ćwiczenia z biologii molekularnej

Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ
WYDZIAŁ BIOLOGII I BIOTECHNOLOGII
ZAKŁAD BIOLOGII MOLEKULARNEJ
ĆWICZENIA Z BIOLOGII MOLEKULARNEJ
(załącznik do ćwiczeń)
dla studentów II roku biologii oraz
III roku mikrobiologii i biotechnologii
LUBLIN 2015
Wersja 1.3
1
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAŁ DNA W ŻELU AGAROZOWYM
Agaroza to polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy, otrzymywany
przez oczyszczanie z agaru jadalnego. Agaroza jest łatwo rozpuszczalna w wodzie,
w temperaturze pokojowej odwracalnie tworzy żel. Temperatura przejścia żelu w zol
(potocznie topnienie agarozy) jest wyższa od temperatury zestalania.
Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą
rozdzielić, zidentyfikować lub oczyścić fragmenty DNA. Do zalet tej metody należy zaliczyć
jej prostotę a także możliwość bezpośredniej lokalizacji fragmentów DNA w żelu przy
pomocy barwnika interkalującego – bromku etydyny
Czynniki wpływające na tempo migracji DNA w żelu agarozowym.
Masa cząsteczkowa DNA:
Większe cząsteczki DNA migrują wolniej niż cząsteczki małe ze względu na większe
opory ruchu oraz większe trudności w penetrowaniu porów żelu będącego rodzajem sita
molekularnego. Tempo migracji jest odwrotnie proporcjonalne do logarytmu dziesiętnego
ilości par zasad.
Stężenie agarozy:
Zwiększając stężenie agarozy zwalnia się tempo migracji DNA w żelu. Na podstawie
prac doświadczalnych ustalono optymalne stężenie agarozy do rozdziałów fragmentów DNA
o określonej wielkości. Dane te przedstawiono w tabeli:
Optymalne stężenie agarowy
Wielkość cząsteczki DNA (kb)
Stężenie agarozy (%w/v)
5 - 60
0,3
1 - 20
0,6
0,8 - 10
0,7
0,5 - 7
0,9
0,4 - 6
1,2
0,2 - 3
1,5
0,1 - 2
2,0
2
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
Stosowane napięcie prądu podczas elektroforezy:
Przy niskich napięciach tempo migracji liniowych cząsteczek kwasów nukleinowych
jest wprost proporcjonalne do napięcia. Zależność ta przestaje obowiązywać dla dużych
cząsteczek DNA rozdzielanych przy zastosowaniu wysokich napięć, dlatego też w czasie
rozdziału cząsteczek większych niż 2000 pz (2 kb) nie należy stosować napięcia większego
niż 5 V/cm.
Temperatura rozdziału:
Temperatura w jakiej dokonuje się rozdziału w zakresie od 4°C do temperatury
pokojowej nie wpływa w istotnym stopniu na elektroforetyczne właściwości DNA. Ma
jednakże wpływ na bierną dyfuzję kwasów nukleinowych w żelu, co może mieć wpływ
(szczególnie w przypadku wyższych temperatur a także mniejszych fragmentów DNA) na
ostrość prążków. Obniżenie temperatury podczas rozdziału powoduje wyostrzenie
poszczególnych prążków. W celu przeprowadzenia elektroforezy w obniżonej temperaturze
należy zastosować aparat z wymiennikiem ciepła.
Bromek etydyny:
Obecność bromku etydyny w buforze do elektroforezy (i żelu) lub w barwniku do
próbek zwalnia tempo przemieszczania się cząsteczek o ok. 15%.
Skład i siła jonowa buforu:
W buforze o niskiej sile jonowej DNA przemieszcza się bardzo wolno. W wypadku
stosowania buforu o dużej sile jonowej wydzielana jest duża ilość ciepła, które może
spowodować roztopienie agarozy i denaturację DNA. Najpowszechniej stosowany jest bufor
TAE.
Elektroforezę natywnego RNA przeprowadza się według tych samych zasad co
elektroforezę DNA. Jednakże większość cząsteczek RNA tworzy złożone struktury
drugorzędowe co powoduje, że szybkość migracji takich cząsteczek RNA nie jest
proporcjonalna do ich wielkości. Ponadto, cząsteczki takie mogą tworzyć kilka form
widocznych na żelu w postaci oddzielnych prążków. Toteż, próbki RNA przed elektroforezą
często poddaje się denaturacji i elektroforezę przeprowadza się w warunkach denaturujących.
3
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
Materiały i odczynniki
1. Bufor próbkowy do elektroforezy RNA 2x stężony:
95% formamid
0,025 % SDS
0,025% błękit bromofenolowy
0,025% bromek etydyny
0,5 mM EDTA, w wodzie
2. Bufor próbkowy do elektroforezy DNA:
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
30 % glicerol
0,04% błękit bromofenolowy
3. Bufor TAE 50 x stężony:
242 g Tris
57,1 ml kw. octowy lodowaty
100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
dopełnić H2O do 1000 ml
4. Agaroza
5. Bromek etydyny 10 mg/ml
6. Markery do elektroforezy kwasów nukleinowych
7. Zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych
Wykonanie ćwiczenia
Uwaga! Pracę z bromkiem etydyny wykonywać w rękawicach ochronnych.
Zgodnie z zaleceniami prowadzącego ćwiczenia, przygotować 100 ml 0,7% lub 1%
roztworu agarozy w buforze TAE. W tym celu odpowiednio 0,7 g lub 1 g agarozy rozpuścić
w 100 ml buforu TAE ( 2 ml 50x stężonego buforu TAE + 98 ml H2O). Agarozę gotować
przez ok. 2 minuty w celu dobrego rozpuszczenia. Następnie roztwór agarozy schłodzić do
temp. 60-700C i dodać 5 μl roztworu bromku etydyny. Dokładnie wymieszać, wylać na płytkę
i pozostawić do zastygnięcia.
Badane próbki DNA lub RNA zawiesić w buforze próbkowym do elektroforezy,
odpowiednio, DNA lub RNA. Płytkę z zastygniętym żelem agarozowym umieścić w aparacie
do elektroforezy. Aparat napełnić buforem elektrodowym (1x stężony TAE). Na żel nanosić
po 5-30 l próbek kwasów nukleinowych. Rozdział prowadzić przy napięciu 100V dopóki
4
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
czoło barwnika nie dotrze do 3/4 długości żelu. Po zakończonej elektroforezie obserwować
rozdzielone kwasy nukleinowe pod lampą UV.
ELEKTROFORETYCZNY ROZDZIAŁ BIAŁEK W ŻELU
POLIAKRYLAMIDOWYM
Żel poliakrylamidowy posiada następujące cechy: jest bezbarwny, pozbawiony
ładunków, odznacza się dużą wytrzymałością mechaniczną, łatwy w przygotowaniu
i formowaniu w odpowiednich naczyniach. Żel poliakrylamidowy to łańcuchy akrylamidu
(H2C=CH-CO-NH2) połączone wiązaniami poprzecznymi za pomocą N,N’-metyleno-bisakrylamidu (H2C=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2). W ten sposób tworzy się sieć, przez
„oczka
„
której migrują rozdzielane cząsteczki. Wielkość „oczek” sieci żelu zależy od
stężenia akrylamidu oraz bisakrylamidu. Polimeryzacja żelu odbywa się w obecności
nadsiarczanu amonu (APS) oraz N,N,N’,N’-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) umożliwia rozdział cząsteczek
białkowych różniących się wielkością i ładunkiem elektrycznym. Rozdział ten można
prowadzić w warunkach niedenaturujących oraz w warunkach denaturujących. Elektroforeza
białek w warunkach denaturujących określana skrótem SDS-PAGE odbywa się w obecności
soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), który jest detergentem jonowym. SDS łącząc się
z grupami hydrofobowymi aminokwasów nadaje białkom ładunek ujemny. Sprawia to, że
migrują one w kierunku dodatniej anody. Ilość związanego SDS jest proporcjonalna do
wielkości cząsteczek białkowych. Dzięki temu rozdzielają się one w żelu pod względem masy
cząsteczkowej. Polipeptydy o niższej masie cząsteczkowej migrują szybciej, zaś większe
wolniej. Metoda SDS-PAGE stosowana jest między innymi do: identyfikacji i monitorowania
składu mieszaniny białek, sprawdzania jednorodności (homogenności) białek, oznaczania
masy cząsteczkowej białek, analizy struktury podjednostkowej aktywnych biologicznie
kompleksów białkowych.
5
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
Elektroforeza w warunkach niedenaturujących (PAGE)
Materiały i odczynniki
1. 30% roztwór akrylamidu + 0,8% roztwór bisakrylamidu
2. 1,5M roztwór Tris-HCl pH 8,8
3. 0,5M roztwór Tris-HCl pH 6,8
4. 10% roztwór APS (nadsiarczanu amonu)
5. TEMED
6. 1% roztwór błękitu bromofenolowego
7. 30% roztwór sacharozy
8. Bufor elektrodowy:
Glicyna
14,4 g
Tris
3,0 g
uzupełnić wodą do1000 ml
9. Wzorce białkowe
10. Zestaw do elektroforezy białek
Przygotowanie żelu i próbek białkowych
Umyte i odtłuszczone specjalne płytki szklane do elektroforezy, złożyć zgodnie ze
wskazówkami prowadzącego ćwiczenia. Przygotować 2 rodzaje żeli poliakrylamidowych
według przepisu:
Uwaga! Pracę z akrylamidem wykonywać w rękawicach ochronnych.
Roztwory dodawać wg przedstawionej kolejności.
TEMED – inicjator polimeryzacji, dodawać jako ostatni składnik,
bezpośrednio przed wylaniem mieszaniny między płytki !
6
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
Żel separujący
ODCZYNNIK
Żel 10%
Żel 10%
(8 ml)
(8 ml) z
Żel 12% Żel 13,8%
Żel 15%
(8 ml)
(8 ml)
(8 ml)
edestyną
H2O
3,1 ml
2,3 ml
2,6 ml
2,2 ml
1,8 ml
30% akrylamid + 1% bisakrylamid
2,7 ml
2,7 ml
3,2 ml
3,6 ml
4,0 ml
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
2,0 ml
2,0 ml
2,0 ml
2,0 ml
2,0 ml
10% APS
80 μl
80 μl
80 μl
80 μl
80 μl
1% edestyna
-
0,8 ml
-
-
-
TEMED
8 μl
8 μl
8 μl
8 μl
8 μl
Żel zagęszczający
ODCZYNNIK
na 2,5 ml żelu
na 5,0 ml żelu
H2O
1,3 ml
2,6 ml
30% akrylamid + 1% bisakrylamid
0,5 ml
1,0 ml
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
0,625 ml
1,25 ml
10% APS
25 μl
50 μl
TEMED
2,5 μl
5 μl
Polimeryzację żelu wykonać między przygotowanymi płytkami szklanymi, zgodnie ze
wskazówkami prowadzącego ćwiczenia.
Próbki do analizy przygotować w następujący sposób: do każdej probówki
zawierającej analizowane białka lub wzorce białkowe (1–30 g białka w objętości 30l)
dodać po 10l 30% sacharozy i 1l 1% błękitu bromofenolowego. Dokładnie wymieszać
i bez ogrzewania używać do doświadczeń..
Płytki ze spolimeryzowanym żelem poliakrylamidowym umieścić w aparacie do
elektroforezy. Aparat napełnić buforem elektrodowym. Przygotowane próbki ostrożnie
nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym. Podłączyć elektrody do zasilacza. Rozdział
elektroforetyczny prowadzić pod napięciem 120 V tak długo, aż barwnik przesunie się do
7
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
końca żelu separującego. Wyłączyć zasilacz, wyjąć płytki z żelem, a następnie przeprowadzić
kolejno barwienie i odbarwianie żelu.
Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS-PAGE)
Materiały i odczynniki
1. 30% roztwór akrylamidu + 0,8% roztwór bisakrylamidu
2. 1,5M roztwór Tris - HCl pH 8,8
3. 0,5M roztwór Tris - HCl pH 6,8
4. 10% roztwór SDS
5. 10% roztwór APS
6. TEMED
7. Bufor próbkowy (4x stężony) :
1,25M roztwór Tris-HCl pH 6,8
0,5ml
Glicerol
1,0ml
10% roztwór SDS
2,0ml
DTT
154mg
H2O
1,3ml
1% roztwór błękitu bromofenolowego 200l
8. Bufor elektrodowy:
Glicyna
14,4g
Tris
3,0g
SDS
1,0g
uzupełnić wodą do 1000ml
9. Wzorce białkowe
10. Zestaw do elektroforezy białek
Przygotowanie żelu i próbek białkowych
Umyte i odtłuszczone specjalne płytki szklane do elektroforezy złożyć zgodnie ze
wskazówkami prowadzącego ćwiczenia. Przygotować żel poliakrylamidowy według
przepisu:
8
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
Uwaga! Pracę z akrylamidem wykonywać w rękawicach ochronnych.
Roztwory dodawać wg przedstawionej kolejności.
TEMED – inicjator polimeryzacji, dodawać jako ostatni składnik,
bezpośrednio przed wylaniem mieszaniny między płytki !
Żel separujący
Żel 10%
Żel 12%
Żel 13,8%
Żel 15%
(8 ml)
(8 ml)
(8 ml)
(8 ml)
H2O
3,1 ml
2,6 ml
2,2 ml
1,8 ml
30% akrylamid + 1%bisakrylamid
2,7 ml
3,2 ml
3,6 ml
4,0 ml
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
2,0 ml
2,0 ml
2,0 ml
2,0 ml
10% SDS
80 μl
80 μl
80 μl
80 μl
10% APS
80 μl
80 μl
80 μl
80 μl
TEMED
8 μl
8 μl
8 μl
8 μl
ODCZYNNIK
Żel zagęszczający
ODCZYNNIK
na 2,5 ml żelu
na 5,0 ml żelu
H2O
1,3 ml
2,6 ml
30% akrylamid + 1%bisakrylamid
0,5 ml
1,0 ml
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
0,625 ml
1,25 ml
10% SDS
25 μl
50 μl
10% APS
25 μl
50 μl
TEMED
2,5 μl
5 μl
Polimeryzację żelu wykonać między przygotowanymi płytkami szklanymi, zgodnie ze
wskazówkami prowadzącego ćwiczenia .
Próbki do analizy przygotować w następujący sposób: do każdej probówki
zawierającej analizowane białka lub wzorce białkowe (1-30 g białka w objętości 30 l)
dodać po 10 l buforu próbkowego (4x stężonego) i wymieszać. Następnie, próbki ogrzewać
9
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
przez 3 min. w temp. 900C. Bufor próbkowy zawierający SDS i DTT niszczy strukturę
natywną białek w podwyższonej temperaturze.
Płytki ze spolimeryzowanym żelem poliakrylamidowym umieścić w aparacie do
elektroforezy. Aparat napełnić buforem elektrodowym. Przygotowane próbki białkowe
ostrożnie nanieść do studzienek w żelu zagęszczającym. Rozdział prowadzić pod napięciem
150V tak długo, aż barwnik przesunie się do końca żelu separującego. Wyłączyć zasilacz,
wyjąć płytki z żelem do wybarwienia .
Barwienie białek po elektroforezie
Celem uwidocznienia oraz identyfikacji rozdzielonych prążków białkowych, żel
poliakrylamidowy po elektroforezie poddaje się barwieniu. Najczęściej stosuje się tu roztwór
barwnika Coomassie lub barwienie metodą srebrową .
A. Barwienie błękitem Coomassie
Odczynniki
Mieszanina barwiąca:
Metanol
400 ml
Kwas octowy
100 ml
H2O
500 ml
Błękit Coomassie
2,5 g
Odbarwiacz:
Metanol
400 ml
Kwas octowy
100 ml
H2O
500 ml
Wykonanie ćwiczenia
Wyjęty żel poliakrylamidowy umieścić w roztworze barwnika na okres około
15-30 min. Po tym czasie, zlać barwnik, żel przepłukać wodą a następnie odbarwiać go
roztworem odbarwiającym tak długo, aż widoczne staną się rozdzielone prążki białka. Po
10
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
wybarwieniu żel wysuszyć. Barwienie błękitem Coomassie pozwala na wykrycie prążków
białkowych zawierających około 0,1 g białka.
B. Barwienie srebrem
Jest to metoda 10-100 razy czulsza od metody barwienia białek błękitem Coomassie.
W metodzie srebrowej większość białek ulega zabarwieniu na kolor czarny lub brązowy.
Lipoproteiny wybarwiają się na niebiesko, a glikoproteiny na brązowo lub czerwono.
METODA I
Odczynniki
Nr 1. 10%
roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA)
Nr 2. 2%
roztwór błękitu Coomassie G - 250
Nr 3. Roztwór do barwienia koloidalnego:
(NH4)2SO4
70 g
85% H3PO4
23,6 ml
Metanol
200 ml
uzupełnić wodą do
950 ml
Nr 4. 0,2 mM roztwór DTT:
10 l 2M DTT w 100 ml H2O
Nr 5. 0,1% roztwór AgNO3:
50 mg AgNO3 w 50 ml H2O
Nr 6. 3% roztwór Na2CO3 + 0,018% HCHO: 7,5 g Na2CO3
125 l 37% HCHO w 250 ml H2O
Nr 7. 20% kwas cytrynowy: 5 g kw. cytrynowego w 25 ml H2O
Uwaga! Odczynniki nr 4, 5, 6 przygotować bezpośrednio przed użyciem.
Barwienie wykonywać w kuwecie przeznaczonej wyłącznie do tego celu.
Wykonanie ćwiczenia
1. Żel poliakrylamidowy po elektroforezie utrwalać przez 1 godz. w 50ml 10% TCA .
2. Płukać 3 x 5 min w 100 ml wody destylowanej.
3.Barwić żel przez 1godz. w 50 ml roztworu do barwienia koloidalnego, zawierającego
2,5 ml 2% błękitu Coomassie.
4. Płukać 3 x 5 min. w 100 ml wody destylowanej.
11
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
5. Płukać 10 min. w 50 ml wody destylowanej, w gorącej łaźni wodnej stale mieszając.
6. Dodać 50 ml 0,2M DTT i mieszać przez następne10 min. w gorącej łaźni wodnej.
7. Przepłukać żel w 100 ml wody destylowanej.
8. Barwić w 50 ml 0,1% AgNO3 w gorącej łaźni wodnej przez 10 min. stale mieszając.
9. Przepłukać żel 100 ml wody destylowanej.
10. Dodać 50ml roztworu wywoływacza barwy (odczynnik nr 6) na około 30 sek., następnie
zlać go i powtórnie dodać 50 ml świeżego wywoływacza. Całość dokładnie mieszać. Z chwilą
pojawienia się pierwszych prążków białkowych dodać pozostałą porcję wywoływacza i
całość mieszać do momentu pojawienia się wyraźnych prążków białkowych.
11. Zatrzymać barwienie przez dodanie 25 ml 20% kw. cytrynowego (odczynnik nr 7).
METODA II
Odczynniki
1. Roztwór A (50% metanol, 10% kw. octowy)
2. 30% etanol
3. Roztwór B (20 mg tiosiarczanu sodu na 100 ml H2O)
4. Roztwór C ( 5 ml 25% glutaraldehydu + 95 ml H2O)
5. Roztwór D (200 mg AgNO3 + 75 l 37% formaldehydu + 100 ml H2O)
6. Roztwór E (6g Na2CO3 + 50 l 37% formaldehydu + 200 l tiosiarczanu z wyjść.
roztworu 20 mg na 10 ml H2O – dopełnić wodą do 100 ml)
Uwaga! Roztwory B, C, D i E przygotować bezpośrednio przed użyciem.
Barwienie wykonywać w kuwecie przeznaczonej wyłącznie do tego celu.
Wykonanie ćwiczenia
1. Żel poliakrylamidowy po elektroforezie utrwalać przez 3 x 1 godz. lub przez noc
w 100 ml roztworu A.
2. Dodać 100 ml 30% etanolu i mieszać przez 1 godz.
3. Dodać 100 ml roztworu B i mieszać przez 1 min.
4. Dodać 100 ml roztworu C i mieszać przez 30 min.
5. Płukać 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.
6. Barwić w 100 ml roztworu D, stale mieszając przez 20 min.
7. Płukać 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.
12
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
8. Dodać 100 ml roztworu E (wywoływacza barwy) i mieszać do momentu pojawienia
się wyraźnych prążków białkowych.
9. Płukać 3 x 20 sek. w 100 ml wody destylowanej.
10. Zatrzymać barwienie przez dodanie 100 ml roztworu A na 10 min.
11. Przepłukać żel wodą i wysuszyć.
ILOŚCIOWE OZNACZANIE BIAŁKA
METODY SPEKTROFOTOMETRYCZNE
Białka charakteryzują się zdolnością absorpcji promieniowania ultrafioletowego,
której maksimum przypada na fale o długości 280nm oraz 235nm. Wiąże się to z obecnością
aminokwasów aromatycznych (tyrozyna, tryptofan) oraz wiązań peptydowych w łańcuchu
polipeptydowym. Na wartość absorpcji mogą wpływać zanieczyszczenia kwasami
nukleinowymi, dla których maksimum absorpcji promieni UV przypada na fale o długości
260nm.
Metoda Beavena i Holidaya
Zasada metody polega na spektrofotometrycznym pomiarze absorpcji promieni UV o
długości 280 nm oraz 260 nm, przez jednocentymetrową warstwę badanego roztworu białka.
Uzyskane wartości podstawia się do wzoru i oblicza stężenie białka w mg/ml:
Cbiałka(mg/ml) = 1,55 A280 - 0,76 A260
Metoda ta obarczona jest pewnym błędem, wynikającym z różnej zawartości
aminokwasów
aromatycznych
w
różnych
białkach
oraz
zanieczyszczeń
kwasami
nukleinowymi.
Metoda Whitakera i Granuma
Jest to metoda spektrofotometrycznego oznaczenia stężenia białka, w której wykonuje
się pomiar absorpcji promieni UV o długości fali 280 nm oraz 235 nm. Otrzymane wartości
absorpcji podstawia się do wzoru i oblicza stężenie białka w mg/ml.
C białka(mg/ml)  A235-A280
2,51
13
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
W oznaczeniach stężenia białka tą metodą nie przeszkadza obecność kwasów
nukleinowych, dla których wartość absorpcji fal świetlnych o długości 235 nm i 280 nm jest
taka sama.
Odczynniki
Roztwory badanych białek.
Wykonanie ćwiczenia
Przeprowadzić spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany
roztwór białka przy trzech długościach fal 235 nm, 260 nm oraz 280 nm. Pomiar wykonać
względem próby kontrolnej (bufor lub H2O dest. bez białka). Jeśli zaistnieje konieczność,
(tzn. wielkość absorpcji przekracza 1), należy próbkę białka rozcieńczyć, a następnie
uwzględnić to przy obliczaniu jego stężenia. Znając wartość absorpcji (A) obliczyć stężenie
białka według podanych wyżej wzorów.
METODA KOLORYMETRYCZNA
Metoda Bradford
Metoda ta pozwala na szybkie oznaczenie stężenia białka w roztworze. W metodzie
Bradford wykorzystywana jest zdolność białka do tworzenia kompleksu z barwnikiem
zwanym
błękitem
Coomassie
(Coomassie
Brilliant
Blue).
Błękit
Coomassie
w środowisku kwaśnym posiada zabarwienie brunatne, które zmienia się na błękitne w reakcji
z białkiem. Natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia białka. Absorpcję powstałego
kompleksu barwnego odczytuje się w zakresie światła widzialnego przy długości fali 595 nm.
Odczynniki
1. Odczynnik Bradford (preparat handlowy)
2. Roztwór wzorcowy albuminy wołowej o stężeniu 100g/ml
3. Roztwór badanego białka
14
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
Wykonanie ćwiczenia
a) wykreślenie krzywej wzorcowej
Przygotować 8 ponumerowanych probówek, do których odmierzyć (według tabeli)
następujące ilości roztworu białka wzorcowego i wody destylowanej:
Nr probówki
1
2
3
4
Wzorzec albuminowy (l)
20
40
80
100 120 160 200
Woda (l)
780 760 720 700 680 640 600
800
Ilość białka w próbie (g)
2
0
4
8
10
5
12
6
7
16
20
8
0
Do wszystkich probówek dodać po 0,2 ml odczynnika Bradford i dokładnie wymieszać.
Po upływie 5 min, zmierzyć absorpcję w kolorymetrze przy długości fali 595nm.
Pomiarów dokonywać względem próby kontrolnej (nr 8). Wykreślić krzywą wzorcową
odkładając na osi odciętych (X) stężenia białka, a na osi rzędnych (Y) wartości absorpcji.
b) wykonanie pomiaru w badanej próbce białka.
Do dwóch probówek odmierzyć 2 – 20 l badanego roztworu białka (zgodnie z zaleceniami
prowadzącego ćwiczenia) i uzupełnić wodą do objętości 0,8 ml. Do wszystkich probówek
dodać po 0,2 ml odczynnika Bradford i dokładnie wymieszać. Po upływie 5 min, zmierzyć
absorpcję w kolorymetrze przy długości fali 595 nm.
Stężenie białka odczytać z przygotowanej krzywej wzorcowej.
ILOŚCIOWE OZNACZANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH
METODA SPEKTROFOTOMETRYCZNA
Kwasy
nukleinowe
charakteryzują
się
zdolnością
absorpcji
promieniowania
ultrafioletowego, której maksimum przypada na fale o długości 260 nm. Na wartość absorpcji
mogą wpływać zanieczyszczenia białkami, dla których maksimum absorpcji promieni UV
przypada na fale o długości 280 nm i 235 nm. Zasada metody polega na
spektrofotometrycznym pomiarze absorpcji promieni UV o długości 260 nm, przez
jednocentymetrową warstwę badanego roztworu kwasu nukleinowego i obliczeniu jego
15
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
stężenia wiedząc że, absorpcja (A) o wartości A = 1 odpowiada około 50 μg/ml
dwuniciowego dsDNA, około 33 μg/ml jednoniciowego ssDNA oraz około 40 μg/ml
jednoniciowego ssRNA i 20 -30 μg/ml oligonukleotydów.
Przykład oznaczenia stężenia RNA
Objętość próbki RNA: 100 μl
Rozcieńczenie: 10 μl próbki RNA + 490 μl dest. wody (rozcieńczenie 1/50)
A260 rozcieńczonej próbki = 0.55
Stężenie RNA
= 40 μg/ml x A260 x rozcieńczenie
= 40 μg/ml x 0.55 x 50
= 1100 μg/ml
Całkowita ilość RNA
= stężenie x objętość próbki w ml
= 1100 μg/ml x 0,1
= 110 μg RNA
Ponieważ tak roztwory DNA jak i RNA częściowo absorbują światło przy długości fali
280 nm, a roztwory białek częściowo pochłaniają światło również przy długości fali 260 nm,
stosunek odczytu przy długości fali 260 nm i 280 nm (A260/A280) informuje o czystości
kwasów nukleinowych. W przypadku dobrej izolacji wartość A260/A280 dla DNA wynosi 1,8
– 2,0, a dla RNA 1,9 – 2,1.
Odczynniki
Roztwory badanych kwasów nukleinowych.
Wykonanie ćwiczenia
Przeprowadzić spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany
roztwór kwasu nukleinowego przy dwóch długościach fal 260 nm oraz 280 nm. Pomiar
wykonać względem próby kontrolnej (bufor lub H2O). Jeśli zaistnieje konieczność (tzn.
wielkość absorpcji przekracza 1), należy próbkę kwasu nukleinowego rozcieńczyć (najlepiej
wodą), a następnie uwzględnić to przy obliczaniu jego stężenia. Znając wartość absorpcji (A)
obliczyć czystość i stężenie badanego kwasu nukleinowego.
16
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
ILOŚCIOWE OZNACZANIE RYBOSOMÓW
Stężenie rybosomów w zawiesinie oznacza się spektrofotometrycznie przez pomiar
absorpcji przy długości fali 260 nm. Otrzymaną wartość absorpcji podstawia się do wzoru i
oblicza stężenie rybosomów w mg/ml.
C rybosomów w mg/ml = ( A260 X rozcieńczenie ) : 11
Odczynniki
Roztwory badanych rybosomów
Wykonanie ćwiczenia
Przeprowadzić spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV przez badany
roztwór rybosomów przy długości fali 260 nm. Pomiar wykonać względem próby kontrolnej
(bufor lub H2O). Jeśli zaistnieje konieczność, (tzn. wielkość absorpcji przekracza 1), należy
próbkę rybosomów rozcieńczyć (zwykle konieczne jest rozcieńczenie 1000 lub 2000-krotne).
Znając wartość absorpcji (A) obliczyć stężenie rybosomów według podanego wyżej wzoru.
WYSALANIE BIAŁEK
Dzięki obecności grup polarnych w białkach, następuje wiązanie cząsteczek wody,
które wytwarzają tzw. płaszcz hydratacyjny. Dodanie niektórych soli (np. siarczanu amonu
bądź siarczanu magnezu) do roztworu białka, powoduje jego odwodnienie, co prowadzi do
wytrącenia białka z roztworu. Proces ten nosi nazwę wysalania. Wysolone białko można
ponownie rozpuścić w wodzie lub w odpowiednim buforze bez straty jego właściwości
biologicznych. Dzięki temu wysalanie białek stosuje się często w praktyce jako jeden
z etapów ich łagodnego wydzielania z roztworu. Aby uzyskać określony stopień nasycenia
siarczanem amonu, należy dokładnie znać objętość badanego roztworu i na podstawie
załączonej tabeli (patrz strona 54) odważyć potrzebną ilość gramów soli. Podczas procedury
wysalania białek ważna jest znajomość temperatury roztworu. Wytrącone białka obserwuje
się jako bezpostaciowe lub kłaczkowate osady zawierające pewną ilość soli, która wpływa
ujemnie na pomiar stężenia białka. Usunięcie soli z roztworu białka możliwe jest poprzez
dializę.
17
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
DIALIZA BIAŁEK
Metoda
dializy
pozwala
m.in.
na
usunięcie
soli
i
innych
związków
niskocząsteczkowych z roztworu białka oraz zmianę buforu w którym białko jest zawieszone.
Materiały i odczynniki
2% roztwór węglanu sodu
0,5 M roztwór EDTA, pH 8,0
Rozwór badanego białka
Roztwór dializacyjny (zgodnie z zaleceniami prowadzącego)
Celulozowe „węże” do dializy
Zaciski do „węży” dializacyjnych
Wykonanie ćwiczenia
1. Uciąć potrzebną długość „węża” dializacyjnego i gotować przez 10 minut w 200 ml
2% roztworu węglanu sodu z dodatkiem 1 mM EDTA w celu usunięcia metali
ciężkich i siarczków. Długość „węża” obliczyć następująco:
- długość dializowana (mm) = [poj.(w μl) x 3,2] / [szer. „węża”2 (w mm2)]
- dodać 10 % długości dializowanej
- dodać 4 cm na zaciski
2. Po oziębieniu, dokładnie przepłukać „węże” wodą destylowaną (tak przygotowane
„węże” można przechowywać w wodzie z dodatkiem substancji konserwujących, np.
NaN3 w 40C).
3. Jeden koniec przygotowanego „węża” zamknąć zaciskiem tak, aby wystawał on co
najmniej na 1 cm. Otrzymany woreczek wypełnić wodą destylowaną w celu
sprawdzenia jego szczelności.
4. Po wylaniu wody, napełnić woreczek roztworem białka przygotowanym do dializy.
Z niewypełnionej części woreczka usunąć powietrze ściskając delikatnie woreczek
nad płynem.
5. Zamknąć zaciskiem drugi koniec „węża” i umieścić woreczek w roztworze
dializacyjnym. Dializę należy prowadzić, przy stałym mieszaniu, w temperaturze 40C.
18
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
6. Roztwór dializacyjny powinien być zmieniany co najmniej 3 razy w trakcie trwania
dializy. Zaleca się wymianę po upływie 2-4 godzin, 6-8 godzin i 10-14 godzin.
Całkowita objętość roztworu powinna być ok. 100 razy większa niż objętość próbki
białkowej.
7. Po zakończeniu dializy, zdjąć jeden zacisk, otworzyć woreczek i usunąć roztwór
za pomocą pipety.
19
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
TABELA WYSYCEŃ (NH4)2SO4 (temp. pokojowa)
Końcowe nasycenie siarczanem amonu w %
10
20
25
30
33
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
90
100
Nasycenie
początkowe
Ilość gramów siarczanu amonu, którą należy dodać do 1 dm3 roztworu
%
0
10
20
25
30
33
35
56
114 144 176 196 209 243 727 313 351 390 430 472 516 561 662
767
57
86
118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592
694
29
59
78
91
123 155 189 225 262 300 340 382 424 520
619
30
49
61
93
125 158 193 230 267 307 348 390 485
583
19
30
62
94
127 162 198 235 273 314 356 449
546
12
43
74
107 142 177 214 252 292 333 426
522
31
63
94
129 164 200 238 278 319 411
506
31
63
97
132 168 205 245 285 375
469
32
65
99
134 171 210 250 339
431
33
66
101 137 176 214 302
392
33
67
103 141 179 264
353
34
69
105 143 227
314
34
70
107 190
275
35
72
153
237
36
115
198
77
157
40
45
50
55
60
65
70
75
80
90
79
Uwaga ! Przystępując do wysalania białek w temperaturze 40C należy pomnożyć
wyliczoną z Tabeli ilość gramów siarczanu amonu przez współczynnik 0,92, który
uwzględnia zmniejszoną rozpuszczalność tego związku w niższej temperaturze.
Przykład : Jeżeli procedurę wysalania białka (0% - 50% nasycenia) prowadzimy w temp. 40C,
wówczas na 1 dm3 roztworu białka należy przygotować odważkę 288g (313 g  0,92)
siarczanu amonu. By zwiększyć nasycenie siarczanem amonu od 50% do 100%, należy
odważyć dodatkowo 360g (392 g  0,92) soli.
20
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
Tabela 1
Symbole wielokrotności i ułamków dziesiętnych
Symbol
T
G
M
k
h
dk
d
c
m
μ
n
p
Określenie
TeraGigaMegaKiloHektoDekaDeciCentiMiliMikroNanoPiko-
12
10
109
106
103
102
101
10-1
10-2
10-3
10-6
10-9
10-12
Przeliczenie
1 000 000 000 000
1 000 000 000
1 000 000
1 000
100
10
0,1
0,01
0,001
0,000 001
0,000 000 001
0,000 000 000 001
Tabela 2
Przybliżona molowość i ciężar właściwy stężonych kwasów
Związek
Kwas azotowy
Kwas fosforowy
Kwas nadchlorowy
Kwas nadchlorowy
Kwas octowy
Kwas siarkowy
Kwas solny
Procent
wagowy
Molowość
M
70
85
60
70
99,5
96
37
15,7
14,8
9,2
11,6
17,4
18
12
Otrzymanie
molowego
roztworu (ml/l)
64
68
109
86
58
56
84
Ciężąr
właściwy
1,42
1,70
1,54
1,67
1,05
1,84
1,19
Tabela 3
Barwy promieniowania widzialnego
Przybliżony zakres
długości fali
(m)
400-450
450-480
480-490
490-500
500-560
560-575
575-590
590-625
625-750
Barwa
Barwa
dopełniająca
fioletowa
niebieska
zielononiebieska
niebieskozielona
zielona
żółtozielona
żółta
pomarańczowa
czerwona
żółtozielona
żółta
pomarańczowa
czerwona
purpurowa
fioletowa
niebieska
zielononiebieska
niebieskozielona
21
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW
APS
- nadsiarczan amonowy (ang. Ammonium Persulphate)
β-MET
- β-merkaptoetanol (ang. β-Mercaptoethanol)
DEPC
- pirowęglan dietylu (ang. Diethyl Pyrocarbonate)
DMEM
- podłoże do hodowli komórkowych (ang. Dulbecco/Vogt modified Eagle’s
Minimal Essential Medium)
dsDNA
- dwuniciwy DNA (ang. double stranded DNA)
DTT
- ditiotreitol (ang. Dithiothreitol)
EDTA
- kwas etylenodwuaminoczterooctowy (ang. Ethylenediaminetetraacetic Acid)
HeLa
- linia komórkowa wywodząca się z komórek raka szyjki macicy Henrietty
Lacks (ang. Henrietta Lacks cell)
LB
- podłoże do hodowli bakterii (ang. Luria-Bertani medium)
NIH 3T3
- linia komórkowa fibroblastów mysich (ang. National Institute of Health,
3-day Transfer, inoculum 3 x 105 cells)
PAGE
- elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (ang. Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)
PMSF
- sulfofluorek fenylometanu (ang. Phenylmethylsulphonyl Fluoride)
RPMI
- podłoże do hodowli komórkowych (ang. Roswell Park Memorial Institute
medium)
SD
- podłoże do hodowli drożdży (ang. synthetic defined)
SDS
- sól sodowa siarczanu dodecylu (ang. Sodium Dodecyl Sulphate)
SDS-PAGE - elektroforeza w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS (ang. Sodium
Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
ssDNA
- jednoniciowy DNA (ang. single stranded DNA)
TAE
- bufor do elektroforezy DNA/RNA (ang. Tris- Acetate-EDTA)
TCA
- kwas trójchlorooctowy (ang. Trichloroacetic Acid)
TEMED
- N,N,N’,N’-czterometyletylenodiamina (ang. N,N,N’,N’tetramethylethylenediamine)
Tris
- trójhydroksymetyloaminometan; 2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol
UV
- promieniowanie ultrafioletowe (ang. Ultraviolet )
22
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
WYKAZ WYBRANYCH SUBSTANCJI CHEMICZNYCH STOSOWANYCH
NA ĆWICZENIACH
Aceton – wykorzystywany do wytrącania białka z roztworu oraz przepłukiwania osadów
białek
APS – inicjator polimeryzacji akrylamidu i N,N'-metylenobisakrylamidu
β-MET – substancja redukująca, m. in. mostki dwusiarczkowe w białkach
Błękit bromofenolowy – barwnik stosowany w buforach do próbek DNA, RNA i białek
poddawanych elektroforezie żelowej
Bromek etydyny – barwnik wykorzystywany do barwienia kwasów nukleinowych
po elektroforezie żelowej, silny mutagen.
DEPC – inhibitor RNaz
DTT – substancja redukująca, m. in. mostki dwusiarczkowe w białkach
EDTA – chelator jonów dwuwartościowych, substancja hamująca nukleazy
Fenol – stosowany do ekstrakcji kwasów nukleinowych, substancja denaturująca białka,
silnie żrąca i toksyczna
NaH2PO4 – substancja buforująca, utrzymuje pH roztworu
NaCl – substancja zapewniająca siłę jonową roztworu
PMSF – nieodwracalny inhibitor proteaz serynowych
SDS – anionowy detergent, upłynniający wszystkie błony komórkowe i denaturujący białka,
nadający białkom ujemny ładunek wypadkowy
TCA – silny kwas, stosowany do wytrącania białka z roztworu
TEMED – katalizator polimeryzacji akrylamidu i N,N'-metylenobisakrylamidu
Tris – (w formie Tris-HCl, Tris-octan, Tris-glicyna) – substancja buforująca, utrzymuje pH
roztworu w zakresie 7-9
Triton X-100 – detergent używany do lizy błon komórkowych.
23
Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2015
LITERATURA
1. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., Biochemia, PWN, Warszawa, 2005
2. Brown T.A., Genomy, PWN, Warszawa, 2009
3. Kłyszejko-Stefanowicz L., Cytobiochemia, PWN, Warszawa, 2002
4. Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 2001
5. Tuner P.C. i inni, Krótkie wykłady. Biologia molekularna, PWN, Warszawa, 2007
6. Prace oryginalne i artykuły przeglądowe wskazane przez prowadzącego ćwiczenia.
24