Elektroforeza DNA

Elektroforeza kwasów
nukleinowych
•Elektroforeza
•jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych
pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła
(po odpowiednim wybarwieniu żelu jesteśmy w stanie zobaczyć ng DNA)
•jest techniką rozdzielania fragmentów DNA według ich wielkości
•pozwala na określenie wielkości cząsteczek przez porównanie drogi
migracji z fragmentami o znanej wielkości (tzw. markerów)
•jest techniką oczyszczania DNA
•techniki elektroforetyczne w swoich podstawowych wersjach są proste,
szybkie i stosunkowo tanie
Podział technik elektroforezy DNA
•Agarozowa (horyzontalna)
-w stałym polu elektrycznym
-w zmiennym polu (PFGE)
•Akrylamidowa (wertykalna)
-denaturująca
-niedenaturująca
•elektroforezę w żelu agarozowym stosuje się do rozdzielania
„większych” cząsteczek DNA.
•elektroforezę w żelu poliakrylamidowym stosuje się do rozdzielania
„małych” fragmentów DNA.
•Elektroforeza DNA w żelu agarozowym w stałym polu elektrycznym jest
rutynową techniką wizualizacji DNA i RNA
Funkcjonuje na zasadzie sita molekularnego, gdzie negatywnie
naładowane cząsteczki poruszają się w polu elektrycznym w kierunku
anody; krótsze wędrują szybciej, dłuższe – wolniej
Fragmenty DNA
Cząsteczki żelu
Pory
Elektroforeza agarozowa
Agaroza jest naturalnym polimerem izolowanym z krasnorostów
Zalety elektroforezy agarozowej
•duży zakres rozdzielanych fragmentów DNA od kilkuset pz do 40 kpz
(w elektroforezie w stałym polu) i Mpz (w zmiennym polu
elektrycznym)
•łatwość przygotowania żelu i elektroforezy
•jest nietoksyczna
Wady
•mała zdolność rozdzielcza żeli agarozowych
• agaroza jest stosunkowo droga
Przebieg elektroforezy
Przygotowanie
próbek
Roztwór DNA
miesza się z
buforem
próbkowym, który
zagęszcza DNA (nie
wypływa ze
studzienek)
pozwala
obserwować
migrację DNA
Barwienie żeli agarozowych
Bromek etydyny (EB) jest używany najczęściej, lecz jest silnie mutagenny. Należy
unikać barwienia żeli przed elektroforezą (tzn. barwnik dodany do agarozy lub do
buforu). Daje dość silne tło i żele powinno się odbarwiać przed archiwizacją.
SYBR Green, SYBR Gold bardzo czuły, nieszkodliwy, degraduje w lekko
alkalicznych warunkach, WADA!!! - drogi.
Porównanie czułości
barwników Gel Red i EB
Czynniki wpływające na stopień migracji DNA w żelu agarozowym
Wielkość cząsteczki - dsDNA liniowe migruje w żelu z szybkością
odwrotnie proporcjonalną do ilości par zasad (odwrotnie
proporcjonalna do log10 z masy cząsteczkowej)
Konformacja DNA - superzwinięta kolista forma (CCC), otwarto
kolista (OC) i liniowa (LIN) forma migrują w żelu z różną szybkością.
Względna ruchliwość tych form zależy od stęż. agarozy, natężenia
prądu, siły jonowej buforu i gęstości superskrętów formy CCC.
Najlepiej dla odróżnienia form stosować odpowiednie markery
(zwykle plazmidy i fragmenty DNA).
Forma OC
Forma LIN
Forma CCC
 Stężenie agarozy – jest liniowa zależność
między logarytmem mobilności
elektroforetycznej DNA () i stężeniem żelu ()
wg. równania:
log  = log o – Kr 
gdzie o jest swobodną ruchliwością DNA i
Kr jest współczynnikiem opóźnienia, czyli stałą
związaną z własnościami żelu oraz wielkością i
kształtem cząsteczek.
Elektroforeza DNA w żelach o różnym stęż.
agarozy
Range of
Agarose
gel,
%
Range of
separation,
bp
Polyacrylamid
e gel,
%
separation,
bp
0.5
1,000-30,000
3.5
100-1,000
0.7
800-12,000
5.0
80-500
1.0
500-10,000
8.0
60-400
1.2
400-7,000
12.0
40-200
1.4
200-4,000
20.0
5-100
2.0
50-2,000
Obecność bromku etydyny w żelu i buforze.
Interkalacja bromku etydyny powoduje spadek ładunku negatywnego w dsDNA
i wzrost sztywności i długości DNA. Stopień migracji jest opóźniony o około
15%.
Napięcie prądu – w niskim napięciu, stopień migracji liniowych fragmentów
DNA jest proporcjonalny do zaaplikowanego napięcia. W wyższym napięciu
mobilność wysoko-cząsteczkowych fragmentów nie jest proporcjonalna do
napięcia.
Skład buforu do elektroforezy – w roztworach o niskiej sile jonowej DNA
migruje wolno, w buforach o zbyt wysokiej sile jonowej przepływ ładunku
powoduje wydzielanie się ciepła co może prowadzić do rozpuszczenia żelu i
denaturacji DNA
Markery wielkości
Konwencjonalne oparte na DNA plazmidów i fagów
Tzw. drabinki (ladders)
Izolacja DNA z żeli agarozowych
• DNA rozdzielone w żelu agarozowym, można „odzyskać” –
elektroforeza jest techniką oczyszczania DNA
• Komercyjne zestawy do izolacji DNA z żelu oferowane przez firmy
wykorzystują np. bardzo drobne perełki szklane. DNA jest adsorbowane
na perełkach z rozpuszczonej agarozy w wysokim stęż. soli, a eluowane
w niskim stęż. soli.
Elektroforeza pulsacyjna - PFGE (Pulsed- Field Gel Electrophoresis)
Fragmenty dsDNA powyżej krytycznej wielkości ~40 kb migrują w żelu agarozowym ze stałą szybkością, niezależną od wielkości. Z tego powodu nie można
ich rozdzielić w stałym prądzie na horyzontalnych żelach.
PFGE jest elektroforezą, w której pole elektryczne jest okresowo zmieniane, co
pozwala na rozdział cząsteczek DNA do wlk. rzędu Mpz. Rozdział następuje
ponieważ czas wymagany do zmiany kierunku migracji dla cząsteczki DNA
zależy od jej wielkości w zmiennym polu elektrycznym. Krótsze cząsteczki
mogą szybciej reorientować się (tzn. zmieniać konformację i powracać do
stanu pierwotnego) niż dłuższe i dlatego wędrują w żelu z większą
szybkością. Dłuższe cząsteczki większość czasu potrzebują na reorientację w
zmieniającym się napięciu pola, niż na migrację. Różnica w czasie reorientacji
jest tym czynnikiem, który decyduje o rozdzielaniu się fragmentów DNA o
wlk. powyżej 40 kb.
CHEF – Cantour-Clamped Homogenous Electric Field Electrophoresis –
Elektroforeza w zmiennym, homogennym polu elektrycznym o kształcie
sześciokąta foremnego
Elektrody ułożone są w kształcie sześciokąta foremnego daje to jednorodne pole
elektryczne o kącie reorientacji 120o. DNA migruje w prostych torach rozdziału.
CHEF –Elektroforeza w zmiennym, homogennym polu elektrycznym o kształcie
sześciokąta foremnego
Przygotowanie próbek
PFGE wymaga nieuszkodzonego DNA ponieważ każde uszkodzenie spowoduje
zmianę wyglądu prążków.
Najpierw umieszcza się bakterie lub inne komórki w agarozie, a następnie trawi
się je enzymami litycznymi, co nie narusza DNA. DNA następnie można trawić
enzymami restrykcyjnymi. Tak przygotowany preparat jest przycinany do
odpowiedniej wielkości, wkładany do wejścia w żelu agarozowym i zaklejany
agarozą.
Enzymy restrykcyjne w PFGE
Wybiera się enzymy, które:
- tną DNA rzadko np. rozpoznają 8-nukleotydowe sekwencje,
-w rozpoznawanej sekwencji mają dużo par GC ( jest rzadko spotykany u
Eukaryota
-w rozpoznawanej sekwencji mają dużo par AT (mogą być rzadsze u Prokaryota
Zastosowanie PFGE
- rozdzielanie cząsteczek DNA w zakresie 50 kpz – 10 Mpz
Izolowane fragmenty mogą być użyte do klonowania;
- konstruowanie map restrykcyjnych całych genomów bakterii
oraz dużych
regionów genomów eukariotycznych;
- identyfikacja genomów w tzw. epidemiologii molekularnej
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Polimer akrylamidu może służyć do rozdziału dsDNA i ssDNA
według wielkości i konformacji. Żele poliakrylamidowe
mają trzy główne cechy korzystniejsze niż żele agarozowe:
- ich zdolność rozdzielcza jest tak duża, że mogą rozdzielać
cząsteczki różniące się długością równą 0.1% (tzn. 1 bp w
1000 bp);
- można rozdzielać większe ilości DNA – można rozdzielać
do 10 µg DNA w jednej ścieżce (1 cm x 1 mm) bez utraty
zdolności rozdzielczej;
- DNA odzyskane z żelu akrylamidowego jest bardzo czyste
(metodami podobnymi do odzyskiwania z agarozy ) i można
go używać np. do iniekcji zarodków mysich).
Zdolność rozdzielcza zależy od wielkości porów jakie tworzy polimer, a
to zależy od stężenia akrylamidu i N,N’-metylenbisakrylamidu oraz od
szeregu innych czynników jak natężenie prądu czy grubość żelu.
Zakres stężenia akrylamidu to 3.5% - 20%, w którym dzieli się
fragmenty 6-2000 pz.
Stosunek bisakrylamidu do akrylamidu wynosi zwykle 1:30
Żele akrylamidowe nie mogą być barwione przed elektroforezą,
ponieważ bromek etydyny hamuje polimeryzację akrylamidu, ale barwią
się po elektroforezie, lecz z mniejszą efektywnością niż agaroza.
Do barwienia DNA w tych żelach można używać także innych
barwników jak SYBR.
Rodzaje żeli akrylamidowych w elektroforezie DNA:
Żele denaturujące służą do rozdzielania i oczyszczania ssDNA lub RNA.
Te żele są polimeryzowane w obecności mocznika, formamidu lub
formaldehydem co hamuje tworzenie par w DNA. Zdenaturowany
DNA migruje w tych żelach z szybkością niezależną od
składu zasad i ich sekwencji. Stosuje się m.in. do rozdziału
RNA, izolacji radioaktywnych sond i do rozdziału produktów reakcji
sekwencyjnych.
Żele niedenaturujące są używane do
rozdziału i oczyszczania
dsDNA.
Zasadniczo dsDNA migruje w żelach z szybkością odwrotnie
proporcjonalną do log10 z ich wielkości. Jednakże szybkość migracji
zależy też od składu zasad i fragmenty tej samej wielkości mogą
migrować z szybkością różniącą się nawet o 10%.
Zwykle służą do preparowania bardzo czystego DNA i
do wykrywania interakcji DNA-białko (EMSA - Gel Shift
Assay).