ĆWICZENIE II DZIAŁANIE ANTYBIOTYKÓW β
advertisement
ĆWICZENIE II DZIAŁANIE ANTYBIOTYKÓW -LAKTAMOWYCH NA BAKTERIE Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak Wstęp Ostatni etap biosyntezy mureiny katalizowany jest przez enzymy, które wiążą penicylinę i inne antybiotyki -laktamowe. Enzymy te zwane białkami wiążącymi penicylin (ang. penicillin binding proteins) zlokalizowane są w błonie cytoplazmatycznej wszystkich bakterii syntetyzujących peptydoglikan, a także u pozbawionych mureiny chlamydii i mikoplazm, które wrażliwe są na -laktamy. Poszczególne gatunki bakterii posiadają charakterystyczny wzór białek PBP. Białka te oznacza się cyframi arabskimi od największego (PBP1) do najmniejszego. Taksonomicznie pokrewne bakterie mają podobny zestaw PBPs, natomiast białka wiążące penicylinę pochodzące z niespokrewnionych taksonów, choć mają te same numery, nie muszą pełnić tych samych funkcji fizjologicznych. Liczba i rodzaj PBP jest różna u różnych bakterii i wynosi od 3, np. u Chlamydia trachomatis, do kilkunastu, np. 10 u E. coli czy 16 u tworzącego endospory gramdodatniego gatunku Bacillus subtilis. Liczba kopii wszystkich białek wiążących penicylinę, zależnie od gatunku, waha się od kilkuset do kilku tysięcy. Powinowactwo poszczególnych białek PBP do antybiotyków -laktamowych jest bardzo różne. -laktamy mogą wiązać się selektywnie z jednym lub kilkoma PBP danego szczepu. Różna jest też rola poszczególnych PBP w komórce. Niektóre z nich są tzw. celami letalnymi dla -laktamów, inne zaś mogą być inaktywowane (np. przez delecję genu strukturalnego czy selektywne zablokowanie przez określony antybiotyk -laktamowy) bez widocznych zmian fenotypowych. Co najmniej jedno z PBP jest niezbędne do wzrostu bakterii. Białka wiążące penicylinę odgrywają istotną rolę w procesach fizjologicznych, związanych zarówno ze wzrostem komórki bakteryjnej, jej podziałem, jak i ze zmianą jej wrażliwości na antybiotyki -laktamowe. Wszystkie dotychczas scharakteryzowane mają aktywność DD-peptydaz. Enzymy zaliczane do PBP o aktywności DD-peptydaz zostały podzielone na dwie główne grupy: wielkocząsteczkowe PBP (ang. hmw PBP) i drobnocząsteczkowe PBP (ang. lmw PBP). Wielkocząsteczkowe białka PBP klasy A (np. u E. coli są to PBP1A, PBP1B i PBP1C) i B (E. coli: PBP2 i PBP3) są głównymi enzymami odpowiedzialnymi za syntezę peptydoglikanu. Posiadając bowiem aktywność transpeptydazy i/lub transglikozylazy, katalizują zarówno reakcję włączania prekursora do istniejącej mureiny, powodując tym samym wydłużanie łańcucha cukrowego, jak i wytwarzanie wiązań peptydowych pomiędzy peptydami sąsiednich łańcuchów cukrowych. Enzymy te odgrywają więc kluczową rolę we wzroście komórki bakteryjnej, determinowaniu jej prawidłowego kształtu, a także formowaniu septy i podziale komórkowym. U E. coli brak któregokolwiek z białek tej klasy tzn. albo PBP1A, albo PBP1B lub PBP1C, nie wpływa na przeżywalność tej bakterii. Jednak, pomimo tego, że wszystkie te białka mają domenę transglikozylazy i transpeptydazy, to obecność albo PBP1A albo PBP1B jest absolutnie niezbędna do zainicjowania i kontynuowania wydłużania łańcucha cukrowego, a także tworzenia wiązań peptydowych. Inaktywacja genów kodujących PBP1A i PBP1B jest mutacją letalną dla komórki, bowiem białko PBP1C samo nie jest w stanie zrekompensować utraty tych dwóch białek. W komórkach E. coli, w wyniku zablokowania aktywności enzymatycznej PBP2 przez selektywnie wiążący się z tym białkiem antybiotyk -laktamowy następuje zahamowanie procesu elongacji, co objawia się zmianą kształtu komórki z pałeczki w formę kulistą. Białko to odgrywa bowiem zasadniczą rolę w syntezie mureiny tworzącej cylindryczną część komórki tzw. mureinę elongacyjną. PBP2 zlokalizowane jest w tej części komórki, chociaż znajdowane jest również w tworzonej przegrodzie podziałowej. Jednak bezpośrednio po podziale jest ono usuwane z biegunów komórek, które powstały w wyniku podziału. Inny laktam wybiórczo acyluje PBP3 E. coli. Inaktywacja tego białka prowadzi z kolei do zahamowania podziału komórek. W wyniku tego komórki rosną w postaci długich filamentów. Filamentacja świadczy o uczestnictwie tego enzymu w syntezie mureiny tworzącej przegrodę (septę) w dzielących się komórkach Białko to znajduje się wyłącznie w przegrodzie, a po podziale na biegunach komórki. Drobnocząsteczkowe białka PBP nie uczestniczą w syntezie mureiny, ale modyfikują ją, ponieważ determinują długość łańcuchów peptydowych. Od ich aktywności zależy bowiem, ile peptydów w prekursorze będzie pełnić funkcje akceptorowe w reakcji transpeptydacji, a tym samym jaki będzie stopień usieciowania mureiny. Regulując stopień usieciowania mogą powodować zmiany kształtu komórek. Celem ćwiczenia jest badanie wpływu wybranych antybiotyków -laktamowych na wzrost i morfologię komórek E. coli. 1. Hodowla E. coli w podłożu LB (faza stacjonarna i logarytmiczna – OD600 0,2). 2. Pobrać po 20 ml odpowiedniej hodowli (czas t 0) i dodać następujące antybiotyki: Antybiotyk Penicylina G Mecylinam Cefalorydyna Stężenie wyjściowe 1 mg/ml 150 µg/ml 10 mg/ml Stężenie w hodowli 20 µg/ml 3 g/ml 200 g/ml Morfologia komórek 3. Hodowle prowadzić w 37 oC z wytrząsaniem. 4. Prowadzić obserwacje morfologii komórek w mikroskopie kontrastowo-fazowym (hodowle inkubowane z penicyliną i mecylinamem) i mierzyć gęstość optyczną hodowli przy długości fali 600 nm (hodowle inkubowane z cefalorydyną). 5. Na podstawie przeprowadzonych obserwacji określić wpływ różnych antybiotyków laktamowych na wzrost i przeżywalność E. coli w hodowli w fazie wzrostu logarytmicznego i stacjonarnego. Literatura 1. Wykłady „Fizjologia bakterii” prowadzone przez dr Dorotę Korsak i dr Magdalenę Popowską. 2. Biologia molekularna bakterii, 2006. Baj, J., Z. Markiewicz (red), Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. 3. Brock, Microbiology of microorganisms, 2006. Madigan, M.T, J.M. Martinko (red), Eleventh Edition, Pearson Education International.
