Analiza odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego w
advertisement
DOKTORATY, HABILITACJE / DOCTORS THESES, PROFESSORS THESES 185 Analiza odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego w zastosowaniu klinicznym do oceny inwazyjności i progresji raka płaskonabłonkowego krtani Analysis of cellular immune response in clinical use to assess the invasiveness and progression of squamous cell carcinoma of the larynx Katarzyna Starska Streszczenie rozprawy na stopień doktora habilitowanego nauk medycznych nadanego przez Radę Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi w dniu 05.01.2010 r. Recenzenci: Prof. dr hab. Prof. dr hab. Prof. dr hab. Prof. dr hab. n. n. n. n. med. med. med. med. Ewa Brzezińska-Błaszczyk Wiesław Gołąbek h.c. Andrzej Obrębowski Eugeniusz Olszewski Hasła indeksowe: rak płaskonabłonkowy krtani, subpopulacjach limfocytów T CD4+ i CD8+, receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), cytokiny prozapalne i regulatorowe Key words: squamous cell carcinoma of the larynx, T lymphocyte subpopulations CD4+ and CD8+, epidermal growth factor receptor (EGFR), proinfl ammatory and ©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi Otrzymano/Received: 20.03.2010 Zaakceptowano do druku/Accepted: 25.03.2010 I Katedra i Klinika Otolaryngologii i Laryngologii Onkologicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. n. med. T. Durko Konflikt interesu/Conflicts of interest: Autor pracy nie zgłasza konfliktu interesów. Adres do korespondencji/ Address for correspondence: imię i nazwisko: Katarzyna Starska adres pocztowy: I Katedra i Klinika Otolaryngologii i Laryngologii Onkologicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi ul. Kopcińskiego 22, 90-153 Łódź tel./fax 42 678 57 85 e-mail [email protected] regulatory cytokines Rola komórek układu odpornościowego w przebiegu choroby nowotworowej nie jest do końca wyjaśniona. Mimo braku bezpośrednich dowodów na to, iż komórki nadzoru immunologicznego chronią przed rozwojem choroby nowotworowej, pośrednie obserwacje kliniczne oraz najnowsze badania doświadczalne wskazują na ich aktywność w odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko komórkom nowotworowym różnego pochodzenia. Istnieje jednak, wiele dowodów na upośledzenie mechanizmów obrony immunologicznej u chorych z nowotworami, w tym głównie z nowotworami regionu głowy i szyi, co ma podstawowe znaczenie w ocenie przebiegu klinicznego choroby i wyborze optymalnego modelu leczenia. Niewystarczający stan wiedzy dotyczący współzależności parametrów komórkowej odpowiedzi immunologicznej, tj. wydzielanych przez komórki biorące udział w procesach odpornościowych cytokin prozapalnych i immunoregulatorowych, ekspresji markerów pobudzenia wczesnego i późnego na subpopulacjach limfocytów T CD4 + i CD8+, wpływu komórek nowotworowych na modulowanie funkcji komórek układu odpornościowego, aktywności receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) oraz związków z cechami kliniczno-morfologicznymi, jak również brak wyczerpujących danych i jednoznacznych odpowiedzi w dostępnym piśmiennictwie z zakresu immunobiologii raków regionu głowy i szyi, w szczególności Otolar yngologia Polska tom 6 4, nr 3, maj-c zer wiec 2010 raka płaskonabłonkowego krtani, przyczyniły się do wyboru proponowanych badań nad zjawiskami odpowiedzi immunologicznej w przebiegu choroby nowotworowej. Celem pracy było poznanie i uzupełnienie wiedzy dotyczącej mechanizmów regulacji miejscowej odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego w raku płaskonabłonkowym krtani, w układzie doświadczalnym: komórka nowotworowa <—> autologiczne komórki biorące udział w procesach odpornościowych, oraz wskazanie parametrów komórkowej odpowiedzi immunologicznej, które mogłyby mieć kliniczne zastosowanie jako potencjalne biomarkery fenotypu większej agresywności guza nowotworowego i tym samym byłyby pomocne dla wdrożenia właściwych metod postępowania leczniczego oraz umożliwiłyby prognozowanie przebiegu choroby nowotworowej, ze szczególnym uwzględnieniem przypadków raków krtani w wysokim stadium zaawansowania klinicznego. Analizą retrospektywno-prospektywną objęto grupę 106 badanych, w tym grupę 55 chorych ze zweryfikowanym rakiem płaskonabłonkowym krtani, leczonych chirurgicznie w Klinice Laryngologii Onkologicznej, I Katedry Laryngologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, w latach 2003-2007. W celu uzyskania poszukiwanych informacji badania przeprowadzono w dwóch etapach: Otolaryngol Pol 2010; 64 (3): 185-187 186 DOKTORATY, HABILITACJE / DOCTORS THESES, PROFESSORS THESES I. Część doświadczalna pracy, w której wykonano badania doświadczalne w warunkach in vitro na materiale biologicznym od chorych na raka płaskonabłonkowego krtani, II. Część kliniczna badań, dotycząca analizy zależności obserwowanych zjawisk immunologicznych z cechami kliniczno-morfologicznymi guza nowotworowego, odnosząca się do praktycznego zastosowania wyników badań w ocenie zaawansowania i agresywności procesu nowotworowego w konkretnych przypadkach raka krtani. Materiałem biologicznym były izolowane komórki nabłonkowe z frontu nacieku nowotworowego (z obwodowej części nacieku nowotworowego raka płaskonabłonkowego krtani: TMC – tumor marginal cells) położonego przy granicy niezmienionych nowotworowo, w śródoperacyjnej ocenie makroskopowej, tkanek i izolowane komórki nabłonkowe niezmienionej nowotworowo błony śluzowej krtani (z najbardziej dystalnej, w stosunku do guza, prawidłowej błony śluzowej krtani: NCC – non-cancerous cells, jako kontrolę dla układów badawczych z użyciem komórek nowotworowych) oraz próbki krwi pełnej. Czystość hodowli komórek nabłonkowych w zawiesinie komórkowej oceniono z zastosowaniem obiektywnej immunomorfologicznej metody (oznaczono ekspresję filamentów cytokeratynowych metodą immunohistochemiczną IHC z zastosowaniem panelu poliklonalnych przeciwciał przeciw pośrednim filamentom cytokeratynowym). Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Wszyscy uczestnicy badań osobiście wyrazili świadomą pisemną zgodę na udział w badaniu. Badania przeprowadzono w ramach projektu Komitetu Badań Naukowych nr 3 P05C 017 25 i N403 04332/2326. W proponowanych badaniach przeprowadzono ocenę: 1. Bezpośredniego oddziaływania izolowanych z frontu guza komórek nowotworowych raka płaskonabłonkowego krtani na funkcję komórek krwi obwodowej, biorących udział w procesach odpornościowych tj. modyfikację ich profilu cytokinowego prozapalnego i immunoregulatorowego (IL-6, IL-8, TNF, IFN-γ, IL-10) oraz modyfikację ekspresji markerów pobudzenia na subpopulacjach limfocytów T CD4+ i CD8+: antygenów aktywacji wczesnej (CD3/CD69, CD3/CD71) oraz późnej (CD3/CD25, CD3/CD26, CD3/HLA/DR), w badaniach doświadczalnych prowadzonych w układach autologicznych, co pozwoliło na wykazanie istniejących międzykomórkowych interakcji, przy jednoczesnym wykluczeniu oddziaływań wynikających z różnic w obrębie głównego układu zgodności tkankowej. 2. Współzależności parametrów komórkowej odpowiedzi immunologicznej tj. wpływu cytokin prozapalnych i regulatorowych wydzielanych przez komórki krwi obwodowej, biorące udział z procesach odpornościowych, na modyfikację ekspresji markerów pobudzenia na subpopulacjach limfocytów T CD4 + i CD8+, 3. Związków między cechami kliniczno-morfologicznymi w raku płaskonabłonkowym krtani a profilem cytokinowym prozapalnym i regulatorowym oraz ekspresją markerów pobudzenia na subpopulacjach limfocytów T CD4+ i CD8+, dla oceny praktycznego zastosowania wyników badań w ocenie zaawansowania i agresywności procesu nowotworowego. 4. Wpływu wybranych cytokin prozapalnych na modyfikację ekspresji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) oraz związków między immunoekspresją EGFR (uwzględniając odczyn IHC błonowy EGFR-m i odczyn IHC cytoplazmatyczny EGFR-c) a cechami kliniczno-morfologicznymi guza, dla oceny wykorzystania wyników przeprowadzonej analizy w klinicznej ocenie stopnia rozległości zmian nowotworowych i zaawansowania procesu nowotworowego. Zgodnie z przyjętymi założeniami pracy, w części doświadczalnej badań, w celu określenia wpływu komórek raka płaskonabłonkowego krtani na wydzielanie cytokin przez komórki układu odpornościowego oraz ekspresję markerów pobudzenia wczesnego i późnego na subpopulacjach limfocytów T CD4 + i CD8+ prowadzono 21- i 72-godzinne hodowle mieszane w następujących układach komórkowych: krew pełna, izolowane autologiczne komórki nowotworowe części obwodowej guza (TMC), izolowane komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka (NCC), krew pełna + autologiczne komórki nowotworowe części obwodowej guza (WBTMC – mixed whole blood and tumor marginal cells), krew pełna + autologiczne komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka (WBNCC – mixed whole blood and non-cancerous cells). Przeprowadzono także badania doświadczalne w podłożu hodowlanym z dodatkiem fitohemaglutyniny PHA, jako układy porównawcze po stymulacji mitogenem: krew pełna + autologiczne komórki nowotworowe części obwodowej guza, w obecności PHA (WBTMC PHA), krew pełna + autologiczne komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka, w obecności PHA (WBNCC PHA). Stężenia cytokin w nadsączach z hodowli pierwotnych oznaczono metodą immunoenzymatyczną ELISA. Ekspresję antygenów aktywacji na limfocytach T CD4+ i CD8+ określono z zastosowaniem analizy cytofluorymetrycznej. Analizę ekspresji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) w utkaniu raka płaskonabłonkowego krtani wykonano metodą immunohistochemiczną IHC, uwzględniając odczyn błonowy (EGFR-m) i cytoplazmatyczny (EGFR-c). Porównano także średnie wartości stężeń wydzielanych cytokin prozapalnych i regulatorowych oraz ekspresję badanych antygenów aktywacji wczesnej i późnej na limfocytach T CD4+ i CD8+ w grupie badanej i kontrolnej, w określonym czasie inkubacji. Otolar yngologia Polska tom 6 4, nr 3, maj-c zer wiec 2010 DOKTORATY, HABILITACJE / DOCTORS THESES, PROFESSORS THESES Najbardziej istotnym, z punktu widzenia klinicznego, elementem pracy było zestawienie uzyskanych wyników badań przeprowadzonych w warunkach in vitro ze szczegółową analizą kliniczno-histopatologiczną i immunohistochemiczną materiału biologicznego pochodzącego od chorych z rakiem płaskonabłonkowym krtani, w aspekcie praktycznego wykorzystania wyników przeprowadzonych badań w określaniu zaawansowania i agresywności procesu nowotworowego w konkretnych przypadkach raka płaskonabłonkowego krtani. W części klinicznej badań, rezultaty analizy obserwowanych zjawisk immunologicznych zestawiono z cechami kliniczno-morfologicznymi guza nowotworowego, tj. klasyfikacją pTNM, stopniem złośliwości histopatologicznej nowotworu G, oceną morfologiczną frontu nacieku nowotworowego według kryteriów klasyfikacji TFG – Tumor front grading oraz z wynikami immunohistochemicznymi (ekspresja EGFR). W przeprowadzonych badaniach oceniano 6 wykładników opisujących cechy histopatologiczne frontu utkania nowotworowego (zróżnicowanie komórkowe, polimorfizm jąder, liczbę figur podziału) oraz rodzaj reakcji guz – tkanki otaczające (sposób inwazji, głębokość naciekania, obecność nacieku limfoidalnego). Ocena guza została przedstawiona jako suma uzyskanych punktów (każda cecha oceniana w skali od 1 do 4 punktów) z minimalną liczbą 6 punktów i maksymalną liczbą 24 punktów. W dalszej analizie histopatologicznej zastosowano podział badanych raków krtani na 4 podgrupy, w zależności od uzyskanej sumarycznej liczby punktów TFG: 6–9 punktów, 10–13 punktów, 14–17 punktów, 18–21 punktów i >22 punktów. Analiza wybranych parametrów komórkowej odpowiedzi immunologicznej potwierdziła bezpośrednie oddziaływanie komórek nowotworowych raka płaskonabłonkowego krtani na funkcję autologicznych komórek krwi obwodowej biorących udział w procesach odpornościowych oraz znaczenie wzajemnych interakcji międzykomórkowych w regulacji mechanizmów odpowiedzi immunologicznej na antygeny nowotworu. Wyniki oceny profilu cytokinowego prozapalnego i ekspresji markerów pobudzenia na limfocytach T CD4 + i CD8+ oraz rezultaty badań przeprowadzonych w warunkach in vitro w mieszanych układach doświadczalnych z wykorzystaniem izolowanych komórek nowotworowych i komórek nabłonka prawidłowego krtani dowiodły występowania złożonych zaburzeń mechanizmów regulacyjnych odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego oraz zmniejszenia aktywności autologicznych komórek układu odpornościowego w odpowiedzi na antygeny guza nowotworowego, w przebiegu raka płaskonabłonkowego krtani. Analiza związków między cechami kliniczno-morfologicznymi w raku krtani a wybranymi parametrami komórkowej odpowiedzi immunologicznej oraz immuOtolar yngologia Polska tom 6 4, nr 3, maj-c zer wiec 2010 noekspresją receptora naskórkowego czynnika wzrostu EGFR w utkaniu guza nowotworowego wykazała występowanie następujących zależności: 1. Zmniejszony poziom IL-6 i IFN-γ oraz zwiększone stężenie IL-10 we krwi pełnej u chorych z rakiem płaskonabłonkowym krtani był wskaźnikiem większego zaawansowania zmian nowotworowych, ocenionych na podstawie cechy pT, sumy punktów klasyfikacji TFG (tumor front grading) oraz głębokości inwazji nowotworowej, tj. w guzach nowotworowych pT4, które uzyskały w ocenie morfologicznej 18–21 punktów, według kryteriów klasyfikacji TFG oraz charakteryzujących się naciekaniem chrząstki krtani, stwierdzono znamiennie najniższe wydzielanie IL-6 i IFN-γ oraz najwyższą produkcję IL-10 przez autologiczne komórki biorące udział w procesach odpornościowych. 2. Zwiększona ekspresja antygenów aktywacji wczesnej: CD4/CD69, CD8/CD69, CD4/CD71, CD8/ CD71 i markerów pobudzenia późnego CD4/HLA/ DR na subpopulacjach limfocytów T krwi obwodowej u chorych z rakiem płaskonabłonkowym krtani była wskaźnikiem większego zaawansowania zmian nowotworowych ocenionych na podstawie cechy pT oraz sumy punktów klasyfikacji TFG, tj. guzy nowotworowe w wysokim stadium zaawansowania pT3 i pT4 charakteryzowały się wyższymi wartościami średniej ekspresji badanych antygenów aktywacji na subpopulacjach limfocytów T CD4 + i CD8+, jednocześnie dla mniej zaawansowanych raków krtani, które uzyskały w ocenie morfologicznej 6–9 punktów, według kryteriów klasyfikacji TFG, stwierdzono znamiennie najwyższe wydzielanie IL-6 i IFN-γ przez autologiczne komórki współuczestniczące w reakcjach immunologicznych. 3. Nasilony pozytywny odczyn błonowy dla EGFR (EGFR-m) w komórkach raka płaskonabłonkowego krtani był wskaźnikiem wyższego stopnia rozległości miejscowej guza nowotworowego pT (pT3 i pT4), drobnoogniskowego sposobu naciekania oraz rozproszonego nacieku limfoidalnego w utkaniu nowotworowym. 4. Nasilony pozytywny odczyn cytoplazmatyczny dla EGFR (EGFR-c) w komórkach raka płaskonabłonkowego krtani był wskaźnikiem mniejszego stopnia zaawansowania zmian morfologicznych, określonych według klasyfikacji TFG, w grupie guzów pT3 i pT4 oraz wyższego polimorfizmu jądrowego. Wyniki przeprowadzonej analizy wybranych parametrów komórkowej odpowiedzi immunologicznej oraz immunoekspresji receptora naskórkowego czynnika wzrostu EGFR w utkaniu guza nowotworowego wykazały możliwość ich praktycznego wykorzystania, jako istotnej metody w monitorowaniu przebiegu choroby nowotworowej tj. określaniu stopnia zaawansowania kliniczno-morfologicznego zmian, wyborze optymalnego modelu leczenia i pośrednio prognozowaniu w raku płaskonabłonkowym krtani. 187
