tom 42 numer 3 rok 2003 - Polskie Towarzystwo Mikrobiologów

POST. MIKROBIOL.,
2003, 42, 3, 263–283
http://www.pm.microbiology.pl
EWOLUCJA UK£ADU
SYMBIOTYCZNEGO RHIZOBIUM
– ROŒLINY MOTYLKOWATE
Jerzy Wielbo i Anna Skorupska
1. Znaczenie biologicznego wi¹zania azotu. 2. Diazotrofy symbiotyczne i niesymbiotyczne. 3. Charakterystyka procesu symbiotycznego wi¹zania azotu. 4. Filogeneza roœlinnych gospodarzy. 5. Molekularne pod³o¿e predyspozycji roœlin do tworzenia brodawek. 6. Filogeneza rizobiów. 7. Ewolucja kompleksu enzymatycznego nitrogenazy i szlaku biosyntezy czynników Nod. 8. Geny nod-nif: jednostka
genetyczna o odrêbnej filogenezie. 9. Rozprzestrzenianie siê grup genów symbiotycznych. 10. Bakterie i roœliny – ewolucja gatunków i ich wzajemnych oddzia³ywañ. 11. „Œlepe uliczki ewolucji”
– zjawisko niezgodnoœci uniemo¿liwiaj¹ce nawi¹zanie symbiozy pomiêdzy rizobiami a roœlinami
motylkowatymi. 12. Symbiotyczne wi¹zanie azotu – perspektywy. 13. Podsumowanie
The evolution of Rhizobium-legumes symbiosis
Abstract: The process of biological nitrogen fixation was developed by the living organisms over
two billions years ago. Since that time it has been undergoing continuous evolution in parallel
with the evolution of living organisms which eventually led to development of numerous varieties of
this process.
Non-symbiotic reduction of N2 performed by free-living Archea and Bacteria is the oldest form
of biological nitrogen fixation. The evolution of terrestrial seminal plants and their common predisposition for symbiotic interactions with microorganisms, especially with fungi, permitted the development of very effective symbiotic systems.
The formation of correctly functioning symbiotic systems in which diazotrophic bacteria reduce
atmospheric dinitrogen requires the expression of a genetic information, originating from three independently evolving sources: the plant genome, the bacterial genome and the nod-nif region. The plant
genome and the nod-nif genes interact most pronouncely (phenotypic interactions), whereas the bacterial genome plays but a secondary role in the creation of symbiotic systems. The group of bacterial
diazotrophic microsymbionts enlarges dynamically as an outcome of a significant mobility of the nodnif region and its dissemination among new bacterial species by the lateral gene transfer mechanism.
1. Importance of the biological nitrogen fixation. 2. Symbiotic and non-symbiotic diazotrophs.
3. Symbiotic nitrogen fixation: an overview.4. Phylogeny of plant-host species. 5. The molecular
predisposition of plants for nodulation. 6. Phylogeny of rhizobia. 7. The evolution of enzymatic
nitrogenase complex and Nod factors biosynthesis pathway. 8. nod-nif genes – a region with its own
phylogeny. 9. Dissemination of the symbiotic genes among the bacterial species. 10. Bacteria and
plants – the evolution of species and their interactions. 11. “Dead ends” of evolution – non-effective
symbioses as a result of incompatibility between plant host and its microsymbiont. 12. The perspectives of symbiotic nitrogen fixation. 13. Summary
1. Znaczenie biologicznego wi¹zania azotu
Ca³kowit¹ iloœæ azotu na Ziemi szacuje siê na oko³o 1,6×1017 t, z czego 98%
znajduje siê w geosferze niedostêpnej dla organizmów ¿ywych. Pozosta³e 2% przypada na trzy rezerwuary azotu:
263
– atmosferê, gdzie azot gazowy wystêpuje g³ównie w formie cz¹steczkowej (N2),
lecz równie¿ jako podtlenek (N2O), tlenek (NO) i dwutlenek (NO2) azotu
(3,9×1015 t);
– organizmy ¿ywe, w których azot wystêpuje jako sk³adnik zwi¹zków organicznych (ok. 1011 t);
– glebê, gdzie azot g³ównie wchodzi w sk³ad zwi¹zków organicznych poddawanych mineralizacji, lecz wystêpuje równie¿ w postaci azotanów (NO 3–),
azotynów (NO2–) i jonów amonowych (NH4+) (ponad 3,0×1011 t) [33].
Równowagê reguluj¹c¹ okreœlony iloœciowy udzia³ poszczególnych zwi¹zków
azotu w jego ca³kowitej puli zapewnia szereg procesów, z których wiele przeprowadzanych jest przez mikroorganizmy. S¹ to:
– nitryfikacja – utlenianie jonów amonowych poprzez azotyny do azotanów,
przeprowadzane przez grupê chemolitotrofów m.in. przez Nitrosomonas,
Nitrosococcus, Nitrospira, Nitrobacter, Nitrococcus;
– denitryfikacja (oddychanie azotanowe) – beztlenowa redukcja azotanów poprzez azotyny do azotu cz¹steczkowego przebiegaj¹ca z uwolnieniem energii,
przeprowadzana m.in. przez Pseudomonas denitrificans, Paracoccus denitrificans, Thiobacillus denitrificans, Pseudomonas aeruginosa;
– redukcja dysymilacyjna azotanów do jonów amonowych (bez uzyskiwania
energii), prowadzona m.in. przez Enterobacter czy Vibrio;
– asymilacja, czyli zamiana jonów amonowych w azot organiczny, wbudowywany w biomasê;
– amonifikacja, czyli enzymatyczna hydroliza organicznych zwi¹zków azotu
z wydzieleniem jonów amonowych;
– biologiczna redukcja azotu cz¹steczkowego do jonów amonowych, prowadzona przez zró¿nicowane pod wzglêdem systematycznym bakterie, okreœlane
wspólnym terminem „diazotrofy”.
Biologiczna redukcja azotu cz¹steczkowego jest niezwykle istotnym ogniwem
w cyklu obiegu azotu w przyrodzie, poniewa¿ tylko niewielki u³amek nieorganicznych soli azotu znajduje siê w warstwie gleby dostêpnej dla organizmów ¿ywych.
Równoczeœnie iloœæ azotu cz¹steczkowego przekszta³canego rocznie w formy
dostêpne dla wiêkszoœci organizmów ¿ywych stanowi kilka procent iloœci azotu
zawartej w tych organizmach. Aktywnoœæ diazotrofów dostarcza znacznie wiêcej
zwi¹zanego N2 (2,4×108 t rocznie) ni¿ ca³kowita produkcja przemys³u nawozów
sztucznych (3,6×107 t rocznie) i redukcja abiotyczna (8×107 t rocznie), wiêc mo¿na
przyj¹æ, ¿e biologiczne wi¹zanie azotu jest obecnie g³ównym procesem utrzymuj¹cym równowagê pomiêdzy iloœci¹ N2 a iloœci¹ NO3– i NH4+. Dziêki biologicznej
redukcji N2 utrata azotu z gleby do atmosfery spowodowana denitryfikacj¹ nie
jest bezpowrotna, co pozwala na zachowanie w glebie zasobu nieorganicznych soli
azotu dostêpnych dla roœlin [5, 37, 43, 45, 73, 77].
Obserwowane obecnie proporcje pomiêdzy poszczególnymi procesami zwi¹zanymi z obiegiem azotu nie by³y sta³e na przestrzeni dziejów Ziemi. Przypuszcza siê,
¿e przed 2,2 mld lat przewa¿a³a abiotyczna redukcja N2 poprzez etap NO, która by³a
skutkiem wy³adowañ elektrycznych w atmosferze. Wi¹zanie biologiczne pojawi³o
264
siê jako reakcja na rosn¹ce zapotrzebowanie organizmów ¿ywych na zwi¹zki azotu,
id¹ce w parze ze zmniejszeniem intensywnoœci wi¹zania abiotycznego [56]. Bior¹c
pod uwagê istniej¹ce obecnie drogi przemian zwi¹zków azotu oraz ewolucjê atmosfery ziemskiej sugeruje siê, ¿e biologiczne wi¹zanie N2 jest ewolucyjnie najm³odszym procesem, powsta³ym po (kolejno): amonifikacji, denitryfikacji (istniej¹cej
przed powstaniem atmosfery tlenowej) i nitryfikacji (wymagaj¹cej tlenu) [44].
2. Diazotrofy symbiotyczne i niesymbiotyczne
Mikroorganizmy redukuj¹ce cz¹steczkowy azot atmosferyczny, spotyka siê zarówno w domenie Archea jak i w domenie Bacteria [7, 31]. W domenie Bacteria
(Bakterie), mikroorganizmy wi¹¿¹ce azot grupuj¹ siê g³ównie w typach Proteobacteria (Bakterie w³aœciwe), Cyanobacteria (Sinice) i Actinobacteria (Promieniowce). Wœród zdolnych do redukcji N2 Proteobacteria spotykamy zarówno organizmy tlenowe (Azotobacter, Klebsiella) [31, 50], jak i beztlenowe (Clostridium)
[34, 52]. Diazotrofy wystêpuj¹ wœród fotoautotrofów (Rhodospirillum, Rhodobacter) [41, 76], chemolitotrofów (Geobacter, Magnetospirillum) i heterotrofów
(Burkholderia, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Azospirillum), czêsto egzystuj¹cych na powierzchni lub w zewnêtrznych warstwach tkanek roœlinnych [14,
17, 22, 42]. Diazotroficzne sinice mog¹ byæ zarówno organizmami l¹dowymi,
pochodz¹cymi z ró¿nych stref klimatycznych, jak i morskimi [59, 72, 97]. Wchodz¹
w efektywn¹ symbiozê z roœlinami nale¿¹cymi do mchów (Bryopsida), w¹trobowców (Hepaticopsida), glewików (Anthocerophytina, np. Anthoceros), paprociowych
(Pterophytina, np. Azolla), nagozal¹¿kowych sagowców (Cycadopsida, np. Cycas)
i okrytozal¹¿kowych (Myrtales, np. Gunnera). Sinice tworz¹ zewn¹trzkomórkowe
symbiozy z ró¿nymi roœlinami; wyj¹tek stanowi Nostoc tworz¹ca wewn¹trzkomórkow¹ symbiozê z Gunnera. Wi¹zanie azotu u sinic zachodzi w specyficznych
komórkach tzw. heterocystach przystosowanych do ochrony labilnej nitrogenazy
przed tlenem [1, 10].
Zwi¹zek bakterii zdolnych do redukcji azotu cz¹steczkowego z eukariontami
mo¿e przybieraæ czasem znacznie œciœlejsze formy. Wówczas mikroorganizmy dostarczaj¹ce ³atwo przyswajalnych zwi¹zków azotu staj¹ siê endosymbiontami roœlin
lub zwierz¹t (termitów) – jak niektóre Spirochaetales (krêtki) [39, 57, 58]. Symbioza diazotrofów (Proteobacteria i Actinobacteria) z roœlinami zachodzi zazwyczaj
w obrêbie specjalnych organów roœlinnych – brodawek korzeniowych lub (rzadziej)
brodawek ³odygowych [63, 80]. Wiêkszoœæ bakterii symbiotycznych to Gram-ujemne
bakterie glebowe okreœlane ogólnym terminem „rizobiów”, wchodz¹ce w interakcje
z licznymi gatunkami z rodziny Fabaceae = Leguminoseae (motylkowate) oraz
wyj¹tkowo z gatunkiem niemotylkowatej Parasponia z rodziny Ulmaceae (wi¹zowate) [79]. Promieniowce, Gram-dodatnie bakterie z rodzaju Frankia s¹ znacznie
mniej wyspecjalizowanymi endosymbiontami ni¿ rizobia [79]. Frankia jest symbiontem wybranych gatunków z 8 rodzin roœlin okrytozal¹¿kowych: Betulaceae
(1 z 6 gatunków), Casuarinaceae (wszystkie 4 gatunki), Elaeagnaceae (wszystkie
265
3 gatunki), Myricaceae (2 z 3 gatunków), Rhamnaceae (7 z 55 gatunków), Rosaceae
(5 ze 100 gatunków), Datiscaceae (1 z 3 gatunków) oraz Coriariaceae (1 gatunek).
Jednak pomimo znacznie mniejszej liczby potencjalnych gospodarzy nie nale¿y
lekcewa¿yæ ekologicznego znaczenia wariantu symbiozy realizowanego przez
Frankia. Przyjmuje siê, ¿e iloœæ N2 redukowanego w uk³adach z udzia³em promieniowców dorównuje iloœci azotu przyswajanego przy udziale rizobiów [10].
3. Charakterystyka procesu symbiotycznego wi¹zania azotu
Do nawi¹zania efektywnej symbiozy, w wyniku której nastêpuje redukcja azotu
atmosferycznego, potrzebne s¹ dwa niezale¿ne dopasowane do siebie organizmy,
czyli bakterie zdolne do wi¹zania N2 na poziomie znacznie przekraczaj¹cym ich
zapotrzebowanie na ten pierwiastek oraz roœliny, zapewniaj¹ce odpowiednie warunki
dla tego procesu, tzn. beztlenowe œrodowisko i energiê konieczn¹ do przebiegu
reakcji redukcji azotu cz¹steczkowego.
Rhizobia (mikrosymbionty) zdolne do symbiotycznego wi¹zania N2 maj¹ funkcjonalny kompleks enzymatyczny nitrogenazy redukuj¹cej N2 do NH3, komplet
enzymów niezbêdnych do funkcjonowania szlaku biosyntezy chitolipooligosacharydów (czynników Nod) indukuj¹cych u roœlin powstanie brodawek korzeniowych,
odpowiednio zbudowane struktury powierzchniowe umo¿liwiaj¹ce roœlinom rozpoznanie bakterii oraz prawid³owo funkcjonuj¹ce mechanizmy kolonizacji korzeni
i hamowania reakcji obronnej roœlin. Roœlinny partner symbiozy (makrosymbiont)
posiada receptory umo¿liwiaj¹ce percepcjê bakteryjnych czynników Nod, sprawne
mechanizmy reakcji na chitolipooligosacharydy pozwalaj¹ce na wytworzenie
brodawek, zestaw bia³ek pozwalaj¹cych bakteriom na kolonizacjê korzeni (noduliny buduj¹ce niæ infekcyjn¹) oraz bia³ka odpowiedzialne za zapewnienie mikroaerofilnych warunków w brodawkach odpowiednich dla redukcji azotu (np. leghemoglobiny czy bia³ka systemów transportu substancji bêd¹cych Ÿród³ami energii
dla bakteroidów).
Nawi¹zywanie efektywnej symbiozy jest procesem wieloetapowym i precyzyjnym [63, 80]. Rozpoczyna go wymiana sygna³ów pozwalaj¹ca na wzajemne rozpoznanie siê partnerów. Roœliny wydzielaj¹ do ryzosfery szereg zwi¹zków flawonoidowych, które s¹ atraktantami dla zgodnych mikrosymbiontów, hamuj¹ wzrost
konkuruj¹cych z nimi bakterii oraz indukuj¹ za poœrednictwem bia³ka regulatorowego NodD ekspresjê bakteryjnych genów nod (ang. nodulation) odpowiedzialnych
za brodawkowanie roœlin. Mikrosymbionty ulegaj¹ adhezji do powierzchni w³oœników korzeniowych i produkuj¹ tzw. czynniki Nod (chitolipooligosacharydy, CLOS)
– specyficzne morfogeny, które wywo³uj¹ zmiany morfologiczne we w³oœnikach
korzeniowych oraz indukuj¹ w korze korzenia powstawanie nowych merystemów.
Bakterie s¹ odpowiedzialne za supresjê roœlinnych mechanizmów obronnych i za
poœrednictwem czynników Nod indukuj¹ nowe merystemy korzeni daj¹c pocz¹tek
brodawkom korzeniowym. Rizobia docieraj¹ do zawi¹zków brodawek w obrêbie
tubularnych struktur zwanych niæmi infekcyjnymi i zaka¿aj¹ brodawki. W zaka¿o266
nych brodawkach, bakterie otoczone roœlinnymi b³onami peribakteroidalnymi przekszta³caj¹ siê w bakteroidy zdolne do wi¹zania azotu dziêki ekspresji genów nif i fix
(ang. nitrogen fixation) koduj¹cych bia³ka kompleksu enzymatycznego nitrogenazy.
Struktury brodawki korzeniowej roœliny zapewniaj¹ odpowiednie œrodowisko dla
przebiegu procesu redukcji azotu [63, 80].
Proces ten przybra³ swój obecny kszta³t w wyniku trwaj¹cych przez co najmniej
kilkadziesi¹t milionów lat prób dopasowania budowy i funkcjonowania organizmów
gospodarzy i mikrosymbiontów. Ewolucja symbiozy doprowadzi³a do wypracowania mechanizmów wzajemnego rozpoznawania partnerów oraz obustronnego zredukowania tych mechanizmów lub cech, które mog³yby niekorzystnie wp³yn¹æ
na efektywnoœæ procesu. Obecnie zaœ ewolucja symbiotycznego wi¹zania azotu
wydaje siê przebiegaæ w kierunku poszerzania krêgu zarówno mikrosymbiontów,
jak i ich roœlinnych gospodarzy.
4. Filogeneza gatunków roœlinnych gospodarzy
Na ogóln¹ liczbê 380 rodzin roœlin okrytozal¹¿kowych, tylko 10 rodzin jest
gospodarzami dla diazotroficznych symbiontów. Podanie zadawalaj¹cego wyjaœnienia dla faktu pojawienia siê cech umo¿liwiaj¹cych nawi¹zanie symbiozy u tej w¹skiej grupy roœlin by³o niemo¿liwe przy stosowaniu tradycyjnej taksonomii opartej
o klasyfikacjê morfologiczn¹. W tym systemie taksonomicznym roœliny–gospodarze
dla diazotrofów nie stanowi¹ jednej grupy, lecz s¹ rozproszone po ró¿nych, nie
zwi¹zanych ze sob¹ jednostkach systematycznych. Zastosowanie wspó³czesnej
klasyfikacji opartej o analizê porównawcz¹ sekwencji genu rbcL koduj¹cego du¿¹
podjednostkê chloroplastowej karboksylazy rybulozo-1,5- bisfosforanu pozwala na
konstrukcjê drzewa filogenetycznego (kladogramu) grupuj¹cego razem przedstawicieli 10 wspomnianych rodzin w obrêbie taksonu Ró¿owe-I (ang. Rosid-I clade),
wywodz¹c je od wspólnego przodka [79]. Poniewa¿ nie wszystkie gatunki roœlin
z ga³êzi ewolucyjnej Ró¿owe-I s¹ zdolne do nawi¹zywania symbiozy z mikroorganizmami, jedn¹ z jego podgrup, z³o¿on¹ w wiêkszoœci z potencjalnych gospodarzy,
okreœla siê mianem kladu wi¹¿¹cego azot (ang. nitrogen-fixing clade). Uwa¿a siê,
¿e w przypadku pozosta³ych roœlin z Ró¿owych-I utrata zdolnoœci do symbiotycznego wspó³¿ycia z bakteriami lub promieniowcami jest wtórna i mo¿e wynikaæ
z mutacji pojedynczych genów [11]. Klasyfikacja oparta o sekwencjê rbcL dowodzi
równie¿, ¿e symbioza typu roœlina-sinice (na przyk³adzie Gunnera-Nostoc) [65]
to odmienny i ewolucyjnie bardzo odleg³y wariant tego zjawiska [79].
Poszukiwanie cech wspólnych ³¹cz¹cych roœliny z grup potencjalnych gospodarzy dla wi¹¿¹cych azot symbiotycznych diazotrofów wykaza³y, ¿e istniej¹ równie¿
inne, wspólne dla nich cechy genetyczne. Podobnie jak w przypadku rbcL, badanie
sekwencji genów leghemoglobin roœlinnych, czy sekwencji ITS (ang. internal transcribed spacer) w obrêbie genów rDNA pozwoli³o na skonstruowanie drzew filogenetycznych grupuj¹cych roœliny zdolne do symbiozy w obrêbie blisko spokrewnionych
taksonów [86, 91].
267
5. Molekularne pod³o¿e predyspozycji roœlin do tworzenia brodawek
Uwa¿a siê, ¿e predyspozycja roœlin do tworzenia brodawek wynika z obecnoœci
w ich genomie specyficznych genów regulatorowych. Mog¹ one kodowaæ bia³ka
takie jak np. Nmh7, NmhC5 czy Ngl9 w Medicago truncatula, które s¹ czynnikami
transkrypcyjnymi typu kaseta-MADS (skrót od nazw 4 genów roœlinnych dla czynników transkrypcyjnych: mcm1, ap3, defA, srf) [25, 26, 100]. Bia³ka typu kaseta-MADS
s¹ szeroko rozpowszechnione wœród roœlin. Uwa¿a siê, ¿e ich wszystkie obecnie
spotykane warianty wywodz¹ siê od prototypu obecnego u roœlin przed rozdzieleniem siê linii rozwojowych paproci i roœlin nasiennych. W wyniku duplikacji
pojedynczego genu oraz póŸniejszej ewolucji jego kopii u wspólnych przodków
nago- i okrytonasiennych (ok. 340 mln lat temu) prawdopodobnie pojawi³a siê
rodzina genów okreœlana mianem kwiatowych genów homeotycznych (ang. floral
homeotic genes), z której wywodz¹ siê wszystkie bardzo licznie spotykane warianty
genów bia³ek MADS [55]. Obecnie bia³ka tego typu funkcjonuj¹ jako czynniki
transkrypcyjne zaanga¿owane w rozwój kwiatów, i s¹ odpowiedzialne za skierowanie komórek na okreœlon¹ drogê ró¿nicowania [26]. Wyró¿nia siê wœród nich
2 podgrupy: bia³ka odpowiedzialne za cechy merystemów, z których rozwijaj¹ siê
tkanki kwiatów, oraz bia³ka odpowiedzialne za wykszta³cenie poszczególnych cech
kwiatów [25]. Prawdopodobnie pojawienie siê bia³ek typu kaseta-MADS oraz
realizowanych przez nie mechanizmów regulacyjnych by³o warunkiem niezbêdnym
dla wytworzenia przez roœliny nowych organów – kwiatów [55]. Mo¿na przypuszczaæ, ¿e dalsza ewolucja niektórych genów dla bia³ek MADS doprowadzi³a do
powstania nowych wariantów, takich jak np. bia³ka Nmh7, NmhC5, Ngl9, w przypadku których dosz³o do zmiany miejsca ekspresji i utworzenia nowych merystemów korzenia oraz nowych organów indukowanych dzia³alnoœci¹ bakterii. Bez
zmian pozosta³a natomiast zdolnoœæ bia³ek typu kaseta-MADS do kierowania
ekspresj¹ innych genów, a przez to do sterowania programem rozwoju okreœlonego
organu – brodawki korzeniowej.
Najwiêksz¹ adaptacjê w tym kierunku wykaza³y niektóre gatunki roœlin z rodziny motylkowatych. Badania Leguminoseae wykaza³y, ¿e w trakcie ewolucji w ich
trzech podrodzinach, tzn. Ceasalpinioideae (brezylkowate), Mimosoideae (mimozowate), oraz Papillionoideae (motylkowate w³aœciwe) ró¿nie kszta³towa³a siê presja selekcyjna zwi¹zana z wykszta³caniem siê cech pomocnych w nawi¹zywaniu
symbiozy z diazotrofami. Zdolnoœæ do symbiozy z rizobiami obserwuje siê u oko³o
30% Ceasalpinioideae, podczas gdy u Mimosoideae oraz Papillionoideae, które
prawdopodobnie wyewoluowa³y z prymitywnych Ceasalpinioideae, iloœæ gatunków
wchodz¹cych w symbiozê wynosi oko³o 90% ogólnej ich liczby [4].
Tworzenie brodawek wynikaj¹ce z regulacyjnej aktywnoœci czynników transkrypcyjnych typu kaseta-MADS zale¿y równie¿ od obecnoœci bakterii i produkowanych przez nie zwi¹zków. Jednak w pewnych warunkach u roœlin motylkowatych
takich jak lucerna czy koniczyna mo¿na zaobserwowaæ spontaniczne (przebiegaj¹ce
bez udzia³u bakterii) ukierunkowanie rozwoju zespo³ów komórek, prowadz¹ce do
powstania merystemów w korze korzenia lub struktur przypominaj¹cych brodawki
268
(tzw. pseudobrodawek). We wnêtrzu pseudobrodawek stwierdzono wystêpowanie
du¿ych iloœci amyloplastów oraz tkanek aktywnych w transporcie metabolitów.
Przypuszcza siê, ¿e tego typu lub podobne struktury mog³y u przodków motylkowatych stanowiæ organy przechowywania skrobi, po czym zosta³y zaadaptowane do
nowych funkcji [2, 23, 47].
Szereg faktów przemawia za przyjêciem hipotezy, ¿e symbioza roœliny–diazotrofy jest szczególnym wariantem ogólnej predyspozycji roœlin do wchodzenia
w symbiozê z innymi organizmami. Szacuje siê, ¿e oko³o 80% roœlin l¹dowych
jest zdolne do symbiozy z grzybami, czyli endomikoryzy. Jest to najstarszy typ
symbiozy wykryty w skamienielinach roœlin l¹dowych pochodz¹cych sprzed
400 mln lat [66]. Istot¹ mikoryzy jest wymiana substancji mineralnych (g³ównie
zwi¹zków fosforu) uzyskiwanych przez grzyby, na zwi¹zki wêgla produkowane
przez roœliny. Mikoryzê od symbiozy z udzia³em bakterii odró¿nia znacznie ni¿sza
specyficznoœæ oraz brak zdolnoœci do wywo³ywania precyzyjnie kontrolowanych
zmian w tkankach roœlinnych. Istnieje jednak wiele cech wspólnych mikoryzy i symbiozy: stymulacja kie³kowania spor i rozwoju grzybni przez flawonoidy, adhezja
i penetracja tkanek roœlinnych, wymiana substancji od¿ywczych, brak indukcji
silnych reakcji obronnych u gospodarza [27]. W wyniku zaka¿enia roœlin przez
grzyby mikoryzowe obserwuje siê wzrost aktywnoœci genów zaanga¿owanych
w procesy odpornoœciowe roœlin, jednak jest to indukcja na bardzo ograniczon¹ skalê podobnie jak w przypadku infekcji Rhizobium [70]. Symbioza i mikoryza maj¹
czêœciowo nak³adaj¹cy siê program genetyczny, co oznacza, ¿e istnieje zwi¹zek
pomiêdzy zdolnoœci¹ do tworzenia efektywnych brodawek a zdolnoœci¹ do nawi¹zywania mikoryzy u okreœlonych roœlin. Mutanty roœlin motylkowatych niezdolne
do brodawkowania lub tworz¹ce brodawki defektywne mog¹ byæ równie¿ niezdolne
do wchodzenia w symbiozê z grzybami [70, 75]. Badania funkcjonuj¹cych w komórkach roœlinnych szlaków transmisji sygna³ów wykaza³y, ¿e za percepcjê sygna³ów wysy³anych przez bakteryjne lub grzybowe mikrosymbionty odpowiedzialne
s¹ te same bia³ka roœlinne, takie jak SYMRK (ang. symbiosis receptor-like kinase)
wystêpuj¹ca u Lotus japonicus (komonica) lub NORK (ang. nodulation receptor
kinase) obecna w komórkach Medicago (lucerna) i Pisum (groch). Kinazy te zlokalizowane s¹ w b³onie komórkowej i przypuszczalnie pe³ni¹ funkcjê receptora
dla bakteryjnych czynników Nod [15, 83]. Prawdopodobnie mechanizmy funkcjonuj¹ce w mikoryzie zosta³y zaadaptowane i zmodyfikowane do formy obecnie
obserwowanej w przypadku symbiozy roœlin i diazotrofów. U³atwieniem dla ewolucji nowego procesu mog³a byæ obecnoœæ roœlin, grzybów i bakterii we wspólnym
œrodowisku, niekiedy przejawiaj¹ca siê jako endosymbioza bakterii wi¹¿¹cych azot
w organizmach grzybów [51].
Podsumowuj¹c mo¿na stwierdziæ, ¿e zdolnoœæ roœlin do nawi¹zywania symbiozy
z bakteriami, manifestuj¹ca siê morfologicznie jako zdolnoœæ do tworzenia brodawek
przeznaczonych do zasiedlenia przez bakterie, jest mo¿liwa u gatunków wykazuj¹cych szereg okreœlonych cech fizjologicznych. Mo¿na do nich zaliczyæ zdolnoœæ do
syntezy leghemoglobin, czynników transkrypcyjnych typu kaseta-MADS oraz wielu
innych, dotychczas nieznanych bia³ek. Wiadomo jednak, ¿e ich wystêpowanie jest
269
skorelowane z obecnoœci¹ okreœlonych wariantów genów rbcL, leghemoglobin, czy
sekwencji ITS, co wskazuje na istnienie wspólnej filogenetycznie linii rozwojowej
dla tego typu roœlin.
6. Filogeneza rizobiów
Podobnie jak roœliny, które s¹ gospodarzami dla wi¹¿¹cych azot mikrosymbiontów, równie¿ rizobia nie stanowi¹ z punktu widzenia systematyki jednolitej grupy
o wspólnej filogenezie. Metody klasyfikacji oparte o podobieñstwo sekwencji genów 16S rDNA (koduj¹cego 16S rRNA) umieszczaj¹ zdecydowan¹ wiêkszoœæ wi¹¿¹cych azot bakterii symbiotycznych w obrêbie rodziny Rhizobiaceae (Rys. 1) [99].
Okreœla siê je równie¿ mianem ga³êzi Mesorhizobium / Rhizobium / Sinorhizobium
(ang. Mesorhizobium / Rhizobium / Sinorhizobium branch), nale¿¹c¹ wraz z trzema
Rys. 1. Drzewo filogenetyczne Rhizobiaceae oparte na sekwencji 16S rDNA wykonane metod¹
„najbli¿szego s¹siedztwa” (ang. neighbor-joining) [wg. 99]
270
pozosta³ymi ga³êziami – Bradyrhizobium, Azorhizobium i Methylobacterium do podklasy " Proteobacteria. Bakteryjne endosymbionty roœlin spotyka siê równie¿ wœród
gatunków zaliczanych do podklasy $ Proteobacteria. S¹ to niektóre szczepy Burkholderia, znajduj¹ce siê tam obok wi¹¿¹cych N2 niesymbiotycznych Herbaspirillum
i Azoarcus [29, 53]. Niewykluczone, ¿e w miarê postêpu badañ odkrywane bêdzie
coraz wiêcej ewolucyjnie odleg³ych od siebie gatunków bakterii zdolnych
do nawi¹zania efektywnej symbiozy z roœlinami. Nale¿y bowiem pamiêtaæ, ¿e do
tej pory scharakteryzowano mikrosymbionty dla zaledwie 10% z 750 istniej¹cych
rodzajów roœlin motylkowatych [53, 87].
Sekwencja genu koduj¹cego 16S rRNA nie jest jedynym kryterium, na podstawie
którego mo¿na tworzyæ drzewa filogenetyczne (dendrogramy) bakterii. Jako referencyjne wykorzystuje siê równie¿ geny takie jak 23S rDNA [88], czy geny syntetazy
glutaminowej (GS) [64]. Wykorzystanie wszystkich trzech wymienionych genów daje
w zasadzie podobne wyniki, potwierdzaj¹c ugruntowan¹ pozycjê systematyczn¹ wiêkszoœci gatunków rizobiów. Obserwowane niewielkie ró¿nice, pojawiaj¹ce siê w przypadku opierania klasyfikacji o ró¿ne geny s¹ nie do unikniêcia, ze wzglêdu na ró¿ne
tempo ewolucji tych genów; obserwuje siê je nawet w przypadku definiowania jednostek taksonomicznych w oparciu o ró¿ne fragmenty tego samego genu [13].
Niezale¿nie od wyboru genu u¿ytego w celach taksonomicznych, przeprowadzone badania wykazuj¹, ¿e bakterie symbiotyczne zdolne do wi¹zania azotu w komórkach roœlin nale¿¹ do kilku ró¿nych, czasem bardzo od siebie ewolucyjnie odleg³ych linii rozwojowych. Dlatego uwa¿a siê, ¿e zdolnoœæ do indukowania brodawek
i wi¹zania w nich azotu wyp³ywaj¹ca z faktu posiadania przez bakterie genów
brodawkowania nod i genów nitrogenazy nif ma niewiele wspólnego z pozycj¹
systematyczn¹ poszczególnych gatunków bakterii, okreœlan¹ na podstawie analizy
sekwencji genów takich jak 16S rDNA.
7. Ewolucja kompleksu enzymatycznego nitrogenazy i szlaku biosyntezy
czynników Nod
Kompleks nitrogenazy sk³ada siê z homodimeru metaloproteiny Fe o masie cz¹st.
oko³o 60 kDa (kodowanej przez gen nifH) oraz tetrameru metaloproteiny Mo-Fe ("2$2)
o masie oko³o 240 kDa (kodowanych przez geny nifD i nifK) [32]. Do ekspresji
i dzia³ania nitrogenazy wymagana jest ponadto obecnoœæ kilkunastu bia³ek, kodowanych przez geny nif i tworz¹cych operony. Takie operony wraz z towarzysz¹cymi
im jednostkami monocistronowymi mog¹ byæ zgrupowane w obrêbie wydzielonego
regionu genetycznego po³o¿onego na plazmidzie lub chromosomie lub lokowaæ siê
w ró¿nych, odleg³ych od siebie miejscach chromosomu stanowi¹c regulon [50, 69,
84, 85]. Przypuszcza siê, ¿e istnienie wielu genów nif jest skutkiem ewolucji prototypu genu nitrogenazy powsta³ego u wspólnych przodków Archea i Bacteria [36].
Duplikacje i dywergencja poszczególnych jego kopii prawdopodobnie spowodowa³a
powstanie genów nifH oraz operonów nifDK i nifEN [18]. Z kolei ewolucja genów
nifDK doprowadzi³a do powstania nowych wariantów kompleksu metaloprotein
271
Mo-Fe, w których dosz³o do wymiany molibdenu na wanad (metaloproteina V-Fe,
kodowana przez geny vnfDK, spotykana u Azotobacter saliestris, A. chroococcum
czy Anabaena variabilis), lub do utraty zdolnoœci wi¹zania atomów dwu ró¿nych
metali na korzyœæ wy³¹cznoœci ¿elaza (metaloproteina Fe, kodowana przez geny
anfDK, spotykana u Clostridium pasteurianum, Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum czy Azomonas macrocytogenes) [31, 32, 41, 76]. Obecnie spotyka
siê trzy g³ówne typy nitrogenaz, przy czym mo¿liwe jest wystêpowanie dwóch ró¿nych izoform enzymu w komórkach jednego szczepu bakterii [40, 41, 76]. Zakres
wystêpowania poszczególnych typów nitrogenaz w populacjach bakteryjnych
w znacznej czêœci zale¿y od zjawiska poziomego transferu genów [7].
Czynniki Nod (chitolipooligosacharydy) s¹ g³ównymi czynnikami bakteryjnymi
wyzwalaj¹cymi u roœlin mechanizm brodawkowania. Poszczególne rodzaje czynników Nod produkowane przez ró¿ne szczepy rizobiów mog¹ wykazywaæ znaczne
ró¿nice dotycz¹ce ich struktury jak równie¿ zakresu reaguj¹cych na nie roœlin. Tym
niemniej wszystkie zbudowane s¹ z oligosacharydowego rdzenia i przy³¹czonych do
niego podstawników, do których zawsze nale¿y reszta d³ugo³añcuchowego nienasyconego kwasu t³uszczowego [49]. Istniej¹ przes³anki wskazuj¹ce, ¿e szlak biosyntezy
tego typu zwi¹zków móg³ powstaæ dziêki modyfikacji szlaku biosyntezy zwi¹zków
wchodz¹cych w sk³ad struktur powierzchniowych bakterii, takich jak np. BF-7 z grupy diglikozylodiacylogliceroli (DGDG). Prawdopodobnie z powodu ró¿nic w strukturze chemicznej, BF-7 nie wywo³uje tak rozleg³ych zmian w tkankach roœlin jak CLOS,
tym niemniej jego synteza jest powi¹zana z syntez¹ czynników Nod [60]. Przyk³ad
BF-7 mo¿e wyjaœniaæ mechanizm zmian prowadz¹cych do syntezy zwi¹zków sekrecyjnych o charakterze morfogenów (chitolipooligosacharydy) w wyniku ewolucji
szlaków biosyntezy zwi¹zków buduj¹cych struktury powierzchniowe bakterii.
Analiza sekwencji genów nod (nodA, nodC, nodD) ujawni³a, ¿e ich ewolucja przebiega³a wspólnie (jako ca³ych zespo³ów), lecz z ró¿nie ukierunkowan¹ presj¹ selekcyjn¹ [91]. W przypadku tzw. genów wspólnych nod (ang. common nod genes), spotykanych u wszystkich rizobiów, presja selekcyjna zapewni³a zachowanie wzglêdnie
du¿ej konserwatywnoœci sekwencji. W przypadku genów nod okreœlaj¹cych specyficznoœæ gospodarza (ang. host specifity nod genes) presja selekcyjna innego rodzaju
pozwoli³a na wyewoluowanie wielu nowych genów, których wystêpowanie ograniczone jest do niewielkiej liczby szczepów. Poniewa¿ w wyniku ekspresji genów nod
bakterie tworz¹ lipooligosacharydowe morfogeny przeznaczone do dzia³ania na
komórki i tkanki œciœle okreœlonego gatunku roœlin, dlatego struktura tych zwi¹zków
musi byæ dopasowana do mo¿liwoœci percepcyjnych okreœlonych roœlin. Dziêki temu
bakterie ró¿nych gatunków wchodz¹ce w symbiozê z tym samym gospodarzem
[np. w uk³adzie Phaseolus (fasola) – Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli, R. etli,
R. gallicum czy Sinorhizobium sp. (Phaseolus)] wykazuj¹ bardzo wysokie podobieñstwo sekwencji swoich genów nod [35]. Równie¿ mikrosymbionty roœlin zbli¿onych
pod wzglêdem fizjologicznym (tworz¹cych podobny typ brodawek) wykazuj¹ bliskie
pokrewieñstwo genów nod, rizobia zasiedlaj¹ce brodawki typu niezdeterminowanego
R. leguminosarum bv. viciae, bv. trifolii i S. meliloti, czy obecne w brodawkach typu
zdeterminowanego R. leguminosarum bv. phaseoli i Bradyrhizobium [91].
272
8. Geny nod-nif: jednostka genetyczna o odrêbnej filogenezie
Geny nif oraz geny nod stanowi¹ region genomu rizobiów, zlokalizowany najczêœciej na jednym z plazmidów, nazwanym „symbiotycznym” (pSym). Szacuje siê,
¿e wystêpuje 45 typów zespo³ów genów nod oraz 41 typów grup genów nif, daj¹cych w sumie ponad 50 typów „zespo³ów genów symbiotycznych” [35]. Drzewa
filogenetyczne rizobiów konstruowane w oparciu o sekwencje genów nod lub nif s¹
do siebie zbli¿one. Jednoczeœnie obserwuje siê du¿e rozbie¿noœci przy porównaniu
ich do dendrogramów tworzonych w oparciu o sekwencje genów takich jak geny
koduj¹ce 16S rRNA, 23S rRNA czy syntetazê glutaminow¹ (GS). Grupowanie
gatunków mikrosymbiontów na podstawie homologii regionu nod-nif jest w wysokim stopniu zgodne z grupowaniem ich roœlinnych gospodarzy opartym o analizê
sekwencji genów leghemoglobin, genu rbcL czy sekwencji ITS. Pozwala to na
stwierdzenie, ¿e istot¹ ewolucji procesu symbiozy rizobia – roœliny motylkowate
jest dopasowanie siê fenotypów roœlin i fenotypów bakterii bêd¹cych wynikiem
dzia³ania okreœlonych zestawów genów nod-nif. Pozosta³a czêœæ genomu bakterii
pe³ni w tym procesie raczej drugoplanow¹ rolê [10, 86, 91].
9. Rozprzestrzenianie siê „grup genów symbiotycznych”
Obecnoœæ regionu nod-nif w genomach odleg³ych ewolucyjnie gatunków bakterii glebowych wynika z pionowego lub poziomego mechanizmu przekazywania zespo³u tych genów. Badania populacyjne dowiod³y, ¿e w przekazywaniu i rekombinacji materia³u genetycznego u rizobiów preferencyjnie wykorzystywana jest œciœle
okreœlona strategia [3, 20, 46, 48, 71, 82]. Jej charakterystycznymi cechami s¹:
– du¿e potencjalne mo¿liwoœci przekazywania materia³u genetycznego na drodze koniugacji (do 40% materia³u genetycznego rizobiów znajduje siê w plazmidach);
– wysoka czêstoœæ rekombinacji wynikaj¹ca z wystêpowania sekwencji insercyjnych, sekwencji powtórzonych i zduplikowanych genów (ang. reiterrated
genes);
– wystêpowanie zjawiska przesuniêcia równowagi sprzê¿eñ miêdzy genami
(sprzê¿enia niezrównowa¿one) (ang. linkage disequilibrium) pozwalaj¹cego
na nieprzypadkowe segregowanie alleli, co prowadzi do powstania kilku odrêbnych linii w populacji;
– sporadyczna wymiana materia³u genetycznego pomiêdzy liniami/gatunkami;
– swobodna wymiana genetyczna w obrêbie linii/gatunku.
Poziomy transfer genów, czêsto zlokalizowanych na plazmidach i przekazywanych za ich poœrednictwem, obserwowany pomiêdzy liniami (czy gatunkami)
zdarza siê wprawdzie niezbyt czêsto [78, 94], lecz mo¿e mieæ szczególne znaczenie
w przypadku drastycznej zmiany warunków ¿ycia mikroorganizmów lub spotkania
dwu do tej pory nie kontaktuj¹cych siê linii/gatunków. W takich warunkach mo¿e
wydatnie pomóc w wygenerowaniu nowego fenotypu, potrzebnego do zasiedlenia nowych terenów lub gospodarzy [95]. O du¿ym znaczeniu koniugacyjnego
273
przekazywania plazmidu symbiotycznego dla rozprzestrzeniania siê w populacjach
bakteryjnych zdolnoœci do wchodzenia w efektywn¹ symbiozê z roœlinami motylkowatymi œwiadcz¹ takie zjawiska jak:
– uderzaj¹ce podobieñstwo genów wspólnych nod w grupie obejmuj¹cej R. leguminosarum bv. trifolii, bv. viciae i S. meliloti, jak równie¿ obserwowane
w grupie skupiaj¹cej m.in. R. leguminosarum bv. phaseoli i Bradyrhizobium [91];
– wystêpowanie tego samego plazmidu pSym, pochodz¹cego z R. leguminosarum bv. trifolii, w komórkach R. tropici i S. meliloti, zajmuj¹cych tê sam¹ co
R. leguminosarum bv. trifolii niszê ekologiczn¹ [78];
– badania genetyczne nad Rhizobium galegae wykazuj¹ce, ¿e jest to prawdopodobnie Agrobacterium (podobieñstwo sekwencji 16S rDNA) wyposa¿ony
w region symbiotyczny nod-nif rizobiów szybkorosn¹cych (R. leguminosarum
bv. trifolii, bv. viciae czy S. meliloti) [86];
– symbiotyczne wi¹zanie azotu przez Methylobacterium nodulans, Burkholderia sp. STM678 i STM815 czy Ensifer adhaerens, bêd¹ce wynikiem nabycia
przez te bakterie genów nod i nif [53, 68, 87].
Przeniesienie plazmidu symbiotycznego czêsto oznacza dla jego biorcy ca³kowit¹ zmianê behawioru – np. zmianê z patogena lub z bakterii ¿ywi¹cej siê innymi
bakteriami w symbionta roœlin [68, 86]. Z drugiej strony stwierdzono, ¿e niektóre z
cech bakterii opisywanych jako charakterystyczne dla patogena (a nie dla rizobiów)
utrzymuj¹ siê tak¿e u symbiotycznych rizobiów, jak np. synteza opin (typowa dla
komórek roœlinnych zaka¿onych przez Agrobacterium) obserwowana w brodawkach
korzeniowych indukowanych przez S. meliloti [54]. W genomie bakterii z rodzaju
Rhizobium stwierdzono równie¿ wystêpowanie genów koduj¹cych bia³ka nale¿¹ce
do III systemu sekrecyjnego (ang. type III secretion system, TTSS) [62, 93].
W sk³ad tego systemu wchodzi ca³y szereg bia³ek pozwalaj¹cych mikroorganizmom
na infekcjê komórek eukariotycznych, dlatego bia³ka TTSS wystêpuj¹ powszechnie
u wielu bakteryjnych patogenów roœlin i zwierz¹t [21, 92]. Na przyk³adzie bakteryjnych endosymbiontów owadów wykazano, ¿e prowadz¹ce do mutualizmu zacieœnianie symbiozy jest skorelowane z postêpuj¹c¹ redukcj¹ III systemu sekrecyjnego
– od zmniejszania aktywnoœci transkrypcyjnej genów koduj¹cych bia³ka TTSS po
ca³kowit¹ ich utratê [8]. Mo¿na wiêc przypuszczaæ, ¿e gatunki rizobiów uwa¿ane
obecnie za „typowe” i „modelowe” (jak np. Sinorhizobium meliloti), to bakterie
dawniej saprofityczne lub patogenne dla roœlin, a zmiana ich behawioru na dostosowany do warunków symbiozy nast¹pi³a stosunkowo niedawno w porównaniu do
czasu ewolucji gatunków bakterii.
Uwa¿a siê, ¿e wystêpuj¹ce obecnie geny nod i nif maj¹ monofiletyczne pochodzenie. Rizobia nale¿¹ce do linii ewolucyjnej, w której po raz pierwszy pojawi³ siê
zespó³ genów nod-nif otrzyma³y go w wyniku pionowego transferu genów, a rizobia
nale¿¹ce do linii, które uleg³y dywergencji przed pojawieniem siê zespo³u genów
nod-nif jako integralnej ca³oœci, naby³y go w wyniku transferu poziomego. Poniewa¿ proces ten trwa nadal, nale¿y spodziewaæ siê, ¿e grupa bakterii okreœlanych
mianem rizobiów bêdzie wzbogaca³a siê wci¹¿ o nowe gatunki, powsta³e w sposób
naturalny [53, 86, 87] lub sztuczny [68].
274
Przekazywanie plazmidów pSym nie jest jedyn¹ drog¹ rozprzestrzeniania siê
genów symbiotycznych w populacjach bakteryjnych. Na chromosomach szczepów
Mesorhizobium loti spotyka siê regiony DNA o wielkoœci oko³o 500–600 kb, zawieraj¹ce m.in. geny nod, nif oraz geny odpowiedzialne za syntezê biotyny, kwasu
nikotynowego i tiaminy, którego przekazanie do szczepu nieefektywnego w symbiozie powoduje jego zmianê w szczep efektywny. Region ten nazwany zosta³
wysp¹ symbiotyczn¹ (ang. symbiosis island), ze wzglêdu na uderzaj¹ce podobieñstwo do opisanych wczeœniej wysp patogenicznoœci (ang. pathogenicity islands)
wystêpuj¹cymi u bakterii chorobotwórczych. Podobnie jak wyspy patogenicznoœci,
równie¿ wyspy symbiotyczne charakteryzuje szereg specyficznych cech jak ró¿na
od reszty chromosomu zawartoœæ par G/C, mo¿liwoœæ przemieszczania siê na
drodze rekombinacji wynikaj¹ca z obecnoœci sekwencji IS i genów koduj¹cych
bia³ka homologiczne do integraz fagowych oraz przenoszenie zestawu genów
powoduj¹cych gwa³town¹ zmianê fenotypu biorcy umo¿liwiaj¹c¹ kolonizowanie
organizmu tkankowego [84, 85].
10. Bakterie i roœliny – ewolucja gatunków i ich wzajemnych oddzia³ywañ
Badania filogenezy poszczególnych linii ewolucyjnych zarówno mikro- jak i makrosymbiontów sugeruj¹, ¿e powstanie poszczególnych gatunków rizobiów znacznie
wyprzedzi³o ewolucjê gatunków ich roœlinnych gospodarzy. Uwa¿a siê, ¿e dywergencja pomiêdzy Bradyrhizobium a rizobiami szybkorosn¹cymi (Rhizobium, Sinorhizobium) nast¹pi³a 500–550 mln lat temu, po czym 200–300 mln lat temu dosz³o
do wyodrêbnienia poszczególnych gatunków rizobiów szybkorosn¹cych. Z drugiej
strony rozdzia³ roœlin na jedno- i dwuliœcienne zarysowa³ siê prawdopodobnie
150–170 mln lat temu, a wyodrêbnienie siê roœlin motylkowatych zasz³o oko³o
120–130 mln lat temu. Dopiero ten fakt pozwoli³ na szybk¹ ewolucjê regionu genów
nod-nif, opart¹ o ich jednoczesne rozprzestrzenianie siê w istniej¹cych gatunkach bakterii i dopasowywanie ich funkcji do postêpuj¹cej ewolucji roœlin motylkowatych [90].
Istniej¹ równie¿ dowody przemawiajace na korzyœæ hipotezy, która zak³ada
istnienie znacznie starszych powi¹zañ bakterii – przodków rizobiów z eukariontami. Analiza sekwencji wspomnianego ju¿ genu syntetazy glutaminowej wykaza³a,
¿e enzym ten, uwa¿any za bardzo dobry „zegar molekularny” pozwalaj¹cy na odtworzenie jego ewolucji do oko³o 2,5 mld lat wstecz, wystêpuje w dwóch ró¿nych
formach: GSI i GSII. Forma GSI spotykana jest w komórkach bakterii, GSII w komórkach eukariontów, a oba typy enzymu razem jedynie w komórkach Rhizobium.
Filogeneza GSI rizobiów jest zgodna z filogenez¹ ich 16S rRNA. Brak zgodnoœci
filogenezy GSII z filogenez¹ 16S rRNA pozwala na przypuszczenie, ¿e rizobia
otrzyma³y ten gen od eukariontów na drodze poziomego transferu, i mia³o to miejsce
oko³o 1,2 mld lat temu. Byæ mo¿e ju¿ wtedy dochodzi³o do tworzenia zwi¹zków
pomiêdzy zdolnymi do redukcji azotu przodkami dzisiejszych rizobiów i prymitywnymi organizmami eukariotycznymi [64, 90], chocia¿ nie by³a to symbioza
realizowana w brodawkach korzeniowych.
275
11. „Œlepe uliczki ewolucji” – zjawisko niezgodnoœci uniemo¿liwiaj¹ce
nawi¹zanie symbiozy pomiêdzy rizobiami a roœlinami motylkowatymi
Symbioza pomiêdzy diazotrofami i roœlinami istnieje dziêki predyspozycji roœlin
do reakcji na bakteryjne morfogeny, prowadz¹cej do wytworzenia brodawek, oraz
dziêki wykorzystaniu zdolnoœci rizobiów do kolonizacji tkanek roœlinnych i redukcji azotu atmosferycznego. W uk³adach symbiotycznych pomiêdzy rizobiami a roœlinami motylkowatymi zazwyczaj dochodzi do zrealizowania obu tych aktywnoœci.
Tym niemniej opisano szereg przyk³adów wskazuj¹cych, ¿e w obrêbie gatunku,
pomiêdzy poszczególnymi szczepami bakteryjnymi lub odmianami roœlin istniej¹
drobne, lecz istotne ró¿nice genetyczne, uniemo¿liwiaj¹ce nawi¹zanie efektywnej
symbiozy. Przyk³adami takiego zjawiska mog¹ byæ:
– opornoœæ Trifolium subterraneum cv. Woogenellup (koniczyna œródziemnomorska) na zaka¿enie przez R. leguminosarum bv. trifolii ANU794 [9];
– opornoœæ Trifolium subterraneum cv. Woogenellup na zaka¿enie przez R. leguminosarum bv. trifolii TA1, prawdopodobnie spowodowana wystêpowaniem
pojedynczego genu roœlinnego oraz genu nodM w genomie bakterii [38];
– opornoœæ Pisum sativum cv. Afghanistan (groch zwyczajny) posiadaj¹cego
unikalny allel sym2A, na zaka¿enie szczepami pozbawionymi genu nodX [28];
– utrata zdolnoœci grochu do efektywnej symbiozy z naturalnym endosymbiontem R. leguminosarum bv. viciae TOM, w przypadku zmiany iloœci produkowanych przez ten szczep specyficznych morfogenów [28];
– opornoœæ odmian Vicia faba (bób) posiadaj¹cych allele sym-2 i sym-3 na zaka¿enie przez niektóre szczepy takie jak R. leguminosarum bv. viciae St48 czy
St53 [16];
– istnienie niezgodnoœci uniemo¿liwiaj¹cej zaka¿enie izolowanych geograficznie odmian Medicago truncatula okreœlonymi szczepami Sinorhizobium meliloti (brak mo¿liwoœci wzajemnej wymiany gospodarzy i mikrosymbiontów pochodz¹cych z ró¿nych siedlisk) [89];
– zjawisko fenotypowego zró¿nicowania populacji Amphicarpaea (gospodarza
Bradyrhizobium) i jego mikrosymbionta [96], zale¿ne od zdolnoœci do produkcji rizobiotoksyny przez Bradyrhizobium i wra¿liwoœci/opornoœci na rizobiotoksynê w ró¿nych odmianach i populacjach roœlin [12, 61].
Wymienione przypadki niezgodnoœci dotycz¹ce okreœlonych odmian roœlin
i szczepów bakteryjnych kontrastuj¹ z ogóln¹ zgodnoœci¹ obserwowan¹ na poziomie gatunków. Niezgodnoœci te wynikaj¹ z obecnoœci lub braku pojedynczych
genów lub ich alleli, a zasiêg zjawiska ogranicza siê do wybranych populacji danego
gatunku. Z tego powodu populacje roœlinne ró¿nicuje siê na niewyspecjalizowane
pod wzglêdem symbiotycznym (ang. symbiotic generalists), nawi¹zuj¹ce symbiozê
z wiêkszoœci¹ szczepów danego gatunku bakterii, oraz na symbiotycznie wyspecjalizowane (ang. symbiotic specialists), wchodz¹ce w symbiozê jedynie z wybranymi
szczepami. Z kolei w przypadku bakterii wyró¿nia siê o szczepy o szerokim zakresie gospodarza (ang. broad host range), zaka¿aj¹ce wiêkszoœæ populacji danego
gatunku roœlin, ró¿ne gatunki a nawet rodzaje roœlin. Natomiast mianem szczepów
276
o w¹skim zakresie gospodarza (ang. narrow host range), okreœla siê szczepy zaka¿aj¹ce jedynie niewielk¹ liczbê odmian danego gatunku lub pojedyncze gatunki roœlin.
Zjawisko niezgodnoœci obserwowane jest najczêœciej w przypadku zetkniêcia siê
bakteryjnego szczepu o w¹skim zakresie gospodarza z symbiotycznie wyspecjalizowan¹ odmian¹ roœlin [96].
12. Symbiotyczne wi¹zanie azotu – perspektywy
Zdolnoœæ rizobiów do kolonizacji tkanek roœlinnych i przeprowadzania w nich
redukcji azotu atmosferycznego nie ogranicza siê do gatunków rodziny Leguminoseae zdolnych do tworzenia brodawek. Obecnoœæ diazotrofów wi¹¿¹cych azot
atmosferyczny stwierdzono równie¿ w tkankach korzeni roœlin motylkowatych niezdolnych do tworzenia brodawek [4]. Ponadto zarejestrowano szereg przypadków
kolonizacji przez rizobia korzeni roœlin spoza rodziny Leguminoseae. Stwierdzono:
РobecnoϾ R. leguminosarum bv. trifolii na powierzchni korzeni pszenicy czy
kukurydzy [74];
– kolonizacjê korzeni ry¿u przez R. leguminosarum bv. trifolii [67, 98];
РobecnoϾ Rhizobium etli w tkankach kukurydzy [24];
– symbiozê pomiêdzy roœlinami ry¿u a Bradyrhizobium [6].
Efekt kolonizacji uzale¿niony jest od wspó³dzia³ania danego szczepu bakteryjnego
i okreœlonej odmiany roœlin. Decyduj¹c¹ rolê odgrywa fakt d³ugotrwa³ego bytowania roœlin i potencjalnych bakteryjnych endosymbiontów we wspólnym œrodowisku.
W przypadku Rhizobium i ry¿u bakterie mog¹ wystêpowaæ w przestworach miêdzykomórkowych oraz w zlizowanych komórkach gospodarza, co wywo³uje indukcjê
reakcji obronnych roœlin, manifestuj¹cych siê jako wytwarzanie pogrubionych œcian
celulozowych w komórkach kory korzenia [67]. W przypadku d³ugiego i powtarzanego kontaktu R. leguminosarum bv. trifolii z roœlinami ry¿u (np. wskutek stosowania
p³odozmianu ry¿ – koniczyna) mo¿na doprowadziæ do sytuacji, w której bakterie staj¹
siê endosymbiontami ry¿u [98]. Podobny mechanizm obserwuje siê w uk³adzie R. etli
– kukurydza, który wyewoluowa³ w wyniku d³ugotrwa³ego stosowania w bezpoœrednim s¹siedztwie upraw fasoli i kukurydzy [24]. Z kolei zdolnoœæ Bradyrhizobium do
symbiozy z wybranymi odmianami ry¿u pojawi³a siê w wyniku dostosowania bakterii
do wspó³¿ycia z dzikimi odmianami ry¿u (Oryza brevilingulata) spotykanymi na tych
samych terenach co Aeschynomene (naturalny symbiont fotosyntetyzuj¹cych bradyrizobiów) [19], po czym zdolnoœæ ta zosta³a zaadaptowana do potrzeb uk³adu Bradyrhizobium – uprawne odmiany ry¿u (Oryza glaberriana) [6].
W wiêkszoœci opisywanych przypadków bakterie s¹ endosymbiontami wspomagaj¹cymi wzrost roœlin (ang. PGPR, plant growth promoting rhizobacteria), nie
dostarczaj¹cymi gospodarzom zwi¹zków azotu [24, 98]. Jednak w pewnych okolicznoœciach diazotrofy kolonizuj¹ce korzenie roœlin niezdolnych do wytworzenia
brodawek s¹ zdolne do redukcji N2 przeznaczonego na potrzeby roœlin [6, 29, 30].
Obserwowane dynamiczne przystosowywanie siê rizobiów do kolonizacji systemów korzeniowych i nawi¹zywania symbiozy z nowymi gatunkami roœlin jest
277
wyraŸnym przyk³adem ukazuj¹cym ci¹g³oœæ procesu ewolucji i powszechnoœæ adaptacji gatunków do zmieniaj¹cych siê warunków œrodowiskowych. Byæ mo¿e jesteœmy œwiadkami kolejnego rozszerzania zasiêgu uk³adu symbiotycznego z udzia³em
roœlin i diazotrofów – tym razem o roœliny jednoliœcienne [29, 81]. Jednak na razie
musi pozostaæ bez odpowiedzi pytanie o koñcowy (ewolucyjnie stabilny) efekt tych
procesów – czy dojdzie do wytworzenia struktur analogicznych do brodawek korzeniowych np. u roœlin zbo¿owych, czy te¿ bêdzie to symbioza realizowana w innych
ni¿ brodawki zespo³ach tkanek roœlinnych.
Podsumowanie
Proces biologicznego wi¹zania azotu pojawi³ siê na Ziemi ponad 2 mld lat temu.
Od tego czasu ulega ci¹g³ej ewolucji, podobnie jak wci¹¿ ewoluuj¹ mikroorganizmy
redukuj¹ce azot cz¹steczkowy. Zjawisko to doprowadzi³o do powstania licznych
odmian procesu biologicznego wi¹zania azotu.
Najstarsz¹ form¹ wi¹zania azotu jest niesymbiotyczna redukcja N2 wystêpuj¹ca
u wolno¿yj¹cych archebakterii, sinic i bakterii w³aœciwych. Ewolucja l¹dowych roœlin
nasiennych i ich powszechna predyspozycja do wchodzenia w symbiozê z mikroorganizmami, szczególnie z grzybami, pozwoli³a na powstanie bardzo wydajnych
uk³adów symbiotycznych z udzia³em roœlin i bakterii.
Wytworzenie prawid³owo funkcjonuj¹cych uk³adów symbiotycznych wymaga
zaanga¿owania informacji genetycznej pochodz¹cej z trzech odrêbnych, posiadaj¹cych w³asn¹ filogenezê Ÿróde³: genomu roœlinnego, genomu bakteryjnego i regionu
nod-nif. Spoœród nich najaktywniej wspó³dzia³aj¹ ze sob¹ (poprzez interakcje fenotypów) genom roœlinny i region nod-nif, natomiast genom bakteryjny odgrywa drugoplanow¹ rolê. Region nod-nif jest bardzo mobilny, a dziêki mo¿liwoœci poziomego
transferu grupa diazotroficznych mikrosymbiontów roœlin wci¹¿ siê powiêksza.
Piœmiennictwo
1. Bergman B., Matveyev A., Rasmussen U.: Chemical signalling in cyanobacterial-plant symbioses. Trends Plant Sci. 1, 191–197 (1996)
2. Blauenfeldt J., Joshi P.A., Gresshoff P.M., Caetano-Anollés G.: Nodulation of white clover
(Trifolium repens) in the absence of Rhizobium. Protoplasma, 179, 106–110 (1994)
3. Brom S., de los Santos A.G., de Lourdes-Girard, Davilla G., Palacios R., Romero D.: High-frequency rearrangements in Rhizobium leguminisarum bv. trifolii plasmids. J. Bacteriol. 173,
1344–1346 (1991)
4. Bryan J.A., Berlyn G.P., Gordon J.C.: Toward a new concept of the evolution of symbiotic nitrogen fixation in the Leguminoseae. Plant Soil, 18, 151–159 (1996)
5. Burris R.H., Roberts G.P.: Biological nitrogen fixation. Annu. Rev. Nutr. 13, 317–335 (1993)
6. Chaintreuil C., Giraud E., Prin Y., Lorquin J., Bâ A., Gillis M., de Lajudie P., Dreyfus B.: Photosynthetic bradyrhizobia are natural endophytes of the African wild rice Oryza breviligulata. Appl.
Environ. Microbiol. 6, 5437–5447 (2000)
7. Chien Y.T., Auerbuch V., Brabban A.D., Zinder S.H.: Analysis of genes encoding an alternative
nitrogenase in the archaeon Methanosarcina barkeri 227. J. Bacteriol. 182, 3247–3253 (2000)
278
8. Dale C., Plague G.R., Wang B., Ochman H., Moran N.A.: Type III secretion system and the evolution of mutualistic endosymbiosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12397–12402 (2002)
9. de Boer M.H., Djordjevic M.A.: The inhibition of infection thread development in the cultivarspecific interaction of Rhizobium and subterranean clover is not caused by a hypersensitive
response. Protoplasma, 185, 58–71 (1995)
10. Doyle J.J.: Phylogenetic perspectives on nodulation: evolving views of plants and symbiotic bacteria. Trends Plant Sci. 3, 473–478 (1998)
11. Doyle J.J., Doyle J.L., Ballenger J.A., Dickson E.E., Kajita T., Ohashi H.: A phylogeny of the
chloroplast gene rbcL in the Leguminoseae: taxonomic correlations and insights into the evolution of nodulation. Am. J. Bot. 84, 541–554 (1997)
12. Duodu S., Bhuvaneswari T.V., Stokkermans T.J.W., Peters N.K.: A positive role for rhizobiotoxine in Rhizobium-legume symbiosis. Mol. Plant-Microbe Interact. 12, 1082–1089 (1999)
13. Eardly B.D., Wang F.S., van Berkum P.: Corresponding 16S rRNA gene segments in Rhizobiaceae
and Aeromonas yield discordant phylogenies. Plant Soil, 186, 69–74 (1996)
14. Elbeltagy A., Nishioka K., Sato T., Suzuki H., Ye B., Hamada T., Isawa T., Mitsui H., Minamisawa K.: Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillum sp. isolated
from wild rice species. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5285–5293 (2001)
15. Endre G., Kereszt A., Kevei Z., Mihacea S., Kalo P., Kiss B.G.: A receptor kinase gene regulating
symbiotic nodule development. Nature, 417, 962–966 (2002)
16. Esser-Mönning K., Roskothen P., Röbbelen G.: Two host genes in Vicia faba for nodulation defficiency with strain specifity for Rhizobium leguminosarum. Plant Bred. 114, 363–365 (1995)
17. Estrada-De Los Santos P., Bustillos-Cristales R., Caballero-Mellado J.: Burkholderia, a genus
rich in plant – associated nitrogen fixers with wide environmental and geographic distribution.
Appl. Environ. Microbiol. 67, 2790–2798 (2001)
18. Fanni R., Gallo R., Lio P.: Molecular evolution of nitrogen fixation: the evolutionary history of
the nifD, nifK, nifE and nifN genes. J. Mol. Evol. 51, 1–11 (2000)
19. Fleischman D., Kramer D.: Photosynthetic rhizobia. Biochim. Biophys. Acta, 1364, 17–36 (1998)
20. Flores M., Gonzalez V., Pardo M.A., Leija A., Martínez E., Romero D., Piñero D., Dávila G.,
Palacios R.: Genomic instability in Rhizobium phaseoli. J. Bacteriol. 170, 1191–1196 (1988)
21. Foultier B., Troisfontaines P., Muller S., Opperdoes F.R., Cornelis G.R.:Characterization of the
ysa pathogenicity locus in the chromosome of Yersinia enterocolitica and phylogeny analysis of
type III secretion system. J. Mol. Evol. 55, 37–51 (2002)
22. Fuentes-Ramirez L.E., Bustillos-Critales R., Tapia-Hernandez A., Jimenez-Salgado T., Wang E.T.,
Martinez-Romero E., Caballero-Mellado J.: Novel nitrogen-fixing acetic acid bacteria, Glukonacetobacter johannae sp. nov. and Glukonacetobacter azotocaptans sp. nov., associated with
coffee plants. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1305–1314 (2001)
23. Grosjean C., Huguet T.: A persistent meristem is formed in nodular structures elicited by Nod
factor or by a Rhizobium meliloti exopolysaccharide mutant in alfalfa plants which nodulate
spontaneously. Plant Sci. 127, 215–225 (1997)
24. Gutirrez-Zamora M.L., Martinez-Romero E.: Natural endophytic association between Rhizobium
etli and maize (Zea mays L.). J. Biotechnol. 91, 117–126 (2001)
25. Heard J., Caspi M., Dunn K.: Evolutionary diversity of symbiotically induced nodule MADS-box
genes: characterization of nmhC5, a member of a novel subfamily. Mol. Plant-Microbe Interact.
10, 665–676 (1997)
26. Heard J., Dunn K.: Symbiotic induction of a MADS-box gene during development of alfalfa root
nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5273–5277 (1995)
27. Hirsch A., Kapulnik Y.: Signal transduction pathways in mycorrhizal associations: comparisons
with the Rhizobium-legume symbiosis. Fungal Genet. Biol. 23, 205–212 (1998)
28. Hogg B., Davies A.E., Wilson K.E., Bisseling T., Downie A.: Competitive nodulation blocking of
cv. Afghanistan pea is related to high levels of nodulation factors made by some strains of Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Mol. Plant-Microbe Interact. 15, 60–68 (2002)
29. Hurek T., Handley L.L., Reinhold-Hurek B., Piche Y.: Azoarcus grass endophytes contributes fixed
nitrogen to the plant in an unculturable state. Mol. Plant-Microbe Interact. 15, 233–242 (2002)
279
30. James E.K.: Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis. Field Crops Research,
65, 197–209 (2000)
31. Kessler P.S., McLarnan J., Leigh J.A.: Nitrogenase phylogeny and the molybdenum dependence
of nitrogen fixation in Methanococcus maripaludis. J. Bacteriol. 179, 541–543 (1997)
32. Kim J., Rees D.C.: Nitrogenase and biological nitrogen fixation. Biochemistry, 33, 389–397 (1994)
33. Krug E.C., Winstanley D.: The need for comprehensive and consistent treatment of the nitrogen
cycle in nitrogen cycling and mass balance studies: I. Terrestial nitrogen cycle. Sci. Total Environ.
293, 1–29 (2002)
34. Kuhner C.H., Matthies C., Acker G., Schmittroth M., Gossner A.S., Drake H.L.: Clostridium
akagii sp. nov. and Clostridium acidisoli sp. nov.: acid-tolerant, N2-fixing clostridia isolated from
acidic forest soil and litter. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 873–881 (2000)
35. Laguerre G., Nour S.M., Macheret V., Sanjuan J., Drouin P., Amarger N.: Classification of rhizobia based on nodC and nifH gene analysis reveals a close phylogenetic relationship among
Phaseolus vulgaris symbionts. Microbiology, 147, 981–993 (2001)
36. Leigh J.A.: Nitrogen fixation in methanogenes: the archaeal perspective. Curr. Issues Mol. Biol.
2, 125–131 (2000)
37. Levine J.S., Augustsson T.R., Anderson I.C., Hoell J.M. Jr.: Troposferic sources of NO x: lightning
and biology. Atmos. Environ. 18, 1797–1804 (1984)
38. Lewis-Henderson W.R., Djordjevic M.A.: A cultivar-specific interaction between Rhizobium
leguminosarum bv. trifolii and subterranean clover is controlled by nodM, other bacterial cultivar
specificity genes, and a single recessive host gene. J. Bacteriol. 173, 2791–2799 (1991)
39. Lilburn T.G., Kim K.S., Ostrom N.E., Byzek K.R., Leadbetter J.R., Breznak J.A.: Nitrogen fixation by symbiotic and free-living spirochetes. Science, 292, 2495–2498 (2001)
40. Loveless T.M., Bishop P.E.: Identification of genes unique to Mo-independent nitrogenase systems in diverse diazotrophs. Can. J. Microbiol. 45, 312–317 (1999)
41. Loveless T.M., Saah J.R., Bishop P.E.: Isolation of nitrogen-fixing bacteria containing molybdenum-independent nitrogenases from natural environments. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4223–4226
(1999)
42. Magalhaes Cruz L., de Souza E.M., Weber O.B., Baldani J.I., Dobereiner J., Pedrosa Fde O.: 16S
ribosomal DNA characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated from banana (Musa spp.)
and pineapple (Ananas comosus (L.) Merril). Appl. Environ. Microbiol. 67, 2375–2379 (2001)
43. Mancinelli R.L.: The nature of nitrogen: an overview. Life Support Biosph. Sci. 3, 17–24 (1996)
44. Mancinelli R.L., McKay C.P.: The evolution of nitrogen cycling. Orig. Life Evol. Biosph. 18,
311–325 (1988)
45. Mandermack K.W., Kinney C.A., Coleman D., Huang Y.S., Freeman K.H., Bogner J.: The biogeochemical controls of N2O production and emission in landfill cover soils: the role of methanotrophs in the nitrogen cycle. Environ. Microbiol. 2, 298–309 (2000)
46. Maynard Smith J., Smith N.H., O’Rourke M., Spratt B.G.: How clonal are bacteria? Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90, 4384–4388 (1993)
47. McIver J., Djordjevic M.A., Weinman J.J., Rolfe B.G.: Influence of Rhizobium leguminosarum
bv. trifolii host specific nodulation genes on the ontogeny of clover nodulation. Protoplasma,
172, 166–179 (1993)
48. Mercado-Blanco J., Toro N.: Plasmids in rizobia: the role of nonsymbiotic plasmids. Mol. PlantMicrobe Interact. 9, 535–545 (1996)
49. Mergaert P., van Montagu M., Holsters M.: Molecular mechanisms for Nod factor diversity. Mol.
Microbiol. 25, 811–817 (1997)
50. Merrick M.J.: Nitrogen control of the nif regulon in Klebsiella pneumoniae: involvement of the
ntrA gene and analogies between ntrC and nifA. EMBO J. 2, 39–44 (1983)
51. Minerdi D., Fani R., Gallo R., Boarino A., Bonfante P.: Nitrogen fixation genes in endosymbiotic
Burkholderia strain. Appl. Environ. Microbiol. 67, 725–732 (2001)
52. Monserrate E., Leschine S.B., Canale-Parola E.: Clostridium hungatei sp. nov., a mesophilic,
N2-fixing cellulolytic bacterium isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 123–132 (2001)
280
53. Moulin L., Munive A., Dreyfus B., Boivin-Masson C.: Nodulation of legumes by members of
$-subclass of Proteobacteria. Nature, 411, 948–950 (2001)
54. Murphy P.J., Heycke N., Banfalvi Z., Tate M.E., de Brujin F., Kondorosi A., Tempe J., Schell J.:
Genes for catabolism and synthesis of an opine-like compound in Rhizobium meliloti are closely
linked and on the Sym plasmid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 493–497 (1987)
55. Münster T., Pahnke J., di Rosa A., Kim J.T., Martin W., Saedler H., Theissen G.: Floral homeotic
genes were recruited from homologous MADS-box genes preexisting in the common ancestor of
ferns and seed plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2415–2420 (1997)
56. Navarro-Gonzalez R., McKay C.P., Mvondo D.N.: A possible nitrogen crisis for Archaean life
due to reduced nitrogen fixing by lightning. Nature, 412, 61–64 (2001)
57. Noda S., Ohkuma M., Usami R., Horikoshi K., Kudo T.: Culture-independent characterization of
a gene responsible for nitrogen fixation in the symbiotic microbial community in the gut of the
termite Neotermes koshunensis. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4935–4942 (1999)
58. Ohkuma M., Noda S., Kudo T.: Phylogenetic diversity of nitrogen fixation genes in the symbiotic
microbial community in the gut of diverse termites. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4926–4934
(1999)
59. Olson J.B., Steppe T.F., Litaker R.W., Paerl H.W.: N2-fixing microbial consortia associated with
the ice cover of Lake Bonney, Antarctica. Microb. Ecol. 36, 231–238 (1998)
60. Orgambide G.G., Philip-Hollingsworth S., Hollingsworth R.I., Dazzo F.B.: Flavone-enhanced
accumulation and symbiosis-related biological activity of a diglycosyl diacylglicerol membrane
glycolipid from Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. J. Bacteriol. 176, 4338–4347 (1994)
61. Parker M.A., Peters N.K.: Rhizobiotoxine production and symbiotic compatibility of Bradyrhizobium from Asian and North American lineages of Amphicarpaea. Can. J. Microbiol. 47,
889–894 (2001)
62. Perret X., Freiberg C., Rosenthal A., Broughton W.J., Fellay R.: High-resolution transcriptional
analysis of the symbiotic plasmid of Rhizobium sp. NGR234. Mol. Microbiol. 32, 415–425 (1999)
63. Perret X., Staehlin C., Broughton W.: Molecular basis of symbiotic promiscuity. Microbiol. Mol.
Biol. Rev. 64, 180–201 (2000)
64. Pesole G., Bozzetti M.P., Lanave C., Preparata G., Saccone C.: Glutamine synthetase gene evolution: a good molecular clock. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 522–526 (1991)
65. Rasmussen U., Johansson C., Renglin A., Petersson C., Bergman B.: A molecular characterization of the Gunnera-Nostoc symbiosis: comparison with Rhizobium- and Agrobacterium-plant
interactions. New Phytol. 133, 391–398 (1996)
66. Remy W., Taylor T.N., Hass H., Kerp H.: Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular
mycorrhizae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11841–11843 (1994)
67. Reddy P.M., Ladha J.K., So R.B., Hernandez R.J., Ramos M.C., Angeles O.R., Dazzo F.B., de
Brujin F.J.: Rhizobial communication with rice roots: induction of phenotypic changes, mode of
invasion and extent of colonization. Plant Soil, 194, 81–98 (1997)
68. Rogel M.A., Hernández-Lucas I., Kuykendall L.D., Balkwill D.L., Martinez-Romero E.: Nitrogen-fixing nodules with Ensifer adhaerens harboring Rhizobium tropici symbiotic plasmids. Appl.
Environ. Microbiol. 67, 3264–3268 (2001)
69. Romero D., Davilla G., Palacios R.: The dynamic genome of Rhizobium. (w:) Bacterial genomes:
physical structure and analysis. Chapman & Hall, Int. Thomson Publ. 1998
70. Ruiz-Lozano J.M., Roussel H., Gianinazzi S., Gianinazzi-Pearson V.: Defense genes are differentially induced by a mycorrhizal fungus and Rhizobium sp. in wild-type and symbiosis-defective
pea genotypes. Mol. Plant-Microbe Interact. 12, 976–984 (1999)
71. Saleena L.M., Loganathan P., Rangarajan S., Nair S.: Genetic diversity of Bradyrhizobium strains
isolated from Arachis hypogaea. Can. J. Microbiol. 47, 118–122 (2001)
72. Sanudo-Wilhelmy S.A., Kustka A.B., Gobler C.J., Hutchins D.A., Yang M., Lwiza K., Burns J.,
Capone D.G., Raven J.A., Carpenter E.J.: Phosphorus limitation of nitrogen fixation by Trichodesmium in the central Atlantic Ocean. Nature, 411, 66–69 (2001)
73. Schlegel H.G.: Mikrobiologia ogólna. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 2000
281
74. Schloter M., Wiehe W., Assmus B., Steindl H., Becke H., Höflich H., Hartmann A.: Root colonization of different plants by plant-growth-promoting Rhizobium leguminosarum bv. trifolii R39
studied with monospecific polyclonal antisera. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2038–2046 (1997)
75. Shirtliffe S.J., Vessey J.K.: A nodulation (Nod+/Fix–) mutant of Phaseolus vulgaris L. has nodulelike structures lacking peripheral vascular bundles (Pvb–) and is resistant to mycorrhizal infection
(Myc–). Plant Sci. 118, 209–220 (1996)
76. Siemann S., Schneider K., Drottboom M., Muller A.: The Fe-only nitrogenase from Rhodobacter
capsulatus: a coparative study on the redox properties of metal clusters present in the dinitrogenase components. Eur. J. Biochem. 269, 1650–1661 (2002)
77. Singleton P.: Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa
2000
78. Sivakumaran S., Lockhart P.J., Jarvis B.D.W.: Identification of soil bacteria expressing a symbiotic plasmid from Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. Can. J. Microbiol. 43, 164–177 (1997)
79. Soltis D.E., Soltis P.S., Morgan D.R., Swensen S.M., Mullin B.C., Dowd J.M., Martin P.G.:
Chloroplast gene sequence data suggest a single origin of the predisposition for symbiotic nitrogen fixation in angiosperms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2647–2651 (1995)
80. Spaink H.P.: Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria. Annu. Rev.
Microbiol. 54, 257–88 (2000)
81. Steenhoudt O., Vanderleyden J.: Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely
associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects. FEMS Microbiol. Rev. 24,
487–506 (2000)
82. Stêpkowski T., Legocki A.B.: Reduction of bacterial genome size and expansion resulting from
obligate intracellular lifestyle and adaptation to soil habitat. Acta Biochim. Polon. 48, 367–381
(2001)
83. Stracke S., Kistner C., Yoshida S., Mulder L., Sato S., Kaneko T., Tabata S., Sandal N., Stiugaard
J., Szczyglowski K., Parniske M.: A plant receptor-like kinase required for both bacterial and
fungal symbiosis. Nature, 417, 959–962 (2002)
84. Sullivan J.T., Ronson C.W.: Evolution of rhizobia by acquisiting of a 500-kb symbiosis island
that integrates into a phe-tRNA gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5145–5149 (1998)
85. Sullivan J.T., Trzebiatowski J.R., Cruickshank R.W., Gouzy J., Brown D.S., Elliot R.M.,
Fleetwood D.J., McCallum N.G., Rossbach U., Stuart G.S., Weaver J.E., Webby R.J., de Brujin F.J.,
Ronson C.W.: Comparative sequence analysis of the symbiosis island of Mesorhizobium loti strain
R7A. J. Bacteriol. 184, 3086–3095 (2002)
86. Suominen L., Roos C., Lortet G., Paulin L., Lindström K.: Identification and structure of Rhizobium galegae common nodulation genes: evidence for horizontal gene transfer. Mol. Biol. Evol.
18, 907–916 (2001)
87. Sy A., Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A., de Laudje P., Prin Y., Neyra M., Gillis M.,
Boivin-Masson C., Dreyfus B.: Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and fix
nitrogen in symbiosis with legumes. J. Bacteriol. 183, 214–220 (2001)
88. Tesfaye M., Petersen D.J., Holl F.B.: Comparison of partial 23S rDNA sequences from Rhizobium species. Can. J. Microbiol. 43, 526–533 (1997)
89. Trichine L., de Billy F., Huguet T.: Mtsym6, a gene conditioning Sinorhizobium strain-specific
nitrogen fixation in Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 845–851 (2000)
90. Turner S.L., Young P.W.: The glutamine synthetases of Rhizobia: phylogenetics and evolutionary
implications. Mol. Biol. Evol. 17, 309–319 (2000)
91. Ueda T., Suga Y., Yahiro N., Matsuguchi T.: Phylogeny of Sym plasmids of rhizobia by PCRbased sequencing of a nodC segment. J. Bacteriol. 177, 468–472 (1995)
92. Van Sluys M.A., Monteiro-Vitorello C.B., Camargo L.E., Menck C.F., da Silva A.C., Ferro J.A.,
Oliveira M.C., Setubal J.C., Kitajima J.P., Simpson A.J.: Comparative genomic analysis of plantassociated bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 40, 169–189 (2002)
93. Viprey V., del Greco A., Golinowski W., Broughton W.J., Perret X.: Symbiotic implications of
type III protein secretion machinery in Rhizobium. Mol. Microbiol. 28, 1381–1389 (1998)
282
94. Wernergreen J.J., Harding E.E., Riley M.A.: Rhizobium gone native: unexpected plasmid stability of indigenous Rhizobium leguminosarum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 5483–5488 (1997)
95. Wernegreen J.J., Riley M.A.: Comparison of the evolutionary dynamics of symbiotic and housekeeping loci: a case for the genetic coherence of rhizobial lineages. Mol. Biol. Evol. 16, 98–113
(1999)
96. Wilkinson H.H., Parker M.A.: Symbiotic specialization and the potential for genotypic coexistence in a plant-bacterial mutualism. Oecologia, 108, 361–367 (1996)
97. Wong F.C., Meeks J.C.: Establishment of a functional symbiosis between the cyanobacterium
Nostoc punctiforme and the bryophyte Anthoceros punctatus requires genes involved in nitrogen control and initiation of heterocyst differentiation. Microbiology, 148, 315–323 (2002)
98. Yanni Y.G., Rizk R.Y., Corich V., Squartini A., Ninke K., Philip-Hollingsworth S., Orgambide G.,
de Brujin F., Stolzfus J., Buckley D., Schmidt T.M., Mateos P.F., Ladha J.K., Dazzo F.B.: Natural
endophytic association between Rhizobium leguminosarum bv. trifolii and rice roots and assssment
of its potential to promote rice growth. Plant Soil, 194, 99–114 (1997)
99. Young J.M., Kuykendall L.D., Martinez-Romero E., Kerr A., Sawada H.: A revision of Rhizobium Frank 1889, with an emended description of the genus, and the inclusion of all species of
Agrobacterium Conn 1942 and Allorhizobium undicola de Lajudie et al. 1998 as new combination: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubri, R. undicola and R. vitis. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 51, 89–103 (2001)
100. Zuchcero J.C., Caspi M., Dunn K.: ngl9: a third MADS-box gene expressed in alfalfa root nodules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 1463–1467 (2001).
Praca wykonana ze œrodków Komitetu Badañ Naukowych
w ramach grantu badawczego nr 6 PO4A 058 18.
Zak³ad Mikrobiologii Ogólnej
Instytut Mikrobiologii i Biotechnologii
Uniwersytetu Marii Curie-Sk³odowskiej
ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin
Wp³ynê³o w styczniu 2003 r.
283
POST. MIKROBIOL.,
2003, 42, 3, 285–300
http://www.pm.microbiology.pl
ORGANIZACJA, FUNKCJA
I FILOGENEZA BAKTERYJNEGO
SYSTEMU NAPRAWY
B£ÊDNIE SPAROWANYCH ZASAD W DNA
Adam Jaworski, Liliana Serweciñska, Pawe³ St¹czek
1. Wprowadzenie. 2. Ogólna organizacja i funkcja systemu MMR. 3. Charakterystyka genów i bia³ek
naprawczych uk³adu MMR. 4. Udzia³ systemu MMR w innych, molekularnych procesach komórkowych. 5. System MMR w œwietle osi¹gniêæ genomiki bakterii
Organization, function and phylogeny of the DNA mismatch repair system in bacteria
Abstract: The postreplication mismatch repair system (MMR) is evolutionarily conserved and stabilizes the cellular genome by correcting DNA replication errors. The methyl-directed Mut HSL pathway is able to recognize and repair all base-base mismatches (except C/C) and small insertion/deletion mismatches that arise during DNA replication. The MMR enzymes protect the cell against mutations as well as interspecies recombination, whereas the SOS response increases both. There is the
wide range of effects that MMR can exert ; the VSP (Very Short Pathway) and TCR (TranscriptionCoupled Nucleotide-Excision Repair) systems of Escherichia coli are strongly stimulated or
supported by the MMR factors MutS and MutL but not by MutH. MMR factors are required for the
repair of mismatches in heteroduplex DNA that form as a result of interspecies recombination
between divergent DNA sequences. In addition, MutH,S,L proteins play an important role in
rearragement of chromosomal DNA subsequent to strand-slippage mutagenesis of tandemly repeated
sequences, and can act to prevent interchromosomal exchanges between homologous DNAs. The
multiple homologues of bacterial MutS and MutL exist in eukaryotes but play different roles in
the MMR pathway or in recombination.
1. Introduction. 2. General organization and function of MMR system. 3. Characteristics of genes
and repair proteins of MMR. 4. Contribution of MMR to the other molecular processes in the cell.
5. MMR system in the light of bacterial genomics achievements
1. Wprowadzenie
Filogenetyczny rozwój wszystkich organizmów ¿ywych, w tym bakterii, jest determinowany okreœlonym stanem równowagi miêdzy aktywnoœci¹ komórkowych
mechanizmów utrzymuj¹cych integralnoœæ genomów a tempem mutacji wprowadzanych przez zewn¹trz- i wewn¹trzkomórkowe czynniki mutagenne, które nieprzerwanie dzia³aj¹c na materia³ genetyczny ka¿dej komórki, z jednej strony generuj¹
dostateczny stopieñ zmiennoœci mutacyjnej i fizjologicznej, konieczny dla adaptacji
do ró¿norodnych warunków œrodowiska, z drugiej zaœ zagra¿aj¹ prawid³owemu
funkcjonowaniu organizmów w tym¿e œrodowisku [1, 2, 20, 93].
Zmiany strukturalne i przestrzenne DNA spowodowane dzia³aniem mutagenów
mog¹ polegaæ miêdzy innymi na pojawieniu siê pêkniêæ w jednej lub obydwu niciach
tego polimeru, modyfikacjach zasad purynowych i pirymidynowych, powstawaniu
285
miejsc AP (apurynowych i apirymidynowych), adduktów, usieciowanych regionów
DNA, pojedynczych i wiêkszych niesparowañ zasad w dupleksie DNA. Uszkodzenia
te nie usuniête w porê mog¹ mieæ daleko id¹ce konsekwencje biologiczne dla komórki, bowiem bezpoœrednio lub poœrednio prowadz¹ do zmiany informacji genetycznej,
a w efekcie do zaburzenia prawid³owego przebiegu procesów komórkowych.
Ogromna ró¿norodnoœæ mutagenów i mo¿liwych zmian w budowie i w strukturze przestrzennej DNA ma swoje odzwierciedlenie zarówno w z³o¿onoœci bia³ek
i enzymów naprawczych jak i w ró¿norodnoœci mechanizmów komórkowych odpowiedzialnych za naprawê b³êdów i uszkodzeñ DNA. Mo¿na powiedzieæ, i¿ nie ma
takiego uszkodzenia czy aberracji strukturalnej DNA, które nie by³oby rozpoznawane przez odpowiednie bia³ka i naprawiane w okreœlonym szlaku metabolicznym.
Jedne z tych mechanizmów s¹ wysoce specyficzne i zdolne do naprawy tylko œciœle
okreœlonego rodzaju zmian strukturalnych w DNA (np. Base Excision Repair, BER),
inne zaœ bardziej uniwersalne, usuwaj¹ szereg ró¿norodnych uszkodzeñ (Nucleotide
Excision Repair, NER). Zró¿nicowanie bakteryjnych mechanizmów naprawy DNA
polega tak¿e i na tym, i¿ w niektórych przypadkach funkcjê naprawcz¹ spe³nia jedno
okreœlone bia³ko w jednoetapowym procesie, podczas gdy w innych w naprawie
uczestniczy wiele czynników, wype³niaj¹cych œciœle okreœlone funkcje w szeregu
nastêpuj¹cych po sobie reakcji i etapów [22].
Ze wzglêdu na molekularne mechanizmy usuwania uszkodzeñ i b³êdów DNA,
ró¿norodne szlaki mo¿na najogólniej podzieliæ na 4 g³ówne klasy:
– naprawy bezpoœredniej (ang. Direct Damage Repair, DDR), kiedy to zmiany
w DNA s¹ w pe³ni odwracalne w stosunkowo prostej reakcji enzymatycznej,
– naprawy rekombinacyjnej (ang. Recombinational Repair, RER), kiedy w naprawê uszkodzonej nici zaanga¿owany jest mechanizm homologicznej rekombinacji,
– naprawy przez wycinanie (ang. Excision Repair), gdy uszkodzony odcinek
pojedynczej nici w okreœlonym regionie DNA jest rozpoznawany i wycinany,
a powsta³a luka w dupleksie DNA jest de novo syntetyzowana na matrycy
drugiej, nie uszkodzonej nici,
– naprawy uszkodzeñ DNA zwi¹zanych z indukcj¹ bakteryjnego systemu SOS,
który cechuje siê znacz¹c¹ mutagennoœci¹ [2, 22].
W ka¿dej z wy¿ej wymienionych 4 klas mo¿na wyró¿niæ po kilka subklas,
ze wzglêdu na ich strukturalne zró¿nicowanie i wype³nian¹ funkcjê. Przyk³adem
mo¿e byæ wymieniony wy¿ej sposób naprawy uszkodzeñ DNA przez wycinanie
(Excision Repair), który ze wzglêdu na biologiczne funkcje mo¿na podzieliæ na:
– szlak naprawy przez wycinanie uszkodzonych lub zmodyfikowanych zasad
azotowych (ang. Base Excision Repair, BER),
– system naprawy uszkodzeñ DNA przez wycinanie nukleotydów (ang. Nucleotide Excision Repair, NER),
– system naprawy b³êdnie sparowanych zasad w DNA (ang. Methyl-Directed
Mismatch Repair System lub Mismatch Excision Repair, MMR) [2, 20, 22, 93]
Bia³ka naprawcze systemu MMR oraz mechanizm rozpoznawania i naprawiania
niesparowanych zasad w DNA, zosta³y najpe³niej scharakteryzowane w komórkach
286
Escherichia coli, Salmonella enterica sv. Typhimurium i Streptococcus pneumoniae
[29, 36, 39, 62, 75], znacznie mniej natomiast wiadomo o genach i bia³kach szlaku
MMR w komórkach innych bakterii. Z uwagi na fakt, i¿ do chwili obecnej poznano
pe³n¹ sekwencjê nukleotydow¹ genomów 64 gatunków bakterii z grup Gram-dodatnich, Gram-ujemnych, wewn¹trzkomórkowych paso¿ytów oraz ekstremalnych
halofili i termofili, mo¿liwym sta³y siê tak¿e porównawcze badania taksonomiczne
tego wa¿nego systemu naprawy DNA w komórkach ró¿nych, filogenetycznie odleg³ych rodzajów bakterii, w tym nale¿¹cych do królestwa Archea (www.tigr.org).
2. Ogólna organizacja i funkcja szlaku MMR
B³êdnie sparowane zasady w dupleksie DNA mog¹ byæ naprawiane przez trzy
ró¿ne systemy E. coli: w krótkim szlaku naprawy (ang. Very Short Path, VSP),
w szlaku zale¿nym od bia³ka MutY (ang. MutY-dependent Repair) oraz na drodze
zale¿nej od metylotransferazy Dam (ang. Dam-Directed DNA Mismatch Repair,
DDMR lub Methyl-Directed Mismatch Repair, MMR). Dwa pierwsze systemy
charakteryzuje œciœle okreœlona specyficznoœæ substratowa, bowiem rozpoznaj¹
w dupleksie DNA niesparowania, odpowiednio TG i AG, trzeci z nich, MMR, mo¿e
rozpoznawaæ i naprawiaæ 11 z 12 teoretycznie mo¿liwych niekomplementarnoœci,
bowiem nie rozpoznaje jedynie niesparowania typu CC. Najefektywniej naprawiane
s¹ niekomplementarnoœci G:T, A:C, A:A i G:G. Co wiêcej, bia³ka tego systemu
rozpoznaj¹ i usuwaj¹ pêtle (ang. loops) powstaj¹ce w dupleksie DNA, kiedy niesparowania obejmuj¹ do 4 par zasad [62, 75].
Poznanie w latach 70-tych i 80-tych strukturalnej organizacji i biologicznej funkcji szlaku MMR E. coli, przedstawionego schematycznie na rys. 1, zwi¹zane
jest z pracami wielu oœrodków naukowych, w szczególnoœci z odkryciami Paula
M o d r i c h ’ a i wsp. z Duke University [40, 49, 61].
W komórkach Enterobacteriacae DNA jest w pe³ni metylowany przez metylazê
Dam, która rozpoznaje sekwencjê docelow¹ d(GATC) i metyluje adeninê w pozycji
N6. Metylaza Dam i proces metylacji spe³niaj¹ w komórkach E. coli i bakterii pokrewnych wiele wa¿nych funkcji, jak inicjacja replikacji, regulacja transpozycji, regulacja ekspresji genów [7, 10, 75]. Jedn¹ z dodatkowych funkcji tej metylazy jest „ukierunkowanie” systemu MMR na naprawê b³êdów replikacji w nowosyntetyzowanej
nici DNA. DNA bezpoœrednio po replikacji jest w stanie hemimetylowanym, to znaczy, i¿ wszystkie docelowe sekwencje d(GATC) s¹ zmetylowane w nici matrycowej,
zaœ w nowo syntetyzowanej nici potomnej pozostaj¹ przez krótki czas nie zmetylowane. Zatem metylaza Dam niejako naznacza niæ rodzicielsk¹ DNA, kieruj¹c w ten
sposób aktywnoœæ systemu MMR na nowosyntetyzowan¹ niæ potomn¹ [40, 61, 62].
Jedno z bia³ek naprawczych, MutS, rozpoznaje b³êdy replikacji wprowadzane do
DNA przez replisom i wi¹¿e siê do tych regionów dupleksu DNA, w których znajduj¹
siê niesparowane zasady [68, 81, 82]. Drugi czynnik, MutL, tworzy kompleks
z bia³kiem Mut S, który po przy³¹czeniu do regionów o niesparowanych zasadach
powoduje ich wypêtlenie i w nastêpnej fazie naprawy aktywacjê bia³ka Mut H [26].
287
Rys. 1. Model dzia³ania systemu postreplikacyjnej naprawy b³êdów MMR u bakterii (opis w tekœcie)
To ostatnie nacina nowosyntetyzowan¹ niæ w miejscach GATC, le¿¹cych najbli¿ej
niesparowanych zasad w kierunku 5’ lub 3’. Niæ rodzicielska jest w tych miejscach
zmetylowana przez metylazê Dam, a wiêc chroniona przed endonukleolitycznym dzia³aniem bia³ka MutH. W kolejnym etapie helikaza UvrD, nazywana tak¿e w literaturze
bia³kiem UvrE, MutU lub RecL [17, 90], rozwija naciêt¹ niæ, a egzonukleazy ExoI,
ExoVII lub RecJ degraduj¹ kolejne nukleotydy nowosyntetyzowanej nici od koñca 3’
288
lub 5’ w kierunku uszkodzenia, w zale¿noœci od miejsca wczeœniej dokonanego naciêcia przez bia³ko MutH. Je¿eli ciêcie nowosyntetyzowanej nici przez bia³ko MutH
nast¹pi³o w pozycji 5’ od niesparowanych zasad, degradacje nici prowadz¹ egzonukleazy ExoVII lub RecJ, bowiem oba te enzymy degraduj¹ niæ DNA w kierunku
5’ → 3’, natomiast je¿eli naciêcie nast¹pi³o od strony 3’, to degradacje prowadzi
egzonukleaza I, odznaczaj¹ca siê hydrolityczn¹ aktywnoœci¹ w kierunku odwrotnym [15, 25, 41, 48]. Ostatnio zidentyfikowano nowy enzym, egzonukleazê X, zdoln¹ do degradacji DNA (podobnie jak egzonukleaza I) w kierunku 3’→ 5’. Enzym
ten by³by zatem kolejnym, wa¿nym sk³adnikiem bakteryjnego systemu MMR [90].
W komórkach E. coli region nowosyntetyzowanej nici DNA, usuwany przez
omawiane egzonukleazy, mo¿e siêgaæ od 1 do 3 tysiêcy par zasad [9]. Tak wytworzona luka w dupleksie DNA jest wype³niana przez polimerazê III DNA, która
w obecnoœci bia³ka SSB dosyntetyzowuje usuniêty fragment na matrycy rodzicielskiej nici DNA. Ligaza, ³¹cz¹c koñce DNA przeprowadza ostatni etap naprawy
niekomplementarnych zasad w dupleksie DNA, jednak sygna³em do zakoñczenia
ca³ego procesu naprawy jest pe³na metylacja sekwencji GATC w naprawionej nici
przez metylazê Dam, bowiem bia³ko MutS nie rozpoznaje i nie ³¹czy siê z tak zmetylowanym dupleksem DNA [40, 61].
3. Charakterystyka genów i bia³ek naprawczych uk³adu MMR
W odró¿nieniu od zgromadzonej ju¿, du¿ej wiedzy na temat genów i bia³ek systemu MMR E. coli, S. enterica sv. Typhimurium i Streptococcus pneumoniae [20, 39,
61, 62, 68, 75, 95] i w mniejszym stopniu kilku innych gatunków bakterii np. Thermus
termophilus, T. aquaticus, Halobacterium, Haemophilus influenzae [5, 6, 20, 83, 92],
niewiele wiadomo na temat mechanizmu genetycznej i biochemicznej regulacji
omawianego szlaku naprawy b³êdów DNA. Wiadomo, ¿e gen dam jest czêœci¹ operonu, na który sk³ada siê nie mniej ni¿ 7 genów [46, 51]. S¹dzi siê, ¿e ekspresja genu
dam jest skorelowana z szybkoœci¹ wzrostu komórki, a rola samej metylotransferazy
Dam w kontroli replikacji chromosomu by³a wielokrotnie udowadniana [73, 74].
Kontrola ekspresji tego genu jest w komórce bardzo œcis³a, a wszelkie jej zaburzenia
prowadz¹ nieuchronnie do wzrostu czêstoœci mutacji, asynchronicznej inicjacji
nowych rund replikacyjnych, a tak¿e zmiany czêstoœci transpozycji [7, 54, 55, 77].
Gen mutL jest czêœci¹ du¿ego operonu, zbudowanego co najmniej z 5 genów.
Kontrola ekspresji tego genu, jak i ca³ego operonu, nie jest bli¿ej poznana, wiadomo
jedynie, ¿e regulacja ta jest zwi¹zana z szybkoœci¹ wzrostu komórek oraz stabilnoœci¹ mRNA, kontrolowan¹ przez RNA-azê E [13, 14, 84–86]. Nic natomiast nie
wiadomo o regulacji ekspresji genów mutS i mutH pomimo tego, i¿ geny te zosta³y
sklonowane i poznano ich pe³n¹ sekwencjê nukleotydow¹ [24, 28, 52, 67, 78]. Obecnoœæ bia³ek naprawczych MutS, MutL i MutH oraz Dam w czasie logarytmicznego
wzrostu E. coli ocenia siê na 100–200 cz¹steczek w przeliczeniu na 1 komórkê,
jednak¿e zawartoœæ tych bia³ek zmniejsza siê w komórkach bêd¹cych w stacjonarnej fazie wzrostu [30, 31, 64]. Dla zapewnienia aktywnoœci ca³ego systemu MMR
289
w komórkach E. coli konieczna jest bezpoœrednia interakcja wy¿ej wymienionych
czynników [8, 21, 39].
Masa cz¹steczkowa bia³ka MutS wynosi 97 kDa, a dla rozpoznania niesparowanych zasad w heterodupleksach DNA in vitro konieczne jest wytworzenie dimeru,
który po przy³¹czeniu do DNA zajmuje obszar 22 par zasad, powoduj¹c protekcjê
tego regionu przed dzia³aniem DNAzy [68, 82]. Jedynym kofaktorem niezbêdnym
do zwi¹zania MutS z DNA s¹ jony Mg2+. Ustalono, i¿ bia³ko MutL, o masie cz¹steczkowej 70 kDa, istnieje w roztworze tak¿e w postaci dimeru i in vitro przy³¹cza
siê do kompleksu MutS-DNA, zwiêkszaj¹c do 100 par zasad obszar DNA chroniony przed dzia³aniem DNazy I i zapobiegaj¹c „œlizganiu siê” (dalszej migracji)
bia³ka MutS [26]. Na tym etapie, w obecnoœci ATP, nastêpuje aktywacja latentnego
bia³ka MutH (masa cz¹steczkowa 25 kDa), które wykazuje s³ab¹ aktywnoœæ endonukleolityczn¹, wzrastaj¹c¹ jednak 20–70 razy w obecnoœci MutS, MutL i ATP [57].
Endonukleaza MutH trawi niezmetylowan¹ niæ w obrêbie hemimetylowanej sekwencji GATC, nawet w znacznej (do 3000 par zasad) odleg³oœci w dowolnym kierunku
od niekomplementarnoœci [61, 62].
Podczas gdy ogólny schemat dzia³ania szlaku MMR jest podobny u ró¿nych bakterii, to sam mechanizm rozpoznawania uszkodzonej nici ró¿ni siê doœæ znacznie
u poszczególnych gatunków. Nie ulega w¹tpliwoœci, ¿e centralne ogniwo omawianego systemu stanowi¹ bia³ka MutS i MutL lub ich homologi. Dla przyk³adu bia³ko
HexA S. pneumoniae, wykazuj¹ce 36% podobieñstwa na poziomie sekwencji aminokwasowej do MutS E. coli, rozpoznaje niesparowane zasady w dupleksie DNA, natomiast HexB (40% homologii z MutL) przy³¹czaj¹c siê do kompleksu HexA/heterodupleks DNA powoduje wypêtlenie uszkodzonego regionu, jednak zarówno u S. pneumoniae jak i wiêkszoœci badanych gatunków bakterii brak jest trzeciego czynnika,
homologu bia³ka MutH [28, 37–39, 70,71]. Zachodzi zatem pytanie w oparciu
o jakie molekularne mechanizmy nastêpuje przeciêcie nici rodzicielskiej i potomnej
u tych gatunków, u których funkcjonuje system MMR ale bez udzia³u bia³ka MutH?
Jak dot¹d nie znaleziono jednoznacznej odpowiedzi wyjaœniaj¹cej ten problem,
s¹dzi siê jednak, ¿e rolê MutH spe³niaj¹ inne enzymy restrykcyjne wprowadzaj¹ce
naciêcia w naprawianej nici DNA. Hipotezê tê potwierdza³by zaskakuj¹cy fakt,
i¿ endonukleaza MutH jest spokrewniona z restryktazami Sau3AI Staphylococcus
aureus oraz LlaKR2I Lactobacillus lactis [4, 20, 87]. Z kolei sekwencja aminokwasowa metylotransferazy Dam E.coli wykazuje wysoki stopieñ homologii z innymi
metylotransferazami, wprowadzaj¹cymi grupê metylow¹ w pozycji N4 adeniny
w sekwencjach GATC (metylotransferaza Dam bakteriofaga T4, metylotransferaza
DpnII) a tak¿e sekwencji GATATC (metylotransferaza EcoRV) i GAATTC (metylotransferaza EcoRI) [39, 53]. Spekuluje siê, ¿e metylaza DpnII S. pneumoniae pe³ni
analogiczn¹ do enzymu Dam funkcjê i naznacza rodzicielsk¹ niæ DNA, a wolne
koñce fragmentów Okazaki w nici potomnej stanowi¹ docelow¹ tarczê dla bia³ek
uk³adu HexA/HexB w czasie naprawy b³êdów replikacji [39, 53].
Obecnie publikowane prace doœwiadczalne w znacznym stopniu zmieniaj¹ nasze
pogl¹dy na temat mechanizmu replikacji DNA w warunkach in vivo. Wyniki tych
prac wskazuj¹, ¿e synteza nici wiod¹cej nie przebiega w sposób ci¹g³y, bowiem
290
zdarzaj¹ siê liczne i czêste pêkniêcia DNA, oraz zatrzymania wide³ek replikacyjnych [16]. Rozwa¿a siê, ¿e wolne koñce fragmentów Okazaki oraz powsta³e wskutek pêkniêæ wolne koñce w nowosyntetyzowanej nici wiod¹cej, mog¹ pe³niæ rolê
sygna³u tak¿e dla systemu naprawy MMR u tych bakterii, które nie wykszta³ci³y
uk³adu MutH/metylaza Dam [11, 27].
4. Udzia³ MMR w innych, molekularnych procesach komórkowych
Jedn¹ z przyczyn uszkodzeñ DNA polegaj¹cych na powstawaniu niesparowanych zasad TG jest spontaniczna deaminacja 5-metylocytozyny w sekwencjach
nukleotydowych CCAGG [75]. W tych naturalnych sekwencjach nukleotydowych
bakterii, metylowana cytozyna (w pozycji 2-giej) podlega w komórkach procesowi
spontanicznej deaminacji i przekszta³caj¹c siê w tyminê prowadzi do wytworzenia
w omawianej sekwencji b³êdu, czyli niesparowania TG [45]. B³êdy te s¹ w komórkach E. coli efektywnie naprawiane przez uk³ad enzymatyczny VSR (ang. Very
Short Repair Pathway), który skutecznie przeciwdzia³a narastaniu, szczególnie
w sekwencjach CCAGG, mutacji typu amber (CG do TA) [45]. Dowiedziono, ¿e
w komórkach bakterii pozbawionych zdolnoœci metylowania cytozyny, czêstoœæ
mutacji typu amber w sekwencjach CCAGG jest znacznie ni¿sza. System naprawy
omawianych niesparowañ TG wymaga obecnoœci aktywnych genów vsr, mutL, mutS
i polA [32]. Gen vsr koduje syntezê bia³ka o wielkoœci wyra¿anej mas¹ cz¹st. 18 kDa,
które jest endonukleaz¹ zale¿n¹ od jonów Mg2+. Prosty model naprawy b³êdów TG
obejmuje: etap przeciêcia wi¹zania fosfodiestrowego od strony 5’ b³êdnie sparowanej
tyminy, nastêpnie do wolnego koñca 3’ przy³¹cza siê polimeraza I DNA, która dziêki
swojej aktywnoœci egzonukleolitycznej 5’-3’ usuwa tyminê prawdopodobnie wraz
z kilku-, kilkunastoma s¹siednimi nukleotydami, jednoczeœnie wype³niaj¹c prawid³owymi nukleotydami tak powsta³¹ lukê. W ostatnim etapie, w obecnoœci ligazy, dochodzi do po³¹czenia wolnych koñców nici [44]. Ten model nie t³umaczy w sposób
zadowalaj¹cy udzia³u bia³ek MutS i MutL w omawianym procesie; wiadomo jedynie, ¿e pewien poziom aktywnoœci systemu VSR jest zachowany przy braku tych
dwóch czynników, ale efektywnoœæ naprawy b³êdów TG jest wtedy znacznie ni¿sza,
w porównaniu do komórek zdolnych do syntezy tych bia³ek naprawczych [44].
Alternatywny i bardziej prawdopodobny model (rys. 2) [3] zak³ada, i¿ bia³ka
MutS i MutL rozpoznaj¹ niesparowania TG, a nastêpnie w obecnoœci ATP tworz¹
w miejscu rozpoznania pêtlê DNA, co eksponuje niesparowania TG na dzia³anie
endonukleazy VSR.
Interesuj¹cym jest fakt, i¿ gen vsr jest zlokalizowany obok genu dcm koduj¹cego
syntezê metylotransferazy cytozyny, tworz¹c razem z nim jedn¹ jednostkê transkrypcyjn¹. Okaza³o siê, ¿e takie u³o¿enie genów vsr i dcm jest charakterystyczne
nie tylko dla E. coli, ale tak¿e dla wielu innych gatunków bakterii. Mo¿na s¹dziæ, i¿
szlak VSR jest wa¿ny dla utrzymania stabilnoœci genetycznej bakterii w regionach
genomów bogatych w sekwencje CCTGG/CCAGG [23]. Potwierdzeniem œcis³ej zale¿noœci miêdzy metylacj¹ przy udziale bia³ka Dcm oraz napraw¹ b³êdów typu VSR
291
Rys. 2. Schemat dzia³ania szlaku VSP w komórce bakteryjnej
mo¿e byæ fakt, ¿e mutacja genu dcm blokuje funkcjê biologiczn¹ ca³ego systemu,
aczkolwiek sama metylaza nie bierze ¿adnego udzia³u w naprawie DNA [18].
W piœmiennictwie narasta liczba doniesieñ wskazuj¹cych na bezpoœredni zwi¹zek miêdzy systemem MMR a napraw¹ uszkodzeñ transkrybowanej nici DNA,
która przebiega przy udziale uk³adu TCR [22] (Transcription Coupled Nucleotide
Excision Repair). Dowiedziono, miêdzy innymi, ¿e defekt systemu MMR prowadzi
do os³abienia mo¿liwoœci naprawy uszkodzeñ w transkrybowanej nici DNA, wywo³ywanych w warunkach laboratoryjnych np. dzia³aniem UV czy czynnikami alkilu292
j¹cymi [59, 75] Autorzy omawianej pracy sadz¹, i¿ sta³a wi¹zania siê kluczowego
dla szlaku TCR kompleksu UvrA2/UvrB jest zbyt niska dla efektywnej naprawy
takich uszkodzeñ, w sytuacji gdy, w nieobecnoœci bia³ek Mut, nie s¹ one odpowiednio wypêtlone i eksponowane na dzia³anie tego kompleksu. Omawiane zale¿noœci
pomiêdzy systemami MMR, VSR i TCR nie by³y wczeœniej rozwa¿ane z uwagi na
fakt, i¿ specyficznoœæ substratowa poszczególnych, znanych czynników naprawczych tych systemów jest zupe³nie odmienna.
W ostatnich latach okaza³o siê tak¿e, ¿e bia³ka MutH, S, L pe³ni¹ wa¿n¹ rolê równie¿ w rearan¿acji chromosomalnego DNA bakterii, zachodz¹cej w wyniku œlizgania
siê matryc DNA w czasie replikacji (Strand-Slippage Mutagenesis) tandemowo
powtórzonych sekwencji nukleotydowych. Dowiedziono, ¿e delecje regionu chromosomalnego DNA E. coli, zlokalizowanego pomiêdzy dwiema kopiami takich sekwencji o d³ugoœci 101 par zasad ka¿da i homologii 96%, pojawiaj¹ siê z bardzo wysoka
czêstoœci¹ [47]. Delecje te nie s¹ zwi¹zane z procesem homologicznej rekombinacji,
bowiem inaktywacja systemu RecA nie zmienia³a czêstoœci omawianych mutacji.
Co wiêcej, okaza³o siê, ¿e w komórkach z nieaktywnym systemem MMR czêstoœæ
delecji wzrasta³a oko³o stukrotnie. W odró¿nieniu, czêstoœæ delecji na odcinkach
pomiêdzy w pe³ni homologicznymi, tandemowymi sekwencjami nie ulega³a zmianie
w komórkach z defektywnym systemem MMR. Te wyniki oraz inne dane wskazuj¹,
¿e nie w pe³ni homologiczne, tandemowe, powtórzone sekwencje w wyniku poœlizgu
nici rodzicielskiej w stosunku do nowosyntetyzowanej, tworz¹ niesparowania zasad,
które s¹ rozpoznawane i naprawiane przez bia³ka MutH, S, L. Autorzy omawianej
pracy badali wy³¹cznie czêstoœæ delecji, mo¿na jednak przewidywaæ z du¿¹ doz¹
prawdopodobieñstwa, ¿e czêstoœæ duplikacji takich nie w pe³ni homologicznych,
tandemowych sekwencji jest tak¿e regulowana aktywnoœci¹ systemu MMR.
Bardzo interesuj¹ce dane uzyskano w badaniach ludzkich mikrosatelitarnych
sekwencji (TG)n, replikowanych w komórkach E. coli. Okaza³o siê, ¿e czêstoœæ delecji i ekspansji tych dwunukleotydowych, powtórzonych sekwencji zale¿y w decyduj¹cym stopniu od sprawnoœci systemu MMR; inaktywacja choæby jednego z genów tego szlaku prowadzi do wielokrotnego wzrostu czêstoœci omawianych mutacji
w obrêbie badanych sekwencji mikrosatelitarnych [43]. W tym miejscu nale¿y
zaznaczyæ, ¿e wyniki uzyskane na modelu komórki bakteryjnej s¹ w pe³ni zgodne
z danymi uzyskanymi w analogicznych eksperymentach przeprowadzanych na komórkach Saccharomyces cerevisiae z mutacjami w genach mut [80].
W ostatnich latach ukaza³o siê te¿ wiele znacz¹cych prac doœwiadczalnych,
których autorzy, w oparciu o wyniki uzyskiwane na modelach komórek bakteryjnych i dro¿d¿owych wskazuj¹ na istotn¹ rolê systemu MMR w generowaniu tak
zwanych mutacji dynamicznych w obrêbie ludzkich, powtórzonych, trójnukleotydowych sekwencji DNA [34, 69].
Proces rekombinacji zachodz¹cy pomiêdzy, heterologicznymi sekwencjami DNA
u gatunków spokrewnionych jest jednym ze Ÿróde³ zmiennoœci genetycznej bakterii.
Taka miêdzygatunkowa rekombinacja, zale¿na od bia³ka RecA zachodzi w wyniku
przenoszenia obcego DNA do komórki biorcy na drodze koniugacji, transdukcji
czy transformacji. Jednak czêstoœæ miêdzygatunkowej rekombinacji genetycznej
293
w œwiecie bakterii jest ograniczana przez bia³ka funkcjonalnego systemu MMR, które
przeciwdzia³aj¹ wymianie odcinków DNA pomiêdzy heterologicznymi sekwencjami.
S¹dzi siê, ¿e kluczow¹ rolê w tym procesie odgrywa bia³ko MutS, które w procesie
rekombinacji blokuje przemieszczanie siê struktury Holliday’a (branch migration)
nie w pe³ni homologicznych nici DNA [94, 57]. Mo¿na przypuszczaæ, ¿e system
MMR w komórkach bakterii gramujemnych skutecznie przeciwdzia³a destabilizacji
genomu powodowanej nie tylko narastaniem w DNA b³êdów replikacji, ale tak¿e
mo¿liw¹ miêdzygatunkow¹ rekombinacj¹ pomiêdzy heterologicznymi sekwencjami
DNA. Odwrotne do wy¿ej opisanych skutki, wywo³uje indukcja bakteryjnego systemu SOS. W odpowiedzi na uszkodzenia materia³u genetycznego, które stwarzaj¹
zagro¿enie dla ¿ycia komórki, uruchomiany mechanizm naprawy typu SOS prowadzi
do ogromnego wzrostu zarówno czêstoœci mutacji jak i rekombinacji pomiêdzy heterologicznymi sekwencjami DNA. Mo¿na domniemywaæ, ¿e przeciwstawne dzia³anie
systemów MMR i SOS w komórkach E. coli, S. enterica sv. Typhimurium i zapewne
innych bakterii gramujemnych prowadzi do ustalenia tempa dywergencji genomów
w ewolucyjnym rozwoju tych bakterii. Ciekawym przyk³adem na tym tle jest system MMR S. pneumoniae. Wydaje siê, ¿e czynniki Hex tego gatunku, w odró¿nieniu od E. coli i S. enterica sv. Typhimurium, nie stanowi¹ bariery dla rekombinacji
pomiêdzy heterologicznymi sekwencjami DNA [33, 72]. Stwierdzono, ¿e pomimo,
i¿ bia³ka naprawcze systemu Hex (Hex DNA Mismatch Repair) by³y ca³kowicie
wysycane, to jest zaanga¿owane w czasie transformacji komórek S. pneumoniae
DNA pochodz¹cymi ze spokrewnionych gatunków S. oralis i S. mitis, to jednak nie
hamowa³y procesu miêdzygatunkowej rekombinacji. Wyniki te dodatkowo potwierdza³yby opisywan¹ ju¿ wczeœniej odmiennoœæ systemu naprawy S. pneumoniae.
Reasumuj¹c mo¿na stwierdziæ, ¿e omawiane bia³ka szlaku MMR mog¹ skutecznie zapobiegaæ rekombinacjom pomiêdzy heterologicznymi sekwencjami u jednych
gatunków bakterii, jak E. coli i S. enterica sv. Typhimurium [58], b¹dŸ nie stanowiæ
takiej bariery dla rekombinacji pomiêdzy heterologicznymi, blisko spokrewnionymi
sekwencjami DNA w komórkach innych gatunków, jak to ma miejsce w przypadku
S. pneumoniae. Inaktywacja szlaku MMR w komórkach bakterii prowadzi, miêdzy
innymi, do wzrostu czêstoœci mutacji w regionach sekwencji mikrosatelitarnych
oraz innych powtórzonych sekwencji nukleotydowych. Najnowsze prace doœwiadczalne z tego zakresu dostarczaj¹ dowodów œwiadcz¹cych o tym, ¿e niestabilnoœæ
takich sekwencji (zmiana liczby powtórzeñ) mo¿e le¿eæ u pod³o¿a z³o¿onych
mechanizmów reguluj¹cych zmianê antygenów powierzchniowych czy ekspresji
czynników chorobotwórczoœci bakterii z rodzaju Mycobacterium, Haemophilus,
Neisseria, Streptococcus [12, 50, 60, 76, 88, 89].
5. System MMR w œwietle osi¹gniêæ genomiki bakterii
Zgromadzona w ostatnich kilkunastu latach wiedza o organizacji i funkcjonowaniu systemów naprawy b³êdów DNA oraz ich roli w zmiennoœci i stabilnoœci genomów dotyczy w g³ównej mierze trzech, najlepiej scharakteryzowanych pod tym
294
wzglêdem gatunków bakterii: E. coli, S. enterica sv. Typhimurium i S. pneumoniae.
Ogromny rozwój biologii molekularnej, w tym technik klonowania i sekwencjonowania genów i ca³ych genomów pozwoli³ w ostatnich latach lepiej poznaæ homologi
genów mutS i mutL w komórkach takich gatunków bakterii jak: Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis, Azotobacter vinelandii, T. aquaticus, T. thermophilus, Pseudomonas aeruginosa [20, 60, 65, 75, 79]. Znajomoœæ pe³nej sekwencji nukleotydowej
genomów 64 gatunków bakterii chorobotwórczych i niechorobotwórczych oraz
zaawansowanie prac nad sekwencjonowaniem genomów kolejnych 156 szczepów
bakterii z ró¿nych gatunków i rodzajów (www.tigr.org), w po³¹czeniu z dostêpem
do ogromnych baz danych, pozwala obecnie podejmowaæ problemy zwi¹zane z filogenetyk¹ bakterii, a w tym stawiaæ pytania na temat filogenetycznego rozwoju
podstawowych, molekularnych mechanizmów komórkowych, do których nale¿y
zaliczyæ systemy naprawy b³êdów i uszkodzeñ DNA.
W literaturze przedmiotu panuje zgodna opinia, i¿ podstawowe elementy systemu
MMR, to jest geny mutS i mutL, nale¿y uznaæ jako ewolucyjnie bardzo stare, prawdopodobnie by³y one ju¿ obecne w komórkach wspólnego przodka organizmów proi eukariotycznych, a uk³ad MutH/metylaza Dam wykszta³cony zosta³ ze starszych ewolucyjnie systemów restrykcji–modyfikacji DNA, bowiem w komórkach wielu gatunków identyfikuje siê homologi metylotransferazy Dam [19, 20]. Uwa¿a siê, ¿e mutS
i mutL oraz ich homologi obecne s¹ w genomach wszystkich wspó³czeœnie wystêpuj¹cych organizmów, od bakterii poczynaj¹c na komórkach cz³owieka koñcz¹c [1, 20,
35]. Zgodnie z obecn¹ wiedz¹ wyj¹tkiem s¹ tutaj ¿yj¹ce w ekstremalnych warunkach
œrodowiska bakterie nale¿¹ce do królestwa Archea oraz wewn¹trzkomórkowe paso¿yty – Mycoplasma pneumoniae, M. genitalium, Rickettsia prowazeki, Mycobacterium
tuberculosis i M. leprae oraz Helicobacter pylori i Campylobacter jejuni [20]. Uwa¿a
siê, ¿e powy¿sze gatunki utraci³y ten podstawowy system naprawy DNA w trakcie
rozwoju ewolucyjnego, a w komórkach ró¿nych gatunków archeonów funkcjonuj¹,
byæ mo¿e, inne mechanizmy naprawy b³êdów DNA [20, 79].
Potwierdzeniem ostatniej hipotezy mo¿e byæ fakt, i¿ w genomach niektórych gatunków Archea (Haloferax volcani, Halobacterium) obecny jest, odpowiednio, fragment genu mutL oraz homolog tego genu [63]. Natomiast w genomach Pyrococccus
furiosus, P. horikoshii, P. woesei, Methanobacterium thermoautotrophicus i Halobacterium wykryto sekwencje nukleotydowe koduj¹ce bia³ka o znacznej homologii do
znanych bia³ek MutS, ale nie wykryto sekwencji homologicznych do genów mutL
i mutH [63, 79]. Istotnym jest pytanie, czy utrata omawianego systemu naprawy by³a
wynikiem genetycznej niestabilnoœci genów mut, czy te¿ utrata tych genów b¹dŸ ich
mutacyjna inaktywacja doprowadzi³a w przesz³oœci ewolucyjnej do pojawienia siê
szczepów hiperzmutowanych, odznaczaj¹cych siê niezwykle wysok¹ czêstoœci¹
mutacji ró¿nych genów, które w konsekwencji uzyska³y przewagê selekcyjn¹ i przystosowa³y siê do nowych, ekstremalnych warunków œrodowiska lub do warunków
wewn¹trzkomórkowego paso¿ytnictwa. Wspomniano wczeœniej, ¿e os³abienie, inaktywacja lub utrata genów mut prowadzi do 100–400-krotnego wzrostu czêstoœci mutacji, a tym samym generuje ogromn¹ zmiennoœæ genetyczn¹ bakterii, co w konsekwencji u³atwia i przyspiesza przystosowanie do zmienionych warunków ¿ycia.
295
Wiêkszoœæ badaczy sk³ania siê ku tej drugiej hipotezie, a praca doœwiadczalna
opublikowana ostatnio w Molecular Microbiology [65] dowodzi, i¿ czêstoœæ ró¿nych mutacji genów mutS, mutL i uvrD (insercje, delecje, zmiany ramki odczytu)
w komórkach szczepów P. aeruginosa, izolowanych z p³uc pacjentów chorych na
mukowiscydozê i leczonych antybiotykami w d³ugich przedzia³ach czasu, by³a
niezwykle wysoka i wynosi³a a¿ 20%. Uzyskane dane doœwiadczalne wskazuj¹,
¿e geny mutS, mutL i uvrD P. aeruginosa s¹ genami mutatorowymi, bowiem ich
inaktywacja doprowadzi³a do pojawiania siê z du¿¹ czêstoœci¹ szczepów hypermutantów, w tym szczepów lekoopornych.
W zakoñczeniu niniejszego artyku³u warto przypomnieæ, ¿e hyperzmutowane
szczepy bakterii chorobotwórczych i niechorobotwórczych pojawiaj¹ siê w naturalnych populacjach z czêstoœci¹, jak siê ocenia np. dla E. coli, Salmonella i Neisseria
meningitidis, œrednio wynosz¹c¹ 1% [42, 56, 65, 66, 76]. Szczepy te zwykle charakteryzuj¹ siê nieaktywnymi lub os³abionymi genami szlaku naprawy b³êdów DNA
(MMR). Zatem bardzo wysoka czêstoœæ mutacji w ró¿nych genach i regionach
genomu takich szczepów, a tak¿e u³atwiona miêdzygatunkowa rekombinacja, generuj¹ ogromn¹ zmiennoœæ genetyczn¹ i fenotypow¹, co stwarza szansê ³atwego
przystosowania siê do zmiennych warunków œrodowiska takich mutantów, które
w obecnoœci antybiotyków, wskutek uruchomienia mechanizmów odpowiedzi immunologicznej lub komórkowej makroorganizmu b¹dŸ w warunkach innych stresów œrodowiskowych uzyskaj¹ przewagê selekcyjn¹.
Piœmiennictwo
1. Aquilina G., Bignami M.: Mismatch repair in correction of replication errors and processing of
DNA damage. J. Cell. Physiol. 187, 145–154 (2001)
2. Aravind L., Walker R.D., Koonin E.V.: Conserved domains in DNA repair proteins and evolution
of repair systems. Nucleic Acids Res. 27, 1223–1242 (1999).
3. Balganesh T.S., Lacks S.A.: Heteroduplex DNA mismatch repair system of Streptococcus pneumoniae: Cloning and expression of the hexA gene. J. Bacteriol. 162, 979–984 (1985)
4. Ban C., Yang W.: Structural basis for MutH activation in E. coli mismatch repair and relationship
of MutH to restriction endonucleases. EMBO J. 17, 1526–1534 (1998)
5. Biswas I., Hsieh P.: Identification and characterization of a thermostable MutS homolog from
Thermus aquaticus. J. Biol. Chem. 271, 5040–5048 (1996)
6. Biswas I., Hsieh P.: Interaction of MutS protein with the major and minor grooves of a heteroduplex DNA. J. Biol. Chem. 272, 13355–13364 (1997)
7. Boye E., Lobner-Olesen A.: The role of dam methyltransferase in the control of DNA replication
in E. coli. Cell, 62, 981–989 (1990)
8. Boye E., Marinus M.G., Lobner-Olesen A.: Quantitation of Dam methyltransferase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 1682–1685 (1992)
9. Bruni R., Martin D., Jiricny J.: d(GATC) sequences influence Escherichia coli mismatch repair in
a distance-dependent manner from positions both upstream and downstream of the mismatch.
Nucleic Acids Res. 16, 4875–4890 (1988)
10. Campbell J.L., Kleckner N.: E. coli oriC and dnaA gene promoter are sequestered from dam
methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell, 62, 967–979
(1990)
296
11. Chen J.D., Lacks S.A.: Role of uracil-DNA glycosylase in mutation avoidance by Streptococcus
pneumoniae. J. Bacteriol. 173, 283–290 (1991)
12. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon SV., Eiglmeier K.,
Gas S., Barry C.E 3rd., Tekaia F., Badcock K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor
R., Davies R., Devlin K., Feltwell T., Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K.,
Barrell B.G.: Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome
sequence. Nature, 393, 537–544 (1998)
13. Connolly D.M., Winkler M.E.: Genetic and physiological relationships among the miaA gene,
2-methylthio-N6-(delta 2-isopentenyl)-adenosine tRNA modification, and spontaneous mutagenesis in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 171, 3233–3246 (1989)
14. Connolly D.M., Winkler M.E.: Structure of Escherichia coli K-12 miaA and characterization of
the mutator phenotype caused by miaA insertion mutations. J. Bacteriol. 173, 1711–1721 (1991)
15. Cooper D.L., Lahue R.S., Modrich P.: Methyl-directed mismatch repair is bidirectional. J. Biol.
Chem. 268, 11823–11829 (1993)
16. Cox M.M., Goodman M.F., Kreuzer K.N., Sherratt D.J., Sandler S.J., Marians K.J.: The importance of repairing stalled replication forks. Nature, 404, 37–41 (2000)
17. Dao V., Modrich P.: Mismatch-, MutS-, MutL-, and helicase II-dependent unwinding from the
single-strand break of an incised heteroduplex. J. Biol. Chem. 273, 9202–9207 (1998)
18. Dar M.E., Bhagwat A.S.: Mechanism of expression of DNA repair gene vsr, an Escherichia coli
gene that overlaps the DNA cytosine methylase gene dcm. Mol. Microbiol. 9, 823–833 (1993)
19. Eisen J.A.: A phylogenomic study of the MutS family of proteins. Nucleic Acid. Res. 26,
4291–4300 (1998)
20. Eisen J.A., Hanawalt P.C.: A phylogenomic study of DNA repair genes, proteins, and processes.
Mutat. Res. 435, 171–213 (1999).
21. Feng G., Tsui H.C., Winkler M.E.: Depletion of the cellular amounts of the MutS and MutH
methyl-directed mismatch repair proteins in stationary-phase Escherichia coli K-12 cells. J. Bacteriol. 178, 2388–2396 (1996)
22. Freiberg E.C. Walker G.C., Side W.: DNA repair and mutagenesis, ASM Press, Washington D.C.,
1995
23. Glasner W., Merkl R., Schellenberger V., Fritz H.J.: Substrate preferences of Vsr DNA mismatch
endonuclease and their consequences for the evolution of the Escherichia coli K-12 genome.
J. Mol. Biol. 245, 1–7 (1995)
24. Grafstrom R.H., Hoess R.H.: Nucleotide sequence of the Escherichia coli mutH gene. Nucleic
Acids Res. 15, 3073–3084 (1987)
25. Grilley M., Griffith J., Modrich P.: Bidirectional excision in methyl-directed mismatch repair.
J. Biol. Chem. 268, 11830–11837 (1993)
26. Grilley M., Welsh K.M., Su S.S., Modrich P.: Isolation and characterization of the Escherichia
coli mutL gene product. J. Biol. Chem. 264, 1000–1004 (1989)
27. Guild W.R., Shoemaker N.B.: Mismatch correction in pneumococcal transformation: donor length
and hex-dependent marker efficiency. J. Bacteriol. 125, 125–135 (1976)
28. Haber L.T., Pang P.P., Sobell D.I., Mankovich J.A., Walker G.C.: Nucleotide sequence of the
Salmonella typhimurium mutS gene required for mismatch repair: homology of MutS and HexA
of Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol. 170, 197–202 (1988)
29. Hanawalt P.C.: DNA repair comes of age. Mutat. Res. 336, 101–113 (1995)
30. Harris R.S., Feng G., Ross K.J., Sidhu R., Thulin C., Longerich S., Szigety S.K., Hastings P.J.,
Winkler M.E., Rosenberg S.M.: Mismatch repair is diminished during stationary-phase mutation.
Mutat. Res. 437, 51–60 (1999)
31. Harris R.S., Feng G., Ross K.J., Sidhu R., Thulin C., Longerich S., Szigety S.K., Winkler M.E.,
Rosenberg S.M.: Mismatch repair protein MutL becomes limiting during stationary-phase mutation. Genes Dev. 11, 2426–2437 (1997)
32. Hennecke F., Kolmar H., Brundl K., Fritz H.J.: The vsr gene product of E. coli K-12 is a strandand sequence-specific DNA mismatch endonuclease. Nature, 353, 776–778 (1991)
297
33. Humbert O., Prudhomme M., Hakenbeck R., Dowson C.G., Claverys J.P.: Homeologous recombination and mismatch repair during transformation in Streptococcus pneumoniae: saturation of
the Hex mismatch repair system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9052–9056 (1995)
34. Jaworski A., Rosche W.A., Gellibolian R., Kang S., Shimizu M., Bowater R.P, Sinden R.R.,
Wells R.D.: Mismatch repair in Escherichia coli enhances instability of (CTG)n triplet repeats
from human hereditary diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11019–11023 (1995)
35. Kolodner R.: Biochemistry and genetics of eukaryotic mismatch repair. Genes Dev. 10,
1433–1442 (1996)
36. Koonin E.V., Mushegian A.R., Rudd K.E.: Sequencing and analysis of bacterial genomes. Curr.
Biol. 6, 404–416 (1996)
37. Kramer W.B., Kramer M.S., Williamson M.S., Fogel S.: Cloning and nucleotide sequence of DNA
mismatch repair gene PMS1 from Saccharomyces cerevisiae: homology of PMS1 to procaryotic
MutL and HexB. J. Bacteriol. 171, 5339–5346 (1989)
38. Lacks S.A.: Generalized DNA mismatch repair its molecular basis in Streptococcus pneumoniae
and other organisms, (w) Genetic of Transformation and Expression, eds: L.O.C. Harwood,
B.E.B. Moseley, Intercept, Wimbourne, England, 1989
39. Lacks S.A.: DNA repair and mutagenesis in Streptococcus pneumoniae., (w) DNA repair in procaryotes and lower eucaryotes, vol. 1., s. 263–286, ed: J.A. Nickoloff, M.F. Hoekstra, Humana
Press Inc., Totowa, NJ, 1998
40. Lahune R.S., Au K.G., Modrich P.: DNA mismatch correction in a defined system. Science, 245,
160–164 (1989)
41. Langle-Rouault F., Maenhaut-Michel G., Radman M.: GATC sequences, DNA nicks and the MutH
function in Escherichia coli mismatch repair. EMBO J. 6, 1121–1127 (1987)
42. LeClerc J.E., Li B., Payne W.L., Cebula T.A.: High mutation frequencies among Escherichia coli
and Salmonella pathogens. Science, 274, 1208–1211 (1996)
43. Levinson G., Gutman G.A.: High frequencies of short frameshifts in poly-CA/TG tandem repeats
borne by bacteriophage M13 in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 15, 5323–5338 (1987)
44. Lieb M.: Bacterial genes mutL, mutS and dcm participate in repair of mismatches at 5-methylcytosine sites. J. Bacteriol. 169, 5241–5246 (1987)
45. Lieb M.: Spontaneous mutation at a 5-methylcytosine hotspot is prevented by very short patch
(VSP) mismatch repair. Genetics, 128, 23–27 (1991)
46. Lobner-Olesen A., Boye E., Marinus M.G.: Expression of the Escherichia coli dam gene. Mol.
Microbiol. 6, 1841–1851 (1992)
47. Lovett S.T., Feschenko V.V.: Stabilization of diverged tandem repeats by mismatch repair:
evidence for deletion formation via a misaligned intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,
7120–7124 (1996)
48. Lu A.L.: Influence of GATC sequences on Escherichia coli DNA mismatch repair in vitro.
J. Bacteriol. 169, 1254–1259 (1987)
49. Lu A.L., Clark S., Modrich P.: Methyl-directed repair of DNA base-pair mismatches in vitro.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4639–4643 (1983)
50. Lukomski S., Nakashima K., Abdi I., Cipriano V.J., Shelvin B.J., Graviss E.A., Musser J.M.:
Identification and characterization of a second extracellular collagen-like protein made by group
A Streptococcus: control of production at the level of translation. Infect. Immun. 69, 1729–1738
(2001)
51. Lyngstadaas A., Lobner-Olesen A., Boye E.: Characterization of three genes in the dam-containing operon of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 247, 546– 554 (1995)
52. Mankovich J.A., McIntyre C.A., Walker G.C.: Nucleotide sequence of the Salmonella typhimurium mutL gene required for mismatch repair: Homology of MutL to HexB of Streptococcus pneumoniae and to PMS1 of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 171, 5325–5331 (1989)
53. Mannarelli B.M., Balganesh T.S., Greenberg B., Springhorn S.S., Lacks S. A.: Nucleotide sequence of the Dpn II DNA methylase gene of Streptococcus pneumoniae and its relationship to the
dam gene of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4468–4472 (1985)
298
54. Marinus M.G. Morris N.R.: Biological function for 6-methyladenine residues in the DNA of
Escherichia coli K12. J. Mol. Biol. 85, 309–322 (1974)
55. Marinus M.G., Poteete A., Arraj J.A.: Correlation of DNA adenine methylase activity with spontaneous mutability in Escherichia coli K-12. Gene, 28, 123–125 (1984)
56. Matic I., Radman M., Taddei F., Pcard B., Doit C., Bingen E., Denamur E., Elion J.: Highly variable
mutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli. Science, 277 1833–1834 (1997)
57. Matic I., Rayssiguier C., Radman M.: Interspecies gene exchange in bacteria: the role of SOS and
mismatch repair systems in evolution of species. Cell, 80, 507–515 (1995)
58. Matic I., Taddei F., Radman M.: Genetic barriers among bacteria. Trends Microbiol. 4, 69–72, (1996)
59. Mellon I., Champe G.N.: Products of DNA mismatch repair genes mutS and mutL are required for
transcription coupled nucleotide-excision repair of lactose operon in Escherichia coli. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93, 1292–1297 (1996)
60. Mizrahi V., Andersen S.J.: DNA repair in Mycobacterium tuberculosis. What have we learnt from
the genome sequence? Mol. Microbiol. 29, 1331–1339 (1998)
61. Modrich P.: Mechanisms and biological effects of mismatch repair. Annu. Rev. Genet. 25,
229–253 (1991)
62. Modrich P., and Lahue R.: Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, and
cancer biology. Annu. Rev. Biochem. 65, 101–133 (1996)
63. Ng W.V., Kennedy S.P., Mahairas G.G., Berquist B., Pan M., Shukla H.D., Lasky S.R., Baliga N.S.,
Thorsson V., Sbrogna J., Swartzell S., Weir D., Hall J., Dahl T.A., Welti R., Goo Y.A., Leithauser B.,
Keller K., Cruz R., Danson MJ., Hough D.W., Maddocks D.G., Jablonski P.E., Krebs M.P.,
Angevine C.M., Dale H., Isenbarger T.A., Peck R.F., Pohlschroder M., Spudich J.L., Jung K.W.,
Alam M., Freitas T., Hou S., Daniels C.J., Dennis P.P., Omer A.D., Ebhardt H., Lowe T.M., Liang P.,
Riley M., Hood L., DasSarma S.: Genome sequence of Halobacterium species NRC-1. Proc.
Natl. Acad. Sci.USA, 97, 12176–12181 (2000)
64. Nowosielska A.: Mutageneza zwi¹zana z g³odzeniem aminokwasowym w komórkach Escherichia coli. Praca doktorska, Zak³ad Biologii Molekularnej, Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN,
Warszawa, 2002
65. Oliver A., Baquero F., Blazquez J.: The mismatch rapair system (mutS, mutL and uvrD genes) in
Pseudomonas aeruginosa: molecular characterization of naturally occuring mutants. Mol. Microbiol. 43, 1641–1650 (2002)
66. Oliver A., Canton R., Campo P., Baquero F., Blazquez J.: High frequency of hypermutable
Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis lung infection. Science, 288, 1251–1254 (2000)
67. Pang P.P., Lundberg A.S, Walker G.C.: Identification and characterization of the mutL and mutS
gene products of Salmonella typhimurium LT2. J. Bacteriol. 163, 1007–1015 (1985)
68. Parker B.O., Marinus M.G.: Repair of DNA heteroduplexes containing small heterologous sequences in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1730–1734 (1992)
69. Parniewski P., Jaworski A., Wells R.D., Bowater R.P.: Length of CTG/CAG repeats determines
the influence of mismatch repair on genetic instability. J. Mol. Biol. 299, 865–874 (2000)
70. Priebe S.D., Hadi S.M., Greenberg B., Lacks S.A.: Nucleotide sequence of the hexA gene for
DNA mismatch repair in Streptococcus pneumoniae and homology of hexA to mutS of Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 170, 190–196 (1988)
71. Prudhomme M., Martin B., Mejean V., Claverys J.P.: Nucleotide sequence of the Streptococcus
pneumoniae hexB mismatch repair gene: homology of HexB to MuL of Salmonella typhimurium
and to PMS1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 171, 5332–5338 (1989)
72. Radman M., Taddei F., Matic I.: Evolution-driving genes. Res Microbiol. 151, 91–95 (2000)
73. Rasmussen L.J., Lobner-Olesen A., Marinus M.G.: Growth-rate-dependent transcription initiation from the dam P2 promoter. Gene, 157, 213–215, (1995)
74. Rasmussen L.J., Marinus M.G., Lobner-Olesen A.: Novel growth rate control of dam gene expression in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 12, 631– 638, (1994)
75. Rasmussen L.J., Samson L., Marinus M.G.: Dam-directed DNA Mismatch Repair, (w:) DNA
repair in procaryotes and lower eucaryotes, vol. 1., 205–228, eds: J.A. Nickoloff, M.F. Hoekstra,
Humana Press Inc., Totowa, NJ 1998
299
76. Richardson, A.R., Stojiljkovic I.: Mismatch repair and the regulation of phase variation in Neisseria
meningitidis. Mol. Microbiol. 40, 645–655 (2001)
77. Roberts D., Hoopes B.C., McClure W.R., Kleckner N.: IS10 transposition is regulated by DNA
adenine methylation. Cell, 43, 117–130 (1985)
78. Schlensog V., Bock A.: The Escherichia coli fdv gene probably encodes mutS and is located at
minute 58.8 adjacent to the hyc-hyp gene cluster. J. Bacteriol. 173, 7414–7415 (1991)
79. Stanis³awska A.: Rekombinatowe bia³ka MutS jako narzêdzia do wykrywania mutacji punktowych. Rozprawa doktorska, Katedra Mikrobiologii Wydzia³u Chemicznego Politechniki Gdañskiej, 2002
80. Strand M., Prolla T.A., Liskay R.M., Petes T.D.: Destabilization of tracts of simple repetitive
DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature, 365, 274–276 (1993)
81. Su S.S., Lahue R.S., Au K.G., Modrich P.: Mispair specificity of methyl- directed DNA mismatch
correction in vitro. J. Biol. Chem. 263, 6829–6835 (1988)
82. Su S.S., Modrich P.: Escherichia coli mutS-encoded protein binds to mismatched DNA base pairs.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5057–5061 (1986)
83. Takamatsu S., Kato R., Kuramitsu S.: Mismatch DNA recognition protein from an extremely
thermophilic bacterium, Thermus thermophilus HB8. Nucleic Acids Res. 24, 640–647 (1996)
84. Tsui H.C., Leung H.C., Winkler M.E.: Characterization of broadly pleiotropic phenotypes caused
by an hfq insertion mutation in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 13, 35–49 (1994)
85. Tsui H.C., Winkler M.E.: Transcriptional patterns of the mutL-miaA superoperon of Escherichia
coli K-12 suggest a model for posttranscriptional regulation. Biochimie, 76, 1168–1177 (1994)
86. Tsui H.C., Zhao G., Feng G., Leung H.C., Winkler M.E.: The mutL repair gene of Escherichia
coli K-12 forms a superoperon with a gene encoding a new cell-wall amidase. Mol. Microbiol. 11,
189–202 (1994)
87. Twomey D.P., McKay L.L., O’Sullivan D.J.: Molecular characterization of the Lactococcus lactis
LlaKR2I restriction-modification system and effect of an IS982 element positioned between the
restriction and modification genes. J. Bacteriol. 180, 5844–5854 (1998)
88. van Belkum A., Scherer S., van Alphen L., Verbrugh H.: Short-sequence DNA repeats in prokaryotic genomes. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 275–293 (1998)
89. van Belkum A., Scherer S., van Leeuwen W., Willemse D., van Alphen L., Verbrugh H.: Variable
number of tandem repeats in clinical strains of Haemophilus influenzae. Infect. Immun. 65,
5017–5027 (1997)
90. Viswanathan M., Burdett V., Baitinger C., Modrich P., Lovett S.T.: Redundant exonuclease involvement in Escherichia coli methyl-directed mismatch repair. J. Biol. Chem. 276, 31053–31058 (2001)
91. Welsh K.M., Lu A.L., Clark S., Modrich P.: Isolation and characterization of the Escherichia coli
mutH gene product. J. Biol. Chem. 262, 15624–15629 (1987)
92. Whitehouse A., Deeble J., Parmar R., Taylor G.R., Markham A.F., Meredith D.M.: Analysis of
the mismatch and insertion/deletion binding properties of Thermus thermophilus, HB8, MutS.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 834–837 (1997)
93. Wood R.D., Mitchell M., Sgouros J., Lindahl T.: Human DNA repair genes. Science, 291,
1284–1289 (2001).
94. Worth L.Jr., Clark S., Radman M., Modrich P.: Mismatch repair proteins Mut S and MutL inhibit RecA-catalyzed strand transfer between diverged DNAs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91,
3238–3241 (1994)
95. Wu T.H., Marinus M.G.: Deletion mutation analysis of the mutS gene in Escherichia coli. J. Biol.
Chem. 274, 5948–5952 (1999)
Zak³ad Genetyki Drobnoustrojów U£
Instytut Mikrobiologii i Immunologii
90-237 £ódŸ, Banacha 12/16
Wp³ynê³o w maju 2002 r.
300
POST. MIKROBIOL.,
2003, 42, 3, 301–317
http://www.pm.microbiology.pl
ODPOWIED
LEUKOCYTÓW GOSPODARZA
NA ANTYGENY BAKTERYJNE
Justyna Stanis³awska, Bo¿enna Interewicz,
Waldemar L. Olszewski
1. Wprowadzenie. 2. LPS i jego wp³yw na komórki uk³adu immunologicznego. 3. Budowa i aktywnoœæ biologiczna peptydoglikanu (mureiny). 4. Inne sk³adniki os³on bakteryjnych o w³aœciwoœciach
antygenowych. 5. Immunogenne w³aœciwoœci DNA. 6. Mimikra molekularna i jej rola w etiologii
chorób. 7. Podsumowanie
Immune response of host leukocytes for bacterial antigens
Abstract: The immune system has traditionally been divided into innate and adaptive components.
The innate immunity refers to the primary immunity against diseases. The innate immune response
develops first and then activates the adaptive immune response. The innate components recognize
only some antigens. These structures are referred to as pathogen-associated molecular pattern (PAMP),
for example: lipopolisaccharide – LPS, peptidoglycan – PGN, lipoteichoic acid – LTA, bacterial DNA.
Some bacterial antigens show similarity with host structures. This phenomenon is called molecular
mimicry and it is one of the important pathogenic factors of microorganisms.
1. Introduction. 2. Effects of lipopolysaccharide on immune cells. 3. Composition and biological
activity of peptidoglycan. 4. Others components of bacterial cell wall and their antigenic properties.
5. Immunologic properties of DNA. 6. Molecular mimicry. 7. Conclusions
1. Wprowadzenie
Mechanizmy odpornoœci wrodzonej stanowi¹ wczesn¹, nieswoist¹ fazê odpowiedzi immunologicznej, dopóki nie rozwinie siê odpowiedŸ specyficzna. Zwykle wiêkszoœæ mikroorganizmów zostaje eliminowana w drodze mechanizmów wrodzonych.
Jednak nie s¹ one w stanie rozpoznaæ ka¿dego mo¿liwego antygenu, ale rozpoznaj¹
raczej kilka wysokokonserwowanych struktur obecnych u wiêkszoœci mikroorganizmów. Struktury te okreœla siê czêsto jako zwi¹zane z patogenami wzory molekularne (PAMP – pathogen-associated molecular pattern) [1, 4], zaœ receptory zdolne
do ich rozpoznawania i wi¹zania okreœlane s¹ jako receptory rozpoznaj¹ce wzory
(PRR – pattern recognition receptors) [31]. Najbardziej znanymi przyk³adami takich
Stosowane skróty okreœleñ angielskich
APC – antigen presenting cells; BPI – bacterial permeability increasing factor; CTL – cytotoxic T
lymphocytes; DC – dendritic cells; FAF – fibroblast activating factor; GlcNAc – N-Acetylglucosamine; GM-CSF – granulocyte-macrophage colony stimulating factor; IFN( – intereferon (; LBP – LPS
binding protein; LPS – lipopolisaccharide; MurNAc – N-acetylmuramic acid; NF6B – nuclear factor
6B; PAMP – pathogen-associated molecular pattern; PGN – peptidoglycan; PGRP – peptidoglycan
recognition proteins; PMN – polymorphonuclear leukocytes; PRR – pattern recognition receptors;
ROS – reactive oxygen species; TCR – T cell receptor; TLR – Toll like receptors; TNF – tumor
necrosis factor
301
moleku³ s¹: bakteryjny lipopolisacharyd (LPS), peptydoglikan (mureina), kwasy
tejchojowe, tejchuronowe i lipotejchojowe, lipoproteiny, bakteryjne DNA, mannan
w œcianie komórkowej dro¿d¿y oraz glikan i chityna w œcianach komórkowych grzybów [2]. Chocia¿ zwi¹zki te pod wzglêdem budowy chemicznej ca³kiem siê ró¿ni¹,
to posiadaj¹ pewne wspólne cechy: produkowane s¹ tylko przez mikroorganizmy,
a nie wystêpuj¹ u ich gospodarzy (wyj¹tek – DNA z wieloma niezmetylowanymi
elementami CpG w odró¿nieniu od DNA eukariotycznego); s¹ one zwykle szczególnie wa¿ne dla prze¿ycia lub patogennoœci mikroorganizmów; struktury te s¹
zazwyczaj zwi¹zane z jak¹œ œciœle okreœlon¹ grup¹ patogenów np. LPS jest struktur¹
charakterystyczn¹ tylko dla bakterii Gram-ujemnych [31]. G³ówn¹ grup¹ wœród
PRRs s¹ „Toll like receptors” – TLR, zidentyfikowane najpierw u Drosophila melanogaster jako receptory Toll, a nastêpnie u wielu innych organizmów [6]. Wszystkie
TLR wykazuj¹ charakterystyczn¹ budowê – posiadaj¹ dwie specyficzne domeny
– konserwatywn¹ cytoplazmatyczn¹ domenê sygnaln¹ Toll/IL-1R (TIR) i zewn¹trzkomórkow¹ domenê obfituj¹c¹ w liczne powtórzenia leucynowe (LRR) [4, 34, 39].
Do tej pory u ssaków znaleziono dziesiêæ receptorów TLR, okreœlanych jako TLR1
do TLR 10 [1, 55] i podzielono na trzy grupy w zale¿noœci od sposobu ekspresji:
powszechne (TLR1), ograniczone (TLR2, TLR4, TLR5) i specyficzne (TLR3) [33].
Rozpoznanie patogenów przez TLR powoduje z regu³y aktywacjê NFêB i gwa³town¹
odpowiedŸ immunologiczn¹ w postaci produkcji cytokin i nadregulacji ekspresji
moleku³ kostymuluj¹cych [19, 22]. Warto wspomnieæ, ¿e ró¿ne PAMP rozpoznawane s¹ przez odrêbne kombinacje TLRs, zaœ tylko kilka TLRs funkcjonuje jako
receptory dla produktów bakteryjnych, pozosta³e mog¹ pe³niæ funkcjê koreceptorów (TLR1, TLR6), promuj¹cych lub hamuj¹cych odpowiedŸ komórkow¹ na ró¿ne
ligandy [1, 55]. Wiêkszoœæ komórek wykazuje ekspresjê przynajmniej jednego TLR,
a kilka prawie wszystkich poznanych TLRs ( splenocyty, PBL). Najwiêksz¹ ró¿norodnoœci¹ TLR charakteryzuj¹ siê jednak profesjonalne komórki fagocytuj¹ce (g³ównie makrofagi i komórki dendrytyczne-DC), które stanowi¹ wa¿ne elementy wrodzonych mechanizmów odpornoœciowych, stanowi¹cych pierwsz¹ liniê obrony
przed patogenami [19, 22]. TLR1 wystêpuje na wszystkich leukocytach (monocyty,
PBL, komórki T, B i NK); TLR2 na komórkach linii mieloidalnej [33]; TLR3
– wy³¹cznie na komórkiach dendrytycznych [33], choæ pewna grupa badaczy stwierdzi³a ekspresjê tego bia³ka równie¿ w komórkach epitelialnych, monocytach, granulocytach, komórkach T i B [55]; TLR4 zidentyfikowano na komórkach linii
mieloidalnej [33]; a ekspresj¹ TLR5 w monocytach, niedojrza³ych komórkach DC
i komórkach epitelialnych [1, 14]; TLR6 – ekspresja g³ównie w œledzionie, grasicy
i p³ucach [45]; TLR9 i TLR10 – wystêpuj¹ g³ównie na limfocytach B [55].
2. LPS i jego wp³yw na komórki uk³adu immunologicznego
Najbardziej znanym antygenem bakteryjnym jest LPS czyli lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych, bêd¹cy tzw. endotoksyn¹ bakteryjn¹. Jest on czêœci¹ sk³adow¹
b³ony zewnêtrznej bakterii Gram-ujemnych i zbudowany jest z trzech podstawowych
302
czêœci: lipidu A, polisacharydowego rdzenia oraz O-swoistego ³añcucha cukrowego
zwanego antygenem O [17, 27, 53]. Antygen O jest najbardziej zmienn¹ czêœci¹
LPS – u ró¿nych gatunków bakterii odkryto ok. kilkudziesiêciu ró¿nych cukrów,
które mog¹ go budowaæ. Jest on g³ówn¹ determinant¹ antygenow¹ LPS i przeciw
niemu wytwarzana jest wiêkszoœæ produkowanych przeciwcia³. U wielu gatunków
bakterii istnieje wyraŸny zwi¹zek pomiêdzy ich zjadliwoœci¹ a budow¹ LPS
np. porównanie ró¿nych szczepów Salmonella enterica sv. Typhimurium, które ró¿ni³y siê budow¹ ³añcucha cukrowego wykaza³o ró¿nice w zjadliwoœci wyp³ywaj¹ce
ze stopnia wra¿liwoœci na fagocytozê [27]. Kluczowe znaczenie dla mechanizmów
odpornoœci wrodzonej ma natomiast konserwatywna hydrofobowa domena LPS
– lipid A, który zosta³ zidentyfikowany jako struktura odpowiedzialna za biologiczne
efekty dzia³ania LPS [2, 29] i to w³aœnie ten fragment LPS jest g³ównym ligandem
dla receptorów TLR [38].
Kr¹¿¹cy w organizmie LPS wi¹zany jest najpierw przez bia³o osocza LBP (LPS
binding protein), transportuj¹c¹ LPS do receptora CD14, który mo¿e wystêpowaæ
w formie rozpuszczalnej albo jako receptor powierzchniowy makrofagów, monocytów i komórek B [32]. Rozpuszczalny CD14 (sCD14) po przy³¹czeniu LPS wi¹¿e
siê do niezidentyfikowanego jeszcze receptora i aktywuje komórki linii niemieloidalnej [48]. B³onowy CD14 (mCD14) jest kluczow¹ protein¹ w aktywacji komórek
przez LPS, choæ jest bia³kiem bez domeny cytoplazmatycznej zakotwiczonym w
b³onie za poœrednictwem glkofosfoinozytolu [32, 48]. Sugeruje siê zatem, ¿e CD14
poœredniczy w odpowiedzi komórki na LPS poprzez interakcje z kompleksem moleku³ transdukuj¹cych sygna³ do jej wnêtrza, w sk³ad którego wchodz¹ najprawdopodobniej hsp70 i hsp90 [48]. Na powierzchni makrofagów obecne s¹ równie¿ dwa
inne bia³ka – proteina adaptorowa MD2 i receptor TLR4 lub TLR2, które tak¿e
uczestnicz¹ w wi¹zaniu LPS [6, 32], choæ zaczyna przewa¿aæ pogl¹d, ¿e zasadniczym receptorem dla LPS jest TLR4 [19, 28]. MD2 poœredniczy w rozpoznawaniu
LPS przez TLR4, co prowadzi do wytworzenia trójsk³adnikowego (CD14, MD2
i TLR4) kompleksu rozpoznaj¹cego i wi¹¿¹cego tê strukturê [19]. TLR4 i MD2 s¹
konstytutywnie ze sob¹ po³¹czone, natomiast CD14 jest przy³¹czany dopiero
po zwi¹zaniu LPS. Powstanie kompleksu LPS – CD14 – MD2 – TLR4 wywo³uje
dimeryzacjê TLR4, ale tylko jeden TLR4 ulega aktywacji i inicjuje kaskadê sygna³ow¹, która w rezultacie prowadzi do aktywacji kinaz fosforyluj¹cych inhibitor czynnika transkrypcyjnego NF6B (I6B). Fosforylacja I6B prowadzi do jego degradacji
i uwolnienia NFêB, który przemieszcza siê do j¹dra i indukuje transkrypcjê wielu
genów, których produkty uczestnicz¹ w reakcji zapalnej i odpowiedzi immunologicznej [11]. W efekcie dochodzi do ekspresji moleku³ kostymulacyjnych takich jak
np. CD40, CD80 i CD86 oraz sekrecji cytokin zapalnych – IL1, IL6, IL12 i TNF"
(rys. 1) [31]. Na powierzchni limfocytów B tak¿e wystêpuje kompleks receptorów
uczestnicz¹cych w wi¹zaniu LPS. G³ównym sk³adnikiem tego kompleksu oprócz
TLR4 i CD14 jest bia³ko RP 105-transb³onowy receptor z ektodomen¹ zawieraj¹c¹
powtórzenia leucynowe, podobne do tych, które wystêpuj¹ w TLRs. RP-105 zwi¹zany jest z cz¹steczk¹ MD1, która poœredniczy w rozpoznawaniu LPS i indukcji
sygna³u w komórce [19, 21]. LPS mo¿e zostaæ zwi¹zany równie¿ przez inne bia³ko
303
Rys. 1. Droga sygna³owa zainicjowana przez kompleks LPS-CD14-TLR1-MD2
– BPI (bacterial permeability increasing factor). BPI jest bia³kiem kationowym, wystêpuj¹cym na powierzchni neutrofili lub wewn¹trz tych komórek w ziarnach azurofilnych. Ekspresjê BPI stwierdzono równie¿ w granulach eozynofili i w komórkach
epitelialnych [7]. Bia³ko to wi¹¿e LPS i przeciwdzia³a aktywacji komórek przez
LPS [13]. Oprócz tego opsonizuje komórki bakterii Gram-ujemnych, co u³atwia usuwanie tych patogenów przez neutrofile na drodze fagocytozy [7].
Rozpoznanie zwi¹zanych z patogenami wzorów molekularnych (PAMP) przez
specyficzne receptory generuje sygna³y, które aktywuj¹ z kolei mechanizmy uczestnicz¹ce w swoistej odpowiedzi odpornoœciowej. Ale zanim dojdzie do inicjacji tych
mechanizmów antygen bakteryjny oprócz tego, ¿e zostanie zwi¹zany na powierzchni
komórki musi równie¿ zostaæ przetworzony i odpowiednio zaprezentowany na
powierzchni komórek APC (antigen presenting cells), do których zaliczane s¹ przede
wszystkim makrofagi i komórki dendrytyczne – DC (dendritic cells). W procesie
tym uczestnicz¹ receptory endocytarne zdolne do rozpoznawania cz¹stek charakterystycznych dla mikroorganizmów. Przyk³adem takich receptorów jest makrofagowy
304
Rys. 2. Wzajemne interakcje miêdzy specyficzn¹ i niespecyficzn¹ odpowiedzi¹ immunologiczn¹
receptor mannozowy, który wi¹¿e siê do komponentów œciany komórkowej mikroorganizmów i poœredniczy w fagocytozie i przetwarzaniu patogenów przez APC
[31]. Bia³ka mikroorganizmów ulegaj¹ strawieniu w endosomach, a¿ do utworzenia
peptydów, zdolnych do tworzenia kompleksów z MHC klasy II na powierzchni APC.
Peptydy te rozpoznawane s¹ nastêpnie przez receptory komórek T – TCR (T cell
receptor), które ulegaj¹ aktywacji za poœrednictwem sygna³ów p³yn¹cych zarówno
od TCR, jak i generowanych w wyniku oddzia³ywania moleku³ kostymulacyjnych
np. CD80 na makrofagach z CD28 na komórkach T ( rys. 2) [31].
Rozpoznanie swoistych wysokokonserwowanych u mikroorganizmów struktur
indukuje zatem ekspresjê wielu moleku³ kostymulacyjnych i sekrecjê licznych cytokin, które wspó³pracuj¹c b¹dŸ dzia³aj¹c niezale¿nie wywo³uj¹ i wzmacniaj¹ swoist¹
i nieswoist¹ odpowiedŸ immunnologiczn¹ gospodarza przeciw intruzowi.
Komórkami aktywowanymi przez LPS s¹ g³ównie makrofagi [29]. Pobudza on
makrofagi do wywarzania trzech grup silnych mediatorów: bia³ek (TNF", IL1, IL6,
IL8, interferon), aktywnych zwi¹zków tlenowych (tlen, nadtlenek wodoru, tlenek
azotu) i lipidów (prostaglandyny, tromboksan A2, czynnik aktywuj¹cy p³ytki krwi,
leukotrieny), które dzia³aj¹c niezale¿nie, razem lub w odpowiedniej kolejnoœci mog¹
wywo³ywaæ ró¿ne efekty [53]. Kluczowym bia³kiem, a zarazem jednym z g³ównych
mediatorów wydzielanych przez makrofagi jest TNF" [53]. Wywo³uje on ró¿ne
305
Rys. 3. Wp³yw lipopolisacharydu – LPS na makrofagi
reakcje – wydzielany w miejscu zaka¿enia lub guza nowotworowego przyci¹ga ró¿ne komórki, które zwalczaj¹ zaka¿enie lub niszcz¹ komórki guza; stymuluje komórki
œródb³onka, co objawia siê wiêkszym przyleganiem granulocytów do powierzchni
naczyñ; podwy¿sza poziom bia³ek ostrej fazy we krwi oraz bezpoœrednio dzia³a
na granulocyty, co wywo³uje zwiêkszon¹ migracjê granulocytów do uszkodzonej
tkanki. Pozosta³e bia³ka uwalniane przez makrofagi indukuj¹ podobne efekty. Ponadto TNF" wraz IL1 aktywuje limfocyty T, a te z kolei produkuj¹ IL2 – cytokinê
uczestnicz¹c¹ w aktywacji komórek T i B. Pobudzone makrofagi uwalniaj¹ tak¿e
szereg lipidów, które przyczyniaj¹ siê g³ównie do wzrostu temperatury i reguluj¹
aktywnoœæ komórek uk³adu odpornoœciowego. Natomiast aktywne zwi¹zki tlenowe
dzia³aj¹c wewn¹trz komórek makrofagów b¹dŸ na ich powierzchni przyczyniaj¹ siê
do niszczenia bakterii [53] (rys. 3).
Wytwarzane przez makrofagi substancje s¹ pomocne w ograniczaniu zaka¿enia
przez wywo³anie zlokalizowanej i kontrolowanej odpowiedzi immunologicznej.
Takie efekty jak stan podgor¹czkowy oraz pobudzenie uk³adu immunologicznego
przyœpieszaj¹ zazwyczaj wyzdrowienie i chroni¹ przed innymi zaka¿eniami bakteryjnymi. Gdy zaka¿enie jest ciê¿kie, to w organizmie jest znaczna iloœæ bakterii,
306
które szybko siê mno¿¹ i produkuj¹ ogromne iloœci LPS, który z kolei kr¹¿¹c we
krwi kontaktuje siê z makrofagami i powoduje wydzielanie du¿ej iloœci mediatorów.
Dla organizmu gospodarza ma to bardzo negatywne skutki, a mo¿e nawet doprowadziæ do wstrz¹su zagra¿aj¹cemu ¿yciu tzw. wstrz¹su septycznego [53].
LPS wykazuje równie¿ aktywnoœæ bez poœrednictwa mediatorów. Wykazuje on
aktywnoœæ mitogenn¹ wobec limfocytów B i wzmaga aktywnoœæ komórek NK.
Ma on tak¿e zdolnoœæ aktywacji klasycznej drogi dope³niacza przez bezpoœrednie
zwi¹zanie lipidu A do czynnika C1 [27].
3. Budowa i aktywnoϾ biologiczna peptydoglikanu (mureiny)
Peptydoglikan (PGN, mureina) to podstawowy sk³adnik bakteryjnych œcian komórkowych. Jest to heteropolimer zbudowany z N-acetyloglukozaminy (GlcNAc)
i kwasu N-acetylomuraminowego (MurNAc), po³¹czonych wi¹zaniem $-1,4-glikozydowym, gdzie grupa karboksylowa w MurNAc mo¿e byæ podstawiona krótkim peptydem (g³ównie 5 aminokwasów, zarówno D, jak i L) tworz¹cym usieciowanie mureiny.
Szczególnie obfity peptydoglikan wystêpuje u bakterii Gram-dodatnich, gdzie mo¿e
stanowiæ nawet po³owê masy œciany komórkowej [17, 27, 40].
Komórki gospodarza s¹ nara¿one na du¿e iloœci nierozpuszczalnego PGN w postaci debris œcian komórkowych, ale tak¿e w postaci rozpuszczalnego nieusieciowanego PGN, który uwalniaj¹ bakterie podczas normalnych procesów wzrostowych (metaboliczny obrót mureiny) b¹dŸ te¿ w obecnoœci antybiotyków $-laktamowych. [27].
Innym mechanizmem powoduj¹cym uwalnianie mureiny do œrodowiska s¹ procesy
autolizy bakteryjnej, do której dochodzi wówczas, gdy w pewnych warunkach enzymy rozszczepiaj¹ce wi¹zania w mureinie dzia³aj¹ w sposób niekontrolowany, prowadz¹c do degradacji woreczka mureinowego i œmierci komórki. Równie¿ w surowicy
krwi wystêpuje szereg czynników (poliaminy, polikationy) oraz bia³ek kationowych
(rybonukleaza, lizozym, amidaza, N-acetyloglukozamidaza), które mog¹ indukowaæ
autolizê komórek bakteryjnych. Procesy degradacji PGN zachodz¹ tak¿e podczas
fagocytozy bakterii przez makrofagi, gdy¿ w lizosomach obecne s¹ równie¿ enzymy
degraduj¹ce mureinê. Bardzo wa¿n¹ drog¹ pojawiania siê muropeptydów czyli podstawowych jednostek strukturalnych mureiny w p³ynach ustrojowych jest sorpcja
z jelita cienkiego, w którym s¹ zwykle bardzo du¿e iloœci wolnej mureiny [27].
PGN jako charakterystyczny sk³adnik bakteryjnych œcian komórkowych podobnie jak LPS rozpoznawany jest przez specyficzne dla niego receptory. Jedn¹ z grup
tego typu cz¹stek s¹ PGRP (peptydoglycan recognition proteins) czyli bia³ka rozpoznaj¹ce PGN, które s¹ szeroko rozpowszechnionymi i konserwatywnymi bia³kami
wystêpuj¹cymi ju¿ u owadów [25]. Wysok¹ ekspresjê mRNA dla PGRP obserwuje
siê w komórkach szpiku – g³ównie w neutrofilach, a ni¿sz¹ w innych tkankach limfatycznych. Sugeruje to udzia³ ssaczych PGRP w odpornoœci, jakkolwiek dok³adny
rodzaj komórek wykazuj¹cych ekspresjê PGRP, jak i funkcja tych bia³ek nie jest
do koñca znana. Wiadomo, ¿e ssacze PGRP funkcjonuj¹ jako wewn¹trzkomórkowe
antybakteryjne bia³ka w neutrofilach i hamuj¹ wzrost bakterii Gram-dodatnich,
307
a tak¿e przyczyniaj¹ siê do zahamowania kilku zaindukowanych przez bakterie
w makrofagach i neutrofilach procesów (fagocytoza bakterii Gram-dodatnich w makrofagach, wybuch tlenowy w neutrofilach, produkcja cytokin zaindukowana przez
PGN w makrofagach) [25]. Najprawdopodobniej mo¿na je zaliczyæ do grupy PRR
podobnie jak wspomniany ju¿ CD14, który równie¿ posiada zdolnoœæ rozpoznawania i wi¹zania mureiny [9]. Specyficznoœæ PGRP jest jednak znacznie bardziej ograniczona w porównaniu z CD14. PGRP wi¹¿¹ z wysok¹ specyficznoœci¹ tylko rozpuszczalny, nieusieciowany i niezmodyfikowany PGN, a nie rozpoznaj¹ w ogóle
innych komponentów œcian komórkowych bakterii takich jak np. LPS czy kwasy
lipotejchojowe – LTA. CD14 wi¹¿e natomiast wszystkie te struktury z takim samym
powinowactwem. Po drugie PGRP ulegaj¹ ekspresji wy³¹cznie w PMN (polymorphonuclear leukocytes), gdzie s¹ obecne wewn¹trz ziaren i funkcjonuj¹ jako wewn¹trzkomórkowe bia³ka o w³aœciwoœciach antybakteryjnych. CD14 jest z kolei
receptorem powierzchniowym wystêpuj¹cym przede wszystkim na monocytach
i makrofagach, poœrednicz¹cym w odpowiedzi zapalnej komórek. Ponadto CD14
mo¿e byæ obecny równie¿ w formie rozpuszczalnej w osoczu, gdzie funkcjonuje
jako aktywator komórek CD14– i wzmacnia odpowiedŸ komórek CD14+. Bia³ka te
nie wykazuj¹ tak¿e ¿adnej strukturalnej i sekwencyjnej homologii [25]. CD14 mo¿e
zatem s³u¿yæ jako receptor zarówno dla LPS, jak i PGN. W przypadku LPS
najpierw powstaje w osoczu kompleks LPS-LBP, a dopiero nastêpnie za poœrednictwem CD14 i TLR4 dochodzi do aktywacji komórki. Natomiast w przypadku
mureiny w aktywacji uczestnicz¹ tylko CD14 i TLR 2 [40], który funkcjonuje jako
heterodimer z TLR6 [1, 19] lub TLR1 [1, 21], co stwarza mo¿liwoœæ rozpoznawania
wiêkszego repertuaru czasteczek.
Muropeptydy oddzia³ywuj¹ na organizm gospodarza g³ównie za poœrednictwem
makrofagów [40]. Do najwa¿niejszych oddzia³ywañ na makrofagi mo¿na zaliczyæ:
zahamowanie syntezy DNA; zahamowanie migracji makrofagów i zwiêkszenie ich
przylegania do powierzchni; zwiêkszenie iloœci wydzielanych metabolitów tlenowych,
które uczestnicz¹ w procesach niszczenia drobnoustrojów i komórek nowotworowych;
przed³u¿enie ¿ycia makrofagów. Muropeptydy stymuluj¹ równie¿ silnie wydzielanie
ró¿nego rodzaju czynników przez monocyty i makrofagi np. GM-CSF – czynnik stymuluj¹cy powstawanie kolonii makrofagów i granulocytów, czynnik FAF aktywuj¹cy
fibroblasty, czynnik snu, IL1, IL6, IL8 i TNF" [40]. Aktywacja makrofagów i sekrecja przez nie mediatorów powoduje z kolei aktywacjê limfocytów B i T. PGN oddzia³ywuje na limfocyty B równie¿ bezpoœrednio jako nieswoisty poliklonalny aktywator,
co wywo³uje produkcjê przeciwcia³ i limfokin przez zaktywowane komórki B. Natomiast aktywacja komórek T prowadzi do sekrecji limfokin, ale równie¿ przyczynia siê
do powstawania cytotoksycznych komórek T [27].
5. Inne sk³adniki os³on bakteryjnych o w³aœciwoœciach antygenowych
Œciany komórkowe wszystkich bakterii Gram-dodatnich oprócz PGN zawieraj¹
kwasy tejchojowe albo tejchuronowe, a niektóre zawieraj¹ mieszaninê obu tych kwa308
sów. Równie powszechnie w œcianach komórkowych bakterii Gram-dodatnich wystêpuj¹ kwasy lipotejchojowe – LTA oraz bia³ka, których iloœæ oraz znaczenie ró¿ni
siê w zale¿noœci od gatunku, a nawet szczepu [27]. Kwasy tejchojowe s¹ polimerami
fosforanów glicerolu lub rybitolu. Kwasy tejchuronowe natomiast s¹ d³ugimi polimerami zbudowanymi z powtarzaj¹cych siê jednostek – zwykle naprzemiennie wystêpuj¹cych reszty cukrowej i reszty kwasu uronowego np. glukuronowego. Natomiast
cech¹ charakterystyczn¹ LTA jest wystêpowanie na koñcu ³añcucha glikolipidu
zakotwiczonego w b³onie cytoplazmatycznej [17]. Glicerolowe kwasy tejchojowe
maj¹ zdolnoœæ modulacji odpowiedzi immunologicznej organizmu. Modulacja ta
przebiega najprawdopodobniej ró¿nymi szlakami i przy wspó³udziale wszystkich
g³ównych populacji komórek tworz¹cych uk³ad odpornoœciowy. Powoduj¹ one miêdzy innymi aktywacjê makrofagów, aktywacjê limfocytów T w obecnoœci makrofagów i bezpoœredni¹ poliklonaln¹ aktywacjê komórek B. LTA wydzielane s¹ przez
rosn¹ce bakterie w du¿ych iloœciach do otaczaj¹cych tkanek podczas bakteriolizy
indukowanej przez lizozym, antybiotyki hamuj¹ce syntezê makromoleku³ œciany
lub leukocytarne peptydy kationowe. Najwa¿niejsze z biologicznych w³aœciwoœci
LTA to: antygenowoœæ – indukuj¹ wytwarzanie przeciwcia³, aktywuj¹ dope³niacz
i powoduj¹ uwolnienie przez neutrofile i makrofagi reaktywnych zwi¹zków tlenu,
tlenku azotu, cytokin (TNF", IL1, IL6, IL10) i innych czynników zapalnych [18].
Do komórek docelowych LTA mog¹ wi¹zaæ siê niespecyficznie za poœrednictwem
b³onowych fosfolipidów albo specyficznie przy udziale CD14 i TLR2 [8].
Z os³onami bakteryjnymi zwi¹zanych jest równie¿ wiele bia³ek. Jedn¹ z takich
grup s¹ bakteryjne lipoproteiny, wystêpuj¹ce u wszystkich Eubacteria i bêd¹ce silnymi stymulatorami odpowiedzi immunologicznej [27]. Za biologiczne w³aœciwoœci tych
bia³ek odpowiedzialna jest zmodyfikowana reszta cysteinowa na N-koñcu, podstawiona przez trzy reszty kwasu palmitynowego. Lipoproteiny aktywuj¹ g³ównie makrofagi przy udziale TLR2 i CD14, prowadz¹c do rozwoju odpowiedzi zapalnej [2,55].
Antygenowoœæ wykazuj¹ tak¿e poryny b³ony zewnêtrznej [17]. Jednym z takich
bia³ek jest OmpA, które jest szeroko rozpowszechnione i konserwowane wœród
Enterobacteriaceae. Innymi bia³kami, o których warto wspomnieæ to poryny
– OmpC i OmpF. Obserwacje wskazuj¹, ¿e OmpC Salmonella enterica sv. Typhimurium poœredniczy w adherencji do makrofagów, natomiast peptydy wywodz¹ce siê
z Omp F E. coli wzmacniaj¹ cytotoksycznoœæ tych komórek [27]. Doœwiadczenia
potwierdzaj¹ równie¿, ¿e bia³ko OmpA jest rozpoznawane i wi¹zane przez makrofagi, a nastêpnie ulega internalizacji, co w rezultacie prowadzi do aktywacji tych
komórek oraz produkcji TNF", IL1, IL8 i innych cytokin zapalnych oraz rodników
tlenowych, które uczestnicz¹ w odpowiedzi antybakteryjnej [41]. Prowadzono równie¿ badania z bia³kiem porynowym PorB Neisseria meningitidis i stwierdzono, ¿e
bia³ko to wykazuje zdolnoœæ do stymulacji limfocytów B i nadregulacji powierzchniowej ekspresji moleku³y B7-2 (CD86). Znacz¹c¹ rolê w tym procesie odgrywa
TLR2, który jest zdolny do rozpoznawania du¿ej grupy antygenów bakteryjnych.
Sugeruje siê tak¿e, ¿e poryny jako bia³ka zdolne do tworzenia kana³ów w b³onach
bakteryjnych mog¹ aktywowaæ komórki uk³adu immunologicznego równie¿ przez
tworzenie kana³ów jonowych w ich b³onach [28].
309
Tak¿e na zewnêtrznej powierzchni komórki bakteryjnej mog¹ wystêpowaæ struktury o w³aœciwoœciach antygenowych. Przyk³adem mog¹ byæ dwa rodzaje wypustek
zakotwiczonych w os³onach – s¹ to d³ugie rzêski i znacznie krótsze oraz zwykle od
nich liczniejsze fimbrie (pili). Komórki Gram-ujemne zwykle maj¹ i rzêski i fimbrie,
natomiast rzadko struktury te wystêpuj¹ u bakterii Gram-dodatnich. Rzêski umo¿liwiaj¹ bakteriom poruszanie siê i zbudowane s¹ z bia³ka flagelliny, które mo¿e byæ
bakteryjnym czynnikiem wirulencji i jest rozpoznawane przez TLR5 [2, 21], co powoduje aktywacjê NF6B i wydzielanie TNF" [14, 55]. Fimbrie, czyli pili s¹ z kolei
cienkimi wyrostkami zbudowanymi z bia³ka piliny i odgrywaj¹ wa¿n¹ rolê podczas
koniugacji – uczestnicz¹ w transferze materia³u genetycznego z komórki do komórki
[17]. U niektórych gatunków poœrednicz¹ tak¿e w adhezji. S¹ one umieszczone na
zewn¹trz komórki, nie s¹ os³oniête materia³em otoczkowym i maj¹ silne w³aœciwoœci
antygenowe. Stwierdzono, ¿e fimbrie powoduj¹ uwalnianie wielu cytokin z komórek
epitelialnych, monocytów, makrofagów, fibroblastów i limfocytów [17].
6. Immunogenne w³aœciwoœci DNA
Równie¿ DNA bakteryjne stanowi silny antygen. Wynika to z faktu, ¿e w DNA
bakteryjnym wystêpuj¹ struktury i sekwencje, które nie s¹ obecne w DNA ssaków
i to w³aœnie one rozpoznawane s¹ przez uk³ad immunologiczny jako obce [35, 44].
Podstawowa ró¿nica miêdzy DNA bakteryjnym a ssaczym polega na tym, ¿e
w DNA bakteryjnym obecna jest du¿a iloœæ tzw. sekwencji CpG, natomiast w genomie krêgowców dinukleotydy CpG s¹ rzadkie, a dodatkowo ulegaj¹ preferencyjnej
metylacji w pozycji pi¹tej cytozyny [16, 24]. U ssaków metylacja CpG i ma³a iloœæ
tych sekwencji zapobiega aktywacji uk³adu immunologicznego przez DNA gospodarza [51]. Wiêkszoœæ zmetylowanych sekwencji CpG wystêpuje w promotorach
genów, czyli w miejscach inicjacji replikacji i transkrypcji DNA. Pozosta³e czêœæ
funkcjonuje jako niezmetylowane wyspy CpG do³¹czone do koñca 5' wielu genów.
Sugeruje siê zatem, ¿e krêgowce pozostawi³y metylacjê DNA jako mechanizm
obronny przed obcym DNA, które mog³oby siê wintegrowaæ w ich genom [50].
Prowadzono równie¿ badania z DNA wywodz¹cym siê od bezkrêgowców (owady
– D. melanogaster, dro¿d¿e, nicienie i miêczaki) i stwierdzono, ¿e wywiera on podobny do bakteryjnego DNA wp³yw na uk³ad immunologiczny, gdy¿ podobnie jak
DNA drobnoustrojów zawiera niezmetylowane dinukleotydy CpG. Nale¿y wspomnieæ, ¿e aktywacji nie powoduje DNA bakteryjne, które w warunkach doœwiadczalnych poddano metylacji, a tak¿e DNA strawione DNA-z¹ [50].
DNA podobnie jak inne antygeny bakteryjne rozpoznawane jest przez komórki
APC (makrofagi, DC i monocyty). Do wnêtrza komórki DNA przedostaje siê na
drodze endocytozy, a nastêpnie dochodzi do generowania specyficznych metabolitów tlenowych – ROS (reactive oxygen species) [30], co z kolei przyczynia siê do
indukcji fosforylacji inhibitora I6B, jego degradacji i uwolnienia NF6B [43]. NF6B
przemieszcza siê do j¹dra, gdzie uczestniczy w regulacji transkrypcji wielu genów
[24]. Jednak¿e ekspresja nie wszystkich genów uczestnicz¹cych w odpowiedzi
310
Rys. 4. Schemat drogi sygnalnej zainicjowanej przez bakteryjne DNA (CpG DNA)
a – endocytoza, b – powstawanie reaktywnych metabolitów tlenowych – ROS, c – indukcja fosforylacji I6B przez
ROS, d – degradacja I6B, e – translokacja NF6B do j¹dra, f – fosforylacja kinazy JNK i p38, g – fosforylacja c-Jun
aktywuj¹cego czynnik transkrypcyjny ATF-2, h – aktywacja AP-1, i – translokacja AP-1 do j¹dra
immunologicznej regulowana jest za poœrednictwem NF6B. Do indukcji mo¿e dojœæ
równie¿ w inny sposób – przy udziale kaskady sygna³owej, w której uczestniczy
du¿a grupa kinaz bia³kowych, co w rezultacie aktywuje inny czynnik transkrypcyjny
– AP1, który równie¿ wêdruje do j¹dra i wyzwala sekrecjê cytokin (TNF",
IL1, IL12) oraz syntezê moleku³ kostymulacyjnych (CD80,CD86, CD40) [10]
(rys. 4). Na komórki B bakteryjne DNA mo¿e dzia³aæ bezpoœrednio wywo³uj¹c ich
proliferacjê i syntezê przeciwcia³. CpG DNA bezpoœrednio aktywuje równie¿
komórki NK [42, 44], co prowadzi do wzrostu ich aktywnoœci litycznej i produkcji
IFN(. Nie wykazano natomiast bezpoœredniego wp³ywu DNA drobnoustrojów na
limfocyty T. Stymulacja tych komórek przebiega poœrednio za spraw¹ dojrza³ych
APC, ich moleku³ kostymulacyjnych i wydzielanych przez nie cytokin. Aktywne
komórki T wydzielaj¹ IL2 oraz wzmagaj¹ ekspresjê receptora dla IL2, a tak¿e
ulegaj¹ wzmo¿onej proliferacji i przekszta³caj¹ siê w komórki CTL (cytotoxic T
lymphocytes) [37] (rys. 5). Efekt stymulacji przez bakteryjne DNA jest prawie identyczny jak w przypadku LPS – istniej¹ jednak pewne ró¿nice. CpG DNA indukuj¹
odpowiedŸ w komórkach i organach, które s¹ odporne na dzia³anie LPS. LPS
potrzebuje obecnoœci LBP w surowicy i musi zostaæ zwi¹zany przez to bia³ko, ¿eby
311
Rys. 5. Aktywacja komórek uk³adu immunologicznego przez CpG DNA
- - - - – aktywacja niebezpoœrednia (kostymulacja)
–––– – aktywacja bezpoœrednia
↑ – nadregulacja syntezy i sekrecji; bakteryjne DNA stymuluje bezpoœrednio komórki B, NK i APC
(DC, makrofagi). Komórki T ulegaj¹ kostymulacji za poœrednictwem moleku³ powierzchniowych
zaindukowaæ odpowiedŸ. Aktywacja przy udziale CpG DNA jest z kolei wra¿liwa
na inhibitory endocytozy, w zwi¹zku z czym inicjacja drogi sygnalnej przez LPS
i DNA bakteryjne musi przebiegaæ nieco inaczej [16]. Jednak¿e obie te drogi aktywacyjne w pewnym momencie ³¹cz¹ siê i nastêpuje to najprawdopodobniej na
etapie indukcji czynników transkrypcyjnych. Zatem zarówno DNA, jak i LPS
wywieraj¹ podobny wp³yw na komórki uk³adu immunologicznego – w wyniku
nadmiernej aktywacji i nadprodukcji mog¹ wyst¹piæ liczne stany zapalne, szok
septyczny, a nawet œmieræ organizmu gospodarza.
OdpowiedŸ na bakteryjne DNA odbywa siê za poœrednictwem TLR9 [1, 3,
19, 21, 55]. Lokalizacja receptora rozpoznaj¹cego CpG nadal pozostaje spraw¹
dyskusyjn¹. Istnieje jednak wiele dowodów wskazuj¹cych na to, i¿ TLR9 nie jest
312
zlokalizowany na powierzchni komórki ale w jej wnêtrzu [3]. Przemawia za tym
miêdzy innymi fakt, ¿e do aktywacji komórki niezbêdna jest internalizacja CpG
[19], a inhibitory endocytozy jak np. bafilomycyna A hamuj¹ kaskadê sygnaln¹
zainicjowan¹ przez bakteryjne DNA [16].
W zwi¹zku ze specyficznymi w³aœciwoœciami bakteryjnego DNA istniej¹ du¿e
szanse na wykorzystanie plazmidowego DNA b¹dŸ te¿ syntetycznych pochodnych
tzw. CpG ODN (syntetyczne oligodeoksynukleotydy z sekwencjami CpG) jako
szczepionki lub adjuwanty w szczepionkach przeciw bakteriom, paso¿ytom i wirusom [37, 46]. Szczepionki bazuj¹ce na bakteryjnym DNA maj¹ wiele zalet w stosunku do obecnie stosowanych szczepionek: nie ma mo¿liwoœci rewersji do postaci
wirulentnej; s¹ ³atwe do wyprodukowania, podczas gdy wiele do tej pory wykorzystywanych antygenów jest technicznie trudna do uzyskania. DNA bakteryjne
wywo³uje równie¿ in vivo polaryzacjê limfocytów T w kierunku populacji Th1,
co stwarza przes³anki do zastosowania go w immunoterapii np. w alergiach jako
adjuwanty promuj¹ce odpowiedŸ Th1 [20, 24, 51].
8. Mimikra molekularna i jej rola w etiologii chorób
Pisz¹c o antygenach bakteryjnych nale¿y równie¿ wspomnieæ o zjawisku okreœlanym jako mimikra molekularna. Mo¿na j¹ zdefiniowaæ jako podobieñstwo strukturalne ró¿nych moleku³ pochodz¹cych od ró¿nych genów. Podobieñstwo to mo¿e wynikaæ z podobnej sekwencji aminokwasów lub podobnej konformacji cz¹steczki i mo¿e
wystêpowaæ u bardzo odrêbnych grup organizmów [26]. OdpowiedŸ immunologiczna
przeciwko determinantom antygenowym wystêpuj¹cym zarówno u gospodarza, jak
i patogenu mo¿e doprowadziæ do tkankowo-specyficznej odpowiedzi immunologicznej, która z kolei mo¿e wywo³aæ destrukcjê komórek i tkanek w wyniku reakcji
autoimmunologicznej. Mimikra molekularna mo¿e byæ zatem strategi¹ wykszta³con¹
przez patogeny, umo¿liwiaj¹c¹ im wnikniêcie do organizmu gospodarza, dotarcie do
komórki docelowej, a nastêpnie manipulowanie wewn¹trz- i zewn¹trzkomórkowymi
procesami w celu wymkniêcia siê spod kontroli uk³adu odpornoœciowego gospodarza.
Podobieñstwo miêdzy antygenami drobnoustrojów takimi jak: wêglowodany, lipopolisacharydy, glikolipidy czy bia³ka, i autoantygenami organizmu cz³owieka sprawia, ¿e
nawet ³agodne w przebiegu zaka¿enie mo¿e doprowadziæ do rozwoju reakcji krzy¿owej, a w konsekwencji do rozwoju choroby autoimmunologicznej [52].
Do chorób, których etiologia wi¹zana jest z mimikr¹ molekularn¹ nale¿¹ miêdzy
innymi: gor¹czka reumatyczna (rheumatic fever), przewlek³y goœciec postêpuj¹cy (rheumatic arthritis), pierwotna marskoœæ ¿ó³ciowa (PBC – primary biliary
cirrhosis) [52].
G³ówn¹ przyczyn¹ gor¹czki reumatycznej – RF i jej formy ostrej – ARF (acute
rheumatic fever) s¹ paciorkowce grupy A – bakterie Gram-dodatnie, które mog¹
wywo³ywaæ równie¿ zaka¿enia gard³a i krtani oraz prowadziæ do licznych powik³añ. Powik³ania te zwi¹zane s¹ miêdzy innymi z wystêpowaniem podobieñstw miêdzy sk³adnikami œciany komórkowej paciorkowców (wêglowodany, mukopeptydy,
313
bia³ka – M, R i T) a tkankami ludzkimi. Natomiast wydaje siê, ¿e na patogenezê
gor¹czki reumatycznej mo¿e mieæ znaczny wp³yw strukturalne podobieñstwo
bia³ek M do bia³ek ludzkich takich jak: tropomiozyna, keratyna i wimentyna [52].
Mimikra cz¹steczkowa jest równie¿ jedn¹ z przyczyn przewlek³ego goœæca postêpuj¹cego – RA. Antygenami bakteryjnymi, które s¹ prawdopodobnie zwi¹zane z wystêpowaniem tego schorzenia s¹ bia³ka szoku termicznego (heat shock proteins),
okreœlane równie¿ jako bia³ka stresu [36]. W organizmie ludzkim dochodzi tak¿e do
ekspresji bia³ek wstrz¹su termicznego, które pojawiaj¹ siê na powierzchni komórek
gospodarza w tkankach dotkniêtych procesem zapalnym. Odkryto mimikrê cz¹steczkow¹ miêdzy Hsp65 z Mycobacterium tuberculosis a antygenami hsp tkanki chrzêstnej czlowieka, co wp³ywa na powstawanie autoprzeciwcia³ i stymulacjê limfocytów
T. Istniej¹ tak¿e dane dotycz¹ce zwi¹zku pa³eczek jelitowych E.coli z wystêpowaniem goœæca na skutek mimikry molekularnej pomiêdzy Hsp60 cz³owieka i Hsp60
E. coli. Warto wspomnieæ, ¿e bia³ka szoku cieplnego i to zarówno prokariotyczne,
jak i eukariotyczne wykazuj¹ silne w³aœciwoœci immunoregulacyjne oraz posiadaj¹
zdolnoœæ do indukcji odpowiedzi zapalnej [2], co mo¿e stanowiæ podstawê teorii, ¿e
bia³ka Hsp mog¹ byæ ogniwem pomiêdzy infekcj¹ a chorob¹ autoimmunologiczn¹
[36]. Wiele dowodów wskazuje na to, ¿e bia³ka Hsp takie jak: Hsp60, Hsp70, Hsp90
i GP96 aktywuj¹ makrofagi i komórki DC za poœrednictwem TLR2 i TLR4 [1].
Pa³eczka jelitowa E.coli jest równie¿ brana pod uwagê jako czynnik patogenny
w pierwotnej marskoœci ¿ó³ciowej – PBC. Badania wykazuj¹, ¿e podobieñstwo
miêdzy podjednostk¹ E2 dehydrogenazy pirogronianowej cz³owieka i tak¹ sam¹
podjednostk¹ enzymu z E.coli mo¿e byæ czynnikiem zapocz¹tkowywuj¹cym reakcjê autoimmunologiczn¹, w której bior¹ udzia³ zarówno limfocyty T, jak i autoprzeciwcia³a antymitochondrialne, co prowadzi do destrukcji przewodów ¿ó³ciowych
i zniszczenia w¹troby [52].
Istnieje jeszcze wiele innych chorób, których wystêpowanie wi¹zane jest z mimikr¹ cz¹steczkow¹ – choroba Gravesa i Basedowa, miastenia, zesztywniaj¹ce
zapalenie stawów krêgos³upa [52], borelioza – choroba z Lyme [15, 54], choroba
wrzodowa zwi¹zana z Helicobacter pylori [47, 49], zapalenie opon mózgowych wywo³ane przez E.coli K1, Neisseria meningitidis grupy B i Streptococcus grupy B,
zespó³ Guillaina-Barrego (GBS) [23], choroby serca zwi¹zane z zaka¿eniem Chlamydia [5]. We wszystkich tych schorzeniach du¿¹ rolê odgrywa autoimmunologiczna reakcja organizmu wynikaj¹ca z podobieñstw pomiêdzy antygenami ludzkimi
i bakteryjnymi. Dok³adne poznanie tego zjawiska stanowi du¿e wyzwanie dla badaczy, gdy¿ bêdzie mia³o du¿e znaczenie praktyczne zarówno w leczeniu, jak i profilaktyce. Dotyczy to g³ównie szczepionek, w przygotowaniu których nale¿y koniecznie wykluczyæ antygeny wspólne dla bakterii i gospodarza.
9. Podsumowanie
Ostatnie lata przynios³y znacz¹cy postêp w zrozumieniu wrodzonych mechanizmów odpornoœciowych. Sta³o siê to dziêki identyfikacji receptorów specyficznych
dla produktów bakteryjnych, poznaniu zasadniczych elementów komórkowych dróg
314
sygnalnych i g³ównych mediatorów, produkowanych przez komórki w odpowiedzi
na infekcje. Stworzy³o to solidne podstawy do dalszych badañ w tej dziedzinie,
które dotyczyæ bêd¹ najprawdopodobniej analizy polimorfizmu TLRs oraz zrozumienia, jak poszczególne receptory TLR rozpoznaj¹ specyficzne dla siebie ligandy.
Piœmiennictwo
1. Akira S.: Mammalian Toll-like receptors. Curr. Opin. Immunol. 15, 5–11 (2003)
2. Aderem A., Ulevitch R.J.: Toll-like receptors in the induction of the innate immunne response.
Nature, 406, 782–787 (2000)
3. Ahmad-Nejad P., Hacker H., Rutz M., Bauer S., Vabulas R.M., Wagner B.: Bacterial CpG-DNA and
lipopolysaccharides activate Toll-like receptors at distinct cellular compartments. Eur. J. Immunol.
32, 1958–1968 (2002)
4. Anderson K.V.: Toll signaling pathways in the innate immune response. Curr. Opin. Immunol. 12,
13–19 (2000)
5. Bachmaier K., Le J., Penninger J.M.: „Catching heart disease”: Antigenic mimicry and bacterial
infections. Nature Medicin, 6, 841–843 (2000)
6. Brightbill H.D., Modlin R.L.: Toll-like receptors: molecular mechanisms of the mammalian
immune response. Immunol. 101, 1–10 (2000)
7. Canny G., Levy O., Furuta G., Narravula-Alipati S., Sisson R.B., Serhan Ch.N., Colgan S.P.:
Lipid mediator-induced expression of bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) in
human mucosal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 3902–3907 (2002)
8. Ginsburg I.: Role of lipoteichoic acid in infection and inflammation. Lancet, 2, 171–179 (2002)
9. Gupta D., Kirkland T.N., Viriyakosol S., Dziarski R.: CD14 is a cell activating receptor for bacterial peptidoglycan. J. Biol. Chem. 271, 23310–23316 (1996)
10. Häcker H., Mischak H., Miethke T., Liptay S., Schmid R., Sparwasser T., Heeg K., Lipford G.,
Wagner H.: CpG-DNA-specific activation of antigen-presenting cells requires stress kinase
activity and is preceded by non-specific endocytosis and endosomal maturation. EMBO J. 17,
6230–6240 (1998)
11. Haddad J.J., Fahlman C.S.: Nuclear factor-6B-independent regulation of lipopolysaccharidemediated interleukin-6 biosynthesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 291, 1045–1051 (2002)
12. Hajjar A.M., Ernst R.K., Tsai J.H., Wilson C.B., Miller S.I.: Human Toll-like receptor 4 recognizes host-specific modifications. Nat. Immunol. 3, 354–359 (2002)
13. Haudek S.B., Natmessnig B.E., Redl H., Schlag G., Hatlen L.E., Tobias P.S.: Isolation, partial
characterization, and concentration in experimental sepsis of baboon lipopolysaccharide – binding protein. J. Lab. Clin. Med. 136, 363–370 (2000)
14. Hayashi F., Smith K.D., Ozinsky A., Hawn T.R., Yi E.C., Goodlett D.R., Eng J.K., Akira S.,
Underhill D.M., Aderem A.: The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by
Toll-like receptor 5. Nature, 410, 1099–1103 (2001)
15. Hemmer B., Gran B., Zhao Y., Marques A., Pascal J., Tzou A., Kondo T., Cortese I., Bielekova B.,
Straus S.E., McFarland H. F., Houghten R., Simon R., Pinilla C., Martin R.: Identification of candidate T-cell epitopes and molecular mimics in chronic Lyme disease. Nat. Med. 5, 1375–1382 (1999)
16. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K.,
Wagner H., Takeda K., Akira S.: A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature, 408,
740–745 (2000)
17. Henderson B., Poole S., Wilson M.: Bacteria Cytokine Interactions in Health and Disease. Portland Press Ltd. London 1998
18. Hermann C, Spreitzer I., Schroder N.W., Morath S., Lehner M.D., Fischer H., Schutt C., Schumann R.R., Hartung T.: Cytokine induction by purified lipoteichoic acids from various bacterial
species-role of LBP, sCD14, CD14 and failure to increase IL-12 and subsequent IFN-gamma
release. Eur. J. Immunol. 32, 541–551 (2002)
315
19. Imler J-L., Hoffman J.A.: Toll receptors in innate immunity. Trends Cell Biol. 11, 304–311 (2001)
20. Jakob T., Walker P.S., Krieg A.M., Udey M.C., Vogel J.C.: Activation of Cutaneous Dendritic
Cells by CpG-Containing Oligodeoxynucleotides: A Role for Dendritic Cells in the Augmentation of Th1 Responses by Immunostimulatory DNA. J. Immunol. 161, 3042–3049 (1998)
21. Janeway C.A., Medzhitov R.: Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197–216
(2002)
22. Kaisho T., Akira S.: Toll-like receptors as adjuvant receptors. Biochim. Biophys. Acta. 1589, 1–13
(2002)
23. Korzeniowska-Kowal A., Witkowska D., Gamian A.: Mimikra cz¹steczkowa bakteryjnych antygenów polisacharydowych i jej rola w etiologii chorób infekcyjnych i autoimmunologicznych.
Post. Hig. Med. Doœw. 55, 211–232 (2001)
24. Krieg A. M.: The role of CpG motifs in innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 12, 35–43 (2000)
25. Liu Ch., Gelius E., Liu G., Steiner H., Dziarski R.: Mammalian peptidoglycan recognition protein
binds peptidoglycan with high affinity, is expressed in neutrophils and inhibits bacterial growth.
J. Biol. Chem. 275, 24490–24499 (2000)
26. Oldstone M. B.: Molecular mimicry and immune mediated diseases. FASEB J. 12, 1255–126
(1998)
27. Markiewicz Z.: Struktura i funkcje os³on bakteryjnych. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa 1993
28. Massari P., Henneke P., Ho Y., Latz E., Golenbock D.T., Wetzler L.M.: Cutting edge: immune
stimulation by neisserial porins is toll-like receptor 2 and myD88 dependent. J. Immunol. 168,
1533–1537 (2002)
29. Matsuguchi T., Takagi K., Musikacharoen T., Yoshikai Y.: Gene expression of lipopolysaccharide
receptors 2 and 4 are differently regulated in mouse T lymphocytes. Blood, 95, 1378–1385 (2000)
30. McCluskie M.J., Davis H.L.: Novel Strategies Using DNA for the Induction of Mucosal Immunity.
Crit. Rev. Immunol. 19, 303–329 (1999)
31. Medzhitov R., Janeway Ch.: Innate immunity. N. Engl. J. Med. 343: 338–343 (2000)
32. Muta T., Takeshige K.: Essential roles of CD14 and lipopolysaccharide-binding protein for activation of toll-like receptor TLR2 as well as TLR4. Eur. J. Biochem. 268, 4580–4589 (2001)
33. Muzio M., Bosisio D., Polentarutti N., D’amico G., Stoppacciaro A., Mancinelli R., van’t Veer
C., Penton-Rol G., Ruco L.P., Allavena P., Mantovani A.: Differential expression and regulation
of toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells.
J. Immunol. 164, 5998–6004 (2000)
34. Muzio M., Mantovani A.: Toll-like receptors (TLRs) signalling and expression pattern. J. Endotoxin. Res. 7, 297–300 (2001)
35. Pisetsky D.S.: The immunologic properties of DNA. J. Immunol. 156, 421–423 (1996)
36. Pockey G.A.: Heat shock proteins in health and disease: therapeutic targets or therapeutic agents?
Expert Reviews in Molecular Medicine, 21, 1–21 (2001)
37. Polañczyk M.: Immunostimulatory effects of DNA and CpG motifs. Centr. Eur. J. Immunol. 25,
160–166 (2000)
38. Reisser D., Pance A., Jeannin J.-F.: Mechanisms of the antitumoral effect of lipid A. BioEssays,
244, 284–289 (2002)
39. Schuster J.M., Nelson P.S.: Toll receptors: an expanding role in our understanding in human
disease. J. Leukoc. Biol. 67, 767–773 (2000)
40. Schwandner R., Dziarski R., Wesche H., Rothe M., Kirschning C.J.: Peptidoglycan and lipoteichoic acid induced cell activation is mediated by toll-like receptor 2. J. Biol. Chem. 274,
17406–17409 (1999)
41. Soulas C., Baussant T., Aubry Y. D., Barillant N., Caron G., Renno T., Bonnefoy J.-Y., Jeannin P.:
Outer membrane protein A (Omp A) binds to and activates human macrophages. J. Immunol. 165,
2335–2340 (2000)
42. Sparwasser T., Koch E.-S., Vabulas R.M., Heeg K., Lipford G., Ellwart J.H.: Bacterial DNA and
immunostimulatory CpG oligonucleotides trigger maturation and activation of murine dendritic
cells. Eur. J. Immunol. 28, 2045–2054 (1998)
316
43. Sparwasser T., Miethke T., Lipford G., Erdmann A., Häcker H., Heeg K., Wagner H.: Macrophages sense pathogens via DNA motifs: induction of tumor necrosis factor á-mediated shock.
Eur. J. Immunol. 27, 1671–1679 (1997)
44. Stacey K.J., Sweet M.J., Hume D.A.: Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA.
J. Immunol. 157, 2116–2122 (1996)
45. Takeuchi O., Kawai T., Snajo H., Copeland N.G., Gilbert D.J., Jenkins N.A., Takeda K., Akira S.:
TLR6: A novel member of an expanding toll-like receptor family. Gene, 231, 59–665 (1999)
46. Tascon R.E., Ragno S., Lowrie D.B., Colston M.J.: Immunostimulatory bacterial DNA sequences
activate dendritic cells and promote priming and differentiation of CD8+ cells. Immunol, 99,
1–7 (2000)
47. Taylor D.E., Fedorak R.N., Sherburne R.: Antigenic mimicry between Helicobacter pylori and
gastric mucosa: failure to implicate heat-shock protein Hsp60 Using immunoelectron microscopy.
Helicobacter, 4, 148–153 (1999)
48. Triantafilou K., Triantafilou M., Ladha S., Mackie A., Dedrick R.L., Fernandez N., Cherry R.:
Fluorescence recovery after photobleaching reveals that LPS rapidly transfers from CD14 to
hsp70 and hsp90 on the cells membrane. J. Cell Science, 114, 2535–2545 (2001)
49. Vandenbroucke-Grauls C. M., Appelmelk B. J.: Helicobacter pylori LPS: molecular mimicry with
host and role in autoimmunity. Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. 30, 259–260 (1998)
50. Wagner H.: Bacterial CpG DNA Activates Immune Cells to Signal Infection Danger. Adv. Immunol.
73, 329–368 (1999)
51. Weiner G.J.: The immunobiology and clinical potential of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides. J. Leukoc. Biol. 68, 455–463 (2000)
52. Witkowska D.: Mimikra cz¹steczkowa jako czynnik patogennoœci bakterii. Post. Hig. Med. Doœw.
53, 545–558 (1999)
53. Woltmann A., Hamann L., Ulmer A.J., Gerdes J., Bruch H.-P., Rietschel E.T.: Molecular mechanism of sepsis. Arch. Surg. 383, 2–10 (1998)
54. Zajkowska J.M., Hermanowska-Szpakowicz T., Pancewicz S.A., Kondrusik M.: Selected aspects
of immunopathogenesis in Lyme disease. Pol. Merkuriusz Lek. 9, 579–583 (2000)
55. Zarember K.A., Godowski P.J.: Tissue expression of human toll-like receptors and differential
regulation of toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and
cytokines. J. Immunol. 168, 554–561 (2002)
Zak³ad Chirurgii Transplanatacyjnej
Instytut Medycyny Doœwiadczalnej i Klinicznej im. Miros³awa Mossakowskiego PAN
ul. Pawiñskiego 5, 02-106 Warszawa, tel. (022) 608 64 06, (022) 608 64 10 lub (022) 668 53 16
Wp³ynê³o w lutym 2003 r.
317
POST. MIKROBIOL.,
2003, 42, 3, 319–343
http://www.pm.microbiology.pl
ZADANIA LABORATORIÓW
MIKROBIOLOGICZNYCH
W PRZYPADKU
ATAKU BIOTERRORYSTYCZNEGO
Adam Kaznowski, Joanna Mokracka,
Ryszard Koczura
1. Wprowadzenie. 2. Zarys historyczny u¿ycia broni biologicznej. 3. Charakterystyka broni biologicznej. 4. Rola laboratoriów mikrobiologicznych. 4.1. Sytuacje œwiadcz¹ce o u¿yciu broni biologicznej. 4.2. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium mikrobiologicznym 4.3. Organizacja systemu
laboratoriów mikrobiologicznych w USA. 4.4. Opakowywanie i przesy³anie materia³ów zakaŸnych. 4.5. Ochrona laboratorium. 4.6. Identyfikacja wa¿niejszych czynników broni biologicznej.
4.6.1. B. anthracis. 4.6.2. Francisella tularensis. 4.6.3. Yersinia pestis. 4.6.4. Wirus ospy prawdziwej.
4.6.5. Wirusy gor¹czek krwotocznych. 4.6.6. Toksyna botulinowa. 5. Podsumowanie
Role of microbiological laboratories in case of bioterroristic attack
Abstract: The threat of terrorists using biological warfare agents has received increased attention
in recent years. Biological agents have been used as weapon for thousands of years to produce fear
and harm in humans. They are invisible, silent, odorless, tasteless, easy to disperse and inexpensive
to produce. In this article, the properties of the most important biological agents are presented.
A short history of biological weapon usage, and its clinical aspects are described. Microbiology laboratories are considered to be the first lines of defense for recognision of biological agents during
a possible terrorism event. In the USA, laboratories involved in preparedness to bioterrorism have
been classified by CDC into four biosafety levels depending on their facilities and abilities. The
paper focuses on the role of microbiology laboratory in preparation for and response to a bioterroristic
event, clues indicating attack and identification methods of the most important biological agents. The
microbiologists can provide a practical assessment of the biological weapons incident, consequently
the best response to a terroristic incident could be undertaken, many lives saved, panic and crisis
throughout the country avoided.
1. Introduction. 2. Short historical view on using of biological weapon. 3. Characterization of
biological weapon. 4. The role of microbiological laboratories. 4.1. Clues of a biological weapon
attack. 4.2. Biosafety in microbiological laboratories. 4.3. Organization of microbiological laboratory network in the USA. 4.4. Packing and shipping of infectious substances. 4.5. Laboratory
security. 4.6. Identification of the most important biological weapon agents. 4.6.1. B. anthracis.
4.6.2. Francisella tularensis. 4.6.3. Yersinia pestis. 4.6.4. Variola virus. 4.6.5. Hemorrhagic fever
viruses. 4.6.6. Botulinum toxin. 5. Summary
1. Wprowadzenie
Zgodnie z artyku³em I Konwencji o broni biologicznej, która odby³a siê w 1972 r.
w Genewie, zalicza siê do niej „mikrobiologiczne lub inne biologiczne czynniki
lub toksyny, bez wzglêdu na ich pochodzenie lub sposób produkcji, typ lub iloœæ,
których u¿ycie nie jest uzasadnione ze wzglêdów profilaktycznych, ochronnych lub
do innych pokojowych celów” [74].
319
Ataki terrorystyczne na niespotykan¹ skalê przeprowadzone w USA (11 wrzeœnia 2001 r.) i Moskwie (paŸdziernik 2002 r.), doniesienia s³u¿b wywiadowczych
oraz groŸby organizacji terrorystycznych sygnalizuj¹ mo¿liwoœæ zastosowania
tak¿e i broni biologicznej w tego rodzaju akcjach. Przedmiotem ataku mog¹ byæ
bezpoœrednio ludzie [39, 56], a tak¿e zwierzêta hodowlane i uprawy rolne, co
w konsekwencji mo¿e mieæ du¿y wp³yw na cz³owieka [72, 76].
Broñ biologiczna nie jest nowoœci¹, w przesz³oœci stosowano j¹ w dzia³aniach
wojennych, podejmowano tak¿e próby jej u¿ycia w akcjach terrorystycznych [8, 44,
45, 66]. W³aœciwoœci broni biologicznej predestynuj¹ j¹ do zastosowania w atakach
terrorystycznych. U¿ycie jej mo¿e spowodowaæ wysok¹ zachorowalnoœæ i œmiertelnoœæ, a w konsekwencji uczyniæ przeciwnika niezdolnym do walki w czasie wojny
lub przyczyniæ siê do osi¹gniêcia du¿ego spektakularnego efektu, co jest jednym
z celów oczekiwanych przez terrorystów. Zastosowanie broni biologicznej mo¿e
spowodowaæ tak¿e negatywne efekty psychologiczne i spo³eczne: depresjê, panikê,
chaos i dezorganizacjê ¿ycia spo³ecznego [17, 36, 39, 61, 63, 70].
Drobnoustroje, które mog¹ byæ wykorzystane jako broñ biologiczna s¹ stosunkowo ³atwe do otrzymania, poniewa¿ mo¿na je wyosobniæ z próbek pobranych
od chorych zwierz¹t i ze œrodowiska. Broñ biologiczna jest skuteczna w niewielkich
iloœciach lub stê¿eniach, jej produkcja nie wymaga skomplikowanych technologii,
a gromadzenie mo¿na ³atwo utajniæ [32, 36, 63].
U¿ycie broni biologicznej nie jest natychmiast wykrywalne, poniewa¿ jest ona
pozbawiona zapachu, smaku, nie tworzy widocznych chmur, a objawy zwykle
wystêpuj¹ po kilku dniach i mog¹ mieæ one charakter klasycznych symptomów grypowych [3, 61]. Ze wzglêdu na du¿¹ ró¿norodnoœæ czynników zakaŸnych i toksyn,
ich identyfikacja jest czasoch³onna i mozolna, czêsto wymaga specjalistycznych
metod, natomiast leczenie poszkodowanych jest trudne. Dotyczy to w szczególnoœci
drobnoustrojów wystêpuj¹cych na danym terenie endemicznie, ale zmienionych
genetycznie, o zwiêkszonej wirulencji i opornoœci na wiele czynników przeciw
drobnoustrojowych, w tym antybiotyki i œrodki dezynfekcyjne [36, 45, 63]. Broñ
biologiczn¹ mo¿na stosunkowo ³atwo zaadaptowaæ do zastosowania na du¿¹ skalê,
np. w postaci aerozolu. Jest ona tañsza w produkcji w porównaniu z broni¹ wybuchow¹ konwencjonaln¹, j¹drow¹ i chemiczn¹ [60]. Analiza ekonomiczna wykaza³a,
¿e do osi¹gniêcia zbli¿onych efektów strat cywilnych nak³ady finansowe na broñ
biologiczn¹ wynosz¹ zaledwie 0,5% kosztów broni wybuchowej [19].
Ostateczny efekt u¿ycia broni biologicznej uzale¿niony jest nie tylko od rodzaju
preparatu i wielkoœci dawki, ale tak¿e od wielu innych czynników, np. drogi podania. Wiêkszoœæ preparatów broni biologicznej przygotowuje siê w postaci aerozoli,
w takiej formie dzia³aj¹ one szybciej i skuteczniej ni¿ po rozpuszczeniu w wodzie
lub podaniu do ¿ywnoœci. Liczba bakterii, wirusów lub iloœæ toksyny, podana
w preparacie aerozolowym mo¿e byæ niska poniewa¿ czynniki biologiczne mog¹
podlegaæ kumulacji do iloœci wywo³uj¹cej objawy chorobowe i œmieræ [14].
Aerozol mo¿e byæ uwolniony z samolotów, ³odzi motorowych, samochodów poruszaj¹cych siê pod wiatr lub nawet z wysokich wie¿owców. Warunki meteorologiczne mog¹ mieæ wp³yw na ostateczn¹ skutecznoœæ u¿ytej broni poniewa¿ silny
320
wiatr i turbulencja powietrza przyczyniaj¹ siê do szybkiego rozproszenia aerozolu
i tym samym spadku efektywnoœci broni biologicznej [61].
Realna mo¿liwoœæ u¿ycia broni biologicznej w atakach wojennych lub terrorystycznych stworzy³a koniecznoœæ przeprowadzenia dzia³añ informacyjnych
wœród spo³eczeñstwa, przygotowania odpowiednich œrodków pozwalaj¹cych na
przeciwdzia³anie skutkom jej u¿ycia, oraz organizacyjnych w zakresie postêpowania s³u¿by zdrowia, policji, stra¿y po¿arnej i administracji [26, 59, 63]. Dzia³ania takie podjêto tak¿e i w Polsce. Zasady postêpowania lekarskiego w przypadku ataku bioterrorystycznego zosta³y opracowane przez C h o m i c z e w s k i e g o
i wsp. [7]. Schematy postêpowania i zwi¹zane z tym zadania szpitali dostêpne s¹ na
stronach internetowych G³ównego Inspektoratu Sanitarnego [18, 37]. Niezwykle
wa¿ne jest tak¿e okreœlenie zadañ laboratoriów mikrobiologicznych, które powinny
pe³niæ podstawow¹ rolê w szybkiej i skutecznej diagnostyce pozwalaj¹cej zidentyfikowaæ rodzaj i w³aœciwoœci u¿ytych preparatów biologicznie czynnych. Wyniki
uzyskane w tych laboratoriach powinny przyczyniæ siê do oceny niebezpieczeñstwa, podjêcia dzia³añ terapeutycznych i profilaktycznych, a tak¿e byæ wykorzystane przy doborze metod neutralizacji u¿ytej broni biologicznej w œrodowisku
[4, 34, 51]. W niniejszej pracy zostanie krótko przedstawiona historia u¿ycia broni
biologicznej, najwa¿niejsze jej rodzaje i w³aœciwoœci, a tak¿e zadania i metody
diagnostyczne dla laboratoriów mikrobiologicznych w przypadku ataku z zastosowaniem tego rodzaju broni.
2. Zarys historyczny u¿ycia broni biologicznej
Poni¿ej przedstawiono wa¿niejsze fakty dotycz¹ce u¿ycia broni biologicznej oraz
dzia³ania zmierzaj¹ce do zakazu jej u¿ycia.
l Staro¿ytnoœæ – do XIX w. Ska¿anie wody pitnej wrogów zdech³ymi, cuchn¹cymi zwierzêtami [8],
l Œredniowiecze. Katapultowanie zw³ok ludzi zmar³ych w wyniku epidemii, np.
w roku 1346 Tatarzy wywo³ali w ten sposób epidemiê d¿umy w oblê¿onej
twierdzy Kaffa na Krymie (aktualnie Feodozja, Ukraina) [71].
l 1763 r. Wywo³anie epidemii wœród Indian w czasie wojny w Stanach Zjednoczonych, wskutek przekazania im koców i chust zaka¿onych wirusem ospy
prawdziwej [8, 19, 21, 34].
l 1914–1917. U¿ycie przez Niemców laseczki w¹glika i pa³eczki nosacizny celem zaka¿enia zwierz¹t hodowlanych przeciwników, ponadto podjêcie próby
zastosowania bakterii cholery i d¿umy przeciwko ludziom [8, 14, 19].
l 1925 r. Podpisanie „Protoko³u Genewskiego” o zakazie stosowania broni chemicznej i biologicznej w dzia³aniach wojennych [63].
l 1931–1941. Badania i u¿ycie bronii biologicznej przez Japoñczyków. Podczas prób w Mand¿urii i Chinach zginê³o ok. 10000 osób w wyniku zaka¿enia
bakteriami cholery, d¿umy, tyfusu, w¹glika, riketsjami, wirusem ospy i innymi drobnoustrojami. Japoñczycy zaka¿ali wodê pitn¹ i ¿ywnoœæ, ponadto
321
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
322
hodowle bakterii by³y rozpylane z samolotów. Uwolniono tak¿e z samolotów
15 mln. pche³ wyhodowanych i zaka¿onych w laboratoriach [19].
1941–1942. Przeprowadzenie przez Brytyjczyków prób u¿ycia bomb ze sporami laseczki w¹glika na wyspie Gruinard w pobli¿u Szkocji. Przetrwalniki
wykazywa³y ¿ywotnoœæ a¿ do roku 1986, kiedy przeprowadzono dezynfekcjê
wyspy przy u¿yciu formaldehydu i wody morskiej [8, 43].
1941. Podjêcie programu badawczego w zakresie broni biologicznej w USA
[19].
1957–1963. Zastosowanie w Brazylii wirusów ospy, ospy kurzej, grypy i bakterii gruŸlicy przeciwko Indianom [19].
1972 r. Ustanowienie w Genewie konwencji „O zakazie produkcji, przechowywania i zniszczeniu broni biologicznej i chemicznej”. Do 1975 r. podpisa³y
j¹ 144 pañstwa [74].
1978 r. Atak z u¿yciem rycyny, toksyny wyekstrahowanej z nasion r¹cznika
pospolitego (Ricinus communis), na bu³garskiego emigranta W³adymira
Kostowa w Pary¿u oraz 10 dni póŸniej na innego dysydenta, Georgi Markowa
w Londynie, który pomimo udzielonej pomocy medycznej zmar³ trzy dni póŸniej [8, 19, 36, 61].
1979 r. Awaria w oœrodku wojskowym w Swierd³owsku (aktualnie Jekaterynburg), przetrwalniki laseczki w¹glika wydosta³y siê do powietrza [27, 43].
Ostatnie analizy dostêpnych danych sugeruj¹, ¿e kontakt z endosporami laseczki w¹glika mia³o 250 osób, z których 100 zmar³o [29].
1960–1999. Podjêcie w USA 33 prób u¿ycia broni biologicznej. Miêdzy innymi w 1984 roku w stanie Oregon, religijna grupa Indian Rajneeshee skazi³a
bary sa³atkowe w 10 restauracjach w Dallas bakteriami Salmonella Typhimurium w konsekwencji czego zachorowa³o 751 osób [41, 63, 66]. Motywy terrorystów by³y ró¿ne, poczynaj¹c od protestów o charakterze antyrz¹dowym,
¿¹dañ nacjonalistycznych, politycznych, apokaliptycznych proroctw, motywów przestêpczych i kryminalnych, a¿ do ekoterrorystycznych i walki o prawa zwierz¹t [41, 64, 66].
1972–1991. Tajna produkcja bronii biologicznej w ZSRR. W arsenale posiadano 30 ton przetrwalników B. anthracis i ponad 20 ton wirusa ospy prawdziwej, a tak¿e wirus Marburg i bakterie d¿umy [11, 34].
1991 r. Wykazanie posiadania przez Irak 19000 l stê¿onej toksyny botulinowej. Ta iloœæ by³aby wystarczaj¹ca do zabicia ka¿dego cz³owieka na ziemi
trzykrotnie [2]. Ponadto, w Iraku wyprodukowano 8500 l bakterii i przetrwalników w¹glika [11, 27, 36] oraz 2200 l aflatoksyny [11, 36].
1997–1998. Nowa forma ataku bioterrorystycznego w USA, polegaj¹ca na
przes³aniu adresatom listów z endosporami bakterii w¹glika. Osoby, które
mia³y stycznoœæ z broni¹ biologiczn¹, w tym pracownicy przyjmuj¹cy i sortuj¹cy pocztê, zosta³y poddane natychmiastowej kuracji antybiotykowej, nie
zanotowano zgonu w wyniku tych akcji [64].
2001 r. Ataki sporami B. anthracis przesy³anymi drog¹ pocztow¹. Stwierdzono
22 przypadki w¹glika u ludzi, w tym 11 zaka¿eñ skórnych i 11 inhalacyjnych.
Piêæ osób zmar³o. Dwadzieœcia (91%) osób, u których stwierdzono w¹glik by³o
pracownikami poczty, wœród nich byli dorêczyciele oraz pracownicy sortowni
listów i przesy³ek [31]. Obecnoœæ laseczek w¹glika stwierdzono tak¿e w próbkach pobranych na terenie sortowni [16, 65]. Bakterie B. anthracis wyizolowane z proszku z 4 kopert, wyhodowane z próbek materia³ów pobranych od
10 pacjentów oraz ze 121 próbek pobranych ze œrodowiska wzd³u¿ drogi jak¹
przeby³y przesy³ki, nie wykazywa³y ró¿nic przy zastosowaniu molekularnej
metody typowania MLVA (multiple-locus variable-number tandem repeat
analysis) [24]. Izolaty mia³y taki sam wzór opornoœci na antybiotyki. By³y wra¿liwe na penicylinê, amoksycylinê, ciprofloksacynê, doksycyklinê, chloramfenikol, klindamycynê, tetracyklinê, rifampicynê, klarytromycynê i wankomycynê,
natomiast by³y œrednio wra¿liwe na erytromycynê i ceftriakson [31].
3. Charakterystyka broni biologicznej
Wiele rodzajów, gatunków, grup drobnoustrojów lub ich produktów mo¿e byæ wykorzystane jako broñ biologiczna. Nie wszystkie mikroorganizmy lub ich produkty
maj¹ tak¹ sam¹ potencjê do u¿ycia w atakach terrorystycznych lub wojnach. Ze wzglêdu na chorobotwórczoœæ, mo¿liwoœæ u¿ycia na du¿¹ skalê, trudnoœæ w rozpoznawaniu
chorób i identyfikacji drobnoustrojów, broñ biologiczn¹ podzielono na 3 kategorie.
Do kategorii A zaliczono Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Francisella tularensis,
toksyny Clostridium botulinum, Poxvirus variolae, Filoviridae (np. wirus Ebola)
i Arenaviridae (np. wirus Lassa). Czynniki kategorii A stanowi¹ potencjalnie najwiêksze zagro¿enie dla ludzi, charakteryzuj¹ siê mo¿liwoœci¹ wywo³ania wysokiej
œmiertelnoœci i chorobotwórczoœci, a ich identyfikacja wymaga specjalistycznego przygotowania personelu i niestandardowych metod identyfikacji [39, 56].
W kategorii B umieszczono Coxiella burnetii, Brucella spp., Burkholderia mallei,
Burkholderia pseudomallei, Chlamydia psittaci, Rickettsia prowazekii, rycynê (toksyna z Ricinus communis), toksynê epsilon Clostridium perfringens, enterotoksynê B
Staphylococcus aureus i wirusy rodzaju Alphavirus: wenezuelski wirus zapalenia
mózgu, wirus koñskiego zapalenia mózgu typu wschodniego, wirus koñskiego zapalenia mózgu typu zachodniego. Wydzielon¹ podgrup¹ w tej kategorii s¹ drobnoustroje,
którymi mo¿na zakaziæ ¿ywnoœæ lub wodê, natomiast nie opracowano techniki przygotowania ich w postaci aerozolu. Nale¿¹ do niej: Salmonella sp., Shigella sp., Escherichia coli O157:H7, Vibrio cholerae i Cryptosporidium parvum. Wiêkszoœæ czynników zaliczonych do kategorii B tak¿e wykazuje potencjalne mo¿liwoœci u¿ycia
na du¿¹ skalê, ale powoduj¹ one ni¿sz¹ œmiertelnoœæ i chorobotwórczoœæ, ponadto
s¹ ³atwiejsze do zidentyfikowania, chocia¿ tak¿e wymagaj¹ specyficznych metod
diagnostycznych i specjalistycznego przygotowania personelu [39, 56].
Czynniki kategorii C ze wzglêdu na swoje cechy chorobotwórcze mog¹ stanowiæ
zagro¿enie w przysz³oœci. Zaliczono do nich wirus Nipah, hantawirusy, wirus kleszczowego zapalenia mózgu, wirus ¿ó³tej febry, wirus kleszczowej gor¹czki krwotocznej i bakterie Mycobacterium tuberculosis oporne na wiele antybiotyków [39, 56].
323
Aktualnie powszechnie s¹dzi siê, ¿e najwiêksze prawdopodobieñstwo u¿ycia jako
broni biologicznej dotyczy przetrwalników bakterii w¹glika. Ich wa¿niejsze w³aœciwoœci przedstawiono w tabeli I. Spory laseczki w¹glika mo¿na produkowaæ w du¿ych iloœciach, wykorzystuj¹c proste metody, powszechnie znane przez mikrobiologów. Mo¿na je przechowywaæ latami bez utraty ich potencji. Mog¹ byæ ³atwo
rozproszone w powietrzu z pocisków, rakiet lub pojemników pod ciœnieniem. Spory
nie maj¹ koloru, nie tworz¹ ob³oków, s¹ bez zapachu i smaku. Istniej¹ wiêc bardzo
du¿e trudnoœci w stwierdzeniu u¿ycia tej broni [19, 27, 61].
W warunkach naturalnych Ÿród³em laseczek w¹glika zaka¿aj¹cych cz³owieka s¹
chore zwierzêta roœlino¿erne (owce, kozy, konie, œwinie, byd³o) oraz materia³y pochodz¹ce od nich, np. miêso, skóra, krew, we³na, produkty spo¿ywcze [15, 27, 38,
67]. W¹glik u cz³owieka wystêpuje w trzech postaciach: skórnej, p³ucnej i jelitowej. Najczêœciej wystêpuje postaæ kliniczna skórna (95–98%), która rozwija siê
jako charakterystyczna czarna krosta. W postaci jelitowej, wystêpuj¹cej po spo¿yciu zaka¿onego, surowego mleka lub niedogotowanego miêsa zaka¿onych zwierz¹t,
przetrwalniki dostaj¹ siê do b³ony œluzowej i wêz³ów ch³onnych jelit, wywo³uj¹c
zmiany krwotoczne i martwicze. Przebieg choroby jest ciê¿ki, rozpoczyna siê wymiotami, bólami brzucha, biegunk¹, wysok¹ gor¹czk¹. Chory zwykle umiera po
2–3 dniach od daty zaka¿enia [15, 27, 38, 40, 46, 67].
Postaæ p³ucna na pocz¹tku objawia siê zmianami typowymi dla zaka¿enia górnych dróg oddechowych i ju¿ w ci¹gu 3–5 dni prowadzi do ostrej niewydolnoœci
uk³adu oddechowego. [15, 17, 27, 36, 38, 40, 46, 67]. Wiêksz¹ iloœæ danych dotycz¹cych chorobotwórczoœci B. anthracis i jej uwarunkowania przedstawili M a t r a s
i B a r t o s z c z e [40].
Dokonano szczegó³owej analizy pierwszych 10 przypadków inhalacyjnego w¹glika, bêd¹cego wynikiem ataku bioterrorystycznego w USA w 2001 r. Mia³y one
miejsce w stanach Columbia, Floryda, New Jersey i Nowy Jork. Œredni wiek zaka¿onych osób wynosi³ 56 lat (zakres 43–73 lat), 70% stanowili mê¿czyŸni. Poszkodowani ulegli zaka¿eniu w wyniku otrzymania listu ze sporami lub sortowania,
dostarczania przesy³ek do odbiorców. Czas od ekspozycji do pojawienia siê pierwszych objawów chorobowych wynosi³ 4–6 dni. Pierwszymi objawami zaka¿enia
by³a podwy¿szona temperatura cia³a i dreszcze (n=10), pocenie siê (n=7), znu¿enie
lub z³e samopoczucie (n=10), niewielki kaszel (n= 9), dusznoœci, wymioty (n=10).
Przeœwietlenie klatki piersiowej wykaza³o nacieki w p³ucach u 7 osób oraz wysiêk
op³ucnowy u 8 osób. W leczeniu pacjentów zastosowano kombinowan¹ intensywn¹
terapiê z równoczesnym zastosowaniem kilku preparatów antybakteryjnych. Pomimo
tego czterech pacjentów zmar³o [30].
Do tej pory istniej¹ braki w zakresie skutecznych metod leczenia ludzi, którzy
uprzednio nie zostali zabezpieczeni przez szczepienie. Dostêpna w USA szczepionka powoduje niewielkie uboczne reakcje, nie jest jednak przeznaczona do powszechnego zastosowania, zalecana jest do u¿ycia dla osób nara¿onych zawodowo na kontakt z tymi bakteriami. Antybiotyki s¹ skuteczne wówczas, je¿eli s¹ podane w bardzo
krótkim czasie po zaka¿eniu, zwykle 24–48 godzin. W terapii zaka¿eñ powodowanych przez laseczki w¹glika zalecane s¹: ciprofloksacyna w dawce 400 mg co
324
Charakterystyka broni biologicznej zaliczonej do kategorii A [2, 13, 22, 27, 29, 34, 36, 48]
Czynnik biologiczny
Przenoszenie
z cz³owieka
chorego
na zdrowego
Dawka zakaŸna
(w postaci
aerozolu)
Bacillus anthracis
nie
Yersinia pestis
tak,
10–50 komórek
wysoka czêstoœæ
Francisella tularensis nie
8000–50000 spor
10–50 komórek
Czas
inkubacji
Czas
trwania
choroby
Œmiertelnoœæ przy
braku
leczenia
Tabela I
Identyfikacja
1–6 dni
3–5 dni
ok. 99%
Morfologia komórek i kolonii, w³aœciwoœci
fenotypowe, immunofluorescencja, RT-PCR,
sekwencjonowanie 16S rDNA
2–3 dni
1–6 dni
40–70%
Morfologia komórek i kolonii, w³aœciwoœci
fenotypowe, testy serologiczne
2–10 dni 2 tygodnie
33%
Morfologia komórek i kolonii, w³aœciwoœci
fenotypowe, testy serologiczne
Variola major
tak,
10–100 wirionów
wysoka czêstoœæ
7–17 dni 4 tygodnie
20–50%
ELISA, PCR, efekty cytopatyczne i inkluzje
w hodowli na zarodkach kurzych, techniki
immunologiczne
Wirusy gor¹czek
krwotocznych
tak,
œrednia czêstoœæ
1–10 wirionów
4–21 dni 7–16 dni
53–88%
PCR, ELISA, testy serologiczne i immunohistologiczne, hodowle na zwierzêtach
laboratoryjnych
Toksyna
botulinowa A
nie
LD 50 = 0,001 mg/kg 1–5 dni
zgon w czasie wysoka
24–72 godz. lub
kilku miesiêcy
ELISA, odczyn neutralizacji na myszach
325
8–12 godzin, doksycyklina (200 mg do¿ylnie i potem 100 mg co 8–12 godz.) oraz
penicylina (2 mln jednostek) ze streptomycyn¹ (30 mg/kg) podawane co 2 godz.
[9, 15, 17, 27, 36, 38, 67].
W 1970 roku komitet ekspertów WHO teoretycznie okreœli³, ¿e uwolnienie
z samolotu 50 kg przetrwalników w¹glika nad terenem zamieszka³ym przez 5 mln
ludzi spowoduje chorobê u 250 000 osób z czego, w przypadku braku podjêcia leczenia, zmar³oby ok. 100 000 osób [27]. W 1993 r. w USA oszacowano, ¿e po uwolnieniu 100 kg spor w¹glika w Waszyngtonie, 130 000 do 3 mln osób ponios³oby
œmieræ [29]. W symulacjach kosztów leczenia terapia 100 000 osób kosztowa³aby
26,2 miliardów dolarów [33].
Inn¹ broni¹ biologiczn¹ zaliczon¹ do kategorii A s¹ bakterie d¿umy, Yersinia
pestis (Tab. I). D¿uma to ostra choroba zakaŸna, która znana jest w dwóch podstawowych postaciach klinicznych: d¿umy dymienicznej, przenoszonej na ludzi przez
pch³y z zaka¿onych gryzoni, przewa¿nie szczurów i d¿umy p³ucnej, w której zaka¿enie nastêpuje od chorego cz³owieka. Objawami zaka¿enia pa³eczk¹ d¿umy s¹:
gor¹czka, dreszcze, ból g³owy, krwioplucie. W typowym przebiegu d¿umy liczba
leukocytów u pacjentów wynosi 12 000–25 000/ml krwi [73]. W krótkim czasie postêpuje toksemia i nasilaj¹ca siê dusznoœæ. Œmieræ nastêpuje w wyniku niewydolnoœci
wielonarz¹dowej. Okres inkubacji trwa 2–3 dni, czas choroby 1–6 dni [28, 36].
Wed³ug obliczeñ ekspertów WHO uwolnienie 50 kg bakterii Y. pestis w postaci
aerozolu nad miastem zamieszkiwanym przez 5 mln osób mo¿e wywo³aæ zaka¿enie
p³ucne u 150 000 osób, z których 36 000 umrze. Pa³eczki d¿umy s¹ ¿ywotne w aerozolu przez 1 godz. i mog¹ byæ z samolotu rozprzestrzenione na odleg³oœæ do 10 km.
W leczeniu tej choroby stosowane s¹: streptomycyna, gentamycyna, tetracyklina,
doksycyklina, chloramfenikol i fluorochinolony, np. ciprofloksacyna, lewofloksacyna i ofloksacyna [17, 28].
Pa³eczki tularemii powoduj¹ ostr¹ odzwierzêc¹ chorobê zakaŸn¹, wystêpuj¹c¹
w naturalnych warunkach wœród gryzoni. Bakterie te mog¹ dostaæ siê do organizmu
cz³owieka poprzez uszkodzon¹ skórê, nab³onek, drogi pokarmowe i przez p³uca
w przypadku aerozolu. Pa³eczka ta przekazywana mo¿e byæ na cz³owieka przez
kleszcze, gzy, a nawet komary. Ponadto, Ÿród³em zaka¿enia cz³owieka mo¿e byæ
woda, gleba i roœlinnoœæ. Pocz¹tek choroby u cz³owieka jest nag³y, z gwa³townymi
dreszczami, bólem miêœni, g³owy, uczuciem os³abienia i wymiotami. Czêsto obserwuje siê tak¿e zapalenie spojówek i zaczerwienienie twarzy. W przypadku ataku
z u¿yciem tych bakterii w postaci aerozolu zaka¿enie przybierze najciê¿sz¹ postaæ
tej choroby, z obrazem œródmi¹¿szowego zapalenia p³uc. Œmiertelnoœæ w przypadku
braku leczenia jest wysoka i siêga 30–50%. W leczeniu tularemii skuteczne s¹: streptomycyna, gentamycyna, tetracykliny, chloramfenikol i ciprofloksacyna [13, 17, 36].
W latach 50- i 60-tych opracowano technikê aerozolizacji tych bakterii, a w 90-tych przeprowadzono modyfikacje genetyczne, w konsekwencji których uzyskano
szczepy oporne na wiele antybiotyków i o innej strukturze antygenowej, co uczyni³o nieskutecznym zabezpieczenie szczepionk¹ [36]. W 1969 r. eksperci WHO oszacowali, ¿e rozproszenie 50 kg bakterii tularemii w postaci aerozolu nad obszarem
zamieszkiwanym przez 5 mln ludzi spowoduje zaka¿enie 250000 osób, z których
326
19 000 umrze [13]. Analiza kosztów leczenia wykaza³a koniecznoœæ nak³adów
5,4 miliarda dolarów na ka¿de 100000 osób [33].
Do bardzo groŸnej broni biologicznej zaliczono tak¿e wirusy ospy prawdziwej
(Tab. I). W okresie gdy ospa panowa³a endemicznie na ró¿nych kontynentach, obserwowano dwie postacie tej choroby: ospê wielk¹, czyli klasyczn¹ ze œmiertelnoœci¹ do
30% oraz ospê ma³¹ o œmiertelnoœci ok. 1%. Rezerwuarem tych wirusów i Ÿród³em
zaka¿enia jest wy³¹cznie cz³owiek, okres zakaŸliwoœci ok. 3 tygodnie. Do przenoszenia siê choroby dochodzi drog¹ kropelkow¹ lub przez stycznoœæ ze zmianami
na skórze, b³onami œluzowymi lub odzie¿¹ i zanieczyszczonymi przedmiotami. Ospa
prawdziwa przebiega z charakterystyczn¹ wysypk¹, pocz¹tek choroby jest nag³y
z gor¹czk¹, bólami g³owy, uczuciem rozbicia i wyczerpania, silnymi bólami miêœni
grzbietu, niekiedy z bólami brzucha. Pierwsze 2–3 dni choroby, przed pojawieniem
siê wysypki, przypominaj¹ objawy grypy, dopiero póŸniej temperatura obni¿a siê i na
skórze pojawiaj¹ siê wykwity przechodz¹ce od plamki, grudki do krosty. Wysypka
rozpoczyna siê na twarzy i koñczynach, a nastêpnie na tu³owiu. W roku 1958 WHO
podjê³a próbê wykorzenienia tej choroby, w latach 70-tych uzyskano sukces. Ostatnie
zachorowania na ospê zarejestrowano w 1977 r. [17, 21, 22, 36]. W 1980 r. WHO
uzna³a t¹ chorobê za zlikwidowan¹ i zaprzestano szczepieñ [22].
Wobec zaprzestania szczepieñ ochronnych aktualnie u¿ycie wirusa ospy prawdziwej jako broni biologicznej wywo³a³oby katastrofalne efekty. Odpornoœæ po
szczepionce wynosi 3–5 lat i w celu jej utrzymania konieczne jest ponowne szczepienie [21, 22]. Poniewa¿ aktualna iloœæ zgromadzonej szczepionki jest za ma³a
istnieje koniecznoœæ opracowania nowych, bardziej efektywnych preparatów antygenowych do uzyskania odpornoœci na ospê prawdziw¹ na wypadek u¿ycia tych
wirusów podczas ataku wojennego lub bioterrorystycznego [42, 55].
Gor¹czki krwotoczne stanowi¹ grupê zachorowañ charakteryzuj¹cych siê stanem
podwy¿szonej temperatury oraz zaburzeniami krzepniêcia krwi, co prowadzi do
wybroczyn, krwawienia narz¹dów wewnêtrznych i w jamach cia³a oraz ich uszkodzenia. GroŸnym powik³aniem przy zaka¿eniach tymi mikroorganizmami s¹ zakrzepy
naczyniowe. Pocz¹tkowe objawy zaka¿enia trwaj¹ zwykle do 6 dni, nie wykazuj¹
cech charakterystycznych i s¹ to: os³abienie, gor¹czka, ból g³owy, bóle miêœniowe,
zapalenie gard³a, wymioty, biegunka. Wirusy tej grupy mog¹ byæ wykorzystane
w atakach bioterrorystycznych w celu zaka¿enia ludzi przez drogi oddechowe.
Objawy kliniczne zaka¿eñ zale¿¹ od wzajemnych interakcji pomiêdzy wirusem
i gospodarzem. Œmiertelnoœæ waha siê od 0,2% a¿ do 50–90%. Grupa wirusów
powoduj¹ca gor¹czki krwotoczne jest zró¿nicowana. Arenaviridae obejmuj¹ wirusy: argentyñski, boliwijski, wenezuelski i gor¹czki Lassa. Bunyaviridae obejmuj¹
hantawirusy i wirusa gor¹czki krymsko-kongijskiej. Z kolei do Filoviridae zaliczane s¹ wirusy Ebola, Marburg, ¿ó³tej gor¹czki i Denga. NajgroŸniejsze wirusy
to Marburg i Ebola. S¹ to RNA wirusy, wra¿liwe na temp. 60°C oraz rutynowo
stosowane œrodki dezynfekcyjne: fenolany, podchloryn sodu, formalina, promienie
UV, b-propiolakton. Okres inkubacji wirusem Marburg wynosi 3–9 dni, a Ebola
2–21 dni. Powoduj¹ one uszkodzenia œródmi¹¿szowe licznych wewnêtrznych
narz¹dów. W przypadku zaka¿enia cz³owieka obserwuje siê zapalenie w¹troby,
327
miêœnia sercowego, trzustki, p³uc, j¹der i nerek. Œmiertelnoœæ przy chorobie marburskiej wynosi do ok. 27%, a przy zaka¿eniu wirusem Ebola 50–90% [17, 36, 45].
Aktualnie brakuje skutecznej szczepionki chroni¹cej przed zaka¿eniami powodowanymi przez te wirusy [10].
Do broni biologicznej kategorii A zaliczono tak¿e toksynê botulinow¹ (Tab. I).
Jest ona wytwarzana przez laseczki beztlenowe Clostridium botulinum. Wyró¿nia
siê 7 ró¿nych antygenowych typów toksyny botulinowej, oznaczonych od A do G.
Typ A toksyny jest letalny dla cz³owieka o wadze 70 kg w iloœci 0,09–0,15 mg
przy podaniu do¿ylnym, 0,7–09 mg podanej drog¹ wziewn¹, natomiast 70 mg przy
podaniu drog¹ pokarmow¹. Obliczono, ¿e 1 gram tej toksyny jest wystarczaj¹cy do
zabicia przesz³o 1 miliona osób [2, 17]. Objawami zatrucia toksyn¹ botulinow¹ jest
znu¿enie, zawroty g³owy, nieostre widzenie i dwojenie widzenia, suchoœæ w ustach,
trudnoœci w po³ykaniu, upoœledzenie mowy, ból gard³a, dusznoœæ, zaparcia, nudnoœci, wymioty, bóle brzucha, biegunka, os³abienie miêœni ramion i nóg, pora¿enie
nerwu twarzowego, opadanie powiek, nieruchome Ÿrenice oraz brak czucia, chocia¿
pacjent jest w pe³ni œwiadomy [2, 17, 36].
Objawy neurologiczne przy botulizmie pokarmowym rozpoczynaj¹ siê w 12–36
godzin po spo¿yciu toksyny, natomiast przy ekspozycji oddechowej 24–72 godzin.
W profilaktyce mo¿liwe jest stosowanie szczepionki opracowanej przez amerykañski Departament Obrony [1, 10].
Oprócz szerzej opisanych czynników biologicznych zaliczonych do kategorii A,
groŸn¹ broni¹ mog¹ byæ inne drobnoustroje i toksyny. Wa¿niejsze w³aœciwoœci niektórych czynników zaliczonych do kategorii B przedstawiono w tabeli II. Wed³ug
danych WHO [74], NATO [48] i innych [32, 35, 53] do broni biologicznej zaliczyæ
tak¿e mo¿na wiele innych czynników, z których najczêœciej wymieniane s¹: bakterie Rickettsia rickettsi, grzyby Coccidioides immitis, toksyny bakteryjne (shiga,
b³onicy), z koralowców morskich (maitotoksynê, palytoksynê), z ¿ab (bratrachotoksynê), jadu wê¿y (alfa-conotoksynê, taipoksynê), z ryb (tetradotoksynê), skorpionów (alfa-tityustoksyna), glonów (anatoksynê A, mikrocystynê), grzybów (toksynê
T-2, aflatoksynê) i roœlin (np. abrynê).
4. Rola laboratoriów mikrobiologicznych
Ataki bioterrorystyczne przeprowadzone na terenie USA w 2001 r. uœwiadomi³y
skalê zagro¿eñ i koniecznych dzia³añ, które wystêpuj¹ wskutek u¿yciu broni biologicznej. W laboratoriach mikrobiologicznych przebadano przesz³o 121700 próbek
materia³ów na obecnoœæ B. anthracis [50]. Profilaktycznie podano antybiotyki
94 pracownikom poczty w Connecticut [75]. Telefoniczne centrum informacyjne
uruchomione w CDC odpowiedzia³o na przesz³o 11 tys. zapytañ [47].
W opracowaniach Centrów Kontroli Chorób ZakaŸnych w USA (Centers for
Diseasae Central and Preventicy – CDC) [5, 50], Instytutu Badawczego Chorób
ZakaŸnych Armii Amerykañskiej (USA Army Medical Research Institute of Infections Research – USAMRIID) [36] i innych oœrodków [32, 34, 49, 51] podkreœla siê,
¿e laboratoria mikrobiologiczne s³u¿b medycznych powinny odegraæ kluczow¹ rolê
328
Tabela II
Charakterystyka broni biologicznej kategorii B, która mo¿e byæ u¿yta w postaci aerozolu [5, 14, 34, 36, 48, 56]
Czynnik biologiczny
Przenoszenie
z cz³owieka chorego
na zdrowego
Dawka
zakaŸna/œmiertelna
(w postaci aerozolu)
Czas inkubacji
Czas trwania choroby
Œmiertelnoœæ
Coxiella burnetti
tak, niska czêstoœæ
1–10 komórek
10–40 dni
2–14 dni
≤ 20%
Brucella spp.
nie
10–100 komórek
5–60 dni
tygodnie do miesiêcy
≤ 5%
Burkholderia mallei
tak, niska czêstoœæ
brak danych
1–14 dni
zwykle zgon po 2–3 tygodniach,
w postaci przewlek³ej 2–3 lata
≥ 50%
Burkholderia pseudomallei bardzo niska czêstoœæ
brak danych
kilka dni do
kilku lat
4–20 dni
≤ 20%
Rickettsia prowazekii
nie
brak danych
6–16 dni
tygodnie do miesiêcy
1–2%
Chlamydia psittaci
nie
brak danych
4–15 dni
2–8 tygodni
≤ 20%
Wirusy zapalenia mózgu
tak, niska czêstoœæ
10–100 wirionów
2–6 dni
kilka dni do kilku tyg.
≤ 20%
Rycyna
nie
50–100 :g/osobê
(dawka œmiertelna)
18–24 godz.
kilka dni
21–49%
Enterotoksyna B S. aureus nie
1,7 :g/osobê
(dawka œmiertelna)
3–12 godzin
kilka godzin
≤ 1%
Toksyna epsilon
C. perfringens
LD50 = 0,1–5 mg/kg
8–12 godzin
24 godziny
wysoka
nie
329
w identyfikacji biologicznych czynników u¿ytych w atakach wojennych lub terrorystycznych. Wymaga to przygotowania odpowiednich œrodków, wyszkolenia
personelu oœrodków diagnostycznych i innych placówek s³u¿by zdrowia, do wykrywania nietypowych i rzadko wystêpuj¹cych czynników etiologicznych, które mog¹
byæ u¿yte jako broñ biologiczna oraz ich zwalczania [32, 34, 41, 68]
Kierownictwo i personel laboratoriów wraz z pracownikami dzia³ów kontroli zaka¿eñ i administracji powinni przygotowaæ plan dzia³añ zarówno dla danego laboratorium oraz ca³ej instytucji, w sk³ad której pracownia wchodzi. Plan ten powinien
obejmowaæ [62]:
l informacje w zakresie uczestnictwa danej pracowni w sieci laboratoriów bior¹cych udzia³ w diagnostyce i przeciwdzia³aniu atakom bioterrorystycznym,
l kryteria œwiadcz¹ce o typie ataku bioterrorystycznego,
l zasady bezpiecznego postêpowania,
l procedury testowania w kierunku najwa¿niejszych czynników broni biologicznej, w tym protokó³y diagnostyczne,
l protokó³y komunikuj¹ce i sprawozdawcze,
l zasady bezpiecznego opakowywania i transportu czynników zakaŸnych,
l ochronê laboratorium.
Kierownik laboratorium powinien ustanowiæ i wprowadziæ sposób zawiadamiania, który obowi¹zuje w przypadku uzasadnionego podejrzenia ataku z u¿yciem
broni biologicznej i koniecznoœci przes³ania izolatów do laboratorium wy¿szej kategorii. Plan musi uwzglêdniaæ kontakty z osobami odpowiedzialnymi za przekaz
informacji do osób kluczowych w danej instytucji oraz z lokalnym wydzia³em zdrowia. Ka¿dy przypadek powinien byæ szczegó³owo opisany. Aby oceniæ stopieñ
zagro¿enia personel zajmuj¹cy siê kontrol¹ zaka¿eñ powinien odnotowywaæ pojawianie siê niezwyk³ych zachorowañ. Stosowne w³adze, w oparciu o te dane, powinny
oceniæ czy wystêpuje zagro¿enie dla spo³eczeñstwa i czy materia³ od pacjentów
oraz izolaty powinny byæ przekazywane do laboratoriów wy¿szej kategorii. Wykrycie drobnoustrojów wykazywanych na liœcie czynników mog¹cych stanowiæ broñ
biologiczn¹ nie jest jeszcze dowodem, ¿e dosz³o do ataku bioterrorystycznego.
Niektóre z drobnoustrojów wymienionych na tej liœcie wystêpuj¹ naturalnie na
pewnych obszarach geograficznych i powoduj¹ sporadyczne zaka¿enia. Dopiero
decyzja uprawnionych w³adz wydzia³ów zdrowia i w³adz ustawowych okreœla
czy przypadek by³ wiarygodny. Podczas procesu okreœlenia czy istnieje zagro¿enie
dla spo³eczeñstwa, mikrobiolodzy powinni zawiadomiæ najbli¿sze laboratorium B
celem otrzymania szczegó³owych wskazówek w zakresie ewentualnego u¿ycia
testów potwierdzaj¹cych [62].
4.1. Sytuacje œwiadcz¹ce o u¿yciu broni biologicznej
Atak broni¹ biologiczn¹ mo¿e byæ zapowiedziany lub nie, szczególnie groŸny
jest drugi wariant. Efekty ataku mog¹ pojawiæ siê dopiero po kilku dniach i mog¹
byæ trudne do rozpoznania. Niew¹tpliwie pierwszoplanow¹ rolê na tym etapie reakcji
odegraæ powinni lekarze, którzy musz¹ byæ przygotowani na rozpoznanie sytuacji
330
bêd¹cej wynikiem u¿ycia broni biologicznej oraz laboratoria przygotowane do poboru prób i przeprowadzenia badañ [7, 26]. Przes³anki œwiadcz¹ce o ataku bioterrorystycznym s¹ nastêpuj¹ce [36, 74]:
l pojawienie siê w populacji du¿ej liczby zachorowañ z podobnymi objawami,
l wiele przypadków niewyjaœnionych chorób lub zgonów,
l ciê¿szy przebieg choroby w porównaniu z typowym dla danego czynnika etiologicznego, brak skutecznoœci standardowej terapii,
l nietypowa droga zaka¿enia, np. poprzez drogi oddechowe, podczas gdy zazwyczaj zaka¿enie danym patogenem nastêpuje przez inne wrota,
l pojawienie siê chorób nie wystêpuj¹cych na danym obszarze geograficznym
lub w nietypowym sezonie,
l choroba warunkowana drobnoustrojem, który normalnie nie wystêpuje na danym terenie,
l równoczesny, wielokrotny wzrost liczby zachorowañ lub seria epidemii ró¿nych chorób w tej samej populacji,
l pojedynczy przypadek zachorowania spowodowany niezwyk³ym czynnikiem
(np. ospa prawdziwa, wirusowa gor¹czka krwotoczna),
l wyst¹pienie choroby, która jest niezwyk³a w danej grupie wiekowej,
l nietypowe chorobotwórcze szczepy lub organizmy o opornoœci na antybiotyki
ró¿nej od chorobotwórczych szczepów na danym terenie,
l podobieñstwo genetyczne wœród czynników etiologicznych izolowanych z ró¿nych Ÿróde³, miejsc lub w ró¿nym czasie,
l wy¿sza czêstoœæ zaka¿eñ wœród ludzi na obszarach otwartych ni¿ u ludzi przebywaj¹cych w budynkach,
l wyst¹pienie wybuchów epidemii tych samych chorób na obszarach nie po³¹czonych ze sob¹,
l wybuch epidemii powodowanych czynnikiem wywo³uj¹cym epizoocjê,
l informacja o potencjalnym ataku terrorystycznym lub wojennym, odkrycie
broni biologicznej nielegalnie przechowywanej lub transportowanej.
Niezwykle wa¿nym zagadnieniem jest odpowiednie zabezpieczenie ludnoœci
przed spodziewanym atakiem bioterrorystycznym i podjêcie dzia³añ po ataku.
Zastosowanie profilaktycznych szczepieñ lub kuracja antybiotykowa wymagaj¹
d³u¿szego czasu a¿eby uzyskaæ ich skutecznoœæ i dlatego nie s¹ uwa¿ane za optymalne metody. Dodatkow¹ niedogodnoœci¹ w zastosowaniu szczepieñ jako pierwszej linii obrony przed broni¹ biologiczn¹ s¹ wysokie koszty i trudnoœæ w szczepieniu du¿ych populacji na szerokie spektrum czynników biologicznych. Aktualnie brakuje dobrych szczepionek na wszystkie mikroorganizmy i toksyny, które
mog¹ byæ wykorzystane jako broñ biologiczne. Zaleca siê stosowanie szczepieñ jedynie dla grup ludzi wysokiego ryzyka, np. pracowników laboratoriów diagnostycznych i lekarzy [57].
C a s a d e v a l l [4] sugeruje, ¿e najkorzystniejsze zabezpieczenie ludzi w przypadku ataku bioterrorystycznego mo¿e stanowiæ bierne uodpornienie uzyskane w wyniku podania swoistych przeciwcia³. Metoda ta ma wiele zalet, z których najwa¿niejsz¹ jest bardzo szybkie nabycie odpornoœci na czynniki biologiczne u¿yte w ataku.
331
4.2. Zasady bezpiecznej pracy w laboratorium mikrobiologicznym
Prace z materia³em zakaŸnym mog¹ byæ wykonywane wy³¹cznie w laboratoriach posiadaj¹cych odpowiednie zabezpieczenia. Pod koniec ubieg³ej dekady,
w CDC ustalono rodzaje zabezpieczeñ dla mikrobiologicznych i biomedycznych
laboratoriów, oznaczaj¹c je symbolami od BSL 1 do BSL 4. Zabezpieczenia BSL 1
polegaj¹ na podstawowych procedurach, takich jak zakaz spo¿ywania posi³ków
i picia w laboratorium, mycie r¹k przed jego opuszczeniem, zakaz pipetowania ustami, odka¿anie powierzchni roboczych, niszczenie materia³u zakaŸnego po skoñczonej pracy. Wejœcie do zak³adu powinno byæ kontrolowane i ograniczone dla osób
postronnych. Zabezpieczenia BSL 2, oprócz wymagañ dla BSL 1, polegaj¹ na prowadzeniu prac w kabinach biohazard klasy II, stosowaniu fartuchów, rêkawiczek
i maseczek, które nie mog¹ byæ wynoszone poza laboratorium przed wyja³owieniem.
Personel powinien byæ przeszkolony do pracy ze szczególnie niebezpiecznymi drobnoustrojami i szczepiony, np. przeciwko WZW B. W laboratorium powinna byæ dostêpna surowica odpornoœciowa przeciwko szczególnie niebezpiecznym drobnoustrojom, z którymi prowadzone s¹ prace. Materia³y i sprzêt po skoñczonej pracy
powinien byæ odpowiednio zabezpieczony (zamkniêty w szczelnych pojemnikach)
i wysterylizowany, laboratoryjny sprzêt i powierzchnie robocze musz¹ byæ zdezynfekowane bezpoœrednio po skoñczonej pracy. Meble i sprzêt powinny byæ wykonane z materia³u umo¿liwiaj¹cego jego dezynfekcjê. W laboratorium powinna znajdowaæ siê p³uczka do oczu. W laboratoriach z zabezpieczeniami BSL 3 wszystkie
badania z materia³em zakaŸnym powinny byæ prowadzone w kabinach biohazard
klasy II lub III. Personel zobowi¹zany jest do noszenia odzie¿y ochronnej, laboratorium powinno byæ specjalnie zaprojektowane, oddzielone od powierzchni powszechnie u¿ytkowanych, zabezpieczone zamkniêtymi drzwiami. Powierzchnie œcian, pod³óg i sufitu powinny byæ wykonane z materia³ów umo¿liwiaj¹cych ich dezynfekcjê.
Okna powinny byæ zamkniête i uszczelnione. Klimatyzacja powinna byæ zaopatrzona
w filtry HEPA. Sprzêt tworz¹cy aerozole, w tym wirówki, musi byæ odpowiednio
zabezpieczony. W laboratoriach BSL 4 wystêpuj¹ zabezpieczenia najwy¿szego stopnia. Tego typu laboratoria stanowi¹ wydzielone pomieszczenia odseparowane od pozosta³ych czêœci budynku lub umieszczone w oddzielnym budynku. Oprócz zabezpieczeñ wymaganych dla laboratoriów BSL 3, s¹ one specjalnie zaprojektowane aby
uniemo¿liwiæ wydostanie siê z nich drobnoustrojów do œrodowiska. Personel musi
byæ odpowiednio przeszkolony, w trakcie prac ubrany w specjaln¹ odzie¿, która jest
sterylizowana po ich ukoñczeniu. Tak¿e wszystkie inne materia³y przed opuszczeniem pracowni musz¹ byæ odka¿one, natomiast pracownicy powinni wzi¹æ natrysk
przed opuszczeniem laboratorium. Ca³oœæ powietrza w laboratorium powinna byæ
sterylizowana przez filtracjê i zastosowanie œrodków bakterio- i wirusobójczych [54].
W laboratoriach nale¿y prowadziæ sta³¹, codzienn¹ kontrolê mikrobiologiczn¹.
Powinna ona obj¹æ badanie personelu, miejsc i sprzêtu, który najczêœciej podlega
zaka¿eniu: r¹k personelu, uchwytów i klamek drzwi, sto³ów i sto³ków laboratoryjnych, masek, ca³ej pracowni mikrobiologicznej i pracowni PCR, a ponadto korytarzy i pomieszczeñ przechowywania próbek [20].
332
4.3. Organizacja systemu laboratoriów mikrobiologicznych w USA
W USA pod nadzorem CDC utworzono sieæ laboratoriów przygotowanych do
postêpowania w przypadku ataku z u¿yciem broni biologicznej. Sieæ taka obejmuje
pracownie prywatne, szpitalne, sanitarno-epidemiologiczne i wojskowe uczestnicz¹ce w badaniach mikrobiologicznych i dochodzeniach epidemiologicznych zwi¹zanych z atakiem bioterrorystycznym. Laboratoria mikrobiologiczne s¹ klasyfikowane
na podstawie ich wyposa¿enia i mo¿liwoœci diagnostycznych do jednej z czterech
kategorii, A-D [5, 34].
Pracownie kategorii A maj¹ odegraæ g³ówn¹ rolê w rozpoznaniu sytuacji u¿ycia
broni biologicznej wówczas, kiedy atak nie zosta³ zapowiedziany. W przypadku takiego typu ataku nastêpuje du¿e zagro¿enie dla lekarzy i personelu laboratoryjnego
poniewa¿ pierwsze objawy wystêpuj¹ po okresie inkubacji. Dlatego najwa¿niejszym
elementem na tym etapie odpowiedzi jest identyfikacja pocz¹tkowych przypadków
bêd¹cych wynikiem u¿ycia broni biologicznej. Przes³anki œwiadcz¹ce o mo¿liwoœci
u¿ycia broni biologicznej zosta³y podane w rozdziale 4.1. niniejszego artyku³u. Do
laboratoriów tej kategorii zaliczono wiêkszoœæ pracowni spe³niaj¹cych warunki
bezpieczeñstwa BSL 2, w których prowadzone s¹ hodowle drobnoustrojów i identyfikacja powszechnie wystêpuj¹cych patogenów. Najwiêksz¹ liczbê w tej grupie
stanowi¹ laboratoria szpitalne i to w³aœnie one odegraj¹ najistotniejsz¹ rolê
w przypadku ataku z u¿yciem broni biologicznej. G³ówna rola tych laboratoriów
bêdzie polega³a na pobraniu, zabezpieczeniu i przetransportowaniu próbek materia³ów pobranych od ludzi oraz ich wstêpnym przebadaniu. W pracowniach kategorii
A powinno byæ mo¿liwe wykonanie niewielkiej liczby prostych testów diagnostycznych i w przypadku przes³anek œwiadcz¹cych o obecnoœci w pobranych próbkach
czynników, które mog³y byæ wykorzystane jako broñ biologiczna, przesy³anoby je
do pracowni kategorii B. Na wyposa¿eniu laboratorium poziomu A musi znajdowaæ
siê komora biohazard klasy II. Personel powinien byæ przeszkolony w zakresie podstawowych metod pozwalaj¹cych wstêpnie rozpoznaæ czynniki broni biologicznej
oraz bezpiecznego pobierania, pakowania, oznakowywania i przekazywania próbek
materia³ów zawieraj¹cych niebezpieczne patogeny do pracowni wy¿szej kategorii.
Laboratoria powinny posiadaæ plan dzia³añ, a ponadto przygotowane procedury
operacyjne, które obejmuj¹ drogi komunikowania siê, w tym numery telefoniczne
do laboratoriów wy¿szych kategorii oraz do centralnego oœrodka koordynuj¹cego.
Laboratoria powinny tak¿e posiadaæ aktualny wykaz czynników, które mog¹ stanowiæ broñ biologiczn¹ wraz ze stopniem zagro¿enia które one stwarzaj¹. W przypadku ekspozycji pracowników na broñ biologiczn¹ szybko powinna zostaæ podjêta
decyzja, czy u¿yæ profilaktycznie antybiotyki, podaæ szczepionkê, czy zastosowaæ
tylko obserwacjê w kierunku wykrycia objawów chorobowych [5, 34, 62].
W przypadku zapowiedzianego ataku z u¿yciem broni biologicznej laboratoria
szpitalne nie powinny pobieraæ próbek do testowania. Potencjalny odbiorca, cel ataku,
powinien byæ uprzedzony i odpowiednio poinstruowany, natomiast próbki powinny
byæ dostarczone bezpoœrednio do laboratoriów kategorii B lub C. Podobn¹ politykê powinno stosowaæ siê tak¿e w przypadku badania ¿ywnoœci, wody i próbek
333
pobranych od zwierz¹t. Ograniczenie w prowadzeniu badañ tych materia³ów w pracowniach klasy A wynika z koniecznoœci utrzymanie bezpieczeñstwa personelu,
pacjentów i instytucji. G³ówn¹ przeszkod¹ w badaniu materia³ów œrodowiskowych
w laboratoriach szpitalnych jest nieznana natura próbek, którymi mog¹ byæ eksploduj¹ce lub ulatniaj¹ce siê toksyczne chemikalia lub substancje radioaktywne [20, 62].
Wyposa¿enie laboratoriów kategorii B powinno spe³niaæ wymogi bezpieczeñstwa co najmniej BSL 2, chocia¿ zalecane jest BSL 3. T¹ grupê tworzyæ powinny
laboratoria, które maj¹ mo¿liwoœci do badania specyficznych czynników i przesy³ania mikroorganizmów lub materia³ów zawieraj¹cych je, do pracowni wy¿szego
stopnia. Laboratoria kategorii B powinny zmniejszyæ liczbê fa³szywie dodatnich,
wstêpnych wyników i zabezpieczyæ laboratoria C przed nadmiernym przeci¹¿eniem.
Ich dzia³alnoœæ polega³aby na szybkiej, wstêpnej identyfikacji drobnoustrojów
(np. technikami immunofluorescencyjnymi). W przypadku stwierdzenia czynników,
które mog³y byæ u¿yte w atakach terrorystycznych, izolaty by³yby przekazywane do
laboratoriów poziomu C [5, 34].
Laboratoria kategorii C, powinny spe³niaæ wymogi bezpieczeñstwa BSL 3 i mieæ
dodatkowe mo¿liwoœci szybkiej specjalistycznej identyfikacji czynników stanowi¹cych broñ biologiczn¹. Powinny to byæ stanowe mikrobiologiczne, akademickie
lub federalne centra badawcze, zdolne do wykonania specjalistycznych badañ,
z wykorzystaniem zaawansowanych technik diagnostycznych (np. opartych o amplifikacjê kwasów nukleinowych i typowania mikroorganizmów metodami molekularnymi), a ponadto maj¹cymi zdolnoœæ do oznaczenia toksyn. Laboratoria tej kategorii powinny równie¿ braæ czynny udzia³ w ocenie nowo opracowywanych testów
i odczynników oraz okreœleniu, które metody mog¹ byæ stosowane w pracowniach
kategorii B [5, 34, 62].
Laboratoria kategorii D, posiadaj¹ce zabezpieczenia BSL 4, powinny pe³niæ funkcje eksperckie w diagnostyce rzadko wystêpuj¹cych w naturze i szczególnie niebezpiecznych biologicznych czynników, np. wirusów gor¹czek krwotocznych, wirusów zapalenia mózgu i wirusa ospy prawdziwej. W laboratoriach tych powinna
istnieæ tak¿e mo¿liwoœæ oznaczenia drobnoustrojów zmodyfikowanych genetycznie oraz archiwizowania czynników u¿ytych w atakach bioterrorystycznych. Personel tych pracowni powinien posiadaæ unikatowe doœwiadczenia i umiejêtnoœci
w diagnostyce wszystkich czynników, które mog¹ byæ u¿yte jako broñ biologiczna.
W tych laboratoriach tak¿e powinny byæ opracowywane nowe testy i metody diagnostyczne [5, 34, 62].
W przypadku ataku bioterrorystycznego, oprócz sieci sta³ych laboratoriów, wa¿n¹
rolê odegraæ mog¹ ruchome laboratoria terenowe. Przyk³adem by³o laboratorium uruchomione w Waszyngtonie po ataku bioterrorystycznym w paŸdzierniku 2001 roku
[23]. Przeznaczone by³o ono do przeprowadzania szybkich molekularnych analiz
próbek œrodowiskowych, g³ównie powietrza i wymazów z powierzchni przesy³ek,
urz¹dzeñ, mebli i przedmiotów stanowi¹cych wyposa¿enie biur w budynkach administracji w Waszyngtonie, na obecnoœæ przetrwalników B. anthracis. Laboratorium
równolegle kierowa³o próby do wyznaczonych sta³ych pracowni celem przeprowadzenia standartowych analiz technikami hodowlanymi. Laboratorium ruchome
334
wyposa¿one by³o w dwie kabiny z laminarnym przep³ywem powietrza klasy I, przenoœny autoklaw, dwa przenoœne termocyklery do przeprowadzania RT-PCR oraz
niezbêdne odczynniki. Analiza RT-PCR zwi¹zana by³a z monitorowaniem fluorescencji wynikaj¹cej z zastosowania fluorogennych sond w PCR. DNA do reakcji
PCR uzyskiwano bezpoœrednio z wymazów i próbek powietrza oraz z materia³u
wyhodowanego z ww. próbek na pod³o¿ach hodowlanych. Wykorzystuj¹c metody
hodowlane i RT-PCR mo¿liwe by³o uzyskanie wyników w ci¹gu 24 godzin od pobrania próbki. Podsumowuj¹c, laboratorium zapewni³o wygodny i ³atwo dostêpny
punkt do zbierania i badania na obecnoœæ przetrwalników B. anthracis, próbek œrodowiskowych i potencjalnie zaka¿onych powierzchni np. kopert. Dziêki analizom
molekularnym w po³¹czeniu ze standartowymi metodami hodowlanymi uda³o siê
zidentyfikowaæ kilka przypadków wystêpowania przetrwalników B. anthracis i przeprowadziæ skuteczn¹ dekontaminacjê ska¿onych miejsc [23].
4.4. Opakowywanie i przesy³anie materia³ów zakaŸnych
Próbki zawieraj¹ce materia³y, które mog¹ byæ Ÿród³em zaka¿enia powinny byæ
pakowane zgodnie z wytycznymi Miêdzynarodowego Stowarzyszenia Transportu
Powietrznego oraz innymi rozporz¹dzeniami obowi¹zuj¹cymi w danym kraju.
Wszystkie materia³y zawieraj¹ce kultury drobnoustrojów s¹ traktowane jako zakaŸne i powinny byæ opakowywane oraz transportowane w taki sam sposób bez wzglêdu na odleg³oœæ [62]. Podstawowy zestaw do pakowania sk³ada siê z trzech warstw.
Opakowanie bezpoœrednie stanowi oznakowane, wodoszczelne naczynie, zawieraj¹ce próbkê. Naczynie to powinno byæ owiniête materia³em ch³onnym, przeznaczonym do zaadsorbowania ca³ej zawartoœci p³ynnej w przypadku uszkodzenia
opakowania bezpoœredniego. Drug¹ warstwê stanowi naczynie wtórne, bêd¹ce
wodoszczelnym pojemnikiem chroni¹cym opakowanie bezpoœrednie. Zewnêtrzna
paczka przesy³owa chroni naczynie wtórne i jego zawartoœæ przed dzia³aniem czynników zewnêtrznych [1]. Personel laboratoriów powinien byæ przeszkolony i posiadaæ certyfikaty upowa¿niaj¹ce do pakowania i wys³ania materia³ów zakaŸnych
przy zastosowaniu zatwierdzonych materia³ów opakowuj¹cych i pojemników. Kierownictwo laboratoriów powinno posiadaæ wykaz przewoŸników uprawnionych do
transportu takich materia³ów. Wiêkszoœæ takich przesy³ek bêdzie wysy³ana z pracowni A do B [62].
Próbki przed przyjêciem do badañ w laboratorium powinny przejœæ przez specjalnie zaprojektowane wejœcie, gdzie bêd¹ dodatkowo podwójnie opakowane
w torebki i nastêpnie odka¿ane zewnêtrznie przed przeniesieniem do pracowni gdzie
bêd¹ poddane analizom. Ponadto, powinna zostaæ dla nich wykonana dokumentacja
oraz ocena, które z nich s¹ priorytetowe [20].
Materia³y wyjœciowe i kultury pierwotne powinny byæ przechowywane poniewa¿ mog¹ byæ wykorzystane w dochodzeniach epidemiologicznych i kryminalnych.
Po pobraniu do badania pozosta³a czêœæ próbki powinna byæ na nowo opakowana
tak, a¿eby na zewn¹trz nie by³a ska¿ona i nastêpnie umieszczona w wyznaczonym
miejscu, zabezpieczonym przed dostêpem przez nieuprawniony personel [20, 62].
335
4.5. Ochrona laboratorium
Laboratoria powinny posiadaæ ochronê zaplanowan¹ przez specjalistów [62].
Mog¹ one byæ monitorowane kamerami telewizyjnymi przez ca³¹ dobê, wstêp do
pracowni powinien byæ kontrolowany i ograniczony tylko dla personelu posiadaj¹cego karty wstêpu. Osoby postronne powinny byæ przyjmowane w wyznaczonym
miejscu. Korzystne jest ograniczenie do jednego liczby wejœæ dostêpnych dla
pacjentów i osób z zewn¹trz oraz wydzielenie innego wyjœcia do przyjmowania
próbek materia³ów [20]. Dodatkow¹ ochron¹ jest zamykanie wszystkich kabin,
ch³odni, inkubatorów i drzwi do pomieszczeñ w których prowadzone s¹ prace oraz
przechowywane materia³y i hodowle pierwotne [62].
4.6. Identyfikacja wa¿niejszych czynników broni biologicznej
Poni¿ej przedstawiono laboratoryjne procedury testowania w kierunku najwa¿niejszych czynników, które mog¹ byæ wykorzystane jako broñ biologiczna.
4.6.1. B. anthracis
Bakterie w¹glika mog¹ byæ izolowane w przypadku zaka¿enia przebiegaj¹cego
w postaci skórnej z uszkodzeñ nab³onka, w postaci p³ucnej z plwociny, krwi, natomiast w postaci jelitowej z ka³u, p³ynu ¿o³¹dkowo-jelitowego i krwi. Plwocinê, ka³
i wymazy skórne posiewa siê na pod³o¿e agarowe z krwi¹ barani¹, agar czekoladowy i MacConkey’a. Kryteria wstêpnej identyfikacji B. anthracis, prowadzonej
w laboratoriach A, obejmuj¹ barwienie metod¹ Grama, opis morfologii kolonii, zdolnoœæ do sporulacji i ocenê ruchliwoœci [6]. B. anthracis roœnie dobrze na pod³o¿u
agarowym z krwi¹ barani¹ w temperaturze 35°C, tworz¹c po 15–24 godzinach inkubacji, kolonie o œrednicy 2–5 mm, p³askie, lekko wynios³e, z nieregularnymi brzegami, matowe o lepkiej konsystencji, nie hemolizuj¹ce. Laseczki B. anthracis s¹ Gram-dodatnie, wzglêdnie beztlenowe (1–1,5 mm × 3–5 mm), wytwarzaj¹ce katalazê. Bakterie te s¹ nieurzêsione, czêsto u³o¿one s¹ w ³añcuszki sk³adaj¹ce siê z 2–4 komórek.
Otoczki zwykle widoczne s¹ w preparatach wykonanych z zainfekowanych tkanek,
natomiast nie obserwuje siê ich tworzenia, kiedy bakterie hodowane s¹ na standardowych pod³o¿ach laboratoryjnych. Barwienie tuszem indyjskim mo¿e byæ stosowane przy przygotowywaniu preparatów bezpoœrednich z krwi lub p³ynu rdzeniowomózgowego. Bakterie te mog¹ tworzyæ w obecnoœci tlenu przetrwalniki owalne, nie
zniekszta³caj¹ce komórki, zlokalizowane centralnie lub podbiegunowo [5, 15, 34,
40, 67]. Najwa¿niejsze w³aœciwoœci ró¿nicuj¹ce B. anthracis z innymi fenotypowo
podobnymi gatunkami tego rodzaju to brak ruchliwoœci i zdolnoœci do hemolizowania erytrocytów barana oraz wytwarzanie poliglutaminowych otoczek [5, 34]. Przy
minimalnym kontakcie z tymi bakteriami szczepienie personelu nie jest wymagane,
natomiast zalecane jest u¿ywanie fartuchów, rêkawic, maseczek na twarz oraz wykorzystywanie technik nie tworz¹cych aerozolu. Izolaty wstêpnie zidentyfikowane jako
B. anthracis powinny byæ niezw³ocznie przekazane najbli¿szemu upowa¿nionemu
laboratorium wy¿szej kategorii w celu wykonania identyfikacji potwierdzaj¹cej
336
[5, 34]. W pracowniach poziomu B, oprócz ww. badañ przewidziano wykonanie
testów potwierdzaj¹cych: lizê fagiem gamma oraz wykrycie polisacharydów œciany
komórkowej (galaktoza/N-acetylgalaktozamina) i otoczki technik¹ bezpoœredniej fluorescencji [6]. W laboratoriach kategorii C powinna byæ okreœlona opornoœci bakterii
w¹glika na antybiotyki oraz dalsze testowanie z udzia³em zaawansowanych technik
laboratoryjnych, np. PCR, natomiast molekularna charakterystyka (np. MLVA, sekwencjonowanie 16S rDNA) powinna byæ wykonana w pracowni D [6]. Ostatnio opracowano nowe, bardzo szybkie i czu³e metody identyfikacji B. anthracis z wykorzystaniem monoklonalnych przeciwcia³ znakowanych fluorescein¹ [12], techniki RT-PCR
[25] i sekwencjonowania genu 16S rRNA [58]. Potwierdzenie zaka¿enia laseczkami
w¹glika u ludzi mo¿na uzyskaæ technik¹ ELISA, wykrywaj¹c¹ obecnoœæ specyficznych immunoglobulin IgG w surowicy zaka¿onych osób [52].
4.6.2. Francisella tularensis
Bakterie tularemii s¹ ma³ymi (0,2–1,0 :m), polimorficznymi, nieruchliwymi,
Gram-ujemnymi ziarniakowatymi pa³eczkami, bezwzglêdnie tlenowymi. Mog¹ byæ
hodowane zale¿nie od formy zaka¿enia z krwi, p³ynu op³ucnowego, plwociny, ran,
wêz³ów ch³onnych lub aspiratów ¿o³¹dkowych. Krew badana jest metodami standardowymi, natomiast materia³y inne posiewa siê na pod³o¿e agarowe z krwi¹ barani¹, agar czekoladowy, MacConkey’a, pod³o¿e agarowe z cystein¹ lub z cystein¹
i 9% gotowan¹ krwi¹ barani¹. F. tularensis wyrasta na pod³o¿u agarowym z krwi¹
barani¹, zalecana jest hodowla do 5 dni. Wymagaj¹ do wzrostu cysteiny, na agarze
z tym aminokwasem (cysteine heart agar) tworz¹, po 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 35–37°C, ma³e (1–2 mm) zielonkawe, opalizuj¹ce kolonie. Mniejsze, szaro-bia³e kolonie tworzone s¹ na agarze czekoladowym lub pod³o¿u Thayer-Martina.
Zwiêkszone stê¿enie CO2 w atmosferze hodowlanej mo¿e stymulowaæ ich wzrost.
Buforowany agar BCYE (bacto charcoal agar) równie¿ zapewnia wzrost pa³eczkom
tularemii i mo¿e byæ stosowany zamiast pod³o¿a z cystein¹, jednak kolonie F. tularensis rosn¹ce na nim nie maj¹ zielonkawego po³ysku. Bakterie tularemii nie
wyrastaj¹ na pod³o¿u MacConkey’a i EMB Levine’a, s³abo rosn¹ na pod³o¿ach
bulionowych, np. z tioglikolanem i na wyci¹gu mózgowo-sercowym, nawet jeœli
wzbogacone s¹ witaminami. W³aœciwoœci fenotypowe, sugeruj¹ce przynale¿noœæ
wyhodowanych bakterii do gatunku F. tularensis, to brak oksydazy cytochromowej,
s³abo dodatni wynik w teœcie na katalazê, pozytywna reakcja w teœcie na wytwarzanie $-galaktozydazy i brak produkcji ureazy. Izolaty podejrzane o przynale¿noœæ
do gatunku F. tularensis powinny byæ jak najszybciej przekazane z laboratorium
kategorii A do wyznaczonej pracowni poziomu B w celu potwierdzenia wstêpnej
identyfikacji [5, 34]. Taka praktyka jest zalecana nie tylko ze wzglêdu na nieznajomoœæ tego gatunku przez mikrobiologów, lecz równie¿ z powodu du¿ego ryzyka
laboratoryjnego zaka¿enia tym groŸnym patogenem. Na podstawie w³aœciwoœci
fenotypowych bakterie te mog¹ byæ b³êdnie rozpoznane jako Haemophilus influenzae
lub Actinobacillus sp. W identyfikacji stosowane s¹ tak¿e testy serologiczne, ale
opisano reakcje krzy¿owe przeciwcia³ anty – F. tularensis z komórkami Brucella
sp., Proteus OX19 i Yersinia spp. [5, 34].
337
4.6.3. Yersinia pestis
Pa³eczki d¿umy najczêœciej izolowane s¹ od chorych z krwi, wymazów z gard³a,
plwociny, bioptatu z wêz³ów limfatycznych, w¹troby, trzustki, p³uc lub œledziony,
p³ynu rdzeniowo-mózgowego. W przypadku badania krwi, nale¿y wykonaæ kilka
posiewów, bowiem bakteriemia ma charakter nieci¹g³y. Pobranie trzech próbek krwi
co 45 minut przed podjêciem terapii zazwyczaj pozwala stwierdziæ obecnoœæ Y. pestis
w badanym materiale metodami hodowlanymi [73]. W preparacie mikroskopowym
wykonanym bezpoœrednio z pobranego materia³u, komórki Y. pestis maj¹ kszta³t
pa³eczek o wielkoœci 1–3×0,5–0,8 :m, uk³adaj¹cych siê pojedynczo, pary lub krótkie
³añcuszki. W metodzie Wrighta-Giemzy komórki barwi¹ siê dwubiegunowo [5, 28,
34, 73]. Rozmazy powinny tak¿e byæ bezpoœrednio barwione technik¹ immunofluorescencyjn¹ z wykorzystaniem immunoglobulin przeciwko antygenowi F1.
W ostrej fazie choroby i w 4–6 tygodniu rekonwalescencji surowicê powinno badaæ
siê na obecnoœæ przeciwcia³ anty – Y. pestis [73]. Bakterie te naj³atwiej jest hodowaæ
na pod³o¿u agarowym z krwi¹ barani¹, pod³o¿u z cefsulodin¹ (4 mg/ml), irgasanem
i nowobiocyn¹ oraz na agarze MacConkey’a, na którym tworz¹ kolonie laktozoujemne, po d³u¿szej inkubacji przypominaj¹ce wygl¹dem sadzone jajko. Pierwotne
posiewy nale¿y hodowaæ do 5 dni. W przypadku podejrzenia d¿umy nale¿y inkubacjê prowadziæ w temperaturze 22–28°C poniewa¿ Y. pestis roœnie szybciej w tej
temperaturze ni¿ w 37°C. Na pod³o¿u MacConkey’a i EMB ich wzrost po 24 godz.
mo¿e byæ niewidoczny. W przeciwieñstwie do pozosta³ych gatunków rodzaju Yersinia, pa³eczki d¿umy nie s¹ zdolne do ruchu. Wiêkszoœæ komercyjnie dostêpnych
zestawów do identyfikacji bakterii obejmuje Y. pestis, jednak ich przydatnoœæ nie
zosta³a okreœlona. Podstawowymi kryteriami dla laboratoriów A, œwiadcz¹cymi
o mo¿liwoœci obecnoœci pa³eczek d¿umy w próbkach materia³ów jest dwubiegunowe
wybarwienie komórek, wzrost w postaci bardzo ma³ych kolonii (jak gdyby uk³ucie
ig³y) na pod³o¿u agarowym z krwi¹ barani¹ po 24 godz. hodowli, brak fermentacji
laktozy, negatywna reakcja w testach na oksydazê i ureazê, natomiast pozytywna na
katalazê oraz wzrost lepszy w temperaturze 28°C ni¿ 37°C [5, 34]. Potwierdzenie
diagnozy nale¿y uzyskaæ w laboratoriach wy¿szej kategorii metodami immunoenzymatycznymi i PCR, które jednak nie s¹ dostêpnie komercyjnie [34] Ostateczne
potwierdzenie mo¿na tak¿e uzyskaæ na podstawie lizy komórek Y. pestis swoistym
bakteriofagiem oraz co najmniej 4-krotnym wzroœcie w surowicy krwi pacjentów,
miana przeciwcia³ przeciw antygenowi F1, okreœlanego w teœcie hemaglutynacji
biernej [73]. Próbki (biopsje tkanek, skrzep) pobrane do testów opartych na technice
PCR nale¿y przewoziæ w suchym lodzie. Prace z Y. pestis powinny byæ prowadzone
w laboratoriach z zabezpieczeniem co najmniej BSL 2 [5, 34].
4.6.4. Wirus ospy prawdziwej
Wirus ospy jest najwiêkszym wirusem zwierzêcym. Wiriony maj¹ wielkoœæ ok.
300×200×100 :m. Ich kszta³t nie pozwala na odró¿nienie go od znacznie mniej
groŸnego wirusa krowianki. Nukleokapsyd wirusa ospy, przypominaj¹cy kszta³tem
hantle, zawiera dwuniciowy DNA otoczony dwiema b³onami lipoproteinowymi.
Diagnostyk¹ wirusa ospy powinny zajmowaæ siê wy³¹cznie wyspecjalizowane labo338
ratoria kategorii D z zabezpieczeniami BSL 4. Pracownicy laboratoriów szpitalnych
powinni jedynie uczestniczyæ w opakowaniu i przes³aniu pobranych próbek do
wyznaczonej pracowni. Najlepszym materia³em do badañ laboratoryjnych jest p³yn
pêcherzykowy z rany zebrany na szkie³ko podstawowe i wysuszony. Skrzepy,
zeskrobiny i bioptaty umieszcza siê w szczelnych pojemnikach, które wytrzymuj¹
zamra¿anie. Próbki mo¿na przechowywaæ w 4°C do 6 godzin, d³u¿ej w temperaturze
–20 do –70°C. Wstêpne laboratoryjne rozpoznanie mo¿e byæ dokonane metod¹ barwienia Giemzy materia³u pobranego ze zmian skórnych. Pewn¹ metod¹ jest hodowla
na 12–14 dniowej b³onie kosmówkowo-owodniowej zarodka kurzego, bowiem zmiany wywo³ane przez wirusa ospy pozwalaj¹ na ró¿nicowanie go z innymi pokswirusami. Rozpuszczalne antygeny wirusa, obecne w krwi, grudkach i pêcherzykach, mo¿na
wykrywaæ za pomoc¹ technik immunofluorescencyjnych, metody immunodyfuzji
Ouchterlony’ego, metod¹ hemaglutynacji lub neutralizacji oraz odczynu wi¹zania
dope³niacza. Wirus ospy mo¿e byæ namna¿any w hodowlach komórkowych. Po
48 godzinach wykrywane s¹ tzw. cia³ka Guarnieri – eozynoch³onne inkluzje cytoplazmatyczne, a efekt cytopatyczny wystêpuje zwykle po 5–8 dniach. Szybka diagnostyka wirusa ospy mo¿e byæ równie¿ wykonana technik¹ PCR [5, 34].
4.6.5. Wirusy gor¹czek krwotocznych
Badania tej grupy wirusów powinny byæ prowadzone tylko w laboratoriach kategorii D, posiadaj¹cych najwy¿szy stopieñ zabezpieczeñ (BSL 4). Diagnostyka
wirusów gor¹czek krwotocznych mo¿e byæ wykonana metodami serologicznymi,
immunohistologicznymi, hodowli na zwierzêtach laboratoryjnych i technikami
amplifikacji kwasów nukleinowych. Do diagnostyki serologicznej nale¿y zebraæ
surowicê w iloœci 5 do 12 ml w ostrej fazie choroby i 21 dniu rekonwalescencji. Do
badañ mo¿na tak¿e wykorzystaæ poœmiertn¹ krew pobran¹ z serca, skrzep oraz biopsje
tkanek. Sch³odzone próbki surowicy nale¿y transportowaæ w plastikowych probówkach w lodzie lub suchym lodzie. Zatopione w parafinie tkanki nale¿y transportowaæ w temperaturze pokojowej, natomiast próbki pobrane do testowania metod¹
PCR w suchym lodzie, powinny mieæ one objêtoœæ przynajmniej 1 cm3 [5, 34].
4.6.6. Toksyna botulinowa
Obecnoœæ toksyny botulinowej mo¿na wykryæ w surowicy krwi, wymiocinach,
kale, aspiracie z dróg oddechowych, tkankach i materiale pobranym z okolicy rany.
W laboratoriach kategorii A nie powinno prowadziæ siê badañ maj¹cych na celu
wykrycie obecnoœci tej toksyny w pobranych próbkach materia³ów. Podstawowym
zadaniem pracowników tych pracowni jest pobranie próbek materia³ów i przes³anie
ich do laboratoriów wy¿szej kategorii. Próbki tkanek nale¿y przesy³aæ w temperaturze pokojowej, natomiast pozosta³e materia³y powinny byæ przechowywane i transportowane w temperaturze 4°C. Typy antygenowe A, B, E i F s¹ najczêœciej zwi¹zane
z zaka¿eniami u cz³owieka o charakterze zatrucia pokarmowego lub zaka¿enia ran.
Toksynê botulinow¹ oraz jej typ antygenowy okreœla siê na myszach w odczynie
neutralizacji swoist¹ antytoksyn¹ w wyspecjalizowanych laboratoriach o zabezpieczeniu BSL 3 lub 4. Metoda ta pozwala na wykrycie toksyny w iloœci od 0,03 ng
339
w czasie 6–96 godzin. W identyfikacji stosuje siê tak¿e metody radioimmunologiczne i immunoenzymatyczne. Pora¿enie miêœniowe spowodowane u¿yciem toksyny
botulinowej mo¿na okreœliæ elektromiogramem. Niekiedy próbki materia³ów posiewa siê na pod³o¿a i nastêpnie okreœla toksycznoœæ wyhodowanych izolatów Clostridium botulinum [2, 5, 34].
5. Podsumowanie
Wed³ug danych z roku 2001, co najmniej 13 pañstw posiada broñ biologiczn¹
[29]. Z raportu Biura Bezpieczeñstwa Narodowego [53] wynika, ¿e w Polsce nie ma
bezpoœredniego zagro¿enia wywo³anego atakiem broni¹ biologiczn¹. Obecna sytuacja miêdzynarodowa, przede wszystkim d¹¿enie terrorystów do odwetu, sugeruje
jednak realn¹ mo¿liwoœæ jej u¿ycia. Nawet gdyby taki atak mia³ miejsce na obszarze
obcego pañstwa to w bardzo krótkim czasie mo¿e dojœæ do zawleczenia chorobotwórczych drobnoustrojów na teren Polski, s³u¿ba zdrowia musi wiêc byæ przygotowane na tak¹ ewentualnoœæ. W zwalczaniu skutków ataku z u¿yciem broni biologicznej podstawow¹ rolê odegraj¹ laboratoria mikrobiologiczne. Stworzenie sieci
pracowni, analogicznej do tej która funkcjonuje w USA, opracowanie zakresu
kompetencji i technik, które nale¿y w nich stosowaæ wydaje siê byæ potrzeb¹ chwili.
Konieczne jest tak¿e zwiêkszenie wysi³ków w celu opracowania nowych, szybkich
i specyficznych metod identyfikacji czynników, które mog¹ byæ u¿yte jako broñ
biologiczna. Szybka identyfikacja mo¿e przyczyniæ siê do przeciwdzia³ania skutkom ataku i do znacznego zmniejszenia liczby ofiar. Wprowadzenie nowoczesnych technik, w tym molekularnych z amplifikacj¹ DNA metod¹ PCR, szybkim
sekwencjonowaniem kwasów nukleinowych, serologicznych, immunoenzymatycznych i innych, powinno czas ten skróciæ z kilkudziesiêciu do kilku godzin [3, 69].
Uzyskanie postêpu w tym zakresie jest jednym z najwa¿niejszych bie¿¹cych zadañ
oœrodków naukowo-badawczych, specjalizuj¹cych siê w opracowywaniu nowych
testów diagnostycznych [34].
Piœmiennictwo
1. Arciuch H. (on line): Pobieranie, pakowanie, ochrona oraz przesy³anie próbek do badañ laboratoryjnych. http://www.giz.mz.gov.pl./news/sibc.htm (25.02.2003)
2. Arnon S.S., K. Tonat i wsp.: Botulinum toxin as biological weapon. Medical and public health
management. JAMA, 285, 1059–1070 (2001)
3. Black H.: Diagnosing bioterrorrism: applying new technologies. Scientist, July 23, 8–10 (2001)
4. Casadevall A.: Passive antibody administration (immediate immunity) as a specyfic defense against
biological weapons. Emerg. Infect. Dis. 8, 833–841 (2002)
5. Centers for Disease Control and Prevention (online). Public health emergency preparedness and
response, http://www.bt.cdc.gov/roleofclinlab.asp (04.03.2003 r.)
6. Centers for Disease Control and Prevention (online). Approved Tests for the Detection of Bacillus anthracis in the Laboratory Response Network (LRN), http://www.bt.cdc.gov/documentsapp/
Anthrax/ApprovedLRNTests.asp (04.03.2003 r.)
340
7. Chomiczewski K., Kocik J., Szkoda M.T.: Bioterroryzm. Zasady postêpowania lekarskiego. Wyd.
Lek. PZWL. Warszawa 2002
8. Christopher G.W., Cieslak T.J., Pavlin J.A., Eitzen Jr, E.M.: Biological warfare. A historical perspective. JAMA 278, 412–417 (1997)
9. Cieslak T.J., Eitzen Jr.E.M.: Clinical and epidemiologic principles of anthrax. Emerg. Infect. Dis.
5, 552–555 (1999)
10. Cieslak T.J., Christopher G.W., Kortepeter M.G., Rowe J.R., Pavlin J.A., Culpepper R.C.,
Eitzen Jr.E.M.: Immunization against potential biological warfare agents. Clin. Infect. Dis. 30,
843–850 (2000)
11. Davis C.J.: Nuclear blindness: an overview of the biological weapons programs of the former
Soviet Union and Iraq. Emerg. Infect. Dis. 5, 509–512 (1999)
12. De B.K., T. Popovic i wsp.: Two-component direct fluorescent-antibody assay for rapid identification of Bacillus anthracis. Emerg. Infect. Dis. 8, 1060–1065 (2002)
13. Dennis D.T., K. Tonat i wsp.: Tularemia as a biological weapon. Medical and public health management. JAMA, 285, 2763–2773 (2001)
14. Dickinson Burrows W., Renner S.E.: Biological warfare agents as threats to potable water. Environ. Health Perspect. 107, 975–983 (1999)
15. Dixon T.C., Matthew Meselson B.S., Guillemin J., Hanna P.C.: Antrax. New Engl. J. Med. 341,
815–826 (1999)
16. Dull P.M., D. Ashford i wsp.: Bacillus anthracis aerosolization associated with a contaminated
mail sorting machine. Emerg. Infect. Dis. 8, 1044–1047 (2002)
17. Franz D.R., Jahrling P.B., Friendlander A.M., McClain D.J., Hoover D.L., Bryne W.R., Pavlin J.A.,
Christofer G.W., Eitzen Jr.E.M: Clinical recognition and management of patients exposed to biological warfare agents. JAMA, 278, 399–411 (1997)
18. G³ówny Inspektorat Sanitarny (online). Schemat postêpowania i wspó³pracy w przypadku zagro¿enia niebezpieczn¹ chorob¹ zakaŸn¹ oraz bioterroryzmem., http://www.gis.mz.gov.pl./schemat.htm
(02.12.2002).
19. Hawley R.J., Eitzen Jr.E.M.: Biological weapons – a primer for microbiologists. Annu. Rev.
Microbiol. 55, 235–253 (2001)
20. Heller M.B., S.T. Beatrice i wsp.: Laboratory response to anthrax bioterrorism, New York City,
2001. Emerg. Infect. Dis. 8, 1096–1102
21. Henderson D.A.: Smallpox: clinical and epidemiologic features. Emerg. Infect. Dis. 5, 537–539
(1999)
22. Henderson D.A., K. Tonat i wsp.: Smallpox as a biological weapon. Medical and public health
management. JAMA, 281, 2127–2137 (1999)
23. A. Higgins, Cooper M., Schroeder-Tucker L., Black S., Miller D., Karns J. S., Manthey E.,
Breeze R., Perdue M.l.: A field investigation of Bacillus anthracis contamination of U.S. Department of Agriculture and other Washington, D.C., buildings during the anthrax attack of October
2001. Appl. Environ. Microbiol. 69, 593–599 (2003)
24. Hoffmaster A.R., Fitzgerald C.C., Ribot E., Mayer L.W., Popovic T.: Molecular subtyping of
Bacillus anthracis and the 2001 bioterrorism-associated anthrax outbreak, United States. Emerg.
Infect. Dis. 8, 1111–116 (2002)
25. Hoffmaster A.R., Meyer R.F., Bowen M.P., Marston C.K., Weyant R.S., Barnett G.A., Sejvar J.J.,
Jernigan J.A., Perkins B.A., Popovic T.: Evaluation and validation of Real Time Polymerase Chain
Reaction assay for rapid identification of Bacillus anthracis. Emerg. Infect. Dis. 8, 1178–1182 (2002)
26. Hughes J.M.:The emerging threat of bioterrorism. Emerg. Infect. Dis. 5, 494–495 (1999)
27. Inglesby T.V., K. Tonat i wsp.: Anthrax as a biological weapon. Medical and public health management. JAMA, 281, 1735–1745 (1999)
28. Inglesby T. V., K. Tonat i wsp.: Plague as a biological weapon. Medical and public health management. JAMA, 283, 2281–2290 (2000)
29. Inglesby T.V., K. Tonat i wsp.: Anthrax as a biological weapon, 2002. Medical and public health
management. JAMA, 287, 2236–2252 (2002)
341
30. Jernigan J.A., B.A. Perkins i wsp.: Bioterrorism-related inhalational anthrax: the first 10 cases
reported in the United States. Emerg. Infect. Dis. 7, 933–943 (2001)
31. Jernigan D.B., J.L. Gerberding i wsp.: Investigation of bioterrorism-related anthrax, United States, 2001: Epidemiological findings. Emerg. Infect. Dis. 8, 1019–1028, (2002)
32. Jortani S.A., Snyder J.W., Valdes Jr, R.: The role of the clinical laboratory on managing chemical
or biological terrorism. Clin. Chem. 46,1883–1893 (2000)
33. Kaufmann A.F., Meltzer M.I., Schmid G.P.: The economic impact of a bioterrorist attack: are
prevention and postattack intervention programs justifiable? Emerg. Infect. Dis. 3, 83–94 (1997)
34. Klietmann W.F., Ruoff K.L.: Bioterrorism: implications for the clinical microbiologist. Clin.
Microbiol. Rev. 14, 364–381 (2001)
35. Kortepeter M.G, Parker G.W.: Potential biological weapons threats. Emerg. Infect. Dis. 5, 523–527
(1999)
36. Kortepeter M., Christopher G., Cieslak T., Culpepper R., Darling R., Pavlin J., Rowe J., McKee
Jr.K., Eitzen Jr.E. (online): USAMRIID’s Medical management of biological casualties handbook, wyd. 4, U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, Fort Detrick, Frederick,
Maryland, 2001. http://www.usamriid.army.mil/education/ bluebook.html (04.03.2003 r.)
37. Kuroczyñski-Saniutycz S. (online): Podstawowe praktyczne dzia³ania szpitala w odpowiedzi na
zagro¿enia bioterrorystyczne i du¿e epidemie. G³ówny Inspektorat Sanitarny. http://www.gis.mz.
gov.pl./news/kuroczyñski.htm (02.12.2002)
38. LaForce F.M.: Anthrax. Clin. Infect. Dis. 19, 1009–1014 (1994)
39. Lane H.C., La Montagne J., Fauci A.S.: Bioterrorism: a clear and present danger. Nature Medicine.
7, 1271–1273 (2001)
40. Matras J., Bartoszcze M.: Bacillus anthracis. Post. Mikrobiol. 41, 3–19 (2002)
41. McDade J.E., Franz D.: Bioterrorism as a public health threat. Emerg. Infect. Dis. 4, 493–494 (1998)
42. Meltzer M.I., Damon I., LeDuc J.W., Miller J.D.: Modeling potential responses to smallpox as
a bioterrorist weapon. Emerg. Infect. Dis. 7, 959–969 (2001)
43. Mierzejewski J., Bartoszcze M.: Konsekwencje doœwiadczeñ nad wykorzystaniem Bacillus anthracis jako broni biologicznej. Post. Mikrobiol. 34, 385–401 (1995)
44. Mierzejewski J.: Bioterroryzm. Post. Mikrobiol. 40, 279–285 (2001)
45. Mierzejewski J., Franz D.R., Zajtchuck R. (online): Bioterroryzm. G³ówny Inspektorat Sanitarny.
http://www.giz.mz.gov.pl./news/artykul.htm (02.12.2002).
46. Mock M., Fouet A.: Anthrax. Ann. Rev. Microbiol. 55, 647–671 (2001)
47. Mott J.A., Treadwell T.A., Hennessy T.W., Rosenberg P.A., Wolfe M.I., Brown C.M., Butler J.C.:
Call-tracking data and the public health response to bioterrorism-related antrax. Emerg. Infect.
Dis. 8, 1088–1092 (2002)
48. NATO Handbook on medical aspects of NBC defensive operations (online). AMedp-6(B), Part
II-biological, 1996, http://www.unh.org/MedAspNCBDef/2toc.htm (02.12.2002)
49. Pavlin J.A.: Epidemiology of bioterrorism. Emerg. Infect. Dis. 5, 528–530 (1999)
50. Perkins B.A., Popovic T., Yeskey K: Public health in the time of bioterrorism. Emerg. Infect. Dis.
8, 1015–1018 (2002)
51. Peterson L.R., Hamilton J.D., Baron E.J., Tompkins L.L., Miller J.M., Wilfert C.M., Tenover F.C.,
Thomson Jr, R.B.: Role of clinical microbiology laboratories in the managements and control of
infectious diseases and the delivery of health care. Clin. Infect. Dis. 32, 605–611 (2001)
52. Quinn C.P., B.A. Perkins. i wsp.. Specific, sensitive, and quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for human immunoglobulin G antibodies to antrax toxin protective antigen. Emerg.
Infect. Dis. 8, 1103–1110 (2002)
53. Raport BBN o stanie przygotowania pañstwa do realizacji zadañ w zakresie monitorowania, diagnozowania oraz zwalczania i usuwania skutków zagro¿eñ srodkami mikrobiologicznymi (online).
Biuro Bezpieczeñstwa Narodowego RP, Warszawa 2002., http://www.bbn.gov.pl/pl/bbn-pl.html
(04.03.2003 r.)
54. Richmond J.Y., McKinney R.W.: Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (online).
Wyd. 4, U.S. Government printing office, Washington (1999). http://www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/
brnbl4/bmbt4toc.htm (04.03.2003 r.)
342
55. Rosenthal S.R., Merchlinsky M., Kleppinger C., Goldenthal K.L.: Developing new smallpox
vaccines. Emerg. Infect. Dis. 7, 920–926 (2001)
56. Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.M., Ostroff S.M., Hughes J.M.: Public health assessment of
potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225–230 (2002)
57. Russell P.K.: Vaccines in civillan defense against bioterrorism. Emerg. Infect. Dis. 5, 531–533
(1999)
58. Sacchi C.T., Whitney A.M., Mayer L.W., Morey R., Steigerwalt A., Bioras A., Weyant R.S.,
Popovic T.: Sequencing of 16S rRNA gene: a rapid tool for identification of Bacillus anthracis.
Emerg. Infect. Dis. 8, 117–1123 (2002)
59. Shalala D.A.: Bioterrorism: how prepared are we? Emerg. Infect. Dis. 5, 492–493 (1999)
60. Siegrist D. W.: The threat of biological attack: why concern now? Emerg. Infect. Dis. 5, 505–508
(1999)
61. Simon J.D.: Biological terrorism. Preparing to meet the threat. JAMA 278, 428–430 (1997)
62. Snyder J. M.: Role of the Hospital-based Microbiology Laboratory in Preparation for and
Response to a Bioterrorism Event. J. Clin. Microbiol. 41, 1–4 (2003)
63. Spencer R.C., Lightfoot N.F.: Preparedness and response to bioterrorism. J. Infect. 43, 104–110
(2001)
64. Stern J.: The prospect of domestic bioterrorism. Emerg. Infect. Dis. 5, 517–522 (1999)
65. Teshale E.H., D.L. Swerdlow i wsp.: Environmental sampling for spores of Bacillus anthracis.
Emerg. Infect. Dis. 8, 1083–1087 (2002)
66. Trucker J.B.: Historical trends related to bioterrorism: an empirical analysis. Emerg. Infect. Dis.
5, 498–504 (1999)
67. Turnbull P.C.B.: Guidelines for the surveillance and control of anthrax in human and animals
(online). Wyd. 3, WHO/EMC/ZDI/98.6. http://www.who.int/emc-documents/zoonoses/docs/who
emczdi986text.pdf (04.03.2003 r.)
68. Waeckerle J.F.: Domestic preparedness for events involving weapons of mass destruction. JAMA,
12, 252–254 (2000)
69. Walt D.H., Franz D.R.: Biological warfare detection. Anal. Chem. 72, 738A–746A (2000)
70. Wessely S., Hyams K.C., Bartholomew R.: Psychological implications of chemical and biological weapons. BMJ, 323, 878–879 (2001)
71. Wheelis M.: Biological warfare at the 1346 siege of Caffa. Emerg. Infect. Dis. 8, 971–975 (2002)
72. Whitby S.M.: The potential use of plant pathogens against crops. Microbes Infection 3, 73–80 (2001)
73. WHO Communicable Disease Surveillance and Response (online). WHO/CDS/EDC/99.2. Plague
Manual: Epidemiology, distribution, surveillence and Control, http://whqlibdoc.who.int/hq/1999/
WHO_CDS_CSR_EDC_99.2.pdf (04.03.2003 r.)
74. WHO guidance. Public health response to biological and chemical weapons second edition (online), WHO (2001), http://www.who.int/emc/book_2nd_edition.htm (04.03.2003 r.)
75. Williams J.L., Noviello S.S., Griffith K.S., Wurtzel H., Hamborsky J., Perz J.F., Williams I.T.,
Hadler J.L., Swerdlow D.L., Ridzon R.: Anthrax postexposure prophylaxis in postal workers,
Connecticut, 2001. Emerg. Infect. Dis. 8, 1133–1137 (2002)
76. Wilson T., Logan-Henfrey L., Weller R., Kellman B.: Agroterrorism, biological crimes and biological warfare targeting animal agriculture. str. 23–57. W: Emerging Diseases of Animals (red.
C. Brown i C. Bolin), ASM Press, Washington (2000)
Zak³ad Mikrobiologii, Instytut Biologii Eksperymentalnej
Uniwersytet im. A. Mickiewicza
61-701 Poznañ, ul. Fredry 10, e-mail: [email protected]
Wp³ynê³o w marcu 2003 r.
343
POST. MIKROBIOL.,
2003, 42, 3, 345–346
http://www.pm.microbiology.pl
Introduction to Food – and Airborne Fungi. Redakcja: Samson R.A., Hoekstra
Ellen S., Frisvad J.C., Filtenborg O., we wspó³pracy z 13 autorami. Sixth Edition.
Centralbureau voor Schimmelcultures – Utrecht. 2000. 389 stron, twarda oprawa,
ISBN 90-70351-42-0.
Szóste wydanie wymienionego tytu³u, w cztery lata po pi¹tym wydaniu w 1996 r.,
daje wielk¹ satysfakcjê mikologom pracuj¹cym w przemyœle rolno-spo¿ywczym
i w zwi¹zanych z nim instytucjach naukowych oraz us³ugowych.
Stale trzeba mieæ na uwadze fakt, ¿e w wartoœci produkcji sprzedanej, która
w 1999 r. wynios³a 431,7 mld z³, wartoœæ produkcji wyrobów spo¿ywczych i napojów osi¹gnê³a a¿ 87,0 mld z³, czyli 20,2%. Druga pozycja w tej statystyce, wartoœæ
produkcji pojazdów mechanicznych, stanowi tylko 6,6% ca³oœci wartoœci sprzeda¿y
przemys³u. Mikrobiologia, w tym mikologia, nie jest w przemyœle rolno-spo¿ywczym tematem teoretycznym. Drobnoustroje, w tym grzyby, powoduj¹ w wyniku
rozk³adu surowców rolniczych w czasie ich produkcji, a nastêpnie magazynowania
do momentu spo¿ycia, straty ekonomiczne, które siêgaj¹ 20% wartoœci produkcji
w skali roku, czyli 86 mld z³, a wiêc 21,5 mld dolarów. Ta kwota stanowi³a w 2002 r.
65% ca³ego eksportu Polski. Autor recenzji pragnie na wstêpie zwróciæ uwagê, ¿e
mikologia ¿ywnoœci i jej uprawianie w przemyœle ma ogromne znaczenie ekonomiczne, z czego niewiele osób na kierowniczych stanowiskach przemys³u rolnospo¿ywczego zdaje sobie sprawê.
Objêtoœæ szóstego wydania „Introduction ...” wzros³a o 67 stron formatu A4
(6480 znaków na stronie). Najwa¿niejszym elementem nowoœci jest to, ¿e grzyby
powietrza wewnêtrznego znalaz³y siê w tytule recenzowanej ksi¹¿ki. Liczba opisanych i przygotowanych do identyfikacji grzybów pleœniowych (bez dro¿d¿y) wzros³a ze 103 do 133 gatunków. Wielk¹ zas³ug¹ zespo³u pierwszego rozdzia³u jest wyraŸne zwrócenie uwagi, ¿e na 133 gatunki grzybów 53 gatunki wystêpuj¹ zarówno
w ¿ywnoœci jak i w powietrzu pomieszczeñ. W powietrzu pomieszczeñ i tylko
w powietrzu stwierdzono gatunki Chaetomium globosum, Curvularia geniculata,
Memnoniella echinata, Oidiodendron griseum oraz Stachybotrys chartarum.
Autor recenzji traktuje listê grzybów wyizolowanych z ¿ywnoœci, któr¹ ujêto na
stronach 4 i 5, jako wa¿ny dokument. Zastrze¿enia mog¹ natomiast budziæ gatunki
grzybów wymienione jako obecne w pomieszczeniach produkcyjnych i magazynowych przemys³u rolno-spo¿ywczego. Ze studiów w³asnych wynika, ¿e w powietrzu
wewnêtrznym budynków mieszkalnych i gmachów u¿ytecznoœci publicznej krajów
europejskich wyizolowano w okresie od 1958 do 1999 r. a¿ 227 gatunków grzybów.
W tym przedmiocie autorzy rozdzia³u pierwszego nie s¹ precyzyjni i nie informuj¹
czytelnika, ¿e w powietrzu wewnêtrznym ró¿nych pomieszczeñ sk³ad mikoflory
mo¿e siê ró¿nie uk³adaæ (Mikologia lekarska, 2000, 8, 3/4, 127–140).
Godny podkreœlenia jest fakt dobrej redakcji kluczy do oznaczania wymienionych
wy¿ej 133 gatunków w gromadach Zygomycota i Ascomycota oraz w wydzielonej
345
grupie grzybów anamorficznych, wczeœniej okreœlanej jako Deuteromycetes czy
Fungi Imperfecti.
Literatura przedmiotu do pierwszego rozdzia³u wzros³a o 30%. W podrozdziale
o dro¿d¿ach i grzybach dro¿d¿opodobnych zwrócono uwagê na 27 gatunków i wyspecyfikowano 16 systemów automatycznej identyfikacji gatunków tej grupy drobnoustrojów. Przy ca³ym uznaniu dla autorów pierwszego rozdzia³u, który stanowi
72% objêtoœci ksi¹¿ki, zdumiewa fakt, ¿e w piœmiennictwie pominiêto ósme wydanie „Dictionary of Fungi” pod redakcj¹ Hawkswortha i wsp., które jest kontynuacj¹
s³ownika autorstwa Guy Richarda Bisby’ego i Geoffrey’a Ains-wortha, wydanego
w 1943 r. Wymieniony s³ownik jest po prostu „bibli¹” mikologów. ¯a³owaæ trzeba,
¿e autorzy pierwszego rozdzia³u pomijaj¹ w spisie literatury znakomite dzie³o holendra P.J. Van der Werffa z 1958 r., który zestawi³ ca³e listy grzybów pleœniowych
dla ró¿nych ga³êzi przemys³u rolno-spo¿ywczego.
£¹czna liczba rozdzia³ów w ksi¹¿ce nie uleg³a zwiêkszeniu, ale wszystkie treœci
zosta³y uaktualnione. Na szczególn¹ uwagê zas³uguje lista 42 ksi¹¿ek na temat mikotoksyn, opublikowanych w okresie od 1974 do 1998 r. Warto zwróciæ uwagê na
ksi¹¿kê K.K. Sinha i D. Bhatnagara, wydan¹ w 1998 r., o objêtoœci 511 stron, poœwiêcon¹ mikotoksynom w rolnictwie i bezpieczeñstwu w obrocie ¿ywnoœci¹, jakie
narzuca toksycznoœæ tych metabolitów wtórnych dla cz³owieka i zwierz¹t hodowlanych. Temat jest daleki od wyczerpania, jeœli zwa¿yæ, ¿e w roku 2000 ukaza³o siê
330 artyku³ów o mikotosynach, a w 2001–254 artyku³y.
W przemys³owej obróbce ¿ywnoœci zwrócono wiêksz¹ uwagê w nowym wydaniu
ksi¹¿ki na gatunki grzybów odporne na wysokie temperatury oraz wartoœæ D, która
okreœla przedzia³ czasu potrzebny dla dezaktywacji 90% drobnoustrojów w danej temperaturze. Ma³o kto wie, ¿e Talaromyces flavus, a w³aœciwie jego makrospory, wytrzymuj¹ w mi¹¿szu owoców temperaturê 91oC przez okres od 2,1 minuty do 11,7 minuty.
W normach dopuszczalnego stê¿enia grzybów pleœniowych i dro¿d¿y w powietrzu
ró¿nych zak³adów przetwórczych przemys³u spo¿ywczego w wydaniu szóstym nie
zasz³y ¿adne zmiany w stosunku do wydania pi¹tego. Autorzy siódmego rozdzia³u
zwracaj¹ jednak uwagê na nowoœci technologiczne w procesach pasteryzacji ¿ywnoœci, w tym na: – dzia³anie wysokiego ciœnienia hydrostatycznego do 5000 barów, które
ma zabijaæ drobnoustroje oraz – dzia³anie pulsacyjnego pola elektrycznego przy napiêciu od 30 kV/cm do 41,7 kV/cm. Obydwie te technologie s¹ ci¹gle w fazie prób.
Niewielkie zmiany zosta³y dokonane w rozdziale o fungicydach dla produktów
¿ywnoœciowych. W zwalczaniu grzybów w ¿ywnoœci wyeliminowano azotany i azotyny oraz tlenek etylenu, ale dodano pochodne imidazoli. Technolodzy ¿ywnoœci
powinni zwróciæ uwagê na pracê Florosa i wsp. (2000) o modyfikacji atmosfery w
opakowaniach ¿ywnoœci oraz Nielsena i Riosa (2001) o lotnych zwi¹zkach grzybobójczych w zio³ach i przyprawach korzennych.
Dla dokonania postêpu w mikologii ¿ywnoœci by³oby cenn¹ rzecz¹ przet³umaczenie szóstego wydania „Introduction...” na jêzyk polski i szybkie wydanie tej pracy.
Praca O. Fassatiovej sprzed 20 lat jest po prostu przestarza³a. Rzecz jest warta zachodu, gdy siê zwa¿y roczn¹ wartoœæ produkcji przemys³u rolno-spo¿ywczego, o której
mówiono na wstêpie oraz wartoœæ strat powodowanych przez grzyby i bakterie.
Bronis³aw Zyska
346
POST. MIKROBIOL.,
2003, 42, 3, 347–350
http://www.pm.microbiology.pl
NOWE INICJATYWY
FEDERACJI
EUROPEJSKICH TOWARZYSTW
MIKROBIOLOGICZNYCH – FEMS
Stefan Tyski
Federacja Europejskich Towarzystw Mikrobiologicznych, do której od momentu
utworzenia w 1974 roku, nale¿y Polskie Towarzystwo Mikrobiologów, w ostatnich
miesi¹cach podjê³o dwie wa¿ne inicjatywy zmierzaj¹ce do zacieœnienia wspó³pracy
pomiêdzy towarzystwami mikrobiologicznymi dzia³aj¹cymi w Europie.
Podjêto decyzjê o organizowaniu co 3 lata Kongresu Europejskich Mikrobiologów FEMS. Pierwszy taki kongres odby³ siê w Ljubljanie w S³owenii w dniach
29.06. – 03.07 bie¿¹cego roku. Nastêpny rozpocznie siê 1 lipca 2006 roku w Hiszpanii, prawdopodobnie w Toledo, a kolejny planowany jest na lipiec 2009 roku
w Wielkiej Brytanii.
W pierwszym Kongresie wziê³o udzia³ ponad 1000 osób, w tym tylko 21 cz³onków Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów. Tematyka Kongresu by³a bardzo
urozmaicona i dotyczy³a rozmaitych aspektów: mikrobiologii lekarskiej, weterynaryjnej, œrodowiskowej, przemys³owej, ¿ywnoœci a tak¿e genetyki, biochemii,
fizjologii i systematyki drobnoustrojów. Specjaliœci zajmuj¹cy siê bakteriami,
grzybami, wirusami i pierwotniakami mogli znaleŸæ interesuj¹ce sesje, wyk³ady,
plakaty, a tak¿e dyskusje okr¹g³ego sto³u. Wielu m³odych naukowców z ró¿nych
krajów Europy uzyska³o pomoc finansow¹ FEMS umo¿liwiaj¹c¹ im uczestnictwo
w Kongresie – niestety nikt z m³odych cz³onków PTM nie by³ t¹ mo¿liwoœci¹
zainteresowany.
Druga inicjatywa FEMS dotyczy przygotowania Europejskiej Deklaracji Mikrobiologii, której projekt opublikowano w kwartalniku Mikrobiologia Medycyna
2003; 2 (35): 42–43. Na 1 Kongresie FEMS przedstawiono ostateczn¹ wersjê, któr¹
zaaprobowa³o ponad 40 towarzystw mikrobiologicznych Europy. Ze strony Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów Deklaracjê podpisa³ prof. Stefan Tyski cz³onek
Zarz¹du G³ównego PTM, delegat PTM do FEMS. Poni¿ej zamieszczono t³umaczenie przyjêtego tekstu.
347
EUROPEJSKA DEKLARACJA MIKROBIOLOGII
Europejska Deklaracja Mikrobiologii prezentuje opinii publicznej, twórcom polityki, spo³ecznoœci naukowej pogl¹dy i cele Federacji Europejskich
Towarzystw Mikrobiologicznych (FEMS).
Mikrobiologia, nauka o drobnoustrojach (wirusach, bakteriach, glonach,
pierwotniakach i grzybach) ma d³ug¹ i nieprzerwan¹ tradycjê w Europie od
czasów, gdy Antonie van Leeuwenhoek, pracuj¹cy w Delft w Holandii, po raz
pierwszy og³osi³ swoje obserwacje dotycz¹ce glonów, bakterii i pierwotniaków w Królewskim Towarzystwie w Londynie w 1676 roku. W ci¹gu ostatnich 200 lat europejscy uczeni, tacy jak Louis Pasteur, Robert Koch, Sergei
N. Winogradsky i Martinus W. Beijerinck, w³aœnie w mikrobiologii dokonali
brzemiennych w skutki odkryæ, jakimi nie mogli poszczyciæ siê naukowcy
w ¿adnej innej dziedzinie badawczej. Ta silna tradycja wspania³ych osi¹gniêæ
w europejskiej mikrobiologii trwa do dziœ, a europejscy mikrobiolodzy wci¹¿
przyczyniaj¹ siê do najbardziej znacz¹cych postêpów w medycynie, rolnictwie, biotechnologii i naukach podstawowych.
Mikrobiolodzy na ca³ym œwiecie zorganizowali sieæ towarzystw naukowych. W Europie towarzystwa mikrobiologiczne s¹ podzielone, z jednej strony ze wzglêdu na kraje, z drugiej zaœ ze wzglêdu na zagadnienia; na grupy
wirusologów, bakteriologów, algologów, mikologów, protozoologów i parazytologów oraz na specjalnoœci zwi¹zane z dziedzinami, takimi jak mikrobiologia lekarska, ¿ywnoœci, rolnicza, œrodowiskowa czy przemys³owa.
Celem niniejszej deklaracji jest zapocz¹tkowanie procesu, który utrzyma
wspólny cel prowadz¹cy do zjednoczenia europejskiej mikrobiologii. Jedynie
w ten sposób mikrobiolodzy mog¹ jak najlepiej s³u¿yæ spo³ecznoœci Europy,
sk³adaj¹cej siê z naukowców, polityków, przemys³owców i reszty spo³eczeñstwa. Ta spójnoœæ dzia³ania umo¿liwi owocne wspó³zawodnictwo na rynku
miêdzynarodowym i zapewni ukierunkowanie rozwoju œwiata zgodnie z integralnymi normami i zasadami nauki.
Federacja Europejskich Towarzystw Mikrobiologicznych wraz z 46 towarzystwami cz³onkowskimi w 35 krajach Europy wschodniej i zachodniej,
realizuj¹c zasadê, ¿e razem mo¿na zrobiæ wiêcej ni¿ osobno, pragnie staæ siê
centrum takiej wspólnoty. Chcielibyœmy aby pocz¹tek XXI wieku i nowoczesne badania mikrobiologiczne prowadzone od 500 lat, stanowi³y etap,
rozpoczynaj¹cy prawdziwa integracjê i siln¹ naukow¹ wspó³pracê mikrobiologów w Europie!
Celem niniejszej deklaracji jest zapocz¹tkowanie debaty europejskich
mikrobiologów nad ustaleniem mechanizmów harmonizacji i w przysz³oœci,
unifikacji w mikrobiologii. Nale¿y tego dokonaæ nie naruszaj¹c bogatej ró¿norodnoœci mikrobiologii europejskiej Ta ró¿norodnoœæ bowiem kreuje przysz³ych laureatów nagrody Nobla i stymuluje rozszerzanie wp³ywu mikro348
biologii na myœl technologiczn¹, naukow¹, polityczn¹, spo³eczn¹ i œrodowiskow¹ w Europie.
FEMS ¿ywi nadziejê, ¿e niniejsza deklaracja bêdzie stymulowaæ nastêpuj¹ce zagadnienia:
1. Zapewnienie, ¿e mikrobiologia s³u¿y poprawie dobrobytu ca³ej ludzkoœci
i pozwala na nieustaj¹cy rozwój ludzi, zapewniaj¹c ochronê i konserwacjê przyrody oraz pomoc w osi¹gniêciu pokoju na œwiecie.
2. Wzmocnienie ogólnej œwiadomoœci korzyœci dla œwiata i ludzi, p³yn¹cych
z istnienia drobnoustrojów i zrozumienie, ¿e niebezpieczeñstwa wynikaj¹ce
z ich istnienia s¹ niewielkie, a korzyœci w znacznym stopniu je przewa¿aj¹.
3. Zapewnienie wszystkim Europejczykom dostêpu do szczegó³owej informacji na temat mikrobiologii, w³¹cznie z dostêpem do w³aœciwego piœmiennictwa. Zapewnienie wiedzy o korzyœciach i zagro¿eniach dla ludzi
i naszego œrodowiska naturalnego.
4. Wsparcie zrozumienia i zachowanie ró¿norodnoœci biologicznej w mikrobiologii drog¹ badañ naukowych i utrzymanie sieci kolekcji kultur drobnoustrojów.
5. Potêpienie umyœlnego stosowania drobnoustrojów na szkodê ludzi (broñ
biologiczna i bioterroryzm).
6. Zapewnienie, ¿e nauczanie mikrobiologii stanie siê czêœci¹ wszystkich
europejskich systemów edukacyjnych i bêdzie w³¹czone w edukacjê naukow¹ i spo³eczn¹ na wszystkich poziomach. Zachêcanie mikrobiologów
do popularyzacji ich pracy i upowszechniania znaczenia drobnoustrojów.
7. Zachêcanie do stosowania najwy¿szych norm bezpieczeñstwa we wszystkich procesach mikrobiologicznych, produktach i procedurach oraz zapewnienie, ¿e wszystkie technologie wywodz¹ce siê z badañ mikrobiologicznych s¹ dok³adnie testowane przed zastosowaniem.
8. Zapewnienie, ¿e dane dotycz¹ce genomu drobnoustrojów s¹ dziedzictwem
ca³ej ludzkoœci.
9. Wykreowanie mikrobiologii europejskiej poprzez zwiêkszanie mobilnoœci
naukowców w Europie i zatrzymywanie w niej najlepszych mikrobiologów oraz tworzenie struktury zapewniaj¹cej intensywne badania mikrobiologiczne na uniwersytetach, w szpitalach, laboratoriach pañstwowych
i przemys³owych Europy.
10. Wsparcie rozwoju dziedzin mikrobiologii takich jak biotechnologia,
mikrobiologia ¿ywnoœci, szybka diagnostyka i ochrona œrodowiska.
Opracowane przez Federacjê Europejskich Towarzystw Mikrobiologicznych
na 1 Kongres Europejskich Mikrobiologów FEMS w 2003 roku.
Prezydent FEMS
Dr Hans G, Trüper
Vice Prezydent FEMS
Dr Eliora Z. Ron
Sekretarz Generalny FEMS
Dr Peter Raspor
349
Przy okazji sygnalizowania powy¿szych inicjatyw, wydaje siê celowym przypomnienie mo¿liwoœci i korzyœci p³yn¹cych z faktu przynale¿noœci Polskiego
Towarzystwa Mikrobiologów do FEMS oraz zachêcenie cz³onków PTM aby w sposób pe³niejszy korzystali z istniej¹cych mo¿liwoœci.
Pe³ne informacje na temat pomocy finansowej dotycz¹cej: wyjazdów do zagranicznych oœrodków badawczych, uczestnictwa w zagranicznych zjazdach i sympozjach naukowych, organizacji konferencji i kursów miêdzynarodowych a tak¿e dane
dotycz¹ce wydawanych przez FEMS czasopism (FEMS Microbiology Letters,
FEMS Microbiology Ecology, FEMS Microbiology Reviews, FEMS Yeast Research,
FEMS Immunology and Medical Microbiology) znajduj¹ siê na stronach internetowych: www.fems-microbiology.org
Nale¿y przypomnieæ, ¿e FEMS przeznacza œrodki finansowe uzyskane ze sk³adek organizacji cz³onkowskich (w tym PTM) na:
– stypendia (Fellowships) dla m³odych badaczy (35 lat, do 3.500 Euro na pobyt
do 3 miesiêcy w laboratorium zagranicznym),
– finansowanie kosztów podró¿y naukowej (Visiting Scientist Grants) w obrêbie
Europy na zaproszenie towarzystwa mikrobiologicznego nale¿¹cego do FEMS,
– finansowanie kosztów uczestnictwa w konferencji naukowej (Young Scientists
Grants) dla m³odych osób (35 lat, do 6.000 Euro),
– finansowanie kosztów organizacji miêdzynarodowych konferencji (Meeting
Support Grants – do 12.000 Euro),
– finansowanie kosztów organizacji miêdzynarodowych kursów laboratoryjnych
(Laboratory Workshop Grants – do 12.000 Euro),
– po¿yczkê na rozpoczêcie prac zwi¹zanych z organizacj¹ konferencji. (Redeemable Start-Up Fund – do 10.000 Euro),
– indywidualn¹, subskrypcjê on-line wszystkich czasopism FEMS (120 Euro za
54 zeszytów czasopism w 2003 roku),
– nagrodê FEMS im. Lwoffa dla mikrobiologa lub grupy osób wnosz¹cych wybitny wk³ad w mikrobiologiê europejsk¹. Nagroda wrêczana jest na Kongresie
FEMS – specjalny wyk³ad, medal i 1000 Euro.
Bior¹c pod uwagê powy¿sze mo¿liwoœci nale¿y szeroko rozpropagowaæ tê informacjê oraz zachêciæ, szczególnie m³odych cz³onków PTM do liczniejszego i pe³niejszego korzystania z oferty FEMS. Mo¿liwoœci jakie daje przynale¿noœæ do
FEMS powinny byæ równie¿ zachêt¹ do wstêpowania do Polskiego Towarzystwa
Mikrobiologów.
Nasze Towarzystwo w sposób skromny korzysta³o z dofinansowania FEMS
w okresie od wrzeœnia 2002 do wrzeœnia 2003. Z 19 przyznanych stypendiów „Fellowships” (19 aplikacji) otrzymano 2 dla cz³onków PTM (2 aplikacje) a ze 113 stypendiów „Young Scientists Grants” (143 aplikacje), 5 przyznano dla cz³onków PTM.
Z pozosta³ych mo¿liwoœci FEMS nie korzystano.
Zak³ad Antybiotyków i Mikrobiologii
Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego
00-725 Warszawa, Che³mska 30/34
350
Stefan Tyski
Cz³onek Zarz¹du G³ównego PTM
Delegat PTM do FEMS
Spis treœci
J. W i e l b o, A. S k o r u p s k a – Ewolucja uk³adu symbiotycznego Rhizobium – roœliny
motylkowate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. J a w o r s k i, L. S e r w e c i ñ s k a, P. S t ¹ c z e k – Organizacja, funkcja i filogeneza
bakteryjnego systemu naprawy b³êdnie sparowanych zasad w DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . .
J. S t a n i s ³ a w s k a, B. I n t e r e w i c z, W. L. O l s z e w s k i – OdpowiedŸ leukocytów
gospodarza na antygeny bakteryjne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. K a z n o w s k i, J. M o k r a c k a, R. K o c z u r a – Zadania laboratoriów mikrobiologicznych w przypadku ataku bioterrorystycznego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
263
285
301
319
Contents
J. W i e l b o, A. S k o r u p s k a – The evolution of Rhizobium-legumes symbiosis . . . . . . . . .
A. J a w o r s k i, L. S e r w e c i ñ s k a, P. S t ¹ c z e k – Organization, function and phylogeny
of the DNA mismatch repair system in bacteria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
J. S t a n i s ³ a w s k a, B. I n t e r e w i c z, W. L. O l s z e w s k i – Immune response of host
leukocytes for bacterial antigens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A. K a z n o w s k i, J. M o k r a c k a, R. K o c z u r a – Role of microbiological laboratories
in case of bioterroristic attack . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
263
285
301
319