badanie wpływu wybranych antybiotyków -laktamowych na
wzrost i morfologię komórek E. coli.
1. Hodowla E. coli w podłożu LB (faza stacjonarna i logarytmiczna – OD600 0.4-0.5).
2. Pobrać po 20 ml odpowiedniej hodowli (czas t0) i dodać następujące antybiotyki:
Antybiotyk
Penicylina G
Mecylinam
Imipenem
Stężenie
wyjściowe
1 mg/ml
150 µg/ml
1 mg/ml
Stężenie w
hodowli
20 µg/ml
3 g/ml
20 g/ml
Morfologia komórek
3. Hodowle prowadzić w 37 oC z wytrząsaniem.
4. Prowadzić obserwacje morfologii komórek w mikroskopie kontrastowo-fazowym
(hodowle inkubowane z penicyliną i mecylinamem) i mierzyć gęstość optyczną hodowli
przy długości fali 600 nm (hodowle inkubowane z imipenemem).
5. Na podstawie przeprowadzonych obserwacji określić wpływ różnych antybiotyków laktamowych na wzrost i przeżywalność E. coli w hodowli w fazie wzrostu
logarytmicznego i stacjonarnego.
Literatura
1. Wykłady „Fizjologia bakterii” prowadzone przez dr Dorotę Korsak i dr hab.
Magdalenę Popowską.
2. Biologia molekularna bakterii, 2006. Baj, J., Z. Markiewicz (red), Wydawnictwo
Naukowe PWN, Warszawa.
3. Brock, Microbiology of microorganisms, 2006. Madigan, M.T, J.M. Martinko (red),
Eleventh Edition, Pearson Education International.
2. Wykorzystanie metod molekularnych w wyrywaniu oporności bakterii
2.1 Molekularne mechanizmy oporności szczepów Campylobacter jejuni/coli na
fluorochinolony i tetracykliny
Mechanizm oporności bakterii z rodzaju Campylobacter (C. jejuni i C. coli) na
fluorochinolony związany jest głównie pojawieniem się mutacji chromosomowych w genie
gyrA kodującym podjednostkę A topoizomerazy II – gyrazy. Mutacje punktowe w genie gyrA
zmieniają sekwencję nukleotydową, co prowadzi do modyfikacji miejsca, które są celem
działania dla fluorochinolonów. Prowadzi to zmniejszenia powinowactwa enzymu do tych
chemioterapeutyków. Najczęstszą mutacją punktową w genie gyrA spotykaną wśród
szczepów Campyloabcter opornych na fluorochinolony jest zamiana kodonu ACA
(kodującego treoninę) na ATA (kodującego izoleucynę ) w pozycji 86. Techniką stosowaną
do identyfikacji tej mutacji jest metoda MAMA PCR (ang. mismatch amplification mutation
assay PCR). Jest to reakcja amplifikacji ze starterami o zmodyfikowanej sekwencji. Startery
są komplementarne do zmienionej sekwencji w DNA.
Oporność na tetracykliny szczepów Campylobacter związana jest z obecnością genu tet(O).
Gen ten koduje białko chroniące rybosom przed działaniem antybiotyku.
Materiały
DNA genomowy szczepów C. coli i C. jejuni
Startery
Mutacja Thr 86 w genie gyr A dla C. jejuni;
gyrA1 5- TTT TTA GCA AAG ATT CTG AT-3
gyrA2 5- CAA AGC ATC ATA AAC TGC AA-3
Mutacja Thr 86 w genie gyr A dla C. coli
gyrA3 5- TAT GAG CGT TAT TAT CGG TC -3
gyrA4 5-TAA GGC ATC GTA AAC AGC CA-3
Obecność genu tet(O)
TET1 5- GGC GTT TTG TTT ATG TGC G-3
TET2 5-ATG GAC AAC CCG ACA GAA GC-3
2.1.1 Oporność na fluorochinolony
Wykrywanie mutacji w genie kodującym podjednostkę A gyrazy
Skład mieszaniny reakcyjnej (20 µl)
PCR mix *
10 µl
starter A1 (lub A3) (stężenie wyjściowe 10 µM)
1 µl
starter A2 (lub A4) (stężenie wyjściowe 10 µM)
1 µl
DNA matrycowe
2 µl
woda
6 µl
PCR mix * (Taq DNA polimeraza - 0.1 U/ul; MgCl2 - 4 mM; dNTPs- 0.5 mM każdego z
dNTP; czerwony barwnik i bufor obciążający).
Warunki reakcji - 35 cykli
94oC – 5 min
94oC – 1 min
48oC – 1 min
72oC – 1 min
72oC – 7 min; 4oC - 
2.1.2 Oporność na tetracykliny
Wykrywanie genu tet(O)
Skład mieszaniny reakcyjnej taki jak w pkt. 2.1.1. Startery: TET1 i TET2
Warunki reakcji jak wyżej – jedyna zmiana to temperatura przyłączania starterów (Tm ) 57 oC
Probówki umieścić w termocyklerze
1. Przeprowadzić reakcję PCR.
2. Po zakończeniu reakcji produkty amplifikacji rozdzielić w 1% żelu agarozowym w buforze
TAE przez 50 min przy napięciu 120 V. Na żel agarozowy nanieść po 10 l odpowiedniej
próby. Po zakończeniu rozdziału żel wybarwić w wodnym roztworze bromku etydyny przez
10–15 min i oglądać UV.
3. Określić, czy badany szczep jest oporny na fluorochinolony i/lub tetracykliny.