Analiza utraty heterozygotycznosci w regionach wystepowania
advertisement
DOKTORATY, HABILITACJE / DOCTORS THESES, PROFESSORS THESES 55 Analiza utraty heterozygotyczności w regionach występowania przeciwnowotworowych genów supresorowych w raku krtani Loss of heterozygosity analysis in the regions harboring anticancer tumor suppressor genes in laryngeal cancer Katarzyna Kiwerska Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej Poznań, 21.12.2009 Instytut Genetyki Człowieka PAN w Poznaniu Promotor: Recenzenci: Prof. dr hab. Krzysztof Szyfter (IGCz PAN Poznań) Prof. dr hab. Maria Małgorzata Sąsiadek (UM Wrocław) Dr hab. Kamal Morshed (UM Lublin) ©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi Otrzymano/Received: 10.01.2010 Zaakceptowano do druku/Accepted: 02.02.2010 Konflikt interesu/Conflicts of interest: Autor pracy nie zgłasza konfliktu interesów. Hasła indeksowe: płaskonabłonkowy rak krtani, wznowa miejscowa, utrata heterozygotyczności, geny supresorowe Płaskonabłonkowy rak krtani stanowi ogromny problem medyczno-społeczny pomimo postępów w rozpoznawaniu i leczeniu tej choroby, rozwoju chirurgii i radioterapii. Niepowodzenia w leczeniu spowodowane są przede wszystkim występowaniem wznów nowotworowych (wznów miejscowych, wznów w układzie chłonnym szyi lub późnych przerzutów), przerzutów odległych oraz drugich pierwotnych ognisk nowotworowych. Raki krtani, podobnie jak inne guzy lite cechuje wieloletni i wielostopniowy proces kancerogenezy, w trakcie którego komórki nabywają zmiany genetyczne w obrębie ważnych genów kontrolujących różnicowanie, prawidłowe podziały i śmierć komórek, za co odpowiadają głównie przeciwnowotworowe geny supresorowe. Jednym z dobrze poznanych mechanizmów prowadzących do inaktywacji genu supresorowego jest utrata heterozygotyczności (Loss of Heterozygosity, LOH), czyli utrata jednego z dwóch alleli danego genu. Wprowadzenie tej metody do badań umożliwiło ustalenie, które delecje pojawiają się na poszczególnych etapach rozwoju nowotworów głowy i szyi, identyfikację ważnych genów supresorowych oraz wskazanie miejsc, w których potencjalne geny mogą być zlokalizowane. Przede wszystkim wykazano, iż pomimo prawidłowej histologii otoczenie guza nie jest wolne od zmian genetycznych. Celem pracy była odpowiedź na pytanie: czy istnieje marker lub markery, które pozwolą przewidzieć wystąpienie wznowy miejscowej u pacjentów z płaskonabłonkowym rakiem krtani? Cel ten realizowano poprzez ocenę stopnia utraty heterozygotyczności w tkance nowotworowej, w tkance otaczającej guz oraz w 1 - 2 niezmienionych makroskopowo wycinkach błony śluzowej, w loci znanych genów supresorowych, zlokalizowanych w ramionach: 3p, 7q, 8p, 9p, 13q, 17p, 18q oraz korelację O t o l a r y ngo l og i a Po l sk a t o m 6 4 , nr 1, s t yc ze ń – l ut y 2 010 danych genetycznych z cechami pacjenta (wiek, nałogi), cechami guza (TNM, G, lokalizacja), czasem przeżycia oraz wystąpieniem wznowy miejscowej w grupie 65 pacjentów z płaskonabłonkowym rakiem krtani. Oceniano również, czy LOH w analizowanych regionach pozwoli na ocenę ryzyka rozwoju wznowy miejscowej u pacjentów operowanych z powodu raka krtani w oparciu o monitoring kliniczny pacjentów (follow up). Materiał do badań stanowiło DNA pozyskane od 65 pacjentów leczonych chirurgicznie z powodu płaskonabłonkowego raka krtani w Klinice Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Od każdego pacjenta pobierano pełną krew obwodową stanowiącą materiał referencyjny oraz w zależności od przeprowadzonego zabiegu 3 lub 4 fragmenty tkanek. Od 46 pacjentów po laryngektomii całkowitej pobrano: tkankę nowotworową (a), tkankę otaczającą (b), makroskopowo prawidłową błonę śluzową z okolicy nadgłośni lub nasady języka (c) oraz makroskopowo prawidłową błonę śluzową z I-III pierścienia tchawicy (d). Od 19 pacjentów po laryngektomii częściowej pobrano: tkankę nowotworową (a), tkankę otaczającą (b) oraz makroskopowo prawidłową błonę śluzową z punktu najbardziej oddalonego od guza (c). Pacjenci zrekrutowani do badanej grupy zostali objęci rutynowym monitoringiem klinicznym. W trakcie dwóch z takich kontroli, w sumie od 18 pacjentów pobrano do badań złuszczony nabłonek z tracheostomy lub wymaz z okolicy gardła dolnego. Jako metodę zastosowano reakcję PCR ze starterami oskrzydlającymi sekwencje 24 polimorficznych markerów mikrosatelitarnych zlokalizowanych w pobliżu znanych genów supresorowych, takich jak: FHIT (3p13-3p14.2), R ASSF1 (3p21.31), VHL (3p25.3-3p26.1), ING3 (7q31.2-7q31.31), MTUS1 Otolaryngol Pol 2010; 64 (1): 55-56 56 DOKTORATY, HABILITACJE / DOCTORS THESES, PROFESSORS THESES oraz CSMD1 (8p22-8p23.3), CDKN2A (9p21.3), RB1 (13q14.2), ING1 (13q33.2-13q34), TP53 (17p13.1) oraz SMAD4 i DCC (18q21.2). Celem detekcji LOH uzyskane produkty PCR rozdzielano elektroforetycznie z zastosowaniem automatycznego sekwenatora ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) lub ALF Express® II (Amersham Biosciences). Pod uwagę brano tylko przypadki heterozygotyczne dla danego markera. LOH stwierdzano w przypadkach, gdy następowała przynajmniej 50% redukcja jednego z alleli w badanym DNA w porównaniu do DNA referencyjnego. Wykazano, iż nie wszystkie markery mikrosatelitarne są jednakowo przydatne do analizy LOH (duża ilość przypadków nieinformatywnych, tj. homozygot), co wynika głównie z małych różnic etniczno-rasowych w populacji polskiej. W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano, iż głównymi regionami delecji w przebiegu płaskonabłonkowego raka krtani są regiony, w których zlokalizowane są geny supresorowe TP53 (17p13.1) oraz RB1 (13q14.2). LOH przynajmniej w jednym markerze zlokalizowanym w regionie TP53 obserwowano w tkance nowotworowej, tkance otaczającej oraz prawidłowej błonie śluzowej z okolicy tracheostomy, odpowiednio w: 41,1%, 12,5% oraz 4,9% przypadków. Z kolei najczęstsze utraty w zdrowej błonie śluzowej z okolicy nadgłośni obserwowano dla markerów zlokalizowanych w regionie genu RB1 (11,9%). Ponadto wykazano, iż największa akumulacja zmian genetycznych występuje w guzie – dla genów supresorowych VHL, FHIT, MTUS1/CSMD1, CDKN2A, RB1, ING1 oraz TP53 zaobserwowano statystycznie istotną różnicę w częstościach LOH pomiędzy guzami a poszczególnymi tkankami prawidłowymi, natomiast dla tych samych regionów nie obserwowano statystycznie istotnej róż- nicy w częstościach LOH pomiędzy tkanką otaczającą a: zdrową błoną śluzową z okolicy nadgłośni oraz zdrową błoną śluzową z okolicy tracheostomy a także pomiędzy obiema zdrowymi tkankami. Jednocześnie wykazano, iż akumulacja LOH w tkance nowotworowej jest predykcyjnym czynnikiem wystąpienia wznowy miejscowej. W tkankach prawidłowych nie zaobserwowano przewagi LOH w poszczególnych regionach ramion 3p i 9p, co mogłoby przemawiać za możliwym wystąpieniem wznowy miejscowej. Nie jest wykluczone, iż mechanizm formowania się wznowy, związany jest z nabyciem innych zmian genetycznych w porównaniu do ogniska pierwotnego. Analizując dane kliniczne, histopatologiczne oraz czas przeżycia pacjentów wykryto statystycznie istotną zależność pomiędzy czasem przeżycia a cechą T (im wyższy stopień zaawansowania nowotworu tym krótszy czas przeżycia), a także pomiędzy czasem wystąpienia wznowy miejscowej a długością przeżycia chorego, przy czym zależność ta była statystycznie istotna, gdy wznowa wystąpiła w okolicy tracheostomy. Stwierdzono, iż u pacjentów z rakiem krtani istnieje tendencja do rozwijania się wznowy miejscowej poniżej guza pierwotnego, co daje gorsze implikacje kliniczne (krótszy czas przeżycia). W badaniach follow up nie potwierdzono predykcyjnej wartości LOH w kierunku prognozowania wznowy miejscowej. Podsumowując, w przeprowadzonych badaniach zaobserwowano, iż akumulacja LOH w tkance nowotworowej jest czynnikiem predykcyjnym wystąpienia wznowy miejscowej. Niemniej jednak wydaje się, iż na chwilę obecną dobry monitoring kliniczny pozostaje najlepszym narzędziem diagnostycznym w kierunku predykcji wznowy. O t o l a r y ngo l og i a Po l sk a t o m 6 4 , nr 1, s t yc ze ń – l ut y 2 010
