Zastosowanie kliniczne cytometrii przepływowej

Zastosowanie kliniczne
cytometrii przepływowej
Katarzyna Bocian
[email protected]
peripheral blood smear
http://www.darkrwi.info.pl/portal/pokaz/21/co-to-jest-krew-i-do-czego-sluzy.html
Identification of immune system cells
LEUKOCYTES CD 45+
GRANULOCYTES
CD 15+
neutrophils
eosinophils
AGRANULOCYTES
MONOCYTES
MAKROFAGES
CD14+
LYMPHOCYTES
T CELL
basophils
CD3+
B CELL
CD19+ CD20+
Th CD4+
Tc CD8+
Treg
mature,
CD4+CD25+
naive
IgM i IgD
Mature,
activated
IgG
Identification of immune system cells
CD (Cluster Determinants) cellular antigens
•Granulocytes CD15+
•Monocytes CD14+
•T cells CD3+
CD45+
T helper CD3+ CD4+
T cytotoxic CD3+ CD8+
•B cells CD19+ lub CD20+
•Trombocyte CD61+
•NK CD16+ CD56+ CD3•Dendritic Cells CD11c+…
norm adults between the ages of 18 and 65 years
Izolacja MNC w gradiencie - Gradisol L
nawarstwianie
krwi na gradisol L
wirowanie
20min 400g
monocyty
limfocyty
Gradisol L
płyn separacyjny
(gęstość 1,077 g/ml)
Krew obwodowa
pobrana na antykoagulant
nawarstwiona na
gradisol L
mononuklearne (MNC) komórki
Analiza populacji limfocytów
krwi obwodowej
•
From this experiment you can see the percentages of T helper, T cytotoxic/suppresor, B cells, and NK cells in a lymphocyte population. Using
flow cytometry an investigator can study any cell type with a certain protein located on its surface. Apoptosis, clinical, and stem cells are just a
few of the many types of studies that can be done using surface proteins with flow cytometry.
Zastosowanie kliniczne cytometrii przepływowej
Ocena fenotypowa
krwi obwodowej
szpiku
węzłów chłonnych
płynu mózgowo-rdzeniowego
Popłuczyn pęcherzykowooskrzelikowych
Zastosowanie kliniczne cytometrii przepływowej
Monitorowanie
przebiegu choroby i leczenia
choroby rozrostowe układu krwiotwórczego, białaczki i chłoniaki
choroby nowotworowe
wrodzone i nabyte niedobory immunologiczne
choroby autoimmunizacyjne,
choroby płuc,
przeszczepy narządów
Zastosowanie kliniczne cytometrii przepływowej
HIV
Zdrowy pacjent
ocena bezwzględnej liczby komórek populacji CD4/CD8 u osób zakażonych
AIDS pacjent
subpopulacje
NK
Immunoregulacyjna (10%)
 CD56++ CD16+
Cytotoksyczna (90%)
 CD56+/- CD16++
węzły limfatyczne i migdałki
krew obwodowa, tkanki
38
Jak „widzimy” populacje komórek NK
CD56-PerCP
NK CD56++CD16+
immunoregulacja
NK CD56+/-CD16++
cytotoksyczność
CD3-FITC
perforyny
39
W późnej fazie lutealnej i
I trymestrze ciąży,
sygnałów hamujący
sygnałów aktywujący
od matczynych HLA-G,A,E
receptory KIR, cytokiny
infekcje zwiększonej
cytotoksyczności.
75% NK
o fenotypie CD56+/CD16niezbędne w procesie implantacji zarodka i
tworzenia łożyska
Tolerancja trofoblastu
Diagnostyka
Ocena aktywności komórek NK we krwi obwodowej.
Ponad 12% kobiet z PN ma podwyższoną aktywność komórek NK.
(działają agresywnie, uszkadzając komórki łożyskowe. Sa źródłem cytokin typu Th1 (IFNγ, TNFα).
Ocena aktywności komórek NK pozwala ocenic skuteczności zastosowanej immunoterapii przed decyzją o kolejnej ciąży.
O skuteczności immunoterapii będzie świadczyć obniżenie aktywności komórek NK.
AKTYWNOŚĆ
cytotoksyczna komórek
NK
Inkubujemy komórki krwi obwodowej pacjentki z komórkami linii nowotworowej K562
oceniamy
5 ml pełnej krwi
%
komórek K562 w apoptozie używając IP
MNC w tym NK
pacjentki
K562
(human erythroleukemia)
%
APOPTOZA
komórek
K 562
Przykładowa analiza określająca cytotoksyczność komórek NK
K 562
K 562
CD45
NK : K562
PI
K 562
2.5 : 1
% komórek K562 z R1
IP pozytywnych
APOPTOTYCZNYCH
NK
CD45
PI
CD45
PI
1:1
MNC pacjentki
Inkubujemy
komórki krwi obwodowej (MNC) pacjentki
komórki linii nowotworowej K562
K562 z DiO
+
oceniamy %
komórek apoptotycznych
używając IP :
w Q2 MNC i K562 spontaniczna apoptoza
MNC
PI
apoptotyczne K562 po działaniu NK
MNC + K562
K562
PI
PI
DiO
DiO
AKTYWNOŚĆ cytotoksyczna komórek
NK
K562
MNC + K562
PI
PI
DiO
DiO
Według wzoru :
Q2 + Q4 cells
Q4
_
Q2 + Q4 cells
Q4
x 100
NORMY: 5 – 17 %
Przeprowadź ocenę cytotoksyczności komórek NK pacjentki z nawracającymi poronieniami
Krew pełna
Krew po Gradisolu