Wybrane substancje: znaczenie dla organizmu oraz możliwe
advertisement
Wybrane substancje: znaczenie dla organizmu oraz możliwe zastosowania Wybrane substancje: znaczenie dla organizmu oraz możliwe zastosowania Redakcja: Monika Olszówka Kamil Maciąg Lublin 2015 Recenzenci: dr Artur Banach dr n. med. Anna Irzmańska-Hudziak dr Monika Jach dr hab. Andrzej Junkuszew dr hab. n. med. Tomasz Kocki dr hab. inż. prof. WSOSP Grzegorz Koralewski dr Konrad Kubiński dr n. med. Marta Łuczyk dr Maciej Masłyk dr Anna Pytlak dr Anna Szafranek-Nakonieczna Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje. Skład i łamanie: Ilona Żuchowska Projekt okładki: Agnieszka Ciurysek © Copyright by Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL ISBN 978-83-65272-02-7 Wydawca: Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL ul. Głowackiego 35/348, 20-060 Lublin www.fundacja-tygiel.pl Spis treści Joanna J. Sajkowska, Paweł Kozielewicz, Katarzyna Paradowska Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów ................... 7 Jerzy Potyka, Jakub Rok, Elektra Sliupkas-Dyrda Antynowotworowe właściwości witaminy D 3 ........................................... 27 Monika Pilecka, Maciej Berbecki, Katarzyna Wojewoda Receptor programowanej śmierci PD-1 jako potencjalny cel w terapii nowotworów ............................................................................... 41 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Artur Anisiewicz Znaczenie szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1 w nowotworach .................. 51 Joanna Woźniak, Tomasz Wandtke Maciej Gawroński TNF-α – budowa molekularna, aktywność w procesach nowotworowych oraz potencjalne wykorzystanie w badaniach klinicznych ........................ 61 Katarzyna Terlega, Justyna Płonka, Dariusz Kuśmierz Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach .............................................. 70 Tomasz Wandtke, Joanna Woźniak, Alicja Janicka Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne w diagnostyce infekcji wirusowych? ......................................................... 84 Anna Machnikowska, Aleksandra Jarosz, Lidia Kotuła Możliwości farmakologiczne w zaburzeniach syntezy neuroprzekaźników w autyzmie ................................................................................................ 94 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób ..................................................................................... 103 Arkadiusz Czerwonka, Anna Wawruszak, Karolina Okła Spirulina – historia, skład i właściwości prozdrowotne ........................... 121 Paulina Syryjczyk, Paulina Miziak, Julita Kołodziejczyk, Marta Fiołka, Krzysztof Grzywnowicz Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic ...................... 132 Michał Chojnacki, Maciej Frant, Mateusz Pięt, Adrian Zając Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących na terenie polskich lasów ........................................................................ 144 5 Karolina Kasprzak, Kinga Kropiwiec, Marek Babicz Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich ............................. 156 Blanka Bukowska Szczenięta podczas pierwszych tygodni życia: problemy pediatryczne u psów ................................................................ 170 Agata Pawłowska, Joanna Kwiczak, Donata Pluskota-Karwatka Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej ....................... 179 Mateusz Niścior, Katarzyna Tarnawska, Monika Adamczyk Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych ...................... 194 Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały ... 208 Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka ................................................................................ 225 6 Joanna J. Sajkowska1, Paweł Kozielewicz2, Katarzyna Paradowska3 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów Opublikowane w ostatnich latach prace sugerują, że niedobory witaminy D mają nie tylko negatywny wpływ na układ mięśniowo-szkieletowy, ale również są czynnikiem współtowarzyszącym wielu chorobom m.in. sercowo-naczyniowym, autoimmunologicznym, kilku rodzajom nowotworów, cukrzycy typu 1 oraz zaburzeniom psychicznym. Badanie poziomu witaminy D nie jest przeprowadzane rutynowo. Ponadto świadomość społeczeństwa na temat tej molekuły jest niewystarczająca. Wydaje się, iż działania podejmowane przez środowiska naukowe powinny skutkować lepszym poznaniem obszarów i skutków działania witaminy D. 1. Wprowadzenie Historycznie witamina D kojarzona była głównie z prewencją chorób szkieletu i wpływem na gospodarkę wapnia i fosforu. Liczne badania naukowe ostatnich lat wskazują na obecność receptora dla witaminy D (VDR) w różnych komórkach poza układem mięśniowo-szkieletowym, m.in. miocytach, śródbłonka naczyniowego, β-trzustki, neuronach i układu immunologicznego. Z roku na rok przybywa doniesień literaturowych ukazujących potencjalnie niekorzystny wpływ hipowitaminozy D na rozwój chorób układu sercowo-naczyniowego, zespołu metabolicznego czy depresji [1-4]. Obecnie w wielu jednostkach naukowych na świecie trwają badania eksperymentalne nad skutecznością witaminy D i jej analogów w leczeniu m.in. wyżej wymienionych schorzeń. Pierwsze naukowe doniesienia dotyczące witaminy D datowane są na XVII wiek. Jednak przełom w badaniach nad jej poznaniem przypadł na wiek XX, kiedy to amerykański uczony Elmer V. McCollum odkrył w tranie frakcję odpowiedzialną za działanie przeciwkrzywicze i nazwał ją witaminą D (była to czwarta w kolejności odkryta witamina). Na Uniwersytecie w Göttingen w Niemczech w laboratorium profesora Adolfa Windausa określono chemiczną strukturę molekuły i niedługo potem na rynek farmaceutyczny została wprowadzona jej syntetyczna 1 [email protected], Zakład Chemii Fizycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 2 [email protected], School of Clinical and Experimental Medicine, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham 3 [email protected], Zakład Chemii Fizycznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 7 Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska forma [5]. Od lat 70-tych obserwowany jest intensywny rozwój badań nad witaminą D. Coraz więcej wiemy na temat mnogości kierunków jej działania oraz skutkach niedoborów. Według bazy Web of Science na temat witaminy D w 1985 roku ukazało się 856 prac, z czego jedynie 9% stanowiły artykuły przeglądowe. W 2013 roku ogólna liczba prac odnoszących się do witaminy D wynosiła 9357, w tym 1056 przeglądowych (Wykres [1]). Zainteresowanie molekułą jest duże i ciągle rośnie, podobnie jak nadzieje na to, że dzięki lepszemu poznaniu samej witaminy D możliwe będzie skuteczniejsze prowadzenie farmakoterapii wielu chorób o charakterze zarówno ostrym czy przewlekłym. liczba publikacji Hasło "vitamin D" w bazie Web of Science 10080 9080 8080 7080 6080 5080 4080 3080 2080 1080 80 1985 1995 2009 2011 2013 rok wszystkie artykuły prace przeglądowe Wykres 1. Występowanie hasła ”vitamin D” w bazie Web of Science [opracowanie własne] 2. Witamina D i jej niedobory – bieżący stan wiedzy Około 2,5 tysiąca dorosłych osób (2091 kobiet, 596 mężczyzn) wzięło udział w pierwszej części Ogólnopolskiego Programu Bezpłatnych Badań Poziomu Witaminy D przeprowadzonej na przełomie lutego i marca 2014 roku w 10 miastach Polski. Jedynie 8,4% osób miało optymalne stężenie, czyli 30-50 ng/ml 25(OH)D we krwi. Ponad 90% dorosłych Polaków charakteryzował zbyt niski poziom witaminy D [6]. Wyniki otrzymane przez profesora Płudowskiego i współpracowników są zgodne z danymi dla innych społeczeństw europejskich oraz amerykańskich. Pod koniec 2007 roku amerykański tygodnik TIME na liście dziesięciu najważniejszych (Top Ten) „przełomów medycznych” roku umieścił „korzyści z witaminy D”. W chwili obecnej zasadne wydaje się prowadzenie profilaktyki zdrowia z uwzględnieniem aktualnego stanu wiedzy na temat metabolizmu i działania witaminy D, zwłaszcza że wykracza on 8 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów znacznie poza gospodarkę kostno-mineralną. Z roku na rok przybywa opinii eksperckich podkreślających, iż zapewnienie właściwego zaopatrzenia organizmu człowieka w witaminę D powinno zredukować częstość występowania wielu powszechnych stanów patologicznych. Tabela 1. Przykłady badań dokumentujących związek pomiędzy stężeniem 25(OH)D a optymalizacją stanu zdrowia [7] Badany efekt Typ badania Badane stężenie 25(OH)D Wynik Piśmienn ictwo Wystąpienie raka piersi Meta-analiza 5 przypadków 30 ng/ml vs 10 ng/ml Iloraz szans = 0.44 [8] Nowotwór jelita grubego Meta-analiza 10 przypadków i badanie kohortowe 30 ng/ml vs 5 ng/ml Iloraz szans = 0.40 [9] Choroby układu krążenia Badania prospektywne 30 ng/ml vs < 15 ng/ml Hazard względny = 1.62 [1] Najniższe vs najwyższe Ryzyko względne = 1.86 [10] Iloraz ryzyka = 0.57 [3] Choroby układu krążenia Cukrzyca typu II Cukrzyca typu II Zaburzenie funkcji poznawczych Spadek funkcji poznawczych Zakażenia dróg oddechowych, ostre wirusowe Meta-analiza badań prospektywny ch Meta-analiza badań prospektywny ch Obserwacyjne badania prospektywne Kobiety powyżej 70. roku życia Kobiety powyżej 70. roku życia Zakażenie jesienne i zimowe >25 ng/ml vs < 14 ng/ml 30.1 ng/ml vs 12.8 ng/ml < 10 ng/ml vs > 30 ng/ml < 10 ng/ml vs > 30 ng/ml >38 ng/ml vs < 38 ng/ml 9 Hazard względny = 0.72 Iloraz szans = 1.60 Iloraz szans = 1.58 Ryzykowe względne = 0.51 [11] [12] [12] [13] Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska 2.1. Drogi zaopatrzenia organizmu człowieka w witaminę D Jak wiadomo organizm człowieka otrzymuje witaminę D z dwóch źródeł: z absorpcji jelitowej oraz z syntezy skórnej. W wyniku działania obydwu procesów w układzie krążenia pojawia się witamina D, która po przekształceniu w aktywną formę 1,25(OH)2D (kalcytriol, 1,25-dihydroksywitamina D) wykazuje różnokierunkowe działanie biologiczne [7, 14]. 2.1.1. Źródła witaminy D Ze wszystkich naturalnych źródeł witaminy D najbogatszym jest mięso ryb i tran. Jednostką międzynarodową (IU) witaminy D jest 0,025 mg czystego kalcyferolu [14]. W zależności od pochodzenia tran może zawierać od 100 IU (z soli szarej) do 4 500 000 IU/100 g (w przypadku tuńczyka). Znacznie mniej witaminy D występuje w mięsie wieprzowym, żółtku jaja kurzego, żółtym serze lub w mleku matki (1,5-8 IU/100 ml) Tabela [2]. Tabela 2. Zawartość witaminy D w niektórych surowych produktach żywnościowych [7, 15] Nazwa produktu Zawartość witaminy D [IU/100 g] Węgorz Sandacz Śledź Łosoś Żółtko jajka Dorsz Mięso wieprzowe Wątróbka, wołowina Żółtko jaja kurzego Masło Żółty ser 1024 984 616 496 312 280 80 32 20-50 12 7-28 Działaniem podejmowanym w obecnym czasie, mającym na celu zapobieganie wystąpienia ewentualnych niedoborów witaminy D, jest uzupełnianie w nią niektórych produktów spożywczych. W Polsce w witaminy A i D obligatoryjnie wzbogacane są margaryny oraz odżywki dla dzieci i niemowląt. W innych krajach europejskich dodatkowo płatki śniadaniowe. W Stanach Zjednoczonych wśród tych produktów są: mleko i jogurty, płatki śniadaniowe, soki pomarańczowe oraz margaryny. 10 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów 2.1.2. Absorpcja jelitowa witaminy D Witamina D należy do związków rozpuszczalnych w tłuszczach, wobec czego przyswajanie jej po podaniu drogą doustną jest możliwe dzięki dyspersji w wodnej treści jelita. Proces ten zachodzi dzięki występującym w przewodzie pokarmowym człowieka naturalnym detergentom jakimi są kwasy żółciowe. Tworzą one struktury micelarne, co ułatwia rozpuszczanie związków niepolarnych, takich jak cholesterol lub witaminy A, D, E i K. Analizując mechanizm absorpcji jelitowej witaminy D, widać, iż podstawowym warunkiem, od którego zależy wydajność tego procesu, jest obecność żółci w przewodzie pokarmowym. Jej brak w jelicie cienkim spowodowany różnego rodzaju zaburzeniami (m.in. wydzielania, dyskinezami dróg żółciowych, resekcją fragmentu jelita), tak jak dieta niskotłuszczowa, skutkuje zanikiem absorpcji witaminy D [16]. Przesadna ilość tłuszczów w pokarmie również może mieć negatywny wpływ na sprawność opisywanego procesu. Powstające w wyniku działania lipaz kwasy tłuszczowe dostają się do wnętrza miceli zwiększając rozpuszczalność witaminy D. To powoduje, iż nie przechodzi ona do błon komórkowych. Ponadto zbyt duże micele trudniej migrują do komórek jelita [16, 17]. Po dostaniu się do wnętrza enterocytu witamina D zostaje włączona do powstających tam chylomikronów (dużych lipoprotein o kulistej budowie), po czym razem z nimi przemieszcza się do strumienia limfy. W przewodach limfatycznych 90% witaminy D nadal jest związane z frakcją chylomikronową, 9,5% z białkową, jedynie około 0,5% z lipoproteinami niskiej (LDL) i wysokiej gęstości (HDL). Tuż po zmieszaniu się limfy z krwią pod wpływem działania lipazy chylomikrony rozpadają się, witamina D transportowana jest do frakcji białkowej surowicy i równocześnie powstają tzw. Resztki chylomikronów. Na skutek tego około 40% podanej puli witaminy D związane jest z białkami – głównie α-globulinami, a pozostała część z lipoproteinami wywodzącymi się z resztek chylomikronów [17]. Witamina D stosunkowo krótko przebywa w krwioobiegu, skąd przechodzi do wątroby, gdzie podlega procesom aktywacji lub magazynowana jest w tkance tłuszczowej [18]. 11 Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska 2.1.3. Skórna synteza witaminy D Rys. 1. Budowa skóry (zmodyfikowano wg [19]) Naturalnym i bezpiecznym źródłem witaminy D dla człowieka jest jej synteza skórna zachodząca pod wpływem promieniowania UVB (290315 nm). W szlaku tych przemian biochemicznych prekursorem witaminy D jest czteropierścieniowy związek steroidowy: 7-dehydrocholesterol (7DHC). Prewitamina D występuje głównie w warstwie kolczystej i podstawnej naskórka, mniejsze zasoby znajdują się w zewnętrznych warstwach naskórka czy skórze właściwej (Rysunek [1]) [14, 15, 18]. Biosynteza przebiega w dwóch etapach. W pierwszym zachodzącym na skutek działania promieniowania po zaabsorbowaniu fotonu dochodzi do pęknięcia pierścienia B między węglami C9 i C10, w efekcie powstaje pochodna 6,7-cis-heksatrienowa, czyli prewitamina D (Rysunek [2]). Następnie pod wpływem temperatury ciała w ciągu kilku godzin ulega izomeryzacji w 5,6-cis-izomer – witaminę D (Rysunek [3]) [14]. Rys. 2. Fotoizomeryzacja 7-dehydrocholesterolu do prewitaminy D3 [opracowanie własne] 12 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów Rys. 3. Izomeryzacja prewitaminy D3 do witaminy D3 [opracowanie własne] Witamina D, która powstaje w głębszych warstwach naskórka w sąsiedztwie naczyń krwionośnych i limfatycznych, przyłączana jest do białka wiążącego witaminę D (DBP) znajdującego się we krwi. W tej postaci przebywa w układzie krążenia, skąd pobierana jest przez wątrobę, gdzie podlega procesowi przekształcenia w 25-hydroksywitaminę D (25(OH)D), po czym ponownie trafia do krwi i w kompleksie z DBP transportowana jest do nerek, w których zachodzą kolejne etapy jej metabolizmu. Prekursory i produkty uboczne biosyntezy witaminy D charakteryzują się niewielkim powinowactwem do DBP, tak więc w organizmie człowieka występuje specyficzna translokacja powstającej witaminy przez białko wiążące. Zgodnie z regułą przekory Le Chateliera-Brauna usuwanie produktu reakcji ze środowiska skóry do układu krążenia napędza tworzenie kolejnych cząsteczek witaminy D z powstałej wcześniej prewitaminy. Sposób transportu witaminy D pobranej drogą absorpcji jelitowej i otrzymanej w wyniku syntezy skórnej istotnie się różni. Witamina D związana z resztkami chylomikronów wychwytywana jest przez wątrobę znacznie szybciej niż ta występująca w kompleksie z DBP, aczkolwiek wydajność przekształcenia w 25(OH)D z drugiego substratu jest większa. Pobudzenie biosyntezy skórnej witaminy D skutkuje łagodniejszym wzrostem stężenia 25(OH)D w układzie krążenia niż po wprowadzenie do krwi tej samej dawki witaminy D drogą absorpcji jelitowej. 13 Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska Rys. 4. Witamina D: skórna synteza, metabolizm i jeden ze szlaków jej dezaktywacji (zmod. [20]) Wytwarzanie w szlaku biosyntezy witaminy D też jej nieaktywnych metabolitów (tachysterol i lumisterol) skutkuje tym, że nawet przy zbyt długiej ekspozycji na światło słoneczne, nie pojawia się ryzyko przedawkowania [21]. Jednym z głównych czynników wpływających na ilość powstającej w skórze witaminy D jest długość fal padającego promieniowania UVB. Z największą intensywnością proces ten zachodzi przy fali o długości 295 ± 2 nm, zaś przy równej 320 nm jego szybkość spada do zera. Promieniowanie o długości fali 260 nm indukuje powstawanie największych ilości tachysterolu, zaś 310 nm – lumisterolu [21]. Pracujące w Polsce solaria zazwyczaj wyposażone są w lampy emitujące promieniowanie powyżej zakresu 290-310 nm, a więc promieniowanie UVA, które zamiast syntezy witaminy D doprowadza do jej rozkładu [15]. Kolejnym ważnym czynnikiem wpływającym na biosyntezę witaminy D jest czas naświetlania. Już po 10-15 minutach zawartość Prewitamina D osiąga swoje maksimum (około 20% wyjściowej ilości 7DHC), po czym znacznie się obniża. Zatem w celu zaopatrzenia organizmu w odpowiednio dużą dawkę witaminy D, powinno się zrezygnować z długich ekspozycji na słońce, co ma miejsce zwłaszcza w czasie letniego wypoczynku. Znaczenie mają również: pora roku, stosowanie filtrów przeciwsłonecznych (krem z filtrem nr 15 zmniejsza skórną syntezę o 99,9%), grubość warstwy ozonowej (absorbuje UVB) stopień zanieczyszczenia powietrza, szerokość geograficzna, ubranie, wiek (wraz z wiekiem zmniejsza 14 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów się zawartość 7DHC w keranocytach) oraz intensywność pigmentacji. Obecność melaniny pochłaniającej promieniowanie ultrafioletowe sprawia, że u osób z fenotypem skóry VI (ciemnobrązowa lub czarna skóra) wymagana jest 6-krotnie większa dawka naświetlania niż u przedstawicieli fenotypów I-III (skóra biała), aby stężenie witaminy D we krwi było podobne (wydajność jej syntezy jest odwrotnie proporcjonalna do zawartości melaniny). Dla skóry o jasnej karnacji maksymalne stężenie Prewitamina D osiągane jest na równiku po 15-30 minutach, zaś na wysokości Bostonu (południk 42,2ºN) po 30-60 minutach. Należy podkreślić, iż nadmiernie intensywne naświetlanie nie ma korzystnego wpływu na poziom zaopatrzenia organizmu w witaminę D i dodatkowo zwiększa ryzyko powstania nowotworów skóry. Zaleca się zatem krótkie, regularne ekspozycje na działanie światła słonecznego, najbardziej skuteczne również z punktu widzenia wydajności biosyntezy witaminy D [6, 7]. Ważna jest także temperatura ciała – gdy jest równa 37ºC, to 50% przemian zachodzi w ciągu 28 godzin, a po 4 dniach osiągany jest stan równowagi reakcji (80% prowitaminy zostaje przekształcone w witaminę D). Wraz z obniżeniem temperatury wydłużeniu ulega czas, np. przy 25ºC dla przeprowadzenia 50% przemian potrzeba 48h [21]. Zachowując zatem zasady racjonalnej ekspozycji na słońce (odsłonięte przedramiona i częściowo nogi) w Polsce w od maja do września, kiedy promieniowanie ultrafioletowe pada pod kątem większym niż 30º (warunek zachodzenia procesu), możliwe jest prawidłowe zaopatrzenie organizmu w witaminę D [7, 21]. Jej biosynteza odbywa się jeszcze w ciągu kilku dni od zakończenia ostatniego naświetlania skóry. 2.2. Metabolizm witaminy D Przez lata uważano, że metabolizm witaminy D odbywa się nieomal wyłącznie w wątrobie i nerkach. Nowe doniesienia wskazują także na inne organy ludzkiego organizmu. Z wyjątkiem nieenzymatycznej biosyntezy witaminy D w skórze, kolejne przemiany „słonecznej witaminy” wymagają obecności enzymów. Są nimi hydroksylazy należące do klasy oksydoreduktaz. Pierwszy etap biosyntezy aktywnej postaci witaminy D zachodzi w wątrobie: jest nim hydroksylacja przy węglu 25-tym. Następnie 25-hydroksywitamina D (25(OH)D, kalcyfediol) ulega w nerkach 1-hydroksylacji. Otrzymany kalcytriol (1,25-dihydroksywitamina D, 1,25(OH)2D) także w nerkach ulega hydroksylacji przy 24-tym atomie węgla [18]. 2.2.1. Hydroksylacja w pozycji ‘25’ Pierwszy etap aktywacji metabolicznej witaminy D, czyli hydroksylacja przy 25-tym atomie węgla, zachodzi w wątrobie we frakcji mikrosomalnej 15 Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska oraz mitochondrialnej hepatocytów pod wpływem zespołu 25-hydroksylaz. Enzymy te zawierają cytochrom P450, lecz charakteryzują się odmiennymi wartościami stałej Michaelisa-Menten (Km) – stężeniami substratu, przy którym szybkość prowadzonej reakcji enzymatycznej jest równa połowie szybkości maksymalnej (Vmax) tej reakcji. Enzymy frakcji mikrosomalnej mają wyższe powinowactwo do substratu (Km~0,1 µM) i niższą wartość Vmax niż mitochondrialnej (Km~3-10 µM przy wysokim Vmax). Dlatego uważa się, że w warunkach fizjologicznych hydroksylaza mikrosomalna pełni kluczową rolę. Po przedawkowaniu witaminy D uaktywniają się enzymy mitochondrialne, wzrasta stężenie jej metabolitów we krwi i występują objawy zatrucia [20, 22]. 2.2.2. Hydroksylacja w pozycji ‘1’ Kluczowym miejscem metabolizmu witaminy D są nerki. Powstaje tu najbardziej aktywna ze wszystkich forma witaminy D jaką jest kalcytriol – 1,25(OH)2D. Hydroksylacja przy atomie C1 przeprowadzana jest w kanalikach nerkowych (ich proksymalnej i dystalnej części). Substratem jest postać 25(OH)D. U pacjentów z niewydolnością nerek, zwłaszcza w zaawansowanym stadium choroby odnotowano stężenia 1,25(OH)2D na granicy wykrywalności. Uznaje się zatem, że te hydroksylazy działają jedynie w miejscach ich występowania. Dodatkowo produkowana porcja kalcytriolu nie jest uwalniana do układu krążenia, lecz wiąże się z lokalnym zapotrzebowaniem na ten hormon np. koniecznością zahamowania proliferacji i pobudzeniem różnicowania komórek albo stymulacją wytwarzania innych hormonów. Wyjątkiem od sytuacji gdy 1-hydroksylacja na obwodzie nie zwiększa całkowitego poziomu 1,25(OH)2D we krwi, jest wystąpienie schorzenia, w przebiegu którego dochodzi do silnej aktywacji układu odpornościowego, głównie limfocytów, np.: gruźlica, sarkoidoza. Komórki te znacznie zwiększają ilość 1-hydroksylaz, co powoduje zwiększenie ilości aktywnej postaci witaminy D we krwi. Nadmiar kalcytriolu może spowodować zachwianie homeostazy mineralnej i wystąpienie hiperkalcemii. Obecnie hydroksylazom obwodowym przypisuje się rosnącą rolę w oddziaływaniu witaminy D na organizm ludzki, zwłaszcza w kontekście jej nowo odkrywanych funkcji [14, 15, 20, 22]. Proces 1-hydroksylacji podlega regulacji i jest zależny od stężenia w surowicy krwi: wapnia, fosforanów i parathormonu (PTH). Jeżeli stężenie PTH jest podwyższone albo stężenie wapnia lub fosforanów obniżone, to PTH pobudza 1-hydroksylazę do przekształcania kalcyfediolu w kalcytriol i jednocześnie wzrasta ilość wapnia wchłanianego przez nerki. Natomiast w przypadku wystąpienia nadmiaru 1,25(OH)2D dochodzi 16 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów do hamowania zwrotnego 1-hydroksylazy, by zapobiec dalszemu powstawaniu kalcytriolu i w efekcie spada stężenie wapnia we krwi [22]. 2.2.3. Hydroksylacja w pozycji ‘24’ Kolejny etap metabolizmu witaminy D, hydroksylacja przy atomie C24, również zachodzi w nerkach (głównie w kanalikach proksymalnych). 24-hydroksylaza, podobnie jak wcześniej omówione biokatalizatory, zawiera cytochrom P450 i jest enzymem multikatalitycznym hydroksylującym boczne łańcuchy różnych metabolitów witaminy D. Substratami są zarówno 25-hydroksy, jak i 1,25-hydroksy pochodne. Wzrost stężenia 1,25(OH)2D zwiększa aktywność enzymu i jednocześnie obniża stężenie 1-hydroksylazy. Z uwagi na fakt, iż hydroksylacja w pozycji ‘24’ zapoczątkowuje jeden ze szlaków katabolicznych witaminy D, 24-hydroksylaza jest jednym z najważniejszych czynników kontrolujących poziom kalcytriolu w organizmie [15, 20, 22]. 2.3. Mechanizm działania witaminy D Witamina D i jej metabolity wykazują działanie za pośrednictwem specyficznych receptorów (VDR, ang. Vitamin D receptor) należących do rodziny receptorów jądrowych (NR1ǀ1). Gen kodujący VDR zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu 12 w locus 12q13.11. [23] Receptory dla witaminy D występują one w wielu typach komórek: kościach, jelicie, nerkach i przytarczycach, ale również w komórkach nabłonka naczyniowego, miocytach, kardiomiocytach, komórkach β-trzustki, neuronach, komórkach układu immunologicznego [1-3]. W wyniku pierwszych kluczowych etapów metabolizmu witaminy D powstaje forma 1,25(OH)2D, która krąży we krwi głównie w postaci związków kompleksowych z DBP w równowadze z niewielką ilością wolnej formy. Metabolit witaminy D dyfunduje do błony komórkowej, dochodzi do jego odłączenia od DBP, po czym jako samodzielna cząsteczka 1,25(OH)2D przechodzi przez dwie warstwy lipidowej błony i trafia do jądra komórkowego, gdzie wykazuje duże powinowactwo do VDR – silnie się z nim sprzęga tworząc kompleks transkrypcyjny. Przyłączony ligand powoduje zmianę konformacji receptora, w wyniku czego może on związać się z receptorem kwasu 9-cis retinojowego (RXR) tworząc heterodimer, do którego przyłączają się dwa dodatkowe koaktywatory. Kompleks VDR-RXR-koaktywatory wzajemnie oddziałuje z ogólnym aparatem transkrypcyjnym (GTA), by zainicjować lub dokonać supresji transkrypcji około 200 genów [15, 23, 24]. 17 Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska Rys. 5. Synteza 1,25(OH)2D3 i molekularny mechanizm działania (zmod. [24]) 2.4. Witamina D i gospodarka wapniowo-fosforanowa Szeroko znaną, często intuicyjnie wymienianą funkcją witaminy D jest jej wpływ na regulację homeostazy mineralnej w organizmie. I faktycznie witamina D to zwiększa efektywność jelitowej absorpcji jonów wapnia (Ca2+) oraz fosforanów (PO43-), w celu utrzymania kalcemii w wąskich granicach normy (2,2-2,6 mmol/l albo 9,0-10,5 mg/l), do czego niezbędny jest również współudział PTH i kalcytoniny. 1,25(OH) 2D zwiększa przenikalność wapnia do wnętrza enterocytu, zwiększa szybkość przepływu Ca2+ przez cytozol komórki,a także jego translokację do układu krążenia. W intensyfikacji transportu fosforanów ważną rolę odgrywa zależny od „słonecznej witaminy”co-transporter sodowo-fosforanowy. Jednocześnie znaczna część jonów PO43- przemieszcza się z jelita do krwi w sposób niezwiązany z witaminą D [15]. 18 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów Witamina D jest niezbędna dla zapewnienia prawidłowej mineralizacji kości – czyni to właśnie poprzez zapewnienie odpowiedniego poziomu jonów Ca2+ i PO43- we krwi. Wapń osoczowy występuje w dwóch odmianach: w 40% w formie nierozpuszczalnej – związanej z białkami osocza i w około 50% w postaci rozpuszczalnej (przesączalnej), która prawie w całości jest zjonizowana – tylko ta frakcja wykazuje aktywność fizjologiczną (jest to około 50% całkowitej puli wapnia w osoczu). Wapń w każdym momencie może być pobierany z rezerwuaru kostnego, dzięki czemu organizm jest niezależny od zmiennej podaży w przyjmowanym pokarmie. U dorosłego człowieka uwalnia się około 500 mg wapnia w ciągu doby i równocześnie tyle samo pierwiastka odkłada się w formie kryształów hydroksyapatytów w nowotworzonych beleczkach kostnych. Jednym z czynników pobudzających wytwarzanie przez osteoblasty kolagenu, na którym odkładają się powstające cząsteczki hydroksyapatytów o wzorze 3Ca3(PO4)2•Ca(OH)2, jest również 1,25(OH)2D. Jednakże w obecności podwyższonego poziomu PTH aktywna forma witaminy D aktywuje osteoblasty do produkowania limfokin o różnej funkcji – część z nich stymuluje osteoklasty do wzmożonej resorpcji kości, pozostałe powodują fuzję prekursorów osteoklastów i tworzenie dojrzałych form komórek kościogubnych. W efekcie nasilonej resorpcji kości dochodzi do podwyższenia stężenia wapnia i fosforanów w układzie krążenia. Nerka jest kolejnym narządem biorącym udział w regulacji gospodarki mineralnej organizmu. Wyprodukowana w komórkach kanalików nerkowych (na skutek działania PTH) 1,25(OH)2D hamuje swoją własną syntezę i aktywuje 24-hydroksylazę, wynikiem czego jest wzmożona produkcja 24,25(OH)2D. [15] W utrzymaniu homeostazy mineralnej w organizmie istotną rolę odgrywają też przytarczyce. Gruczoły te zawierają VDR – za jego pośrednictwem aktywna forma witaminy D hamuje syntezę i wydzielanie PTH, którego produkcja wzrasta w przypadku obniżenia poziomu wapnia w układzie krążenia. Zatem hipowitaminoza D powoduje zmniejszenie absorpcji wapnia z przewodu pokarmowego i następczą hipokalcemię. Ta zaś odpowiedzialna jest za wywołanie wtórnej nadczynności przytarczyc. Wobec tego zarówno nadczynność gruczołów przytarczycznych, jak i deficyt 1,25(OH)2D leżą u podstaw zwiększenia nerkowego klirensu fosforanowego oraz nadmiernie nasilonej demineralizacji kości [15]. 19 Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska 2.5. Witamina D w leczeniu nowotworów W 1981 roku Colston i współ. Pokazali, że kalcytriol hamował wzrost złośliwych komórek czerniaka [25]. Abe i inni wykazali, że kalcytriol powoduje różnicowanie komórek ostrej białaczki szpikowej HL60 w kierunku makrofagów [26, 27]. Od tego czasu w ośrodkach naukowych na świecie trwają intensywne badania nad przeciwnowotworowym działaniem witaminy D, zarówno in vitro, jaki i in vivo na różnych modelach. Wykazana różnorodna aktywność witaminy D może wynikać z wpływu jej aktywnej formy na transkrypcję wielu genów, które pośredniczą w procesach nowotworowych. Wykazano, że kalcytriol reguluje specyficzne ścieżki sygnałowe w tkankach piersi, okrężnicy oraz gruczołu krokowego. Działanie witaminy D w komórkach raka jelita grubego hamuje szlak β-kateniny, a tym samym przeciwdziała nieprawidłowej aktywacji ścieżki Wnt β-kateniny, która to ścieżka jest aktywna podczas rozwoju procesu nowotworowego jelita [28]. Efekty witaminy D w zmniejszeniu ryzyka zachorowania na raka badano często na przykładzie raka jelita grubego, który jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów w Europie i USA. W 2005 roku zbadano zależność między spożyciem witaminy D, jej poziomem w surowicy i rakiem jelita grubego. U osób przyjmujących codziennie witaminę D w ilości przynajmniej 1000 IU lub u których poziom tej witaminy w surowicy wynosił 33 ng/ml, stwierdzono 50% mniejsze ryzyko raka odbytnicy [29]. Badacze przeanalizowali także kilka czynników żywieniowych w stosunku do nawrotu polipów w okrężnicy, które mogą być zwiastunem raka jelita grubego. Niskie spożycie wapnia i witaminy D było powiązane ze zwiększonym ryzykiem nawrotu choroby. Przeprowadzone próby kliniczne sugerują, że witamina D i jej analogi mogą być przyszłością w terapii różnych nowotworów. Uważa się, że aktywna forma witaminy D m.in. promuje różnicowanie i hamowanie proliferacji, inwazyjności i przerzutów ludzkiego raka prostaty. W jednym z badań sprawdzana była zależność pomiędzy ekspozycją na słońce a zapadalnością na raka prostaty. Porównując grupę 450 mężczyzn ze zdiagnozowanym rakiem prostaty (stadium zaawansowane) z tak samo liczebną grupą zdrowych mężczyzn, okazało się, że osoby, u których obserwowano dostatecznie wysoką ekspozycją na słońce, były o 50% mniej narażone na raka prostaty niż mężczyźni z niską ekspozycją na słońce. Naukowcy uważają, że promieniowanie słoneczne pomaga chronić mężczyzn przed rakiem prostaty poprzez promowanie skórnej syntezy witaminy D. Pomimo związku pomiędzy 20 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów ekspozycją na słońce i niektórymi nowotworami skóry, naukowcy zauważają, że „zwiększenie spożycia witaminy D z diety i suplementów może być najbezpieczniejszym rozwiązaniem w celu osiągnięcia odpowiedniego poziomu witaminy D” [30]. Działanie analogów kalcytriolu polegające na hamowaniu wzrostu nowotworów badano szeroko na modelach zwierzęcych. Naukowcy chcieli w ten sposób ocenić efekty in vivo, a także monitorować poziom wapnia. Dane z różnych zwierzęcych modelów raka pokazały że suplementacja witaminą D i jej analogami istotnie zmniejsza tempo wzrostu nowotworów. Myszy pozbawione receptora witaminy D (VDR) są bardziej podatne na rozwój indukowanego nowotworu. Badania te wykazały, że obecność VDR jest niezbędna w obliczu rakotwórczych czynników stresogennych. 2.6. Witamina D i cukrzyca Witamina D odgrywa też rolę w cukrzycy. Już w 1980 roku dowiedziono, że niedobór witaminy D hamuje wydzielanie trzustkowe i gospodarkę insuliną, powodując upośledzoną tolerancję glukozy. Stwierdzono istnienie korelacji pomiędzy niskim promieniowaniem UVB, a częsty występowaniem cukrzycy typu 1. W regionach, gdzie stopień tego promieniowania jest duży występowanie cukrzycy 1 jest zdecydowanie niższe [31]. 2.7. Witamina D i stwardnienie rozsiane Stwardnienie rozsiane (SM) jest chorobą autoimmunologiczną, w której następuje infiltracja komórek układu odpornościowego do układu nerwowego i stopniowe niszczenie osłonki mielinowej. Wyniki przeprowadzonych analiz jednoznacznie wskazały na związek pomiędzy czasem ekspozycji na promienie słoneczne (szczególnie w okresie dzieciństwa) a ryzykiem rozwoju stwardnienia rozsianego. Prawdopodobieństwo zachorowania na SM jest większe, gdy w wieku dziecięcym czas ekspozycji na słońce był ograniczony. Powyższy wniosek został sformułowały na podstawie wyników badania przeprowadzonego wśród chorych na SM i w grupie kontrolnej [32]. Poziom witaminy D u kobiet ciężarnych jest ważnym aspektem. Parametr ten jest szczególnie istotny dla ciężarnych, u których zdiagnozowano stwardnienie rozsiane. Pomiar witaminy D w tej grupie kobiet jednoznacznie pokazał, iż u 73% badanych występowały bardzo duże niedobory tej witaminy. Opisane zagadnienie z pewnością wymaga kolejnych badań [32]. 21 Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska 2.8. Oznaczenie witaminy D we krwi Podstawowym metabolitem witaminy D jest 25(OH)D. Oznaczenie jego stężenia najdoskonalej pozwala ocenić stan zaopatrzenia organizmu w witaminę D pochodzącą zarówno z diety, jak i zsyntetyzowanej w skórze. Okres półtrwania 25(OH)D w porównaniu z innymi metabolitami jest długi i wynosi około 21 dni. Jednocześnie 25(OH)D występuje w najwyższym stężeniu (w zależności od autora w granicach 20-80 ng/ml) spośród pozostałych form (np. okres półtrwania 1,25(OH)2D to 1-7 godzin, stężenie 0,034 ng/ml) i znacząco koreluje z wieloma klinicznymi parametrami tkanki kostnej np. BMD [33, 34]. Należy mieć na uwadze istnienie jednostek chorobowych, w których powinno się oznaczać poziom 1,25(OH)2D zamiast 25(OH)D lub oba związki. Przykładem jest niewydolność nerek – w wyniku zmniejszenia filtracji kłębuszkowej dochodzi do upośledzenia nerkowej produkcji 1-α-hydroksylazy i spadku stężenia 1,25(OH)2D przy jednocześnie wysokim stężeniu 25(OH)D. Przeciwnie dzieje się w przypadku sarkoidozy lub gruźlicy, w których dochodzi do nadmiernej pozanerkowej 1-α-hydroksylacji witaminy D w makrofagach i ziarniniakach, w wyniku czego rozwija się hiperkalcemia [15, 20]. 2.9. Zalecenia dotyczące profilaktyki niedoborów witaminy D Zapotrzebowanie na witaminę D jest różne w zależności od wieku i pory roku. Obowiązkowo należy suplementować dietę niemowląt, dla których do 6 miesiąca nie jest wskazana bezpośrednia ekspozycja na słońce. Osobom powyżej 65 roku także zaleca się suplementację. Wynika to głównie z faktu zmniejszonej u nich zdolności syntezy skórnej. Ponadto seniorzy stosunkowo rzadziej przebywają na świeżym powietrzu. Ostatnie wytyczne dotyczące profilaktyki niedoborów witaminy D wskazują, iż jej suplementacja u zdrowych osób dorosłych powinna być prowadzona w miesiącach od września do kwietnia, a dawka dobowa powinna wynosić 800 – 2000 IU (Tabela 3). Takie działanie zapewnienia w surowicy krwi poziom 25(OH)D powyżej 30 ng/ml, czyli poziom optymalny Stężenie nie powinno spadać poniżej 20 ng/ml [7, 14]. 22 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów Tabela 3. Zalecenia suplementacji witaminy D dotyczące osób zdrowych [7] Grupa docelowa Rekomendacje Noworodki i niemowlęta (0-12 miesięcy) Suplementacja od pierwszych dni życia, niezależnie od sposobu żywienia dziecka (karmienie piersią czy mlekiem modyfikowanym) w dawce: * 400 IU/dobę do 6. Miesiąca życia * 400-600 IU/dobę między 6. A 12. Miesiącem życia w zależności od podaży witaminy D w diecie Dzieci i młodzież (1-18 lat) 600-1000 IU/dobę (zależnie od masy ciała) w miesiącach wrzesień-kwiecień lub przez cały rok, jeśli nie jest zapewniona efektywna skórna synteza witaminy D w miesiącach letnich. Dorośli (18-65 lat) 800-2000 IU/dobę (w zależności od masy ciała) w miesiącach wrzesień-kwiecień lub przez cały rok, jeśli nie jest zapewniona efektywna skórna synteza witaminy D w miesiącach letnich. Seniorzy (>65 lat) 800-2000 IU/dobę (w zależności od masy ciała) przez cały rok, ze względu na obniżoną efektywność skórnej syntezy witaminy D. Osobne rekomendacje dotyczą dzieci przedwcześnie urodzonych, kobiet ciężarnych i karmiących piersią, osób otyłych, mających ciemną karnację oraz pracujących w nocy. 3. Podsumowanie W artykule przedstawiona została charakterystyka działania witaminy D. Racjonalna ekspozycja na promieniowanie słoneczne powinna zapewnić efektywną produkcję związku w wyniku syntezy skórnej. Grupą wiekową charakteryzującą się optymalnymi stężeniami witaminy D w organizmie są niemowlęta do około 6 miesiąca życia. Jest to efekt odpowiedzialnego prowadzenia przez rodziców i służby zdrowia profilaktyki przeciwkrzywiczej polegającej na regularnej suplementacji tej substancji. Wraz z wiekiem rośnie odsetek osób z niedoborem witaminy D. W ostatnich latach obserwowany jest wzrost liczby doniesień naukowych istotnych dla rozumienia wpływu hipowitaminozy D na zdrowie człowieka. Coraz więcej wiemy na temat syntezy skórnej, metabolizmu i mechanizmu działania witaminy D, co zostało opisane w niniejszej pracy. Należy podkreślić, że niedobory witaminy D mają negatywny wpływ na funkcjonowanie układu mięśniowo-szkieletowego, ale ponadto mogą leżeć u podłoża cukrzycy typu I i stwardnienia 23 Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska rozsianego. Witamina D i jej analogi wykazały również aktywność przeciwnowotworową głównie w modelach in vitro. Niezwykle ważne jest prowadzenie akcji sprzyjających lepszemu poznaniu szerokich wpływów tej witaminy na zdrowie przez społeczeństwo oraz nieustawanie w badaniach nad skutkami działania witaminy D. Literatura 1. Anderson J.L., May H.T., Horne B.D., Bair T.L., Hall N.L., Carlquist J.F., Lappé D.L., Muhlestein J.B., Intermountain Heart Collaborative (IHC) Study Group, Relation of vitamin D deficiency to cardiovascular risk factors, disease status, and incident events in a general healthcare population. Am J Cardiol, 2010. 106: p. 963-968 2. Holick M.F., Vitamin D deficiency. N Engl J Med, 2007. 357(3): p. 266-281 3. Mitri, J., Muraru, M.D., Pittas, A.G., Vitamin D and type 2 diabetes: a systematic review. Eur J Clin Nutr, 2011. 65: p. 1005-1015 4. Zittermann A., Vitamin D and disease prevention with special reference to cardiovascular disease. Prog Biophys Mol Biol, 2006. 92(1): p. 39-48 5. Sajkowska J.J., Paradowska K., Multiple activities of vitamin D. Biul. Wydz. Farm. WUM, 2014. 1: p. 1-6 6. Pludowski P., Jaworski M., Niemirska A., Litwin M., Szalecki M., Karczmarewicz E., Michalkiewicz J., Vitamin D status, body composition and hypertensive target organ damage in primary hypertension. J Steroid Biochem Mol Biol, 2014. 144 Pt A: p. 180-184 7. Pludowski P., et al., Practical guidelines for the supplementation of vitamin D and the treatment of deficits in Central Europe - recommended vitamin D intakes in the general population and groups at risk of vitamin D deficiency. Endokrynol Pol, 2013. 64(4): p. 319-27 8. Grant W.B., A review of the evidence regarding the solar ultraviolet-B– vitamin D–cancer hypothesis. Standardy Med, 2012. 9: p. 610-619 9. Grant W.B., Relation between prediagnostic serum 25-hydroxyvitamin D level and incidence of breast, colorectal, and other cancers. J Photochem Photobiol B: Biol, 2010. 101: p. 130-136 10. Wang L., Song Y., Manson J.E., Pilz S., März W., Michaëlsson K., Lundqvist A., Jassal, S.K., Barrett-Connor, E., Zhang, C., Eaton, C.B., May, H.T., Anderson, J.L., Sesso, H.D., Circulating 25-hydroxy-vitamin D and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of prospective studies. Circ Cardiovasc Qual Outcomes, 2012. 1(5): p. 819-829 11. Pittas A.G., Nelson J., Mitri J., Hillmann W., Garganta C., Nathan D. M., Hu F. B., Dawson-Hughes B., Plasma 25-hydroxyvitamin D and progression to diabetes in patients at risk for diabetes: an ancillary analysis in the Diabetes Prevention Program. Diabetes Care, 2012. 35(3): p. 565-573 12. Slinin Y., Paudel M., Taylor B.C., Ishani A., Rossom R., Yaffe, K., Blackwell T., Lui L. Y., Hochberg M., Ensrud K. E., Association between serum 25(OH) vitamin D and the risk of cognitive decline in older women. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 2012. 67(10): p. 1092-1098 24 Aktualny stan wiedzy dotyczący witaminy D i jej niedoborów 13. Sabetta J.R., DePetrillo P., Cipriani R. J., Smardin J., Burns L. A., Landry M. L., Serum 25-hydroxyvitamin d and the incidence of acute viral respiratory tract infections in healthy adults. PLoS One, 2010. 5(6): p. e11088 14. Marcinowska-Suchowierska E., Walicka M., Tałałaj M., Horst-Sikorska W., Ignaszak-Szczepaniak M., Sewerynek E., Vitamin D supplementation in adults - guidelines. Endokrynol Pol, 2010. 61(6): p. 723-729 15. Karczmarewicz E., Łukaszkiewicz J., Lorenc R., Vitamin D - metabolism, action, requirements and treatment strategies. Standardy Med., 2007. 4: p. 137-142 16. Lukaszkiewicz J., Ryzko J., Socha J., Lorenc R. S., Endogenous, cutaneous vitamin D synthesis stimulation as an effective way of improving the vitamin D status in children with hepatobiliary malfunctions. Digestion, 1989. 42(3): p. 158-162 17. Dueland S., Pedersen J. I., Helgerud P., Drevon C. A., Absorption, distribution, and transport of vitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D3 in the rat. Am J Physiol, 1983. 245(5 Pt 1): p. E463-467 18. Jones G., Expanding role for vitamin D in chronic kidney disease: importance of blood 25-OH-D levels and extra-renal 1alpha-hydroxylase in the classical and nonclassical actions of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D(3). Semin Dial, 2007. 20(4): p. 316-324 19. Zimmerli R.C. Forever Young Skin Care System. 2000 20. Dusso A.S., Brown A. J., Slatopolsky E., Vitamin D. Am J Physiol Renal Physiol, 2005. 289(1): p. F8-28 21. Webb A.R., Holick M. F., The role of sunlight in the cutaneous production of vitamin D3. Annu Rev Nutr, 1988. 8: p. 375-399 22. Holick M.F., McCary L.C., DeLuca H.F., Vitamin D: Physiology, Molecular Biology and Clinical Applications. 1999: Humana Press 23. Rochel N., Wurtz J. M., Mitschler A., Klaholz B., Moras D., The crystal structure of the nuclear receptor for vitamin D bound to its natural ligand. Mol Cell, 2000. 5(1): p. 173-179 24. Malloy P.J., Pike J. W., Feldman D., The vitamin D receptor and the syndrome of hereditary 1,25-dihydroxyvitamin D-resistant rickets. Endocr Rev, 1999. 20(2): p. 156-188 25. Colston K., Colston M. J., Feldman D., 1,25-dihydroxyvitamin D3 andmalignant melanoma: the presence of receptors and inhibition of cell growth in culture. Endocrinology, 1981. 108(3): p. 1083-1086 26. Abe E., Miyaura C., Sakagami H., Takeda M., Konno K., Yamazaki T., Yoshiki S., Suda T., Differentiation of mouse myeloid leukemia cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981. 78(8): p. 4990-4994 27. Krishnan A.V., Feldman D., Molecular pathways mediating the antiinflammatory effects of calcitriol: implications for prostate cancer chemoprevention and treatment. Endocr Relat Cancer, 2010. 17(1): p. R19-38 28. Feldman D., Krishnan A. V., Swami S., Giovannucci E., Feldman B. J., The role of vitamin D in reducing cancer risk and progression. Nat Rev Cancer, 2014. 14(5): p. 342-357 25 Joanna J. Sajkowska , Paweł Kozielewicz , Katarzyna Paradowska 29. Gorham E.D., Garland C. F., Garland F. C., Grant W. B., Mohr S. B., Lipkin M., Newmark H. L., Giovannucci E., Wei M., Holick M. F., Optimal vitamin D status for colorectal cancer prevention: a quantitative meta analysis. Am J Prev Med, 2007. 32(3): p. 210-216 30. John E.M., Schwartz G. G., Koo J., Van Den Berg D., Ingles S. A., Sun exposure, vitamin D receptor gene polymorphisms, and risk of advanced prostate cancer. Cancer Res, 2005. 65(12): p. 5470-5479 31. Mathieu C., Gysemans C., Vitamin D and cancer. Av Diabetol., 2006. 22(3): p. 187-193 32. Schmitz K., Barthelmes J., Stolz L., Beyer S., Diehl O., Tegeder I., "Disease modifying nutricals" for multiple sclerosis. Pharmacol Ther, 2014 33. Szechinski J., Aktywbe postaci witaminy D3 i ich funkcja w leczeniu różnych schorzeń. Swiat Med. i Farm., 2007: p. 23-27 34. Napiórkowska L., Franek E., Rola oznaczania witaminy D w praktyce klinicznej. Chor. Serca Naczyn., 2009. 6(4): p. 203-210 Current state of knowledge about vitamin D and its deficiency Abstract The data published in recent years have suggested that vitamin D deficiency not only has a negative effect on the musculoskeletal system but can also be a factor in many diseases including cardiovascular and autoimmune disorders, several types of cancer, type 1 diabetes and mental disorders. The determination of vitamin D serum levels is not performed routinely. Moreover, public awareness about this molecule is insufficient. It seems that the actions taken by the scientific community should lead to a better understanding how vitamin D works. 26 Jerzy Potyka1, Jakub Rok2, Elektra Sliupkas-Dyrda1 Antynowotworowe właściwości witaminy D3 Witaminę D tworzy grupa związków sekosteroidowych, zwanych kalcyferolami. Istotne znaczenie mają tu: witamina D2 (ergokalcyferol) oraz powstająca w organizmach zwierząt i ludzi witamina D3 (cholekalcyferol). Sam cholekalcyferol nie posiada żadnej aktywności biologicznej i aby mógł skutecznie działać na tkanki i narządy docelowe, ulega przemianie do postaci aktywnej – kalcytriolu (1,25-dihydroksycholekalcyferol, 1,25-(OH)2D3). Najbardziej jest on znany z wpływu na różnicowanie i specjalizację komórek tkanki kostnej, prawidłowy rozwój kośćca u małych dzieci jak również za prawidłową jego budowę i funkcjonowanie u osób dorosłych. Kalcytriol i jego pochodne mogą też wpływać bezpośrednio lub pośrednio na funkcjonowanie komórek niezwiązanych z gospodarką wapniowo – fosforanową. Dzięki obecności w komórkach 1α-hydroksylazy oraz receptorów witaminy D (VDR), powstały 1,25-(OH)2D3 może regulować ich cykl komórkowy, proliferację, apoptozę i różnicowanie oraz ekspresję cytokin, czynników wzrostu, enzymów i hormonów. To wielokierunkowe działanie budzi ogromne zainteresowanie w aspekcie terapii nowotworów. Wskazuje się tu między innymi na wzrost ekspresji genów kodujących inhibitory kinazy zależnej od cyklin – CDK2: CDKN1A (koduje białko p21/WAF1/CIP1) i CDKN1B (koduje białko p27/KIP1) oraz represję genów kodujących cykliny: D1, D3, A1 i E1, wpływ na poziom białka p53, p73 czy GADD45γ. Kalcytriol może też hamować wzrost komórek poprzez wpływ na ścieżki sygnałowe związane z kinazami: ERK 1/2, Akt oraz MEKK-1. Badania prowadzone na różnych liniach nowotworowych (gruczolakorak piersi, glejak, czerniak) potwierdzają cyt otoksyczne i antyproliferacyjne działanie kalcitriolu oraz wpływ na ekspresję TP53 i stosunek ilościowy produktów ekspresji genu BAX i BCL-2 w badanych komórkach. Zmiany ekspresji BCL-2 i BAX mogą prowadzić do uwolnienia z mitochondriów białek aktywujących wewnętrzny szlak apoptozy. Do indukcji apoptozy może tu też prowadzić destabilizacja mRNA odwrotnej transkryptazy telomerazy TERT (telomerase reverse transcriptase) wywołana obecnością 1,25-(OH)2D3. 1 [email protected], Zakład Biologii Komórki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 2 Katedra i Zakład Chemii i Analizy Leków, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 27 Jerzy Potyka, Jakub Rok, Elektra Sliupkas-Dyrda 1. Witamina D3 Witamina D3 (cholekalcyferol) to naturalnie występujący w organizmach zwierzęcych związek należący do sekosteroidów. Syntetyzowany jest pod wpływem promieniowania UV z 7-dehydrocholesterolu obecnego w skórze. Sam cholekalcyferol nie posiada żadnej aktywności biologicznej i aby mógł skutecznie działać na tkanki i narządy docelowe, musi ulec przemianie do postaci aktywnej [1]. Aktywacja ta polega na dwustopniowej hydroksylacji. W pierwszym etapie, przy udziale 25-hydroksylazy – enzymu monooksygenazy zależnej od cytochromu P-450 – powstaje 25-hydroksycholekalcyferol (kalcydiol) (reakcja zachodząca głównie w komórkach wątroby i w mniejszym stopniu w skórze, jelitach oraz nerkach). Następnie przy udziale 1α-hydroksylazy 25-hydroksywitaminy D3 (monooksygenaza 1-kalcydiolowa) – enzymu zlokalizowanego w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, należącego do rodziny cytochromów P-450 – CYP1α (CYP27B1) – powstaje 1α,25-dihydroksycholekalcyferol (1,25(OH)2-D3, kalcytriol) [2]. Jest to najbardziej aktywny naturalny metabolit witaminy D. Powstały aktywny metabolit odpowiada za prawidłowe różnicowanie i specjalizację komórek tkanki kostnej, prawidłowy rozwój kośćca u małych dzieci jak również za prawidłową jego budowę i funkcjonowanie u osób dorosłych i w podeszłym wieku [3]. Niski poziom aktywnej formy witaminy D3 powoduje zniekształcenie i osłabienie kości oraz ich wykrzywianie się pod wpływem ciężaru ciała szybko rosnącego dziecka. Kości i nadgarstki stają się powiększone, klatka piersiowa zaczyna przypominać pierś gołębia, u dzieci powstają opóźnienia we wzroście zębów. Dziecko częściej poci się i staje się nadpobudliwe. U osób dorosłych zaburzona gospodarka wapniowo-fosforanowa oraz związane z tym nieprawidłowości w modelowaniu i mineralizacji kości skutkują osteomalacją i nasilonym postępowaniem osteoporozy [4]. 2. Mechanizm działania witaminy D3 Witamina D3 może się łączyć z receptorami błonowymi, wywołując szybką odpowiedź, jednak głównie oddziałuje na komórki poprzez receptor wewnątrzkomórkowy VDR (vitamin D receptor), który należy do nadrodziny receptorów jądrowych zależnych od ligandów, tzn. działających jak aktywowane przez ligand białkowe czynniki transkrypcyjne [3]. Receptor ten reguluje ekspresję genów zaangażowanych w gospodarkę wapniowo-fosforanową w komórkach tkanki kostnej, nabłonka jelit, kanalików nerkowych i przytarczyc, ale znajduje się również w wielu innych komórkach nie powiązanych bezpośrednio z gospodarką mineralną organizmu. Znaczne ilości tych receptorów odkryto 28 Antynowotworowe właściwości witaminy D3 w komórkach należących do różnych linii komórek nowotworowych [5, 6, 7]. Fakt ten wydaje się bardzo istotny, ze względu na możliwość wykorzystania witaminy D do regulacji ekspresji genów w tych komórkach. Obecnie największe zainteresowanie spośród nieklasycznych działań witaminy D3 wzbudza aktywność przeciwnowotworowa oraz możliwość modulacji funkcjonowania układu immunologicznego. Powinowactwo liganda do VDR zależy od typu komórki, w której receptor się znajduje. Za wiązanie liganda odpowiedzialna jest domena wiążąca ligand LBD (ligand binding domain) na końcu karboksylowym receptora [8]. Kluczowym elementem cząsteczki witaminy D3 odpowiedzialnym za przyłączenie do VDR jest pierścień A, zawierający grupę hydroksylową w pozycji 1α. Przyłączenie się liganda skutkuje przemieszczeniem VDR z cytoplazmy do wnętrza jądra komórkowego. W odpowiedzi na ligand, VDR ulega fosforylacji przez kinazy, która może wpłynąć zarówno pozytywnie jak i negatywnie na aktywację VDR [9]. Do genów aktywowanych przez kalcytriol zalicza się CYP24A1 (gen kodujący enzym katabolizujący witaminę D), BGLAP (koduje osteokalcynę), oraz geny białek stojących na straży cyklu komórkowego, takich jak p21 czy GADD45. Hamowanie ekspresji przez kalcytriol zaobserwowano w przypadku takich genów jak: PTH (koduje hormon przytarczyc) oraz CYP2B1 (koduje enzym przekształcający kalcydiol w kalcytriol) [10, 11]. Ligandy VDR hamują też ekspresję protoonkogenu MYC, genów cytokin IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ, a także genu receptora dla błonowego czynnika wzrostu EGFR (epidermal growth factor receptor). Produkty tych genów działają prozapalnie i pobudzają proliferację [12]. Opisano też wiele przypadków blokowania, bądź aktywacji protoonkogenów i genów supresorowych przez kalcytriol, ale tylko nieliczne z tych genów zawierają swoiste sekwencje DNA w obszarze promotorowym, do których przyłącza się VDR tzw. VDRE (vitamin D response element), co sugeruje, że kalcytriol może wywoływać swoje działanie również inną drogą [10]. Wytłumaczeniem tego zjawiska w części przypadków może być wspominana wcześniej droga aktywacji receptora błonowego. Wykazano bowiem, że równolegle do wywoływania efektu komórkowego przez związanie z receptorem VDR, witamina D, w przeciągu kilku minut lub nawet sekund, może pobudzać różne szlaki wewnątrzkomórkowe. W ten sposób pobudzany jest ruch jonów wapnia, szybka aktywacja kinazy białkowej C (PKC), fosfataza zasadowa, 29iog, metabolizm fosfoinozytolu [9]. Tą drogą, przez wzrost stężenia wapnia w komórce może dojść do aktywacji MAPK (kinaza białkowa aktywowana mitogenami), nazywanej też ERK, odpowiedzialnej za wzrost komórki. MAPK może zwiększyć aktywność transkrypcyjną VDR [10]. 29 Jerzy Potyka, Jakub Rok, Elektra Sliupkas-Dyrda 3. Witamina D3 i nowotwory Niedobór witaminy D dotyka ok. 1 miliarda ludzi na świecie i jest spowodowany głównie niewystarczającą ekspozycją na światło słoneczne. W związku z wielokierunkowym działaniem witaminy D, jej niedobór wiąże się z niekorzystnym wpływem na większość tkanek i narządów, nie wykluczając zwiększonego ryzyka do występowania wielu chorób przewlekłych i nowotworów [13]. Już w 1941 roku Frank Apperly odnotował odwrotną zależność pomiędzy śmiertelnością z powodu nowotworów w Ameryce Północnej a ekspozycją na światło słoneczne. Z kolei w roku 1980 bracia Frank i Cedric Garland po raz pierwszy zasugerowali, że witamina D może pełnić ochronną rolę przed rakiem okrężnicy. Przeprowadzone przez nich badania wykazały większą śmiertelność z powodu tego nowotworu wśród populacji zamieszkujących obszary Stanów Zjednoczonych, na których w ciągu roku występuje mniejsza ekspozycja na światło słoneczne, a tym samym obniżony poziom witaminy D w organizmach ludzi. Późniejsze odkrycia wielokrotnie wykazały zależność pomiędzy odpowiednią ekspozycją na promieniowanie UV i właściwym poziomem witaminy D oraz niższym ryzykiem wystąpienia chorób nowotworowych. Obecnie istnieją dowody na ochronną rolę promieniowania UV w stosunku do zachorowalności na czerniaka, białaczkę złośliwą, raka płuc, jajników, mózgu, pęcherza moczowego, prostaty i trzustki [13]. Wykazano również odwrotną zależność pomiędzy stężeniem 25-(OH)D3 we krwi a ryzykiem wystąpienia raka piersi, jelita grubego i odbytu, prostaty, płuc oraz chłoniaków nieziarniczych [14, 15, 16, 17, 18]. Dane epidemiologiczne wskazujące na przeciwnowotworowe działanie witaminy D, skłaniały do przeprowadzenia prób klinicznych w kierunku zastosowania kalcytriolu i jego pochodnych w leczeniu i zapobieganiu chorób nowotworowych. Pierwsze takie badania odbyły się w latach dziewięćdziesiątych i obejmowały pacjentów z ostrą białaczką szpikową i zespołem mielodysplastycznym. Od tamtej pory kalcytriol był wykorzystywany w licznych badaniach, zarówno jako pojedynczy czynnik terapeutyczny i w skojarzeniu z innymi lekami przeciwnowotworowymi, jak np.: cisplatyna, karboplatyna, cytarabina, fludarabina doksorubicyna, docetaksel, paklitaksel, gefitinib i mitoksantron [6, 19, 20]. Aktywność przeciwnowotworowa witaminy D i jej pochodnych została także potwierdzona w licznych badaniach in vitro przeprowadzonych na hodowlach komórkowych. Mechanizm tego działania jest złożony. Ogólnie przyjmuje się, że związany jest przede wszystkim z wpływem na cykl komórkowy, proliferację, różnicowanie i apoptozę komórek nowotworowych oraz hamowaniem procesu angiogenezy w obrębie guza. 30 Antynowotworowe właściwości witaminy D3 Wymienione właściwości zależą głównie od aktywacji receptora VDR i regulacji za jego pośrednictwem ekspresji genów docelowych. 4. Działanie antyproliferacyjne Antyproliferacyjne działanie kalcytriolu związane jest z jego wpływem na poziom ekspresji genów kodujących białka regulujące przebieg cyklu komórkowego. Do takich białek należą m.in. cykliny, kinazy zależne od cyklin – CDK (cyklin-dependent protein kinases) oraz inhibitory tych kinaz – CKI (CDK inhibitors). Cykliny, CDK oraz CKI tworzą wspólnie układ kontrolujący cykl komórkowy. Cykliny są białkami, których poziom ekspresji w komórkach jest zależny od fazy cyklu komórkowego, co przekłada się na cykliczne zmiany ich stężenia. Same cykliny nie posiadają aktywności enzymatycznej; jednak łącząc się z kinazami CDK powodują ich aktywację. Aktywne kompleksy typu cyklina-kinaza CDK fosforylują i aktywują kolejne białka uczestniczące w regulacji cyklu komórkowego, co skutkuje przejściem komórek przez tzw. punkty kontrolne cyklu komórkowego i rozpoczęciem fazy S lub M. Jednym z elementów hamujących progresję cyklu komórkowego są inhibitory CDK, które łączą się z cyklinami, kinazami CDK lub kompleksami cyklina-CDK, doprowadzając do utraty ich aktywności. Badania przeprowadzone na ludzkich komórkach raka piersi MCF-7 poddanych działaniu kalcytriolu wykazały wzrost ekspresji genów kodujących inhibitory CDK2: CDKN1A (koduje białko p21/WAF1/CIP1) i CDKN1B (koduje białko p27/KIP1) oraz represję genów kodujących cykliny: D1, D3, A1 i E1. Indukujący wpływ kalcytriolu wykazano również w stosunku do ekspresji CDKN1A w ludzkich komórkach mielomonocytowych U937 (linia komórek białaczkowych) i raka prostaty LNCaP oraz CDKN1B w komórkach raka kolczystokomórkowego skóry (SCC, squamous cell carcinoma) oraz komórkach ludzkiej białaczki promielocytarnej HL-60 [17, 21, 22, 23, 24]. Taki profil działania 1,25-(OH)2D3 powoduje zahamowanie aktywności kinazy CDK2, co z kolei zapobiega fosforylacji białka RB. Nieufosforylowane białko RB wiąże czynnik transkrypcyjny E2F, który odpowiada za transkrypcję genów uczestniczących w replikacji materiału genetycznego. Utworzenie kompleksu RB-E2F uniemożliwia przyłączenie się E2F do DNA i progresję cyklu komórkowego – rozpoczęcie fazy S. Kalcytriol ponadto aktywuje ekspresję inhibitorów kinazy CDK4 – INK4, które są odpowiedzialne za zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G1 oraz hamuje ligazę ubikwitynową SKP2 (S-phase kinase-associated protein 2) kierującą CKI do proteasomów. 1,25-(OH)2D3 wykazuje także działanie represyjne w stosunku do ekspresji 31 Jerzy Potyka, Jakub Rok, Elektra Sliupkas-Dyrda genów syntazy tymidylanowej TYMS oraz kinazy tymidynowej TK1, przez co może również wpływać na proces replikacji DNA [22]. 5. Regulacja cyklu komórkowego Hamowanie przez kalcytriol cyklu komórkowego związane jest również z jego wpływem na poziom białka p53. Białko to jest fosfoproteiną jądrową, która funkcjonuje jako tzw. „strażnik genomu” i jest kodowana przez gen należący do grupy genów supresorowych nowotworu. Poziom aktywnego białka p53 wzrasta w komórce w odpowiedzi na uszkodzenia DNA, hipoksję lub zaburzenia szlaku sygnałowego RB. Białko p53 powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego w punkcie kontrolnym G1/S m.in. poprzez stymulację transkrypcji genu kodującego białko p21. Zahamowanie cyklu komórkowego pozwala na naprawę materiału genetycznego, a w przypadku gdy reperacja DNA nie jest możliwa, białko p53 kieruje komórkę na drogę apoptozy. Badania in vitro przeprowadzone na linii komórkowej MCF-7 wykazały zwiększony poziom białka p53 pod wpływem kalcytriolu [3]. 1,25-(OH)2D3 spowodował również wzrost stężenia białka p73 (homologu p53) w komórkach raka pęcherza moczowego (linia T74 i UMUC3) i kolczystokomórkowego skóry oraz białka GADD45γ (growth arrest and DNA damage-inducible gene gamma) w komórkach raka prostaty LNCaP [6, 25]. GADD45γ jest białkiem zależnym od p53. Jego ekspresja wzrasta pod wpływem działania czynników stresowych i uszkodzenia materiału genetycznego. GADD45γ należy do białek hamujących cykl komórkowy oraz stymulujących apoptozę. Mechanizm tego działania jest złożony i obejmuje pośrednictwo w aktywacji ścieżki kinazy p38/c-Jun, interakcję z jądrowym antygenem komórek proliferujących - PCNA (proliferating cell nuclear antygen) i p21/WAF1/CIP1 oraz hamowanie aktywności kompleksu cyklina B1-CDK1. Na skutek interakcji z PCNA i p21/WAF1/CIP1 białko GADD45γ uczestniczy w zatrzymaniu cyklu komórkowego w fazie G1. Z kolei inhibicja kompleksu cyklina B1-CDK1 prowadzi do zatrzymania cyklu w punkcie kontrolnym G2-M [25, 26]. W przypadku badanych komórek raka prostaty, w których doszło do ekspresji GADD45γ pod wpływem kalcytriolu, stwierdzono kumulację komórek będących w fazie G1 [25]. Kalcytriol może hamować wzrost komórek również poprzez wpływ na ścieżki sygnałowe związane z kinazami: ERK 1/2 (extracellular signalrelated kinase 1/2), Akt, znaną także jako kinaza białkowa B (PKB protein kinase B) oraz MEKK-1 (MEK kinase-1). Kinazy ERK 1/2 należą do grupy kinaz serynowo-treoninowych aktywowanych przez mitogen – MAPK (mitogen-activated protein kinases). W wyniku zewnątrz- 32 Antynowotworowe właściwości witaminy D3 komórkowej stymulacji, ulegają one fosforylacji przez kinazy MEK (mitogen-activated protein kinase kinase) do aktywnej formy P-ERK 1/2. W tej postaci przemieszczają się z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie aktywują czynniki transkrypcyjne stymulujące podziały komórkowe np.: c-Myc, c-Jun, c-Fos czy Ets [27]. Z kolei Akt to cytoplazmatyczna kinaza serynowo-treoninowa biorąca udział w regulacji ścieżek i mechanizmów związanych m.in. z przeżyciem i proliferacją komórek. Aktywna, ufosforylowana postać kinazy Akt działa stymulująco na cykl komórkowy. Hamuje ona ekspresję oraz fosforyluje inhibitory kinazy CDK2 – p27/KIP1 oraz p21/WAF1/CIP1, uniemożliwiając im translokację do jądra komórkowego. Kinaza Akt ponadto inaktywuje, poprzez fosforylację, kinazę GSK3 (glycogen synthase kinase 3), co z kolei zapobiega fosforylacji i inaktywacji cykliny D, cykliny E oraz czynników transkrypcyjnych c-Jun i c-Myc [28]. Przeprowadzone doświadczenia na komórkach poddanych działaniu kalcytriolu wykazały spadek ilości ufosforylowanej formy ERK 1/2 przy zachowaniu stałego poziomu ERK 1/2 oraz zahamowanie ekspresji i fosforylacji Akt. Inhibicja fosforylacji kinaz ERK 1/2 związana jest z proteolitycznym rozpadem kinaz MEK pod wpływem kaspaz [6, 20, 23, 29]. Kalcytriol może ponadto wpływać na poziom i aktywność kinazy MEKK-1. Kinaza ta ulega ekspresji i aktywacyjnej fosforylacji pod wpływem działania czynników stresu komórkowego oraz czynników genotoksycznych. Powstała aktywna forma MEKK-1 może następnie ulec proteolitycznemu rozpadowi pod wpływem kaspazy 3 do regulatorowej domeny N-końcowej oraz aktywnej katalitycznie domeny C-końcowej. Kinaza MEKK-1 uczestniczy w szlaku sygnalizacyjnym stresu komórkowego oraz prowadzi do aktywacji kinaz MAPK: kinazy c-Jun Nterminalnej – JNK (c-Jun N-terminal kinase) oraz p38 i stymulacji procesu apoptozy. Badania in vitro przeprowadzone na komórkach SCC wykazały zdolność kalcytriolu do indukcji ekspresji kinazy MEKK-1, dzięki czemu może przyczynić się do zahamowania cyklu komórkowego i uruchomienia mechanizmów programowanej śmierci komórki [6, 20, 30]. 6. Apoptoza Indukcja apoptozy jest jednym z głównych mechanizmów przeciwnowotworowego działania kalcytriolu i jego pochodnych. Apoptoza zwana inaczej programowaną lub samobójczą śmiercią komórki, jest fizjologicznym procesem zachodzącym w stanie prawidłowo funkcjonującego organizmu, który pozwala m.in. na eliminację starzejących się i patologicznie zmienionych komórek [3]. Proces apoptozy jest uruchamiany poprzez aktywację szlaku zależnego od mitochondriów (szlak wewnętrzny) 33 Jerzy Potyka, Jakub Rok, Elektra Sliupkas-Dyrda lub szlaku zależnego od tzw. receptorów śmierci z rodziny TNF (tumor necrosis factor) (szlak zewnętrzny). Oba wymienione szlaki prowadzą do aktywacji kaspaz, które z kolei są odpowiedzialne za proteolizę białek niezbędnych do właściwego funkcjonowania komórek [31]. Jednym z takich białek jest polimeraza poli-ADP-rybozy – PARP (poly-ADP-ribose polimerase) – enzym, który rozpoznaje i naprawia uszkodzenia DNA. Badania przeprowadzone na szczurzych komórkach raka prostaty wykazały zdolność kalcytriolu do indukcji rozkładu enzymu PARP. Procentowa wartość tego rozkładu wyniosła 90 – 100% przy zastosowaniu kalcytriolu w stężeniu 10 µmol/l, co stanowiło wartość IC50 [23]. Proteolityczną degradację PARP pod wpływem 1,25-(OH)2D3 wykazano także w przypadku badań z wykorzystaniem komórek SCC. Stwierdzono ponadto, że rozkład PARP może być jednym z mechanizmów odpowiedzialnych za zwiększenie wrażliwości SCC na działanie cisplatyny [6]. Apoptoza zależna od mitochondriów związana jest ze zwiększeniem przepuszczalności błon mitochondrialnych i uwolnieniem do cytoplazmy białek aktywujących kaskadę apoptotyczną np.: cytochromu c lub czynnika indukcji apoptozy AIF (apoptosis inducing factor). Przepuszczalność błony mitochondrialnej jest regulowana m.in. przez białka z rodziny BCL-2. Białka BCL-2 są produktami onkogenów, które regulują proces śmierci komórkowej. Do rodziny BCL-2 należą zarówno białka o działaniu proapoptotycznym, np.: BAX i BAK; oraz antyapoptotycznym, np.: BCL-2, BCL-XL i MCL-1 [32]. Podczas procesu apoptozy występujące w cytoplazmie białka proapoptotyczne zmieniają swoją konformację, a następnie wbudowują się do zewnętrznej błony mitochondrialnej. Tam ulegają oligomeryzacji oraz przyłączają się do kanałów anionowych zależnych od napięcia VDAC (voltage dependent anion channel) powodując uwolnienie białek indukujących apoptozę [31]. Z kolei białka antyapoptotyczne działają m.in. poprzez tworzenie z białkami proapoptotycznymi heterodimerów, co ogranicza ich zdolność do oligomeryzacji. Antyapoptotyczne białko BCL-2 może ponadto łączyć się z kanałami VDAC i zamykać ich światło [33]. Przeprowadzone badania wykazały hamujący wpływ kalcytriolu na ekspresję BCL-2 w przypadku komórek raka żołądka SNU1, przewodów żółciowych HuCCT, piersi MCF-7, prostaty ALVA-31 oraz białaczki promielocytarnej HL-60 [22, 34, 35]. Proapoptotyczne działanie kalcytriolu potwierdziła również indukcja ekspresji BAX w komórkach inwazyjnego raka sutka SUM-159PT [24] oraz BAX i BAK w przypadku raka prostaty oraz gruczolaka i raka jelita grubego [22]. Kalcytriol, wpływając przeciwstawnie na ekspresję BCL-2 i BAX, zmienia wzajemny stosunek ich ilości w komórkach na korzyść białka BAX, co w konsekwencji prowadzi do uwolnienia z mitochondriów białek aktywujących wewnętrzny szlak apoptozy. 34 Antynowotworowe właściwości witaminy D3 Badania z wykorzystaniem komórek raka trzustki Capan-1 wykazały ponadto zdolność 1,25-(OH)2D3 do aktywacji kaspazy 9 oraz znaczny wzrost aktywności kaspazy 8, 6, 9 i 3 w przypadku połączenia kalcytriolu i gemcytabiny [36]. Kolejny mechanizm działania kalcytriolu, który może prowadzić do apoptozy komórek nowotworowych, związany jest z odwrotną transkryptazą telomerazy TERT (telomerase reverse transcriptase). TERT jest białkiem kodowanym przez gen, którego ekspresja w komórkach ludzkich po urodzeniu zostaje zahamowana, co skutkuje inaktywacją telomerazy i skracaniem się telomerów po każdym podziale komórki, aż do momentu całkowitego zahamowania aktywności proliferacyjnej. Wyjątek od tej reguły stanowią komórki macierzyste i nowotworowe, posiadające aktywną telomerazę. Zastosowanie 1,25-(OH)2D3 w terapii komórek nabłonkowych raka jajnika spowodowało destabilizację mRNA TERT, co w konsekwencji doprowadziło do zahamowania aktywności telomerazy, skrócenia telomerów i indukcji apoptozy [37]. Z kolei w komórkach raka prostaty pod wpływem kalcytriolu i kwasu 9-cis-retinowego doszło do zahamowania ekspresji TERT w wyniku bezpośredniego oddziaływania heterodimeru receptorów VDR/RXR z promotorem tego genu, co w konsekwencji skutkowało spadkiem aktywności telomerazy [38]. Zdolność kalcytriolu do indukcji apoptozy komórek endotelialnych pozwala na ograniczenie tworzenia się nowych naczyń krwionośnych w obrębie tkanki nowotworowej, a co za tym idzie hamowanie wzrostu, inwazyjności i możliwości tworzenia przerzutów przez guz. Warto zaznaczyć, że tylko komórki endotelialne otrzymane z nowotworu – TDECs (tumor derived endothelial cells) podlegają takiemu działaniu. Ma to prawdopodobnie związek z ich większą wrażliwością na 1,25-(OH)2D3 z powodu epigenetycznego wyciszania genu dla CYP241A, odpowiedzialnego za przekształcenie kalcytriolu do 24-hydroksypochodnej o niskim poziomie aktywności biologicznej [22]. 7. Działanie antyangiogenne Mechanizm antyangiogennego działania kalcytriolu związany jest z jego wpływem na czynniki stymulujące tworzenie nowych naczyń krwionośnych: czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF (vascular endothelial growth factor) oraz interleukinę 8 (IL-8). Czynnik VEGF jest jednym z kluczowych regulatorów angiogenezy. W stosunku do komórek śródbłonka naczyniowego wykazuje działanie mitogenne oraz stymuluje ich migrację oraz elongację. Badania przeprowadzone przez Mantel i wsp. Wykazały zdolność kalcytriolu do hamowania elongacji oraz proliferacji komórek endotelialnych BAEC (bovine aortic endothelial cell) 35 Jerzy Potyka, Jakub Rok, Elektra Sliupkas-Dyrda stymulowanych VEGF. 1,25-(OH)2D3 hamował również formowanie się sieci wydłużonych komórek śródbłonka w żelu kolagenowym 3D. Antyangiogenne właściwości kalcytriolu zostały także potwierdzone w badaniach in vivo z wykorzystaniem myszy, którym wszczepiono komórki raka piersi MCF-7 oraz MDA-435S. Ośmiotygodniowa terapia kalcytriolem badanych zwierząt skutkowała mniejszą waskularyzacją guzów w porównaniu do grupy kontrolnej, która nie otrzymywała leku [39]. 8. Prozapalne działanie IL-8 jest chemokiną, która oprócz zdolności do rekrutacji i stymulacji przemieszczania się leukocytów do miejsca zapalenia, posiada m.in. właściwości pobudzające patologiczną angiogenezę, wzrost guzów nowotworowych i tworzenie przerzutów. Badania z wykorzystaniem normalnych (HPr-1, RWPE-1) oraz złośliwych androgenoniezależnych (PC-3, DU145 Pca) i androgenozależnych (LNCaP) komórek epitelialnych prostaty wykazały ich zdolność do ekspresji i wydzielania IL-8. Profil ekspresji był skorelowany ze stopniem agresywności badanych komórek: najwyższy poziom mRNA IL-8 odnotowano w przypadku komórek androgenoniezależnych [34]. Poddanie opisanych komórek działaniu kalcytriolu spowodowało w każdym przypadku obniżenie poziomu mRNA i białka IL-8. Mechanizm tego działania związany jest z blokowaniem translokacji do jądra komórkowego białka p65, które stanowi podjednostkę czynnika transkrypcyjnego NF-κB, odpowiedzialnego za ekspresję IL-8 [40]. 9. Podsumowanie Witamina D3 bierze udział w regulacji wielu procesów metabolicznych organizmu. Jej klasyczne działanie to wpływ na gospodarkę wapniowofosforanową organizmu. Doniesienia z ostatnich lat wskazują jednak również na istotny wpływ witaminy D3 i pochodnych na proliferację i dyferencjację komórek oraz modulację odpowiedzi immunologicznej. W świetle tych informacji związki te budzą ogromne nadzieje w aspekcie poszukiwań nowych leków antynowotworowych. 36 Antynowotworowe właściwości witaminy D3 Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Holick M.F. Vitamin D: a millennium perspective, J Cell Biochem., 88 (2003), pp. 296-307 Prosser E., Jones G. Enzymes involved in the activation and inactivation of vitamin D, Trends Biochem Sci., 29 (2004), pp. 664-673 Pełczyńska M., Jaroszewicz I., Świtalska M., Opolski A. Właściwości biologiczne kalcytriolu i jego nowych analogów – potencjalne zastosowania terapeutyczne, Postepy Hig Med Dosw., 59 (2005), pp. 129-139 Tukaj C. Właściwy poziom witaminy D warunkiem zachowania zdrowia, Postepy Hig Med Dosw., 62 (2008), pp. 502-510 Doroszko A., Gronowicz E., Niedzielska E. Cholekalcyferol a procesy wzrostu i różnicowania komórek - znaczenie w terapii onkologicznej, Onkol Pol., 1 (2008), pp. 15-18 Ma Y., Trump D.L., Johnson C.S. Vitamin D in combination cancer treatment, J Cancer., 1 (2010), pp. 101-107 Trump D.L., Muindi J., Fakih M., Yu W.D., Johnson C.S. Vitamin D compounds: clinical development as cancer therapy and prevention agents, Anticancer Res., 26 (2006), pp. 2551-2556 Kopij M., Rapak A. Rola receptorów jądrowych w procesie śmierci komórek, Postepy Hig Med Dosw., 62 (2008), pp. 571-581 Brown A.J. Mechanisms for the selective actions of vitamin D analogues, Curr Pharm Des., 6 (2000), pp. 701-716 Trump D.L., Deeb K.K., Johnson C.S. Vitamin D: considerations in the continued development as an agent for cancer prevention and therapy, Cancer J., 16 (2010), pp.1-9 Mathiasen I.S., Lademannm U., Jäättelä M.Apoptosis induced by vitamin D compounds in breast cancer cells is inhibited by Bcl-2 but does not involve known caspases or p53, Cancer Res., 59 (1999), pp. 4848-4856 Rostkowska−Nadolska B., Latocha M., Gawron W., Kutner A., Bochnia M. Badanie wpływu kalcitriolu i tacalcitolu na proliferację fibroblastów otrzymanych z polipów nosowych, Adv Clin Exp Med., 16 (2007), pp. 213-219 Arends J. Vitamin D in oncology, Forsch Komplementmed., 18 (2011), pp. 176-184 Molica S., Digiesi G., Antenucci A., Levato L., Mirabelli R., Molica M., Gentile M., Giannarelli D., Sperduti I., Morabito F., Conti L. Vitamin D insufficiency predicts time to first treatment (TFT) in early chronic lymphocytic leukemia (CLL), Leuk Res., 36 (2012), pp. 443-447 Swami S., Krishnan A.V., Feldman D. Vitamin D metabolism and action in the prostate: implications for health and disease, Mol Cell Endocrinol., 347 (2011), pp. 61-69 Yaghjyan L., Colditz G.A. , Drake B.Vitamin D and mammographic breast density: a systematic review, Cancer Causes Control., 23 (2012), pp. 1-13 Ramnath N., Kim S., Christensen P.J. Vitamin D and lung cancer, Expert Rev Respir Med., 5 (2011), pp. 305-309 37 Jerzy Potyka, Jakub Rok, Elektra Sliupkas-Dyrda 18. Lazzeroni M., Gandini S., Puntoni M., Bonanni B., Gennari A., DeCensi A. The science behind vitamins and natural compounds for breast cancer prevention. Getting the most prevention out of it, Breast., 20 (2011), pp. 36-41 19. Woloszynska-Read A., Johnson C.S., Trump D.L. Vitamin D and cancer: clinical aspects, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab., 25 (2011), pp. 605-615 20. Beer T.M. Development of weekly high-dose calcitriol based therapy for prostate cancer, Urol Oncol., 21 (2003), pp. 399-405 21. Zittermann A. Vitamin D in preventive medicine: are we ignoring the evidence?, Br J Nutr., 89 (2003), pp. 552-572 22. Deeb K.K., Trump D.L., Johnson C.S. Vitamin D signaling pathways in cancer: potential for anticancer therapeutics, Nat Rev Cancer., 7 (2007), pp. 684-700 23. Johnson C.S., Hershberger P.A., Bernardi R.J., McGuire T.F. , Trump D.L. Vitamin D receptor: a potential target for intervention, Urology., 60 (2002), pp. 123-130 24. Kuryłowicz A., Bednarczuk T., Nauman J. Wpływ niedoboru witaminy D na rozwój nowotworów i chorób autoimmunologicznych, Pol J Endocrinol., 58 (2007), pp. 140-152 25. Flores O., Burnstein K.L. GADD45gamma: a new vitamin D-regulated gene that is antiproliferative in prostate cancer cells, Endocrinology., 151 (2010), pp. 4654-4664 26. Liebermann D.A., Hoffman B. Gadd45 in stress signaling, J Mol Signal., (2008), pp. 3-15 27. Chang F., Steelman L.S., Lee J.T., Shelton J.G. , Navolanic P.M., Blalock W.L., Franklin R.A., McCubrey J.A. Signal transduction mediated by the Ras/Raf/MEK/ERK pathway from cytokine receptors totranscription factors: potential targeting for therapeutic intervention, Leukemia., 17 (2003), pp. 1263-1293 28. Mitsuuchi Y., Johnson S.W., Selvakumaran M., Williams S.J., Hamilton T.C., Testa J.R. The phosphatidylinositol 3-kinase/AKT signal transduction pathway plays a critical role in theexpression of p21WAF1/CIP1/SDI1 induced by cisplatin and paclitaxel, Cancer Res., 60 (2000), pp. 5390-5394 29. McGuire T.F., Trump D.L., Johnson C.S. Vitamin D(3)-induced apoptosis of murine squamous cell carcinoma cells. Selective induction of caspasedependent MEK cleavage and up-regulation of MEKK-1, J Biol Chem., 276 (2001), pp. 26365-26373 30. Hershberger P.A., McGuire T.F., Yu W.D., Zuhowski E.G., Schellens J.H., Egorin M.J., Trump D.L., Johnson C.S. Cisplatin potentiates 1,25-dihydroxyvitamin D3-induced apoptosis in association with increased mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 (MEKK-1) expression, Mol Cancer Ther., 1 (2002), pp. 821-829 31. Stańczyk M., Majsterek I. Apoptoza – cel ukierunkowanej terapii przeciwnowotworowej, Post Biol Kom., 35 (2008), pp. 467-484 38 Antynowotworowe właściwości witaminy D3 32. Rupniewska Z., Bojarska-Junak A. Apoptosis: mitochondrial membrane permeabilization and the role played by Bcl-2 family proteins, Postepy Hig Med Dośw., 58 (2004), pp. 538-547 33. Hordyjewska A., Pasternak K. Apoptotic death of the cell, Adv Clin Exp Med., 14 (2005), pp. 545-554 34. Baek S., Lee Y.S., Shim H., Yoon S., Baek S.Y., Kim B.S., Oh S.O. Vitamin D3 regulates cell viability in gastric cancer and cholangiocarcinoma, Anat Cell Biol., 44 (2011), pp. 204-209 35. Guzey M., Kitada S., Reed J.C. Apoptosis induction by 1alpha,25dihydroxyvitamin D3 in prostate cancer, Mol Cancer Ther., 1 (2002), pp. 667-677 36. Yu W.D., Ma Y., Flynn G., Muindi J.R., Kong R.X., Trump D.L., Johnson C.S. Calcitriol enhances gemcitabine anti-tumor activity in vitro and in vivo by promoting apoptosis in a human pancreatic carcinoma model system, Cell Cycle., 9 (2010), pp. 3022-3029 37. Jiang F., Bao J., Li P., Nicosia S.V. , Bai W. Induction of ovarian cancer cell apoptosis by 1,25-dihydroxyvitamin D3 through the down-regulation of telomerase, J Biol Chem., 279 (2004), pp. 53213-53221 38. Ikeda N., Uemura H., Ishiguro H., Hori M., Hosaka M., Kyo S., Miyamoto K., Takeda E., Kubota Y. Combination treatment with 1alpha,25dihydroxyvitamin D3 and 9-cis-retinoic acid directly inhibitshuman telomerase reverse transcriptase transcription in prostate cancer cells, Mol Cancer Ther., 2 (2003), pp. 739-746 39. Mantell D.J., Owens P.E., Bundred N.J., Mawer E.B., Canfield A.E. 1α,25dihydroxyvitamin D3 inhibits angiogenesis in vitro and in vivo, Circ Res., 87 (2000), pp. 214-220 40. Bao B.Y., Yao J., Lee Y.F. 1α,25-dihydroxyvitamin D3 suppresses interleukin 8 –mediated prostate cancer cell angiogenesis, Carcinogenesis., 27 (2006), pp. 1883-1893 Antitumor effect of the vitamin D3 Vitamin D is a group of seco-steroid compounds called calcitoferols. The most important here are: vitamin D2 (ergocalciferol) and resulting in the bodies of animals and humans, vitamin D3 (cholecalciferol). Cholecalciferol itself has no biological activity and to be able to act effectively on target tissues and organs, is converted to its active form - calcitriol (1,25-dihydroxycholecalciferol, 1,25 (OH) 2D3). It is the most known for its influence on the differentiation and specialization of bone tissue, normal skeletal development in young children as well as for the proper functioning of its construction and adults. Calcitriol and its derivatives may also directly or indirectly affect the functioning of cells unrelated to calcium-phosphate homeostasis. Due to the presence in the cells of 1αhydroxylase, and vitamin D receptors, VDR, the resulting 1,25 (OH) 2D3 can regulate the cell cycle, proliferation, differentiation and apoptosis and the expression of cytokines, growth factors, enzymes and hormones. This multidirectional action raises great interest in tumor therapy. Reference is made to increase the expression of genes encoding inhibitors of cyclin-dependent kinase CDK2: CDKN1A (encodes a protein p21/WAF1/CIP1) and CDKN1B (encodes a protein p27/KIP1) and the repression of the genes encoding cyclin D1, D3, A1, and E1, the influence on the protein levels of p53, p73 or GADD45γ. Calcitriol 39 Jerzy Potyka, Jakub Rok, Elektra Sliupkas-Dyrda may also inhibit cell growth by interfering with the signaling pathways associated with kinases: ERK 1/2, Akt and MEKK-1. Research conducted on different tumor lines (breast adenocarcinoma, glioblastoma, melanoma) confirm the cytotoxic and antiproliferative effects of calcitriol and the effect on the expression of TP53 and the ratio of the products of gene expression of BAX and BCL-2 in the test cells. Changes in the expression of BCL-2 and BAX may lead to the release of mitochondrial proteins internal activating the apoptotic pathway. To induce apoptosis can also be carried out by telomerase reverse transcriptase TERT mRNA destabilization caused by the presence of 1,25 (OH) 2D3. 40 Monika Pilecka1, Maciej Berbecki2, Katarzyna Wojewoda3 Receptor programowanej śmierci PD-1 jako potencjalny cel w terapii nowotworów Ciągle doskonalona o nowe doniesienia i przesłanki wiedza na temat molekularnych mechanizmów rządzących odpowiedzią immunologiczną ustroju na nowotwór prowadzi do identyfikacji „gorących punktów” (ang. checkpoint- punkt krytyczny) na ścieżkach sygnałowych zaangażowanych w ograniczanie immunologicznej odpowiedzi antynowotworowej ustroju. Jednym z rozpoznawanych jako najbardziej kluczowe punktem, odpowiedzialnym za pośredniczenie w powstawaniu indukowanej nowotworzeniem supresji układu immunologicznego, jest ścieżka receptora programowanej śmierci PD-1, która w warunkach prawidłowych odpowiada za tolerancję immunologiczną ustroju i zapobiega niszczeniu tkanek w warunkach przewlekłych zapaleń. Receptor programowanej śmierci PD-1 wykazuje nadmierną ekspresję w aktywowanych limfocytach T i hamuje funkcje tych limfocytów do momentu związania ze swoimi ligandami B7H1 (PD-L1) i B7-DC (PD-L2). Wiele nowotworów litych wykazuje ekspresję ligandu PD-1 (PD-L1) co często koreluje z gorszym rokowaniem. Limfocyty naciekające guz wyizolowane od pacjentów z nowotworem, który typowo wykazuje ekspresję PD-1 posiadają upośledzone mechanizmy antynowotworowe. Dowody takie płyną z analizy kilku badań przedklinicznych, w których blokada PD-1 lub PD-L1 poprawiały funkcje limfocytów T i podnosiły skuteczność lizy komórek nowotworu. Aktualnie trzy przeciwciała monoklonalne przeciwko PD-1 oraz jedno przeciw PD-L1 przeszły fazę pierwszą badań. Wszystkie cztery czynniki wykazują wstępnie obiecujące właściwości, a ewaluacja na szerszej grupie badanych przynosi zachęcające informacje odnośnie bezpieczeństwa leków. Jeśli kolejne doniesienia potwierdzą wstępne rezultaty, czynniki blokujące szlak PD1/PD-L1 staną się wartościową pozycją w arsenale leków immunoterapeutycznych w walce z nowotworami. 1 [email protected], Katedra i Zakład Gastroenterologii z Pracownią Endoskopową Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 2 [email protected], Staż podyplomowy Szpital MSW w Lublinie 3 [email protected], Katedra i Zakład Ortopedii i Traumatologii Narządu Ruchu Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 41 Monika Pilecka, Maciej Berbecki, Katarzyna Wojewoda 1. Wstęp Wraz z rosnącą liczbą zachorowań na nowotworowy złośliwe medycyna XXI wieku staje nie tylko przed problemem szybkiej i skutecznej diagnostyki ale również profilaktyki pierwotnej, wyłaniania grup o wysokim stopniu narażenia oraz poszukiwania nowoczesnych rozwiązań w leczeniu radykalnym i paliatywnym. Nowoczesna genetyka molekularna w walce z nowotworami analizuje różnorodne szlaki patogenetyczne, z których istotne znaczenie w onkogenezie okazują się mieć: cytokiny zapalne, infekcje, mutacje oraz wyłamywanie się spod nadzoru immunologicznego. Przykładami stanów przednowotworowych są min.: metaplazja Barretta, polipy jelita grubego, zespoły polipowatości rodzinnej, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych, choroba Leśniowskiego-Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, przewlekłe zapalenie trzustki. W wyżej wymienionych przypadkach nowoczesnym wymiarem profilaktyki byłaby identyfikacja molekularnego czynnika/-ów progresji stanów przedrakowych do nowotworu inwazyjnego, wyłonienie markera klinicznie użytecznego i wdrożenie skutecznej immunoterapii jeszcze przed diagnozą „carcinoma in situ”. Bowiem stosowane obecnie metody predykcji (markery, antygeny) nie są wystarczająco skuteczne dla określenia kierunku i dynamiki rozwoju takich zmian [8]. Ciągle doskonalona wiedza na temat molekularnych mechanizmów rządzących odpowiedzią organizmu na nowotwór prowadzi do identyfikacji „gorących punktów” sygnałowych na ścieżkach zaangażowanych w funkcjonowanie prawidłowej antynowotworowej odpowiedzi immunologicznej. Okazuje się, że kontrola rozwijającej się odpowiedzi immunologicznej jest niezwykle istotnym aspektem regulacji mechanizmów układu odpornościowego. Ta wysoce czuła i wielostopniowa selekcja umożliwia niszczenie obcych antygenów i jednocześnie tolerancję na antygeny własne. Wyróżnia się tolerancję centralną, dzięki której już w fazie dojrzewania eliminowane są komórki autoreaktywne oraz tolerancję obwodową, której podlegają komórki, które nabyły autoreaktywność w późniejszych stadiach rozwoju. W sytuacjach gdy mechanizmy tolerancji pozostają nieszczelne lub działają nieprawidłowo dochodzi do rozwoju zaburzeń autoimmunologicznych [1, 2, 6]. Udowodniono, że niektóre z zabu-rzeń o podłożu autoimmunologicznym predysponują do rozwoju nowotworów. Dowiedziono również, że oprócz zaburzeń tolerancji immunologicznej do rozwoju procesu nowotworowego przyczynia się nabycie przez patologicznie zmienione komórki cech, które pozwalają im na modulację odpowiedzi immunologicznej. Komórki takie posiadają zdolność zmiany fenotypu (dysplasia), generowania antygenów (markery nowotworowe) oraz modulowania sygnałów swojego mikrośrodowiska celem ucieczki 42 Receptor programowanej śmierci PD-1 jako potencjalny cel w terapii nowotworów spod nadzoru immunologicznego. Okazuje się, że u podstaw, zarówno zaburzeń tolerancji jak i modulacji odpowiedzi immunologicznej prowadzących do utrzymywania się zmienionych patologicznie/nowotworowo komórek leżą zaburzenia szlaku sygnałowego receptora programowanej śmierci PD-1 (ang. Programmed cell-death-1 receptor) i jego ligandów: PD-L1 (B7-H1) i PD-L2 (B7-DC). Receptor programowanej śmierci PD-1 (CD279), należący do rodziny CD28 jest tzw. negatywnym receptorem zlokalizowanym na powierzchni limfocytów [3,4]. Negatywne receptory ulegają pobudzeniu w odpowiedzi na ligand podczas kontaktu limfocytu z komórką prezentującą antygen (ang. antigen presenting cell – APC) [9,10,13]. Ich zadaniem jest generowanie sygnału hamującego aktywację, proliferację i funkcje efektorowe limfocytów, tak aby w momencie zakończenia roli limfocytu w zwalczaniu antygenu nie nabrał on cech niepożądanych, autoreaktywnych lub nowotworowych. Receptor ten odpowiada za zachowanie tolerancji, zapobiega rozwojowi chorób autoimmunologicznych, a także kontroluje uszkodzenia tkanek zdrowych podczas infekcji [7]. W przypadkach utrzymywania się stanu stymulacji antygenem (przewlekłe infekcje, przewlekłe zapalenia) dochodzi do przedłużającej się i wysokiej ekspresji PD-1 na limfocytach. Limfocyty takie określane są mianem „wyczerpanych” (ang. exhausted), a ich funkcje cytotoksyczne są upośledzone [11]. Wysoka ekspresja liganda i/lub pobudzenie ekspresji receptora PD-1 może hamować odpowiedź przeciwnowotworową; dodatkowo wysoki poziom ekspresji PD-1 promuje utrzymywanie się ognisk przewlekłego zapalenia w organizmie i tolerancji na obce antygeny przyczyniając się do rozwoju procesu nowotworowego [6, 7, 12, 14,16, 17]. Bardzo istotne znaczenie szlaku PD-1/PD-1L wynika z faktu jego powszechnej ekspresji w organizmie i dużej możliwości indukcji- to zdecydowanie wyróżnia receptor PD-1 na tle innych cząsteczek z rodziny CD28, w tym także innej immunosupresyjnej cząsteczki CTLA-4 (ang. cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) [7, 14]. Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko składowym szlaku PD-1/PD-L1 jest obiecującym przykładem translacji badań nad układem immunologicznym do celów terapeutycznych. Dotychczas dokonany postęp w dziedzinie immunoterapii nowotworów z zastosowaniem przeciwciał przeciwko cząsteczkom PD-1 oraz PD-1 pozwala sądzić, że ich wykorzystanie będzie coraz powszechniejsze w przyszłości. 43 Monika Pilecka, Maciej Berbecki, Katarzyna Wojewoda 2. Receptor programowanej śmierci PD-1 jako kolejny „gorący punkt” w immunoterapii nowotworów 2.1. Charakterystyka funkcji receptora PD-1 i jego ligandów Rodzina sygnałowych cząsteczek CD28 (B7), do której należy receptor programowanej śmierci PD-1 (CD279) odgrywa kluczową rolę w prawidłowej aktywacji limfocytów T w odpowiedzi komórkowej. Cząsteczki tej rodziny dostarczają krytycznego sygnału zarówno w aktywacji jak i hamowaniu limfocytów T. Poprzez aktywację limfocytów przyczyniają się do wzrostu ich populacji, różnicowania i zwiększenia produkcji cytokin; poprzez negatywny sygnał „usypiają” funkcję limfocytów [16, 25]. Receptor PD-1 został po raz pierwszy opisany w latach 90. XX wieku przez Ishida i współpracowników [5]. Od tamtej pory trwają intensywne badania molekularne nad ekspresją PD-1 w różnorodnych nowotworach. Aktualnie pojawiają się obiecujące doniesienia o efektach prób przedklinicznych, z przeciwciałami monoklonalnymi hamującymi ekspresję PD-1/PD-1L [8, 22, 23, 24, 26, 28, 29]. Receptor PD-1 jest glikoproteiną o budowie charakterystycznej dla typu I transbłonowych protein. Najistotniejszym funkcjonalnie elementem struktury receptora jest ogon cytoplazmatyczny, który zawiera dwa motywy tyrozynowe (ITSM), do których przyłączane są fosfatazy odpowiedzialne za przekazywanie sygnału immunosupresyjnego [7, 27]. Do ekspresji receptora PD-1 dochodzi na komórkach prezentujących antygen: głównie limfocytach B i T (poprzez szlak sygnałowy TCR i BCR), a także komórkach dendrytycznych i monocytach [7, 19]. Aktywacja PD-1 zachodzi w momencie związania jednego z jego ligandów: PD-1L (B7-H1) i PD-2L (B7-DC). Na większości komórek ludzkiego organizmu stwierdza się ekspresję PD-L1, zaś PD-L2- głównie na komórkach dendrytycznych i monocytach [27]. Po aktywacji receptora PD-1 zostaje do niego przekazany negatywny sygnał, który hamuje szlaki receptorów TCR/BCR, czego efektem jest spadek produkcji cytokin, białek antyapoptotycznych (np. Bcl-2) oraz wzrost syntezy IL-10, która hamuje odpowiedź zapalną [12, 20]. Ekspresja PD-1 jest podtrzymywana tak długo, jak długo utrzymuje się stymulacja antygenem. W sytuacji przedłużającego się stanu stymulacji antygenem (przewlekłe infekcje, zapalenia) mamy do czynienia z wysoką ekspresją PD-1 na limfocytach, których funkcje ulegają stopniowemu upośledzeniu i wyczerpaniu (fenotyp limfocytów „wyczerpanych”, opisywany min. w przewlekłej białaczce limfocytowej) [21]. W efekcie dochodzi do upośledzenia komórkowych mechanizmów obrony organizmu i zaburzenia homeostazy ustroju, które mogą skutkować osłabieniem „czujności” immunologicznej [6]. Obserwuje 44 Receptor programowanej śmierci PD-1 jako potencjalny cel w terapii nowotworów się swego rodzaju dezorganizację informacyjną w obrębie komórek: z jednej strony wysoka ekspresja PD-1 wskazuje na konieczność wzmożonej aktywności przeciwko obcym antygenom, z drugiej zaś strony wygasanie cytokinowej reakcji zapalnej hamuje migrację komórek żernych i aktywność cytotoksyczną. Kaskada reakcji unieczynniających antygen nie może zostać zakończona pełną eliminacją, a reakcja zapalna całkowitym wygaszeniem ognisk zapalenia. 2.2. Charakterystyka ekspresji receptora PD-1 i jego ligandów Ekspresja ligandów receptora programowanej śmierci PD-1 jest zróżnicowana. Na większości komórek organizmu obserwuje się ekspresję PD-L1, zaś PD-L2 ogranicza się do komórek dendrytycznych i monocytów [14]. Oba ligandy współzawodniczą o wiązanie się do receptora, z tym że PD-L2 wykazuje średnio trzykrotnie większe powinowactwo do PD-1 niż PD-L1 [15]. Ekspresję PD-L1 stwierdzono w rakach: płuc, okrężnicy, żołądka, nerki, piersi, pęcherza moczowego, nowotworach głowy i szyi oraz czerniaku [14,18,19,29]. Podwyższenie ekspresji PD-L1 w badaniach nad chorymi z rakiem nerki, przełyku, trzustki oraz jajnika została powiązana z krótszym czasem przeżycia. Opisano ekspresję PD-1 i PD-L1 w chłoniakach ziarniczych jak i nieziarniczych. Do tej pory nie poznano mechanizmu, na drodze którego komórki nowotworowe wzbudzają ekspresję PD-L1 na własnych komórkach, bądź PD-1 na limfocytach naciekających zmianę. Wydaje się, że znaczący wpływ na poziom ekspresji szlaku PD-1/PD-L mają warunki mikrośrodowiska komórek nowotworu, co potwierdza fakt iż ekspresja PD-L1 na świeżo izolowanych komórkach nowotworowych jest wyższa niż w analogicznych komórkach pochodzących z hodowli komórkowej. 2.3. Rola szlaku PD-1 w odpowiedzi przeciwnowotworowej Z analizy piśmiennictwa wynika że szlak sygnałowy PD-1/PD-1L jest jednym z istotniejszych w odpowiedzi przeciwnowotworowej organizmu. Komórki nowotworowe wykorzystują szlak PD-1 w następujących mechanizmach: hamowanie odpowiedzi przeciwnowotworowej poprzez wysoką ekspresję liganda lub/i pobudzenie receptora PD-1; hamowanie odpowiedzi zapalnej poprzez nasilenie negatywnego sygnału ko stymulującego; nabywanie przez komórki nowotworowe właściwości antyapoptotycznych; nasilenie apoptozy limfocytów atakujących komórki nowotworowe wykazujące podwyższoną ekspresję PD-L1; 45 Monika Pilecka, Maciej Berbecki, Katarzyna Wojewoda modyfikacja warunków mikrośrodowiska, w którym rozwija się nowotwór: umiejętność wzbudzania ekspresji PD-L1 na komórkach nowotworowych oraz limfocytach naciekających zmianę (mechanizmy niewyjaśnione). 3. Potencjał kliniczny przeciwciał anty-PD-1 i anty-PD-L1 3.1. Badania przedkliniczne- blokada receptora PD-1 i jego ligandów Blokada zarówno receptora PD-1, jak i jego ligandów wykazała jednolity efekt immunostymulujący w fazie badań przedklinicznych. Przeciwciała przeciwko PD-1 i PD-L1 mogą zwiększać lub odbudowywać efektorowe funkcje limfocytów T, włączając w to cytolityczną aktywność skierowaną przeciwko komórkom nowotworowym. Dodatkowo, blokada PD-L1 promuje naciek guza limfocytami CD8+ o właściwościach antynowotworowych, co udowodniono na mysim modelu raka trzustki. Przeciwciała anty-PD-1 hamują przerzutowanie w czerniaku oraz raku jelita grubego na modelu mysim. Eksperyment na mysich limfocytami pozbawionych PD-1 wykazał zahamowanie rozsiewu guza drogą krwio-pochodną poprzez mechanizmy potęgujące proliferację i cytotoksyczność limfocytów T. Badania dowiodły również synergizm efektów chemioterapii i działania przeciwciał anty-PDL1. Te obserwacje mają istotne implikacje dla rozwoju potencjalnych strategii leczniczych u pacjentów znowotworami. 3.2 Badania kliniczne z zastosowaniem przeciwciał anty-PD1/anty-PD-L1 [26, 28,29] 3.2.1. Przeciwciała anty-PD-1 NIVOLUMAB (BMS-936558) Nivolumab, ludzkie IgG4 przeciwciało anty-PD-1, ex vivo wykazywał wzrost proliferacji i produkcji cytokin limfocytów T, które dodatkowo charakteryzowały się wzmożonym powinowactwem i właściwościami litycznymi w stosunku do komórek czerniaka w hodowli. Także myszy z czerniakiem i nowotworem przełyku przeżywały dłużej po terapii nivolumabem i GM-CSF. Pierwsza faza badań klinicznych z użyciem różnych dawek (0,3-10 mg/kg) nivolumabu u pacjentów w zaawansowanym stadium czerniaka, raka nerki, raka niedrobnokomórkowego płuc i raka odbytu rozpoczęto w 2010 roku. W badaniu tym zaobserwowano jedną całkowitą remisję dla raka odbytu i 2 częściowe odpowiedzi na leczenie dla pacjentów z czerniakiem i rakiem nerki. Na limfocytach T uzyskanych 46 Receptor programowanej śmierci PD-1 jako potencjalny cel w terapii nowotworów z krwi obwodowej pacjentów, w drodze analizy za pomocą cystometrii przepływowej, stwierdzono długotrwałe utrzymywanie się większości receptorów PD-1 nawet po 3 miesiącach od zastosowania pojedynczej dawki nivolumabu. W późniejszym badaniu kohortowym stosowano dawki 10 mg/kg uzyskując dobrą odpowiedź u pacjentów z czerniakiem i rakiem nerki oraz nie obserwując toksycznych działań niepożądanych. Jeden z uczestników badania, pacjent z nowotworem nerki, po aplikacji 3 dawek nivolumabu osiągnął częściową regresję guza utrzymującą się przez ponad 16 miesięcy [26, 28]. Zachęcające wyniki badań z zastosowaniem pojedynczych dawek przeciwciał anty-PD-1 sugerowały konieczność zastosowania dwutygodniowego harmonogramu podawania substancji (nivolumab co 2 tygodnie w 8-tygodniowych cyklach). Uzyskano ORs (ang. objective response rate) u 20/122 pacjentów z rakiem niedrobnokomórkowym płuc, 33/106 z czerniakiem i 10/34 z rakiem nerki. Nivolumab jest aktualnie przedmiotem badań kilku badań klinicznych z udziałem pacjentów z rakiem nerki, czerniakiem i innymi nowotworami. PIDILIZUMAB (CT-011) Humanizowane przeciwciało anty-PD-1 pod nazwą pidilizumab w badaniach przedklinicznych wykazało właściwości stymulujące odpowiedź komórkową przeciwko komórkom szpiczaka mnogiego. Rozpoczęto badania w grupie chorych na szereg nowotworów hematologicznych, uzyskując odpowiedź na leczenie u 1/3 chorych. Obecnie trwają badania nad aktywnością przeciwnowotworową pidilizumabu w guzach litych [26]. LAMBROLIZUMAB (MK-3475) Lambrolizumab to humanizowane przeciwciało IgG4 skierowane przeciwko receptorowi PD-1, którego efekt działania oceniono u chorych z różnymi nowotworami litymi obserwując do tej pory dwie częściowe remisje w przypadku czerniaka [26,29]. Bez randomizowanych badań wspomnianych wyżej substancji, oceny bezpieczeństwa i profilu aktywności a także porównania wyników z zastosowaniem przeciwciał anty-PD-1 oraz anty-PD-L1, żadne ostateczne zestawienia nie mogą być uważane za pełne. Z dotychczasowych wyników wynika, że stosowanie leków będących przeciwciałami anty-PD-L1 może wiązać się z mniejszą toksycznością narządową, podczas gdy blokowanie z użyciem przeciwciał anty-PD-1 wydaje się przekładać na lepszą skuteczność kliniczną. 47 Monika Pilecka, Maciej Berbecki, Katarzyna Wojewoda 3.2.2. Przeciwciała anty-PD-L1 BMS-936559 to przeciwciało nad którym w 2012 roku rozpoczęto badania w grupie 217 pacjentów z nowotworami litymi (rak niedrobnokomórkowy płuc, czerniak, rak odbytu, rak nerki, rak trzustki, rak jajnika i piersi) [29, 26]. Przeciwciało podawano co 2 tygodnie w cyklach 6-tygodniowych uzyskując 9 odpowiedzi w czerniaku, 2 w raku nerki, 5 w niedrobnokomórkowym raku płuca i 1 w raku jajnika. 4. Podsumowanie Mimo że pierwsza generacja immunoterapeutyków cechuje się ograniczoną skutecznością, prace nad tymi substancjami dowiodły koncepcji, że u niektórych pacjentów „równowaga immunologiczna” w tkance nowotworowej może być przesunięta na korzyść eliminacji guza. Ciągłe poszerzanie i zdobywanie wiedzy na temat roli układu immunologicznego w karcinogenezie ujawnia różnorodne szlaki, poprzez które nowotwór „ucieka” mechanizmom immunologicznym odpowiedzialnym za jego niszczenie. Rola receptora programowanej śmierci PD-1 oraz innych negatywnych receptorów kostymulujących, zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną typu komórkowego, jest obiecującym przykładem translacji badań nad układem immunologicznym do celów terapeutycznych. Różnorodne nowotwory lite wykazują ekspresję PD-L1, co często ma odzwierciedlenie w złym rokowaniu klinicznym, podczas gdy limfocyty naciekające guzy o ekspresji PD-1 posiadają upośledzone funkcje antynowotworowe. Wyniki przedklinicznych badań z zastosowaniem przeciwciał anty-PD-1/PD-L1 przynoszą wstępne, obiecujące rezultaty; naukowcy podkreślają poprawę właściwości i funkcji antynowotworowych limfocytów T organizmu po zastosowaniu tych substancji. W dalszym ciągu do rozwiązania pozostają kwestie toksyczności dawek oraz występowania efektów ubocznych. Potencjał leczniczy przeciwciał anty-PD-1 i anty-PD-L1 u pacjentów w zaawansowanym stadiów nowotworów jest znaczący i wymaga kolejnych nowatorskich badań. Literatura 1. 2. 3. Van Noort J.M., van Sechel A., Boon J., Boersma W.J., Polman C.H., et al (1993) Minor myelin proteins can be major targets for peripheral blood T cells both multiple sclerosis patients and healthy subjects, J. Neuroimmunol 46: 67-72 Lohmann T., Leslie RD., Londei M. (1996) T cell clones to epitopes of glutamic acid decarboxtlase 65 raised from normal subjects and patients with insulindependent diabetes, J Autoimmun 9:385-389 Lenchow D.J., Walunas T.L., Bluestone J.A. (1996) CD28/B7 system of T cell costimulation, Annu Rev Immunol 14: 233-258 48 Receptor programowanej śmierci PD-1 jako potencjalny cel w terapii nowotworów 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Grewal I.S., Flavell R.A. (1998) CD40 and CD154 in cell- mediated immunity, Annu Rev Immunol 16: 111-135 Ishida Y., Agata Y., Shibahara K., Honjo T. (1992) Incluced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death, EMBO J 11: 3887-3895 Liang S.C., Latchman Y.E., Buhlmann J.E., Tomczak M.F., Horwitz B.H., et al (2003) Regulation of PD-1, PD-1L and PD-L2 expression during normal and autoimmune responses, Eur J Immunol 33: 27-6-2716 Keir M.E., Butte M.J., Freeman G.J., Shape A.H. (2008) PD-1 and its ligands in tolerance and immunity, Annu Rev Immunol 26: 677-704 Okazaki T., Honjo T. (2007) PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application, Int Immunol 19: 813-824 Yamazaki T., Akiba H., Iwai H., Matsuda H., Aoki M., et al (2002) Expression of programmed death-1 ligands by murine T cells and APC, J Immunol 169: 5538-5545 Riley J.L. (2009) PD-1 sygnaling in primary T cells, Immunol Rev 229: 114-125 Nishimura H., Agata Y., Kawasaki A., Sato M., Imamura S., et al. (1996) Developmentally regulated expression of the PD-1 protein on the surface of double negative (CD4-CD8-) thymocytes, Int Immunol 8: 773-780 Dong H., Zhu G., Tamada K., Chen L. (1999) B7-H1, a third member of the B7family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion, Nat Med 5: 1365-1369 Tseng S.Y., Otsuji M., Gorski K., Huang X., Slansky J.E., et al. (2001) B7DC, a new dendritic cell molecule with potent costimulatory properties for T cells, J Exp Med 193: 839-846 Dong H., Strome S.E., Salomao D.R., Tamura H., Hirano F., et al (2002) Tumor associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potencial mechanism of immune evasion, Nat Med 8: 793-800 Youngnak P., Kozono Y., Kozono H., Iwai H., Otsuki N., et al. (2003) Differential binding properties of B7-H1 and B7-DC to programmed death-1, Biochem Biophys Res Commun 307: 672-677 Iwai U., Ishida M., Tanaka Y., Okazaki T., Honjo T., et al. (2002) Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blocade, Proc Natl Acad Sci USA 99: 12293-122297 Blank C., Gajewski T.F., Mackensen A. (2005) Interaction of PD-L1 on tumor cells with PD-1 on tumor-specific T cells as a mechanism of immune evasion: implications for tumor immunotherapy, Cancer Immunol Immunother 54: 307-314 Zang X., Allison JP. (2007) The B7 family and cancer therapy: costimulation and conhibition, Clin Cancer Res 13: 5271-5279 Ishida M., Iwai Y., Tanaka Y., Okazaki T., Freeman G.J., et al. (2002) Differential expression of PD-L1 and PD-L2, ligands for an inhibitory receptor PD-1, in the cells of lymphohematopoietic tissues, Immunol Lett 84: 57-62 Azuma T., Yao S., Zhu G., Flies A.S., Flies S.J., et al (2008) B7-H1 is a ubiquitous antiapoptotic receptor on cancer cells, Blood 111: 3635-3643 49 Monika Pilecka, Maciej Berbecki, Katarzyna Wojewoda 21. Blank C., Brown I., Peterson A.C., Spiotto M., Iwai Y., et al (2004) PD1/B7H-1 inhibits the effector phase of tumor rejection by T cell receptor (TCR) transgenic CD8+ T cells, Cancer Res 64: 1140-1145 22. Curiel T.J., Wei S., Dong H., Alvarez X., Cheng P., et al (2003) Blokade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity, Nat Med 9: 562-567 23. Hirano F., Kaneko K., Tamura H., Dong H., Wang S., et al. (2005) Blokade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity, Cancer Res 65: 1089-1096 24. Blank C., Kuball J., Voelkl S., Wiendl H., Becker B., et al (2006) Blokade of PD-1 (B7-H1) augments human tumor-specific T cell responses in vitro, Int J Cancer 119: 317-327 25. Zhixue Z., Zhaode B., Xijuan L., Lianhai Z., Ziyu L., et al (2013) Level of circulating Pd-1 expression in patients with advanced gastric cancer and its clinical implications, Chin J Cancer Res 26(1): 104-111 26. McDermott D.F., Atkins M.B. (2013) PD-1 as a potential target in cancer therapy, Cancer Med 2(5): 662-673 27. Takanori K., Teruji T., Koji U., Shin M., Tetsuya N., et al (2014) Blockade of B7-H1 Suppresses of Development of Chronic Intestinal Inflammation, J Immunol 171: 4156-4163 28. Takeo N., Masayuki S., Takahiro A., et al (2007) Clinical Significance and Therapeutic Potential of the Programmed Death-1 Ligand/Programmed Death-1 Pathway in Human Pancreatic Cancer, Clin Cancer Res 13, 2151-2157 29. Sznol M., Lieping C. (2013) Antagonist Antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced Human Cancer, Clin Cancer Res 19: 1021-1034 30. Harvey R.D. (2014) Immunologic and Clinical Effects of Targeting PD-1 in Lung Cancer, Clinical Pharmacology & Therapeutics 96 2: 214-217 Programmed death receptor PD-1 as a potential target in anticancer therapy Nowadays, an improved understanding of the molecular mechanisms ruling the host immune response to tumors has led to the identification of checkpoint signaling pathways involved in limiting the anticancer immune response. One of the most significant checkpoint pathways responsible for mediating tumor-inducted immune suppression is the programmed death-1 (PD-1) pathway, which is normally involved in promoting tolerance and preventing tissue damage during chronic inflammation. The programmed death-1 receptor is upregulated in activated T lymphocytes and inhibits T-cell function upon binding to its ligands B7-H1 (PD-L1) and B7-DC (PD-L2). Many solid tumors express PD ligand 1 (PD-L1) and this is often associated with a worse prognosis. Tumor-infiltrating lymphocytes from patients with cancer typically express PD-1 and have impaired antitumor functionality. Proof-of-concept has come from several preclinical studies in which blockade of PD-1 or PD-L1 enhanced T-cell function and tumor cell lysis. Three monoclonal antibodies against PD-1, and one against PD-L1, have reported phase 1 data. All four agents have shown encouraging preliminary activity, and those that have been evaluated in larger patient populations appear to have encouraging safety profiles. If subsequent investigations confirm the initial results, it is conceivable that agents blocking the PD-1/PD-L1 pathway will prove valuable additions to the grooving armamentarium of immunotherapeutic agents. 50 Karolina Okła1, Anna Wawruszak2, Artur Anisiewicz3 Znaczenie szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1 w nowotworach Szlak sygnałowy PD-1/PD-L1 stanowi jedną ze strategii wykorzystywanych przez komórki nowotworowe do ucieczki spod nadzoru układu immunologicznego gospodarza. Zwiększoną ekspresję PD-L1 zaobserwowano w wielu ludzkich nowotworach, co w większości z nich stanowiło negatywną wartość prognostyczną. Wysoką ekspresja liganda PD-L1 na komórkach nowotworowych lub/i pobudzenie ekspresji receptora programowanej śmierci komórkowej PD-1 na limfocytach mogą prowadzić do zahamowania odpowiedzi przeciwnowotworowej. Obecnie prowadzonych jest szereg badań klinicznych nad przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi na poszczególne składowe szlaku PD-1/PD-L1, co daje nadzieję na konstrukcję skutecznych schematów immunoterapeutycznych w leczeniu nowotworów. 1. Wstęp Układ immunologiczny pełni nieodzowną rolę w ochronie organizmu przed patogenami zewnątrzkomórkowymi, a także komórkami własnymi o niepożądanych właściwościach i cechach. Do takich komórek, które wymagają usunięcia z organizmu można zaliczyć komórki przechodzące proces transformacji nowotworowej. Podczas progresji nowotworu, komórki nowotworowe nabywającharakterystycznych właściwości, takich jak: oporność na apoptozę i egzogenne inhibitory wzrostu, nieograniczony potencjał replikacyjny, zdolność wytwarzania własnych sygnałów wzrostowych czy ucieczka spod nadzoru układu immunologicznego, które pozwalają im uzyskać swoistą autonomię [1÷3]. W ucieczce spod kontroli układu odpornościowego komórki nowotworowe wykorzystują dwa mechanizmy[4÷8]. Pierwszy z nich polega na „unikaniu” rozpoznania i eliminacji przez komórki T, drugi zaś na uszkodzeniu lub zahamowaniu aktywności niektórych elementów odpowiedzi immunologicznej przez komórki nowotworowe (Tabela 1). Jednym z punktów kontrolnych modulujących odpowiedź immunologiczną i wykorzystywanych przez 1 [email protected], I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 [email protected], Laboratorium Doświadczalnej Terapii Przeciwnowotworowej, Zakład Onkologii Doświadczalnej, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu 51 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Artur Anisiewicz nowotwór do ucieczki spod nadzoru immunologicznego jest szlak sygnałowy PD-1/PD-L1 (receptor programowanej śmierci 1/ligand receptora programowanej śmierci 1). Komórki nowotworowe, poprzez wysoką ekspresję liganda lub/i pobudzenie ekspresji receptora programowanej śmierci komórkowej PD-1 na limfocytach mogą hamować odpowiedź przeciwnowotworową [9,10]. Podwyższoną ekspresję PD-L1 stwierdzono w wielu ludzkich typach nowotworów [11], co wskazuje na potencjalną rolę PD-1 oraz jego ligandów w kontekście terapii przeciwnowotworowej. Tabela 1. Dwa mechanizmy ucieczki spod nadzoru układu immunologicznego wykorzystywane przez komórki nowotworowe [4-8] • • • • • 1. Unikanie rozpoznania i eliminacji przez komórki limfocytów T zahamowanie ekspresji w komórkach nowotworowych cząsteczek MHC klasy I ↓ ekspresji antygenów na powierzchni komórek nowotworowych „złuszczanie” z powierzchni komórek nowotworowych antygenów ↓ ekspresji cząsteczek kostymulujących z rodziny B7 mających wpływ na odpowiedź limfocytów T ↑ oporność komórek nowotworowych na apoptozę indukowaną przez limfocyty T (↑BCl-2, ↓Fas, ↓ICAM-1) 2. Uszkodzenie, hamowanie aktywności niektórych elementów odpowiedzi odpornościowej przez komórki nowotworowe oraz inne komórki • wydzielanie przez komórki nowotworowe czynników immunosupresyjnych (TGF-β, IL-10, PGE2, VEGF) hamujących dojrzewanie komórek dendrytycznych oraz aktywność limfocytów T • rekrutacja komórek MDSC wydzielających czynniki immunosupresyjne: NOS2, ARG1 • rekrutacja przez komórki nowotworowe, limfocytów T reg, hamujących dojrzewanie k. dendrytycznych i stymulujących je do wydzielania IDO katabolizującego tryptofan (produkty degradacji tryptofanu-kinureniny są toksyczne dla limfocytów ) • wydzielanie przez komórki nowotworowe ligandów FasL i TRAIL indukujących w komórkach T śmierć apoptotyczną • wytwarzanie przez komórki nowotworowe ligandów PD-L1, PD-L2, B7-H4 indukujących śmierć apoptotyczną limfocytów T 2. Charakterystyka i funkcja receptora PD-1 oraz jego ligandów PD-1jestprzezbłonowym, glikoproteinowym receptorem programowanej śmierci 1 należącym do rodziny CD28 (B7).Cząsteczka zbudowana jest z części zewnątrzkomórkowej immunoglobulinopodobnej oraz wewnątrzkomórkowego ogona cytoplazmatycznego, odpowiedzialnego za przekazywanie immunosupresyjnego sygnału. PD-1 ulega ekspresji na aktywo- 52 Znaczenie szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1 w nowotworach wanych limfocytach T oraz B,monocytach/makrofagach i komórkach dendrytycznych(Rys.1.) [9, 12-14]. Należy on do kluczowych negatywnych receptorów odpowiedzi immunologicznej, odpowiedzialnych za zachowanie tolerancji, zapobieganie rozwojowi chorób autoimmuno-logicznych a także kontrolowanieuszkodzeń zdrowych tkanek podczas infekcji. Receptor ten aktywowany jest w momencie związania jednego z dwóch ligandów: PD-L1i PD-L2 (B7–DC) [11, 15, 16,], co prowadzi do zahamowania szlaku receptora TCR/BCR, spadku produkcji cytokin, białek promujących przeżycie komórki oraz zwiększenie syntezy IL-10, która hamuje odpowiedź immunologiczną. PD-L1 ulega indukowanej ekspresji na większości komórek ludzkiego organizmu, z kolei PD-L2 na komórkach dendrytycznych, monocytach i nielicznych komórkach niehematopoetycznych. Pomimo, że PD-L2 wykazuje trzykrotnie większe powinowactwo do PD-1 niż PD-L1, za właściwości immunoregulacyjne związane z PD-1 odpowiada PD-L1 [17,18]. Rys.1. Immunologia nowotworu i szlak sygnałowy PD-L1/PD-1 [11] 53 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Artur Anisiewicz 3. Ekspresja PD-1/PD-L1 w nowotworach Wykazano, że szlak sygnałowy PD-1/PD-L1 stanowi jeden z potencjalnych mechanizmów wykorzystywanych przez komórki nowotworowe, które poprzez wysoką ekspresję liganda lub/i pobudzenie receptora PD-1 na limfocytach mogą hamować odpowiedź przeciwnowotworową. Ekspresję PD-L1 wykazano w wielu ludzkich typach nowotworów takich jak: rak płuc, jelita grubego, wątroby, jajnika, żołądka, okrężnicy, przełyku, trzustki, piersi, pęcherza a także w czerniaku, chłoniaku czy białaczce (Tabela 2) [10, 1,19]. Tabela 2. Ekspresja PD-L1 w nowotworach [11] Typ nowotworu Czerniak Rak niedrobnokomórkowy płuc Rak jamy nosowo-gardłowej Glejak wielopostaciowy/glejak mieszany Rak jelita grubego Rak wątrobowokomórkowy Rak nabłonkowy Szpiczak mnogi Rak jajnika Rak żołądka Rak przełyku Rak trzustki Rak nerkowokomórkowy Rak piersi Chłoniaki Białaczki % PD-L1+ [11] 40–100 35–95 68–100 100 53 45–93 28–100 93 33–80 42 42 39 15–24 31–34 17–94 11–42 Podwyższona ekspresja PD-L1została powiązana z krótszym czasem przeżycia uchorych z rakiem jajnika, nerek, przełyku oraz trzustki [20-23]. Co ciekawe, w przypadku czerniaka stwierdzono zarówno pozytywny [24], jak i negatywny wpływ podwyższonej ekspresji PD-L1 na przeżycie pacjentów[25]. Podobnie, w przypadku chłoniaka grudkowego podwyższona ekspresja receptora PD-1 na limfocytach w zmianie korelowała zarówno z dobrym [26], jak i złym rokowaniem u chorych[27]. Opisano również,że podwyższona ekspresja receptora PD-1 na limfocytach naciekających komórki raka nerki także wiąże się ze złym rokowaniem dla chorych [28]. Z kolei, wysoka ekspresja liganda PD-L1 na komórkach raka nerki wiązała się a bardziej agresywnym przebiegiem choroby oraz znacznie zwiększonym ryzykiem zgonu nią spowodowanego [29]. Podobną zależność uzyskano w przypadku chorych na raka jajnika, gdzie 54 Znaczenie szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1 w nowotworach podwyższenie ekspresji PD-1 na limfocytach naciekających komórki raku jajnika, wiązała się z większym ryzykiem zgonu, a także negatywnie korelowała z ilością limfocytów T CD8 +w jajniku.W przeciwieństwie do PD-L1 ekspresja liganda PD-L2 była rzadsza (około połowy raków jajnika wykazywało PD-L2+) [21].Poza mechanizmem hamowania limfocytów T w nowotworach z ekspresją cząsteczki PD-L1, zaobserwowano zwiększoną oporność na apoptozę tych komórek, co wskazuje na dodatkowy mechanizm zwiększający przeżycie komórek nowotworowych wykorzystujący szlak sygnałowy PD-1/PD-L[30]. Niestety, pomimo intensywnych badań,mechanizmna drodze którego komórki nowotworowe modulują własną ekspresję PD-L1 bądź ekspresję PD-1 na limfocytach efektorowych pozostaje nieznany. W warunkach in vitro ekspresja PD-L1 ulega indukcji pod wpływem interferonu typu I (α,β) i II (γ), a także w mniejszym stopniu TNF-α[10,31]. Ekspresja PD-L1 na komórkach nowotworowych świeżo izolowanych ex vivo jest zdecydowanie większa niż na komórkach hodowanych in vitro, co ze względu na wpływ cytokin może sugerować, iż mikrośrodowisko nowotworu (TME) może modulować ekspresję szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1[10]. 4. Blokowanie szlaku sygnałowegoPD-1/PD-L1 jako potencjalny cel terapii przeciwnowotworowej Cechą wyróżniającą receptor PD-1, na tle innych cząsteczek z rodziny CD28 (np. immunosupresyjnej cząsteczki CTLA-4)jest powszechność ekspresji liganda PD-L1,co wskazuje na szerokie znaczenie w modulacji odpowiedzi immunologicznej.Doświadczenia z komórkami nowotworowymi wykazały, że zastosowanie przeciwciał monoklonalnych(mAb) blokujących PD-L1 wspiera odpowiedź przeciwnowotworową. Innym środkiem terapeutycznym może być również siRNA, powodujący degradację transkryptu PD-1 [16]. Wiele eksperymentów in vivo z wykorzystaniem mysich modelów nowotworów, potwierdziło regresję nowotworu lub wydłużenie czasu przeżycia chorych po inaktywacji szlaku sygnałowego PD-1. Regresji nowotworu towarzyszyło zwiększenie populacji limfocytów T i produkcji immunostymulujących cytokin. Jednak dokładna sekwencja zdarzeń w mikrośrodowisku guza, która prowadzi do regresji nowotworu po zablokowaniu szlaku PD-1 pozostaje nieznana. Przypuszcza się jednak, że blokada szlaku PD-1 hamuje limfocyty naciekające nowotwór (TIL). W przypadku przedłużającego się stanu stymulacji antygenem dochodzi do przedłużającej się i wysokiej ekspresji PD-1 na limfocytach T o fenotypie opisywanym jako „wyczerpane” i nie mogą być one reaktywowane przez samą blokadę PD-1. Wyczerpanie limfocytów T jest wynikiem przewlekłej ekspozycji na antygen (przewlekłe infekcje 55 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Artur Anisiewicz wirusowe lub postępująca choroba nowotworowa). Fenotyp „wyczerpane” charakteryzuje się wysokim poziomem cząsteczek hamujących, słabą funkcją efektorową oraz odrębnym profilem transkrypcji i może w rzeczywistości stanowić etap różnicowania limfocytów T. Wśród pacjentów z przerzutującym czerniakiem, CD8 +TIL wyrażają na swojej powierzchni kilka cząsteczek związanych z wyczerpaniem, w tym TIM-3 LAG-3 i PD-1, które mogą być przyczyną oporności na blokadę szlaku PD-1, a także mogą stać się wskazówką w projektowaniu kombinacji punktów kontrolnych/ koinhibitorów antagonistów tych cząsteczek. Zaobserwowano, że leczenie myszy białkiem fuzyjnym B7-DC-Ig w kombinacji z cyklofosfamidem i szczepionką spowodowało znaczny spadek liczby komórek PD-1hi oraz limfocytów T CD4+ i CD8+ w obrębie guza, co pozwalało na infiltrację i/lub zwiększenie populacji limfocytów T niewyczerpanych (PD-1lo)w mikrośrodowisku guza. Nie wiadomo jednak, czy takie zjawisko występuje także u ludzi [32]. Kilka obiecujących środków immunoterapeutycznych skierowanych na szklak PD-1/PD-L1 jest obecnie w fazie badań klinicznych. Jest to m.in. Nivolumab(BMS-936559), Lambrolizumab (MK-3475) oraz MPDL320A. Nivolumab jest inhibitorem PD-1 a obszar terapeutyczny obejmuje guzy lite. Badania kliniczne prowadzono na grupie 107 pacjentów z czerniakiem złośliwym, u których rak postępował mimo wcześniejszych terapii. Z badanej grupy 33 pacjentów wykazywało zmniejszenie rozmiarów guza o co najmniej 30%, średnia przeżycia wyniosła blisko 16,8 miesięcy. Dodatkowo, w skojarzeniu z innym immunoterapetukiem – Yervoy przynosił jeszcze lepsze efekty powodując zmniejszenie się rozmiarów guza o ponad 80% w ciągu 12 tygodni. Działanie leku pozytywnie oceniono także u chorych z innymi nowotworami m.in. płuc i nerek. Lambolizumab to przeciwciało, które blokuje antygen PD-L1. Badania przeprowadzone w grupie 135 pacjentów z zaawansowanymi zmianami rakowymi skóry wykazały u 51% wszystkich badanych – częściową, a u 9% – całkowitą odpowiedź nowotworu na działanie leku. MPDL320A również jest przeciwciałem anty-PD-L1. Wyniki I fazy badań klinicznych przeprowadzonych w grupie 30 pacjentów wskazały na wysoką aktywność wobec szerokiej grupy nowotworów (m.in. raka płuc, nerki, jelita grubego i żołądka) i bezpieczeństwo tego immunoterapeutyku [33, 34]. Powyższe dane pozwalają stwierdzić, że zastosowanie specyficznych inhibitorów szlaku PD-1/ PD-L1 przynoszą wstępne, obiecujące rezultaty, czy to w monoterapii czy też w leczeniu skojarzonym z innymi lekami, a ich wykorzystanie może być coraz powszechniejsze w przyszłości. 56 Znaczenie szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1 w nowotworach 5. Podsumowanie Szlak sygnałowy PD-1/PD-L1 stanowi ważny punkt kontrolny, który moduluje odpowiedź immunologiczną i jest wykorzystywany przez nowotwór do ucieczki spod nadzoru immunologicznego. Liczne dane literaturowe potwierdzają podwyższoną ekspresję PD-L1 w wielu ludzkich typach nowotworów, co wskazuje na potencjalną rolę receptora PD-1 oraz jego ligandów w kontekście terapii przeciwnowotworowej. Zastosowanie mAb skierowanych przeciwko PD-1 bądź PD-L1 może stać się obiecującym schematem immunoterapii. Pomimo podejmowania prób stosowaniaimmunoterapii, to metoda ta nie weszła jeszcze w standardy leczenia klinicznego. Pozostaje wiele kwestii do rozwiązania, jak toksyczność dawek, występowanie efektów ubocznych, które należy przezwyciężyć, czy zróżnicowany efekt działania w zależności od zastosowania w monoterapii, bądź w skojarzeniu z innymi lekami. Jednakże badania kliniczne nad zastosowaniem takich przeciwciał przynoszą wstępne, obiecujące wyniki, co daje nadzieję na konstrukcję skutecznych modeli immunoterapeutycznych w leczeniu nowotworów. Literatura 1. Zitvogel L., Tesniere A., Kroemer G. (2006). Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion, Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 2. Kroemer G., and Pouyssegur, J. (2008). Tumor Cell Metabolism: Cancer’s Achilles’ Heel, Cancer Cell 13, 472-482 3. Hanahan D., Weinberg R.A. (2000) The hallmarks of cancer, Cell 100, 57-70 4. Bronte V. Mocellin S. (2009). Suppressive influences in the immune response to cancer, J. Immunother. Hagerstown Md 1997 32, 1-11 5. Rabinovich G.A., Gabrilovich D., Sotomayor, E.M. (2007) Immunosuppressive strategies that are mediated by tumor cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 267-296 6. Stewart T.J., Abrams S.I. (2008). How tumours escape mass destruction. Oncogene27, 5894-5903 7. Whiteside T.L. (2006) Immune suppression in cancer: effects on immune cells, mechanisms and future therapeutic intervention. Semin. Cancer Biol. 16, 3-15 8. Whiteside T.L. (2008) The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene27, 5904-5912 9. Keir M.E., Butte M.J., Freeman G.J., Sharpe A.H. (2008). PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu. Rev. Immunol. 26, 677-704 10. Dong H., Strome S.E., Salomao D.R., Tamura H., Hirano F., Flies D.B., Roche P.C., Lu J., Zhu G., Tamada K., et al. (2002). Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 57 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Artur Anisiewicz 11. Chen D.S., Irving B.A., Hodi F.S. (2012). Molecular Pathways: NextGeneration Immunotherapy—Inhibiting Programmed Death-Ligand 1 and Programmed Death-1. Clin. Cancer Res. 18, 6580-6587 12. Philips G.K., Atkins, M. (2015). Therapeutic uses of anti-PD-1 and anti-PDL1 antibodies. Int. Immunol. 27, 39-46 13. Yamazaki T., Akiba H., Iwai H., Matsuda H., Aoki M., Tanno Y., Shin T., Tsuchiya H., Pardoll D.M., Okumura K., et al. (2002). Expression of programmed death 1 ligands by murine T cells and APC. J. Immunol. Baltim. Md 1950 169, 5538-5545 14. Riley J.L. (2009). PD-1 signaling in primary T cells. Immunol. Rev. 229, 114-125 15. Ankri C., Cohen C.J. (2014). Out of the bitter came forth sweet. Oncoimmunology3 16. Grzywnowicz M., Giannopoulos K. (2012). Znaczenie receptora programowanej śmierci 1 oraz jego ligandów w układzie immunologicznym oraz nowotworach. Acta Haematol. Pol. 43, 132-145 17. Youngnak P., Kozono Y., Kozono H., Iwai H., Otsuki N., Jin H., Omura K., Yagita H., Pardoll D.M., Chen L., et al. (2003). Differential binding properties of B7-H1 and B7-DC to programmed death-1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 307, 672-677 18. Brahmer J.R., Drake C.G., Wollner I., Powderly J.D., Picus J., Sharfman W.H., Stankevich E., Pons A., Salay T.M., McMiller T.L., et al. (2010). Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. Off. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 19. Zang X., and Allison J.P. (2007). The B7 Family and Cancer Therapy: Costimulation and Coinhibition. Clin. Cancer Res. 13, 5271-5279 20. Ohigashi Y., Sho M., Yamada Y., Tsurui Y., Hamada K., Ikeda N., Mizuno T., Yoriki R., Kashizuka H., Yane K., et al. (2005). Clinical significance of programmed death-1 ligand-1 and programmed death-1 ligand-2 expression in human esophageal cancer. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 11, 2947-2953 21. Hamanishi J., Mandai M., Iwasaki M., Okazaki T., Tanaka Y., Yamaguchi K., Higuchi T., Yagi H., Takakura K., Minato N., et al. (2007). Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3360-3365 22. Nomi T., Sho M., Akahori T., Hamada K., Kubo A., Kanehiro H., Nakamura S., Enomoto K., Yagita H., Azuma M., et al. (2007). Clinical Significance and Therapeutic Potential of the Programmed Death-1 Ligand/Programmed Death-1 Pathway in Human Pancreatic Cancer.Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 23. Thompson R.H., Kuntz S.M., Leibovich B.C., Dong H., Lohse C.M., Webster W.S., Sengupta S., Frank I., Parker A.S., Zincke H., et al. (2006). Tumor B7H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 24. Taube J.M., Anders R.A., Young G.D., Xu H., Sharma R., McMiller T.L., Chen S., Klein A.P., Pardoll D.M., Topalian S.L., et al. (2012). Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions 58 Znaczenie szlaku sygnałowego PD-1/PD-L1 w nowotworach 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37 Mu C.-Y., Huang J.-A., Chen Y., Chen C., Zhang X.-G. (2011). High expression of PD-L1 in lung cancer may contribute to poor prognosis and tumor cells immune escape through suppressing tumor infiltrating dendritic cells maturation. Med. Oncol. NorthwoodLond. Engl. 28, 682-688 Carreras J., Lopez-Guillermo A., Roncador G., Villamor N., Colomo L., Martinez A., Hamoudi R., Howat W.J., Montserrat E., Campo E. (2009). High Numbers of Tumor-Infiltrating Programmed Cell Death 1–Positive Regulatory Lymphocytes Are Associated With Improved Overall Survival in Follicular Lymphoma. J. Clin. Oncol. 27, 1470-1476 Richendollar B.G., Pohlman B., Elson P., Hsi E.D. (2011). Follicular programmed death 1-positive lymphocytes in the tumor microenvironment are an independent prognostic factor in follicular lymphoma. Hum. Pathol. 42, 552-557 Thompson R.H., Dong H., Lohse C.M., Leibovich B.C., Blute M.L., Cheville J.C., Kwon E.D. (2007). PD-1 is expressed by tumor-infiltrating immune cells and is associated with poor outcome for patients with renal cell carcinoma. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 13, 1757-1761 Thompson R.H., Gillett M.D., Cheville J.C., Lohse C.M., Dong H., Webster W.S., Krejci K.G., Lobo J.R., Sengupta S., Chen L., et al. (2004). Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17174-17179 Azuma T., Yao S., Zhu G., Flies A.S., Flies S.J., Chen L. (2008). B7-H1 is a ubiquitous antiapoptotic receptor on cancer cells. Blood 111, 3635–3643 Mazanet M.M., Hughes C.C.W. (2002). B7-H1 is expressed by human endothelial cells and suppresses T cell cytokine synthesis. J. Immunol. Baltim. Md 1950 169, 3581-3588 Sznol M., Chen L. (2013). Antagonist Antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the Treatment of Advanced Human Cancer. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 19, 1021-1034 Pal S.K., Hu A., Chang M., Figlin R.A. (2014). Programmed death-1 inhibition in renal cell carcinoma: clinical insights and future directions. Clin. Adv. Hematol. Oncol. HO 12, 90-99 Ramalingam S.S., Mazières J., Planchard D., Stinchcombe T.E., Dy G.K., Antonia S.J., Horn L., Lena H., Minenza E., Mennecier B., et al. (2014). Phase II Study of Nivolumab (anti-PD-1, BMS-936558, ONO-4538) in Patients with Advanced, Refractory Squamous Non-Small Cell Lung Cancer: Metastatic Non-small Cell Lung Cancer. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 90, 1266-1267 59 Karolina Okła, Anna Wawruszak, Artur Anisiewicz The role of signaling pathway PD-1 / PD-L1 in tumors Summary: Signaling pathway PD-1/PD-L1 is one of the strategies used by tumor cells to escape from the host immune surveillance system. Increased PD-L1 expression was observed in several human tumors, in most of them constituted a negative predictive value.High expression of thePD-L1 on tumor cells and/or stimulation ofexpression of programmeddeath receptor PD-1 on lymphocytes can lead to inhibition of anti-tumor responses.Currently, numerous clinical trials using of monoclonal antibodies directed against individual components of PD-1/PD-L1 pathway gives hope for the construction of effective immunotherapy schemes in the treatment of cancer. 60 Joanna Woźniak1, Tomasz Wandtke2, Maciej Gawroński3 TNF-α – budowa molekularna, aktywność w procesach nowotworowych oraz potencjalne wykorzystanie w badaniach klinicznych Czynnik martwicy nowotworu (ang. Tumor Necrosis Factor α, TNF-α) to wielofunkcyjna cytokina, która pełni kluczową rolę w procesach zapalnych oraz apoptozie komórek. Obecne wykorzystywanie TNF-α ogranicza się do miejscowego leczenia nowotworów. Związanie TNF-α wraz ze swoistymi receptorami typu 1 oraz typu 2 (TNFR-1, TNFR-2) prowadzi do zapoczątkowana kaskady reakcji na drodze transdukcji, które przebiegają niezależnie od siebie i prowadzą do wystąpienia dwóch różnych efektów – apoptozy lub ochrony komórki przed programowaną śmiercią. Niniejsza praca stanowi zbiór aktualnych informacji o TNF-α: budowę molekularną, mechanizmy sygnałowe oraz potencjalne działanie przeciwnowotworowe. 1. Wstęp TNF-α (ang. Tumor Necrosis Factor, czynnik martwicy nowotworów) to przykład wielofunkcyjnej cytokiny, która zaangażowana jest w szereg procesów: programowaną śmierć komórki, bądź jej przeżycie, przebieg reakcji zapalnych oraz interakcje poprzez dwa różne receptory [1]. TNF-α został wyizolowany w 1975 roku z surowicy myszy, traktowanych endotoksyną bakterii jako aktywny składnik "toksyny Coley". Wówczas to zaobserwowano, że czynnik pochodzący z toksyny bakteryjnej powoduje martwicę guza i jest odpowiedzialny za indukuję procesu nekrozy nowotworów [2]. Było to pierwsze wykorzystanie cytokin w bioterapii nowotworów. 10 lat później określono TNF-α jako kachektynę oraz czynnik różnicowania limfocytów T [3]. W tym samym roku po raz pierwszy sklonowano ludzki gen dla TNF-α [4], co zapoczątkowało szereg badań klinicznych nad omawianą cytokiną. 1 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 2 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 3 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy 61 Joanna Woźniak,Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński 2. Budowa molekularna TNF-α należy do nadrodziny TNF, do których należy 19 białek. Omawiana cytokina zbudowana jest z 157 aminokwasów o łącznej masie 17 kDa. U ludzi gen kodujący niniejszą cytokinę znajduje się na chromosomie 6 [5]. TNF-α jest wydzielany głównie przez aktywowane makrofagi, limfocyty T oraz komórki NK (ang. Natural Killers). Niska ekspresja TNF- α jest również obserwowana w przypadku szeregu innych komórek, takich jak fibroblasty, neutrofile, keratynocyty, komórki tuczne i komórki nowotworowe. TNF-α jest syntetyzowane w pierwszej kolejności jako pro-TNF o masie 26 kDa, które następnie wiąże się z błoną komórkową i jest uwalniany po odcięciu jego pro-domeny przez enzym konwertujący TNF (ang. TNF-converting enzyme, TACE). W ten sposób ulega proteolityczneej modyfikacji do postaci rozpuszczalnej (ang. soluble TNF-α, sTNF-α) [6]. Bioaktywność TNF-α regulowana jest przez wiązanie rozpuszczalnych receptorów typu 1 (ang. Tumour-Necrosis Factor receptor-1, TNFR-1) o masie cząsteczkowej 55 kDa oraz typu 2 (ang. Tumour-Necrosis Factor receptor-2, TNFR-2) o masie cząsteczkowej 72 kDa. Oba receptory to heterotrimery, składające się z trzech domen: zewnątrzkomórkowej (ang. ExtraCellular Domain, ECD), transbłonowej (ang. TransMembrane Domain, TMD) i wewnątrzkomórkowej (ang. IntraCellular Domain, ICD). Powinowactwo TNF-α do TNFR-2 jest pięć razy wyższe niż do TNFR-1 jednak to receptor typu 2 odpowiedzialny jest za wyższą bioaktywność cytokiny. TNFR-1 jest obecny niemal we wszystkich typach komórek, podczas gdy ekspresja TNFR-2 ograniczona się do komórek układu immunologicznego [7]. Podstawową różnicą pomiędzy tymi dwoma receptorami jest domena śmierci (ang. death domain, DD), która występuje tylko w przypadku TNFR-1. Dlatego też receptor typu pierwszego należy do członków rodziny receptorów śmierci, zdolnych do indukcji śmierci komórek na drodze apoptozy [8]. 3. Ścieżki sygnałowe W przypadku TNFR-1 pierwszym etapem jest jego związanie z homotrimerem TNF-α. Następnie dochodzi do trimeryzacji receptora oraz uwalniania białka wyciszającego domenę śmierci (ang. silencer of death domain, SODD) [9]. Umożliwia to przyłączenie się białka wzmacniającego do domeny śmierci receptora TNF- α (ang. TNF-R1 associated death domain, TRADD), które następnie silne wiąże szereg białek adaptorowych, takich jak: RIP (ang. receptor interacting protein, białko adaptorowe łączące się z receptorem TNF-α), TRAF-2 (ang. TNF- α receptor associated factor 2, białko adaptorowe typu 2 związane z receptorem TNF- 62 TNF-α– budowa molekularna, aktywność w procesach nowotworowych oraz potencjalne wykorzystanie w badaniach klinicznych α), czy FADD (ang. Fas associated death domain, białko z domeną śmierci wiążące się z receptorem Fas) [10]. Prowadzi to następnie do aktywacji NF-kB (ang. nuclear factor kappa B, czynnik jądrowy kappa B) oraz do powstania sygnalosomu, który indukuje fosforylację IkB (ang. inhibitory subunit of NF-kB, podjednostka hamująca aktywność NFkB), jego ubikwitynację oraz degradację proteasomalną [11]. TNFR-2 w odróżnieniu od receptora typu 1 nie posiada domeny śmierci. Posiada natomiast sekwencje pozwalające związać zestaw wewnątrzkomórkowych adapterów TRAF (TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5 i TRAF6). Po zapoczątkowaniu sygnału przeżycia komórki kinaza MAP3K (ang. Mitogen-Activated Protein-3 Kinase, białkowa aktywowana mitogenem kinaza-3) indukuje TRAF 2, które z kolei aktywuje kinazy JNK (ang. Jun N-terminal Kinases, Jun N-końcowe kinazy). W dalszym etapie czynnik NIK (ang. NuclearFactor-NF-kB Incucing Kinase, kinaza indukująca czynnik NF-kB) przy udziale NF-kB aktywuje kaskadę procesów, prowadzących do przeżycia komórki [12]. 4. Wpływ TNF-α na komórki nowotworowe Powszechnie wiadomo, że TNF-α indukuje śmierć komórek podczas leczenia chorób nowotworowych. Jego niepodważalny wpływ potwierdzono podczas serii doświadczeń aplikując szczurom w różnych dawkach kombinację TNF-α i chemioterapeutyków wykazując ich synergistyczne działanie przeciwnowotworowe w leczeniu skojarzonym [13]. Okazało się również, że dostarczenie do komórki samego TNF-α nie wywołuje martwicy nowotworu w tak znacznym stopniu. Na tych samych szczurzych modelach wykazano, że TNF-α zwiększa 3-6-krotnie akumulowanie chemioterapeutyków [14]. Mechanizmy leżące u podstaw działania TNF-α podczas stałego leczenia nie powodują bezpośredniego działania cytotoksycznego lub cytostatycznego TNF-α wobec komórek nowotworowych. Pojawiła się natomiast hipoteza, że cytokina ta nie ma wpływu na same komórki nowotworowe, lecz na komórki podścieliska guza. Zostało to potwierdzone na podstawie danych, zebranych z doświadczeń na myszach, które wskazują cytotoksyczne działanie TNF-α w układzie naczyniowym nowotworu [15]. Co ciekawe, okazuje się, że omawiana cytokina ma również pośredni wpływ na wzbudzanie odpowiedzi przeciwnowotworowej, gdyż odpowiedzialna jest za indukcję komórek NK oraz limfocytów T CD8+, które wzmacniają aktywność cytotoksyczną względem komórek raka [16]. 63 Joanna Woźniak,Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński 5. Udział TNF-α w angiogenezie Rosnący guz aktywuje otaczające naczynia przez wydzielanie czynników angiogennych, zmieniając w ten sposób swój fenotyp oraz tworzy mikrośrodowisko, którego składniki zapewniają mu nieograniczony wzrost [17]. Oprócz wzrostu i proliferacji, guz może dawać przerzuty. Złośliwe komórki nowotworowe, poprzez inwazję naczyń, degradację ECM (ang. extracellular matrix, macierz zewnątrzkomórkowa) oraz zasiedlanie miejsc docelowych mogą tworzyć przerzuty odległe [18]. Niniejsze zjawisko stało się jednym z głównych celów terapeutycznych w leczeniu raka. Postuluje się, iż komórki śródbłonka naczyń nowotworowych w porównaniu z normalnymi wykazują większą ekspresję TNFR1 na swojej powierzchni, co może być zależne od czynników produkowanych przez komórki obecne w mikrośrodowisku nowotworu, takie jak makrofagi. Stanowi to jednocześnie cel terapeutyczny, gdyż umożliwia łączenie się sTNF-α ze swoistym receptorem. Podanie TNF-α do guza litego prowadzi tym samym do kaskady procesów, prowadzących do zaprogramowanej śmierci komórki. Co ciekawe, zdrowy śródbłonek również wiąże cytokinę, lecz posiada mniejszą ilość receptorów na swojej powierzchni [19]. Uważa się, iż związanie TNFR1 do TNF-α powoduje większą przepuszczalność śródbłonka naczyń guza. Pozbawienie nowotworu dużej ilości erytrocytów skutkuje jego „krwotoczną nekrozą”. W wyniku właściwości cytotoksycznych wysokiej dawki TNF-α, niektóre z komórek przechodzą apoptozę, a cały proces silnie wzmaga permeabilizację komórek śródbłonka. Liczne badania wykazały, że już mała dawka TNF-α wywołuje porównywalny efekt anty-angiogenny. Co ciekawe, w przypadku tych badań nie zauważono wpływu TNF-α na zdrowe naczynia: pozostają one nienaruszone, a ich komórki śródbłonka nie ulegają apoptozie, dlatego też nie dochodzi do wynaczynienia [20, 21]. Obserwowane synergiczne działanie w przypadku jednoczesnego podania TNF-α i leków chemioterapeutycznych jest konsekwencją podwójnie indukowanej permeabilizacji. Zjawisko to polega na zwiększeniu przepuszczalności błony przez TNF-α do komórek nowotworowych, do których znacznie skuteczniej wnikają leki terapeutyczne. Powoduje to zwiększone gromadzenie się leków i ich rozkład w guzie poprzez zwiększoną ekspozycję komórek nowotworowych na działanie środków cytostatycznych [22]. Jest to jak dotąd jedyne wytłumaczenie obserwowanej wysokiej odpowiedzi immunologicznej u pacjentów, którym podano oba terapeutyki. 64 TNF-α– budowa molekularna, aktywność w procesach nowotworowych oraz potencjalne wykorzystanie w badaniach klinicznych 6. Metody walki z nowotworem przy wykorzystaniu TNF-α Najpowszechniejszym celem terapeutycznym jest hamowanie ścieżki sygnałowej przeżycia komórek z udziałem NF-κB. Inaktywacja tego czynnika jest powszechnie uznana za uwrażliwienie wielu nowotworów na wpływ TNF-α [23]. NF-κB może być zablokowany na szereg sposobów, do których można zaliczyć zwiększenie ekspresji swoistego inhibitora IκB, bądź innych jego inhibitorów, które poprzez zahamowanie ścieżki przeżycia zwiększają indukcję apoptozy komórek nowotworowych przy udziale TNF-α [24, 25]. Przykładem takiego leku, który wykorzystuje inhibitor NF-κB, jest bortezomib, który jest w fazie badań klinicznych jako terapia skojarzona z chemioterapeutykami w przypadku raka prostaty i szpiczaka [26]. Najnowsze badania Yang i wsp. Również potwierdziły, że blokowanie ścieżki sygnałowej z NF-κB wywołuje skuteczną inhibicję TNF-α [27]. Tlenek azotu (NO, ang. Nitric oxide) jest zaangażowany w ścieżkę przeżycia komórek traktowanych TNF-α poprzez indukowanie ekspresji NF-κB przez indukowaną syntazę tlenku azotu (iNOS, ang. inducible NO synthase) [28]. W badaniach doświadczalnych u szczurów wykazano, że hamowanie NOS poprzez L-NAME (ang. NG-nitro-L-arginine methyl ester, ester metylowy NG-nitro-L-argininy) podczas leczenia z wykorzystaniem TNF-α powodowało znaczny wzrost odpowiedzi przeciwnowotworowej [29]. Niniejsze obserwacje zostały potwierdzone przez kolejne badanie, wykazujące, że indukcja ekspresji NOS przez czerniaka uwrażliwiała komórki endotelialne na cytotoksyczne działanie TNF-α w warunkach in vitro [30]. Z kolei Campanholo i wsp. postanowili jednocześnie zahamować ekspresję iNOS oraz NF-κB, co zaowocowało zmniejszeniem ekspresji TNF-α [31]. Apoptoza komórek indukowana TNF-α jest związana również z wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species). Wykazano, że NF-κB, który jest kluczowym czynnikiem prowadzącym komórkę na ścieżkę przeżycia, indukuje enzymy neutralizujące ROS. Doskonałym przykładem jest dysmutaza ponadtlenkowa. Indukcja produkcji ROS lub inhibicja ścieżki z udziałem NF-κB przez cyklooksygenazę 2 (COX-2, ang. cyclooxygenase-2) jest uważana za skuteczną terapię, prowadzącą do uwrażliwienia komórek nowotworowych na indukcję apoptozy przez TNF-α [32]. Kolejnym sposobem walki z nowotworami przy wykorzystaniu TNF-α jest otrzymanie analogów niniejszej cytokiny, które z większą wydajnością będą wiązać swoisty receptor TNFR-1 na poziomie angiogenezy. Pozytywne wyniki, wykorzystujące opisany mechanizm zostały uzyskane 65 Joanna Woźniak,Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński w warunkach in vivo. Jednak żaden z analogów TNF-α nie osiągnął jeszcze fazy badań klinicznych [33]. Potencjalnym narzędziem terapeutycznym wydaje się również wykorzystywanie innych molekuł, które uwrażliwiają docelową komórkę na TNF-α. Interferon gamma (IFN-γ) jest jedną z najczęściej wybieranych cytokin w badaniach eksperymentalnych. Zaobserwowano, iż jego zastosowanie wchodzi w interakcje z TNFR-1 oraz kaspazą-8, regulując indukcję apoptozy przez TNF-α [34]. Kolejną cytokiną jest nabłonkowy polipeptyd aktywujący monocyty typu 2 (EMAP-2, ang. endothelial monocyte-activating polypeptide-2,). Omawiana cząsteczka wydzielana jest przez komórki nowotworowe, a lokalna produkcja EMAP-2 związana jest z ułatwionym przeciwnowot-worowym działaniem TNF-α [35]. Wykazano również, że sam EMAP-2 wykazuje działanie immunosupresyjne oraz antyangiogenne [36]. Terapia kombinowana, z jednoczesnym wykorzystaniem obu cytokin wydaje się być skuteczną metodą w leczeniu nowotworów. 7. Podsumowanie Wielofunkcyjne działanie TNF-α jest niepodważalne. Z punktu widzenia niniejszej pracy najważniejsza wydaje się odpowiedź cytotoksyczna, skierowana przeciwko nowotworom. TNF-α poprzez łączenie się ze swoim receptorem TNFR-1 kieruje docelową komórkę na szlak apoptozy. Wykorzystanie wysokich dawek TNF-α w leczeniu miejscowym guza zostało potwierdzone jako skuteczna metoda terapeutyczna. Ponadto, TNF-α to skuteczna cytokina anty-angiogenna. W terapii kombinowanej z wykorzystywaniem chemioterapeutyków powoduje permeabilizację błon oraz skuteczniejsze wnikanie i rozkład leków w komórkach nowotworowych. Potwierdzono również, iż sama cytokina wpływa na zwiększenie ilości wolnych rodników. W działaniu przeciwnowotworowym potwierdzono współdziałanie TNF-α z IFN-γ oraz EMAP-2. Ze względu na swoje właściwości biologiczne TNF wydaje się mieć szerokie zastosowanie w leczeniu chorób nowotworowych. Literatura 1. 2. 3. Bazzoni F., Beutler B. The tumor necrosis factor ligand and receptor families, N Engl J Med., 334 (1996), pp. 1717-1725 Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L., Green S., Fiore N., Williamson B. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors, Proc Natl Acad Sci., 72 (1975), pp. 3666-3670 Beutler B., Greenwald D., Hulmes J.D., Chang M., Pan Z.C, Mathison J., Ulevitch R., Cerami A. Identity of tumour necrosis factor 66 TNF-α– budowa molekularna, aktywność w procesach nowotworowych oraz potencjalne wykorzystanie w badaniach klinicznych 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. and the macrophage-secreted factor cachectin Nature., 316 (1985), pp. 552-554 Marmenout A., Fransen L., Tavernier J., Van der Heyden J., Tizard R., Kawashima E., Shaw A., Johnson M.J., Semon D., Müller R., Ruysschaert M.R., van Vliet A., Fiers W. Molecular cloning and expression of human tumor necrosis factor and comparison with mouse tumor necrosis factor Eur J Biochem., 152 (1985), pp. 515-22 Muller U., Jongeneel C.V., Nedospasov S.A., Lindahl K.F., Steinmetz M. Tumour necrosis factor and lymphotoxin genes map close to H-2D in the mouse major histocompatibility complex Nature., 325 (1987), pp. 265-267 Bemelmans M.H., van Tits L.J., Buurman W.A. Tumor necrosis factor: function, release and clearance Crit Rev Immunol., 16 (1996), pp. 1-11 Aggarwal B.B. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword Nat Rev Immunol., 3 (2003), pp. 745-756 Ashkenazi A., Dixit V.M.. Death receptors: signaling and modulation Science., 281 (1998), pp. 1305-1308 Takada H., Chen N.J., Mirtsos C., Suzuki S., Suzuki N., Wakeham A., Mak T.W., Yeh W.C Role of SODD in regulation of tumor necrosis factor responses Mol Cell Biol., 23 (2003), pp. 4026-4033 Rath P.C., Aggarwal B.B.. TNF-induced signaling in apoptosis J Clin Immunol., 19 (1999) pp. 350-36 Zhang S.Q., Kovalenko A., Cantarella G., Wallach D. Recruitment of the IKK sygnalosome to the p55 TNF receptor: RIP and A20 bind to NEMO (IKKg) upon receptor stimulation Immunity., 12 (2000) pp. 301-311 Baker S.J., Reddy E.P.. Modulation of life and death by the TNF receptor superfamily Oncogene., 17 (1998), pp. 3261-3270 Manusama E.R., Stavast J., Durante N.M., Marquet R.L., Eggermont A.M. Isolated limb perfusion with TNF alpha and melphalan in a rat osteosarcoma model: a new anti-tumour approach Eur J Surg Oncol., 22 (1996), pp. 152-157 Manusama E.R., Nooijen P.T., Stavast J., Durante N.M., Marquet R.L., Eggermont A.M. Synergistic antitumour effect of recombinant human tumour necrosis factor alpha with melphalan in isolated limb perfusion in the rat Br J Surg., 83 (1996), pp. 551-555 Watanabe N., Niitsu Y., Umeno H., Kuriyama H., Neda H., Yamauchi N., Maeda M., Urushizaki I. Toxic effect of tumor necrosis factor on tumor vasculature in mice Cancer Res., 48 (1988), pp. 2179-2183 Prevost-Blondel A., Roth E., Rosenthal F.M., Pircher H. Crucial role of TNFalpha in CD8 T cell-mediated elimination of 3LL-A9 Lewis lung carcinoma cells in vivo Journal of Immunology., 164 (2000) pp. 3645-3651 Bergers G., Benjamin L.E. Tumorigenesis and the angiogenic switch Nat Rev Cancer., 3 (2003), pp. 401-410 Chambers A.F., Groom A.C., MacDonald I.C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites Nat Rev Cancer., 2 (2002) pp. 563-572 67 Joanna Woźniak,Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński 19. Bradley J.R., Thiru S., Pober J.S. Disparate localization of 55-kD and 75-kD tumor necrosis factor receptors in human endothelial cells Am J Pathol. 146 (1995), pp. 27-32 20. Hill S., Fawcett W.J, Sheldon J., Soni N., Williams T., Thomas J.M. Low-dose tumour necrosis factor alpha and melphalan in hyperthermic isolated limb perfusion Br J Surg., 80 (1993), pp. 995-997 21. Bonvalot S., Laplanche A., Lejeune F., Stoeckle E., Le Péchoux C., Vanel D., Terrier P., Lumbroso J., Ricard M., Antoni G., Cavalcanti A., Robert C., Lassau N., Blay J.Y., Le Cesne A. Limb salvage with isolated perfusion for soft tissue sarcoma: could less TNF-alpha be better? Ann Oncol., 16 (2005), pp. 1061-1068 22. van der Veen A.H., de Wilt J.H., Eggermont A.M. TNF-alpha augments intratumoural concentrations of doxorubicin in TNF-alpha-based isolated limb perfusion in rat sarcoma models and enhances anti-tumour effects Br J Cancer., 82 (2000), pp. 973-980 23. Orlowski R.Z., Baldwin A.S. NF-kappaB as a therapeutic target in cancer Trends Mol Med., 8 (2002), pp. 385-389 24. Wang C.Y., Cusack J.C, Liu R., Baldwin A.S. Control of inducible chemoresistance: enhanced anti-tumor therapy through increased apoptosis by inhibition of NF-kappaB Nat Med., 5 (1999), pp. 412-417 25. Lee K.Y., Chang W., Qiu D., Kao P.N., Rosen G.D. PG490 (triptolide) cooperates with tumor necrosis factor-alpha to induce apoptosis in tumor cells. J Biol Chem., 274 (1999), pp. 13451-13455 26. Richardson P.G., Barlogie B., Berenson J., Jakubowiak A., Lonial S., Raje N.S., Alsina M., Ghobrial I.M., Schlossman R.L., Munshi N.C., Mazumder A., Vesole D.H., Kaufman J.L., Colson K., McKenney M., Lunde L.E., Feather J., Maglio M.E., Warren D., Francis D., Hideshima T., Knight R., Esseltine D.L., Mitsiades C.S., Weller E., Anderson K.C. A phase 2 study of bortezomib in relapsed, refractory myeloma N Engl J Med., 348 (2003) pp. 2609-2617 27. Yang J.S., Wu C.C., Lee H.Z., Hsieh W.T, Tang F.Y., Bau D.T., Lai K.C., Lien J.C., Chung J.G. Suppression of the TNF-alpha level is mediated by GanLu-Yin (traditional Chinese medicine) in human oral cancer cells through the NF-kappa B, AKT, and ERK-dependent pathways Environ Toxicol. (2015) doi: 10.1002/tox.22127 28. Binder C., Schulz M., Hiddemann W., Oellerich M. Induction of inducible nitric oxide synthase is an essential part of tumor necrosis factoralphainduced apoptosis in MCF-7 and other epithelial tumor cells Lab Invest., 79 (1999), pp.1703-1712 29. de Wilt J.H., Manusama E.R., van Etten B., van Tiel S.T.B., Jorna A.S, Seynhaeve A.L., ten Hagen T.L., Eggermont A.M. Nitric oxide synthase inhibition results in synergistic anti-tumour activity with melphalan and tumour necrosis factor alpha-based isolated limb perfusions Br J Cancer., 83 (2000), pp. 1176-1182 30. Mocellin S., Provenzano M., Rossi C.R., Pilati P., Scalerta R., Lise M., Nitti D. Induction of endothelial nitric oxide synthase expression by melanoma 68 TNF-α– budowa molekularna, aktywność w procesach nowotworowych oraz potencjalne wykorzystanie w badaniach klinicznych 31. 32. 33. 34. 35. 36. sensitizes endothelial cells to tumor necrosis factor-driven cytotoxicity Clin Cancer Res., 10 (2004), pp. 6879-6886 Campanholo V.M., Silva R.M., Silva T.D., Neto R.A., Paiotti A.P., Ribeiro D.A., Forones N.M. Oral Concentrated Grape Juice Suppresses Expression of NF-kappa B, TNF-α and iNOS in Experimentally Induced Colorectal Carcinogenesis in Wistar Rats Asian Pac J Cancer Prev.16 (2015);16(3): 947-52 Totzke G., Schulze-Osthoff K., Janicke R.U. Cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors sensitize tumor cells specifically to death receptor-induced apoptosis independently of COX-2 inhibition Oncogene., 22 (2003), 8021-8030 Curnis F., Sacchi A., Corti A. Improving chemotherapeutic drug penetration in tumors by vascular targeting and barrier alteration J Clin Invest., 110 (2002), pp. 475-482 Fulda S., Debatin K.M. IFNgamma sensitizes for apoptosis by upregulating caspase-8 expression through the Stat1 pathway Oncogene., 21 (2002), pp. 2295-2308 Gnant M.F., Berger A.C., Huang J., Puhlmann M., Wu P.C., Merino M.J., Bartlett D.L., Alexander H.R., Libutti S.K. Sensitization of tumor necrosis factor alpha-resistant human melanoma by tumor-specific in vivo transfer of the gene encoding endothelial monocyte-activating polypeptide II using recombinant vaccinia virus Cancer Res., 59 (1999), 4668-4674 Schwarz M.A., Kandel J., Brett J., Hayward J., Schwarz R.E., Chappey O., J.L. Wauiter, J. Chabot, P.Lo Gerfo, D. Stern Endothelial-monocyte activating polypeptide II, a novel antitumor cytokine that suppresses primary and metastatic tumor growth and induces apoptosis in growing endothelial cells J Exp Med. 190 (1999), pp. 341-54 TNF-α – molecular structure, anti-tumor activity and potential application in clinical trials Abstract Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) is a multifunctional cytokine that plays crucial role in inflammation and also in apoptosis. Despite anti-tumor entitled, it is found in variety other diseases. Up to date, application of TNF-α is limited to local treatment of tumors. The binding of TNF- α with its specific TNF receptor type 1 and type 2 (TNFR-1, TNFR-2) leads to cascade reactions via transduction pathways, which process independently of each other and result in occurrence of two different effects – apoptosis and protection of the cell against programmed cell death. This review pays particular attention to describe current information of TNF-α: its molecular structure, signaling pathways and potential tumor activity. 69 Katarzyna Terlega1, Justyna Płonka1, Dariusz Kuśmierz1 Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej (MMPs) tworzą grupę enzymów proteolitycznych niezbędnych do utrzymania prawidłowej struktury macierzy pozakomórkowej (ECM). Można je znaleźć m.in. w fibroblastach, keratynocytach, monocytach, leukocytach, hepatocytach oraz komórkach nowotworowych. MMPs uczestniczą w regulacji procesów apoptozy, angiogenezy i odpowiedzi immunologicznej oraz wpływają na inwazyjność i tworzenie przerzutów. Obecność aktywnych enzymów z rodziny metaloproteinaz wykrywa się praktycznie na wszystkich etapach rozwoju procesu nowotworowego. Ich działanie polega na degradacji składników macierzy pozakomórkowej oraz uwalnianiu cząsteczek biologicznie czynnych, które z kolei wpływają na zachowanie się komórek nowotworowych. Zaangażowanie metaloproteinaz w procesy związane z rozwojem nowotworu daje szanse na wykorzystanie ich jako markerów pozwalających nie tylko potwierdzić obecność nowotworu, ale także określić jego stopień zaawansowania. 1. Wprowadzenie Rozwój nowotworu jest procesem złożonym i wieloetapowym. Obejmuje on proliferację i migrację komórek nowotworowych oraz ich przemieszczanie się drogą naczyń krwionośnych lub limfatycznych do odległych narządów. Związany jest również tworzeniem przerzutów oraz powstawaniem nowych naczyń krwionośnych, które odżywiają tkankę nowotworową i umożliwiają wzrost guza. Każdy z tych etapów pełniących istotną rolę w przejściu od zdrowej komórki do dojrzałego przerzutującego guza, regulowany jest poprzez interakcje wielu genów [1]. Naciekanie podścieliska tkankowego narządu oraz struktur sąsiadujących, a także tworzenie przerzutów odległych staje się możliwe tylko wtedy, gdy nowotwór przekroczy barierę jaką tworzą błony podstawne i elementy strukturalne macierzy pozakomórkowej. Aby guz mógł powiększać swe rozmiary, a komórki go budujące migrować do innych części organizmu niezbędny jest udział wydzielanych przez komórki nowotworowe enzymów proteolitycznych - głównie metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs), które odpowiadają za rozkład struktury błon podstawnych i macierzy pozakomórkowej [2÷4]. 1 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Zakład Biologii Komórki 70 Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach 2. Metaloproteinazy Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej stanowią liczną rodzinę endopeptydaz, których aktywność proteolityczna zależna jest od jonów cynku i wapnia [5÷7]. Posiadają zdolność degradacji i reorganizacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) [8]. Są jedynymi enzymami proteolitycznymi trawiącymi kolagen typu IV, który buduje szkielet błony podstawnej naczyń, tym samym przyczyniają się do powstawania przerzutów. W organizmie ludzkim występują 24 geny kodujące MMPs lecz tylko 23 metaloproteinazy ponieważ MMP-23 kodowany jest przez dwa jednakowe geny zlokalizowane na chromosomie 1 [5,8,9]. Wszystkie one mają zbliżony do siebie schemat budowy i masę cząsteczkową leżącą w przedziale od 28 do 92 kDa [10]. W strukturze chemicznej wszystkich MMPs można wyróżnić trzy domeny – peptyd sygnałowy, propeptyd oraz domenę katalityczną, a dodatkowo w obrębie większości MMPs również region zawiasowy oraz domenę hemopeksyny. Ponadto wybrane MMPs posiadają charakterystyczne domeny decydujące o ich odmiennych właściwościach [11÷14]. Biorąc pod uwagę budowę chemiczną oraz specyficzność substratową poszczególnych enzymów podzielono metaloproteinazy na sześć podrodzin: kolagenazy, do których należą MMP-1, MMP-8, MMP-13 oraz MMP18 – występujący wyłącznie u Xenopus; wykazują zdolność degradacji m.in. kolagenu typu I, II, III, V i IX; żelatynazy degradujące m.in. kolagen typu IV, lamininę oraz żelatynę; podrodzina obejmuje MMP-2 i MMP-9; stromielizyny, do których zaliczamy MMP-3, MMP-10 i MMP-11, enzymy te powodują rozkład składowych EMC: fibronektyny, lamininy oraz proteoglikanów; matrylizyny – MMP-7 i MMP-26, metaloproteinazy o najkrótszym łańcuchu polipeptydowym; ich substratami są m.in. żelatyna, fibronektyna, ligand Fas czy E-kadheryna; błonowe MMPs związane z powierzchnią błony komórkowej: MMP14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24 oraz MMP-25; niesklasyfikowane MMPs, które nie zostały przyporządkowane do innych grup MMP-12, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23, MMP-27 oraz MMP-28 [4, 15÷17]. Metaloproteinazy pełnią zasadnicze funkcje w licznych procesach fizjologicznych, których podstawą jest przebudowa istoty pozakomórkowej, tj. w morfogenezie tkanek, w rozwoju kości i zębów, w cyklicznym przekształceniu endometrium macicy oraz w zmianach zachodzących w tym narządzie podczas ciąży, porodu i połogu. Ponadto odgrywają znaczną rolę 71 Katarzyna Terlega, Justyna Płonka, Dariusz Kuśmierz w budowie tkanki podporowej narządów wewnętrznych oraz tworzeniu nowych naczyń krwionośnych. Umożliwiają także migrację komórek odpowiedzi immunologicznej do miejsca toczącego się procesu zapalnego oraz uczestniczą w procesie gojenia się ran i powstawania blizn [5, 14, 17, 18]. Syntetyzowane są wówczas przez wiele komórek, między innymi przez fibroblasty, keratynocyty, komórki śródbłonka naczyń, monocyty, makrofagi i leukocyty [11]. Jednak dużo ważniejszy z punktu widzenia diagnostyki i leczenia wydaje się być udział tych enzymów w procesach patologicznych prowadzących do powstania nowotworów lub rozwoju różnego rodzaju chorób. Wzrost aktywności proteolitycznej MMPs wykazano w schorzeniach, w których dochodzi do zaburzenia równowagi pomiędzy syntezą i rozkładem elementów strukturalnych macierzy pozakomórkowej, takich jak: miażdżyca, zapalenie stawów czy choroby nowotworowe [9]. 2.1. Kontrola aktywności metaloproteinaz Zsyntetyzowane MMP mają postać nieaktywnych zymogenów (preproenzymów), ich aktywacja jest realizowana poprzez usunięcie prodomeny i tym samym odsłonięcie miejsca aktywnego. W procesie tym, zwanym przełącznikiem cysteinowym, rozerwane zostaje wiązanie pomiędzy grupą tiolową cysteiny w propeptydzie i atomem cynku w centrum aktywnym, co powoduje zmianę konformacji cząsteczki MMP [4, 19]. Przeważająca część MMP aktywowana jest na zewnątrz komórki, natomiast błonowe MMPs: MMP-1 i MMP-21 aktywowane są wewnątrz komórki w aparacie Golgiego [13]. Do pełnej aktywacji enzymu wymagana jest obecność jonów wapnia [4, 20]. Istnieje wiele czynników mogących wywołać aktywację MMP. Należą do nich między innymi: HgCl2, detergenty (SDS), niskie pH, podwyższona temperatura, proteazy oraz reaktywne formy tlenu [13]. W prawidłowych komórkach metaloproteinazy wydzielane są w małych ilościach a ich aktywność jest niska, jednak gdy zajdzie konieczność niespodziewanej przebudowy macierzy pozakomórkowej natychmiast indukowana jest ich produkcja i uwalnianie [20]. Aktywność tych enzymów w warunkach fizjologicznych podlega regulacji na poziomie: transkrypcji genów; translacji; aktywacji proenzymów; oraz poprzez inhibitory tkankowe [6, 14, 21÷23]. W badaniach in vitro udowodniono, że liczne substancje takie jak czynniki wzrostu i cytokiny a wśród nich: nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF), czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), interleukina 1β (IL-1β), 72 Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), interleukina 6 (IL-6), transformujący czynnik wzrostu β (TNF-β), środki chemiczne, psychiczny stres, onkogeniczna transformacja błonowa podobnie jak wzajemne oddziaływanie komórki na komórkę lub komórki na macierz – regulują ekspresję genów kodujących MMP [6,14]. Aby stać się aktywnym, proenzym MMP musi przejść przez proces zwany „przełącznikiem cysteinowym” podczas, którego zyskuje aktywność katalityczną [24]. Większość proMMP jest wydzielana z komórki i aktywowana poza nią. Nieaktywny zymogen może zostać aktywowany przez proteinazy lub czynnik nie posiadający właściwości proteolitycznych [6]. Proces nadania aktywności zymogenowi MMP obejmuje bezpośrednią aktywację przez proteinazy, redukcję przez utleniacze lub nie fizjologiczne reagenty oraz przekształcenia allosteryczne [24]. Aktywacja proenzymu zachodząca pod wpływem enzymów proteolitycznych, plazminy, jonów metali oraz oksydantów jest kolejnym stopniem kontroli aktywności metaloproteinaz [24]. Aktywność metaloproteinaz kontrolowana jest również przez szereg endogennych inhibitorów, niektóre z nich to ogóle inhibitory proteazy np. α2-makroglobulina lub α1-proteaza, które są niespecyficzne w stosunku do MMPs i powodują blokowanie aktywność MMPs przede wszystkim w osoczu i płynach tkankowych [19]. Istnieje również grupa strukturalnie powiązanych i specyficznych w stosunku do MMPs tkankowych inhibitorów metaloproteinaz zwanych w skrócie TIMP [25÷29]. Obecnie zidentyfikowane zostały cztery takie inhibitory: TIMP-1, TIMP-2 i TIMP-4 są wydzielane do płynów tkankowych natomiast TIMP-3 zakotwiczony jest w ECM czyli w macierzy pozakomórkowej [19]. Wszystkie TIMPs posiadają 12 konserwatywnych reszt cysteiny, które są niezbędne do utworzenia sześciu wiązań dwusiarczkowych. N-końcowa domena każdego TIMPs jest wymagana do hamowania aktywności MMP [30]. Mechanizm działania inhibitorów tkankowych może być dwojaki. Po pierwsze inhibitory TIMP mogą działać już na poziomie aktywacji proenzymu poprzez zablokowanie możliwości odłączenia N-końcowego fragmentu metaloproteinaz [14]. Po drugie może zostać utworzony kompleks TIMP-MMP co powoduje inaktywację aktywnej formy metaloproteinazy [29, 31]. 73 Katarzyna Terlega, Justyna Płonka, Dariusz Kuśmierz 3. Metaloproteinazy w nowotworach 3.1. Metaloproteinazy a mikrośrodowisko guza Metaloproteinazy odgrywają niezwykle istotną rolę w procesie rozwoju nowotworu, jednak - jak wykazano w licznych pracach - same komórki nowotworowe syntetyzują tylko niewielkie ilości MMPs. Strategia przyjęta przez nowotwór polega przede wszystkim na pobudzaniu otaczających je prawidłowych komórek (fibroblastów, makrofagów, komórek tucznych, wielojądrzastych neutrofili, adypocytów i komórek śródbłonka) do wytwarzania potrzebnych im MMPs. W procesie tym pośredniczą interleukiny, interferony, czynniki wzrostu i induktor metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej (EMMPRIN) [32,33]. Należy pamiętać też, że zwiększenie ekspresji MMPs jest naturalną konsekwencją starzenia się fibroblastów, które może być ważnym ogniwem w wytworzeniu proonkogenicznego środowiska w tkance i zwiększać liczbę zachorowań wraz z wiekiem. Uszkodzenia DNA powodują wzmożony MMP-zależny wzrost komórek rakowych [34]. 3.2. Rola metaloproteinaz w rozwoju nowotworu Wśród krytycznych dla rozwoju nowotworu procesów, na które oddziaływują MMPs warto wymienić: proliferację komórek nowotworowych, inwazyjność, migrację, angiogenezę oraz blokowanie apoptozy komórek nowotworowych. Jedne z najnowszych badań pozwalają stwierdzić, iż rożne enzymy z rodziny MMPs wpływają na rozmaite procesy odbywające się na kolejnych etapach rozwoju choroby. Bardzo ciekawym jest fakt, że są one zdolne zarówno do przyśpieszenia jak i do hamowania rozwoju nowotworu, a kierunek w jakim będzie przebiegał rozwój zależy między innymi od stadium guza i jego lokalizacji [35]. MMPs mogą przyczyniać się do proliferacji komórek nowotworowych na kilka sposobów. Mogą one zmieniać biologiczną dostępność czynników wzrostu i funkcję receptorów na powierzchni komórek. Posiadają np. zdolność uwalniania insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF) i receptorów czynnika wzrostu naskórka (EGFR) dla ligandów, które promują proliferację. EGFR pełni funkcję mediatora proliferacji komórkowej, który przyczynia się do rozwoju nowotworu, ponieważ ulega nadekspresji w przypadku ponad jednej trzeciej wszystkich guzów litych [36]. Warte uwagi są również wyniki badań, które potwierdzają kluczową rolę interakcji pomiędzy glikozoaminoglikanami (GAG)-MMP-GFS, która powoduje aktywację proMMP [37]. Migracja komórek nowotworowych jest podstawowym procesem w inwazyjności i przerzutowaniu nowotworu, ale żeby była możliwa 74 Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach konieczna jest degradacja macierzy zewnątrzkomórkowej przez metaloproteinazy. Nadekspresja MMPs intensyfikuje migrację komórek nowotworowych, natomiast nadmierna ekspresja TIMPs lub wykorzystanie inhibitorów MMPs ogranicza migrację [14]. Nowotwór odżywiany tylko przez naczynia krwionośne z sąsiadujących tkanek może osiągnąć maksymalną średnicę około 2 mm dalszy jego wzrost i możliwość przerzutowania zależy od zaopatrzenia w tlen i substancje odżywcze dostarczane poprzez naczynia krwionośne [14,38]. Najistotniejszą rolę w procesie angiogenezy nowotworowej odgrywają MMP-2, MMP-9 oraz MMP-14 i w mniejszym stopniu MMP-1 i MMP-7 [36]. MMP-9 m.in. uczestniczy w uruchamianiu włącznika naczyniotwórczego, MMP-2,-7,-9,12 posiadają możliwość trawienia plazminogenu i uwalniania zwiększającej apoptozę komórek nowotworowych angiostatyny [38]. Angiogeneza w obrębie zmian nowotworowych prawie zawsze dotyczy małych naczyń krwionośnych. Proces tworzenia nowych naczyń możemy podzielić na pięć etapów: zwiotczenie ściany naczyń i pobudzenie komórek śródbłonka; degradacja błony podstawnej i macierzy zewnątrzkomórkowej; migracja i proliferacja komórek śródbłonka; wytworzenie rurkowatych struktur nowego naczynia; otoczenie nowopowstałych naczyń przez komórki mezenchymalne [13]. Powstawanie nowych naczyń krwionośnych może odbywać się na różne sposoby. Poprzez waskulogenezę, czyli tworzenie naczyń de novo z angioblastów, różnicujących się następnie w dojrzale komórki śródbłonka lub poprzez tworzenie naczyń na bazie już istniejącej sieci naczyń [13]. Innym sposobem jest najczęściej opisywany mechanizm zwany kiełkowaniem (sprouting) wykorzystujący proliferacją i migrację EC, tworzących ściany powstających naczyń [39]. Wśród czynników regulujących proces angiogenezy najistotniejszym jest VEGF czyli naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu [38,40]. Metaloproteinazy mają zdolność zarówno indukowania jak i hamowania apoptozy. Działanie proapoptotyczne MMP-7 polega na uwolnieniu związanego z błoną ligandu Fas, który łącząc się ze swoimi receptorami uruchamia szlak sygnalizacyjny [7]. MMPs mogą wspomagać apoptozę komórek w procesie anoikis [13]. Pośrednio również zmiana składu ECM wywołana działaniem MMPs może wywierać efekt proapoptotyczny. Efekt antyapoptotyczny związany jest z aktywacją pośrednią serynowo/treoinowej kinazy Akt/białko B przez kaskady sygnalizacyjne EGFR i IGFR [36]. 75 Katarzyna Terlega, Justyna Płonka, Dariusz Kuśmierz 3.3. Metaloproteinazy w różnych nowotworach Liczne badania prowadzone w celu oceny zależności pomiędzy ekspresją metaloproteinaz np. w tkance nowotworowej czy surowicy krwi, a występowaniem zmian nowotworowych, ich stopniem zaawansowania, oraz występowaniem przerzutów odległych potwierdzają, iż w wielu nowotworach złośliwych następuje wzrost ekspresji MMPs. 3.3.1. Nowotwór krtani Jest to najczęściej występujący złośliwy nowotwór szyi i głowy. Współczynnik zachorowań na raka krtani wynosi wśród mężczyzn 4,8% a wśród kobiet tylko 0,4% wszystkich zarejestrowanych zachorowań na nowotwory. W męskiej populacji występowanie tego typu nowotworu jak i umieralność nim spowodowana jest około 10-15-krotnie wyższe niż w populacji kobiet. Najliczniejszą grupą chorych z takim umiejącowieniem zmian stanowią wśród mężczyzn pacjenci w przedziale wiekowym od 50 do 60 lat, a wśród kobiet te powyżej 70 roku życia [41]. W wyniku przeprowadzonych badań ekspresji MMP-1,-2,-9 w preparatach mikroskopowych pobranych od chorych na raka krtani, zaobserwowano wzrost ekspresji MMP-1 u 63,5% pacjentów, MMP-2 u 16,3% pacjentów oraz MMP-9 u 37,5% pacjentów. Uzyskane wyniki dotyczyły nowotworów o niskim zróżnicowaniu. W przeprowadzonych testach obserwowano istotną zależność między ekspresją MMP-2, a obecnością przerzutów do węzłów chłonnych oraz brak takiej zależności dla MMP-1 i MMP-9 [42]. 3.3.2. Nowotwór żołądka Rak żołądka plasuje się na drugim miejscu w rankingu chorób nowotworowych o najwyższej śmiertelności. Najczęściej chorują na niego mieszkańcy Japonii, Chin oraz Rosji a najrzadziej występuje on w Ameryce Północnej i Europie Zachodniej. Biorąc jako kryterium częstość zachorowania na nowotwory złośliwe w Polsce to rak żołądka zajmuje trzecie miejsce wśród mężczyzn i ósme wśród kobiet [21]. W licznych badaniach zaobserwowano nasiloną ekspresję metaloproteinaz i fakt iż poziom ekspresji MMPs jest proporcjonalny do stopnia zaawansowana nowotworu. Stężenie MMP-9 w osoczu chorych jest wyższe niż u zdrowych, a jej nasilona ekspresja występuje w przypadku obecności przerzutów odległych i słabo zróżnicowanego guza. Krótsza przeżywalność obserwowana jest w przypadku wzrostu ekspresji: MMP-2, MMP-3, MMP7, MMP-9 I MMP-13. Występowanie przerzutów do węzłów chłonnych związane jest z ekspresją MMP-2 i MMP-9. W badaniach wykazano również istotny związek pomiędzy nadekspresją MMP-7, MMP-9 i MMP-13, a zwiększoną złośliwością nowotworu [5]. 76 Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach 3.3.3. Nowotwór trzustki Szacunkowa roczna ilość zachorowań na raka trzustki waha się od 4 do 10 przypadków wykrytych na 100 tysięcy mieszkańców, co powoduje że jest on ósmą przyczyną zgonów powodowanych przez nowotwory złośliwe na świecie. Nowotwór tego narządu cechuje się agresywnym przebiegiem, złym rokowaniem i wysokim wskaźnikiem śmiertelności [5, 18]. Rak trzustki jest niezwykle podstępną chorobą, która przez długi czas nie daje prawie żadnych objawów a w momencie wystąpienia symptomów chorobowych najczęściej mamy już do czynienia z zaawanso-wanym jej stadium. Zastosowanie metaloproteinaz w diagno-styce może dać szansę na wykrycie choroby w jej wczesnym stadium co zwiększyło by szanse chorych na dłuższe przeżycie, a może nawet całkowity powrót do zdrowia. Przeprowadzono badania oceniające poziom różnych biomarkerów raka trzustki w tkankach, krwi oraz soku trzustkowym. W analizach surowicy krwi oraz tkanek zauważono, iż stężenie MMP-9 było znacznie wyższe u pacjentów z gruczolakorakiem przewodowym trzustki niż u chorych z przewlekłym zapaleniem trzustki oraz osób zdrowych [26]. Liczne badania potwierdzają, że MMP-9 ma znaczący wpływ na powstawanie przerzutów raka przewodowego trzustki [43]. Inne badania wskazują, iż nasilona synteza MMP-2 i MMP-9 w komórkach nowotworowych może ułatwiać naciekanie guza i zwiększać stopień jego inwazyjności [18]. Dodatkowo wykazano występowanie mRNA dla MMP-1 w komórkach raka trzustki, a badania Ito i wsp. sugerują, że pacjenci, u których wykryto MMP-1 mają gorsze rokowania niż ci, u których jej nie znaleziono [44]. Kolejne badania dowiodły, że komórki raka trzustki charakteryzują się wyższą ekspresją MMP-7,-8,-9,-11 w porównaniu do zdrowej tkanki . Nadekspresja MMP-11 powiązana jest z obecnością przerzutów do węzłów chłonnych [45]. Stosując żelatynową zymografię do analizy wskaźnika aktywności MMP-2, (stosunek aktywnej postaci MMP-2 do całkowitego MMP-2 oraz proMMP-2) w uzyskanym endoskopowo soku trzustkowym, wykazano znaczący wzrost tego wskaźnika u chorych z rakiem trzustki w stosunku do pacjentów z zapaleniem trzustki oraz osób zdrowych. Aktywna forma MMP-2 została znaleziona także u pacjentów, u których średnica guza trzustki była mniejsza niż 2 cm, co pozwala sądzić, iż ocena aktywności MMP-2 za pomocą zymografii może pełnić funkcję wskaźnika w diagnostyce raka trzustki, także w jego wczesnym stadium [46]. 77 Katarzyna Terlega, Justyna Płonka, Dariusz Kuśmierz 3.3.4. Nowotwór płuc Największa zachorowalność na raka płuc występuje między 55 a 70 rokiem życia i w 80% przypadków występuje postać niedrobnokomórkowa (NDRP). Pośród czynników zwiększających ryzyko rozwoju nowotworu w płucach są: palenie tytoniu, zapalne zmiany włókniste płuc oraz praca w powietrzu zawierającym azbest, uran. Bardzo często nowotwór płuc ma przebieg bezobjawowy, a z powodu przerzutów 30-40% chorych nie kwalifikuje się do chirurgicznego usunięcia guza [5]. Badania dotyczące MMPs w próbkach surowicy krwi oraz plwociny wykazały znaczący wzrost poziomu MMP-2 w przypadku nowotworu płuc w porównaniu do zmian łagodnych i grupy kontrolnej [47]. Ekspresja MMP7 była wyższa w NDRP niż w komórkach gruczolakoraka i skorelowana z krótszym czasem przeżycia pacjentów. Zauważono także ujemną korelację między poziomem MMP-7, a ogólną odpowiedzią na chemioterapię dlatego też ekspresja MMP-7 może być znaczącym czynnikiem prognostycznym i służyć może do przewidywania odpowiedzi na chemioterapię [26]. Wykazano ponadto brak wpływu podwyższonego stężenia MMP-9 w surowicy krwi na wielkość guza oraz przerzutowanie do węzłów chłonnych. Natomiast potwierdzono, iż MMP-9 odpowiada za przerzuty odlegle [5]. 3.3.5. Rak piersi Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem u kobiet na świecie. Badania, w których rozpatrywany jest udział MMPs i TIMPs w patogenezie raka piersi zmierzają do wytypowania tych spośród metaloproteinaz, które mogłyby znaleźć zastosowanie jako wczesne markery raka gruczołu piersiowego oraz czynniki prognostyczne przebiegu choroby. Sugeruje się, że MMP-1 przyczynia się do zapoczątkowania rozwoju raka piersi. W tkance nowotworowej uzyskanej od pacjentek z rakiem piersi obserwuje się podwyższoną aktywność proteolityczną MMP-1, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-15, MMP-19, MMP-23 i MMP-28 [48] oraz MMP-2 i MMP-9 [49]. Stosunki ekspresji MMP2/TIMP-2 oraz MMP-9/TIMP-1 mogą mieć znaczenie jako wskaźniki pozwalające różnicować łagodne i złośliwe zmiany nowotworowe rozwijające się w obrębie gruczołu piersiowego. Podwyższony stosunek MMP-9/TIMP-1 w tkance nowotworowej piersi koreluje z większym rozmiarem zmiany nowotworowej, natomiast MMP-2/TIMP-2 z występującymi przerzutami w węzłach chłonnych [50]. 78 Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach 3.3.6. Czerniak Czerniak (melanoma malignum) jest jednym z najbardziej złośliwych nowotworów skóry. Wywodzi się on z melanocytów, ulegających złośliwej przemianie. Najczęstszym umiejscowieniem czerniaka jest skóra oraz błony śluzowe i siatkówka oka. Wykorzystanie wielu technik badawczych pozwoliło na identyfikację metaloproteinaz macierzy zarówno w obrębie komórek czerniaka, jak i komórkach podścieliska je otaczających. Z rozwojem czerniaka związany jest zwiększony poziom MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13 i MMP-14. MMP-2 identyfikowana jest zarówno w zmianach barwnikowych łagodnych jak i złośliwych, przy czym w złośliwych jest wyraźnie wyższa. MMP-2 koreluje również z występowaniem odległych przerzutów i krótszym czasie przeżycia u chorych z czerniakiem [51]. Również ekspresja MMP-1, MMP-13, MT-MMP-1, TIMP-1 oraz TIMP-3 jest podwyższona w fazach zaawansowanych zmian, natomiast ekspresja MMP-9 ogranicza się do wczesnych faz czerniaka, co wskazuje na odmienne profile ekspresji MMP w różnych stadiach rozwoju tych zmian [52]. 4. Podsumowanie Przytoczone dane prezentują ważną rolę jaką metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej spełniają zarówno w procesach fizjologicznych jak i w rozwoju procesu nowotworowego. Czynny udział MMP w procesach związanych z powstawaniem i rozwojem zmian nowotworowych daje szansę na zastosowanie ich jako markerów nowotworowych. Dokładne poznanie właściwości biologicznych metaloproteinaz oraz związków hamujących ich aktywność może w przyszłości podnieść skuteczność terapii przeciwnowotworowych. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. Martin M.D., Matrisian L.M. The Rother side of MMPs : protestive roles in tumor progression, Cancer Metastasis Rev., 2007 Dec, 26 (3-4), pp. 717-724 Grębecka L. Migracja komórek nowotworowych w organizmie, Kosmos, 44 (1995), pp. 405-436 Radzikowski C., Opolski A., Wietrzyk J. Postęp w badaniach procesu inwazyjnego i przerzutowania, Nowotwory – Journal of Oncology, 53 (2002), pp. 57-65 Kwiatkowski P., Godlewski J., Śliwińska – Jewsiewicka A., Kmieć Z. Rola metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej w procesie inwazji nowotworu, Pol. Ann. Med. 15 (2008), pp.43-50 Zygmunt K., Zygmunt L. Znaczenie Metaloproteinaz i ich inhibitorów tkankowych w procesie nowotworowym, Przegl. Med. Uniw. Rzesz. Inst. Leków, 3 (2013), pp. 410-417 79 Katarzyna Terlega, Justyna Płonka, Dariusz Kuśmierz 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. Hijova E. Matrix metalloproteinases: their biological functions and clinical implications, Bratisl Lek Listy, 106 (2005), pp. 127-132 Zitka O., Kukacka J., Krizkova S., Huska D.,. Adam V, Masarik M., Prusa R., Kizek R. Matrix Metalloproteinases, Curr Med Chem, 17 (2010), pp. 3751-3768 Hadler-Olsen E., Fadnes B., Sylte I., Uhlin-Hansen L., Winberg J.O. Regulation of matrix Metalloproteinase activity in health and disease, FEBS J, 278(2011), pp. 28-45 Dziankowska-Bartkowiak B., Waszczykowska E., Żebrowska E. Udział metaloproteinaz i ich inhibitorów w patogenezie wybranych chorób skóry, Alergia Astma Immunologia, 9 (2004), pp.71-79 Tauro M., McGuire J., Lynch C.C. New approaches to selectively target associated matrix metalloproteinases activity, Cancer Metastasis Rev., 33 (2014), pp. 1043-1057 Kessenbrock K., Plaks V., Werb Z. Matrix metalloproteinases: Regulators of the tumor microenvironment, Cell, 141 (2010), pp. 52-67 Scherer R.L., McIntyre J.O., Matrisian L.M. Imaging matrix metalloproteinases in cancer, Cancer Metastasis Rev., 27 (2008), pp. 679-690 Fink K., Boratyński J. Rola metaloproteinaz w modyfikacji macierzy zewnątrzkomórkowej w nowotworowym wzroście inwazyjnym, w przerzutowaniu i w angiogenezie, Postep Hig Med Dosw, 66 (2012), pp. 609-628 Śliwowska I., Kopczyński Z. Metaloproteinazy macierzy zewnątrz – charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartość oznaczenia u chorych na raka piersi, Współczesna Onkologia, 9 (2005), pp. 327-335 Decock J., Thirkettle S., Wagstaff L., Edwards D.R. Matrix metalloproteinases: protectice, roles in cancer, J Cell Mol Med., 6 (2011), pp. 1254-1265 Krizkova S., Zitka O., Masarik M., Adam V., Stiborova M., Eckschlager T., Hubalek J., Kizek R. Clinical importance of matrix metalloproteinases, Bratisl Lek Listy, 112 (2011), pp. 435-440 Wlaźlak E., Surkont G., Kobos J., Tyliński W., Stetkiewicz T., Suzin J. Ekspresja metaloproteinaz MMP-1, MMP-9 oraz tkankowego inhibitora metaloproteinazy TIMP-1 w przypadkach raka endometrium oraz rozrostów błony śluzowej jamy macicy, Przegląd Menopauzalny, 6 (2006), pp. 363-366 Łukaszewicz M., Mroczko B., Szmitkowski M. Rola metaloproteinaz i ich inhibitorów w raku trzustki, Post. Hig. Med. Dośw., 62 (2008), pp. 141-147 Folgueras A.R., Pendas A.M., Sanchez L.M., Lopez-Otin C. Matrix metaloproteinas in cancer: from new functions to improved inhibition strategies, Int. J. Dev. Biol., 48 (2004), pp. 411-424 Nagase H., Woessner J.F. Matrix metalloproteinases, J Biol Chem, 274 (1999), pp. 21491-21494 Łukaszewicz-Zając M., Mroczko B., Szmitkowski M. Znaczenie metaloproteinaz oraz ich inhibitorów w raku żołądka, Postępy Hig. Med. Dośw., 63 (2009), pp. 258-265 Biljana E., Boris V., Cena D., Veleska-Stefkovska D. Matrix metaloproteina (with akcent to collagenases), J Cell and Animal Biology, 5 (2011), pp. 113-120 80 Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach 23. Egeblad M., Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression, Nat Rev Cancer, 2 (2002), pp. 163-176 24. Deryugina E.I., Quigley J.P. Pleiotropic role of matrix metalloproteinases In tumor angiogenesis: Contrasting, overlapping and compensatory function, Biochim Biophys Acta, 1803 (2010), pp. 103-120 25. Konjević G., Stanković S. Matrix metalloproteinases in the process of invasion and metastasis of breast cancer, Arch Oncol, 14 (2006), pp.136-140 26. Roy R., Yang J., Moses M.A. Matrix metalloproteinases as novel biomarks and potential therapeutic target in human cancer, J Clin Oncol, 27 (2009), pp. 5287-5297 27. Visse R., Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function and biochemistry, J Am Heart Assoc, 92 (2003), pp. 827-839 28. Noel A., Jost M., Maquoi E. Matrix metalloproteinases at cancer tumor-host interface, Seminars in Cell & Developmental Biology, 19 (2008), pp. 52-60 29. Murphy G., Nagase H. Progress in matrix metalloproteinases research, Mol Aspects Med., 29 (2008), pp. 290-308 30. Polette M., Nawrocki-Raby B., Gilles C., Clavel C., Birembaut P. Tumor invasion and matrix metalloproteinases, Crit Rev Oncol Hematol, 49 (2004), pp. 179-186 31. Albin A., Melchiori A., Santi L., Liotta L.A., Brown P.D., Stetler-Stevenson W.G. Tumor cell invasion inhibited by TIMP-2, J. Natl Cancer Inst, 83 (1991), pp. 775-779 32. Zigrino P., Löffek S., Mauch C. Tumor-stoma interactions: their role In control of tumor cell invasion, Biochimie, 87 (2005), pp. 321-328 33. Sternlicht M.D., Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior, Annu Rev Cell Dev Biol, 17 (2001), pp. 463-516 34. Liu D., Hornsby PJ. Senescent human fibroblasts increase the elary growth of xenograft tumors via matrix metalloproteinase secretion, Cancer Res, 67 (2007), pp. 3117-3126 35. Decock J., Hendrickx W., Vanleeuw U., Van Belle V., Van Huffel S., Christiaens M.R. Plasma MMP-1 and MMP-8 expression in breast cancer: protective role of MMP-8 against lymph node metastasis, BMC Cancer, 20 (2008), pp. 8-77 36. Gialeli C., Theocharis A.D., Karamanos N.K. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting, FEBS Journal, 278 (2011), pp.16-27 37. Yu W.H, Woessner J.F., McNeish J.D., Stamenkovic I. CD44 anchors the assembly of matrilysin/MMP-7 with heparyn-binding epidermal growth factor prekursor and ErbB4 and regulates female reproductive organ remodeling, Genes Dev, 16 (2002), pp. 307-323 38. Yoon S.O., Park S.J., Yun C.H., Chung A.S. Roles of matrix metalloproteineses in tumor metastasis and angiogenesis, J Biochem Mol Biol, 36 (2003), pp. 128-137 39. Risau W. Mechanisms of angiogenesis, Nature, 386 (1997), pp. 671-674 40. Hua H., Li M., Lou T., Yin Y. Matrix metalloproteinases in tumorigenesis: an evolving paradigm, Cell Mol Life Sci, 68 (2011), pp. 3853-3868 81 Katarzyna Terlega, Justyna Płonka, Dariusz Kuśmierz 41. Gryczyński M., Pietruszewska W. Angiogeneza jako nowy czynnik rokowniczy u chorych na raka krtani, Otorynolaryngologia, 1 (2002), pp. 13-20 42. Pietruszewska W., Kobos J., Durko T., Murlewska A., Bojanowska-Poźniak K. Ocena ekspresji i wartości prognostycznej metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej -1, -2 i -9 w raku krtani, Nowotwory – Journal of Oncology, 60 (2010), pp. 28-36 43. Pryczynicz A., Guzińska-Ustymowicz K., Dymicka-Piekarska V., Czyżewska J., Kemona A. Expression of matrix metalloproteinase9 in pancreatic ductal carcinoma is associated with tumor metastasis formation, Folia Histochem Cytobiol, 45 (2007), pp. 37-45 44. Ito T., Ito M., Shiozawa J., Naito S., Kanematsu T., Sekine I. Expression of the MMP-1 in human pancreatic carcinoma: relationship with prognostic factor, Mod Pathol, 12 (1999), pp. 669-674 45. Jones L.E., Humphreys M.J., Campbell F., Neoptolemos J.P., Boyd M.T. Comprehensive analysis of matrix metalloproteinase and tissue inhibitor expression In pancreatic cancer: increased expression of matrix metalloproteinase-7 predicts poor survival, Clin Cancer Res, 10 (2010), pp. 2832-2845 46. Yokohama M., Ochi K., Ichimura M., Mizushima T., Shinji T., Koide N., Tsurumi T., Hasuoka H., Harada M. Matrix metalloproteinase-2 in pancreatic juice for diagnosis of pancreatic cancer, Pancreas, 24 (2002), pp. 344-347 47. Ali-Labib R., Louka M.L., El-Sayed Galal I.H., Tarek M. Evaluation of matrix metalloproteinases-2 in lung cancer, Proteomics. Clinical applications, 8 (2014), pp. 251-257 48. Kohrmann A., Kammerer U., Kapp M., Dietl J., Anacker J. Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) in primary human breast cancer and breast cancer cell lines: New findings and review of the literature. BMC Cancer 9, 188 (2009), pp.1-20 49. Liu S.C., Yang S.F., Yeh K.T. Relationships between the level of matrix metalloproteinase-2 and tumor size of breast cancer, Clin Chim Acta, 371 (2006), pp. 92-96 50. Jinga D.C., Blidaru A., Condrea I., Ardeleanu C., Dragomir C., Szegli G., Stefanescu M., Matache C. MMP-9 and MMP-2 gelatinases and TIMP-1 and TIMP-2 inhibitors in breast cancer: correlations with prognostic factors, J Cell Mol Med, 10 (2006), pp. 499-510 51. Wandel E., Raschke A., Hildebrandt G., Eberle J., Dummer R., Anderegg U., Saalbach A. Fibroblasts ehhance theninvasive capacity of melanoma cells in vitro, Arch Dermatol Res 293 (2002), pp. 601-608 52. Hofmann U., Houben R., Bröcker E., Becker J. Role of matrix metalloproteinases in melanoma cell invasion, Biochime 87 (2005), pp. 307-314 53. Bogaczewicz J., Chodorowska G., Krasowska D., Rola metaloproteaz macierzy i tkankowych inhibitorów metaloproteaz w progresji nowotworów skóry a nowe strategie farmakologicznej inhibicji metaloproteaz macierzy, Prz Dermatol 91 (2004), pp. 153-160 82 Znaczenie metaloproteinaz w nowotworach The importance of metalloproteinases in cancer Abstract Extracellular matrix metalloproteinases (MMPs) are a group of proteolytic enzymes necessary to maintain the normal structure of the extracellular matrix (ECM). MMPs are expressed in fibroblasts, keratinocytes, monocytes, leukocytes, hepatocytes and tumor cells. Virtually all stages of cancer demonstrated activity of enzyme from the family of metalloproteinases which consisted of the degradation of extracellular matrix components and the release of biologically active molecules, which influence the behavior of cancer cells. MMPs are involved in the regulation of apoptosis, angiogenesis and immune response as well as influence on invasiveness and metastasis. The involvement of metalloproteinases in the processes associated with the development of cancer is the chance to use them as sensitive and accurate tumor markers, allowing not only to confirm the presence of cancer but also to determine its degree of the progress. 83 Tomasz Wandtke1, Joanna Woźniak2, Alicja Janicka3 Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne w diagnostyce infekcji wirusowych? Aptamery to sekwencje oligonukleotydowe DNA lub RNA, które nie wykazują własności kodujących. Ich cechą charakterystyczną jest niezwykle wysokie powinowactwo wiązania oraz specyficzność wobec cząsteczek docelowych o różnej budowie (związki wielko- oraz małocząsteczkowe) i pochodzeniu (związki organiczne i nieorganiczne). Aptamery pozyskiwane są w procesie selekcji in vitro, znanym także jako SELEX. Ze względu na swoje właściwości aptamery mogą być wykorzystane jako potencjalnie skuteczne narzędzie zarówno w diagnostyce jak i terapii medycznej. Ich wykorzystanie w aptasensorach pozwala na szybką, czułą i swoistą detekcję zarówno wczesnych (materiał genetyczny, białka wirusa) jak i późnych markerów zakażenia wirusem (przeciwciała produkowane przez organizm gospodarza). 1. Wprowadzenie Aptamery to cząsteczki kwasu rybo- (RNA) lub deoksyrybonukleinowego (DNA) o strukturze jednoniciowej, których cechą charakterystyczną jest zdolność wiązania różnorodnych molekuł [1]. Spektrum wiązanych przez nie drobin okazuje się niezwykle szerokie, odkąd metodami eksperymentalnymi określono, że mogą być to pojedyncze atomy, ale także całe cząsteczki, pochodzenia zarówno nieorganicznego jak i organicznego, a nawet całe komórki [1÷3]. Co niezwykle istotne, rozpoznanie oraz związanie cząsteczki docelowej przez aptamer jest niezwykle specyficzne i trwałe. Niejednokrotnie udowodniono, że stała dysocjacji takich kompleksów wykazywała wielkości nanomolowe [1]. Aptamery to cząsteczki otrzymywane w procesie selekcji in vitro, w skrócie oznaczanym jako SELEX (ang. SystematicEvolution of Ligands by ExponentialEnrichment). Proces ten, szczegółowo opisany w dalszych rozdziałach, pozwala na otrzymanie aptamerów o wysokim powinowactwie wiązania i specyficzności wobec określonych molekuł [4]. Co ważne, modyfikacja warunków przebiegu tego procesu pozwala otrzymać aptamery 1 [email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu; Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy 2 [email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu; Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy 3 [email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu; Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy 84 Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne w diagnostyce infekcji wirusowych? wiążące cząsteczki docelowe z największym powinowactwem i specyficznością w ściśle zdefiniowanych przez eksperymentatora warunkach np. temperatury otoczenia, ciśnienia, pH, lepkości roztworu i wielu innych [3, 5]. Ostatnie dekady to okres intensywnego rozwoju diagnostyki i terapii medycznej z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych. Ich stosowanie uznaje się aktualnie za złoty standard w terapii wielu chorób, a w szczególności w dziedzinie diagnostyki laboratoryjnej gdzie wykorzystywane są w celu wykrywania wielu infekcji. Aptamery, ze względu na łatwość wytwarzania oraz swoje właściwości wydają się być interesującą alternatywą dla aktualnie stosowanych procedur. Istnieje wiele czynników pozwalających uznać aptamery za drobiny konkurencyjne w wymienionych powyżej obszarach. Wśród najważniejszych powodów można wymienić przede wszystkim możliwość pozyskania aptamerów wiążących ligandy o właściwościach toksycznych. Wysiłki podjęte w celu pozyskania przeciwciał monoklonalnych w takich okolicznościach, nastręczają wielu trudności, gdyż jak powszechnie wiadomo w celu ich otrzymania niezbędna jest wcześniejsza immunizacja antygenem zwierząt laboratoryjnych. Jako, że antygen w tym przypadku może wykazywać właściwości toksyczne, immunizacja zwierząt laboratoryjnych z jego udziałem może doprowadzić do ich śmierci. W przypadku aptamerów otrzymywanych na drodze procesu selekcji in vitro, podobne zagrożenie nie występuje [3]. Kolejną przewagą aptamerów nad przeciwciałami monoklonalnymi wydaje się być ich wielkość. Niewielkie rozmiary aptamerów sprawiają, że są one idealne do zastosowań in vivo. Pozwalają one dosięgnąć rejonów, które są niedostępne dla większych przeciwciał monoklonalnych. Interesująca wydaje się także możliwość ich sprzęgania z innymi związkami, co ma na celu poszerzyć spektrum ich właściwości. Proponuje się np. użycie barwników immunofluorescencyjnych co pozwalałoby na wykorzystanie aptamerów w diagnostyce obrazowej i laboratoryjnej, lub środków o działaniu cytotoksycznym co mogłoby przysłużyć się zwiększeniu selektywności leczenia przeciwnowotworowego. Sprzęganie takie, przeciwnie niż w przypadku przeciwciał monoklonalnych, nie wpływa na pierwotną specyficzność i powinowactwo aptamerów [1, 6]. W końcu, także krótszy czas pozyskiwania aptamerów, niższe koszty tego procesu oraz ich większa stabilność w porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi sprawia, że są one w centrum zainteresowania wielu naukowców [3]. Pomimo zainteresowania, oczywistych zalet względem przeciwciał monoklonalnych oraz niezwykle dużej swoistości i powinowactwa względem drobin docelowych nie doszło jak dotąd do szerszego wykorzystania aptamerów w diagnostyce i terapii. Aptamery to drobiny stosunkowo nowe, które wymagają dokładnego zbadania zanim zostaną 85 Tomasz Wandtke, Joanna Woźniak, Alicja Janicka użyte na ludziach. Jak dotąd jedynym aptamerem, który przeszedł pozytywnie wszystkie próby kliniczne i wszedł do powszechnego użytku farmaceutycznego jest Macugen (pegaptanib sodu) stosowany w okulistyce w leczeniu wysiękowej postaci zwyrodnienia plamki żółtej związanej z wiekiem (ang. Age-RelatedMacularDegeneration, AMD). Macugen to aptamer skierowany przeciw czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. VascularEndothelialGrowthFactor, VEGF), blokujący patologiczny rozrost unaczynienia w gałce ocznej w przebiegu wyżej wspomnianej jednostki chorobowej [7]. Mimo skąpej obecności preparatów o składzie aptamerowym na rynku, należy nadmienić, że co najmniej kilka kolejnych środków o różnym spektrum działania i zastosowaniu (m.in. o działaniu przeciwnowotworowym i antykoagulacyjnym) znajduje się aktualnie w zaawansowanej fazie prób klinicznych [1, 7]. Jak dotąd, poza badaniami eksperymentalnymi, aptamerów nie stosowano w diagnostyce laboratoryjnej. Postuluje się, że ich użycie może przyczynić się do: zwiększenia czułości testów oraz stworzenia możliwości szybszego postawienia bardziej wiarygodnej diagnozy, co powinno w sposób bezpośredni przełożyć się na wydajność i skuteczność terapii w przypadku wielu różnych jednostek chorobowych, w tym szczególnie o charakterze infekcji wirusowych. 2. Cel pracy Celem niniejszej pracy jest przedstawienie aktualnego stanu wiedzy na temat możliwości wykorzystania aptamerów w diagnostyce wirusologicznej oraz wykazanie ich wszechstronności i przewagi nad przeciwciałami monoklonalnymi, stanowiącymi „złoty standard” diagnostyki laboratoryjnej. W dalszej części tego opracowania, zaprezentowano sposób otrzymywania, mechanizm działania oraz przykłady aptamerów potencjalnie użytecznych w diagnozowaniu ostrych i przewlekłych chorób wirusowych. 3. Otrzymywanie aptamerów. Proces selekcji in vitro W 1990 roku Ellington i Szostak po raz pierwszy zastosowali nową technikę selekcji cząsteczek kwasów nukleinowych. Jej użycie pozwalało na otrzymanie oligonukleotydów zdolnych do wiązania innych drobin (np. białek) z dużym powinowactwem i specyficznością. Technikę tą nazwali selekcją in vitro (wcześniej przywołany SELEX), a molekuły uzyskane w tym procesie aptamerami [4]. W celu pozyskania aptamerów, w procesie tym wykorzystuje się kombinatoryczną bibliotekę sekwencji DNA lub RNA, obejmującą wszystkie możliwe sekwencje o określonej długości. Długość aptameru, a zatem także sekwencji biblioteki kombinatorycznej, nie jest zwykle 86 Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne w diagnostyce infekcji wirusowych? krótsza niż 20 i dłuższa niż 90 nukleotydów. W pierwszym etapie procesu kombinatoryczną bibliotekę sekwencji poddaje się inkubacji z molekułą docelową w dobranych przez eksperymentatora warunkach [4, 5]. Warto zaznaczyć zatem, że opisywana procedura pozwala otrzymać aptamery wiążące cząsteczki docelowe w różnych, nie zawsze fizjologicznych warunkach, co nie jest możliwe w przypadku przeciwciał monoklonalnych [5]. W trakcie inkubacji, wybrane sekwencje charakteryzujące się specyficznością wobec cząsteczki docelowej i największym wobec niej powinowactwem, ulegają przez nią związaniu. Pozostałe, niezwiązane, usuwane są z mieszaniny. Wyselekcjonowane tą drogą aptamery odzyskuje się, powiela i poddaje kolejnym cyklom selekcyjnym [4]. Każda z sekwencji zawartych w bibliotece kombinatorycznej oskrzydlona jest z dwóch stron tzw. sekwencjami stałymi. Rejony te stanowią miejsca przyczepu białek enzymatycznych o właściwościach polimerazowych. Obecność tych sekwencji pozwala na zwielokrotnienie liczby aptamerów po każdym cyklu selekcyjnym. W przypadku kombinatorycznej biblioteki DNA przeprowadza się łańcuchową reakcję polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR), zaś w przypadku biblioteki RNA najpierw transkrypcję w warunkach in vitro (z użyciem polimerazy RNA bakteriofaga T7) i następnie jak w przypadku biblioteki DNA reakcję PCR. Zwielokrotnienie uszczuplonej już po cyklu selekcyjnym puli aptamerów, pozwala zmusić cząsteczki do współzawodniczenia między sobą o miejsce wiązania z drobiną docelową, której stężenie ulega zmniejszeniu w kolejnym cyklu selekcji. W konsekwencji prowadzi to do pozyskania aptameru, który będzie wiązał cząsteczkę docelową nie tylko w sposób specyficzny, ale także z największym możliwym powinowactwem [4]. Standardowo przeprowadza się od 15 do 25 cyklów selekcji. Po uzyskaniu właściwego aptameru przeprowadza się jego ocenę obejmującą określenie stałej dysocjacji i sekwencji nukleotydowej. Działanie takie pozwala na pozyskanie kolejnych aptamerów na drodze sztucznej syntezy chemicznej, bez przeprowadzania uprzednio selekcji w warunkach in vitro [4]. Niweluje to koszty i ogranicza czas ich pozyskiwania. 4. Diagnostyka zakażeń wirusowych z wykorzystaniem aptamerów Diagnostyka zakażeń wirusowych niesie ze sobą wiele wyzwań [8]. Właściwa i przede wszystkim szybka diagnoza jest kluczem do terapii tego rodzaju zakażeń. Różne infekcje wirusowe charakteryzują się często odmiennym przebiegiem, co jest bezpośrednią pochodną odmiennej 87 Tomasz Wandtke, Joanna Woźniak, Alicja Janicka budowy i biologii wirusów je wywołujących. Istnieją jednak także wspólne elementy dla tego rodzaju chorób. Przede wszystkim początek infekcji zazwyczaj jest skąpoobjawowy, dlatego wykrycieinfekcji wirusowych na wczesnym etapie nastręcza wielu trudności. Sukces terapii bardzo często zależy od wczesnego wykrycia zakażenia. Czas to najważniejszy czynnik warunkujący powodzenie terapii szczególnie w przypadku chorób wirusowych o przewlekłej naturze, takich jak HIV (ludzki wirus niedoboru odporności; ang. Human ImmunodeficiencyVirus) czy HCV (wirus zapalenia wątroby typu C; ang. Hepatitis C Virus). Nie mniej istotne jest także szybkie zdiagnozowanie chorób, które mogą stanowić szybko szerzące się zagrożenie epidemiologiczne, gdzie ilość zakażeń rośnie w krótkim czasie (np. wirus grypy). Obowiązujący standard w diagnostyce infekcji wirusowych stanowią testy immunoenzymosorbcyjne oraz odczyny biologii molekularnej [8÷11]. Chociaż są to powszechnie stosowane procedury, postrzega się je jako nieatrakcyjne, ze względu na ich wieloetapowość, czasochłonność, wysoki koszt i nierzadko zbyt małą czułość [10÷12]. Fundamentalnym problemem testów immunoenzymatycznych jest konieczność stosowania przeciwciał monoklonalnych. Ich pozyskanie po pierwsze nie zawsze jest możliwe, po drugie jeśli możliwe nie jest gwarantem czułości testu, natomiast zawsze bywa długotrwałe i kosztowne [3]. Większość aktualnie stosowanych testów tego rodzaju umożliwia wykrycie zakażenia w momencie wytworzenia odporności (przeciwciał) przez gospodarza, do czego dochodzi nierzadko dopiero po kilku tygodniach, a nawet miesiącach od infekcji. Natomiast u pacjentów poddanych np. leczeniu immunosupresyjnemu do produkcji przeciwciał może nie dojść wcale [13]. Pojawiające się okienko serologiczne stanowi poważny problem dzisiejszej diagnostyki medycznej. Jego występowanie wiąże się z opóźnionym podjęciem decyzji o leczeniu i gorszymi rokowaniami dla chorego, a także niebezpieczeństwem rozprzestrzeniania się zakażenia. Problem ten miały rozwiązać badania molekularne, umożliwiające bezpośrednie wykrycie materiału genetycznego intruza, bez konieczności oczekiwania na odpowiedź immunologiczną gospodarza. Niewątpliwą zaletą testów molekularnych jest ich czułość, pozwalająca wykryć już pojedyncze kopie wirusów w krótkim czasie po zakażeniu. Jednak ze względu na bardzo wysoki jednostkowy koszt badań tego rodzaju, są one wykonywane stosunkowo rzadko [14]. Odpowiedzią na ograniczenia testów molekularnych oraz immunoenzymatycznych są aptamery. Możliwość pozyskania aptamerów o wysokiej specyficzności i powinowactwie wiązania przeciwko dowolnemu antygenowi wirusowemu, w połączeniu z niskim kosztem 88 Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne w diagnostyce infekcji wirusowych? ich produkcji, sprawia że wydają się one atrakcyjną alternatywą dla aktualnie stosowanych procedur. Ich użycie umożliwia wykrycie zarówno wczesnych (materiał genetyczny, białka wirusa) jak i późnych (przeciwciała produkowane przez gospodarza) markerów infekcji wirusem [8, 15]. Interesująca jest także strategia umożliwiająca różnicowanie komórek gospodarza na zakażone wybranym wirusem i zdrowe, a także użycie cząsteczek rozróżniających aktywne i nieaktywne formy wirusów [16, 17]. Od czasu kiedy po raz pierwszy otrzymano aptamery minęło ponad dwadzieścia lat [4]. Jednak możliwości ich wykorzystania w diagnostyce zakażeń wirusowych zaczęto zauważać stosunkowo niedawno. Skala badań nad ich wykorzystaniem na tym polu wciąż jest niewielka i obejmuje najczęściej eksperymenty z wykorzystaniem wirusów już stanowiących, albo mogących stanowić w najbliższej przyszłości poważny problem epidemiologiczny, takimi jak HIV-1, HCV, HBV (wirus zapalenia wątroby typu B, ang. Hepatitis B Virus), HPV (wirus brodawczaka ludzkiego, ang. Human PapillomaVirus), SARS(zespół ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej, ang. SevereAcute Respiratory Syndrome) czy wirusy grypy, gdzie szybkie postawienie diagnozy jest istotne dla chorego i znacząco zmniejsza ryzyko rozprzestrzenienia infekcji [12, 15, 18÷22]. Rzadko prowadzi się badania nad innymi wirusami. W przeprowadzonych dotąd badaniach wykorzystano wiele aptamerów o różnorodnym mechanizmie działania. W swojej pierwotnej formie, aptamery to cząsteczki wiążące i unieczynniające białka. Na tej podstawie mogą przysłużyć się zarówno w diagnostyce jak i w terapii zakażeń wirusowych. W okresie późniejszym stworzono także cząsteczki aptamerowe zdolne do wiązania materiału genetycznego wirusów. Oba mechanizmy pozwalają na wczesną i precyzyjną detekcję obecności wirionów w organizmie gospodarza. Jednak, same aptamery mogą stanowić jedynie element systemu detekcyjnego. Ich odpowiednie wykorzystanie w tzw. aptasensorach wykorzystujących różnego rodzaju oddziaływania biochemiczne, fizyczne oraz fizykochemiczne pozwoliło stworzyć precyzyjne, szybkie oraz czułe wirusologiczne testy diagnostyczne. Przykłady aptamerów, ich ligandy (elementy poszczególnych wirusów lub całe wirusy) oraz mechanizmy ich działania przedstawiono w poniższej tabeli ze wskazaniem odpowiednich referencji, gdzie przedstawiono ich dokładny opis. 89 Tomasz Wandtke, Joanna Woźniak, Alicja Janicka Tabela 1. Przykłady wykorzystania aptamerów w diagnostyce laboratoryjnej Lp. 1. 2. Wirus Grypa typ B Grypa typ A Ligand aptameru Hemaglutynina typ B Hemaglutynina typ A 3. Grypa typ H5N1 (ptasia grypa) Hemaglutynina 4. 5. HIV-1 Białko Tat 6. Antygen rdzeniowy 7. HCV Glikoproteina E2 8. 9. HBV Antygen HbS Wykorzystanie Rok Źródło Detekcja obecności wirusa; różnicowanie wirusa typu A i B 2005 [23] 2006 [24] 2012 [10] 2013 [11] 2005 [18] 2013 [15] 2007 [13] 2009 [20] 2010 [19] Detekcja obecności wirusa; aptamer w sensorze wykorzystującym powierzchniowy rezonans plazmowy (SPR) Detekcja obecności wirusa; aptamer w sensorze wykorzystującym mikrowagę kwarcową (QCM) Detekcja obecności wirusa; aptamer w sensorach wykorzystującychSPR oraz QCM Detekcja obecności wirusa; aptamer w sensorze wykorzystującym diamentowy tranzystor polowy (FET) Detekcja wirusa; aptamer znakowany fluorescencyjnie (Cy-3) Różnicowanie komórek na prawidłowe i zainfekowane wirusem; aptamer znakowany fluorescencyjnie (FITC) Różnicowanie komórek na zainfekowane wirusem i prawidłowe 90 Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne w diagnostyce infekcji wirusowych? 10. Ospakro wia 11. 12. HPV-16 13. 14. Całe cząsteczki wirusa Różnicowanie cząsteczek wirusa na aktywne i nieaktywne; aptamer w sensorze wykorzystującym złotą mikroelektrodęo właściwościach impedymetrycznych Glikowana Hemaglutynina Onkoproteina E7 Epitopy powierzchniow ekomórek prawidłowych Różnicowanie komórek na zainfekowanie i niezainfekowane wirusem Materiał genetyczny wirusa Jakościowa i ilościowa ocena wirusa; 3modułowy fluorescencyjny aptasensor Denga 2012 [17] 2009201 0 [9, 25] 2011 [21] 2012 [16] 2010 [8] Źródło: Opracowanie własne 5. Podsumowanie Aktualna diagnostyka medyczna walczy z wieloma wyzwaniami. Jednym z najpoważniejszych jest tzw. okienko serologiczne, którego istnienie opóźnia diagnozę i leczenie, tym samym przyczyniając się często do gorszych rokowań. Aktualnie stosowanym standardem diagnostycznym w wykrywaniu wielu infekcji, w tym wirusowych są przeciwciała monoklonalne. Ich wykorzystanie, choć pomocne, wiąże się jednocześnie z wieloma ograniczeniami (np. brak możliwości detekcji infekcji wirusowej przed wyprodukowaniem przeciwciał odpornościowych przez organizm gospodarza). Z kolei badania molekularne, choć dają możliwość wczesnej detekcji zakażenia, wykonywane są rzadko ze względu na swój wysoki koszt. Rozwiązaniem dla przywołanych problemów mogą okazać się aptamery, cząsteczki kwasów nukleinowych zdolne do czułej detekcji białek i/lub kwasów nukleinowych wirusów. Ich wykorzystanie wiąże się z niskimi kosztami produkcji oraz możliwością detekcji zakażenia tuż po kontakcie z patogenem. Jak dotąd żaden aptamer nie wszedł do użytku laboratoryjnego w zakresie diagnostyki medycznej. Jednak spektrum ich zalet przedstawionych w artykule powinno zachęcać do dalszych eksperymentów, a nawet wdrożenia rozwiązań diagnostycznych opierających się na ich wykorzystaniu. 91 Tomasz Wandtke, Joanna Woźniak, Alicja Janicka Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Zhou J., Bobbin M.L., Burnett J.C., Rossi J.J. Current progress of RNA aptamer-based therapeutics, Front Genet., 3 (2012), pp. 1-14 Keefe A., Ellington P. S. Aptamers as therapeutics, Nat Rev Drug Discov., 9 (2010),pp. 537-550 Szpechciński A., Grzanka A. Aptamers in clinical diagnostics, Postępy Biochem., 52 (2006), pp. 260-270 Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature, 346 (1990),pp. 818-822 Ni X., Castanares M., Mukherjee A., Lupold E. Nucleic acid aptamers: clinical applications and promising new horizons, Curr Med Chem., 18 (2011), pp. 4206-4214 Dey A., Khati M., Tang M., Wyatt R., Lea S., James W. An Aptamer That Neutralizes R5 Strains of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Blocks gp120-CCR5 Interaction, Journal of Viology, (2005), pp. 13806-13810 Sundaram P., Kurniawan H., Byrne M.E., Wower J. Therapeutic RNA aptamers in clinical trials, Eur J Pharm Sci.,48 (2013),pp. 259-271 Fletcher S.J., Phillips L.W., Milligan A.S., Rodda S.J. Toward specific detection of Dengue virus serotypes using a novel modular biosensor, BiosensBioelectron., 26 (2010), pp.1696-1700 Parekh P., Tang Z., Turner P.C., Moyer R.W., Tan W. Aptamers recognize glycosylated hemagglutinin expressed on the surface of vaccinia virus-infected cells, Anal Chem., 82 (2010), pp. 8642-8649 Bai H., Wang R., Hargis B., Lu H., Li Y. A SPR Aptasensor for detection of avian influenza virus H5N1,Sensors, 12 (2012), pp. 12506-12518 Wang R., Li Y. Hydrogel based QCM aptasensor for detection of avian influenza virus, BiosensBioelectron., 42 (2013), pp. 148-155 Negri P., Chen G., Kage A., Nitsche A., Naumann D., Xu B., Dluhy R.A. Direct optical detection of viral nucleoprotein binding to an anti-Influenza aptamer,Anal. Chem.,84 (2012), pp. 5501-5508 Lee S., Kim Y.S., Jo M., Jin M., Lee D., Kim S. Chip-based detection of hepatitis C virus using RNA aptamers that specifically bind to HCV core antigen, BiochemBiophysRes Commun., 358 (2007), pp. 47-52 Ocadiz-Delgado R., Albino-Sanchez M.E., Garcia-Villa E., Aguilar-Gonzalez M.G., Cabello C., Rosete D., Mejia F., Manjarrez-Zavala M.E., OndarzaAguilera C., Rivera-Rosales R.M., Gariglio P. In situ molecular identification of the Influenza A (H1N1) 2009 Neuraminidase in patients with severe and fatal infections during a pandemic in Mexico City, BMC Infect Dis., 13 (2013), pp. 1-20 Ruslinda R.A., Tanabe K., Ibori S., Wang X., Kawarada H. Effects of diamond-FET-based RNA aptamer sensing for detection of real sample of HIV-1 Tat protein,BiosensBioelectron., 40 (2013), pp. 277-282 Graham J.C., Zarbl H. Use of Cell-SELEX to generate DNA aptamers as molecular probes of HPV-associated cervical cancer cells, PLoSOne.,7 (2012), pp. 1-9 92 Aptamer – czułe i specyficzne narzędzie przydatne w diagnostyce infekcji wirusowych? 17. Labib M., Zamay A.S., Muharemagic D., Chechik A.V., Bell J.C., Berezovski M.V. Aptamer-based viability impedimetric sensor for viruses, Anal Chem., 84 (2012), pp. 1813-1816 18. Tombelli S., Minunni M., Luzi E., Mascicni M. Aptamer-based biosensors for the detection of HIV-1 Tat protein,Bioelectrochemistry, 67 (2005), pp. 135-141 19. Liu J., Yang Y., Hu B., Ma Z., Huang H., Yu Y., Liu S., Lu M., Yang D. Development of HBsAg-binding aptamers that bind HepG2.2.15 cells via HBV surface antigen,VirolSin., 25 (2010), pp. 27-35 20. Chen F., Hu Y., Li D., Chen H., Zhang X. CS-SELEX generates high-affinity ssDNAaptamers as molecular probes for Hepatitis C Virus envelope glycoprotein E2, PLoS One., 4 (2009), pp. 1-11 21. Toscano-Garibay J.D., Benitez-Hess M.L., Alvarez-Salas L.M. Isolation and characterization of an RNA aptamer for the HPV-16 E7 oncoprotein, Arch Med Res., 42 (2011), pp. 88-96 22. Cho S.J., Woo H.M., Kim K.S., Oh J.W., Jeong Y.J. Novel system for detecting SARS coronavirus nucleocapsid protein using an ssDNA aptamer,J BiosciBioeng., 112 (2011), pp. 535-540 23. Gopinath S.C., Kawasaki K., Kumar P.K. Selection of RNA-aptamer against human influenza B virus, Nucleic Acids SympSer (Oxf)., 49 (2005), pp. 85-86 24. Gopinath S.C., Misono T.S., Kawasaki K., Mizuno T., Imai M., Odagiri T., Kumar P.K. An RNA aptamer that distinguishes between closely related human influenza viruses and inhibits haemagglutinin-mediated membrane fusion, J Gen Virol., 87 (2006), pp. 479-487 25. Tang Z., Parekh P., Turner P., Moyer R.W., Tan W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells,Clin Chem., 55 (2009), pp. 813-522 Aptamer – a sensitive and specific tool useful in diagnostics of viral infections? Aptamers are oligonucleotide sequences of DNA or RNA that do not exhibit coding properties. They are characterized by an extremely high binding affinity and specificity towards target molecules of different structure (high- and low-molecular weight compounds) and origin (organic and inorganic). Aptamers are obtained in the process of in vitro selection, also known as SELEX. Due to their properties, aptamerscould be used as a potentially effective tool in diagnostics and medical therapy. Their utilization in aptasensors allows for rapid, sensitive and specific detection of early (the genetic material and/or proteins of the virus) and late (antibodies produced by the host) viral infection markers. 93 Anna Machnikowska1, Aleksandra Jarosz2, Lidia Kotuła3 Możliwości farmakologiczne w zaburzeniach syntezy neuroprzekaźników w autyzmie Streszczenie Wzrastająca wykrywalność zaburzeń ze spektrum autyzmu (Autism Spectrum Disorder; ASD) we współczesnej populacji stanowi ważny problem dla społeczeństwa. Obecnie według danych Centers for Disease Control and Prevention zaburzenia ze spektrum autyzmu są wykrywane w Stanach Zjednoczonych u 1 dziecka na 68. Przyczyna tego zjawiska pozostaje nieznana. Obecnie ASD uznawanie są za zaburzenia o podłożu epigenetycznym - możliwości leczenia przyczynowego pozostają ograniczone. W leczeniu stosuje się psychoterapię oraz farmakoterapię. Podanie leków neurotropowych opiera się na znajomości zaburzeń neurochemicznych mogących wystąpić w mózgu pacjenta. W patogenezie autyzmu odgrywają rolę nieprawidłowości w układzie serotoninergicznym, acetylocholinergicznym, brak równowagi między działaniem aktywującym oraz hamującym glutaminianu i GABA, a także obniżenie stężenia oksytocyny w porównaniu z populacją ogólną. W pracy postaramy się przedstawić możliwości terapeutyczne związane z zaburzeniami receptorów o podłożu genetycznym. 1. Wprowadzenie Zaburzenia ze spektrum autyzmu (autism spectrum disorders – ASD) to pojęcie obejmujące grupę chorób wynikających z zaburzeń rozwoju neurologicznego charakteryzujących się nieprawidłowościami w obrębie interakcji społecznych, komunikacji oraz ograniczonymi zainteresowaniami. Autyzm to najlepiej poznane zaburzenie należące do tej grupy [1]. Problem ASD we współczesnej populacji jest coraz wyraźniej dostrzegalny. Według danych Centers for Disease Control and Prevention wykrywalność zaburzeń ze spektrum autyzmu wzrosła w Stanach Zjednoczonych wzrosła z 1 na 150 dzieci w 2000r do 1 na 68 dzieci w 2010r [2]. W Polsce brak jest danych epidemiologicznych dotyczących zaburzeń ze spektrum autyzmu. Szacuje się, że w populacji polskiej żyje co najmniej 30 tysięcy osób z tym zaburzeniem [3]. Niewątpliwie wzrost wykrywalności ASD ma związek ze zmianą kryteriów diagnostycznych oraz zwiększoną wiedzą społeczną na temat autyzmu, nie wydaje się to jednak ostatecznie wyjaśniać przyczyny tego zjawiska. Podejrzewa się udział czynników środowiskowych w zwiększeniu 1 [email protected] Uniwersytet Medyczny w Lublinie [email protected] Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 [email protected] Uniwersytet Medyczny w Lublinie 2 94 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób zachorowalności na ASD takich jak: zanieczyszczenia środowiska, niedotlenienie okołoporodowe czy ciężkie infekcje w okresie niemowlęcym. Niewątpliwie zaburzenia neuroprzekaźnictwa mają znaczenie w patogenezie autyzmu. Niektóre z nich można korygować za pomocą farmakoterapii. Na złożony patomechanizm ASD nakładają się czynniki genetyczne. 2. Podłoże genetyczne Autyzm to zaburzenie o podłożu wielogenowym, które cechuje duża heterogenność. Niemal w każdym chromosomie odkryto nieprawidłowości, które mogą mieć znaczenie w rozwoju autyzmu. Kluczową rolę przypisuje się genom biorącym udział w synaptogenezie, np. SHANK3 [4]. Na genetyczne predyspozycje do tego zaburzenia wskazuje badanie przeprowadzone wśród brytyjskich bliźniąt, które wykazało, że zgodność zachorowań na autyzm wśród bliźniaków jednojajowych wynosi 60%, zaś wśród dizygotycznych 0%. Natomiast porównując szersze zaburzenia takie jak zaburzenie interakcji społecznej częstość wzrosła do 92% i 10% [5]. Obserwuje się również zwiększoną częstość zapadalności na zaburzenia ze spektrum autyzmu wśród rodzeństwa: jest ona 25-krotnie większa niż w populacji ogólnej [6]. Cechy autystyczne występują ponadto w przebiegu zespołów genetycznych takich jak: zespół Angelmana, zespół łamliwego chromosomu X, stwardnienie guzowate. Dyskutowana jest rola zaburzeń metylacji genów znajdujących się na chromosomie X ulegających ekspresji w mózgowiu w patogenezie autyzmu [4]. Wiele genów, których mutacje są wykrywane u pacjentów z zaburzeniami ze spektrum autyzmu dotyczy neuroprzekaźnictwa. 3. Przekaźnictwo serotoninergiczne Serotonina (5-hydroksytryptamina) jest neuroprzekaźnikiem o działaniu zarówno hamującym jak i pobudzającym. Właściwe przekaźnictwo serotoninergiczne warunkuje prawidłowe reakcje emocjonalne, nastrój, odczuwanie bólu, sen czy łaknienie[7]. Nie można pominąć również jej znaczenia w procesach neurorozwojowych, migracji neuronów, wzrostu komórek neuronalnych czy synaptogenezy[8]. Wyniki badań wskazują na zwiększoną ilość serotoniny w płytkach krwi pacjentów z autyzmem w porównaniu z populacją ogólną aż w 30-50% przypadków. W związku z odkryciem znaczenia przekaźnictwa serotoninergicznego z autyzmem powstała teoria hiperserotoninergiczna. Zgodnie z tą hipotezą zaburzenia ze spektrum autyzmu są skorelowane z nieprawidłowościami w sekrecji serotoniny we wczesnych stadiach rozwoju neuronalnego. Powoduje to zmniejszoną gęstość lub wrażliwość na serotoninę receptorów 5-HT i zaburzenia w synaptogenezie. W rezultacie prowadzi to do zaburzeń w architekturze mózgu. 95 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz W badaniach neuroobrazowych za pomocą pozytonowej emisyjnej tomografii komputerowej wykazano zmniejszoną całkowitą syntezę serotoniny w porównaniu z populacją ogólną, szczególnie wśród najmłodszych pacjentów cierpiących na autyzm. Rozkład deficytu 5HT w poszczególnych częściach kory mózgu zależał od wielkości problemów z komunikacją werbalną. U osób z największymi problemami językowymi wykazano najmniejszy wychwyt tryptofanu w lewej półkuli [9]. Serotonina działa na ponad tuzin różnych typów receptorów[7]. Obecność patologii wśród nich wpływa na powstawanie zaburzeń takich jak: depresja, problemy ze snem, agresja, napady złośliwości oraz problemy z komunikacją, czyli objawów związanych z ASD. Wpływ konkretnych uwarunkowań genetycznych na dysfunkcję przekaźnictwa serotoni-nergicznego nie został dokładnie poznany. Wykazano jednak zwiększoną częstość występowania ASD wśród rodzin, w których występowały zaburzenia związane z układem serotoninergicznym: depresja, choroba dwubiegunowa, zaburzenia obsesyjnokompulsywne [10]. Najmocniejszą pozycję wśród genów, których polimorfizm ma udowodniony związek z objawami ASD zajmuje gen SCL6A4 kodujący transporter serotoniny (5HTT). Występuje on w postaci polimorfizmów: l i s. Haplotyp ss lub ls jest związany z objawami takimi jak problemy z komunikacją oraz odwzajemnieniem społecznym, a haplotyp ll warunkuje zachowania agresywne i stereotypowe. Niemniej jednak obecność danego haplotypu nie jest skorelowana z wystąpieniem autyzmu. W zaburzeniach ze spektrum autyzmu często wykorzystuje się leki działające na układ serotoninergiczny, zwiększające ilość serotoniny w szczelinie synaptycznej. Największe znaczenie w łagodzeniu objawów autyzmu mają inhibitory zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI). Szacuje się, że leki z tej grupy są stosowane aż u 21%-32% dzieci cierpiących na autyzm. Z badań przeprowadzonych do tej pory wynika, że podawanie tych leków zmniejsza zachowania stereotypowe u części pacjentów z ASD oraz agresję. Lepszą odpowiedź na leki z tej grupy i mniej działań niepożądanych zaobserwowano u starszych dzieci oraz dorosłych [11]. Ostatnio zwrócono jednak uwagę, iż dotychczasowe badania na temat skuteczności działania tych leków zostały przeprowadzone na małych populacjach, a ich wyniki nie są jednoznaczne. Ponadto postawiono hipotezę, iż skuteczność selektywnych inhibitorów wychwytu zwrotnego serotoniny może zależeć od polimorfizmu genu SLC6A4. W celu weryfikacji tej hipotezy oraz skuteczności działania leków wpływających na układ serotoninergiczny u pacjentów z ASD zostały zarejestrowane randomizowane badania na dużej populacji [12]. Najpopularniejszym lekiem z grupy SSRI jest fluoksetyna. Jej stosowanie może wiązać się z działaniami niepożądanymi takimi jak: stan maniakalny oraz nadaktywność. Inną grupą leków działającą na układ serotoninergiczny 96 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób są trójpierścieniowe leki przeciwdepresyjne. Nortryptylina, która jest najlepiej tolerowanym lekiem z tej grupy, wpływa na zmniejszenie nadaktywności, agresji oraz zachowań powtarzalnych. Do działań niepożądanych TLPD należy sedacja. Wystąpić może również agresja, drażliwość oraz nadaktywność [13]. 4. Neuroprzekaźnictwo cholinergiczne Acetylocholina w ośrodkowym układzie nerwowym może działać zarówno w sposób hamujący oraz pobudzający w różnych drogach nerwowych. Drogi te mają znaczenie w zapamiętywaniu, odbieraniu bodźców czuciowych oraz koordynacji ruchowej [7]. Receptory dla acetylocholiny dzielą się na muskarynowe i nikotynowe. Ostatnie badania wykazały że dysfunkcje neuroprzekaźnictwa cholinergicznego mogą mieć znaczenie w patogenezie ASD. Wśród osób chorujących na autyzm zaobserwowano zmniejszenie wiązania agonisty do receptora nikotynowego zbudowanego z podjednostki α4 o 40-50% w warstwie ziarnistej i komórkach Purkiniego kory mózgowia w porównaniu do zdrowych osobników. Natomiast wiązanie agonisty do podjednostki α7 receptora nikotynowego warstwy ziarnistej było trzykrotnie zwiększone [14]. Locus dla podjednostki α4 receptora nikotynowego znajduje się na chromosomie 20q13.2-q13.3. Aberracje tego regionu łączy się z występowaniem padaczki oraz schizofrenii, ale ich związek z autyzmem nie został zbadany [15]. Wśród leków działających na neuroprzekaźnictwo cholinergiczne w autyzmie stosuje się inhibitory cholinoesterazy: donepezil, rywastygminę i galantaminę. Wykazano, że łagodzą one szczególnie takie objawy jak nadaktywność oraz drażliwość dzieci [13]. 5. Równowaga między neuroprzekaźnikami: GABA i glutaminianem Glutaminian jest aminokwasem kwaśnym działającym w ośrodkowym układzie nerwowym jako neuroprzekaźnik pobudzający. Jego funkcja to udział w długotrwałym wzmocnieniu synaptycznym niezbędnym w procesach zapamiętywania. Ponadto odgrywa rolę w apoptozie komórek nerwowych spowodowanej krwiakiem lub urazem. Zwiększona ilość tego przekaźnika sprzyja neurodegeneracji. Stężenie glutaminianu jest regulowane przez enzym: dekarboksylazę kwasu glutaminowego (GAD). Przekształca on glutaminian w kwas gamma-aminomasłowy (GABA). GABA jest najważniejszym hamującym neuroprzekaźnikiem mózgowia. Aktywacja receptora GABAA powoduje hiperpolaryzację neuronów i zmniejszenie przewodnictwa w układzie nerwowym. Natomiast pobudzenie receptora GABAB zmniejsza napięcie mięśniowe [7]. Zbyt mały poziom GABA 97 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz upośledza filtrowanie nadmiaru informacji pochodzących ze środowiska zarówno wewnętrznego jak i zewnętrznego. Udowodniono, że w autyzmie występuje zmniejszona gęstość receptorów GABAA w hipokampie, a w 1/5 przypadków odkryto występowanie przeciwciał przeciwko interneuronom GABA [3]. Na udział zaburzeń neuroprzekaźnictwa glutaminergicznego w patogenezie autyzmu zwrócono uwagę w 2006 roku. Przeprowadzono wtedy badania, które wykazały zwiększone stężenie glutaminianu we krwi pacjentów cierpiących na autyzm w porównaniu z grupą kontrolną [16]. Przyczyna wzrostu stężenia kwasu glutaminowego we krwi pacjentów z autyzmem nie została jednoznacznie wyjaśniona. Nie potwierdzono również jej związku ze zwiększeniem ilości glutaminianu w mózgowiu. Jest ona jednak na tyle charakterystyczna, szczególnie u pacjentów z prawidłowym poziomem IQ, że zaproponowano użycie pomiaru stężenia glutaminianu w surowicy jako testu przesiewowego [17]. Do mechanizmów przemawiających za udziałem przekaźnictwa glutaminergicznego w ASD należą przynajmniej dwa. Pierwszy z nich to zmniejszona ekspresja enzymu GAD w komórkach Purkinjego u pacjentów z autyzmem. Została ona potwierdzona badaniami post mortem, w których wykazano zmniejszoną o 40% ilość GAD67 mRNA w komórkach Purkinjego móżdżku pacjentów chorujących na autyzm w porównaniu z grupą kontrolną [18]. Zmniejszona ekspresja GAD zaburza równowagę między pobudzającym wpływem glutaminianu na ośrodkowy układ nerwowy a hamowaniem GABA, co skutkuje nieprawidłowym zachowaniem pacjenta cierpiącego na ASD. Drugi mechanizm ma związek z potwierdzeniem zwiększonej glejozy zachodzącej w ośrodkowym układzie nerwowym u osób z autyzmem. Komórki neurogleju nie tylko wychwytują glutaminian ze szczeliny synaptycznej, ale mogą również przekształcać glutaminę w glutaminian zwiększając jego poziom [19]. Nie należy również zapominać że zwiększona hiperaktywacja glutaminergiczna sprzyja wystąpieniu padaczki: chorobie często towarzyszącej ASD [20]. Badania genetyczne potwierdziły związek mutacji genów kodujących receptory dla glutaminianu z wystąpieniem objawów ASD. Substytucja jednego aminokwasu w receptorze dla glutaminianu (GluR6) występowała istotnie statystycznie częściej w populacji osób z autyzmem niż u zdrowych osobników [15]. Obecnie jednak przeważa pogląd, że w patogenezie ASD ważniejsza od pojedynczych mutacji jest kumulacja często występujących defektów genetycznych. Ostatnio przeprowadzona analiza genotypu 6742 pacjentów z ASD wykazała obecność 3 sieci genetycznych prowadzących do wystąpienia tej choroby. Wśród nich znajduje się upośledzona sieć metabolizmu glutaminianu-defective network of metabotropic glutamate 98 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób (GRM). Geny tworzące tą sieć wpływają na neuroprzekaźnictwo oraz neuroi synaptogenezę: procesów zaburzonych w ASD. Odkrycie to potencjalnie daje nowe możliwości terapeutyczne [20]. Za udziałem neuroprzekaźnictwa glutaminergicznego w patogenezie ASD przemawia również skuteczność antagonistów glutaminianu w leczeniu objawów autyzmu. Stosuje się amantadynę i memantynę. Amantadyna powoduje zmniejszenie nadaktywności u dzieci z ASD, natomiast memantyna ponadto poprawia pamięć , zmniejsza stereotypie ruchowe oraz izolację społeczną. W niektórych przypadkach podanie tych leków powoduje nasilenie objawów autyzmu [13]. W genetycznym podłożu ASD istotną rolę pełni również receptor GABRB3. Należy on do receptorów GABAA . Wykazano, że myszy pozbawione tego receptora cierpią na epilepsję, mają nieprawidłowy zapis EEG, a także charakteryzują się deficytem pamięci i upośledzeniem uczenia się. Objawy te są charakterystyczne również dla pacjentów z ASD.[15] Badania genetyczne przeprowadzone wśród pacjentów z ASD potwierdziły, że polimorfizm genu GABRB3 oraz jego nadekspresja mogą wpływać na występowanie ASD w niektórych przypadkach [22]. 6. Oksytocyna Oksytocyna jest hormonem biorącym udział w laktacji i porodzie. Poza tymi dobrze znanymi funkcjami oksytocyna ma znaczenie również w neuroprzekaźnictwie. Wyższy poziom oksytocyny dodatnio koreluje z empatią oraz tworzeniem więzi społecznych. W ASD w wielu badaniach zaobserwowano zmniejszenie poziomu oksytocyny w surowicy w porównaniu z populacją ogólną oraz zwiększenie stężenia jej prekursora [15]. Może to świadczyć o nieprawidłowościach w przemianie prekursora do aktywnej formy nonapeptydu. W badaniach genetycznych wykryto zwiększoną częstość występowania haplotypu rs2268493 genu kodującego receptor dla oksytocyny u dzieci z Zespołem Aspergera [23] Ponadto z ASD łączy się aberracje w obrębie genu kodującego oksytocynę: 20p13 [15]. W hiperserotoninergicznym zwierzęcym modelu autyzmu wykazano zmniejszoną ilość neuronów przekazujących oksytocynę w przykomorowym jądrze podwzgórza. Neurony te za pośrednictwem jądra półleżącego stymulują uwalnianie serotoniny z jądra grzbietowego szwu. Ostatnie badania wykazały, że ta ścieżka bierze udział w procesach interakcji społecznych, które są zaburzone u osób cierpiących na autyzm [9]. Dobre wyniki odnotowano w przypadku leczenia pacjentów ASD oksytocyną podawaną donosowo. Zaobserwowano zmniejszenie lękliwości oraz poprawę kontaktów społecznych. Lek ten jest dobrze zbadany w populacji osób dorosłych i nie powoduje istotnych objawów niepożądanych. 99 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz Niemniej jednak wątpliwości budzi przewlekłe podawanie oksytocyny u dzieci, gdyż na modelach zwierzęcych wykazano zwiększoną agresję oraz trwałe uszkodzenie osi podwzgórze-przysadka [24]. 7. Neuroprzekaźnictwo dopaminergiczne Dopamina jest aminą biogenną będącą jednym z głównych przekaźników OUN. Działa na 5 typów receptorów. Pobudzając receptor D1 i D5 powoduje wzrost neuroprzekaźnictwa, natomiast działając na receptory D2 D3 lub D4 ma działanie hamujące. Dopaminergiczne drogi nerwowe biorą udział w odczuwaniu lęku oraz w procesach behawioralnych [7]. Mimo braku jednoznacznego potwierdzenia defektu przekaźnictwa dopaminergicznego w badaniach genetycznych osób chorujących na autyzm oraz wątpliwej oceny metabolitów dopaminy w płynie mózgowo rdzeniowym, leki blokujące receptor D2 są jednymi z najskuteczniejszych w leczeniu objawów ASD [15]. Leki przeciwpsychotyczne są najlepiej działającymi na takie objawy autyzmu jak zwiększona drażliwość i napady złości [11]. Najstarszy lek z tej grupy: antagonista receptorów D2 : haloperidol jest rzadko stosowany ze względu na liczne działania niepożądane. Wśród nich najważniejszym działaniem ograniczającym jego użycie są nieodwracalne dyskinezje późne [7]. Częściej stosuje się atypowe neuroleptyki działające zarówno na receptory dopaminergiczne jak i serotoninergiczne. Wśród nich 2 są zarejestrowane przez Agencję Żywności i Leków: risperidon i aripiprazol. Łagodzą takie objawy jak: nadaktywność, zaburzenia koncentracji, autoagresja, zachowania stereotypowe. Poza tym wykazano, że risperidon, wpływając modulująco na funkcję astrogleju, ma działanie neuroprotekcyjne u pacjentów cierpiących na ASD. Niestety, jego użycie ograniczają działania niepożądane: zwiększony apetyt, męczliwość, nudności [13]. 8. Podsumowanie Nieprawidłowości w neuroprzekaźnictwie zaobserwowane u osób cierpiących na ASD mogą dotyczyć niemal wszystkich układów. Ważnym czynnikiem determinującym wystąpienie zaburzeń w działaniu neurotransmiterów są uwarunkowania genetyczne. Część z nich jest spowodowana spontaniczną mutacją jednego genu, ale większość to rezultat skumulowania się nieprawidłowości sieci genów, których warianty często występują w zdrowej populacji [21]. Leczenie zaburzeń ze spektrum autyzmu jest kwestią kontrowersyjną. Nie ma wypracowanego schematu terapeutycznego osób cierpiących na ASD. Zasadniczym problemem jest fakt, że pomimo coraz nowszych metod terapii zarówno farmakologicznych jak i psychologicznych, całkowite odwrócenie 100 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób objawów autyzmu nie jest wykonalne. Za pomocą leków neurotropowych możliwe jest jedynie leczenie objawowe. Co więcej, te preparaty obarczone są ryzykiem działań niepożądanych. Wybór leku neurotropowego opiera się na znajomości możliwych zaburzeń neuroprzekaźnictwa w autyzmie oraz objawów z nim związanych. Przy wyborze należy zachować ostrożność, określić cel terapii i zawsze wziąć pod uwagę wiek pacjenta, nasilenie objawów choroby, możliwości interakcji leków oraz ryzyko wystąpienia efektów niepożądanych. Istotne w terapii dziecka cierpiącego na ASD jest wsparcie multidyscyplinarne. Możliwe, że przyszłość farmakologii autyzmu wiąże się z podłożem genetycznym. Prowadzi się badania nad możliwością wyciszania genów za pomocą mikromolekuł. Potencjalnym celem są geny z sześciu grup: receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), kinazy serynowo-treoninowe i tyrozynowe, metalopeptydazy cynkowe, proteazy serynowe, receptory jądrowe dla hormonów oraz fosfodiesterazy [21]. Badanie genetyczne pacjenta może dać również wskazówki, indywidualizujące postępowanie terapeutyczne. Literatura 1. Abrahams BS, Geschwind DH. Advances in autism genetics: on the threshold of a new neurobiology. Nature Reviews Genetics., 9 (2008), s. 341-355 2. http://www.cdc.gov/ncbddd/autism/data.html dostęp 12.12.14 3. Gerhant A., Olajossy M., Olajossy-Hilkesberger L. Neuroanatomiczne, genetyczne i neurochemiczne aspekty autyzmu dziecięcego. Psychiatr. Pol., 2013; 47(6): 1101–1111. 4. http://www.omim.org/entry/209850 dostęp 12.12.14 5. Bailey A., Le Couteur A., Gottesman I., Bolton P., Simonoff E., Yuzda E., Rutter M. Autism as a strongly genetic disorder: evidence from a British twin study. Psychological Medicine., 1 (1995), s. 63-77 6. Geschwind DH. Advances in autism., Annu Rev Med., 60 (2009), s. 367-80 7. Brenner G., Stevens C., Farmakologia, Wydawnictwo Uniwersytetu Warszawskiego, Warszawa 2010, s. 211-215 8. Patel TD, Zhou FC. Ontogeny of 5-HT1A receptor expression in the developing hippocampus, Brain research., 2005 Jun 9;157(1):42-57 9. Ciranna L., Vincenza Catania. M. 5-HT7 receptors as modulators of neuronal excitability, synaptic transmission and plasticity: physiological role and possible implications in autism spectrum disorders, Frontiers in Cellular Neuroscience., 8 (2014), s. 250 10. DeLong GR. Autism: New data suggest a new hypothesis, Neurology., 52 (1999); s. 911- 916 11. Doyle CA.., McDougle CJ. Pharmacologic treatments for the behavioral symptoms associated with autism spectrum disorders across the lifespan, Dialogues in Clinical Neuroscience., 2012 Sep; 14(3): 263-279 12. Mouti A. et al. Fluoxetine for Autistic Behaviors (FAB trial): study protocol for a randomized controlled trial in children and adolescents with autism, Trials., 2014, Vol. 15(1); 230 101 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz 13. Kumar B. et al. Drug therapy in autism: a present and future perspective, Pharmacological Reports., 64 (2012), 1291-1304 14. Lee M. et al. Nicotinic receptor abnormalities in the cerebellar cortex in autism. Brain A Journal of Neurology., (2002) 125 (7): 1483-1495 15. Muhle R, Trentacoste SV, Rapin I. The Genetics of Autism, Pediatrics., 2004;113; s. 472-486 16. Shinohe A, Hashimoto K, Nakamura K, Tsujii M, Iwata Y, Tsuchiya KJ, Sekine Y, Suda S, Suzuki K, Sugihara G, Matsuzaki H, Minabe Y, Sugiyama T, Kawai M, Iyo M, Takei N, Mori N. Increased serum levels of glutamate in adult patients with autism, Progress in neuro-psychopharmacology and biological psychiatry., 2006 Dec 30;30(8):1472-1477 17. ShimmuraC. et al. Alteration of Plasma Glutamate and Glutamine Levels in Children with High-Functioning Autism, PLoS One., 2011; 6(10): e25340 18. Yip J. et al. Decreased GAD67 mRNA levels in cerebellar Purkinje cells in autism: pathophysiological implications, Acta Neuropathologica., 2007, 113 (5), s. 559-568 19. Shinohe A. et al. Increased serum levels of glutamate in adult patients with autism, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry., 2006, 30 (8), s. 1472-1477 20. Hussman JP. et al. Suppressed GABAergic inhibition as a common factor in suspected etiologies of autism, Journal of Autism and Developmental Disorders., 2001; 31(2), s. 247-248 21. Hadley D. et al. The impact of the metabotropic glutamate receptor and other gene family interaction networks on autism, Nature Communications., 5 (2014),Article number: 4074 22. Chia-Hsiang Chen, Chia-Chun Huang, Min-Chih Cheng, Yen-Nan Chiu, WenChe Tsai, Yu-Yu Wu, Shih-Kai Liu, Susan Shur-Fen Gau Genetic analysis of GABRB3 as a candidate gene of autism spectrum disorders, Molecular Autism., 2014, 5:36 23. Napoli A. et al. Genetic variation in the oxytocin receptor (OXTR) gene is associated with Asperger Syndrom,. Molecular Autism., 2014; 5(1): 48 24. Adrienne E. Taylor, Hsu-en Lee, Femke T. A. Buisman-Pijlman. Oxytocin treatment in pediatric populations, Frontiers in Behavioral Neuroscience., 2014; 8: 360 Possibilities of pharmacotherapy neurotransmitters in autism in deffects of synthesis of The increasing detection of Autism Spectrum Disorder (ASD) in modern population is the key issue for society. Currently, the prevalence of ASD in the United States is in 1 child in 68 (according to the data presented by the Centers for Disease Control and Prevention). The reason of this phenomenon remains unknown. At present, ASD is considered to have epigenetic background – that is why causal treatment possibilities are limited. Treatment options include psychotherapy and pharmacotherapy. The choice of neurotropic drugs is based on the knowledge of neurochemical abnormalities that may occur in a patient’s brain. The pathogenesis of autism is multi-faceted: there are abnormalities in the serotonergic system, cholinergic neurotransmission, also the imbalance between activating and inhibiting function of glutamate and GABA, as well as lower levels of oxytocin compared with the general population. In our article we will try to present pharmacological possibilities of treatment associated with receptor’s disorders on genetic background. 102 Karolina Jakubczyk1, Katarzyna Barchiewicz2 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób Ftalocyjaniny to syntetyczne analogi porfiryn, ważnej grupy biologicznie aktywnych związków, mających duże znaczenie dla procesów zachodzących w komórkach organizmów żywych. Właściwości fizykochemiczne tych związków wynikają z rozkładu gęstości elektronowej w rdzeniu makropierścienia ftalocyjaninowego. Dodatkowo makropierścień może być podstawiony przez różnego rodzaju grupy funkcyjne, dzięki czemu można odpowiednio modyfikować właściwości chemiczne i opto-elektroniczne tych substancji. Ponadto ftalocyjanina oraz jej kompleksy mają naturalne powinowactwo do molekularnego tlenu, stąd też stanowią one bardzo atrakcyjny materiał dla różnych zastosowań medycznych, np. jako fotosensybilizatory w fotodynamicznej metodzie diagnozowania (PDD) oraz leczenia (PDT) nowotworów. Metody te mogą pomóc rozwiązać problemy, z jakimi borykają się dotychczas stosowane strategie terapeutyczne, takie jak mała selektywność oraz skutki uboczne. PDT znajduje również zastosowanie w leczeniu wielu nienowotworowych zmian chorobowych. Przykładem są infekcje wywołane grzybami bądź bakteriami lekoopornymi, choroby oczu (zwłaszcza zwyrodnienie starcze plamki żółtej) oraz choroby skóry. 1. Charakterystyka ftalocyjanin Pierwszą ftalocyjaninę zsyntetyzowano w 1907 roku. Dokonali tego niemieccy naukowcy – Braun i Tcherniac, którzy ogrzewając o-cyjanobenzamid otrzymali niewielką ilość niebieskiej substancji [1]. Już w 1928 roku stwierdzono, że związki tego typu są doskonałymi barwnikami w przemyśle tekstylnym (obecnie ponad 25% stosowanych w przemyśle pigmentów), a w 1933 roku opisano dokładną strukturę cząsteczek. Zjawisko barwienia pochodzi od charakterystycznej makrocyklicznej budowy cząsteczek. Pojedyncza cząsteczka ftalocyjaniny (z ang. phthalocyanine, z gr. naphtha – olej skalny, ropa naftowa i cyanine – ciemnoniebieski) zbudowana jest czterech pierścieni izoindolowych. Pierścienie połączone są ze sobą za pomocą mostków azametinowych. Taki sposób uporządkowania atomów w cząsteczce stworzył płaski układ sprzężonych wiązań podwójnych, z 18 zdelokalizowanymi elektronami π. Znajdujące się w tym układzie elektrony π, spełniają warunek aromatyczności Hückla 1 [email protected] Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski [email protected] Koło Naukowe Chemików „Koronan”, Wydział Chemii, Uniwersytet Opolski 2 103 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz (4n+2π). Aromatyczność cząsteczek powoduje, że cząsteczki ftalocyjanin są stabilne i odporne chemicznie [2]. Rys. 1. Budowa cząsteczki ftalocyjaniny [opracowanie własne] Połączone pierścienie tworzą zamknięte centrum cząsteczki, gdzie do atomów azotu, za pomocą wiązań koordynacyjnych można włączać atomy metali grup głównych (np. magnezu), przejściowych (np. miedzi i cynku) i lantanowców (np. lantanu) (rys. 1). W wyniku chelatowania metali, płaska struktura może ulegać jednak deformacji. Gdy atom metalu jest zbyt duży, wychyla sie delikatnie nad powierzchnię tworzoną przez pierścienie [3, 4]. Oprócz chelatowania metali, ftalocyjaniny mogą być modyfikowane również w zewnętrznej części cząsteczki, a mianowicie, pierścień benzenowy może być podstawiony różnymi grupami funkcyjnymi [5], które mogą wpływać na właściwości związku, na przykład rozpuszczalność. Umieszczenie podstawników takich jak grupy sulfonowe, karboksylowe, czy hydroksylowe w pozycjach peryferyjnych makropierścienia ftalocyjaninowego znacznie zwiększa hydrofilowość cząsteczki, która normalnie jest hydrofobowa. Ftalocyjaniny ulegają również polimeryzacji lub agregacji. Biorą udział w reakcjach redukcji i utleniania, są katalizatorami reakcji chemicznych, a także biorą udział w przemianach fotochemicznych, dzięki możliwości absorpcji promieniowania UV-VIS (ε>105) [6, 7]. Układ czterech pierścieni, połączonych mostkami azametinowymi jest bardzo stabilnym chromoforem. Dzięki temu, związki te są 104 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób dobrym materiałem do badań transferu elektronów w układach biologicznych, gdzie mogą naśladować działanie układów porfirynowych (ftalocyjaniny są analogami porfiryn). Zredukowana lub utleniona cząsteczka (po oderwaniu lub przyłączeniu elektronu do makrocyklicznego układu aromatycznego) staje się π-kationem lub π-anionem i również jest stabilnym układem. Maksima absorpcji promieniowania dla ftalocyjanin znajdują się przy około 340 nm (tzw. pasmo B) oraz w zakresie 600-800 nm (tzw. pasmo Q). Jest to ważna cecha tych cząsteczek, w odniesieniu do przemian w układach biologicznych, bowiem pasma absorpcji nie pokrywają się z pasmami barwników żywych komórek ludzkich, takich jak hemoglobina czy melanina. Przy długościach fali krótszych niż 600 nm absorpcja jest niewielka (w przeciwnym wypadku, zastosowanie ftalocyjanin w terapii fotodynamicznej dawałoby szkodliwy efekt, sprzyjający rozwijaniu się nowotworów skóry). Zastosowanie ftalocyjanin w terapii fotodynamicznej możliwe jest dzięki temu, że cząsteczki nie wywierają działania cytotoksycznego na zdrowe komórki (nie są także mutagenne), lecz potrafią selektywnie kumulować się w tkankach nowotworowych (pozostają w komórkach przez kilkadziesiąt godzin). Mechanizm działania w głównej mierze zależy od dostępności tlenu i zewnętrznego źródła promieniowania (rys. 2). W pierwszym etapie cząsteczka (w podstawowym stanie singletowym) absorbuje foton promieniowania (najczęściej stosowane są lasery, emitujące promieniowanie o długości fali odpowiadającej maksimum absorpcji danego związku) dzięki czemu ftalocyjanina (zwana dalej fotouczulaczem) ulega wzbudzeniu (rys. 3) [8]. Rys. 2. Mechanizm reakcji fotodynamicznej, na podstawie [9] Część energii tak wzbudzonej cząsteczki (w stanie singletowym) zostaje wyemitowana jako fluorescencja (energia wykorzystywana do diagnostyki – lokalizacja komórek nowotworowych [11]). W pewnych przypadkach 105 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz możliwe jest wygenerowanie stanu trypletowego wzbudzonej cząsteczki fotouczulacza, co jest wykorzystywane w procesie terapeutycznym. W momencie, kiedy w środowisku jest wysokie stężenie tlenu, fotouczulacz (we wzbudzonym stanie trypletowym) przekazuje energię do cząsteczki tlenu O2 (w podstawowym stanie trypletowym), w efekcie czego powstaje tlen w stanie wzbudzonym (tlen singletowy), który ma silne właściwości utleniające. Niszczone są wówczas błony organelli komórkowych, a także zewnętrzne błony plazmatyczne. Tlen singletowy ma krótki czas życia, dlatego działa na te struktury, które są najbliżej. W przypadku, kiedy w komórce stężenie tlenu jest małe, zachodzi reakcja przeniesienia wodoru lub elektronu między fotouczulaczem a komórką tkanki, dzięki czemu powstają rodniki lub anionorodniki głównie związków organicznych. Molekuły te reagują następnie z tlenem (w podstawowym stanie trypletowym), powstają rodniki tlenowe (ROS – reaktywne formy tlenu) niszczące tkankę nowotworową utleniając jej składniki. Zapoczątkowana reakcja rodnikowa prowadzi do powstawania dalszych rodników [10, 12]. Rys. 3. Diagram Jabłońskiego poziomów energetycznych fotouczulacza, na podstawie [12] Również w tym przypadku, rodniki niszczą struktury znajdujące się w najbliższym sąsiedztwie, ze względu na krótki czas życia. 2. Dystrybucja ftalocyjanin i innych fotouczulaczy do komórek Fotouczulacze najczęściej podaje się dożylnie, a następnie są transportowane z krwią do chorych komórek. Wykazują one różną biodystrybucję w obrębie ciała ludzkiego (w zależności od charakteru chemicznego) i różną 106 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób farmakokinetykę, która jest zależna od miejsca kumulacji oraz od rodzaju nośnika, z którym są transportowane [9, 13]. Związki hydrofobowe (niemodyfikowane lub z podstawnikami hydrofobowymi) łączą się najczęściej z lipoproteinami i kumulują się w tkance łącznej nowotworu. Powinowactwo cząsteczek hydrofobowych do LDL (lipoprotein o niskiej gęstości) również sprzyja transportowi do komórek, a także przechodzeniu do ich wnętrza ze względu na obecność na powierzchni licznych receptorów dla LDL. Cząsteczki lipofilowe i o charakterze pośrednim – transportowane są dzięki połączeniom z elementami białkowymi surowicy (np. z albuminami) i kumulują się w zrębie naczyń krwionośnych guza. Fotouczulacze mogą się również łączyć z kolagenem, elastyną i fibrynogenem w istocie międzykomórkowej tkanki łącznej. Ponadto, niskie pH komórek nowotworowych jest środowiskiem sprzyjającym dla ftalocyjanin. Słabe naczynia krwionośne nowotworu (powstałe w wyniku angiogenezy) są przepuszczalne dla fotouczulaczy, a ze względu na niezbyt rozbudowany układ naczyń limfatycznych nowotworu, cząsteczki fotouczulaczy zostają zakumulowane w tkance. Wewnątrz komórki, lokalizacja fotouczulaczy również zależy od ich charakteru chemicznego. Związki hydrofobowe lokalizują się głównie w błonach (jądrowa, mitochondrialna, aparatu Golgiego, komórkowa), natomiast hydrofilowe w lizosomach (ponieważ nie przechodzą przez błonę i dostają się do komórki w głównej mierze przez endocytozę) [14]. Najbardziej pożądaną lokalizacją w terapii celowanej jest jądro komórkowe (śmierć komórki z powodu uszkodzenia DNA) lub błona mitochondrialna (śmierć komórki poprzez zahamowanie oddychania komórkowego) (Tab. 1) [13-16]. Tabela 1. Lokalizacja fotouczulaczy w zależności od ich charakteru chemicznego [13-17] Fotouczulacze hydrofobowe komórka tkanka Fotouczulacze hydrofilowe komórka tkanka błona komórkowa, mitochondrialna, jądrowa, aparatu Golgiego naczynia krwionośne, nowotwory lizosomy naczynia krwionośne Źródło: opracowanie własne Charakter chemiczny fotouczulacza decyduje o jego lokalizacji w komórce. Dzięki zastosowaniu liposomów, lipoprotein lub nawet polimerów, można przewidzieć miejsce działania fotouczulacza wewnątrz komórki i zwiększyć efektywność terapii [12, 17]. Terapia fotodynamiczna prowadzi do śmierci komórek. Istnieją dwa mechanizmy tego procesu: nekroza i apoptoza. Obydwa są obserwowane 107 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz jako następstwo działania wzbudzanych fotouczulaczy na komórki nowotworowe, chociaż bezpośrednią przyczyną śmierci komórek jest uszkodzenie białek, tłuszczów i dezorganizacja komórki w efekcie działania silnie reaktywnego tlenu singletowego. Wpływ na śmierć komórek ma przede wszystkim stężenie i rodzaj fotouczulacza, obecność tlenu a także faza cyklu komórkowego. Wysokie stężenie fotouczulacza i naświetlanie promieniowaniem o odpowiedniej długości fali powoduje nekrozę (fot. 1), natomiast podawanie fotouczulacza w niskim stężeniu lecz w kilku dawkach, oraz dłuższy czas inkubacji powoduje apoptozę [12, 13, 18]. Fot. 1. Nekroza komórek raka prostaty po PDT [19] Po spełnieniu swej roli, fotouczulacze (w podstawowym stanie singletowym) odprowadzane są przez naczynia limfatyczne i krwionośne i unieszkodliwiane i wydalane przez wątrobę i nerki. 3. Ftalocyjaniny w diagnostyce fotodynamicznej chorób Dzięki selektywnemu gromadzeniu się fotouczulaczy w tankach nowotworowych, możliwe jest ich wykorzystanie w diagnostyce fotodynamicznej (PDD – Photodynamic Diagnosis), która polega na zjawisku fluorescencji. Fotouczulacz, ulokowany w tkance nowotworowej 108 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób zostaje wzbudzony przez promieniowanie lasera, bądź inne źródło światła. Część pochłoniętej energii zostanie wyemitowana w postaci kwantu fluorescencji, co umożliwia ocenę stanu tych tkanek. Metodę tą stosuje się nie tylko w diagnostyce nowotworów, lecz także zmian miażdżycowych w naczyniach krwionośnych. Dużą zaletą PDD jest wysoka wybiórczość identyfikacji zmian chorobowych [4, 20]. Fotosensybilizatory absorbujące w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR) znalazły zastosowanie w naukach biomedycznych ze względu na ich absorpcję fotonów i fluorescencję w zakresie 600-1000 nm, co pokrywa się z „oknami” transmisyjnymi tkanek. Przy tych długościach fali absorpcja światła przez barwniki endogenne jest minimalna, co z kolei umożliwia głębszą penetrację tkanek światłem. Ftalocyjaniny są jednymi z najbardziej stabilnych i skutecznych chromoforów, absorbujących światło z zakresu bliskiej NIR [21]. Lau i in [22] stworzyli fotouczulacze, które mogą być aktywowane w środowisku redukującym, o pH nieco mniejszym niż 7. Takie środowisko jest bowiem typowe dla tkanek nowotworowych. Cechą charakterystyczną takich związków jest obecność w ich budowie pewnych fragmentów, które powodują wygaszanie fluorescencji i niwelują właściwości fotouczulające. Gdy związek znajdzie się w środowisku kwaśnym i redukującym, następuje odłączenie takiego „wygaszacza”, a właściwości fotosensybilizatora zostają przywrócone. Badane fotouczulacze (Compound 4) były pochodnymi ftalocyjaniny krzemu, w których zastosowano podstawniki ferrocenylowe jako wygaszacze, połączony z atomem krzemu poprzez grupy hydrazonowe i mostki dwusiarczkowe. Taki uczulacz dobrze sprawdzał się zarówno w badaniu in vitro, jak in vivo (rys. 4) [22]. Inną strategią do aktywacji proleków jest wykorzystanie promieniowania z zakresu bliskiej podczerwieni. Promieniowanie to, chociaż przenika w głąb tkanek, jest niskoenergetyczne, co utrudnia wykorzystanie go do aktywacji proleków. Bio i in. wykorzystali więc tlen singletowy (1O2, 1Δg) powstający w procesach fotochemicznych pod wpływem promieniowania NIR. Powstały 1O2 reaguje z bogatymi w elektrony olefinami, w wyniku czego tworzą się niestabilne dioksetany, które ulegają następnie rozkładowi, powodując uwolnienie proleku [23]. Bio i in. jako łącznik pomiędzy ftalocyjaniną a wygaszaczem zastosowali aminoakrylan. Cząsteczki otrzymane przez tych autorów z powodzeniem łączyły właściwości diagnostyczne (fluorescencję ftalocyjaniny krzemu) z właściwościami przeciwnowotworowymi (PDT i uwalnianym lekiem przeciwnowotworowym – komberstatyną A-4) [23]. 109 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz Rys. 4. Zmiana intensywności fluorescencji po podaniu fotouczulacza aktywowanego in situ (Compound 4) u myszy z ludzkim rakiem jelita grubego oraz u osobników w próbie kontrolnej. Widoczne jest przywrócenie fluorescencji fotouczulacza w tkance nowotworowej [21] 4. Ftalocyjaniny w terapii chorób 8.1. Terapie przeciwnowotworowe Tradycyjne terapie przeciwnowotworowe borykają się z licznymi problemami, wśród których wyróżnić można niską specyficzność chemioterapeutyków, której konsekwencją jest uszkodzenie nie tylko komórek nowotworowych, ale też tkanek prawidłowych [24]. Terapia fotodynamiczna nowotworów ma przewagę nad terapiami tradycyjnymi, ze względu na jej selektywność. Po pierwsze – fotouczulacze gromadzą się selektywnie w tkance nowotworowej. Po drugie efekt cytotoksyczny obserwowany jest dopiero po naświetleniu fotouczulacza – ograniczając obszar naświetlania jedynie do tkanek zmienionych chorobowo, można dodatkowo zwiększyć selektywność terapii [25]. Idealny fotouczulacz w diagnostyce i terapii fotodynamicznej powinien odznaczać się następującymi cechami: powinien selektywnie gromadzić się w tkance nowotworowej; nie powinien powodować efektów fitotoksycznych w zdrowych tkankach; 110 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób wykazywać maksimum absorpcji w zakresie 600-800 nm, a więc w „oknach” transmisyjnych tkanki. Dzięki temu pasma absorpcji fotouczulacza nie będą się pokrywać z pasmami absorpcji barwników endogennych, takich jak hemoglobina czy melanina; wykazywać minimum absorpcji w zakresie 400-600 nm, co pozwoli na ograniczenie efektu ubocznego, jakim jest fotowrażliwość skóry; mieć wysoką wydajność kwantową tworzenia tlenu singletowego lub reaktywnych form tlenu (ROS), co ma duży wpływ na efektywność terapii; wykazywać wysoką fotostabilność [4, 20]. Należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że stosowane obecnie fotouczulacze nie są tak specyficzne, jak początkowo zakładano – kumulują się bowiem we wszystkich szybko rozwijających się tkankach (np. w skórze), co skutkuje niepożądaną nadwrażliwością na światło. Problem ten rozwiązać można przez zastosowanie odpowiednich nośników, połączonych z odpowiednimi cząsteczkami, specyficznie rozpoznawanymi i wychwy-tywanymi przez komórki nowotworowe. Takie połączenia, zwane fotouczulaczami trzeciej generacji, stwarzają zupełnie nowe możliwości w PDT [4, 26]. Dalszym rozwiązaniem problemu niskiej specyficzności fotouczulaczy może być zastosowanie nośnika leków. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną przepuszczalność naczyniową oraz zatrzymywanie małych i dużych cząsteczek w tkance guza nowotworowego (efekt EPR - enhanced vascular permeability and retention). Tkance nowotworowej często towarzyszy bowiem nieszczelna sieć naczyń krwionośnych, będąca skutkiem chaotycznej neoangiogenezy, podczas gdy większość zdrowych tkanek (poza m. in. wątrobą, szpikiem kostnym, śledzioną) ma względnie zwartą strukturę śródbłonka naczyń włosowatych. Koniugaty nośnik-lek, będące makrocząsteczkami, ze względu na swoją wielkość nie będą mogły przenikać przez szczelną warstwę śródbłonka naczyń włosowatych zdrowych tkanek. Natomiast względnie łatwo mogą dyfundować do tkanek nowotworowych. Dodatkowo w obrębie guza obserwuje się często upośledzenie drenażu limfatycznego, co skutkuje obniżeniem klirensu leku z tkanki nowotworowej i jego akumulacją w tej tkance [27]. Jednymi z najczęściej badanych fotouczulaczy są pochodne ftalocyjaniny cynku (ZnPc). Ogbodu i in. wykazali, że połączenie monoaminoftalocyjaniny cynku z kwasem foliowym (ZnMAPc-FA) wykazuje bardzo niską cytotoksyczność wobec komórek czerniaka skóry przy braku dostępu światła. Zastosowanie tego związku w połączeniu z naświetlaniem (676 nm) pozwala uzyskać znaczne zahamowanie proliferacji komórek (fot. 2), przy czym skuteczność jest zależna zarówno 111 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz od dawki leku, jak i dawki naświetlenia. Badano również skuteczność tego związku po umiejscowieniu wewnątrz nośnika – jednościennej nanorurki węglowej (SWCNT). Sam nośnik SWCNT poza tym, że poprawia efektywność transportu leku, ma również zdolność do pochłaniania światła z zakresu bliskiej podczerwieni. Dzięki temu zwiększa się skuteczność działania leku poprzez wykorzystanie efektu fototermicznego (PTT). Stwierdzono, że takie połączenie, choć skutkuje zmniejszeniem wydajności kwantowej tlenu singletowego, to znacznie polepsza dostarczanie leku, przez co stanowić może obiecujący fotouczulacz w PDT [28]. Fot. 2. Wpływ ZnMAPc-FA na komórki czerniaka (A) Komórki bez obecności leku (B) Komórki w obecności ZnMAPc-FA, bez napromieniania (C) Komórki bezpośrednio po PDT (5 J/cm2) w obecności ZnMAPc-FA (D)komórki po PDT i 24 h inkubacji w świeżej pożywce hodowlanej [28] Fotouczulacze ftalocyjaninowe zbadano również na kilku modelach zwierzęcych. Tu i in. zastosował mezoporowate nanocząstki krzemionki (MSNs) jako transporter ftalocyjaniny cynku (ZnPc) w leczeniu ksenograftów ludzkiego raka wątroby u myszy. Takie nanocząsteczki transportowane są do cytozolu przez drogę endolizosomalną. Powierzchnia nanocząstek była sfunkcjonalizowana przy użyciu glikolu polietylenowego (PEG) oraz polietylenoiminy (PEI). PEI ułatwia uwalnianie leku 112 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób z endosomów poprzez „efekt gąbki protonowej” oraz zwiększa jego biokompatybilność. Terapia fotodynamiczna z zastosowaniem PEG-PEIMSNs/ZnPc jako fotouczulacza pozwoliła na wydłużenie życia leczonych osobników z 16 do 40 dni (fot. 3) [29]. Fot. 3. Przeciwnowotworowe działanie PEG-PEI-MSNs/ZnPc, w porównaniu do podwójnej kontroli – PEG-PEI-MSNs/ZnPc bez naświetlania oraz naświetlania bez fotouczulacza. Parametry promieniowania: λ = 680 nm, 120 J/cm2 [29] Nishiyama i in. projektując fotouczulacz wykorzystali efekt EPR. Jako nośnik wykorzystali dendrymer, którego rdzeń stanowiła ftalocyjanina cynku. Takie rozwiązanie zapobiegało tworzeniu się agregatów fotouczulacza, przy zachowanej efektywności tworzenia ROS. Do utworzenia miceli wykorzystano kopolimer blokowy poli(glikolu etylenowego) i poli(Llizyny) (PEG-PLL) (rys. 5). Taki układ nośnik-lek wykorzystano do leczenia ksenograftów ludzkiego raka płuc u myszy. Po trzydziestu dniach terapii fotodynamicznej guz wzrósł jedynie 10-krotnie, podczas gdy w grupie kontrolnej zaobserwowano 25-krotny wzrost. Dla porównania, w grupie leczonej stosowanym obecnie fotouczulaczem porfirynowym – Photofrin®, zaobserwowano ponad 15-krotny wzrost guza [30]. Część fotouczulaczy ftalocyjaninowych znajduje się obecnie w fazie badań klinicznych. Wśród takich fotosensybilizatorów wyróżnić można ftalocyjaninę cynku o nazwie handlowej CGP55847 (rys. 6), o maksimum absorpcji przy długości fali 670 nm. Lek ten testowany jest w Szwajcarii wobec płaskonabłonkowego raka górnych dróg oddechowych. W Chinach natomiast prowadzone są testy kliniczne sulfonowanej pochodnej tej ftalocyjaniny o nazwie handlowej Photocyanine, o maksimum absorpcji również przy długości fali 670 nm [31]. 113 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz Rys. 5. Struktura chemiczna anionowego dendrymeru ftalocyjaniny cynku (DPc) (A) i kopolimeru blokowego PEG-PLL (B). Micelę (DPc/m) otrzymano poprzez zmieszanie DPc i PEG-PLL w stosunku stechiometrycznym względem ich ładunków [30] Duże zainteresowanie budzi również Pc 4, znajdująca się w fazie badań klinicznych na terenie USA. Jest to fotouczulacz drugiej generacji, będący modyfikowaną ftalocyjaniną krzemu (rys. 6), o maksimum absorpcji przy długości fali 675 nm. Pierwsza faza testów klinicznych nie wykazała znaczącej toksyczności ani nadwrażliwości na światło. Obiecujące efekty PDT przy użyciu Pc 4 uzyskuje m. in. wobec ziarniaka grzybiastego czy nowotworów skóry [31, 32]. Sulfonowana ftalocyjanina glinu (rys. 6), o maksimum absorpcji przy długości fali 675 nm, została zaakceptowana do komercyjnego użycia w Rosji, pod nazwą handlową Photosens, gdzie jest stosowana w leczeniu m.in. nowotworów skóry, piersi, płuc, krtani, głowy i szyi, mięsaka M1, guzów oczu i powiek [31]. 114 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób Rys. 6. Fotouczulacze ftalocyjaninowe będące w fazie testów klinicznych [31] 4.2. Fotodynamiczna terapia przeciw mikroorganizmom (PACT) Terapeutyczne zastosowanie ftalocyjanin wzbudzanych promieniowaniem świetlnym znalazło zastosowanie w zwalczaniu chorobotwórczych patogenów. Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) zwalcza zakażenia grzybicze, bakteryjne (antybiotykooporne) oraz pasożytnicze. Odnotowano także działanie antywirusowe. Trudność w zwalczaniu patogenów lekami wynika z tworzenia biofilmów przez bakterie. Połączone produkowaną przez komórki macierzą zewnątrzkomórkową drobnoustroje (jednego lub kilku gatunków) tworzą strukturę, która jest bardziej oporna na antybiotyki i działanie układu immunologicznego, dlatego rozpoczęto poszukiwania alternatywnego sposobu ich zwalczania [33, 34]. Mechanizm działania fotouczulaczy wobec mikroorganizmów nie różni się od działania w obrębie komórek nowotworowych, jednak w przypadku bakterii najistotniejszą rolę odgrywa tlen singletowy. Powstające w trakcie reakcji rodniki (w tym także rodniki hydroksylowe – z cząsteczki wody) są unieszkodliwiane przez enzymy bakteryjne – katalazę i dysmutazę ponadtlenkową. Tlen singletowy działa na materiał genetyczny bakterii oraz na błony cytoplazmatyczne. Lipidy znajdujące się w błonie ulegają peroksydacji, w wyniku czego powstają ich nadtlenki. Wzrasta wówczas przepuszczalność błon dla jonów Na+/K+. Peptydy również ulegają przemianom, w wyniku czego liczne enzymy tracą swoją aktywność. W łańcuchu oddechowym (błona mitochondrialna) zachodzą liczne niepożądane reakcje redoks zaburzające porządek reakcji. Enzymy cytoplazmatyczne ulegają oksydacji i zostają dezaktywowane. W materiale genetycznym bakterii dochodzi do uszkodzenia łańcucha DNA w wyniku utlenienia zasad (powstaje 8-hydroksyguanozyna) lub cukrów. W przypadku grzybów fotouczulacze doprowadzają do lizy błon komórkowych, mitochondrialnych i lizosomalnych, co doprowadza do śmierci komórek (fot. 4) [33, 34]. 115 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz Fot. 4. Zastosowanie PACT w grzybicy paznokci. Zastosowano fotouczulacz firmy Briggate Medical Company [35] Zastosowanie fotouczulaczy w PACT musi spełniać te same warunki, które są spełniane wobec komórek nowotworowych (PDT). Fotouczulacze nie mogą być toksyczne dla zdrowych komórek ludzkich ani dla naturalnej flory bakteryjnej, nie mogą być immunogenne, a także muszą działać selektywnie z wysoką wydajnością. Dlatego też, wobec komórek bakteryjnych stosuje się związki kationowe. Aktywność ftalocyjanin zależy od ilości grup kationowych w obrębie cząsteczki. Tetrakationowa ftalocyjanina cynkowa podstawiona czterema grupami aminoalkilowymi działa destrukcyjnie na lekooporne szczepy Candida albicans. Kationowa ftalocyjanina cynku jest skuteczna wobec bakterii gram dodatnich i gram ujemnych. Pc4 posiada właściwości antypierwotniakowe. Działa destrukcyjnie na komórki Trypanosoma crusi oraz Plasmodium falciparum. Fotouczulacze obdarzone ładunkiem ujemnym (takie jak np. pochodne zawierające grupy sulfonowe bądź karboksylowe) są skuteczne tylko wobec niektórych bakterii gram dodatnich, których ściana komórkowa jest wystarczająco porowata, aby związki te mogły przeniknąć do wnętrza komórki. Nie sprawdza się to w przypadku bakterii gram ujemnych, których ściana komórkowa zawiera lipopolisacharydy (LPS), obdarzone również ładunkiem ujemnym [9, 34]. Fotouczulacze drugiej generacji (do których należą ftalocyjaniny) działają na szczepy oporne na antybiotyki (metycylinooporne Staphylococcus aureus, a także wankomycynooporne Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium). Koszty leczenia z zastosowaniem PACT są stosunkowo niskie, w połączeniu z wysoką skutecznością i brakiem skutków ubocznych. Słabym punktem PACT jest to, że światło nie może wnikać do głębszych partii ciała. 116 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób 9. Podsumowanie i perspektywy PDT jest nieinwazyjną metodą niszczenia komórek zmienionych chorobowo, a także zakażeń patogenami. Zaletą tej metody jest możliwość stosowania niezbyt skomplikowanej aparatury, natomiast fotouczulacze można podawać w warunkach ambulatoryjnych. Dotychczas nie wykazano ograniczeń związanych z dawką całkowitą, proces można wielokrotnie powtarzać, a podawanie nie powoduje blizn i uszkodzeń ciała. Terapia fotodynamiczna (PDT) znana jest na całym świecie. W wielu krajach prowadzone są na szeroką skalę badania kliniczne w celu dopuszczenia do powszechnego stosowania fotouczulaczy, a także rozszerzenia ich zastosowań. Wśród krajów zainteresowanych PDT są Stany Zjednoczone, Kanada, kraje Unii Europejskiej a także Japonia. Na etapie I/II badań klinicznych jest ftalocyjanina Pc4 (CWRU), która w PDT może być podawana dożylnie i miejscowo. W III fazie badań klinicznych znajduje się ftalocyjanina cynkowa w leczeniu nowotworu kolczysto komórkowego (lizosomalna formulacja ftalocyjaniny cynkowej). Fenylo-tri(N-metylo-4-pirysylo)porfiryna (znana jako Sylsens) badana jest w kierunku dezynfekcji czerwonych krwinek. Związek ten wykazuje również aktywność antywirusową. We Francji prowadzone są badania kliniczne nad zastosowaniem sulfonowanej ftalocyjaniny glinu (AlPcS), natomiast na Ukrainie testowane są w leczeniu nowotworów skóry ftalocyjaniny cyrkonu i hafnu. Obecnie w Polsce prowadzone są badania diagnostyczne nad 5-ALA i Photofrinem. Obejmują one wiele dziedzin medycyny. Przewiduje się ich zastosowanie w gastroenterologii, pulmonologii, laryngologii, dermatologii, ginekologii, a także ortopedii. Wśród klinik zajmujących się PDT w Polsce znajdują się: Klinika Urologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Centrum Laserowej Diagnostyki i Terapii Fotodynamicznej w Bytomiu, Klinika Ginekologii Onkologicznej B Centrum Onkologii w Warszawie, Katedra Ginekologii i Położnictwa Śląskiego Uniwersytetu Medycznego, oraz Klinika Chorób Przyzębia Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Literatura 1. 2. 3. Braun A., Tcherniac J., Über die Produkte der Einwirkung von Acetanhydrid auf Phthalamid, 1907 Kadish K., Guilard R., Smith K., The Porphyrin Handbook, Volume 17: Phthalocyanines: Properties and Materials, (17) 2002 r. Kinzhybalo V. Synteza, stereochemia i właściwości 4+1 i 4+2 koordynacyjnych związków kompleksowych ftalocyjaniny magnezu, praca doktorska, Instytut Niskich Temperatur i Badań Strukturalnych PAN im. Włodzimierza Trzebiatowskiego we Wrocławiu, 2009 r. 117 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzki S., Fiedurek J., Porfiryny i ftalocyjaniny. Cz.1. Właściwości i niektóre zastosowania. Biotechnologia, 4 (71) (2005), s. 109-127 Chin Y., Lim S., Zorlu Y., Ahsen V., Kiew L. V., Chung L. Y., Dumoulin F., Lee B. H., Improved Photodynamic Efficacy of Zn(II) Phthalocyanines via Glycerol Substitution, PLOS ONE, 9(5) (2014) Contakes M. S., Beatty S. T., Dailey K. K., Rauchfuss T. B., Fenske D., π-Complexes of Phthalocyanines and Metallophthalocyanines, Organometallics 19 (2000), s. 4767-4774 Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzki S., Fiedurek J., Porfiryny i ftalocyjaniny. Cz. II. Porfiryny jako biomimetyczne katalizatory transformacji związków organicznych, Biotechnologia, 4, 71 (2005), s. 128-141 Jiang Z., Shao J., Yang T., Wang J., Jia L., Pharmaceutical development, composition and quantitative analysis of phthalocyanine as the photosenstizer for cancer photodynamic therapy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 87 (2014), s. 98-104 Ratuszna A., Światłoterapia szansą w leczeniu nowotworów, Gazeta Uniwersytecka Uniwersytetu Śląskiego, 2, 135 (2005) Wzgarda A., Koczorowski T., Nowak M., Lijewski S., Czarczyńska-Goślińska B., Szczołko W., Gośliński T., Terapia fotodynamiczna z udziałem fotouczulaczy porfirynoidowych jako narzędzie współczesnej medycyny i wyzwanie dla farmacji, Czasopismo Aptekarskie 8-9 ( 2012), s. 224-225 Sieroń A., Sieroń-Stołtny K., Kawczyk-Krupka A., Latos W., Kwiatek S., Straszak D., Bugaj A. M., The role of fluorescence diagnosis in clinical practise, OncoTargets and Therapy 6(2013), s. 977-982 Urbańska N., Synteza i spektroskopia wielofunkcyjnych pochodnych porficenów, praca doktorska, Instytut Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk, ul. Kasprzaka 44/52, 01-224 Warszawa Nowak-Stępniowska A., Pergoł P., Padzik-Graczyk A., Metoda fotodynamiczna diagnostyki i leczenia nowotworów - mechanizmy i zastosowania, Postępy Biochemii 59, 1 (2013), s. 53-63 Ferreira S., Tedesco A. C., Sousa G., Zângaro R. A., Silva N. S., Pacheco M., Pacheco-Soares C., Analysis of mitochondria, endoplasmic reticulum and actin filaments after PDT with AlPcS4, Lasers in Medical Science 18 (2004), s. 207-212 Brożek-Płuska B., Metody spektroskopowe w diagnostyce zmian nowotworowych ludzkiego gruczołu piersiowego, Zeszyty Naukowe Politechnika Łódzka, 1157 (2013) Souto C., Madeira K., Rettori D., Baratti M., Rangel L., Razzo D., da Silva A., Improved photodynamic action of nanoparticles loaded with indium (III) phthalocyanine on MCF-7 breast cancer cells, Journal of Nanoparticles Research 15 (2013), s. 1879-1898 Portilho F. A., de Oliveira Cavalcanti C., Miranda-Vilela A. L., Estevanato L., Longo J., Santos M., Bocca A., Martins O., Simioni A., Morais P., Azevedo R., Tedesco A.., Lacava Z., Antitumor activity of photodynamic therapy 118 Ftalocyjaniny w fotodynamicznych metodach diagnostyki i leczenia chorób 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. performed with nanospheres containing zinc-phthalocyanine, Journal of nanobiotechnology 11, 41 (2013) Chwiłkowska A., Kulbacka J., Saczko J., Śmierć komórek nowotworowych. Udział reakcji fotodynamicznej w indukcji apoptozy w komórkach nowotworowych, Polski Merkuriusz Lekarski, XXX, 175, 45 (2011) Kwitniewski M., Juzeniene A., Ma L.W., Glosnicka R., Graczyk A., Moan J., Diamino acid derivatives of PpIX as potential photosensitizers for photodynamic therapy of squamous cell carcinoma and prostate cancer: In vitro studiem, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 94, 3(2009), s. 214-222 Osmałek T., Modyfikowane ftalocyjaniny, porfirazyny i subftalocyjaniny jako potencjalne fotosensybilizatory w terapii fotodynamicznej, praca doktorska, Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań Lim C.K., Shin J. , Lee Y.D., Kim J. , Oh K.S. , Yuk S.H. , Jeong S.Y. , Kwon I.C. , Kim S., Phthalocyanine-Aggregated Polymeric Nanoparticles as TumorHoming Near-Infrared Absorbers for Photothermal Therapy of Cancer, Theranostics, 2 (2012), s. 871-879 Lau J.T.F. , Lo P.C. , Jiang X.J., Wang Q., Ng D.K.P., A dual activatable photosensitizer toward targeted photodynamic therapy, Journal of Medicinal Chemistry, 57 (2014), s. 4088-4097 Bio M. , Rajaputra P., Nkepang G., You Y., Far-red light activatable, multifunctional prodrug for fluorescence optical imaging and combinational treatment, Journal of Medicinal Chemistry, 57 (2014), s. 3401-3409 Werengowska K. M., Wiśniewski M., Terzyk A. P., Gurtowska N., Drewa T. A., Olkowska J., Chemiczne aspekty celowanej terapii przeciwnowotworowej II, Połączenia nośnik-lek. Wiadomości Chemiczne. 66 (2012), s. 7-8 Allen C.M. , Sharman W.M. , Van Lier J.E., Current status of phthalocyanines in the photodynamic therapy of cancer, Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 5 (2001), s. 161-169 Osmałek T., Gośliński T., Mielcarek J., Osmałek E., Nowe tendencje oraz bezpieczeństwo terapii fotodynamicznej, Przegląd Lekarski. 69 (2012), s. 1205-1208 Nevozhay D., Kańska U., Budzyńska R., Boratyński J., Współczesny stan badań nad koniugatami i innymi systemami dostarczania leków w leczeniu schorzeń nowotworowych i innych jednostek chorobowych, Postepy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (online), 61(2007), s. 350-360. Ogbodu R.O, Ndhundhuma I., Karsten A., Nyokong T., Photodynamic therapy effect of zinc monoamino phthalocyanine–folic acid conjugate adsorbed on single walled carbon nanotubes on melanoma cells, Acta Spectrochimica Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 137 (2015), s. 1120-1125 Tu J., Wang T., Shi W., Wu G., Tian X., Wang Y., Ge D., Ren L., Multifunctional ZnPc-loaded mesoporous silica nanoparticles for enhancement of photodynamic therapy efficacy by endolysosomal escape, Biomaterials. 33 (2012), s. 7903-7914 119 Karolina Jakubczyk, Katarzyna Barchiewicz 30. Nishiyama N., Nakagishi Y., Morimoto Y., Lai P.S., Miyazaki K., Urano K., Horie S., Kumagai M., Fukushima S., Cheng Y., Jang W.D., Kikuchi M., Kataoka K., Enhanced photodynamic cancer treatment by supramolecular nanocarriers charged with dendrimer phthalocyanine, Journal of Controlled Release, 133 (2009), s. 245-251 31. Jiang Z., Shao J., Yang T., Wang J., Jia L., Pharmaceutical development, composition and quantitative analysis ofphthalocyanine as the photosensitizer for cancer photodynamic therapy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 87 (2014), s. 98-104 32. Baron E. D., Malbasa C. L., Santo-Domingo D., Fu P., Miller J. D. , Hanneman K. K., Hsia A. H. , Oleinick N. L. , Colussi V. C. , Cooper K. D., Silicon phthalocyanine (Pc 4) photodynamic therapy is a safe modality for cutaneous neoplasms: Results of a phase 1 clinical trial, Lasers in Surgery and Medicine, 42 (2010), s. 728-735 33. Wright M., Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), Journal of Antimicrobial Chemotherapy 42 (1998), s. 13-28 34. Gośliński T., Konopka K., Piskorz J., Kryjewski M., Wierzchowski M., Sobiak S., Perspektywy zastosowania fotodynamicznej terapii skierowanej przeciw mikroorganizmom - PACT, Postępy mikrobiologii, 47, 4 (2008), s. 447-456 35. www.briggatemedical.com Phthalocyanines in photodynamic methods of diagnosis and treatment Abstract Phthalocyanines are synthetic analogues of porphyrins, an important group of biologically active compounds, which are of great importance for the processes occurring in the cells of living organisms. The physicochemical properties of these compounds result from the electron density distribution in the core of the phthalocyanine macrocycle. Additionally, the macrocycles can be diversely functionalized which allows modifying and tuning of the chemical and opto-electronic properties of these compounds. Moreover, phthalocyanine and its complexes exhibit natural affinity to molecular oxygen and hence they have been considered a very attractive material for medical applications, i.a. photosensitizers in photodynamic methods for diagnosis (PDD) and therapy (PDT) of tumors. These methods may help solving problems such as low selectivity and side effects faced by the therapeutic strategies used so far. Photodynamic therapy is also used in the treatment of many non-neoplastic lesions. Examples include infections caused by fungi or drug-resistant bacteria, eye diseases (especially age-related macular degeneration) and skin diseases. 120 Arkadiusz Czerwonka1, Anna Wawruszak2, Karolina Okła3 Spirulina – historia, skład i właściwości prozdrowotne Spirulina to produkt handlowy otrzymywany z wolno żyjących w toni wodnej przedstawicieli sinic (cyjanobakterii) z rodzaju Arthrospira, stosowany jako suplement diety. Ze względu na wysoki potencjał odżywczy i prozdrowotny zawartych w niej substancji cieszy się ona obecnie dużym zainteresowaniem zarówno konsumentów, jak i naukowców. W spirulinie stwierdzono bowiem występowanie między innymi: c-fikocyjaniny, β-karotenu, witamin, specyficznych kwasów tłuszczowych, białek i peptydów oraz składników mineralnych. Liczne badania wykazały, że przyjmowanie tego suplementu wpływa korzystnie na ludzki układ sercowo-naczyniowy oraz odpornościowy, a także zmniejsza ryzyko zachorowania na choroby nowotworowe. W związku z tym w ostatnich latach obserwuje się intensywny rozwój zarówno zakładów produkujących, jak też przetwarzających spirulinę. W ostatnim czasie powstało szereg prac badawczych opisujących korzystne działanie spiruliny na organizm ludzki, wynikający z jej spożywania. Celem poniższej pracy było opisanie suplementu diety jakim jest spirulina oraz przybliżenie jej ewentualnego prozdrowotnego wpływu na organizm ludzki z uwzględnieniem aktualnego piśmiennictwa. 1. Wprowadzenie Cyjanobakterie z rodzaju Arthrospira to bakterie tworzące charakterystyczne, kilkumilimetrowe, nitkowate, wielokomórkowe kolonie o spiralnej budowie trychomu. Ze wzglądu na obecność chlorofilu oraz zdolność do fotosyntezy, początkowo opisywano je jako rośliny (Plantae). Wraz z postępem badań nad ich genetyką, fizjologią i biochemią zaklasyfikowano je ostatecznie do królestwem bakterii (Bacteria). Cyjanobakterie z rodzaju Arthrospira charakteryzują się obecnością specyficznych barwników fotosyntetycznych, takich jak allofikocyjanina i c-fikocyjanina, czemu zawdzięczają swój zielono-niebieski kolor [1]. Należy zwrócić uwagę, że produkt rozpowszechniany pod nazwą handlową spirulina, który nie powstaje z cyjanobakterii rodzaju Spirulina lecz 1 [email protected],Zakład Wirusologii i Immunologii, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 2 [email protected], Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 3 [email protected],I Katedra i Zakład Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie 121 Arkadiusz Czerwonka, Anna Wawruszak, Karolina Okła Arthrospira. Nieprawidłowość nazwy suplementu wiąże się bardziej z przemysłowymi aspektami produkcji i elementami historycznymi, niż rzeczywistą systematyką opartą na genetycznym podobieństwie organizmów [2]. W związku z tym, że w niektórych pracach naukowych dopuszcza się używanie nazw Spirulina/Arthrospira jako synonimów, prowadzi to do pewnego rodzaju nieścisłości. W naturalnym środowiskusinice z rodzaju Arthrospira występują w silnie zasolonych, ciepłych wodach strefy tropikalnej i subtropikalnej, takich jak wody Meksyku, Ameryki Północnej (Kalifornia), centralnej Afryki i Azji. Najlepsze warunki do ich rozwoju stwarzają płytkie, słone lub słonawe jeziora [3]. Organizmy te były prawdopodobnie spożywane już od bardzo dawna. Po raz pierwszy Europejczycy spotkali się z tym pożywieniem w XVI wieku, kiedy to Hiszpańscy konkwistadorzy zaobserwowali, że Aztekowie zamieszkujący Dolinę Meksyku zbierają z jeziora Texcoco zielone „rośliny” określane przez nich jako "Techuitlatl". Po wyłowieniu z płytkich lagun wolno pływających sinic, suszono je i przyrządzano potrawy przypominające placki [4]. Pierwsze próby hodowli sinic z rodzaju Arthrospira na skalę przemysłową rozpoczęły się w drugiej połowie lat 50 ubiegłego wieku na terenie USA, Niemiec i Japonii, i miały głównie charakter naukowo-badawczy. Po ustaleniu metod hodowli, zbioru i procesów oczyszczania, pierwszą fabrykę komercyjnie produkującą spirulinę otwarto we wczesnych latach 70 XX wieku. Została ona założona na terenie dawnego jeziora Texcoco w Meksyku przez firmę Sosa Texcoco S.A. W związku z dużym potencjałem odżywczym, spirulinę okrzyknięto „cudownym pokarmem przyszłości”, co zaowocowało powstaniem wielu zakładów produkcyjnych w ciągu kilkunastu następnych lat [4]. Obecnie cyjanobakterie z rodzaju Arthrospira hodowane są głównie w otwartych zbiornikach wyposażonych w specjalne mieszadła lub inne systemy zapewniające ciągły przepływ wody i ruch hodowli, takie jak układy kaskadowe lub koryta przepływowe. Zazwyczaj są to płytkie (20-30 cm) zbiorniki o dużej powierzchni (nawet do 1000 m2) i intensywnym nasłonecznieniu. W celu obniżenia kosztów i podniesienia wydajności produkcji, fabryki lokalizuje się na terenach o zbliżonym klimacie w jakim Arthrospira występuje w środowisku naturalnym. Specyficzne warunki hodowli eliminują część niepożądanych glonów mogących rozwijać się w zbiornikach wraz z hodowlą Arthrospira [5]. Obecnie spirulinę otrzymuje się zazwyczaj z trzech gatunków Arthrospira: A. platensis, A. maxima i A. fusiformis wykorzystując ich wysokie wartości odżywcze, a także obecność licznych związków bioaktywnie czynnych [3]. Po zbiorze surowca odbywa się szereg procesów oczyszczania, 122 Spirulina – historia, skład i właściwości prozdrowotne zagęszczania, neutralizowania pH, dezintegracji komórek czy osuszania, pozwalających na uzyskanie ostatecznej formy surowca [4]. Spirulina najczęściej trafia na rynek w formie sproszkowanej lub tabletek. Można ją odnaleźć zarówno w produktach pitnych, jak też żywnościowych, jako dodatek do produktów zbożowych, mlecznych, słodyczy czy emulsji [6]. Sprzedawana zazwyczaj jako suplement diety, który przyjmowany systematycznie i w niewielkich dawkach ma zapewniać szereg prozdrowotnych korzyści dla konsumenta. W związku z stosunkowo prostymi metodami produkcji, szerokim spektrum aktywności biologicznej jak i dużej popularności wśród konsumentów, celem artykułu jest przybliżenie informacji o suplemencie diety jakim jest spirulina z uwzględnieniem zarówno jej pozytywnego jak i negatywnego wpływu na organizmy żywe. 2. Składi aktywność spiruliny Popularność spiruliny wśród konsumentów wiąże się przede wszystkim z bogactwem zawartych w niej składników bioaktywnych. Jej odżywcze właściwości opierają się głównie na znacznej zawartości białka i peptydów, szacowanej na około 55-70% suchej masy. Chociaż produkty bogate w spirulinę uboższe są w metioninę, cystynę i lizynę w porównaniu do protein zwierzęcych, stanowi ona lepsze źródło aminokwasów niż większość białek roślinnych [4]. Spirulina zawiera również znaczną ilość witamin (tiamina, ryboflawina, niacyna, pirydoksyna, kwas foliowy, kobalamina, kwas askorbinowy) i prowitamin (prekursory witaminy D i E), składników mineralnych (potas, wapń, chrom, miedź, żelazo, magnez, mangan, fosfor, selen, sód i cynk), kwasów tłuszczowych (około 4-9 % suchej masy) [7] takich jak wielonienasycone kwasy ω-3 (kwas eikozapentaenowy, kwas stearydynowy, kwas dokozaheksaenowy) i ω-6 (kwas arachidonowy, kwas linolowy, kwas γ- linolenowy) oraz lipidów [4]. Ciekawą grupę związków obecnych w spirulinie, odpowiedzialnych za jej prozdrowotne właściwości, stanowią związki fenolowe oraz barwniki fotosyntetyczne. Możemy tu stwierdzić występowanie między innymi: chlorofilu a i produktów jego rozpadu, c-fikocyjaniny i allofikocyjaniny, β-karotenu, β-kryptoksantyny, zeaksantyny, echinenonu, oscyllaksantyny czy myksoksantofilu [8]. O bogatym składzie odżywczym tego suplementu świadczy fakt, że zarówno Narodowa Agencja Aeronautyki i Przestrzeni Kosmicznej (NASA), jak i Europejska Agencja Kosmiczna (ESA), rekomendują spirulinę jako pokarm dla astronautów podczas długoterminowych misji kosmicznych [9]. Pomimo licznych walorów odżywczych, spirulina przyciąga uwagę konsumentów głównie ze względu na jej prozdrowotny charakter. 123 Arkadiusz Czerwonka, Anna Wawruszak, Karolina Okła Już wczesne badania nad zwierzętami z lat 80- i 90-tych ubiegłego wieku wykazały brak zaburzeń rozwoju płodu, aktywności teratogennej czy zmian behawioralnych osobników, którym podawano spirulinę nawet w wysokich dawkach (30 g na 100 g masy ciała) czy długoterminowo (13 tygodni) [41, 42, 43]. Szereg prac badawczych potwierdziło pozytywny wpływ przyjmowania spiruliny na ograniczenie wystąpienia różnych schorzeń. Zauważono wówczas, że u gryzoni karmionych paszą wysokotłuszczową przy jednoczesnej suplementacji spiruliną uzyskano spadek frakcji transporterów cholesterolu LDL, VLDL oraz acylogliceroli i fosfolipidów z jednoczesnym wzrostem frakcji HDL w surowicy krwi [10]. Zmiany te korelują z ogólno przyjętym modelem zmniejszenia ryzyka wystąpienia chorób układu sercowo-naczyniowego, a mianowicie ograniczeniem wystąpienia miażdżycy. Dalsze badania [11] potwierdziły, że zmiany te wiążą się ze wzrostem aktywności takich enzymów jak lipaza lipoproteinowa i wątrobowa, lipaza triglicerydów na skutek działania spiruliny, co jednocześnie chroni i przeciwdziała rozwojowi takich schorzeń jak np. niealkoholowe stłuszczenie wątroby. Dane uzyskane z badań nad zwierzętami zostały częściowo potwierdzone w kilku projektach z udziałem ochotników. Biorąc jednak pod uwagę stosunkowo mało liczebną grupę badaną i duże rozbieżności pomiędzy osobami badanymi, próby kliniczne powinny zostać uzupełnione [12]. Spirulina wywiera korzystny wpływ na układ sercowo-naczyniowy poprzez bezpośredni wpływ na śródbłonek naczyń krwionośnych. Wzmacnia ona bowiem syntezę i uwalnianie endogennych związków, takich jak tlenek azotu, doprowadzając do rozszerzenia naczyń krwionośnych. Spirulina jednocześnie obniża produkcję niektórych pochodnych kwasu arachidonowego, odpowiedzialnych za skurcz naczyń, co skutkuje obniżeniem ciśnienia krwi [13, 14]. Ponadto z ekstraktów spiruliny wyizolowano również specyficzny tripeptyd (Ile-Gln-Pro) zdolny do inhibicji konwertazy angiotensyny (ACE) [15]. ACE jest odpowiedzialny za przekształcanie angiotensyny I w II, która podnosi ciśnienie tętnicze krwi. Tym samym, zahamowanie aktywności ACE przez wyżej wymieniony peptyd, sprzyja obniżeniu ciśnienia w układzie krwionośnym. Interesujący jest również ewentualny wpływ spiruliny na centralny układ nerwowy. W przypadku badań nad gryzoniami, suplementacja spiruliną niwelowała związany z wiekiem wzrost ekspresji cytokin prozapalnych (TNFα i TNFβ), a także spadek aktywności β-adrenergicznego receptora w móżdżku szczura [16, 17]. Wiele uwagi poświęcono również stymulacji układu odpornościowego pod wpływem spiruliny, zarówno wśród ludzi jak i zwierząt. Wykazano, że na poziomie komórkowym spirulina ułatwia produkcję przeciwciał, 124 Spirulina – historia, skład i właściwości prozdrowotne zwiększa aktywację makrofagów, komórek NK oraz limfocytów T i B, a w komórkach szpikowych, wykazuje stymulujący wpływ na produkcję niektórych cytokin za pośrednictwem receptorów TLR [6, 18, 19]. Może to stymulować układ odpornościowy do szybszej i skuteczniejszej odpowiedzi immunologicznej w przypadku infekcji patogenami. Ponadto, próby z udziałem ochotników spożywających spirulinę, wykazały redukcję alergicznych objawów nieżytu górnych dróg oddechowych, takich jak przekrwienie błon śluzowych, kichanie, swędzenie czy zwiększoną produkcję wydzieliny z nosa [20]. Daje to podstawy do przyjęcia założenia, iż może ona wywierać kompleksowy, modulujący wpływ na komórki immunokompetentne, zarówno zwiększając ich aktywność, jak i hamując, w przypadkach nadwrażliwości, odpowiedź na neutralne antygeny. Spirulina nie tylko potrafi stymulować układ odpornościowy, ale również bezpośrednio zwalczać patogeny odpowiedzialne za infekcję. W przypadku wirusów, ekstrakty uzyskane ze spiruliny hamują replikację, adsorpcję czy też wnikanie wirionów do komórek gospodarza. Aktywność ta przypisywana jest obecności między innymi spirulanowi wapnia, polisacharydowi zawierającemu w swoim składzie ramnozę, rybozę, mannozę, fruktozę, galaktozę, ksylozę, glukozę, kwas glukuronowy, kwas galakturonowy, siarczan oraz chelatowany wapń [21]. Działanie przeciwwirusowe wykazują ponadto związki z grupy sulfolipidów (nawet do 5% suchej masy) obecne w spirulinie, wykazujące między innymi zdolność do inhibicji polimerazy DNA wirusa HIV [6]. Wodne ekstrakty uzyskane z Arthrospira hamują replikację takich wirusów jak Herpes simplex (opryszczka), Human herpesvirus-5 (cytomegalia), Measles virus (odra), Mumps virus (nagminne zapalenie przyusznic), Influenzavirus A (grypa typu A) czy łagodzą objawy leukoplakii związanej z wirusem brodawczaka ludzkiego [6, 22]. W przypadku bakterii, wykazano hamujący wpływ spiruliny na wzrost między innymi Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi czy Enterococcus faecalis [23], a w przypadku grzybów – Aspergillus Niger [24] i Candida albicans [25]. Spirulina może też być użyteczna w hodowli zwierząt. Ze wzglądu na aktywność przeciwbakteryjną w stosunku do różnorodnych przedstawicieli gatunków Pseudomonas, Aeromonas i Vibrio, będących patogenami ryb [26], zwrócono uwagę na ewentualną możliwość suplementacji zwierząt hodowlanych takich jak Tilapia nilowa (Oreochromis niloticus) [27] czy też karp (Cyprinus carpio) [28]. 125 Arkadiusz Czerwonka, Anna Wawruszak, Karolina Okła 3. Spirulina a nowotwory W ostatnich latach duże zainteresowanie wzbudza możliwość przeciwnowotworowego zastosowania spiruliny. Uwagę naukowców zwracają przede wszystkim substancje wykazujące silne działanie przeciwutleniające i przeciwzapalne, sprzyjające hamowaniu procesów nowotworzenia oraz doprowadzające do indukcji enzymów związanych z ochroną komórek przed stresem oksydacyjnym. Badania in vitro wykazały hamujący wpływ ekstraktów spiruliny na proliferację komórek raka trzustki [29] i wątroby [30], co potwierdza jej możliwości terapeutyczne. Aktywność przeciwnowotworową przypisuje się między innymi zawartej w spirulinie c-fikocyjaninie. Kompleks ten, składający się z białek i barwnika fotosyntetyzującego - fikocyjanobiliny, jest selektywnym inhibitorem cyklooksygenazy 2. Enzym ten, aktywowany przez mitogeny, onkogeny i czynniki wzrostowe sprzyja progresji chorób nowotworowych poprzez produkcję prostaglandyn doprowadzając zarówno do indukcji stanu zapalnego, jak i procesów angiogenezy [31]. Ponadto pod wpływem spiruliny stwierdzono wzrost aktywności takich enzymów jak: peroksydaza glutationowa, peroksydaza glutationowa zależna od selenu czy reduktaza glutationu oraz do wzrostu poziomu samego glutationu [32]. Zapobiega to uszkodzeniom komórek wywoływanym przez reaktywne formy tlenu itoksyny, stanowiąc tym samym barierę ochronną przed wczesnymi etapami inicjacji procesu nowotworzenia. Co ciekawe spirulina jest też w stanie chronić organizm przed genotoksycznym wpływem licznych czynników fizycznych, takich jak promieniowanie elektromagnetyczne o częstotliwości 900 MHz [33], promieniowanie izotopu kobalt-60 [34] oraz chemicznych czynników rakotwórczych, takich jak 7,12-dimetylobenzantracen (DMBA) [35,36]. Ochronny chrakter spiruliny przed czynnikami fizycznymi i chemicznymi wynikać może z występowania w niej unikalnych polisacharydów wspomagających mechanizmy naprawcze DNA poprzez modulację aktywności endonukleaz [6]. Podawanie spiruliny może również służyć łagodzeniu skutków terapii cytostatykami. 5-fluorouracyl czy doksorubicyna, to leki używane w terapii przeciwnowotworowej, charakteryzujące się licznymi skutkami ubocznymi, między innymi wywołują uszkodzenie mięśnia sercowego. W obu przypadkach stosowania tych leków można zaobserwować ochronny wpływ spiruliny na ten narząd [37,38]. Podawanie spiruliny obniża również nefrotoksyczność cis-platyny [39]. Uwagę zwraca również fakt, że podczas hodowli w określonych warunkach, spirulina posiada zdolność do silnej akumulacji cząsteczek 126 Spirulina – historia, skład i właściwości prozdrowotne selenu. Pierwiastek ten charakteryzuje się dużym potencjałem przeciwnowotworowym i podawany w takiej formie może zatrzymywać komórki neoplastyczne w fazie G1 cyklu komórkowego, indukując tym samym proces apoptozy [40]. Należy jednak pamiętać, że może istnieć pewne ryzyko związane z suplementacją spiruliną. Już od dawna wiadomo o zdolności Arthrospira do akumulacji metali ciężkich lub rtęci bezpośrednio ze środowiska [44], które mogą wywierać szkodliwy wpływ na organizm. Poza tym, niektóre gatunki cyjanobakterii zanieczyszczające hodowlę Arthrospira mogą wytwarzać substancje chemiczne toksyczne dla wątroby lub komórek układu nerwowego (anatoksyna-A [45] czy β-metylamino-L-alanina (BMAA)) [46]. W związku z tym niezwykle istotna wydaje się być kontrola procesów związanych z produkcją, dystrybucją i przechowywaniem tego surowca, w celu uniknięcia spożywania wraz z nim niepożądanych zanieczyszczeń. 4. Podsumowanie Stosunkowo prosta produkcja, wysoka wydajność oraz atrakcyjność pod względem wartości odżywczych i bogactwo związków bioaktywnie czynnych powinny gwarantować spirulinie, jako suplementowi lub elementowi diety, powodzenie wśród konsumentów. Pomimo szeregu korzystnych właściwości, związek ten nie jest obecnie powszechnie znany i rutynowo stosowany. Produkt ten wydaje się nie wywierać skutków ubocznych przy regularnym jego stosowaniu i może odgrywać dużo istotniejszą rolę jako suplement diety nie tylko ludzi ale również zwierząt hodowlanych. Istnieją silne podstawy naukowe, że przyjmowanie spiruliny może przeciwdziałać lub łagodzić objawy chorób związanych z układem krążeniowooddechowym, gospodarką lipidową lub nowotworami oraz wywierać ochronny wpływ na organy wewnętrzne takie jak wątroba, serce czy mózg. Ponadto, przeciwdziałając indukcji stanu zapalnego, modulując aktywność układu odpornościowego czy też niwelując szkodliwy wpływ niektórych ksenobiotyków wspiera utrzymanie homeostazy w organizmie. W oparciu o dotychczasowe badania spirulina może znaleźć zastosowanie jako substancja pomocnicza w zwalczaniu wielu chorobotwórczych patogenów bakteryjnych, grzybiczych czy też wirusowych. Pomimo wielu właściwości prozdrowotnych spiruliny, należy jednak zwracać pilną uwagę na procesy jej produkcji, dystrybucji czy też przechowywania by zminimalizować ryzyko wystąpienia szkodliwych zanieczyszczeń takich jak metale ciężkie czy też mikroorganizmy patogenne. Ponadto by w pełni zrozumieć mechanizmy odpowiedzialne za działanie spiruliny, należy uwzględnić długoterminowe analizy z udziałem 127 Arkadiusz Czerwonka, Anna Wawruszak, Karolina Okła większej grupy badanej niż te przeprowadzane dotychczas. Pozwoli to uzupełnić niezbędne informacje na temat tego suplementu diety. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Miklaszewska M. Waleron M. Waleron K. Charakterystyka jadalnej cyjanobakterii z rodzaju Arthrospira. Biotechnologia, 3, (2008), pp. 103-118 Ling N. Mao Y. Zhang X. Wang G. Liu W. Sequence analysis of Arthrospira maxima based on fosmid library. Journal of Applied Phycology, (2007), 19 (4), pp. 333-346 Gershwin ME. Belay A. Spirulina in human nutrition and health. Boca Raton: CRC Press, (2008), pp. 4 Habib MAB. Parvin M. Huntington TC. Hasan MR. A review on culture, production and use of spirulina as food for humans and feeds for domestic animals. FAO Fisheries and Aquaculture Circular, (2008) 1034 Borowitzka MA. Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes and fermenters. Journal of Biotechnology 70 (1-3), (1999), pp. 313-321 Hosseini SM. Shahbazizadeh S. Khosravi-Darani K. Mozafari MR. Spirulinapaltensis: Food and Function. Current Nutrition and Food Science, 9 (3), (2013), pp. 189-193 Gouveia L. Oliveira AC. Microalgae as a raw material for biofuels production. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 36 (2), (2009), pp. 269-274 Jaime L. Mendiola JA. Herrero M. Cifuentes A. Ibáñez E. Separation andcharacterization of antioxidants from Spirulinaplatensis microalga combining pressurized liquid extraction, TLC, and HPLC-DAD. Journal of Separation Science, 28 (16), (2005), pp. 2111-2119 Small E. Spirulina - food for the universe. Biodiversity, 12 (4),(2011), pp. 255-265 Kato T. Takemoto K. Katayama H. Kuwabara Y. Effects of Spirulina (Spirulinaplatensis) on dietary hypercholesterolemia in rats. J Jap SocNutr Food Sci., 37, (1984),pp. 323-332 Iwata K. Inayama T. Kato T. Effects of Spirulinaplatensis on plasma lipoprotein lipase activity in fructose-induced hyperlipidemic rats. J NutrSciVitaminol., 36, (1990), pp. 165-171 Deng R. Chow TJ. Hypolipidemic, Antioxidant, and Antiinflammatory Activities of Microalgae Spirulina. Cardiovascular Therapeutics, 28 (4), (2010), pp. e33-e45 Paredes-Carbajal MC. Torres-Durán PV. Díaz-Zagoya JC. Mascher D. JuárezOropeza MA. Effects of the ethanolic extract of Spirulina maxima on endothelium dependent vasomotor responses of rat aortic rings. J Ethnopharmacol, 75, (2001), pp 37-44 Paredes-Carbajal MC. Torres-Durán PV. Rivas-Arancibia S. ZamoraGonzalez J. Mascher D. Juárez-Oropeza MA. Effects of dietary Spirulina maxima on vasomotor responses of aorta rings from rats fed on a fructoserich diet. Nutr Res., 18, (1998) pp. 1769-1782 128 Spirulina – historia, skład i właściwości prozdrowotne 15. Lu J. Ren DF. Xue YL. Miyakawa T. Tanokura M. Isolation of anantihypertensive peptide from alcalase digest of spirulinaplatensis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58 (12), (2010), pp. 7166-7171 16. Gemma C. Mesches MH. Sepesi B. Choo K. Holmes DB. Bickford PC. Diets enriched in foods with high antioxidant activity reverse age-induced decreases in cerebellar beta-adrenergic function and increases in proinflammatory cytokines. J Neurosci., 22, (2002) pp. 6114-6120 17. Hwang JH. Lee IT. Jeng KC. Wu SM. Chan YC. Spirulina prevents memory dysfunction, reduces oxidative stress damage and augments antioxidant activity in senescence-accelerated mice. Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 57 (2), (2011), pp. 186-191 18. Yakoot M. Salem A. Spirulinaplatensis versus silymarin in the treatment of chronic hepatitis C virus infection. A pilot randomized, comparative clinical trial. BMC Gastroenterology, (2012), 12:32 19. Hirahashi T. Matsumoto M. Hazeki K. Ui M. Seya T. Activation of the human innate immune system by Spirulina: Augmentation of interferon production and NK cytotoxicity by oral administration of hot water extract of Spirulinaplatensis. International Immunopharmacology, 2 (4), (2002), pp. 423-434 20. Cingi C. Conk-Dalay M. Cakli H. Bal C. The effects of Spirulina on allergic rhinitis. Eur Arch Otorhinolaryngol, 265, (2008), pp. 1219-1223 21. Hayashi T. Hayashi K. Maeda M. Kojima I. Calcium Spirulan, an Inhibitor of Enveloped Virus Replication, from a Blue-Green Alga Spirulinaplatensis. J Nat Prod., 59 (1), (1996), pp. 83-7 22. Rechter S. König T. Auerochs S. Walter C. Marschall M. Antiviral activity of Arthrospira-derived spirulan-like substances. Antiviral Research, 72 (3), (2006), pp. 197-206 23. El-Baz FK. El-Senousy WM. El-Sayed AB. Kamel MM. In vitro antiviral and antimicrobial activities of Spirulinaplatensis extract. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 3 (12), (2013), pp. 52-56 24. Mendiola JA. Jaime L. Santoyo S. Ibañez E. Señoráns FJ. Screening of functional compounds in supercritical fluid extracts from Spirulinaplatensis. Food Chemistry, 102 (4), (2007), pp. 1357-1367 25. Soltani M. Khosravi AR. Asadi F. Shokri H. Evaluation of protective efficacy of Spirulinaplatensis in Balb/C mice with candidiasis. Journal de MycologieMedicale, 22 (4), (2012), pp. 329-334 26. Pradhan J. Das BK. Sahu S. Mishra BK. Eknath AE. Traditional antibacterial activity of freshwater microalga Spirulinaplatensis to aquatic pathogens. Aquaculture Research, 43 (9), (2012), pp. 1287-1295 27. Ragap HM. Khalil RH. Mutawie HH. Immunostimulant effects of dietary Spirulinaplatensis on tilapia Oreochromisniloticus. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2 (2), (2012), pp. 26-31 28. Watanuki H. Ota K. Tassakka AC. Kato T. Sakai M. Immunostimulant effects of dietary Spirulinaplatensis on carp, Cyprinuscarpio. Aquaculture, 258 (1-4), (2006), pp. 157-163 129 Arkadiusz Czerwonka, Anna Wawruszak, Karolina Okła 29. Koníčková R. Vaňková K. Vaníková J. Wong RJ. Vítek L. Anti-cancer effects of blue-green alga Spirulinaplatensis, a natural source of bilirubin-like tetrapyrrolic compounds. Annals of Hepatology, 13 (2), (2014) pp. 273-283 30. Soheili M. Khosravi-Darani K. The potential health benefits of algae and micro algae in medicine: A review on Spirulinaplatensis. Current Nutrition and Food Science 7 (4), (2011), pp. 279-285 31. Saini MK. Sanyal SN. Targeting angiogenic pathway for chemoprevention of experimental colon cancer using C-phycocyanin as cyclooxygenase-2 inhibitor. Biochemistry and Cell Biology, 92 (3), (2014), pp. 206-218 32. Bermejo-Bescós P. Piñero-Estrada E. Villardel Fresno AM. Neuroprotection by Spirulinaplatensis protean extract and phycocyanin against iron-induced toxicity in SH-SY5Y neuroblastoma cells. Toxicol In Vitro, 22 (2008), pp. 1496-1502 33. Mohamed WA. Ismail SA. El-Hakim YMA. Spirulinaplatensis ameliorative effect against GSM 900-MHz cellular phone radiation-induced genotoxicity in male Sprague-Dawley rats. Comparative Clinical Pathology, 23 (6), (2014), pp 1719-1726 34. Hong-Quan Z. An-Ping L. Yun S. Yang-Mei D. Chemo- and radio-protective effects of polysaccharide of spirulinaplatensis on hemopoietic system of mice and dogs. ActaPharmacologicaSinica, 22 (12), (2001), pp. 1121-1124 35. Grawish ME. Zaher AR. Gaafar AI. Nasif WA. Long-term effect of Spirulinaplatensis extract on DMBA-induced hamster buccal pouch carcinogenesis (immunohistochemical study). Medical Oncology, 27 (1), (2010), pp. 20-28 36. Ouhtit A. Ismail MF. Othman A. Al-Riyami H. Raj MHG. Chemoprevention of rat mammary carcinogenesis by spirulina. American Journal of Pathology, 184 (1), (2014), pp. 296-303 37. Khan M. Shobha JC. Mohan IK. Kuppusamy P, Kutala VK. Protective effect of Spirulina against doxorubicin-induced cardiotoxicity. Phytotherapy Research, 19 (12), (2005), pp. 1030-1037 38. Simbre C. Duffy A. Dadlani H. Miller L. Lipshultz E. Cardiotoxicity of cancer chemotherapy: Implications for children. Pediatr Drugs, 7 (2005), pp. 187-202 39. Mohan, I.K., Khan, M., Shobha, J.C., Kuppusamy, P., Kutala, V.K. Protection against cisplatin-induced nephrotoxicity by Spirulina in rats. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 58 (6), (2006), pp. 802-808 40. Yang F. Tang Q. Zhong X. Li Y. Zheng W. Surface decoration by Spirulina polysaccharide enhances the cellular uptake and anticancer efficacy of selenium nanoparticles. International Journal of Nanomedicine, 7 (2012), pp. 835-844 41. Chamorro G. Salazar M. Salazar S. Teratogenic study of Spirulina in rats. Arch Latinoam Nutr, 39 (1989), pp. 641-649. 42. Chamorro G. Salazar M. Teratogenic study of Spirulina in mice. Arch Latinoam Nutr, 40 (1990), pp. 86-94 43. Salazar M. Chamorro GA. Salazar S. Steele CE. Effect of Spirulina maxima consumption on reproduction and peri- and postnatal development in rats. Food Chem Toxicol, 34 (1996), pp. 353-359 130 Spirulina – historia, skład i właściwości prozdrowotne 44. Johnson PE. Shubert LE. Accumulation of mercury and other elements by Spirulina (cyanophyceae). Nutr Rep Int. 34 (1986), pp. 1063-1070 45. Rellán S. Osswald J. Saker M. Gago-Martinez A. Vasconcelos V. First detection of anatoxin-a in human and animal dietary supplements containing cyanobacteria. Food and Chemical Toxicology, 47 (9), (2009), pp. 2189-2195 46. McCarron P. Logan AC. Giddings SD. Quilliam MA. Analysis of β-Nmethylamino-L-alanine (BMAA) in spirulina-containing supplements by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Aquatic Biosystems, (2014), 10:5 Spirulina - history, composition and health promoting properties Summary: Spirulina is a commercial product obtained from free-living in the water column representatives of blue-green algae (cyanobacteria) of the genus Arthrospira, used asa dietary supplement. Because of the nutritional and health-promoting potential it enjoys considerable interest both consumers and scientists now. In the spirulina was found the c-phycocyanin, β-carotene, vitamins, specific fatty acids, peptides and proteins and minerals. Numerous studies have shown that taking this supplement has a beneficial effect on the human cardiovascular and immune system, and also reduces the risk of developing cancer. Therefore, in recent years there has been intensive development of both production facilities, as well as spirulina processing. Recently created a series of research describing the beneficial effects of spirulina on the human body, resulting from its consumption. The purpose of this study was to describe a dietary supplement that is spirulina and bringing its possible impact on the healthy human body including the current literature. 131 Paulina Syryjczyk1, Paulina Miziak1, Julita Kołodziejczyk1, Marta Fiołka2, Krzysztof Grzywnowicz3 Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic Dżdżownice odgrywają ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu ekosystemu pomagając w recyklingu martwego materiału roślinnego poprzez jego przetwarzanie. Dżdżownice są bogatym źródłem aktywności przeciwbakteryjnej, przeciwgrzybowej i przeciwnowotworowej. Aktywność przeciwgrzybowa u dżdżownic opisywana jest głównie w odniesieniu do ekstraktów z całych zwierząt. Innym źródłem tej aktywności mogą być bakterie związane z jelitem tych bezkręgowców. Celem pracy była analiza badań dotyczących pozyskiwania związków przeciwgrzybowych z organizmu dżdżownic. Analizę przeprowadzono na podstawie dostępnej literatury tematycznej w oparciu o najnowsze publikacje opisujące pozyskiwanie związków przeciwgrzybowych z dżdżownic. Ekstrakty do izolacji związków przeciwgrzybowych były przygotowywane na bazie roztworów wodnych i alkoholowych. Metabolity bakterii jelitowych rozdzielano metodą chromatografii jonowymiennej. Aktywność przeciwgrzybowa była określana metodami mikrobiologicznymi w stosunku do różnych szczepów. Ekstrakty z dżdżownic działają przeciwgrzybowo w stosunku do szczepów Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, A. flavus, Penicillium notatum, Trichophyton rubrum. Metabolity Pseudomonas strutzeri z jelita Eisenia foetida dodatkowo są aktywne przeciw Fusarium oxysporum, F. solani, F. moniliformae, F. udum, Macrophomena phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum capsicii, Metabolity Raoultella ornithinolytica z jelita Dendrobaena veneta działają przeciwko C. albicans. Antagonistyczne mikroorganizmy przez swoje interakcje z różnymi patogenami odgrywają ważną rolę w utrzymaniu równowagi mikrobiologicznej. Są istotnym czynnikiem w eliminacji drobnoustrojów chorobotwórczych. Na podstawie przeanalizowanych badań można stwierdzić, że aktywność metabolitów bakterii związanych z jelitem dżdżownic jest obiecującym źródłem związków przeciwgrzybowych do zwalczania zarówno chorób roślin jak i chorób u ludzi. 1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „Mikron”, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Polska 2 Zakład Immunobiologii Instytut Biologii i Biochemii, Uniwersytet Marii CurieSkłodowskiej w Lublinie, Polska 3 Zakład Biochemii, Instytut Biologii i Biochemii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, Polska 132 Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic 1. Wstęp Dżdżownice to organizmy występujące w glebie, wchodzące w skład edafonu. Ich działalność w łańcuchu pokarmowym opiera się na recyklingu martwego materiału roślinnego, którym się żywią. Dzięki temu odgrywają ogromną rolę w użyźnianiu gleby [1]. Poprzez występowanie w środowisku bogatym w przeróżne drobnoustroje, dżdżownice w toku ewolucji rozwinęły mechanizmy obronne, które pozwoliły im przetrwać [2]. Okazuje się, że substancje występujące w ich organizmie mają działanie przeciwbakteryjne i przeciwgrzybowe. Wyciągi z tych zwierząt były znane medycynie orientalnej jako środki przeciwbólowe, przeciwgorączkowe oraz przeciwzapalne. Na przestrzeni lat istotne dla ludzkości okazały się właściwości przeciwnowotworowe tych organizmów, polegające na zapobieganiu zbyt intensywnej absorpcji glukozy. Celem pracy była analiza badań dotyczących pozyskiwania związków przeciwgrzybowych z organizmu dżdżownic, które wykazały, iż substancje wchodzące w skład tych bezkręgowców uniemożliwiają rozwój poszczególnych gatunków bakterii oraz grzybów. Ze względu na małą szkodliwość i stosunkowo łatwą dostępność materiału biologicznego, jakimi są dżdżownice, możliwe było przeprowadzenie szeregu badań dotyczących ich działania na takie gatunki bakterii jak Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogens czy Escherichia coli oraz grzybów: Aspergillus niger i Candida albicans. Gatunkami dżdżownic wykorzystywanymi powszechnie w badaniach są Mauriti lampito i Eudrilus eugeniae, jak również Eisenia fetida. Ekstrakty bądź puder pochodzące z tych dżdżownic wykazywały silne działanie antybakteryjne i antygrzybicze. Dla człowieka istotny jest negatywny wpływ wyciągów z dżdżownic na gatunek grzyba Candida albicans [1, 5]. Gatunek Candida albicans odpowiedzialny jest za ok. 70-90% grzybic występujących u człowieka. Mimo rozwoju medycyny i dostępie do wielu różnorodnych antybiotyków liczba kandydoz w ostatnich latach zwiększyła się. Wśród wielu czynników sprzyjających wystąpieniu zakażeń grzybami, obok upośledzenia układu immunologicznego, są zabiegi chirurgiczne oraz współistniejące choroby takie jak cukrzyca i gruźlica, w których dochodzi do immunosupresji. Zakażenia grzybicze stanowią istotny problem u biorców przeszczepu narządów unaczynionych i szpiku. Infekcja drożdżakowa błony śluzowej jamy ustnej i dróg oddechowych stanowi najczęstsze zakażenie oportunistyczne u pacjentów z AIDS. Pomimo postępu w opiece medycznej uogólnione infekcje grzybicze są nadal istotnym zagrożeniem dla życia i zdrowia noworodków urodzonych przedwcześnie. W związku z niewielką liczbą antybiotyków przeciwgrzybiczych ważne jest poszukiwanie nowych związków przeciwgrzybowych o efektywnym działaniu i znikomej toksyczności. 133 Paulina Syryjczyk, Paulina Miziak, Julita Kołodziejczyk, Marta Fiołka, Krzysztof Grzywnowicz Okazuje się, że pomocne w zwalczaniu grzyba Candida albicans mogą być dżdżownice. Aktywność przeciwgrzybowa u dżdżownic opisana jest głównie w odniesieniu do ekstraktów z całych zwierząt, chociaż jej źródłem mogą być także bakterie występujące w jelicie tych organizmów glebowych. Określenie aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybowej polega na mierzeniu średnicy zahamowania wzrostu danego szczepu. Badania przeprowadzane są z wykorzystaniem ekstraktów z organizmów całych dżdżownic, przygotowanych na bazie roztworów wodnych lub alkoholowych, jak również otrzymywane są z nich pasty i pudry. W badaniach wykorzystywane zostały też metabolity bakterii związanych z jelitem tych bezkręgowców, które frakcjonowano za pomocą chromatografii jonowymiennej. Aktywność przeciwgrzybowa określana jest przy zastosowaniu metod mikrobiologicznych. Do testów stosowane są różne szczepy bakterii oraz grzybów, w tym Candida albicans [1]. 2. Ekstrakt etanolowy jako silny środek przeciwgrzybowy Ekstrakt etanolowy z dżdżownicy działał na Candida albicans wykazując istotną aktywność przeciwgrzybową. Średnica zahamowania wzrostu szczepu Candida wynosiła 15 mm, zaś Aspergillus 12 mm. Wykorzystanie ekstraktu naftowego pozwala zauważyć, iż wykazuje on znacznie mniejszą, wręcz znikomą aktywność przeciwgrzybową. Całkowity brak aktywności przeciwgrzybowej odnotowano w przypadku ekstraktu w buforze fosforanowym. W przeprowadzanych badaniach kontrolą pozytywną był fuconazol (1mg/ml), który charakteryzował się dużą aktywnością przeciwko wszystkim badanym gatunkom grzybów. W badaniach przeprowadzonych przez Mathur i in [1] dowiedziono, iż 95% ekstrakt etanolowy z dżdżownic działał silnie jako środek przeciwgrzybowy w stosunku do C. albicans. Zastosowanie ekstraktu naftowego nie dało oczekiwanych wyników, w związku z czym okazał się on słabiej działającym środkiem antygrzybowym. Wyciąg z dżdżownicy w buforze fosforanowym nie wykazywał jakichkolwiek właściwości przeciwgrzybowych, jak również przeciwbakteryjnych [1]. 3. Pasta wykonana z dżdżownic i jej działanie na Candida albicans Oprócz ekstraktów powszechne w badaniach nad aktywnością przeciwdrobnoustrojową są pasty wykonane z dżdżownic. Gatunkiem dżdżownicy, z którego otrzymuje się pasty jest Eudrilus eugeniae. W doświadczeniach wykonanych przez Vasanthi i in [2] wykorzystano ww. gatunek bezkręgowca, a otrzymaną pastą działano na pięć wybranych szczepów bakterii i dwa szczepy grzybów. Hodowle bakteryjne 134 Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic przygotowane były na skosach agarowych zawierających odpowiednio dobrane składniki, zaś hodowle grzybów przygotowane na skosach agarowych z dodatkiem dekstrozy utrzymywane w temperaturze 4°C. Szczepami wykorzystanymi do badań były: Candida albicans, Aspergillus niger, Trichophyton niger, Aspergillus flavus i Penicillium notatum. Ilości pasty stosowanej w doświadczeniu to 50 i 100 mikrolitrów. Opracowane wyniki opierały się na 3 powtórzeniach i przy użyciu próby kontrolnej, którą była nystatyna. W badaniach wykazano, że działanie przeciwgrzybowe zależne było od dawki pasty. Spośród przebadanych szczepów dawka 100 mikrolitrów działała najsilniej, zaś najbardziej podatny na działanie tego preparatu był gatunek C. albicans. Mniej podatne na obecność pasty z dżdżownic okazał się gatunek Trichophyton rubrum [2]. Przygotowanie pasty rozpoczyna się od mycia dżdżownic po bieżącą wodą. Następnie karmi się je wilgotną bibułą przez 18-20 godzin, w celu oczyszczenia jelit. Po upływie tego czasu ponownie myje się organizmy, tym razem w destylowanej wodzie. Dżdżownice układa się w plastikowych rynienkach i wystawia na działanie promieni słonecznych przez 3 dni, w tym czasie powinny całkowicie wyschnąć. W czasie tego procesu śluz i płyn celomatyczny trawi martwe organizmy, co nadaje produktowi brązowy kolor. Z wysuszonych dżdżownic przygotowuje się pastę, którą przesączano, a następnie skraplano w łaźni wodnej w temperaturze 35°C. Tak powstała surowa pasta, którą rozcieńczano w 10% DMSO, w celu oceny aktywności przeciwgrzybowej [2]. 4. Porównanie aktywności przeciwgrzybowej pudru przygotowanego z dżdżownicy Lampito mauritii, Eudrilus eugeniae oraz Eisenia fetida Kolejne badania potwierdzające aktywność przeciwgrzybową u dżdżownic, to badania wykorzystujące puder z tych organizmów. Gatunkiem, wykorzystywanym do otrzymywania pudru jest Lampito mauritii. Wysuszony proszek z tych dżdżownic jest dodawany do roztworów różnych rozpuszczalników. Badania z użyciem pudru podobnie jak te wykorzystujące ekstrakty oraz pasty wykazują najsilniejszą aktywność przeciwgrzybową w stosunku do Candida albicans. W doświadczeniu próbą kontrolną o maksymalnej aktywności przeciwgrzybowej była erytromycyna [3]. Początkowe procesy przygotowania pudru z dżdżownicy Lampito mauritii nieco różniły się od procesu tworzenia pasty. Organizmy myje się pod bieżącą wodą, by usunąć zanieczyszczenie z powierzchni ciała. Następnie przez 6-8 godzin moczy się je w wodzie destylowanej, co ma na celu usunięcie gleby z jelit. Dżdżownice przemywa się wodą destylowaną i układa na płytce Petriego. Umieszcza się ją w inkubatorze 135 Paulina Syryjczyk, Paulina Miziak, Julita Kołodziejczyk, Marta Fiołka, Krzysztof Grzywnowicz nastawionym na 55°C na 24 godziny. Po tym czasie zbiera się suche dżdżownice i uciera na jednolity puder. Testy wykonywane na Candida i Aspergillus przez Bhorgin i Uma [3] wykazały zahamowanie wzrostu o średnicy 12 mm dla Candida albicans oraz 9 mm dla Aspergillus niger. Okazuje się, iż ekstrakt etanolowy z dżdżownicy w proszku jest skuteczny, zaś ekstrakt z eterem naftowym dżdżownicy w proszku nie wykazuje właściwości przeciwgrzybowych w stosunku do badanych gatunków grzybów [3]. Puder antygrzybowy otrzymano również z dżdżownic należących do gatunku Eudrilus eugeniae. Badania przeprowadzane przez Anitha i Jayraaj [4] skupiały się zarówno na aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybowej, jak również na występowaniu flawonoidów i fenoli w masie pudru. Preparaty bogate we flawonoidy będące składnikami aktywnymi fizjologicznie były stosowane w zwalczaniu wielu chorób. Podczas badań wyizolowano flawonoidy o określonych strukturach posiadające właściwości przeciwbakteryjne i cytotoksyczne. Badania te skupiały się na sporządzaniu proszku i jego wykorzystaniu do wytwarzania nowych preparatów leczniczych. W celu przygotowania próbki dżdżownice przemywano wodą, aby usunąć zanieczyszczenia. Dalej umieszczano na 1-2 godziny w 0,5% NaCl w temperaturze pokojowej, tak aby oczyścił się system trawienny bezkręgowca. Następnie zwierzęta dzielono nożyczkami, odważano po 3 gramy tkanki dżdżownicy, homogenizowano w 40 ml mieszaniny chloroform-metanol (w stosunku 1:2) i uzyskany roztwór na noc umieszczano w temperaturze 4°C. Po tym czasie dodawano wodę destylowaną do homogenizacji, całość mieszano i wirowano. Po odparowaniu w wyparce rotacyjnej otrzymany płyn o pH 7 został zliofilizowany na proszek. W powyższych badaniach wykorzystano wiele szczepów bakterii oraz pięć szczepów grzybów. Testowanymi gatunkami były: Aspergillus alternate, Aspergillus niger, Candida albicans, Curvularia lunata oraz Fusarium solani [4]. Interesującym etapem badań nad aktywnością przeciwbakteryjną i przeciwgrzybową pudru z Eudrilus eugeniae było oszacowanie zawartości flawonoidów i fenoli. Zawartość flawonoidów określano mierząc absorbancję wcześniej odpowiednio przygotowanego roztworu przy długości fali 506 nm. W celu określenia zawartości całkowitej fenolu zmieszano bufor z próbką badaną (1mg/ml). Po 5 minutach dodawano 7% roztwór węglanu sodu, a następnie wodę destylowaną. Taką mieszaninę przechowywano w ciemności przez okres 90 minut w temperaturze 23°C i następnie odczytywano absorbancję przy długości fali 750nm [4]. 136 Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic Aktywność pudru z Eudrilus eugeniae była sprawdzana na w stosunku do 15 gatunków bakterii: Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella parathypi, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus faecalis, Staphylococcus pyogenes. Najbardziej podatny na puder okazał się szczep Staphylococcus ureus. Wrażliwością charakteryzowały się również gatunki Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Proteus vulgaris, Streptococcus pyogens czy Klebsiella pneumoniae. Niewrażliwe na działanie pudru z dżdżownicy były gatunki: Enterococcus faecalis, Salmonella parathypi, Serratia marcescens, Streptococcus faecalis [4]. Jednocześnie puder otrzymywany z Eudrilus eugeniae wykazywał działanie przeciwgrzybowe w stosunku do wszystkich testowanych gatunków grzybów patogennych. Najsilniejsze działanie zaobserwowano w stosunku do Candida albicans oraz Aspergillus flavus. Badania nad obecnością flawonoidów i fenoli pozwoliły zauważyć, iż w pudrze występują związki lityczne. Doprowadziło to powstania hipotezy o wykorzystaniu tego środka jako antybiotyku. Doświadczenia prowadzone przez Anitha i Jayraaj [4] potwierdziły wcześniejsze wyniki mówiące o aktywności przeciwbakteryjnej płynu jamy ciała dżdżownic Eudrilus eugeniae, który najsilniej oddziałuje na Staphylococcus aureus i Klebsiella pneumoniae [4]. Fenole i flawonoidy należą do metabolitów wtórnych, wykazują działanie antyoksydacyjne. Są istotne w procesach żywieniowych, mają duże znaczenie dla zdrowia człowieka. Związki te są przede wszystkim pochodzenia roślinnego, w mniejszym stopniu analizuje się fenole i flawonoidy otrzymywane ze zwierząt. Wobec powyższych danych obecność flawonoidów i fenoli w pudrze może zostać wykorzystana w procesie tworzenia antybiotyków o szerszym spektrum działania, zarówno na choroby wywoływane przez bakterie jak i różnego rodzaju grzybice. Produkowane leki charakteryzowałyby się mniejszą toksycznością i obniżonym do minimum ryzykiem pojawienia się oporności patogenów na środek pochodzący z dżdżownicy [4]. Testy wykonywane przy użyciu pudru dżdżownic Eisenia fetida wykazały warunki, w których najbardziej zauważalna była aktywność przeciwgrzybowa wobec Candida albicans, przy czym bardziej efektywny okazał się roztwór wodny, niż acetonowy [5]. Porównując pastę i puder pochodzące z dżdżownic można zauważyć podobieństwo polegające najednakowej wrażliwości grzyba Candida na oba środki przeciwgrzybowe. 137 Paulina Syryjczyk, Paulina Miziak, Julita Kołodziejczyk, Marta Fiołka, Krzysztof Grzywnowicz 5. Bakterie jako źródło aktywności antygrzybowej dżdżownic Kolejnym czynnikiem o aktywności antygrzybowej są bakterie izolowane z jelita dżdżownic. Badania prowadzone przez Prasanna i in [6] umożliwiły wyizolowanie i rozpoznanie bakterii żyjących w jelitach tych bezkręgowców. Na podstawie badań biochemicznych i porównania sekwencji 16S rDNA zidentyfikowano bakterie z gatunku Pseudomonas stutzeri szczep EGB3. W celu molekularnego scharakteryzowana szczepu EGB3 przeprowadzono szereg etapów, w tym: ekstrakcje genomowego DNA EGB3, elektroforezę na żelu agarozowym, sekwencjonowanie DNA, amplifikację DNA 16S rybosomu, oczyszczanie produktu PCR, sekwencjonowanie 16S rDNA, analizę filogenetyczną. Fitopatogenne grzyby zawarte w glebie, takie jak Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme, Fusarium udum, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum capsicii, Aspergillus flavus i Aspergillus niger były wrażliwe na działanie przeciwgrzybowych metabolitów wytwarzanych przez EGB3. Badania wykonywane przez Prasanna i in [6] wykazały działanie antygrzybowe skierowane przeciwko chorobotwórczym gatunkom grzybów atakujących rośliny. W celu otrzymania homogenatu stosowano warunki aseptyczne. Dżdżownice po przemyciu głodzono przez okres 24 godzin, tak aby wyeliminować mikroorganizmy związane z glebą i inne organiczne szczątki w jelitach. Po tym czasie przemywano dżdżownice jałową wodą podwójnie destylowaną, dalej izolowano jelito. Zawartość zbierano i po zważeniu mieszano z buforem do homogenizacji przez 5 minut przy użyciu mieszadła magnetycznego. Kolejnym etapem było wirowanie przy 10000 obrotach na minutę przez okres 15 minut. Zebrany supernatant posłużył do dalszych analiz [6]. Istotne również okazało się potwierdzenie przeciwgrzybowych właściwości bakterii pochodzących z jelita dżdżownic. Spośród badanych szczepów największą wrażliwością wykazały się gatunki grzybów: Fusarium oxsysporum, Fusarium udum, Fusarium solani i Fusarium moniliforme. Kluczowe okazało się scharakteryzowanie związku przeciwgrzybowego. Wstępne badania przesiewowe zostały przeprowadzone na pożywce PDA bez dodatku chlorku żelaza III. Warunki te umożliwiłyby hamowanie wzrostu grzybów poprzez obecność wytworzonych sideroforów lub metabolitów. Właściwość antygrzybową tych substancji potwierdzano poprzez trzykrotne powtórzenie ekspertmentu z udziałem EGB3 na płytkach agarowych z dekstrozą ziemniaczaną i dodatkiem 1% chlorku żelaza metodą dyfuzyjną. Brak hamowania na płytkach PDA z dodatkiem 1% chlorku żelaza oznaczał, iż działały siderofory. Aktywność przeciwgrzybową badano pod kątem termosta- 138 Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic bilności oraz działano na środek przeciwgrzybowy enzymem, sprawdzano również jak czas wpływa na jego właściwości [6]. Badania wykonywane na tkankach pochodzących z dżdżownic również wykazały aktywność przeciwgrzybową. Doświadczeń z udziałem tkanek podjął się Chauhan i in [7], a gatunkiem dżdżownicy stosowanym w badaniach był Eudrilus eugeniae. Jako próbę kontrolną o maksymalnej aktywności stosowano antybiotyk- fluconazol o stężeniu 5mg/ml. Płytki inkubowano w temperaturze 20°C przez okres 72 godzin [7]. Z jelita dżdżownic Dendrobaena veneta [Zdjęcie 1] bakterię Raoultella ornithinolytica związaną ze ścianą jelita środkowego, której metabolity charakteryzowały się aktywnością skierowaną na C. albicans. Wyizolowana bakteria jest najprawdopodobniej symbiontem tego gatunku dżdżownicy, gdyż stwierdzono jej obecność u 40 osobników, po zabiegu oczyszczania jelita poprzez karmienie przez 3 doby jałową bibułą filtracyjną. Metabolity bakterii wysalono siarczanem amonu przy wysyceniu do 90%, a następnie rozdzielano przy zastosowaniu ultrafiltracji z punktem odcięcia 100 kDa. Wysokocząsteczkowe metabolity (o masie powyżej 100 kDa) płynu pohodowlanego bakterii R. ornithinolytica rozdzielano przy zastosowaniu chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE-Sepharose, a następnie poddawano filtracji żelowej [8, 9]. Zdjęcie 1. Dżdżownice Dendrobaena veneta, fot. M. Fiołka Otrzymany kompleks glikoproteinowy, wykazywał działanie na komórki C. albicans. Po inkubacji z aktywnym związkiem, przy zastosowaniu mikroskopii świetlnej oraz elektronowej, obserwowano obniżenie aktywności metabolicznej oraz zmiany morfologiczne komórek grzyba. Obserwacje mikroskopowe pozwoliły stwierdzić deformacje komórek, tworzenie się aglomeratów wielokomórkowych oraz łańcuszków zbudowanych z kilku połączonych ze sobą komórek. Specyficzne barwienie komórek poddanych 139 Paulina Syryjczyk, Paulina Miziak, Julita Kołodziejczyk, Marta Fiołka, Krzysztof Grzywnowicz działaniu otrzymanego kompleksu potwierdziło występowanie amyloidu jako charakterystycznej substancji międzykomórkowej [10]. Działanie na C. albicans wykazywał również płyn celomatyczny D. veneta. Badania wstępne pozwoliły zaobserwować zmianę morfologii komórek grzyba, różnice w grubości ściany komórkowej i tendencję do tworzenia skupisk komórek pod wpływem działania płynu celomatycznego [Zdjęcie 2]. Analiza przy zastosowaniu skaningowej mikroskopii elektronowej wykazała również rozpad komórek grzyba jako efekt inkubacji z płynem jamy ciała dżdżownicy [Zdjęcie 3]. A B C D Zdjęcie 2. A,B- komórki hodowli kontrolej C. albicans, C,D- komórki C. albicans po 48h inkubacji z płynem celomatycznym dżdżownic D. veneta; znacznik odpowiada 5µm. Obraz mikroskopowy po zabarwieniu komórek fluorochromem Calcofluor- White. 140 Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic B A Zdjęcie 3.A- komórki hodowli kontrolej C. albicans, komórek kontrola hodowli C. albicans, B- komórki C. albicans po 48h inkubacji z płynem celomatycznym dżdżownic D. veneta; znacznik odpowiada 5µm. Obraz uzyskany po analizie skaningowym mikroskopem elektronowym. 6. Podsumowanie Środki otrzymywane z dżdżownic mogą okazać się szansą w leczeniu kandydoz oraz chorób bakteryjnych. W ostatnich latach mikroorganizmy nabrały oporności na działanie powszechnie stosowanych antybiotyków. Dlatego tak ważne staje się stosowanie nowoczesnych metod zwalczania patogenów. Rozwój badań z wykorzystaniem dżdżownic pozwolił na pozyskiwanie substancji pod różnymi postaciami – pudrów, past i ekstraktów co zwiększyło możliwości nad badaniem najbardziej skutecznych postaci środków przeciwgrzybowych. Uwagę zwrócono również na bakterie występujące w jelicie dżdżownic, które również wykazywały właściwości przeciwgrzybowe. Sukcesem okazuje się silne oddziaływanie ww. środków na Candida albicans jak również jej podatność na obecność substancji otrzymywanych z dżdżownic. Najpowszechniej analizowany pod tym kątem jest gatunek Eudrilus eugeniae. Pomimo rozwoju medycyny kandydozy są dalej chorobami ciężkimi do zwalczania i wymagającymi niejednokrotnie stosowania leków wywołujących wiele niekorzystnych skutków ubocznych. Większość kandydoz jest wywoływanych właśnie przez Candida albicans, dlatego tak istotne są dalsze badania i doświadczenia prowadzące do otrzymania skutecznego i bezpiecznego leku skierowanego przeciwko temu gatunkowi grzyba. 141 Paulina Syryjczyk, Paulina Miziak, Julita Kołodziejczyk, Marta Fiołka, Krzysztof Grzywnowicz Literatura 1. Mathur A., Verma S. K., Bhat R., Singh S. K., Prakash A., Prasad G.B.K.S, Dua V.K., Antimicrobial activity of earthworm extracts, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2 (2010), pp. 364-370 2. Vasanthi K., Chairman K., Ranjit Singh A. J. A., Antimicrobial activity of earthworm (Eudrilus eugeniae) paste, African Journal of Environmental Science and Technology, 7 (2013), pp. 789-793 3. Bhorgin A. J., Uma K., Antimicrobial activity of earthworm powder (Lampito mauritii), International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 3 (2014), pp. 437-443 4. Anitha J., Jayraaj I. A., In-vitro antibacterial activity and evaluation of flavonoid and phenol in earthworm powder(Eudrilus eugeniae), World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2 (2013), pp. 4917-4928 5. Ansari A. A., Sitaram K., An Investigation into the anti-microbial and antifungal properties of earthworm powder obtained from Eisenia fetida, American Journal of Food Technology, 6 (2011), pp. 329-335 6. Prasanna N. D., Vijayalakshmi K., Seshagirirao K., Shaheen S. K., Characterization of antifungal compounds produced by Pseudomonas stutzeri (EGB3) isolated from gut of earthworm (Eisenia foetida), Journal of Microbiology and Antimicrobials, 6 (2011), pp. 57-65 7. Chauhan P. S., Tomar J., Prasad G. B. K. S., O. P. Agrawal, Evaluation of antimicrobial activity if earthworm tissue extract of Eudrilus eugeniae, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 6 (2014), pp. 28-38 8. Fiołka M. J., Grzywnowicz K., Chlebiej K., Szczuka E., Mendyk E., Keller R., Rzymowska J., Anti-Candida albicans action of the glyco-protein complex purified from metabolites of gut bacterium Raoultella ornithinolytica isolated from earthworms Dendrobaena veneta, Journal of Applied Microbiology, 113 (2012), pp. 1106-1119 9. Fiołka M., Grzywnowicz K., Chlebiej K., Nowak A., Keller R., Rzymowska J., Mendyk E., Aktywność anty-Candida albicans kompleksu glikoproteinowego otrzymanego z metabolitów bakterii Raoultella ornithinolytica wyizolowanej ze ściany jelita dżdżownic Dendrobaena veneta, Sepsis, 5 (2012), pp. 223-228 10. Fiołka M. J., Lewtak K., Rzymowska J., Grzywnowicz K., Hułas-Stasiak M., Sofińska-Chmiel W., Skrzypiec K., Antifungal and anticancer effects of a polysaccharide-protein complex from the gut bacterium Raoultella ornithinolytica isolated from the earthworm Dendrobaena veneta, Pathogens and Disease, 69 (2013), pp. 49-61 Different sources of antifungal activity in earthworms Earthworms play an important role in the proper functioning of the ecosystem. They are helping in recycling dead plant material through processing it, increasing soil fertility. Earthworms are rich source of antibacterial, antifungal and antitumor activity. The antifungal activity of earthworms is described mainly in relation to extracts of whole 142 Różne źródła aktywności przeciwgrzybowej u dżdżownic animals. The other source of this activity could be bacteria associated with the intestine of these invertebrates. The aim of the study was to analyze obtaining of antifungal compounds from the body of earthworms. The analysis was conducted on the basis of the most recent publications describing the acquisition of antifungal compounds from earthworms. The extracts for isolation of antifungal compounds were prepared from aqueous and alcoholic solutions. The metabolites from intestinal bacteria were separated by ion exchange chromatography. Antifungal activity was determined by microbiological methods relative to different strains. The extracts of earthworms had antifungal activity against strains like Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger, A. flavus, Penicillium notatum, Trichophyton rubrum. The metabolites of Pseudomonas strutzeri from intensine Eisenia foetida were additionally active against Fusarium oxysporum, F. solani, F. moniliformae, F. udum, Macrophomena phaseolina, Rhizoctonia solani, Colletotrichum capsicii. The metabolites ofRaoultella ornithinolytica from intenstine of Dendrobaena veneta showed activity against C. albicans. Antagonistic micro-organisms through its interactions with various pathogens play an important role in holding microbiological balance. They are significant factor in the elimination of pathogenic microorganisms. On the basis of the analyzed study it can be concluded the activity of the metabolites of bacteria associated with the gut earthworms is promising source of antifungal compounds to fight against both plant and human diseases. 143 Michał Chojnacki1, Maciej Frant1,2, Mateusz Pięt1,2, Adrian Zając1 Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących na terenie polskich lasów Właściwości dziko rosnących grzybów jadalnych były od wieków doceniane i wykorzystywane w medycynie naturalnej. Już wtedy było wiadomo, że ich spożywanie w różnych postaciach (jako dodatki do potraw, napary z suszonych owocników, itp.) ma pozytywny wpływ na zdrowie człowieka. Do niedawna twierdzono, iż grzyby pozbawione są wszelkich wartości odżywczych. Jednak najnowsze badania z ostatnich kilkunastu lat dowodzą, że grzyby wielkoowocnikowe (Macromycetes) posiadają szereg biologicznych aktywności, takich jak: przeciwnowotworowe, przeciwwirusowe, przeciwzapalne, przeciwgrzybiczne czy obniżające poziom cholesterolu. Ponadto, zaobserwowano, że produkują także takie substancje odżywcze, jak: łatwo przyswajalne białka, wszystkie aminokwasy z grupy egzogennych, witaminy, mikro- i makroelementy. Z tego powodu, coraz częściej prowadzi się badania nad popularnie zbieranymi i spożywanymi grzybami z lasów europejskich (w tym z Polski). Mają one na celu obalenie popularnego mitu dotyczącego grzybów jako wyłącznie dodatku poprawiającego smak i aromat potraw. Celem poniższej pracy jest przedstawienie wybranych gatunków grzybów powszechnie rosnących w polskich lasach: Boletus edulis, Boletus badius, Cantharellus cibarius, Lactarius deliciosus jako dobre źródło substancji mających wartości odżywcze i wykazujących właściwości prozdrowotne. 1. Wstęp Grzyby należą do królestwa organizmów powszechnie występujących na całym świecie, we wszystkich strefach klimatycznych. Takson ten jest niejednorodny, w jego skład wchodzą różne organizmy, od jednokomórkowych, poprzez formy komórczakowe, do wielokomórkowych. Grzyby są cudzożywne, niezdolne do aktywnego ruchu, a ich ściana komórkowa zbudowana jest głównie z chityny [5]. Z uwagi na walory smakowe, zapachowe oraz odżywcze, obiektem szczególnych zainteresowań jest grupa jadalnych podstawczaków. Walory odżywcze przez wieki były niedoceniane, jednak szczegółowe badania z ostatniej dekady wykazały, że grzyby są bogatym źródłem, m.in. łatwo przyswajalnych aminokwasów, witamin (głównie z grupy B) oraz makro- i mikro1 Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów „MIKRON”, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, [email protected], [email protected] 2 Zakład Wirusologii i Immunologii, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie, [email protected], [email protected] 144 Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących na terenie polskich lasów elementów. W ostatnich latach stwierdzono również występowanie w ich owocnikach szeregu substancji o silnych właściwościach bioaktywnych. Substancje te wykazują również prozdrowotny wpływ na organizm człowieka. Polska należy do krajów, w których od wieków owocniki grzybów dziko rosnących były powszechnie spożywane pod różnymi postaciami. Do najpopularniejszych i wysoko cenionych ze względu na swoje rozliczne walory zaliczane są m.in. grzyby z rodzaju Boletus, takie jak borowik szlachetny czy podgrzybek brunatny oraz blaszkowe grzyby z pieprznikiem jadalnym i mleczajem rydzem na czele [1, 2, 3]. 2. Borowik szlachetny (Boletus edulis) Borowik szlachetny (Boletus edulis), często nazywany w Polsce prawdziwkiem, jest jadalnym grzybem należącym do rodziny borowikowatych (Boletaceae), występującym powszechnie zarówno w lasach liściastych, iglastych, jak i mieszanych. Pomimo faktu, że wchodzi on w mikoryzę z wieloma gatunkami drzew, najczęściej jego grzybnia łączy się ze świerkami. Borowik szlachetny wytwarza owocniki w okresie od lipca do listopada i harakteryzuje się znakomitymi walorami smakowymi, do czego przyczynia się aromatyczny i zwarty miąższ [2]. Wygląd prawdziwka przedstawiono na rysunku 1. Fot.1. Borowik szlachetny (Boletus edulis) w naturalnym środowisku [źródło własne fot. M. Frant] 145 Michał Chojnacki, Maciej Frant, Mateusz Pięt, Adrian Zając Sucha masa prawdziwka, podobnie jak u większości grzybów, składa się głównie z węglowodanów (65,4%), wśród których dominuje chityna. Borowik ten zawiera również duże ilości mannitolu oraz trehalozy [2, 4]. Boletus edulis wyróżnia się na tle innych grzybów dużą zawartością białka, która może dochodzić nawet do 33,1% suchej masy [2, 5]. Borowik szlachetny, podobnie jak inne grzyby, zawiera niewielkie ilości tłuszczy, z których zdecydowaną większość stanowią kwasy tłuszczowe nienasycone (kwas linolenowy – 42%, kwas oleinowy – 36,1%, kwas palmitynowy – 9,8%) [2]. Grzyb ten jest również cennym źródłem witamin, takich jak: B1, B2, B3, B6, E, C [2, 4]. Dla prawidłowego funkcjonowania ludzkiego organizmu niezwykle istotne są makro- i mikroelementy, które można odnaleźć w owocnikach borowika szlachetnego. Są to m.in. jony wapnia, magnezu, cynku, żelaza, miedzi oraz niewielkie ilości manganu [2]. Boletus edulis oprócz wyżej wymienionych substancji charakteryzuje się zawartością szeregu bioaktywnych substancji o właściwościach prozdrowotnych, w tym przeciwnowotworowych. Były one już znane w połowie XX wieku, jednak badania nad aktywnością poszczególnych związków i grup związków z niego izolowanych są domeną ostatnich lat [3]. Pierwszą taką grupą substancji są polisacharydy, o właściwościach immunostymulujących, przeciwnowotworowych, hipoglikemicznych oraz antyoksydacyjnych. W grupie tych związków szczególną rolę odgrywają β-glukany występujące u borowika szlachetnego. Największą aktywność przeciwnowotworową wykazują wielkocząsteczkowe β-glukany z przewagą wiązań β-(13) [3, 4, 5]. Ergosterol powszechnie występujący u grzybów, w znacznych ilościach obecny jest również w owocnikach prawdziwka. Oprócz podstawowej formy tego sterolu u Boletus edulis występuje on również w formie pochodnej, czyli nadtlenku ergosterolu. Jest to steroid o szerokim spektrum aktywności biologicznej, m.in. przeciwbakteryjnej, przeciwzapalnej oraz cytotoksycznej, ocenianych w testach in vitro w stosunku do różnych linii nowotworowych [6]. Nadtlenek ergosterolu, obecny w borowiku, wykazuje aktywność przeciwnowotworową w stosunku do takich linii nowotworowych, jak: W256 (Walker carcinosarcoma), MDA-MB-231 (ludzki gruczolakorak sutka), SNU-1 (ludzki nowotwór żołądka), SNU-354 (ludzki wątrobiak), czy SNU-C4 (ludzki nowotwór okrężnicy). Cytotoksyczność nadtlenku ergosterolu może być związana z jego konwersją w ergosterol, której towarzyszy wytworzenie toksycznych aktywnych form tlenu. Inne badania na linii komórkowej HL60 (ostra białaczka promielocytowa) wykazały zdolność nadtlenku ergosterolu do indukcji apoptozy [6]. Związki fenolowe zawarte w grzybach odpowiadają za ich właściwości antyoksydacyjne. Z tej klasy związków, Boletus edulis zawiera m.in. kwasy: galusowy, gentyzynowy, p-hydroksybenzoesowy oraz α-tokoferol (o działaniu 146 Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących na terenie polskich lasów podobnym do związków fenolowych) [2]. Badania zespołu Shu-Yao (2007) nad ekstraktami z owocników tego borowika wykazały, że ekstrakt etanolowy był bogatszy w związki antyoksydacyjne (fenolowe), w związku z tym działał silniej antyutleniająco niż ekstrakt wodny [7]. Kolejną, ciekawą grupą substancji występujących w borowiku szlachetnym są lektyny. Jest to grupa glikoprotein wykazująca zdolność do wiązania węglowodanów. Do tej klasy należą również lektyny charakteryzujące się silnym działaniem mitogennym (aktywacja limfocytów i transformacja blastyczna, wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej), znajdujące się m.in. w owocnikach Boletus edulis. Badania zespołu Zheng (2007) wykazały, że oprócz wspomnianej aktywności, lektyny z borowika szlachetnego wykazują również właściwości hamujące aktywność odwrotnej transkryptazy HIV-1 [8]. Borowik szlachetny jest również bogatym źródłem flawonoidów, związków chemicznych o szerokim spektrum aktywności (m.in. zapobiegających miażdżycy, wykazujących działanie przeciwzapalne i przeciwalergiczne) [2]. 3. Podgrzybek brunatny (Boletus badius) Podgrzybek brunatny (Boletus badius) to gatunek grzyba z rodziny borowikowatych powszechnie występujący w polskich lasach zarówno liściastych, jak i iglastych. Występuje on najczęściej na glebach piaszczystych. Jego wzrost obserwuje się zwykle na przełomie lata i jesieni, od czerwca do listopada. Wygląd grzyba przedstawiono na rysunku 2. 147 Michał Chojnacki, Maciej Frant, Mateusz Pięt, Adrian Zając Fot. 2. Podgrzybek brunatny (Boletus badius) w naturalnym środowisku [źródło własne, fot. M Frant] Wielkość kapelusza tego grzyba może osiągać od 5 do nawet 30 i więcej centymetrów i jest zależna od wieku owocnika. Barwa jest najczęściej ciemnobrązowa lub kasztanowobrązowa, spotyka się jednak również owocniki o ciemnej, wręcz czarnej barwie. Sam kapelusz jest gruby, poduchowaty, a jego powierzchnia jest matowa i aksamitna. Podczas uszkodzenia owocnik podgrzybka zmienia swoją barwę na ciemnoniebieską (stąd potoczna nazwa w niektórych regionach: „Siniaki”). Miąższ grzyba zazwyczaj jest biały lub żółtawy, o delikatnym, owocowym zapachu i łagodnym smaku [9]. Pozyskiwane owocniki z gatunku Boletus badius można śmiało zaliczyć do artykułów pełnowartościowych, ponieważ zawierają one wszystkie podstawowe składniki odżywcze. Na suchą masę owocników tego grzyba składają się: duże ilości węglowodanów (w tym polisacharydy o właściwościach prozdrowotnych), łatwo przyswajalne białka, kwasy tłuszczowe, składniki mineralne oraz witaminy [2]. Ogólna zawartość cukrów podgrzybka brunatnego wynosi od 3,8 do 4,0 g/100 g owocnika [10]. Charakteryzuje się on bardzo dużą zawartością chityny oraz chitosanów w ścianie komórkowej. Jednak nie są one jedynymi cukrami wytwarzanymi przez te grzyby. Produkują one również glukozę, trehalozę, mannitol, a także glikogen i błonnik pokarmowy [11, 12]. Chitosany znajdujące się w owocnikach podgrzybka 148 Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących na terenie polskich lasów wykazują działanie przeciwbakteryjne oparte na hamowaniu rozwoju bakterii poprzez zmniejszenie ich adhezji do podłoża. Ponadto, wykazują one właściwości przeciwwirusowe i przeciwgrzybiczne. Chitosany są również stosowane podczas leczenia otwartych ran w celu łagodzenia bólu, przyspieszenia gojenia oraz zniwelowaniu powstawania blizn [12]. Grzyby te są również źródłem wielu polisacharydów, które posiadają silne aktywności biologiczne. Przykładem takich polisacharydów są (1→3)/(1→6)-β-glukany charakteryzujące się właściwościami przeciwnowotworowymi [1]. Powodują one przede wszystkim bardzo silne wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej człowieka oraz stymulują komórki immunokompetentne do wytwarzania cytokin. Niektóre β-glukany zawarte w owocnikach podgrzybka wykazują właściwości cytotoksyczne względem komórek nowotworowych, co potwierdzono badaniami in vitro oraz in vivo, a także nie posiadają właściwości alergicznych [12]. Białka stanowią aż 33,2% suchej masy Boletus badius i jest to jedna z najwyższych wartości notowanych wśród grzybów dziko rosnących w Polsce[2]. Grzyby z tego gatunku wytwarzają praktycznie wszystkie aminokwasy egzogenne, jakie potrzebne są człowiekowi do prawidłowego funkcjonowania, m.in.: walinę, leucynę, metioninę, fenyloalaninę czy tryptofan. Aktywność biologiczna białek jest zależna właśnie od ilości wymienionych aminokwasów. Wśród łatwo przyswajalnych białek i aminokwasów, podgrzybek wytwarza również lektyny. Są to glikoproteiny o właściwościach przeciwnowotworowych. Indukują one apoptozę komórek nowotworowych poprzez hamowanie syntezy białek, wynikające z dezaktywacji rybosomów [12]. Podgrzybek brunatny jest doskonałym źródłem składników mineralnych. Posiada on wiele istotnych biologicznie mikro- i makroelementów, tj.: żelazo, mangan, selen, potas, magnez, wapń. Jednym ze znaczących mikroelementów jest selen, który produkowany jest przez ten gatunek grzyba w ilościach od 0.31 do 19,86 mg/kg suchej masy [13]. Jest on składnikiem centrum aktywnego enzymu peroksydazy glutationowej, która jest jednym z silnych przeciwutleniaczy, występujących w organizmie człowieka. Chroni m.in. czerwone krwinki i błonę komórkową przed szkodliwym działaniem wolnych rodników. Selen zmniejsza również ryzyko wystąpienia większości rodzajów nowotworów, w tym raka płuca:, wątroby, prostaty oraz jelita grubego. Pierwiastek ten bierze także udział w regulacji prawidłowego funkcjonowania tarczycy oraz układu immunologicznego. Jest on również istotnym mikroelementem stosowanym do łagodzenia skutków radio- i chemioterapii. Ponadto, zapobiega przerzutom oraz chroni przed promieniowaniem UV [13]. Boletus badius jest także źródłem licznych związków fenolowych. Wykazano, że w jego owocnikach znajduje się aż sześć różnych kwasów 149 Michał Chojnacki, Maciej Frant, Mateusz Pięt, Adrian Zając fenolowych, tj.: kwas protokatechowy, kwas p-hydroksybenzoesowy, p-kumarowy, synapinowy, cynamonowy oraz ferulowy w łącznej ilości 48,25 mg/kg suchej masy [14]. Związki te posiadają silne właściwości przeciwutleniające oraz chronią ważne struktury organizmu (błony komórkowe, enzymy, kwasy nukleinowe) przed uszkodzeniem oksydacyjnym. Ponadto, fenole pochodzące z ekstraktów z owocników grzyba mają również właściwości przeciwzapalne oraz przeciwnowotworowe [15]. 4. Pieprznik jadalny (Cantharellus cibarius) Pieprznik jadalny (Cantharellus cibarius), potocznie nazywany kurką, jest przedstawicielem rodziny pieprznikowatych (Cantharellaceae), powszechnie występującym w polskich lasach. Kurka jest gatunkiem grzyba mikoryzowego znajdowanym w lasach na całej półkuli północnej, a także w Australii. Najczęściej spotykany jest na piaszczystych, kwaśnych glebach porośniętych mchami [16]. Owocnik pieprznika jadalnego składa się z kapelusza, którego średnica waha się od 2 do 10 cm. Początkowo jest on owalny, natomiast u dojrzałych owocników przyjmuje lejkowaty kształt. Po spodniej stronie kapelusza można zaobserwować dobrze rozwinięty hymenofor w postaci podłużnych blaszek. Trzon kurki ma wysokość do 6 cm i podobnie jak cały owocnik przyjmuje barwę żółtą lub żółtawo-pomarańczową [16]. Znaczącym składnikiem suchej masy grzyba są węglowodany, stanowiące około 13% mokrej masy grzyba. Ważnymi cukrami występującymi w pieprzniku jadalnym są mannitol, glukoza, oraz glikogen. Chityna budująca ścianę komórkową grzyba stanowi 6,4% suchej masy [17]. Pieprznik jadalny jest bogatym źródłem rozpuszczalnych w tłuszczach witamin należących do grupy D, a także A i E [18]. Dodatkowo, owocniki tego grzyba cechują się wysoką zawartością witamin z grupy B, porównywalną do ich zawartosci w drożdżach piekarniczych [2]. Zawartość białka w suchej masie owocników pieprznika jadalnego stanowi około 18,7%. Do najważniejszych aminokwasów stwierdzonych u C. cibarius należy leucyna, składowa wielu białek występujących w kurce. Dodatkowo pieprznik jadalny bogaty jest w takie aminokwasy jak: metionina, fenyloalanina, tryptofan oraz treonina [2]. Obecność tłuszczy w owocnikach pieprznika jadalnego jest niewielka. Jego owocniki zawierają różne rodzaje tłuszczów, a największą ich grupę stanowią wielonienasycone kwasy tłuszczowe, których udział stanowi 54,08%. Dodatkowo, występują tu nasycone kwasy tłuszczowe w ilości 22,63% oraz mononienasycone kwasy tłuszczowe, stanowiące 23,29% wszystkich lipidów [19]. 150 Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących na terenie polskich lasów Kurka ceniona jest głównie za smak i aromat, lecz posiada również wiele substancji biologicznie czynnych o charakterze prozdrowotnym. Spośród substancji aktywnych izolowanych z owocników pieprznika jadalnego szczególną uwagę warto zwrócić na polisacharydy, których głównym źródłem jest grzybowa ściana komórkowa. Aktywność przeciwnowotworowa polisacharydów grzybowych szczególnie związana jest ze związkami typu (1-3) i (1→6) β-glukany oraz (1→3) α-glukany [20]. Badania prowadzone nad aktywnością β-glukanów wykazały, że wiążą się one z receptorami w błonach komórek immunokompetentnych, przez co wpływają na indukcję odpowiedzi immunologicznej organizmu [21]. W badaniach przeprowadzonych w Lublinie, przy użyciu testu MTT, wykazano, że frakcje polisacharydowe otrzymane z owocnika pieprznika jadalnego wpłynęły znacząco na zahamowanie proliferacji komórek nowotworowych raka jelita grubego (linie komórkowe LS 180 oraz HT-29) [22]. W 2006 roku Ribeiro i współpracownicy stwierdzili w testach in vitro, iż obecność w owocnikach pieprznika jadalnego kwercetyny znacząco wpływa na właściwości przeciwutleniające ekstraktu grzybowego, a co za tym idzie, na jego właściwości przeciwnowotworowe [23]. Dodatkowo, portugalscy badacze stwierdzili w owocnikach pieprznika wysoką zawartość związków aktywnych, takich jak: fenole, flawonoidy, kwas askorbinowy, -karoten oraz likopen. Ponadto, badacze udowodnili silną aktywność antybakteryjną owocników kurki przeciwko Bacillus cereus, Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus [24]. Owocniki kurki posiadają także wiele związków fenolowych o działaniu prozdrowotnym. Największą ich ilość u C. cibarius stanowi kwas galusowy, którego zawartość wynosi 161,83 µg/100 g suchej masy oraz kwas gentyzynowy występujący w ilości 53,87 µg/100 g suchej masy [25]. Związki te posiadają udokumentowane właściwości przeciwnowotworowe [2]. 5. Mleczaj rydz (Lactarius deliciosus) Mleczaj rydz (Lactarius deliciosus), potocznie zwany rydzem, jest jadalnym grzybem podstawkowym należącym do rodziny gołąbkowatych (Russulaceae) [26]. Szeroko występuje w Europie, rzadziej w Ameryce Północnej, Australii i Azji. Rośnie w okresie jesiennym, najczęściej w lasach sosnowych i dębowych [27]. Rydz posiada kapelusz o średnicy kilkunastu centymetrów, z wklęsłym środkiem i ziarnistościami na powierzchni, koloru od pomarańczowego, poprzez pomarańczowo-różowy do czerwono-pomarańczowego, czasem sinozielony. Kapelusz zaopatrzony jest w liczne, zbiegające się blaszki o jasno-pomarańczowej barwie, które po uszkodzeniu przyjmują kolor 151 Michał Chojnacki, Maciej Frant, Mateusz Pięt, Adrian Zając zielony. Trzon jest dość krótki, długości kilku centymetrów, z charakterystycznymi wżerami. Grzyb ma przyjemny, owocowy zapach. Mleczko, znajdujące się w miąższu, ma przyjemny zapach i łagodny, lecz gorzki smak [27]. Mleczaj rydz charakteryzuje się niewielką zawartością białka (1,9%) zawiera jednak liczne aminokwasy egzogenne ale także węglowodany (6,9%) i tłuszcze (0,7%). Wysoka zawartość wody i tym samym niewielka zawartość suchej masy powoduje, iż grzyby te mają niską wartość energetyczną. Rydz jest bardzo dobrym źródłem potasu (310 mg/100 g części jadalnych grzyba) i fosforu (74 mg/100 g części jadalnych), w mniejszej ilości także pierwiastków takich jak: wapń, magnez, sód oraz śladowych ilości: żelaza, cynku, miedzi, molibdenu, fluoru, manganu, selenu, kobaltu czy tytanu. Jest również zasobny w witaminy: B1, B2 czy C [1]. Charakteryzuje go niewielka zawartość flawonoidów (około 1 mg/100 g świeżej masy grzyba) [28]. Termiczna obróbka nie prowadzi do zmniejszenia ilości flawonoidów, i polifenoli występujących w mleczaju, zmniejsza natomiast potencjał zmiatania wolnych rodników [29]. Grzyby te mają zdolność akumulacji metali ciężkich, o czym należy pamiętać szczególnie podczas zbiorów w pobliżu terenów przemysłowych [1]. Badania wykazały również, iż ekstrakty metanolowe zarówno z niedojrzałych jak i dojrzałych owocników hamowały rozwój bakterii Gram-dodatnich oraz Gram-ujemnych. Yasukawa i in. (1996) indukowali zapalenie ucha u myszy 12-O-tetradekanoilforbol-13-octanem (TPA). Okazało się, iż metanolowe ekstrakty grzybów jadalnych, w tym także mleczaja rydza, wykazywały pożądany efekt przeciwzapalny [31]. Większy potencjał przeciwbakteryjny wykazywały owocniki niedojrzałe ze względu na większą ilość węglowodanów [30]. Hou i wsp. (2013) badali natomiast właściwości immunostymulacyjne polisacharydu (nazwanego LDG-A) wyizolowanego z Lactarius deliciosus. Analizie poddano aktywność przeciwnowotworową in vivo, proliferację limfocytów i stymulację makrofagów, potencjał wydzielania IL-6 (interleukiny-6) i TNF-α (ang. tumor necrosis factor – czynnik nekrozy nowotworu) oraz tlenku azotu (NO). W celu badania właściwości przeciwnowotworowych wszczepiano myszom komórki linii S-180 (komórki mysiego mięsaka). Badanie te pozwoliły stwierdzić iż u osobników poddanych działaniu określonych stężeń substancji badanej (wyizolowanego polisacharydu) masy guzów nowotworowych były mniejsze o 44-57% w porównaniu do grupy kontrolnej. Badaniu poddano także proliferację limfocytów i makrofagów w komórkach śledziony myszy w hodowli in vitro. Polisacharyd istotnie zwiększał proliferację komórek, obserwowano także zwiększoną fagocytozę przez makrofagi otrzewnowe [32]. 152 Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących na terenie polskich lasów Polisacharyd LDG-A stymuluje także wydzielanie IL-6 i TNF-α, wpływając na stan zapalny [32]. Innym aspektem eksperymentu była analiza wpływu LDG-A na indukcję makrofagów otrzewnowych. Wykazano, iż przy stężeniu polisacharydu powyżej 50 mg/ml makrofagi wydzielały większą ilość NO niż w przypadku ich indukcji lipopolisacharydem (kontrola pozytywna) [32]. Jak wykazały przeprowadzone badania, mleczaj rydz jest zarówno zasobny w pożądane właściwości organoleptyczne, jak i w substancje prozdrowotne (takie jak β-glukany, polisacharydy czy błonnik). Ponadto, wykazuje niewielką kaloryczność i jest postrzegany pozytywnie w aspekcie dietetycznym. 6. Podsumowanie Mechanizmy aktywności prozdrowotnych substancji pochodzących z grzybów nie są jeszcze dokładnie poznane. Substancje izolowane z grzybów wymagają zwiększenia liczby prowadzonych na nich badań. Warto zaznaczyć jednak, że obecny stan wiedzy na temat korzystnego wpływu grzybów na ludzki organizm pozwala wyciągnąć wnioski o ich dużym znaczeniu w profilaktyce niektórych chorób, w tym także nowotworów. Grzyby jadalne mogłyby być w przyszłości stosowane do produkcji żywności funkcjonalnej, czyli takiej, która przyczyni się do poprawy stanu zdrowia człowieka. Należy pamiętać również o znaczącej roli grzybów w medycynie naturalnej, a także starać się wykorzystywać możliwości wytwarzanych przez nie związków w celu poprawy jakości życia. Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. Sas-Golak I., Sobieralski K., Siwulski M., Lisiecka J., Skład, wartość odżywcza oraz właściwości zdrowotne grzybów pozyskiwanych ze stanowisk naturalnych, Kosmos. Problemy nauk biologicznych, 60 (3-4) (2011), pp. 483-490 Sitarska K., Grzyby dziko rosnące - wartość odżywcza i właściwości prozdrowotne, Journal of NutriLife, 03 (2014), url: http://www.NutriLife.pl/index.php?art=142 [dostęp: 2014.11.18] Siwulski M., Sobieralski K., Sas-Golak I., Wartość odżywcza i prozdrowotna grzybów, Żywność Nauka Technologia Jakość, 1(92) (2014), pp.16-28 Rajewska J., Bałasińska B., Związki biologicznie aktywne zawarte w grzybach jadalnych i ich korzystny wpływ na zdrowie, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 58 (2004), pp. 352-357 Kalac P., Chemical composition and nutritional value of European species of wild growing mushrooms: A review, Food Chemistry, 113 (2009), pp. 9-16 Krzyczkowski W., Malinowska E., Suchocki P., Kleps J., Olejnik M., Herold F., Isolation and quantitative determination of ergosterol peroxide in various edible mushroom species, Food Chemistry, 113(1) (2009), pp. 351-355 153 Michał Chojnacki, Maciej Frant, Mateusz Pięt, Adrian Zając 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Shu-Yao T., Hui-Li T., Jeng-Leun Mau L.W.T., Antioxidant properties of Agaricus blazei, Agrocybe cylindracea, and Boletus edulis, Food Science and Technology, 40 (2007), pp. 1392-1402 Zheng S., Li C., Ng T.B., Wang H.X., A lectin with mitogenic activity from the edible wildmushroom Boletus edulis, Process Biochemistry, 42 (2007), pp. 1620-1624 Volk R., Volk F. Praktyczny poradnik grzybiarza, Wydawnictwo DELTA WZ (2009), pp. 45-132 Elmadfa I., Muskat E. Wielkie tabele kalorii i wartości odżywczych, Wydawnictwo Muza S.A, Warszawa (2004), pp. 220-247 Muszyńska B., Jadalne gatunki grzybów źródłem substancji dietetycznych i leczniczych, Wydawnictwo Zakład Opieki Zdrowotnej Ośrodek UMEA SHINODA –K KURACEJO, Kraków (2012), pp. 15-62 Rajewska J., Bałasińska B., Biologically active compounds of edible mushrooms and their beneficial impact on health, Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 58 (2005), pp. 352-357 Kopczyński K., Immunomodulating and anticancer properties of fungi, Acta Mycologica, 47(1) (2012), pp. 91-96 Muszyńska B., Sułkowska-Ziaja K., Ekiert H., Phenolic acids in selected edible basidomycota species: Armillaria mellea, Boletus badius, Boletus edulis, Cantharellus cibarius, Lactarius deliciosus and Pleurotus ostreatus, Acta Scientiarum Polonorum, 12(4) (2013), pp. 107-116 Grzyby i ich hodowle laboratoryjne źródłem substancji leczniczych, Projektor Jagielloński (2014) ulr: http://www.projektor.uj.edu.pl [dostęp: 2014.11.18] Gerhardt E. Przewodnik GRZYBY. MULTICO, Oficyna Wydawnicza, Warszawa, (2001), pp. 28 Muszyńska B., Sułkowska-Ziaja K., Ekiert H., Właściwości lecznicze i dietetyczne wybranych jadalnych grzybów wielkoowocnikowych, Farmacja Polska, 67 (8) (2011), pp. 553-562 Manzi P., Marconi S., Aguzzi A., Pizzoferrato L., Commercial mushrooms, nutritional quality and effect of cooking, Food Chemistry, 84 (2004), pp. 201-206 Barros L., Cruz T., Baptista P., Estevinho L.M., Ferreira I., Wild and commercial mushrooms as source of nutrients and nutraceuticals, Food and Chemical Toxicology, 46 (2008), pp. 2742-2747 Tao Y.,Zhang L., Cheung P.C.K., Physicochemical properties and antitumor activities of water soluble native and sulfated hyper branched mushroom polysaccharides, Carbohydrate Research, 341 (2006), pp. 2261-2269 Czop J.K., Austen K.F. Properties of glycans that activate the human alternative complement pathway and interact with thehuman monocyte betaglucan receptor, Journal of Immunology, 135 (1985), pp. 3388-3393 Lemieszek M., Właściwości przeciwnowotworowe polisacharydów izolowanych z grzybów klasy Basidiomycetes (2014), url: http://www.rsi2004.lubelskie.pl/doc/sty7/art/Lemieszek_Marta_art.pdf [dostęp: 2014.11.21] Ribeiro B., Rangel J., Valentao P., Baptista P., Seabra R. M., Andrade P. B., Contents of carboxylic acids and two phenolics and antioxidant activity 154 Właściwości prozdrowotne wybranych grzybów jadalnych występujących na terenie polskich lasów 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. of dried Portuguese wild edible mushrooms Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, (2006), pp. 8530-8537 Barros L., Calhelha R. C., Vaz J.A., Ferreira I., Baptista P., Estevinho L.M., Antimicrobial activity and bioactive compounds of Portuguese wild edible mushrooms methanolic extracts, European Food Research and Technology, 225 (2007), pp. 151-156 Palacios I., Lozano M., Moro C., Arrigo M.D., Rostagno M.A., Martinez J.A., Garcia-Lafuente A., Antioxidant properties of phenolic compounds occurring in edible mushrooms, Food Chemistry, 128 (2011), pp. 674-678 http://www.indexfungorum.org/ [dostęp: 2014.12.06] http://www.first-nature.com/fungi/lactarius-deliciosus.php [dostęp: 2014.12.06] Mirończuk-Chodakowska I., Witkowska A., Żujko M.E., Zawartość flawonoidów w jadalnych grzybach leśnych, Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, XLV, 3 (2012), pp. 665-668 Pogoń K., Jaworska G., Duda-Chodak A., Maciejaszek I., Influence of the Culinary Treatmet on the Quality of Lactarius deliciosus, Foods, 2 (2013), pp. 238-253 Barros L., Baptista P., Estevinho L.M., Ferreira I.C.F.R., Effect of Fruiting Body Maturity Stage on Chemical Composition and Antimicrobial Activity of Lactarius sp. Mushrooms, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55(21) (2007), pp. 8766-8771 Yasukawa K., Kanno H., Kaminaga T., Takido M., Kasahara Y., Kumaki K., Inhibitory Efect of Methanol Extracts from Edible Mushroom on TPA-induced Ear Oedema and Tumour Promotion in Mouse Skin, Pytotherapy Research, 10(4) (1996), pp. 367-369 Hou Y., Ding X., Zhong J., Immunostimulant Activity of a Novel Polusaccharide Isolated from Lactarius deliciosus (L. ex Fr.) Gray, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 75(4) (2013), pp. 393-399 Pro-health properties of selected edible mushrooms occurring in the Polish forests Properties of wild growing edible mushrooms for centuries were appreciated and used in natural medicine. It was known then, that consumption of the mushrooms in various forms (as food additives, brewed dried fruiting bodies, etc) has a beneficial impact on human health. Until recently, it was claimed that mushrooms are deprived of any nutritional values. However, recent studies of the last several years prove, that Macromycetes mushrooms possess number of biological properties, such as: antitumor, antiviral, antiinflammatory, antifungal or cholesterol-lowering. Moreover, there was observed production of nutrients, such as: easily available proteins, all the exogenous amino acids, vitamins, micro- and macroelements. Therefore there are study on common gathered or consumed mushrooms from European forests (including Polish forests) are conducted. Their goal is to refute the popular myth describing mushrooms as nothing but food additive improving the taste and flavor of dishes. The purpose of the article is to present selected species of mushrooms widely growing in the Polish forests: Boletus edulis, Boletus badius, Cantharellus cibarius, Lactarius deliciosus as a good source of nutrients compounds and pro-health properties. 155 Karolina Kasprzak1, Kinga Kropiwiec2, Marek Babicz3 Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich Prolaktyna należy do rodziny hormonów białkowych. Pełni w organizmie bardzo rozległe funkcje, daleko wykraczające poza sferę reprodukcji. Prolaktyna odgrywa ważną rolę w metabolizmie, wzroście i rozwoju, behawiorze, a także w utrzymaniu homeostazy organizmu. Do tej pory udokumentowano ponad 300 rodzajów oddziaływań tego hormonu na określone funkcje biologiczne ssaków. Prolaktyna poza regulacją funkcji reprodu-kcyjnych i odpornościowych wpływa na laktogenezę i laktopoezę, gospodarkę wodno – elektrolitową organizmu, wzrost i różnicowanie komórek, pobudzanie proliferacji: melanocytów, keratynocytów, hepatocytów, nabłonka kanalików nerkowych, nabłonka jelitowego, mięśni gładkich naczyń, komórek B wysepek trzustkowych oraz astrocytów. Wszystkie działania prolaktyny pośrednio wiążą się jednak z rozmnażaniem się zwierząt i służą dostosowaniu funkcji rozrodczych do szeroko pojętych warunków środowiskowych. Przyjmuje się, że na procesy związane z rozrodem przypada 38% aktywności prolaktyny. Natomiast za najważniejszą funkcję prolaktyny uznaje się stymulację laktacji oraz utrzymanie czynności sekrecyjnej gruczołu mlekowego. Celem pracy było określenie wpływu prolaktyny na rozród zwierząt gospodarskich. 1. Wstęp Wartość rozpłodowa zwierząt gospodarskich jest uwarunkowana zarówno licznymi czynnikami środowiskowymi (m.in. warunkami zoohigienicznymi, żywieniem) jak i genetycznymi (m.in. rasą, genotypem). Dlatego też zwiększenie efektywności produkcyjnej poprzez działania selekcyjne jest problemem złożonym. Z przeglądu literatury tematu z ostatnich kilkudziesięciu lat wynika, że obecnie kształtowanie postępu hodowlanego opiera się przede wszystkim na wykorzystaniu narzędzi genetyki molekularnej [1, 2, 3, 4]. Coraz częściej zwraca się uwagę na możliwość zastosowania selekcji wspomaganej markerami – Marker Assisted Selection MAS [5], jako selekcji pozytywnej. Selekcja tego rodzaju polega na wyszukaniu genów o dodatnim wpływie na wartość danej cechy, a następnie 1 [email protected]; Katedra Hodowli i Ochrony Zasobów Genetycznych Bydła, Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie 2 [email protected]; Katedra Hodowli i Technologii Produkcji Trzody Chlewnej, Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie 3 [email protected]; Katedra Hodowli i Technologii Produkcji Trzody Chlewnej, Wydział Biologii i Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie 156 Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich zwiększeniu puli alleli korzystnych w danej populacji zwierząt gospodarskich [6]. Najczęściej, spośród markerów wybiera się tzw. geny kandydujące, które kodują produkty białkowe biorące udział w procesach metabolicznych mających wpływ na określone cechy m.in. użytkowości tucznej, rzeźnej czy rozpłodowej. Jednym spośród licznych produktów białkowych występujących zarówno w organizmie człowieka, jak i u zwierząt gospodarskich (świnie, bydło, owce) wykazującym wielokierunkowe oddziaływanie na procesy metaboliczne i fizjologiczne organizmu, w tym również te związane z rozrodem, jest prolaktyna. 2. Ogólna charakterystyka prolaktyny Prolaktyna (PRL) wraz z hormonem wzrostu (GH) i laktogenem łożyskowym (PL), należy do rodziny hormonów białkowych [7, 8]. Została zidentyfikowana w 1928 r. przez Strickera i Guetera jako czynna substancja obecna w ekstrakcie z przedniego płata przysadki. Jest peptydem zbudowanym z około 200 aminokwasów. Przez długi czas uważano, że prolaktyna występuje tylko w przysadce i odpowiada przede wszystkim za czynność sekrecyjną gruczołu mlekowego. W 1970 r. wykryto PRL we krwi człowieka, łożysku oraz mózgu, komórkach układu immunologicznego, gruczole krokowym, jądrach, nadnerczach, trzustce, jelicie i wielu innych tkankach [9]. U większości ssaków zbudowana jest ze 199 aminokwasów z trzema mostkami disiarczkowymi znajdującymi się między sześcioma cysternami 10, 11, 12, 13]. Masa cząsteczkowa hormonu wynosi ok. 23 kilodaltonów (kDa) [8]. Prolaktyna może występować w różnych formach, co jest związane z jej modyfikacjami potranslacyjnymi, różnymi wariantami genu prolaktyny (występowania więcej niż jednej jego kopii), alternatywnego składania genów czy też stanu fizjologicznego organizmu [14]. Aktywną postać hormon ten przyjmuje dopiero po utworzeniu kompleksu z dwoma receptorami: receptor – hormon – receptor [15]. Prolaktyna syntetyzowana jest nie tylko przez komórki laktotropowe w przednim płacie przysadki mózgowej lecz także w centralnym układzie nerwowym w komórkach układu immunologicznego, w macicy, łożysku, a także w wymionach [12]. Jej występowanie stwierdzono również w niektórych płynach ustrojowych: mleku, płynie mózgowo – rdzeniowym, pocie czy łzach [11, 16, 17, 18]. Miejsca wiązania prolaktyny zidentyfikowano w wielu tkankach i komórkach dorosłych zwierząt, m.in. w mózgu, jajnikach, łożysku i macicy [19]. W obrębie przysadki mózgowej i w surowicy wykryto jej niejednorodne odmiany o różnym ciężarze cząsteczkowym. Na tej podstawie można wyróżnić kilka odmian biologicznie czynnej prolaktyny: 157 Karolina Kasprzak, Kinga Kropiwiec, Marek Babicz mała – tzw. forma monomeryczna o masie cząsteczkowej ok.23 kDa, uważana za bardzo aktywny biologicznie rodzaj PRL, wykazujący duże powinowactwo z receptorami; duża – tzw. forma dimeryczna o masie cząsteczkowej ok. 50 kDa, będąca mieszanką drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur hormonów; bardzo duża – tzw. forma polimeryczna o masie cząsteczkowej ok. 60 – 100 kDa, wykazująca mniejsze powinowactwo z receptorami [20]; glikozydowa – o masie cząsteczkowej ok. 25 kDa, o mniejszej immunoreaktywności w porównaniu do odmiany małej [21] Hormony białkowe, do których należy prolaktyna, działają na tkanki docelowe najczęściej drogą endokrynną, podczas której określony hormon zostaje uwolniony do krwioobiegu. Następnie razem z krwią dociera do odpowiednich narządów, gdzie łączy się z licznymi receptorami ulokowanymi w błonie komórkowej, przez co wywiera swoisty dla siebie efekt [15]. PRL może również oddziaływać w sposób pośredni, jako czynnik wzrostu, neurotransmiter lub immunomodulator para- lub autokrynnie, z pominięciem uwalniania hormonu do krwi. 3. Funkcje prolaktyny 3.1. Funkcje prolaktyny w organizmie zwierząt Funkcje prolaktyny w organizmie zwierzęcym są rozległe. Uważa się, że hormon ten odgrywa ważną rolę w metabolizmie, wzroście i rozwoju, behawiorze, a także w utrzymaniu homeostazy organizmu [12]. Do tej pory udokumentowano ponad 300 rodzajów oddziaływań tego hormonu na określone funkcje biologiczne ssaków. Prolaktyna poza regulacją funkcji reprodukcyjnych i odpornościowych wpływa na laktogenezę i laktopoezę, gospodarkę wodno – elektrolitową organizmu, wzrost i różnicowanie komórek [8]. Wpływ PRL na wzrost i rozwój obejmuje przede wszystkim: stymulację wzrostu ciała, pobudzanie proliferacji: melanocytów, keratynocytów, hepatocytów, nabłonka kanalików nerkowych, nabłonka jelitowego, mięśni gładkich naczyń, komórek B wysepek trzustkowych oraz astrocytów [22]. U ssaków stymuluje aktywność wydzielniczą mieszków włosowych i gruczołów łojowych. Jednak najważniejszym działaniem regulacyjnym PRL jest wpływ na rozwój i utrzymanie czynności gruczołu mlekowego. Do istotnych działań prolaktyny na organizm należy także zaliczyć jej wpływ na metabolizm organizmu: pobudzanie apetytu i wpływ na metabolizm lipidów, węglowodanów oraz na metabolizm steroidów 158 Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich u ssaków poprzez wzmaganie aktywności enzymów związanych z ich syntezą, stymulację nadnerczy do syntezy i wydzielania glikokortykoidów, aldosteronu i androgenów nadnerczowych. W wątrobie wzmaga aktywność fosforylazy glikogenu, natomiast w trzustce pobudza wydzielanie insuliny. Pobudza syntezę fosfolipidów (surfaktantu) w płucach noworodków ssaków i powoduje wzrost aktywności lipazy lipoproteinowej oraz sekrecji żółci w ich wątrobie, reguluje metabolizm wapnia. Ponadto wpływa na transport jodu w gruczołach mlekowych ssaków. Wśród istotnych funkcji osmoregulacyjnych PRL można wyróżnić: udział w regulacji równowagi wodno-elektrolitowej u wszystkich kręgowców [12, 23], zmniejszanie wydzielania sodu i chloru przez gruczoły potowe u ssaków, wzmaganie absorpcji wody i elektrolitów w jelicie oraz regulację objętości i składu płynu owodniowego u ciężarnych samic [24]. Wpływ PRL na nerki obejmuje stymulację pompy sodowo – potasowej w kanalikach nerkowych i spadek wydalania jonów sodu i potasu, zwiększa także poziom kwasu moczowego we krwi. U ssaków PRL działa na gruczoły (potowe i łojowe) oraz na wytwory skóry. Prolaktyna często opisywana jest jako hormon, który pełni istotną rolę w kontrolowaniu wielu zachowań zwierząt oraz ich adaptacji do warunków środowiska zewnętrznego. Jej działanie ujawnia się przy zmianie środowiska bytowego przez zwierzęta. Bierze również udział w regulowaniu dostosowywania się zwierząt do sezonowych zmian środowiska. U wielu gatunków wykazano dobowe i okresowe zmiany jej wydzielania [9]. Prolaktyna wywiera istotny wpływ na behawior poprzez kontrolę zachowań rozrodczych, ma związek z metabolicznym i behawioralnym przygotowaniem zwierząt do migracji. Jest uważana za hormon będący wskaźnikiem stresu [15], ponadto jej wzrost obserwowany jest także podczas wysiłku fizycznego. Ma właściwości analgetyczne (podobnie jak opioidy i GABA). Reguluje aktywność ATP-azy sodowo – potasowej i magnezowo – wapniowej w podwzgórzu. PRL u ssaków stymuluje proliferację limfocytów i produkcję przeciwciał klasy IgG i IgM. Pod jej wpływem wzrasta w błonie komórkowej gęstość receptorów interleukiny – 2, erytropoetyny i samej PRL. Wykazuje ponadto właściwości hamowania apoptozy limfocytów, aktywuje makrofagi, wzmaga cytotoksyczność komórek NK i produkcję anionów nadtlenkowych odpowiedzialnych za niszczenie patogenów. 159 Karolina Kasprzak, Kinga Kropiwiec, Marek Babicz 3.2. Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt Wszystkie działania prolaktyny pośrednio związane są z rozmnażaniem się zwierząt i służą dostosowaniu funkcji rozrodczych do szeroko pojętych warunków środowiskowych. Przyjmuje się, że na procesy związane z rozrodem przypada 38% aktywności prolaktyny. Istotny wpływ na syntezę i uwalnianie PRL mają hormony gonad. Hormon ten uwalniany jest u samic ssaków w odpowiedzi na pobudzenie receptorów podczas kopulacji [9]. Prolaktyna jest, więc jednym z wielu niezbędnych hormonów, które wywierają wpływ na cechy związane z rozrodem (wielkość miotu, przeżywalność prosiąt, laktacja, instynkt macierzyński [25] a także na funkcjonowanie narządów układu rozrodczego (np. jajników) [26]. Zadaniem regulacyjnym wydzielania PRL do krwi jest intensyfikacja funkcji luteotropowej ciałek żółtych (pobudzanie wydzielania progesteronu) oraz stworzenie odpowiedniego środowiska dla komórek jajowych uwolnionych z pęcherzyków jajnikowych [9]. W zależności od gatunku zwierzęcia oraz fazy cyklu płciowego PRL wpływa na funkcjonowanie ciałka żółtego [12]. Cykliczne wyrzuty prolaktyny pozytywnie wpływają na rozwój ciałek żółtych oraz ich przemianę w ciałka ciążowe. Mają także istotne znaczenie w regresji tych ciałek z poprzedniego cyklu. Wpływ hormonu na ciałko żółte obserwuje się we wczesnej fazie lutealnej cyklu rujowego oraz w drugiej połowie ciąży [11]. Ponadto, prolaktyna wpływa na zwiększenie sekrecji progesteronu, nasilając steroidogenne działanie hormonu luteinizującego (LH) w komórkach ziarnistych – luteinowych oraz hamuje wydzielanie enzymu inaktywującego progesteron. Prawdopodobnie u ssaków prolaktyna jest częścią tzw. „kompleksu luteotropowego” składającego się z hormonów: LH, FSH oraz PRL [12]. PRL poza oddziaływaniem na aktywność enzymów steroidogennych oraz rozwój pęcherzyków jajnikowych wywiera wpływ na gęstość receptorów estrogenowych i progesteronowych w macicy, ułatwia implantację blastocysty w endometrium, a jej poziom wzrasta znacznie podczas ciąży [9]. Potwierdzają to badania Farmera [27] przeprowadzone na loszkach, gdzie przez cały okres dojrzewania płciowego poziom prolaktyny utrzymywał się na stałym poziomie, natomiast jego gwałtowny wzrost obserwowano podczas ciąży. Po porodzie poziom PRL stopniowo obniżał się. Jak podaje Dusza i wsp [28], na 2-3 dni przed porodem stężenie PRL we krwi wzrasta i osiąga poziom maksymalny podczas porodu. Z badań przeprowadzonych na świniach wynika, iż wzrost poziomu prolaktyny obserwowany był po pojawieniu się w macicy co najmniej 3 płodów. Z kolei wysoka koncentracja prolaktyny w czasie porodu inicjuje laktację [29]. Z badań Farmera [27] wynika, iż podanie lochom przed 160 Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich porodem antagonisty prolaktyny – bromokryptyny wpływało na zahamowanie wydzielania prolaktyny, a tym samym zatrzymanie sekrecji mleka wkolejnej laktacji oraz spadek masy miotu w porównaniu do miotów kontrolnych. Natomiast, u krów i kóz podanie bromokryptyny podczas porodu skutkowało opóźnioną sekrecją mleka oraz zmniejszoną jego produkcją Stwierdzono także, iż podanie bromokryptyny nie wpływało na całkowite zahamowanie wydzielania prolaktyny i odnotowywano jej obecność we krwi [30]. Stymulacja laktacji uważana jest za jedną z podstawowych funkcji prolaktyny. Z badań Farmera [27] wynika, iż prolaktyna wywiera ogromny wpływ na odruch ssania. W miotach pochodzących od loch, gdzie laktogeneza była zahamowana odruch ten prawie całkowicie zanikał. U wszystkich ssaków ilość uwolnionej prolaktyny zależy od intensywności ssania oraz jest proporcjonalna do liczby potomstwa [26]. U ludzi, bydła oraz gryzoni wydzielanie prolaktyny podczas karmienia wzmacniane jest całodobowym rytmem sekrecji. Taka regulacja może skutkować zwiększoną sekrecją PRL bez względu na intensywność ssania [12]. Kiedy częstotliwość karmienia zmniejsza się koncentracja prolaktyny spada do poziomu wyjściowego. Jak wynika z badań przeprowadzonych na świniach i owcach prolaktyna jest hormonem niezbędnym do rozwoju gruczołu mlekowego oraz zapoczątkowania wydzielania mleka pod koniec ciąży. U klaczy natomiast, wzrost wydzielania PRL obserwowany jest wraz ze wzrostem koncentracji laktozy, trójglicerydów oraz białka w mleku. W przypadku koni prawdopodobnie prolaktyna nie wywiera tak istotnego wpływu na laktację oraz ssanie, ponieważ odnotowano jej spadek do wartości wyjściowej po ok. 1-2 miesiącach po porodzie. Także zahamowane zostaje uwalnianie prolaktyny u klaczy karmiących, którym po porodzie zabrano źrebięta [31]. Z kolei u przeżuwaczy nie odnotowano zależności pomiędzy stężeniem prolaktyny a ilością produkowanego mleka [26]. Z badań przeprowadzonych na lochach wynika, iż niezależnie od dnia laktacji u 90% karmiących loch następował wzrost stężenia PRL, osiągając szczyt po 15 minutach od początku ssania. Lochy, u których sekrecja prolaktyny była na niskim poziomie, dzięki ssaniu prosiąt wykazywały kilkakrotnie wyższe stężenie hormonu podczas laktacji. Prolaktyna pełni także istotną rolę w rozwoju młodych zwierząt oraz ich zdrowotności. Jak podają Farmer i wsp [32] zarówno u prosiąt płci męskiej jak i żeńskiej stężenie prolaktyny jest na takim samym poziomie. Jednak, wyższą przeżywalnością charakteryzowały się te prosięta, u których zanotowano wyższy poziom PRL. Nie określono jednak czy było to związane z bezpośrednim oddziaływaniem prolaktyny. Z badań przeprowadzonych na owcach [33] wynika, iż masa ciała jagniąt nie jest skorelowana ze stężeniem PRL. Jak dowodzą badania przeprowadzone 161 Karolina Kasprzak, Kinga Kropiwiec, Marek Babicz przez Przałę i wsp [34] podawanie loszkom remontowym egzogennej prolaktyny w dniu porodu wpływa na ograniczenie zachorowań w stadzie na „gorączkę poporodową”, czyli tzw. syndrom MMA. Iniekcja egzogennej PRL pozytywnie wpływa także na liczbę odchowanych prosiąt oraz ich masę ciała [34] a także na dzienne przyrosty prosiąt w pierwszych dwóch tygodniach życia. Zależności takie nie zostały odnotowane u loch wieloródek. W innych badaniach, prowadzonych przez Szczęśniak – Fabiańczyk i wsp [35] wykazano korzystny wpływ podawania prosiętom egzogennej prolaktyny na uzyskiwaną przez zwierzęta masę ciała. Stwierdzono ponadto, iż PRL stymuluje układ odpornościowy zwierząt. Dlatego, uzupełnianie niskiej zawartości prolaktyny w pokarmie matki poprzez stosowanie specjalistycznych preparatów wywiera korzystny efekt zarówno na wzrost jak i zdrowie prosiąt [36,37,38,39]. Liczne badania dowodzą, iż prolaktyna odgrywa istotną rolę w zachowaniach i odruchach płciowych. Jej wysoki poziom związany jest z występowaniem ciąży urojonej. Z kolei ograniczone wydzielanie endogennej prolaktyny prowadzi do zahamowania instynktu macierzyńskiego [12] Wzrost poziomu PRL u loch tuż przed porodem związany jest z rozpoczęciem budowy gniazda [40]. Jak wykazały badania Boultona i wsp [41] podanie loszkom z ciążą urojoną antagonisty prolaktyny – bromokryptyny osłabia wzrost poziomu prolaktyny, wpływając jednocześnie na intensywność budowania gniazda. Rushen i wsp [42] w badaniach stwierdzili, że u loszek prośnych PRL odgrywa ograniczoną rolę w aktywności przedporodowej (w tym w budowaniu gniazda). U ssaków prolaktyna jest hormonem warunkującym przeżycie młodych po urodzeniu, wpływa na behawior macierzyński, pełni kluczową rolę w przygotowaniu (podczas ciąży) i utrzymaniu w czasie laktacji aktywności sekrecyjnej gruczołu mlekowego. Wpływa na ukrwienie gruczołu, proliferację komórek wydzielniczych i stymulację w nich procesów endocytozy, zarówno gotowych składników, jak i substratów do produkcji mleka (tłuszczów, białek, laktozy). Jest współodpowiedzialna za przemieszczanie się ogromnych mas wody i elektrolitów z organizmu matki do mleka. PRL wpływa na ekspresję i tempo transkrypcji genów szeregu białek mleka (-kazeiny, - i -laktoalbuminy) oraz na gromadzenie i stabilizację ich mRNA. Ma również wpływ na translację i modyfikacje potranslacyjne tych białek. W gruczole mlekowym wpływa również na syntezę swoich własnych receptorów i ich fosforylację [9]. Prolaktyna pomimo, iż uznawana jest za hormon związany z procesami zachodzącymi w organizmach samic wywiera istotny wpływ na osobniki męskie. PRL u samców pobudza aktywność steroidogenną jąder i wpływa na czynność wydzielniczą gruczołów dodatkowych (np. prostaty) [9]. Jej wydzielanie u osobników męskich sterowane jest poprzez mechanizm 162 Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich sprzężony przysadkowo – podwzgórzowo – gonadowy, zależny od hormonów sterydowych gonad: testosteronu oraz estradiolu. Mechanizm ten zapewnia utrzymanie stężenia prolaktyny na fizjologicznym poziomie. Jak wykazały badania Gill – Sharma [43] słaba lub niewielka hiperprolaktynemia może wpływać na dojrzewanie plemników oraz ich zdolność do zapłodnienia, określono prolaktynę, jako główny hormon regulujący płodność samców. Poza tym prolaktyna bierze udział w patogenezie niektórych chorób: zaburzeniach steroidogenezy, niepłodności, niektórych chorobach autoimmunologicznych, osteoporozie oraz nowotworach [9]. 4. Gen prolaktyny oraz gen receptora prolaktyny W związku z licznymi funkcjami jakie prolaktyna spełnia w organizmie zwierzęcym [12, 44, 45, 46, 47] istotne jest poszukiwanie genetycznego podłoża warunkującego występowanie poszczególnych form PRL. Analiza powiązań polimorfizmu genu prolaktyny oraz cech funkcjonalnych zwierząt gospodarskich związanych z rozrodem podkreśla celowość wytypowania genu PRL jako markera cech użytkowości rozpłodowej. U ssaków gen prolaktyny (zbudowany z 5 eksonów oraz 4 intronów) został zidentyfikowany na chromosomie 6, blisko genów kodujących układ zgodności tkankowej HLA [48, 49]. U świni domowej gen PRL kodujący hormon prolaktynę zlokalizowano na chromosomie 7 [50], u bydła natomiast na chromosomie 23 [51]. Cowan i wsp [52] zidentyfikowali miejsce polimorficzne w obrębie genu prolaktyny bydła przy użyciu enzymu restrykcyjnego Ava II. Polimorfizm wynikał z delecji/insercji około 200 par zasad w pobliżu genu PRL. Z kolei badania przeprowadzone przez Hart i wsp [53] wykazały cztery allele SSCP w rejonie flankującym – 5' genu prolaktyny. Także Klauzińska i wsp [54] opisali pojedyncze substytucje nukleotydów w regionie – 5' genu PRL. Chung i wsp [55] wykazali istotne zależności polimorfizmu identyfikowanego przy użyciu enzymu restrykcyjnego RsaI a wydajnością mleczną oraz procentowym udziałem tłuszczu w mleku bydła mlecznego. Badania przeprowadzone przez Dybusa [56] wykazały, że krowy o genotypach AA charakteryzowały się wyższym udziałem białka w mleku w porównaniu do osobników heterozygotycznych. Babicz i wsp [57] wykorzystali polimorfizm w regionie 3’UTR w 5 eksonie do poszukiwania zależności pomiędzy zmiennością w locus PRL a wartością cech rozrodczych loch rasy puławskiej. Analiza cech płodności potencjalnej wykazała zależność między polimorfizmem w locus PRL a wielkością określonych wskaźników. Intensywność przejawianych zachowań rujowych była statystycznie istotnie większa u samic o genotypie B/B w porównaniu do obserwowanych u loch A/A. Przewaga loch o genotypach B/B obserwowana była także w odniesieniu do: takich cech, 163 Karolina Kasprzak, Kinga Kropiwiec, Marek Babicz jak: masa macicy, długość prawego rogu macicy, długość lewego rogu macicy, łączna długość rogów macicy oraz liczba ciałek żółtych umiejscowionych na jajniku prawym. Ponadto, samice o genotypie B/B rodziły więcej żywych prosiąt w miocie [57]. Wieloletnie badania genu receptora prolaktyny spowodowały uznanie PRLR jako genu kandydata odpowiedzialnego za cechy związane z rozrodem [50, 58]. Gen receptora prolaktyny (PRLR) zlokalizowany jest na chromosomie szesnastym w pozycji q 1.4 lub q 2.2 – 2.3 [59, 60]. U ssaków receptor prolaktyny wykryto w różnych tkankach, np. u świni domowej: w mózgu, macicy, jajnikach oraz łożysku [61]. Receptor ten jest białkiem międzybłonowym zaliczanym do rodziny receptorów cytokinowych klasy I, wykazującym duże podobieństwo do receptora hormonu wzrostu (GHR) [17, 62]. Sus scrofa domestica L. w gruczole mlekowym posiada dwie formy receptorowe, długą oraz krótką; długa zbudowana jest z 592 aminokwasów, krótka natomiast w swej budowie liczy 291 aminokwasów [63, 64]. Zauważono, że zwierzęta które posiadają zablokowane formy PRLR nie wykazują dostatecznej matczynej opieki nad swym potomstwem [65]. Prowadzone w ostatnich latach badania dotyczące polimorfizmu genu prolaktyny (PRL) oraz genu receptora prolaktyny (PRLR) dowodzą, iż geny te w sposób pośredni i bezpośredni oddziaływują na cechy produkcyjne zwierząt gospodarskich, dzięki czemu są one rozpatrywane jako potencjalni kandydaci na markery tychże cech. Istotne jest więc poznanie i opisanie zależności polimorfizmu genów PRL i PRLR w kontekście efektywnego prowadzenia hodowli zwierząt gospodarskich. Literatura 1. 2. 3. 4. Buske B., Sternstein I., Brockmann G. QTL and candidate genes for fecundity in sows. Animal Reproduction Science, 95, 2006 , pp. 167-183 Ellegren H. Abundant (A)n(T)n mononucleotide repeats in the pig genome: linkage mapping of the porcine APOB, FSA, ALOX12, PEPN and RLN loci. Animal Genetics, 24 (5), 1993, pp. 367-372 Kim C.W., Hong Y.H., Yun S., Lee S., Kim Y.H., Kim M., Chung K.H., Jung W.Y., Kwon E.J., Hwang S.S., Park D.H., Cho K.K., Lee J.G., Kim B.W., Kim J.W., Kang Y.S., Yeo J.S., Chang K. Use of microsatellite markers to detect Quantitative Trait Loci in Yorkshire pigs. Journal of Reproduction and Development, 52 (2), 2006, pp. 229-237 Rohrer G.A., Ford J.J., Wise T.H., Vallet J.L., Christenson R.K. Identyfication of quantitative trait loci affecting female reproductive traits in a multigeneration Meishan-White composite swine population. Journal of Animal Science, 77, 1999, pp. 1385-1391 164 Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. Søller M. Marker – assisted selection – an overview. Animal Biotechnology, 5, 1994, pp. 193-207 Rothschild M., Jacobson C., Vaske D., Tuggle Ch., Wang L., Short T., Eckardt G., Sasaki S., Vincent A., Mclaren D., Southwood O., Van Der Steen H., Milehami A., Plastow G. The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs. Proceedings of the National Academy of Sciences 93, 1996., pp. 201-205 Bonavera J.J., Sahu A., Kalra P.S. Evidence in support of nitric oxide (NO) involvement in the cyclic release of prolactin and LH surges. Brain Res 660, 1994, pp. 175-179 Horseman N.D., Yu-Lee L.Y. Transcriptional regulation by the helix bundle peptide hormones: growth hormone, prolactin, and hematopoietic cytokines. Endocr Rev 15, 1994, pp. 627-649 Sotowska – Brochocka J. Fizjologia zwierząt. Zagadnienia wybrane, 9, 2001, pp. 194-227 Colenbrander B., Erkens H. F., Meijer J. C., Poot P., Trudeau V. L., Van De Wiel D. F. M. Prolactin in the developing Pig. Biology of reproduction, 39, 1988, pp. 264-269 Dusza L., Ciereszko R., (red.) Krzymowskiego T. Fizjologiczna regulacja procesów rozrodczych samicy, Biologia Rozrodu Zwierząt. Wydawnictwo Uniwersytetu Warmińsko – Mazurskiego, Olsztyn, 2007 Freemann M.E. Kannyicska B., Lerant A., Nagy G. Prolactin: structure, function and regulation of secretion. Physiological Review, 80 (4), 2000, pp. 1523-1631 Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V. W. Biochemia Harpera. Wydawnictwo lekarskie PZWL, Warszawa, 1995 Michalik, J., Bartoszewicz, Z. Prolaktyna (PRL)-wielofunkcyjny, przysadkowy hormon peptydowy. Post. Bioch, 48, 2002, pp. 296-305 Terman A., Kmieć M., Kowalewska – Łuczak I. Gen PRLR – marker cech użytkowości rozrodczej loch? Medycyna Weterynaryjna 63(2), 2007, pp. 145-146 Ben-Jonathan N., Mershon J. L., Allen D. L., Steinmetz R. W. Extrapituitary prolactin: distribution, regulation, functions, and clinical aspects. Endocrinology 17, 2006, pp. 639-669 Grattan D. R. Behavioural significance of prolactin signaling in the central nervous system during pregnancy and lactation. Reprod., 123, 2002, pp. 497-506 Kmieć M., Terman A. Polymorphism in the PRLR/AluI gene and its effect on litter size in Large White sows. Anim. Sci. Pap. Rep., 22, 2004. pp. 523-527 Goffin V., Binart N., Clement – Lacroix P., Bouchard B., Bole – Feysot Ch., Edery M., Lucas BK., Touraine P., Pezet A., Maaskant R., Pichard C., Helloco Ch., Baran N., Favre H., Bernichtein S., Allamando A., Ormandy Ch., Kelly 165 Karolina Kasprzak, Kinga Kropiwiec, Marek Babicz 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. PA. From the molecular biology of prolactin and its receptor to the lessons learned from knockout mice models. Genetic Analysis: Biomolecular Engineeing 15, 1999, pp. 189-201 Serri O., Chik C. L. , Ur E., et al. Diagnosis and management of hyperprolactinemia. CMAJ, 2, 2003, pp. 23-32 Badowska-Kozakiewicz A. M. Biologiczna rola prolaktyny. Przegląd Menopauzalny, 4, 2012, pp. 305-308 Vera-Lastra O., Jara L. J., Espinoza L. R. Prolactin and autoimmunity. Autoimmunity reviews, 1(6), 2002, pp. 360-364 Bern H. A. Prolactin and osmoregulation. American Zoologist, 15(4), 1975, pp. 937-948 Pahuja D. N., DeLuca, H. F. (1981). Stimulation of intestinal calcium transport and bone calcium mobilization by prolactin in vitamin D-deficient rats. Science, 214(4524), 1981, pp.1038-1039 Drogemuller C., Hamann H., Dietl O. Candidate gene markers for litter size in different German pig lines. J. Anim. Sci., 79, 2001, pp. 2565-2570 Poniedziałek – Kempny K. Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt. Przegląd hodowlany, 4, 2014, pp. 5-8, Farmer C. The role of prolactin for mammogenesis and galactopoiesis in swine. Livestock Production Science, 70(1), 2001, pp. 105-113 Dusza L., Sobczak J., Jana B., Murdza A., Bluj, W. Zastosowanie Biolactinu-2 (oczyszczona prolaktyna świni) do stymulacji laktacji u loch. Med. Wet., 47, 1991, pp. 418-421 Taverne M., Bevers, M., Bradshaw, J. M., Dieleman, S. J., Willemse, A. H., & Porter D.G. Plasma concentrations of prolactin, progesterone, relaxin and oestradiol-17β in sows treated with progesterone, bromocriptine or indomethacin during late pregnancy. Journal of reproduction and fertility, 65(1), 1982, pp. 85-96 Knight, C. H. (2001). Overview of prolactin’s role in farm animal lactation. Livestock Production Science, 70(1), 2001, pp. 87-93 Zagrajczuk A., Okólski A. Role of prolactin in horse reproduction. Medycyna Weterynaryjna, 62(6), 2006, pp. 624-627 Farmer C., Kensinger R. S., Hagen D. R. (1987). Relationship of estrone and prolactin with growth and survival of piglets to 35 d of age. Journal of animal science, 65(4), 1987, pp. 1034-1041 Witmer B. L. Relationships of Plasma Protein, Hematocrit, and Concentrations of Certain Hormones in Blood to Birth Weight and Growth Rate of Lambs (Doctoral dissertation, Pennsylvania State University), 1985 166 Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich 34. Przała J., Gajęcki M., Przała F., Ryszka F. Prophylactic application of Biolactin-2 preparation in replacement gilts and the MMA syndrome. Med. Weter, 1992, 48(1), pp. 31-33 35. Szczęśniak - Fabiańczyk B., Dolińska B., Ryszka F., Smorąg Z. Efficiency of Biolactin administered to primiparous and multiparous sows. Ann. Anim. Sci., 2002, 2(2), pp. 173-176 36. Gajda B., Szczęśniak - Fabiańczyk B., Grad I., Poniedziałek K., Ryszka F., Smorąg Z., Dolińska B., Leszczyńska L. Effect of “Biolactin” administered per os on viability and body weight of piglets. Acta Biochim. Pol., 2011, 58 (4), pp. 147 37. Gajda B., Szczęśniak-Fabiańczyk B., Poniedziałek K., Ryszka F., Dolińska B., Leszczyńska L., Smorąg Z. Prolaktyna jako stymulator zdrowotności i wzrostu prosiąt. Mat. VI Zjazdu Towarzystwa Biologii Rozrodu, Polańczyk, 8-10.09.2011, pp. 106 38. Gajda B., Szczęśniak - Fabiańczyk B., Grad I., Poniedziałek K., Ryszka F., Smorąg Z., Dolińska B., Leszczyńska L. (2012). Effect of low prolactin dose administered per os on mortality and body weight of piglets. Reprod. Domestic. Anim., 47 (4), pp. 574 39. Gajda B, Szczęśniak-Fabiańczyk B, Mandryk I, Poniedziałek K, Ryszka R, Dolińska B, Leszczyńska L, Smorąg Z. Effect of different dose of prolactin administered per os on the viability and body weight of piglets. 29th Scientific Meeting of AETE (European Embryo Transfer Association), 2013, pp. 136 40. Castrén,H.B. Algers de Passillé A.M.B., Rushen J., Uvnas-Moberg K. Progesterone, prolactin, oxytocin, and somatostatin in relation to nest building in sows. Appl. Anim. Behav. Sci., 38 (1994), pp. 91-102 41. Boulton M. I., Wickens A., Goode J. A., Lawrence A. B., Gilbert C. L. Does Prolactin Mediate Induced Nest-Building Behaviour in Pseudopregnant Gilts Treated with PGF2 ?, Journal of neuroendocrinology, 10, 1998, pp. 601-610 42. Rushen J., Robert S., Farmer C. Evidence of a limited role for prolactin in the preparturient activity of confined gilts. Applied animal behaviour science, 72(4), 2001, pp. 309-319 43. Gill-Sharma, M. K. Prolactin and male fertility: the long and short feedback regulation. International journal of endocrinology, 2009. 44. Vincent A.L., Evans G., Southwood O.I., Plastow G.S., Tuggle C.K., Rothschild M.F. The prolactin receptor gene is associated with increased litter size in pigs. Proceedings of the 6th World Congress of Genetics and Applied Livestock Production. Armidale, Australia, 27, 1998, pp. 15-18 45. Vincent A.L., Wang L., Tuggle C.K., Rothschild M.F. 1998a. Linkage and physical mapping of prolactin to porcine chromosome 7. Animal Genetics 29, 27-29. 46. Korwin-Kosakowska A., Kamyczek M., Cieślak D., Pierzchała M., Kurył J. 2002. The effect of the polymorphism of leptin (LEP), leptin receptor (LEPR) 167 Karolina Kasprzak, Kinga Kropiwiec, Marek Babicz 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. and osteopontin (OPN) genes on selected reproduction traits of synthetic Line 990 sows. Animal Science Papers and Reports 20 (3), 2002, 159-163 Goncikowska E., Sotowska-Brochocka J. Prolaktyna – hormon wszechstronny. (W) Fizjologia zwierząt. Zagadnienia wybrane. Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego, 2001, pp. 191-224 Fiedorowicz, M. Układ prolaktynergiczny? Wytwarzanie i rola prolaktyny w mózgu. Kosmos, 53(3-4), (2004), pp. 305-314 Goffin V., Binart N., Touraine P., & Kelly, P. A. Prolactin: the new biology of an old hormone. Annual Review of Physiology, 64(1), (2002), pp. 47-67 Korwin – Kossakowska A., Kamyczek M., Cieślak D., Pierzchała M., Kurył J. Candidate gene markers for reproductive traits In polish 990 pig line. J. Anim. Breed. Genet. 120, 2003, pp. 181-191 Barendse W., Vaiman D., Kemp S.J., Sugimoto Y., Armitage S.M., Williams J.L., Sun H.S., Eggen A., Agaba M., Aleyasin S.A., Band M., Bishop M.D., Buitkamp J., Byrne K., Collins F.; Cooper L.; Coppettiers W.; Denys B.; Drinkwater R.D.; Easterday K.; Elduque C.; Ennis S.; Erhardt G.; Ferretti L.; Flavin N.; Gao Q.; Georges M.; Gurung R.; Harlizius B.; Hawkins G.; Hetzel J.; Hirano T.; Hulme D.; Jorgensen C.; Kessler M.; Kirkpatrick B.W.; Konfortov B.; Kostia S.; Kuhn C.; Lenstra J.A.; Leveziel H.; Lewin H.A.; Leyhe B.; Lil L.; Martin Burriel, I.; Mcgraw R.A.; Miller, J.R.; Moody D.E.; Moore S.S.; Nakane S.; Nijman I.J.; Olsaker I.; Pomp D.; Rando A.; Ron M.; Shalom A.; Teale A.J.; Thieven U.; Urquhart B.G.D.; Vage D.-I.; Van De Weghe, A.; Varvio S.; Velmala R., Vilkki J., Weikard R., WoodsideC., Womack J.E., Zanotti M., Zaragoza P. A medium-density genetic linkage map of the bovine genome. Mammalian Genome, 8, 1997, pp. 21-28 Cowan C. M, Dentine M.R, Ax R.L. Schuler L.A., Structural variation around prolactin gene linked to quantitative traits in an elite Holstein sire family. Theoretical and Applied Genetics, 79, 1990, pp. 577-582 Hart G.L., Bastiaansen J., Dentine M.R., Kirkpatrick B.W., Detection of a four-allele single strand conformation polymorphism (SSCP) in the bovine prolactin gene 5’ flank. Animal Genetics, 24, 1993, pp. 149 Klauzińska M.; Grochowska R.; Zwierzchowski L. Polymorphism of the 5’ flanking regions of the prolactin and growth hormone receptor genes of cattle. 14TH Congress of Polish Genetics Society, Book of Abstracts, 2001, pp. 84 Chung E.R., Rhim T.J., Han S.K. Associations between PCR-RFLP markers of growth hormone and prolactin genes and production traits in dairy cattle. Korean Journal of Animal Science, 38, 1996, pp. 321-336 Dybus A. Associations of growth hormone (GH) and prolactin (PRL) genes polymorphisms with milk production traits in polish Black-and-White cattle. Animal Science Papers and Reports, 20, 2002, pp. 203-212 168 Rola prolaktyny w rozrodzie zwierząt gospodarskich 57. Babicz M., Pierzchała M., Urbański P., Rucińska-Rozempolska I. An insertion/deletion polymorphism in the 3’ UTR encoding region of the porcie prolactin (PRL) gene. Animal Science Papers and Reports 26(3), 2008, pp. 183-189 58. Van Rens B. T. T. M., Van Der Lende T. Litter size and piglet traits of gilts with different prolactin receptor genotypes, Theriogenol. 57, 2002, pp. 883-893 59. Putnova L., Knoll A., Dvorak J., Cepica S. A new HpaII PCR – RFLP within the porcine prolactin receptor (PRLR) gene and study of its effect on litter size and number of teats. J. Anim. Breed. Genet. 119, 2002, pp. 57-63 60. Terman A. Effect of the polymorphism of prolactin receptor (PRLR) and leptin (LEP) genes on litter size In polish pigs. J. Anim. Breed. Genet. 122, 2005, pp. 400-404 61. Mazurowski A., Mroczkowski S. Analiza polimorfizmu genu prolaktyny (PRL) i genu receptora prolaktyny (PRLR). Journal of Health Sciences, 4(9), 2014 62. Kelly P. A., Djiane J., Postel – Vinay M. C., Edery M. The prolactin/growth hormone receptor family. Endocr. Rev. 12, 1991, pp. 235-251 63. Bole – Feysot C., Goffin V., Edery M., Binart N., Kelly P.A. Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice. Endocr. Rev. 19, 1998, pp. 225-268 64. Lesueur L., Edery M., Ali S., Paly J., Kelly P. A., Djiane J. Comparison of long and short forms of the prolactin receptor on prolactin – induced milk protein gene transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 1991, 824-828 65. Farmer C., Sorensen M. T., Robert S., Petitclerc D. 1999. Administring exogenous porcine prolactin to lactating sows: milk yield, mammary gland composition, and endocrine and behavioral responses. J. Anim Sci. 77: 1851-1859 The role of prolactin in reproduction of farm animals Abstract Prolactin belongs to the family of protein hormones. The functions of prolactin in the body are extensive and far outside the scope of reproduction. This hormone plays an important role in the metabolism, growth, development, behaviour, and in homeostasis maintaining. So far, has been documented more than 300 types of interactions of prolactin hormone on a specific biological functions in mammals organisms. Prolactin, beyond the control of reproductive and immune functions affects lactogenesis and lactopoesis, water electrolyte balance, body cells growth and differentiation, stimulation of proliferation: melanocytes, keratinocytes, hepatocytes, renal tubular epithelial cells, intestinal epithelial cells, cells of vascular smooth muscle, B cells of pancreatic islets and astrocytes. All activities of prolactin indirectly are related to animals reproduction. The 38% of the activity of prolactin associated with the processes of reproduction. Whereas, the most important function of prolactin is to stimulate and maintain mammary gland secretory function The aim of this study was to determine the influence of prolactin on livestock breeding. 169 Blanka Bukowska1 Szczenięta podczas pierwszych tygodni życia: problemy pediatryczne u psów Okres poporodowy (neonatalny) jest to okres od urodzenia szczenięcia do osiągnięcia przez niego 3 tygodnia życia lub momentu kiedy zwierzę zaczyna chodzić oraz samodzielnie oddawać mocz i kał. Prawidłowa opieka nad szczenięciem sprawowana przez hodowcę i lekarza weterynarii decyduje o zdrowiu, zdolności użytkowej i płodności osobników dorosłych. W wczesnym okresie noworodkowym notuje się najwyższą śmiertelność kociąt i szczeniąt, dlatego też okres ten powinien być objęty bacznym nadzorem. Niniejsza praca prezentuje ważniejsze aspekty i informacje z zakresu pediatrii szczeniąt w poszczególnych etapach ich rozwoju. Wstęp/Wprowadzenie Okres neonatalny, obejmujący pierwsze tygodnie życia szczeniąt, jest czasem intensywnego wzrostu i rozwoju szczenięcia. Charakteryzuje się również zwiększoną podatnością na zachorowania wśród osesków. Przetrwanie szczeniąt w tym okresie jest uzależnione od instynktu macierzyńskiego suki oraz od warunków zoohigienicznych stworzonych przez hodowcę. Nowo narodzone szczenię jest podatniejsze na wiele schorzeń i stany patologiczne ze względu na fizjologiczną niedojrzałość wielu procesów życiowych w przeciwieństwie do innych gatunków ssaków. W przypadku szczeniąt śmiertelność pomiędzy narodzinami a 8 tygodniem życia (przed odstawieniem) wynosi prawie 20%. Zwłaszcza dwie pierwsze doby życia wydają się być kluczowe dla nowonarodzonych szczeniąt [1]. Czynniki ze strony płodu takie jak niska masa urodzeniowa, niedotlenienie podczas porodu, stan po urodzeniu, pobranie siary; ze strony matczynej (szczepienia matki, inbred, wady i deformacje na tle czynników genetycznych); czynniki środowiskowe (teratogenne) oraz czynniki zakaźne predysponują szczenięta do wystąpienia stanów zagrożenia życia. Celem lekarza weterynarii jest w pierwszej kolejności rozpoznanie przyczyny choroby, następnie wdrożenie odpowiedniego leczenia oraz poinstruowanie hodowcy odnośnie indywidualnej opieki nad oseskiem. Celem pracy jest przedstawienie ważniejszych zagadnień i wiadomości z zakresu pediatrii szczeniąt. W niniejszej pracy opisane są charakterystyczne dla okresu neonatalnego u psów oraz algorytm postępowania terapeutycznego. 1 [email protected], Katedra Rozrodu Zwierząt z Kliniką, Wydział Medycyny Weterynaryjnej w Olsztynie 170 Szczenięta podczas pierwszych tygodni życia: problemy pediatryczne u psów 2. Pozorna śmierć noworodków (zamartwica, niedotlenienie) Zapotrzebowanie na tlen u noworodków jest 3-krotnie wyższe niż u osobników dorosłych ze względu na szybką przemianę materii. Przez zamartwicę należy rozumieć stan duszenia się płodu (noworodka) w następstwie znacznego zubożenia jego krwi w tlen, a wzrostu stężenia dwutlenku węgla. U noworodków obserwuje się zamartwicę wczesną, czyli siną oraz zamartwicę późną, czyli bladą [2]. Zamartwicę wczesną obserwujemy tuż po porodzie. U szczenięcia następuje zasinienie błon śluzowych, tachykardia i nieregularne oddechy (przy zachowanych odruchach i napięciu mięśni). Zamartwica blada rozwija się w późniejszym czasie niż forma sina. U szczenięcia obserwujemy bezdech, zapaść krążeniową, tony serca są osłabione lub nadmiernie przyśpieszone. Ciało zwierzęcia jest zwiotczałe a widoczne błony śluzowe i niepigmentowana skóra są wyraźnie blade. U szczeniąt przypadki zamartwicy wczesnej mają dobre rokowanie, gdy noworodkowi udzieli się odpowiednio szybko pomocy. W pierwszej kolejności należy udrożnić górne drogi oddechowe czyli uwolnić jamę ustną, nosowo-gardłową i krtań z zalegającego tam śluzu owodniowego. Następnie należy zainicjować proces oddychania poprzez pobudzenie nerwowego ośrodka oddechowego. Drogi oddechowe udrażniane są poprzez ułożenie główki znacznie niżej niż tylnej części ciała, odsysanie zalegających płynów z nosa i pyszczka. Raczej nie zaleca się huśtania i gwałtownego potrząsania ciałem noworodka z powodu niebezpieczeństwa uszkodzenia delikatnej tkanki mózgowej. W celu wywołania oddechów stosuje się inhalacje do płuc czystego tlenu albo mieszanki tlenu z azotem (95% N2 i 5% O2). Kwasicę oddechową neutralizuje się, podając 1,3-1,4% dwuwęglanu sodu. Pracę ośrodka oddechowego pobudza się masażem grzbietu, uciskaniem klatki piersiowej i wdmuchiwaniem powietrza przez otwory nosowe, a także przez podawanie stymulujących preparatów (Respirot, Pneumogen lub Doxapram w dawce 1mg/kg m.c. podjęzykowo). 3. Szczenię – uwarunkowania fizjologiczne Okres noworodkowy u szczeniąt oraz innych gatunków z rodziny naczelnychwymaga wiele uwagi, opieki i ochrony ze strony hodowcy jak również lekarza weterynarii. Szczenięta podczas odchowu powinny znajdować się w specjalnie przygotowanym kojcu. Powinien on być na tyle duży by samica mogła swobodnie się w nim poruszać i ułożyć do karmienia [3]. Noworodki charakteryzują się wieloma unikalnymi cechami fizjologicznymi, anatomicznymi, żywieniowymi oraz behawioralnymi, co znacznie odróżnia je od dorosłych osobników [4]. 171 Blanka Bukowska Początkowy spadek temperatury ciała zaraz po porodzie wydaje się być skutecznym sposobem obrony przed następstwami niedotlenienia. Czas przeżycia u szczenięcia wzrasta wraz z obniżeniem stopnia metabolizmu. Po porodzie ważna jest obserwacja masy urodzeniowej noworodków(zależna rasowo oraz jej dziennych przyrostów. Szczenięta powinny podwoić urodzeniową masę ciała po 8-10 dniach. Sen zajmuje około 90% doby, normalnie pobieranie pokarmu oraz niezaburzony odruch połykania muszą być widoczne. Tabela I obrazuje ważniejsze prawidłowe wartości podstawowych parametrów fizjologicznych u szczeniąt. W tabeli II przedstawiono ważniejsze informacje z rozwoju podstawowych umiejętności psich noworodków. Tabela 1. (Prawidłowe wartości podstawowych parametrów fizjologicznych u szczeniąt.) Szczenię – parametr Masa ciała Lp. oddechów Tętno Temperatura Wartość Zależna rasowo 15-35/minutę 180-220/minutę 34,4-37,2C Źródło: [1, 5, 10] Tabela 2. (Rozwój podstawowych umiejętności szczeniąt.) Zdolność Dominacja mięśni prostowników (napięcie) Drżenie podczas snu, początek czołgania się Podwojenie urodzeniowej masy ciała, otwarcie powiek Otwarcie kanału słuchowego Słyszenie czynnościowe Samoczynne wydalanie Wiek 3 dzień Od 1 tygodnia Od 10 dnia Między 6-17 dniem 4-6 tygodni 3 tygodnie Źródło: [5] Nowonarodzone szczenię wykazuje najczęściej ograniczoną, niepełnąodpowiedźorganizmu na czynniki chorobowe a występujące u niego objawy kliniczne rzadko wskazują na konkretną jednostkę chorobową. W celu prawidłowego zinterpretowania wyników badania klinicznego, ważna jest wiedza, co jest normą dla szczenięcia w danym wieku. Lekarz weterynarii powinien postępować w myśl zasady iż noworodek to niemały dorosły. Stopniowo wzrastająca temperatura w pierwszych tygodniach życia, przekrwienie błon śluzowych do 7 dnia życia, neonetalna leukocytoza, anemia, glikozuria poniżej 7 tygodnia życia to jedne z wielu fizjologicznych stanów, które nie wskazują na objawy chorobowy lub zaburzeń u psiego noworodka. 172 Szczenięta podczas pierwszych tygodni życia: problemy pediatryczne u psów 4. Najczęściej spotykane problemy pediatryczne oraz terapia 4.1. Małe zdolności termoregulacyjne Nowonarodzone szczenię ma temperaturę ciała wynosząca 35-36,5C. Dreszcze i skurcz naczyń w celu podtrzymania ciepła nie występują w pierwszych dniach życia. Brązowy tłuszcz obecny u noworodka jest zużywany w termogenezie bezrdzeniowej. Dreszcze pojawiają się u noworodka od 6 dnia życia, natomiast dyszenie występuje u przegrzanych nowonarodzonych szczeniąt [6]. W 2 i 3 tygodniu życia temperatura u zdrowego szczenięcia wynosi 36-38C, a po odsadzeniu temperatura rektalna prawie zrównuje się z temperaturą u dorosłych psów [6]. Anormalnie niska temperatura u szczenięcia czyli 35C predysponuje do zaburzeń ssania, odwodnienia, spadku motoryki jelit i następującej atonii lub porażenia, wzrasta także podatność na zakażenia herpeswirusowe lub bakteryjne. Spadkowi temperatury towarzyszy spadek częstotliwości pracy serca (temperatura 21,1C – 40-50 uderzeń/minutę). Jeśli stan ten utrzymuje się dłużej to obniża się również częstotliwość oddechów, co może prowadzić do niewydolności krążeniowo-oddechowej. Większość noworodków w tym stanie umiera. U szczeniąt z hipotermią wskazane jest powolne ogrzewanie w temperaturze 28-30C za pomocą butelek z ciepłą wodą owiniętymi w ręcznik. Dużym błędem popełnianym przez hodowców jest zapewnienie ciepła bez pozostawienia szczenieniu możliwości przemieszczenia się do nieprzegrzanego miejsca. U takich zwierząt występuje zwiększone ryzyko zgonu po zbyt długiej ekspozycji na wysokie temperatury otoczenia. Pomiar ciepłoty ciepła w prostnicy wskazuje zwykle na 39-40C ponieważ noworodek w tym wieku nie ma zdolności regulowania temperatury ciała. Przegrzane szczenięwokalizuje i próbuje wyczołgać się z kojca. Przeniesienie zwierzęcia do temperatury pokojowej prowadzi do ustąpienia objawów i zaprzestania wokalizacji. W przypadku znacznej hipotermii można podawać płyny ogrzane do temperatury 35-37C dożylnie lub doszpikowo. Ze względu na duże ryzyko zachłystowego zapalenia płuc nie należy szczeniętom poddawać płynów doustnie. 4.2. Hipoglikemia Kliniczne objawy hipoglikemii u szczeniąt pojawiają się gdy poziom cukru we krwi spada poniżej 40 mg/dl. Hipoglikemia u noworodków (najczęściej u ras typu toy) może być spowodowana rozmaitymi przyczynami – hipotermią, posocznicą, głodzeniem, toksycznym mlekiem lub kombinacjami tych czynników [7]. Jest to często spotykany problem 173 Blanka Bukowska u szczeniąt osieroconych lub chorych. Wynika najczęściej z nie w pełni rozwiniętego funkcjonowania wątroby oraz szybkiego zużywania zapasów glukozy. Noworodki rodzą się z małymi zapasami glikogenu w wątrobie i małą aktywnością enzymów wykorzystywanych w procesie glukoneogenezy, małą masą mięśniową i tkanki tłuszczowej oraz ograniczoną możliwością wykorzystania wolnych kwasów tłuszczowych jako źródła energii, co niewątpliwie przyczynia się do ryzyka wystąpienia hipoglikemii. Nowonarodzone szczenięta cierpiące na hipoglikemie znajdują się pod wpływem olbrzymiego stresu, wykazują zaburzenia funkcji układu pokarmowego, w wyniku czego są wychudzone, maja biegunkę i wymiotują. Inne objawy to apatia, niechęć do ssania, otępienie, drgawki i drżenia, czasami występuje pobudzenie, wokalizują (piszczą), intensywne łaknienie oraz utrata przytomności [7]. Terapia obejmuje zastosowanie powolnego dożylnego wlewu glukozy 0,5-1,0 g/kg jako 5-10% roztworu glukozy w płynie Ringera lub soli fizjologicznej [7]. Należy unikać podawania większej ilości glukozy dożylnie z powodu możliwości wywołania zapalenia żył. Większe stężenie glukozy powinno być podawane bezpośrednio na błony śluzowe jamy ustnej [8]. Nie należy podawać hipertonicznego roztworu dekstrozy w formie podskórnej, ponieważ może dojść do martwicy tkanek w miejscu iniekcji. 4.3. Odwodnienie Mocz noworodka jest zazwyczaj bezbarwny, a jego żółte zabarwienie świadczy o odwodnieniu organizmu [6]. Oseski są również wrażliwe na przeciążenie ustroju nadmierną ilością płynów podawanych w krótkim odstępie czasowym, dlatego terapię zastępczą płynami należy przeprowadzać bardzo ostrożnie [9]. Jeśli odwodnienie jest nieznaczne, temperatura ciała prawidłowa i nie występują zaburzenia żołądkowojelitowe, można podać doustnie lub podskórnie płyny. Przy odwodnieniu umiarkowanym do silnego, najskuteczniejsza jest płynoterapia dożylna. Płyny podawane podskórnie wchłaniają się powoli, przez co nie obciążają homeostazy organizmu. Kolejna drogą wykorzystywaną w celu nawodnienia oseska jest dootrzewnowe podawanie płynów. Płyny podawane tą drogą wchłaniają się wolno i sposób ten nie nadaje się do długotrwałego nawodniania. Przy podaniu płynów dożylnie lekarz weterynarii ma do dyspozycji żyłę szyjną lub odpromieniową u oseska. Przy wkłuciu się należy zachować zasady aseptyki z uwagi na niedojrzały układ immunologiczny u szczenięcia oraz ryzyko zakażenia. W przypadku utrudnionego dostępu do żyły, należy pomyśleć o alternatywnej drodze podania płynów. Dostęp do szpikowy przy wykorzystaniu dołu kretarzowego 174 Szczenięta podczas pierwszych tygodni życia: problemy pediatryczne u psów kości udowej jest najlepszą alternatywą dla dostępu dożylnego. Tą drogą można podawać krew, płyny oraz leki. Należy stosować płyny chłodne. Zbyt duża ilość podana w zbyt krótkim czasie może wywołać ból. Wśród komplikacji iniekcji do szpikowych należy wymienić infekcje, wydostawanie się płynów poza miejsce iniekcji oraz urazy. Zapotrzebowanie na płyny u szczeniąt zapewniające utrzymanie prawidłowych funkcji życiowych, wynosi 80-100ml/kg/dzień. Można stosować roztwór 5% glukozy z płynem Ringera w proporcji 1:1 [8]. Płyny należy podawać dożylnie z szybkością 3-4 ml/kg/godz [8]. 4.4. Zespół toksycznego mleka U szczeniąt do 21 dnia życia może wystąpić zespół toksycznego mleka, wywołujący biegunkę, najczęściej obserwowaną między 3-14 dniem po porodzie. Zakażenie subkliniczne macicy suki najczęściej prowadzi do wchłaniania toksycznych produktów i wydzielania ich z mlekiem. Szczenięta dotknięte tym schorzeniem wykazują biegunkę, kolkę gazową oraz często obrzęk odbytu. Odsadzenie szczenięcia prowadzi do ustąpienia objawów. Przez następne 12-24 godziny podajemy jedynie ciepły płyn fizjologiczny, następnie preparat mleko zastępczy. Celowe jest sztuczne dokarmianie przez następne dni (do czasu ponownego zbadania i wyleczenia suki). 4.5. Niezakaźna biegunka noworodków Przekarmienie lub nieprawidłowy skład preparatów mleko zastępczych (np. domowej produkcji) mogą prowadzić do rozwinięcia się biegunki u szczeniaka. W obu przypadkach dochodzi do przekroczenia wydajności enzymów trawiennych, zakwaszenia jelit oraz zwiększenia produkcji żółci. Kał wykazuje zmianę barwy : od zielonej (żółć) przez szary do białego (kiedy nie pozostały żadne enzymy trawienne). Niestrawione mleko jest pożywką dla bakterii, co stanowi podstawę dla rozwoju wtórnej infekcji bakteryjnej. Na początku zalecane jest leczenie objawowe. Terapia polega na ostawieniu pokarmu, rehydratacji (5% glukoza z płynem Ringera s.c., 5-10% glukoza per os) i stosowaniu antybiotyków. Do picia można podawać rozcieńczoną herbatę. Po ustąpieniu objawów należy ograniczyć ilość pokarmu lub go zmienić [10]. 4.6. Choroby infekcyjne Najczęstsza przyczyna są infekcje bakteryjne. Do często spotykanych patogenów należą : E.coli, paciorkowce (S.canis) i gronkowce (S.aureus i S. pseudointermdius), Klebsiella sp., Psudomonas sp.oraz beztlenowce. 175 Blanka Bukowska Szczepy gronkowców od chorych szczeniąt izolowane są głównie z mleka i pochwy ich matek. U szczeniąt padłych z powodu posocznicy, te same szczepy są izolowane podczas sekcji zwłok z narządów wewnętrznych, z próbek mleka, kału i z pochwy ich matki. Postacie kliniczne obejmują miejscowe infekcje skóry, płuc, oczu i innych narządów. Stany posocznicowe najczęściej przebiegają z nagłąśmiercią. Przeciwciała przekazane biernie przez matkę chronią szczenięta przed powszechnie występującymi wirusami. Jeśli suka nie nabyła odporności przeciwko nim, także nowo narodzone szczenięta mogą cierpieć z powodu zakażeń parwowirusem lub nosówką. Infekcje herpeswirusem psim są uważane za częstą przyczynę strat nowonarodzonych szczeniąt. W zakażeniach tych szczenięta zwykle padają przed osiągnięciem 3 tygodnia. Możliwe jest szczepienie (dwa razy w ciągu ciąży) w celu ochrony szczeniąt za pomocą przeciwciał. Terapia farmakologiczna u oseska uzależniona jest od kliku czynników, które wpływają na wchłanianie leków, dystrybucję, wiązanie oraz metabolizm. Iniekcje dożylne są korzystniejsze niż droga podskórna czy domięśniowa. Większość leków nie była testowana na nowonarodzonych szczeniętach, stąddawkowanie i częstotliwość podania opiera się na własnych doświadczeniach i obserwacjach. Zwykle dawkidla dorosłych osobników zmniejszane są o 30-50% lub zwiększa się przerwy pomiędzy kolejnymi dawkami. U młodych szczeniąt należy unikać stosowania pewnych antybiotyków takich jak aminoglikozydy, chloramfenikol, tetracykliny oraz potencjalizowane sulfonamidy. Antybiotykami zalecanymi są chinolony oraz antybiotyki beta-laktamowe. W wieku 10 dni u szczeniąt można znaleźć pierwsze glisty. Infekcje Trichomonasfetusnie są rzadkie, ale często przechodzą niezdiagnozowane. U kociąt jak i szczeniąt występuje nawracająca, ostra, wodnista biegunka, z typowym wyglądem kału oraz żywymi stadiami pasożyta widocznymi pod mikroskopem, w świeżych, natywnych próbkach. Terapia ronidazolem jest leczeniem z wyboru. Można spróbować leczenia metronidazolem, jednakże oba leki mają wiele efektów ubocznych w tak młodym wieku [11]. 4.7. Wady wrodzone Choroby wrodzone to takie, które – widoczne lub nie – obecne są w chwili narodzin. Mogą być one tła genetycznego albo są spowodowane czynnikami teratogennymi, w niektórych przypadkach także fenokopiami [11]. Choroby wrodzone dotyczą około 1-2% nowo narodzonych szczeniąt. Zaburzenia te manifestują się urodzeniem martwych, zdeformowanych płodów wymagających szybkiego uśpienia zaraz po urodzeniu [12]. Anomalie typu mikroanatomicznego lub biochemicznego zazwyczaj prze- 176 Szczenięta podczas pierwszych tygodni życia: problemy pediatryczne u psów chodzą niezauważone i kryją się za szczeniętami martwo urodzonymi, słabnącymi lub niewyjaśnionymi przyczynami padnięć. Niektóre anomalie mózgu, serca lub układu oddechowego mogą powodować natychmiastowe zagrożenie życia, podczas gdy inne wady pozostają niezauważone przez różnie długi czas, w zależności od ich umiejscowienia. Występowanie patognomicznych objawów – typowych oznak, na podstawie których można podejrzewać lub zdiagnozować chorobę – pomaga w niektórych przypadkach rozpoznać problem. W innych przypadkach RTG, ultrasonografia, endoskopia lub badania krwi mogą pomóc w zdiagnozowaniu zaburzeń i określeniu rokowania. Niektóre wady wewnętrzne mogą zostać wykryte przypadkowo ( np. podczas operacji lub sekcji). W praktyce większość wad wrodzonych jest nie do przewidzenia i nie do uniknięcia, dlatego są one odpowiedzialne za dużą część upadków lub eutanazji szczeniąt. Szacunkowa liczba niezgłaszanych przypadków jest prawdopodobnie o wiele większa niż odsetek podawany w piśmiennictwie, zwłaszcza odnośnie wad wewnętrznych. 5. Podsumowanie Odsetek okołoporodowych chorób i upadków szczeniąt – z pominięciem martwo urodzonych i innych strat porodowych – jest najwyższy w pierwszych dniach życia. Czynniki takie jak niedotlenienie podczas porodu, małe zdolności termoregulacyjne, hipoglikemia, odwodnienie, zespół toksycznego mleka, wady i deformacje na tle czynników genetycznych oraz teratogennych, czynniki środowiskowe oraz czynniki zakaźne predysponują szczenięta do wystąpienia stanów zagrożenia życia. Pierwszym zadaniem lekarza weterynarii jest ustalenie przyczyny choroby, drugim wybranie odpowiedniego algorytmu postępowania, a trzecim przeszkolenie hodowcy (właściciela) odnośnie samodzielnej opieki nad szczenięciem lub miotem [11]. 177 Blanka Bukowska Literatura 1. Mila H., Chastant-Maillard S. The first two days of life of puppies : crucial steps for survival,17th EVSSAR CONGRESS – Reproduction and Pediatric in Dogs, Cats and Exotics., 1 (2014), pp 127 2. Bielas W. Pozorna śmierć noworodkówRozród Zwierząt, red. A.Dubiel, Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Wrocławiu, Wrocław 2010, pp 459-460 3. Niżański W. Opieka lekarska nad suką hodowlaną (przeznaczoną do rozrodu) Rozród Zwierząt, red. A.Dubiel, Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Wrocławiu, Wrocław 2010, pp 379 4. Evermann J.F., Wills T. Immunologic developmental and immunization Small animal peadiatrics, red. M.E. Peterson, M.S. i M. Kutzler, Wydawnictwo Elsevier, WB Saunders Comp 2011, rozdział 8 5. Little S. Osierocone kocięta, Veterinaryfocus, 16(2006), pp3 6. Root- Kustritz M.V. History and physical examination of the neonate Small animal peadiatrics, red. M.E. Peterson, M.S. i M. Kutzler, Wydawnictwo Elsevier, WB Saunders Comp 2011, rozdział 3 7. Fitzgerald K.T., Newquist K.L Husbandry of the neonate neonateSmall animal peadiatrics, red. M.E. Peterson, M.S. i M. Kutzler, Wydawnictwo Elsevier, WB Saunders Comp 2011, rozdział 6 8. Casal M. Managment and critical care of the neonate Manual of canine and feline reproductiion and neonatology, red. G.C. England, Wydawnictwo Heimendhal 2010, rozdział 15 9. Bielas W., Siemieniuch M. Neontologia szczeniąt i kociąt, cz I, Weterynaria w Praktyce , 6 (2005) pp 8-16 10. Zduńczyk S., Janowski T. Zapalenie jelit (biegunka) Zaburzenia rozrodu psów i kotów, Wydawnictwo Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie, Olsztyn 2010, pp79 11. Muennich A. Problemy pediatryczne u psów : noworodek to nie mały dorosły, Sympozjum Problemy w rozrodzie psów i kotów (płodność, ciąża noworodek), 1(2013), pp 120-121 12. Bielas W. Wady wrodzone Rozród Zwierząt, red. A.Dubiel, Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Wrocławiu, Wrocław 2010, pp 445-449 Puppies during the first weeks of life: the pathological newborn in dogs The neonatal period is defined as the period from birth through 3 weeks of age, or when the puppy is walking and capable of spontaneous urination and defecation. Proper careexercised by thebreederandveterinarian of puppies determines the future health and reproductive performance of the adult animals. In the early neonatal period recorded the highest mortality in the kittens and puppies, therefore, this period should be covered by the watchful supervision. This paper presents important data and information concerning paediatric problems in dogs during consecutive stages of puppy development. 178 Agata Pawłowska1, Joanna Kwiczak2, Donata Pluskota-Karwatka3 Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej Znaczenie aminofosfonianów w syntezie wynika z faktu ich strukturalnego podobieństwa do aminokwasów oraz obecności w cząsteczkach atomów fosforu. Modyfikacja budowy aminofosfonianów, poprzez wprowadzenie dodatkowych grup funkcyjnych, np. zawierających atom fluoru, może wpłynąć na zmianę właściwości fizyko-chemicznych oraz ewentualnej aktywności biologicznej tej grupy związków. Wśród aminofosfonianów można wyróżnić związki charakteryzujące się właściwościami przeciwnowotworowymi przeciwgrzybiczymi, przeciwwirusowymi czy owadobójczymi, co sprawia, żezwiązki te mogą znaleźć zastosowanie w farmacji, w medycynie jak również w rolnictwie. 1. Wprowadzenie Aminofosfoniany stanowią analogi aminokwasów, w których grupa karboksylowa została zastąpiona zestryfikowaną resztą kwasu fosforowego (V) (rys. 1). Pierwsza wzmianka dotycząca aminofosfonianów pochodzi z 1940r. i znajduje się w pracach opisujących syntezę kwasu aminometanofosfonowego [1]. Minęło jednak jeszczedwadzieścia lat zanim rozpoczęto intensywne i bardziej regularne badania z udziałem aminofosfonianów. Przyczyniło się do tego odkrycie kwasu 2-aminoetanofosfonowego, związku, który w znacznych ilościach występuje w organizmie człowieka. Obecnie aminofosfoniany stały się przedmiotem badań naukowców na całym świecie [2]. Znaczenie biologiczne tej grupy związków wynika nie tylko z podobieństwa budowy ich cząsteczek do cząsteczek istotnych dla życia aminokwasów, ale także z posiadania w swojej strukturze atomu fosforu. Makroelement ten wchodzi bowiem w skład równie ważnych biomolekuł takich jak kwasy nukleinowe; RNA i DNA, fosfolipidy oraz ATP. Ze względu na charakteryzującą je aktywność biologiczną aminofosfoniany znajdują zastosowanie w medycynie i rolnictwie, mogą także pełnić ważne funkcje w organizmach żywych, między innymi mogą być inhibitorami różnej klasy enzymów. 1 [email protected], Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu 2 [email protected], Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu 3 [email protected], Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu 179 Agata Pawłowska, Joanna Kwiczak, Donata Pluskota-Karwatka Rys. 1. Struktury aminofosfonianów 2. Znaczenie biologiczne aminofosfonianów Szerokie spektrum właściwości i potencjalna aktywność biologiczna sprawia, że aminofosfoniany mogą mieć zastosowanie zarówno w medycynie i farmacji, jak i w rolnictwie. Wśród aminofosfonianów można znaleźć związki charakteryzujące się właściwościami przeciwnowotworowymi, przeciwzapalnymi, przeciwbakteryjnymi, przeciwwirusowymi, przeciwgrzybiczymi czy też owadobójczymi. Ponadto aminofosfoniany mogą być stosowane jako substancje przeciwzakrzepowe, przeciwnadciśnieniowe, chwastobójcze oraz antykorozyjne [3-14]. Aminofosfoniany stanowią także grupę związków będących potencjalnymi inhibitorami enzymów. Tego rodzaju aktywność przypisuje się szczególnie pochodnym zawierającym w swojej strukturze atom fluoru. Przykładem takich związków mogą być inhibitory: fosforylazy pirymidynowej, esterazy serynowej, sfingomielinazy oraz dipeptydazy serynowej [3-14] (rys.2). Rys. 2. Fluorowane aminofosfoniany jako inhibitory enzymów 180 Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej 3. Fosfonopeptydy Aminofosfoniany mogą być wykorzystywane jako jednostki strukturalne w analogach peptydów – w fosfonopeptydach. Fosfonopeptydy są to związki, w których wiązanie peptydowe zostało zastąpione ugrupowaniem fosfonianowym (rys. 3) [15]. Rys. 3. Struktura dipeptydu i fosfonopeptydu Fosfonopeptydy można otrzymać w trójetapowym procesie. Etap I to reakcja pomiędzy kwasem fosfinowym a trietoksymetanem. W etapie II fosfinian etylu reaguje z odpowiednią iminą, a etap III polegający na addycji Michaela prowadzi do utworzenia produktu końcowego (Schemat 1) [15]. Schemat 1. Otrzymywanie fosfonopeptydów 4. Fluorowane aminofosfoniany Jedną z możliwości modyfikowaniem aminofosfonianów jest wprowadzenie do ich cząsteczek atomu fluoru bądź grup fluoroalkilowych. Taka modyfikacja może znaleźć odzwierciedlenie w zmianie właściwości chemicznych i fizycznych, a w konsekwencji również potencjalnej aktywności biologicznej aminofosfonianów. Obecność atomu fluoru przyczynia się bowiem do zmiany kwasowości grup funkcyjnych sąsiadu-jących z tym 181 Agata Pawłowska, Joanna Kwiczak, Donata Pluskota-Karwatka atomem, a wiązania C-F, charakteryzującego się wysoką energią dysocjacji oraz niską polaryzowalnością sprawia, że cząsteczki odznaczają się wzrostem trwałości na proteolityczną degradację. Ponadto obecność grup fluoroalkilowych lub atomów fluoru poprawia lipofilowość związków o znaczeniu biologicznym [11, 12] oraz umożliwia utworzenie wiązania wodorowego pomiędzy dwiema cząsteczkami C-F...H-X. Przykłady fluorowanych aminofosfonianów przedstawia rys. 4 [14]. Rys. 4. Przykłady fluorowanych aminofosfonianów 5. Metody syntezy aminofosfonianów Aminofosfoniany można otrzymać na drodze różnych reakcji, stosując jako substraty szereg związków chemicznych, np. iminy, enaminy, estry, nitryle, oksymy. Poniżej przedstawiono metody wykorzystywane najczęściej. 5.1. Redukcja imin W reakcjach z użyciemimin aminofosfoniany uzyskuje się w dwóch etapach. Etap pierwszy polega na reakcji odpowiedniej aminy ze związkiem karbonylowym. W drugim etapie uzyskana imina reaguje z kwasem dialkilofosfonowym lub dialkilofosfiną tworząc jako produkt końcowy pochodnąaminofosfonianową (Schemat 2). Schemat 2. Dwuetapowa synteza aminofosfonianów oparta na redukcji imin Mechanizm pierwszego etapu polega na nukleofilowym ataku wolnej pary elektronowej atomu azotu na karbonylowy atom tlenu, po którymma miejsce eliminacja cząsteczki wody. Następnie, w wyniku addycji fosfiny (lub kwasu fosfonowego) do wiązania podwójnego iminy otrzymuje się odpowiedni aminofosfonian (Schemat 3). 182 Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej Schemat 3. Mechanizm etapu tworzenia iminy W 1970 r. Roman Tyka zaproponował metodę syntezy fenylometyloaminy opartą na reakcjach z prostymi aldehydami takimi jak: aldehyd octowy, propionowy czy benzaldehyd [16]. Wydajność tych reakcji nie przekraczała jednak 70%. W kolejnych latach wiele grup badawczych zaczęło więc prowadzić prace, których celem była optymalizacja warunków reakcji. Jako substraty wykorzystywano różne aminy oraz związki karbonylowe (aldehydy i ketony), (tab. 1) [17-19]. Tabela 1. Substraty wykorzystywane do syntezy aminofosfonianów Amina Związek karbonylowy Pierwszą metodę syntezy aminofosfonianów opracowali w 1952 r. Kabachnik i Fields. Bazując na reakcji Streckera, zaproponowali trójskładnikową syntezę ze związku karbonylowego, aminy i kwasu dialkilofosfonowego. Mechanizm reakcji ściśle zależy od zasadowości aminy; aminy słabo zasadowe faworyzują tworzenie się iminy (Schemat 4) [19]. 183 Agata Pawłowska, Joanna Kwiczak, Donata Pluskota-Karwatka Schemat 4. Reakcja Kabachnika-Fields’a z zastosowaniem aminy aromatycznej Reakcja Kabachnika-Fieldsa stała się bardzo użyteczna, szczególnie w odniesieniu do syntezy 1-aminoalkanofosfonianów, które stanowią substraty w syntezie fosfonopeptydów [2]. Z tego powodu opracowano wiele modyfikacji pierwotnej procedury Kabachnika-Fields’a. Udowodniono, że zarówno kwas, jak i zasada działa w reakcji jakkatalizator. Zastosowanie kwasów Lewisa takich jak BF3*OEt [20], Yb(OTf)3 (rys. 5.) [21], Sc(OTf)3 [22], Mg(ClO4)2 [23], ZrCl4 [24] zwiększa wydajność reakcji oraz umożliwia przeprowadzenie syntezy w łagodniejszych warunkach. Rys. 5. Jeden z katalizatorów zmodyfikowanej reakcji Kabachnika-Fieldsa Z czasem wykazano, że wymienione wyżej katalizatory posiadają szereg wad. BF3*OEt jest wrażliwy na działanie wody; a ponieważ podczas tworzenia iminy następuje eliminacja cząsteczki wody, niemożliwa stała się regeneracja katalizatora. Stosowanie soli metali ciężkich wiąże się z koniecznością ich utylizacji, nadchlorany są wybuchowe, a z kolei związki metali ziem rzadkich bardzo kosztowne. Niezbędnym okazało się więc zastosowanie katalizatorów bardziej przyjaznych dla środowiska, które rozwiązywałyby wspomniane problemy. Obecnie w literaturze znaleźć można wiele metod syntezy strukturalnych analogów aminokwasów z zastosowaniem bezrozpuszczalnikowych warunków reakcji, wykorzystujących mniej toksyczne katalizatory. Zapewnia to łagodniejsze warunki i krótszy czas reakcji. Warto wymienić katalizatory takie jak: Me2S+Br Br[25], [Cp2Zr(OSO2C4F9)2 2H2O] [26], KAl(SO4)2 12H2O [27], charakteryzujące się odpornością na działanie wody i powietrza oraz trwałością termiczną. Ponadto zastosowanie nanocząsteczek, np. Fe3O4 [28], CoFe2O4 (Schemat 5) [29] również okazało się bardzo dobrym rozwiązaniem, ze względu na możliwość ich wielokrotnego użycia w reakcjach bez znacznego spadku właściwości katalitycznych. 184 Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej Schemat 5. Synteza aminofosfonianów z użyciem jako katalizatora CoFe2O4 5.2. Zastosowanie pochodnych enaminowych Enaminy są obok imin, równie istotnymi związkami w syntezie aminofosfonianów. W metodach opartych na wykorzystaniu pochodnych enaminowych stosuje się między innymi pochodne kwasów karboksylowych: nitryle oraz estry. W reakcji fluoroalkiloestru z dietyloalkilofosfonianem powstaje pochodna ketofosfonianowa, która może reagować z amoniakiem, octanem amonu lub N-trimetylosililofosfazanem prowadząc do utworzenia β-enaminofosfonianu. Następnie związek ten może być poddany katalitycznemu uwodornieniu lub redukcji przy użyciu chlorku cynku i borowodorocyjanianu sodu (Schemat 6) [13, 30]. Schemat 6. Synteza β-aminofosfonianów oparta na enaminach 185 Agata Pawłowska, Joanna Kwiczak, Donata Pluskota-Karwatka 5.3. Redukcja oksymów 5.3.1. Otrzymywanie α-aminofosfonianów Aminofosfoniany można również otrzymać w reakcji przebiegającej z udziałem oksymów. Ogólny schemat syntezy przedstawia się następująco: 1-oksoalkanofosfonian (ester kwasu α-ketofosfonowego) tworzący się w reakcji pomiędzy chlorkiem kwasowym a trialkilofosfiną [31] lub kwasem dialkilofosfonowym [32] reaguje z hydroksyloaminą prowadząc do powstania dialkilo-1-hydroksyiminoalkenofosfonianu. Utworzony oksym redukowany jest do odpowiedniego aminofosfonianu (Schemat 7) [32-34]. Schemat 7. Wykorzystanie oksymów w syntezie α-aminofosfonianów Redukcja oksymu może być przeprowadzona przy użyciu następujących czynników: pył cynkowy w kwasie mrówkowym, amalgamat glinu w bezwodnym eterze lub etanolu oraz układ cynk-miedź w ciepłym etanolu. Może zachodzić również na skutek katalitycznego uwodornienia nad niklem Raney’a w etanolu, metanolu lub ciekłym amoniaku oraz poprzez zastosowanie katalitycznego uwodornienia nad 5% Pd/C w kwasie octowym lub metanolu [32-34]. Utworzenie aminofosfonianu przez redukcję oksymu może nastąpić takżepod wpływem takiego czynnika redukującego jakim jest układborowodorocyjanian sodu/chlorek tytanu (III) [32]. W przypadku zastosowania do redukcji mieszaniny borowodorku litu i chlorku trimetylosililowegow bezwodnym tetrahydrofuranie, istotną rolę odgrywa utworzenie czynnika redukującego, którym jest kompleks boranTHF (Schemat 8). Przy użyciu tego kompleksu redukcja oksymu do aminofosfonianu przebiega w temperaturze pokojowej oraz pod ciśnieniem atmosferycznym [34]. Schemat 8. Tworzenie czynnika redukującego oksym do aminofosfonianu 186 Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej 5.3.2. Otrzymywanie β-aminofosfonianu β-aminofosfoniany otrzymuje się w sposób analogiczny, jak α-aminofosfoniany. Można wyróżnić trzy etapy syntezy: utworzenie odpowiedniego β-ketofosfonianu, reakcję z hydroksyloaminą prowadzącą do otrzymania β-ketoksymu oraz redukcję utworzonego oksymu do odpowiedniego β-aminofosfonianu (Schemat 9) [13]. Schemat 9. Synteza β-aminofosfonianów 5.4. Synteza aminofosfonianów z wykorzystaniem nitronów i azyrydyn Substratami w syntezie strukturalnych analogów aminokwasów mogą być także azyrydyny, które charakteryzują się znaczną reaktywnością ze względu na silnie naprężony, trójczłonowy pierścień. Jedną z możliwości otwarcia tego pierścienia jest reakcja azyrydyny z anionem utworzonym w wyniku deprotonacjidifluorometylenofosfonianu przy wykorzystaniu diizopropyloamidku litu w układzie tetrahydrofuran/heksametylofosforotriamid (Schemat 10) [13]. 187 Agata Pawłowska, Joanna Kwiczak, Donata Pluskota-Karwatka Schemat 10. Wykorzystanie azyrydyn w syntezie aminofosfonianów Zastosowanie różnych reagentów do otwarcia pierścienia azyrydynowego umożliwia otrzymanie szerokiej gamy związków, np. bisfosfonianów, aminofosfonianów zawierających grupy fluorowe, a także dialkilofosfonianów (Schemat 11) [15]. Schemat 11. Azyrydyny jako substraty w syntezie aminofosfonianów 188 Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej W syntezie aminofosfonianów coraz większą uwagę zyskują nitrony, czyli związki zawierające w swojej strukturze ugrupowanie R 1R2C=NR+O-. Odgrywają one istotną rolę ze względu na możliwość otrzymania α-aminofosfonianów lub α-(hydroksyamino)fosfonianów na drodze stereoselektywnej syntezy. W wyniku reakcji pomiędzy nitronem a kwasem dialkilofosfonowym lub trialkilofosfiną uzyskuje się odpowiednią pochodną α-(hydroksyamino)fosfonianu, która w kolejnym etapie, w reakcji z Zn/Cu(OAc)2 ulega przekształceniu w α-aminofosfonian (Schemat 12) [15]. Schemat 12. Synteza aminofosfonianów z zastosowaniem nitronów 6. Zastosowanie łaźni ultradźwiękowej i promieniowania mikrofalowego W nowoczesnej syntezie organicznej coraz częściej wykorzystuje się fale ultradźwiękowe. Stanowią one alternatywne źródło energii, jakiej w sposób klasyczny dostarcza ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej. Ultradźwięki znalazły również zastosowanie w syntezie analogów aminokwasów. Opracowano metodę „one-pot synthesis”, która polega na przeprowadzeniu syntezy w jednym naczyniu reakcyjnym. Najczęściej stosuje się warunki bezrozpuszczalnikowe, a reakcja jest trójskładnikowa. Kondensacji ulega związek karbonylowy, amina oraz dietylofosfina, a produkt uzyskuje się z bardzo wysoką wydajnością sięgającą 99%. Wykorzystanie łaźni ultradźwiękowej powoduje skrócenie czasu reakcji z kilku godzin to kilku lub kilkudziesięciu sekund. Wszystkie wymienione aspekty przyczyniają się do tego, że synteza aminofosfonianów jest przyjazna dla środowiska i zgodna z zasadami zielonej chemii. Jedna z grup badawczych zastosowała tlenki metali jako katalizatory(tab. 2). Najlepszą zdolność katalityczną wykazują nanocząstki tlenku ceru, charakteryzujące się łatwością odzysku, selektywnością oraz brakiem toksycznego działania [35]. Tabela 2. Tlenki metali stosowane jako katalizatory w syntezie aminofosfonianów Wydajność [%] 67 80 72 99 Tlenek metalu SiO2 TiO2 ZnO nanocząstki CeO2 189 Agata Pawłowska, Joanna Kwiczak, Donata Pluskota-Karwatka Innym stosowanym katalizatorem jest tani i nietoksyczny chlorek tiaminy (rys. 6.). Reakcja z jego udziałem prowadzona jest w środowisku wodnym, a jej wydajność wynosi 95% [36]. Rys. 6. Struktura chlorku tiaminy Użycie promieniowania mikrofalowego w syntezie aminofosfonianów stało się kolejną wydajną i przyjazną środowisku metodą. Metoda tą zsyntezowano analogi aminokwasów zarówno z alifatycznych jak i aromatycznych amin oraz różnych związków karbonylowych. Interesującym rozwiązaniem okazało się wykorzystanie promieniowania mikrofalowego do syntezy na podłożu stałym w warunkach bezrozpuszczalnikowych. Reakcję prowadzono przy udziale tlenku glinu Al2O3, przez sześć minut. Wydajność osiągnęła 95% (Schemat 13) [37]. Schemat 13. Synteza aminofosfonianu na podłożu stałym z użyciem promieniowania mikrofalowego 7. Podsumowanie Liczne zastosowanie aminofosfonianów w różnych gałęziach przemysłu sprawia, że coraz więcej grup badawczych na całym świecie zainteresowanych jest syntezą różnorodnych struktur aminofosfonianów charakteryzujących się potencjalną aktywnością biologiczną. Zainteresowanie to powoduje, iż metody otrzymywania strukturalnych analogów aminokwasów są od kilku dekad intensywnie rozwijane i udoskonalane. Oprócz typowych syntez bazujących na klasycznym ogrzewaniu pod chłodnicą zwrotną, istotne znaczenie zyskuje zastosowanie promieniowania mikrofalowego oraz fal ultradźwiękowych. Podziękowania Badania finansowane z projektu POKL.04.01.01-00-049/13. 190 Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Hilderbrand R., Curley-Joseph J., Lubansky H., Henderson T. (1983) Topics in Phosphorus Chemistry, Vol. 11, 297-338 Kafarski P., Zoń J. (2000) Synthesis of α-aminoalkanephosphonic and αaminophosphinic acids, Aminophosphonic and Aminophosphinic Acids, 33-102 Qian Ch., Huang T. (1998) One-pot synthesis of α-aminophosphonates from aldehydes using lanthanide triflate as a catalyst, Journal of Organic Chemistry, 63, 4125-4128 Chung S.-K., Kang D.-H. (1996) Asymmetric synthesis of α-aminophosponates via diastereoselective addition of phosphite to chiral imine derivatives, Tetrahedron: Asymmetry, 7, 21-24 Cen W., Shen Y. (1995) New synthesis of fluorinated 2-aminophosphonates, Journal of Fluorine Chemistry, 72, 107-110 Rak M., Dżygiel P., Wieczorek P. (2001) Supported liquid membrane extraction of aromatic aminophosphonates, AnalyticaChimicaActa, 433, 227-236 Kozyra K., Brzezińska-Rodak M., Klimek-Ochab Magdalena, Żymańczyk-Duda E. (2013) Biocatalyzed kinetic resolution of racemic mixtures of chiral αaminophosphonic acids, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 91, 32-36 Dar B., Singh A., Sahu A., Patidar P., Chakraborty A., Sharma M., Singh B. (2012) Catalyst and solvent-free, ultrasound promoted rapid protocol for the one-pot synthesis of α-aminophosphonates at room temperature, Tetrahedron Letters, 53, 5497-5502 Dar B.A., Chakraborty A., Sharma P. R., Shrivastava V., Bhowmik A., Vyas D., Bhatti P., Sharma M., Singh B. (2013) Grinding-induced rapid, convenient and solvent free approach for the one pot synthesis of α-aminophosphonates using aluminium pillared interlayered clay catalyst, Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 19, 732-738 Bhattacharya A. K., Raut D. S., Rana K. C., Polanki I. K., Khan M. S., Iram S. (2013) Diversity-oriented synthesis of α-aminophosphonates: a new class of potential anticancer agents, European Journal of Medicinal Chemistry, 66, 146-152 Kaboudin B. (2003) A convenient synthesis of 1-aminophosphonates from 1hydroxyphosphonates, Tetrahedron Letters, 44, 1051-1053 Milen M., Abranyi-Balogh P., Dancso A., Frigyes D., Pongo L., Keglevich G. (2013) T3P®-promoted Kabachnik-Fields reaction: an efficient synthesis of α-aminophosphonates, Tetrahedron Letters, 54, 5430-5433 Turcheniuk K. V., Kukhar V. P., Roschenthaler G.-V., Acena J. L., Soloshonok V. A., Sorochinsky A. E. (2013) Recent advances in the synthesis of fluorinated aminophosphonates and aminophosphonic acids, The Royal Society of Chemistry, 3, 6693-6716 Romanenko V. D., Kukhar V. P. (2006) Fluorinated phosphonates: synthesis and biomedical application, Chemical Reviews, 106, 3868-3935 Kukhar V. P., Romanenko V. D. (2009) Chemistry of aminophosphonic acids and phosphonopeptides, Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic 191 Agata Pawłowska, Joanna Kwiczak, Donata Pluskota-Karwatka 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. Chemistry, Vol. 2-Modified Amino Acids, Organocatalysis and Enzyme,WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 191-262 Tyka R. (1970) Novel synthesis of α-aminophosphonic acids, Tetrahedron Letters, 9, 677-680 Green D., Patel G., Elgendy S., Baban J., Claeson G., Kakkar V., Deadman J. (1994) The synthesis of 1-aminobenzylphosphonic acids from benzylidenediphenylmethylamines, for use as structural units in antithrombotic tripeptides, Tetrahedron, 50, 5099-5108 Soroka M., Zygmunt J., (1988) Tritylamine (triphenylmethylamine) in organic synthesis; The synthesis of N-(triphenylmethyl)alkanimines, 1-(triphenylmethylamino)alkylphosphonic esters, and 1-aminoalkylphosphonic acids and esters, Synthesis, 370-372 Galkin V., Cherkasov R. (1998) The Kabachnik-Fields reaction: synthetic potential and the problem of the mechanism, Russian Chemical Reviews, 67, 857-882 Ha H-J., Nam G-S. (1992) An efficient synthesis of anilinobenzylphosphonates, Synthetic Communications, 22, 1143-1148 Qian Ch., Huang T. (1998) One-pot synthesis of α-aminophosphonates from aldehydes using lanthanide triflate as a catalys, Journal of Organic Chemistry, 63, 4125-4128 Lee S., Park J., Kang J., Lee J. (2001) Lanthanide triflate-catalyzed three component synthesis of α-amino phosphonates in ionic liquids. A catalyst reactivity and reusability study, Chemical Communicatons, 1698-1699 Bhagat S., Chakraborti A. (2007) An extremely efficient three-component reaction of aldehydes/ketones, amines, and phosphites (Kabachnik-Fields reaction) for the synthesis of α-aminophosphonates catalysed by magnesium perchlorate, Journal of Organic Chemistry, 72, 1263-1370 Manjula A., Vittal B., Neelakantan P. (2003) One-pot synthesis of alphaaminophosphonates: an inexpensive approach, Synthetic Communications, 33, 2963-2969 Kudrimoti S., Bommena V. (2005) Bromodimethylsulfonium bromide: an inexpensive reagent for the solvent-free, one-pot synthesis of α-aminophosphonates, Tetrahedron Letters, 46, 1209-1210 Li N., Wang X., Qiu R., Xu X., Chen J., Zhang X., Chen S., Yin S. (2014) Airstable zirconocenebis(perfluorobutanesulfonate) as a highly efficient catalyst for synthesis of α-aminophosphonates via Kabachnik-Fields reaction under solvent-free condition, Catalysis Communications, 43, 184-187 Sonar S., Shelke K., Kakade G., Shingate B., Shingare M. (2009) Alum: an efficient catalyst for one-pot synthesis of α-aminophosphonates,Chin. Chem. Lett.20, 1042-1046 Reddy S., Krishna S., Ganesh A., Kumar N. (2011) Nano Fe3O4 as magnetically recyclable catalyst for the synthesis of α-aminophosphonates in solvent-free conditions, Tetrahedron Letters,52, 1359-1362 Hamadi H., Kooti M., Afshari M., Ghiasifar Z., Adibpour N. (2013) Magnetic nanoparticle supported polyoxometalate: an efficient and reusable catalyst for solvent-free synthesis of α-aminophosphonates, Journal of Molecular Catalysis A: Chemical,373, 25-29 192 Aminofosfoniany we współczesnej syntezie organicznej 30. Palacios F., Ochoa de Retana A. M., Oyarzabal J., Pascual S., Fernandez de Troconiz G. (2008) Synthesis of fluoroalkylated β-aminophosphonates and pyridines from primary β-enaminophosphonates,Journal of Organic Chemistry,73, 4568-4574 31. Krzyżanowska B., Pilichowska S. (1988) Synthesis of O,O-dialkyl 1-aminoalkanephosphonate via N-phosphinylated imines and enamines,Polish Journal of Chemistry, 62, 165 32. Ryglowski A., Kafarski P. (1994) The facile synthesis of dialkyl 1-aminoalkylphosphonates,Synthetic Communications, 24, 2725-2731 33. Kowalik J., Kupczyk-Subotkowska L., Mastalerz P. (1981) Preparation of dialkyl 1-aminoalkanephosphonates by reduction of dialkyl 1-hydroxyiminoalkanephosphonates with zinc in formic acid,Synthesis, 57-58 34. Green D., Patel G., Elgendy S., Baban J. A., Claeson G., Kakkar V. V., Deadman J. (1993) The facile synthesis of O, O-dialkyl 1-aminoalkanephosphonates, Tetrahedron Letters, 34, 6917-6920 35. Agawane S., Nagarkar J. (2011) Nano ceria catalysed synthesis of α-aminophosphonates under ultrasonication,Tetrahedron Letters, 52, 3499-3504 36. Mandhane P., Joshi R., Nagargoje D., Gill C. (2011) Thiamine hydrchloride (VB1): an efficient catalyst for one-pot synthesis of α-aminophosphonates under ultrasonic irradiation, Chinese Chemical Letters,22, 563-566 37. Kaboudin B., Nazari R. (2001) Microwave-assisted synthesis of 1-aminoalkyl phosphonates under solvent-free conditions,Tetradehdron Letters, 42, 8211-8213 Novel synthesis of aminophosphonates The significance of aminophosphonates is arising from their structural similarity to amino acids and from the presence of the phosphorus atom in their structure. Modification of aminophosphonates by various functional groups can lead to changes in their biological activity, as well asin physicochemical properties. Analogues of amino acids can exhibit antiviral, antitumor, antibacterial activity. Therefore, they found application in medicine, pharmacy, and agriculture. 193 Mateusz Niścior1, Katarzyna Tarnawska2, Monika Adamczyk3 Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych Daktyloskopia to bardzo ważna dziedzina kryminalistyki, zajmująca się badaniem śladów linii papilarnych. Dzięki niej możemy zidentyfikować sprawcę przestępstwa czy też określić tożsamość zwłok ludzkich przy których nie znaleziono żadnych dokumentów. Artykuł charakteryzuje w skrócie technikę daktyloskopii, jej początki i dalszy rozwój. Skupiono się również nad charakterystyką samych śladów linii papilarnych, ich właściwościami oraz nad systemem ich identyfikacji. System Henry'ego to jedyny system, który opisuje trzy podstawowe wzory układu linii: pętlę, wir i łuk. Jednak najważniejsze są minucje, czyli zestaw charakterystycznych cech takich jak: początki, haczyki, zakończenia czy oczka. Na ich podstawie można dokonywać identyfikacji osób. Opisano również metody służące ujawnieniu śladów linii papilarnych wykorzystujące optyczne, adsorpcyjne i adhezyjne oraz chemiczne właściwości śladów. Artykuł przedstawia także kilka przykładów chemicznych środków do ujawniania śladów linii papilarnych oraz krótko je charakteryzuje, są to m.in. ninhydryna, kleje cyjanoakrylowe, SPR, czerń amidowa oraz genypina. Środków chemicznych służących do ujawniania linii papilarnych jest bardzo dużo, i wciąż naukowcy tworzą kolejne coraz to lepsze, dokładniejsze substancje, dzięki którym stanie się o wiele łatwiejsze i skuteczniejsze dowiedzenie o popełnieniu czynu karalnego przez sprawcę przestępstwa. 1. Wstęp Daktyloskopię uznaje się za jedną z najważniejszych technik kryminalistyki, której głównym zadaniem jest identyfikacja osoby na podstawie zabezpieczonych na miejscu zdarzenia śladów linii papilarnych, czyli listewek znajdujących się na wewnętrznych powierzchniach palców i dłoni oraz na dolnych powierzchniach stóp. Odciski linii papilarnych stanowią niepodważalny dowód na związek sprawców czynów przestępczych z przedmiotowym zdarzeniem. Wymiar sprawiedliwości wykorzystuje ujawnione i zabezpieczone ślady linii papilarnych do: ustalenia czy pobrane odciski linii papilarnych od osoby podejrzanej o popełnienie określonego czynu są identyczne z pozosta1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Biochemików UMCS, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 2 [email protected] Studenckie Koło Naukowe Biochemików UMCS, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 3 [email protected] Studenckie Koło Naukowe Biochemików UMCS, Wydział Biologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie 194 Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych wionymi na miejscu zdarzenia, określenia tożsamości podejrzanego, a także czy osoba ta była już wcześniej daktyloskopowana w związku z jakimś zdarzeniem i jakie wtedy dane podała o sobie. Technika ta umożliwia również identyfikację osób, które ze względu na stan zdrowia nie są w stanie podać swoich danych, oraz pozwala określić tożsamość ludzkich zwłok, przy których nie znaleziono żadnych dokumentów, pod warunkiem, że osoba ta była kiedyś daktyloskopowana. W kryminalistyce daktyloskopia uważana jest za najskuteczniejsze i co bardzo ważne, dość tanie narzędzie w walce z przestępczością, ze względu na możliwość bezpośredniej i indywidualnej identyfikacji człowieka [1]. Celem niniejszej pracy było scharakteryzowanie wybranych środków chemicznych używanych do wykrycia odcisków śladów linii papilarnych na różnych podłożach. Szczególną uwagę zwrócono na nowy środek do ujawniania śladów linii papilarnych – genypinę. 2. Historia Odciskami palców interesowali się już Chińczycy w VII-X w n.e. Stworzyli oni pierwszą w świecie klasyfikację daktyloskopijną mającą na celu oznaczanie pochodzenia przedmiotów. Atramentowe odciski były w ówczesnych Chinach bardzo popularne. Te wyjątkowe podpisy znajdowały się na oficjalnych dokumentach, widniały na aktach sprzedaży ziemi, kontraktach, pożyczkach, uznaniach długów. Jednym z najbardziej kontrowersyjnych i dziwnych faktów w historii wykorzystania odcisków linii papilarnych wydaje się być fakt, że w szesnastowiecznych Chinach, odciski stóp i dłoni dzieci na „rachunku" finalizowały ich sprzedaż. W Persji, już w XIV wieku jeden z urzędników państwowych, lekarz, przyglądając się odciskom palców odbitym na różnych oficjalnych dokumentach stwierdził, że nie sposób znaleźć dwóch identycznych [2]. W 1686 roku Marcello Malpighi opisał charakterystyczne cechy odcisków linii papilarnych takie jak: zagłębienia, pętle i spirale. Książka J. Mayera pt.” Anatomische Kupfertafeln Nebst Dazu Gehorigen”, uważana jest za jeden z pierwszych oficjalnych zapisów o niepowtarzalności układu linii. Jan Ewangelista Purkinje (urodzony w Pradze) pracujący we Wrocławiu profesor anatomii, pierwszy wyszczególnił 9 podstawowych wzorów przebiegu linii papilarnych (1823) [1,2]. Istotny wpływ na rozwój daktyloskopii miał bardzo wysoki poziom analfabetyzmu w XIX w Indiach. W 1858 roku, mieszkający tam angielski zarządca W. Herschel, nakazał używania odbitek dłoni, a potem kciuków na dokumentach potwierdzających m.in. zawieranie wszelkich umów. Początkowo, przesłanki do zastosowania odcisków linii papilarnych nie miały naukowego charakteru, lecz z czasem związane były raczej 195 Mateusz Niścior, Katarzyna Tarnawska, Monika Adamczyk z przesądami i zabobonnym podejściem lokalnej społeczności do tak oznaczonych dokumentów, które w znaczny sposób pomogło Herschelowi wyeliminować często występujące próby fałszerstwa [2]. Niemniej jednak, wraz ze wzrostem liczby zebranych odbitek linii papilarnych stwierdził on, że faktycznie na ich podstawie można potwierdzić lub zanegować czyjąś tożsamość. Odciski palców stały się zatem swoistym podpisem ich właściciela. Ponadto, Herschel rozpoczął pobieranie odbitek odcisków od wszystkich więźniów [2]. Na przełomie XIX i XX w. m. in. za sprawą szkockiego lekarza i misjonarza Henry’ego Faulds'a, dokonał się efektywny rozwój daktyloskopii. Po przeprowadzeniu serii eksperymentów potwierdził swoją hipotezę, która głosiła, że zbiór wzorów linii papilarnych jest w znacznym stopniu zróżnicowany, ponadto nie indywidualny układ linii nie ulega zmianie nawet w wyniku powierzchownych skaleczeń gdyż ten sam, niepowtarzalny wzór odtwarza się po zagojeniu rany. Henry opisał wzory, w które formują się linie na palcach. Opracował też sposób pobierania odbitek na różnego rodzaju tablicach. Niemniej jednak, jego kluczowym osiągnięciem było udowodnienie, że wzór linii odcisków danej osoby jest niepowtarzalny a utajone ślady zostawione przez zabrudzone lub zatłuszczone palce na różnych obiektach mogą prowadzić do naukowej identyfikacji przestępców. W latach osiemdziesiątych XIX wieku Herschel i Henry opublikowali artykuł na temat zastosowania odcisków palców do identyfikacji przestępców [2]. W praktyce, daktyloskopię jako nową procedurę sądową przyjęto po publikacji "Odciski palców” - “Finger Prints" Anglika Sir Francisa Galtona, w której opisywał on unikalność i niezmienność linii papilarnych i ich klasyfikację. Galton opracował również metodę analizy ilościowej listewek skórnych polegającej na liczeniu listewek od centrum wzoru do trójpromienia bocznego oraz zachęcił do jej stosowania w medycynie sądowej. Stworzył kartę daktyloskopijną i stał się prekursorem systemu klasyfikacji dziesięciopalcowej. Specyficzne cechy tzw. minucje, omówione przez Galtona są używane po dziś dzień, a prawo sformułowane przez niego, zwane zasadą 3N mówi, że linie papilarne są nieusuwalne niepowtarzalne i niezmienne [1,2]. 3. Linie papilarne Linie papilarne to inaczej dermatoglify, czyli specyficzny układ bruzd. Możemy go zobaczyć nie tylko u człowieka ale i również u innych ssaków naczelnych. Wiadomo, że znajdują się one na wewnętrznej stronie dłoni, głównie na opuszkach palców, również odnajdujemy je na palcach stóp, wargach, a u niektórych gatunków na dolnej stronie ogona. Z pewnych 196 Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych badań i obserwacji wiemy, że występowanie linii papilarnych stwierdzono jeszcze u koali także u pewnych kangurów nadrzewnych i u lemurów. Koala został wspomniany na pierwszym miejscu, ponieważ odciski palców tego zwierzęcia z trudem da się odróżnić od ludzkich. Powstanie linii papilarnych następuje poprzez wzniesienia i pofałdowanie epidermy jeszcze w okresie prenatalnym, między 100 a 120 dniem od zapłodnienia komórki jajowej. Wzór ten jest niepowtarzalny nawet u bliźniąt jednojajowych. Pewne schorzenia, wady genetyczne, czy leczenie nowotworów może doprowadzić do ich zacierania się a nawet całkowitego utracenia, jednak takie przypadki są niezwykle rzadkie. Wrodzony brak linii papilarnych występuje u osób u których doszło do mutacji w rejonie SMARCAR1. Brak odcisków palców to poważny problem w wykryciu sprawcy zbrodni, jeśli dokonała jej osoba z wspomnianą wcześniej mutacją. Ta mutacja genetyczna w USA określana jest żartobliwie przez celników jako „choroba opóźniająca wjazd” – „immigration delay disease”[3]. Rys. 1. Widok ludzkich linii papilarnych [11] Rys. 2. Dłoń osoby z wrodzonym brakiem linii papilarnych [13] 197 Mateusz Niścior, Katarzyna Tarnawska, Monika Adamczyk O roli linii papilarnych w identyfikacji zadecydowały ich charakterystyczne właściwości: niezmienność – wyraźne dermatoglify można odróżnić już u 6- miesięcznego płodu ludzkiego i od tego momentu pozostają one w zasadzie niezmienne; niezniszczalność – uszkodzenia mechaniczne, chemiczne czy też chorobowe nie prowadzą do trwałego uszkodzenia listewek skórnych; niepowtarzalność listewek skórnych – prawdopodobieństwo powtórzenia się tego samego rysunku linii papilarnych wynosi 1:64 miliardów [1,4]. Fundamentalną zasadą dla daktyloskopii jest indywidualność linii papilarnych. Na całym świecie nie ma dwóch osób mających identyczny rysunek listewek na skórze. Potwierdziły to zarówno liczne badania, obliczenia statystyczne jak i wieloletnia praktyka daktyloskopijna. Karty daktyloskopijne gromadzone są od wielu lat, na całym świecie, jednakże nie znaleziono dotychczas, dwóch identycznych odcisków linii papilarnych [3]. 4. System identyfikacji śladów linii papilarnych Systemie Henry'ego opisuje trzy podstawowe wzory układu linii: pętla, wir i łuk. Rys.3: Rodzaje podstawowych wzorów odcisków palców pobranych z opuszków a) wzór łukowy b) wzór pętlicowy c) wzór wirowy (pola rozwidleń w kształcie litery y są oznaczone na czerwono) [3] Stanowią one odpowiednio 60-70, 25-35 i 5 procent wszystkich odbitek linii papilarnych. Wszystkie te wzory dodatkowo posiadają różne wariacje: łuki mogą być gładkie lub namiotowe, wzory pętlicowe mogą być promieniowe (od kości promieniowej), lub łokciowe (od kości łokciowej), zależy to od tego, w jaką stronę skierowany jest wzór. Wirowe wzory także posiadają wiele odmian, np. wiry kieszeniowe, przypadkowe, podwójne oraz gładkie, itd [3]. Jednak najważniejsze w identyfikacji są minucje, czyli zestaw charakterystycznych cech, a konkretnie punktów opisujący układ linii. Zawiera on opis początku, zakończenia, rozwidlenia (pojedyncze, 198 Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych podwójne, jednostronne, dwustronne) linii, złączenia, oczka, styki, haczyki, wyspy itp. Porównując ich rozmieszczenie z rozmieszczeniem wzorca można dokonywać identyfikacji osób. Poszczególne kraje same określają liczbę i rodzaj minucji, które koniecznie muszą zostać prawidłowo zidentyfikowane, aby uznać za tożsame dwie odbitki linii papilarnych. W Polsce prawo określa, że potrzeba ich 12, chociaż w nielicznych rzadkich i bardziej typowych przypadkach wystarczy ich znacznie mniej, na przykład gdy występują rzadkie haczyki [3]. Poprawne oznaczenie minucji odbywa się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, poniżej przestawiono kilka przykładów: początki złączenie oczko rozwidlenie punkt odcinek styk boczny Rys.4. Różne przykłady minucji [3] Biuro Niemieckiej Federalnej Policji Kryminalnej (BKA) utrzymuje specjalne instytucje i zbiory dla potrzeb identyfikacji. Specjalne kamery skanują odciski palców do Automatycznego Systemu Identyfikacji Odcisków Palców (ang. Automated Fingerprint Identification System AFIS), gdzie później mogą być porównywane ze sobą. W systemie tym obecnie zarejestrowanych jest około 2,7 miliona odcisków palców [3]. 199 Mateusz Niścior, Katarzyna Tarnawska, Monika Adamczyk 5. Metody służące ujawnieniu śladów linii papilarnych 5.1. Wykorzystujące optyczne właściwości śladów Poszukiwania śladów linii papilarnych dokonuję się przy oświetleniu naturalnym lub sztucznym. W przypadku powierzchni nierównych lub matowych wykorzystuje się fluorescencję widzialną, wzbudzoną promieniami ultrafioletowymi. Przy wykorzystaniu fluorescencji w podczerwieni można uwidocznić ślady pochodzące od palców zabrudzonych np. krwią [1,4]. 5.2. Wykorzystujące adsorpcyjne i adhezyjne właściwości śladów Ślady linii papilarnych są z reguły lepkie, co wykorzystuje się do ich ujawniania na nielepkich podłożach za pomocą proszków. Proszki muszą być odpowiednio rozdrobnione, co gwarantuje zachowanie struktury śladu [4]. Rys. 5. Ujawnianie śladów linii papilarnych przy pomocy proszków [8] 5.3. Wykorzystujące chemiczne właściwości śladów Rozwiązaniem trudności z ujawnianiem lub braku możliwości ujawnienia śladów linii papilarnych przy wykorzystaniu właściwości fizycznych są proste metody chemiczne. Istotą metod chemicznych jest zajście reakcji chemicznych pomiędzy składnikami substancji śladotwórczej a zastosowanym środkiem do ujawnienia [4]. 6.Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych 6.1. Ninhydryna W celu ujawnienia śladów linii papilarnych na powierzchniach chłonnych np. karton, papier, używa się metod bazujących na oddziaływaniu śladów ze związkami chemicznymi takimi jak: DFO 200 Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych (1,8-diazafluoren-9-on), ninhydryna, 5-metylotioninhydryna, RTX (ruten diazotu) czy chlorek cynku. Stosując ninhydrynę otrzymuje się purpurowe lub fioletowo-niebieskie ślady. W kolejnych etapach postępowania barwy te mogą ulec zmianie. Metoda ta jest również stosowana do ujawniania śladów na dużych powierzchniach kolorowych tapet oraz do śladów pozostawionych wiele lat temu. Ninhydryna reaguje z zawartymi w odciskach palców aminokwasami, polipeptydami i białkami [4,5]. Rys. 6. Odcisk śladów linii papilarnych ujawniony ninhydryną [12] Dobór odpowiedniej metody badawczej uzależniony jest między innymi od: stopnia zanieczyszczenia i zawilgocenia podłoża, właściwości podłoża, wieku śladu, itp. Niemniej jednak ważne jest również ustalenie wpływu użytej metody na zniszczenie podłoża. Zastosowanie roztworów RTX, ninhydryny, czy 5-metylotioninhydryny, według zasady kontrastowości, pozwala na ujawnienie śladów linii papilarnych widocznych w świetle dziennym. Środki takie jak DFO czy chlorek cynku to metody fluorescencyjne. Roztwór chlorku cynku służy do poprawy i wzmacniania słabo czytelnych, fragmentarycznych śladów linii papilarnych, które zostały wykryte przy użyciu ninhydryny i 5-metylotioninhydryny (ślady te po zastosowaniu roztworu chlorku cynku nabywają właściwości fluorescencyjnych) [6]. 201 Mateusz Niścior, Katarzyna Tarnawska, Monika Adamczyk Rys.7. Odciska palca ujawniony metodą fluorescencyjną [10] 6.2. SPR SPR to wodna zawiesina zmielonego dwusiarczku molibdenu (MoS 2 z dodatkiem środka powierzchniowo — czynnego). Stosuje się go do ujawniania śladów linii papilarnych na mokrych lub wilgotnych podłożach niechłonnych takich jak: ceramika, szkło, tworzywa sztuczne, metale, przedmioty pokryte lakierami i farbami itp., bez konieczności wcześniejszego wysuszenia powierzchni badanego obiektu. Dwusiarczek molibdenu przylega do cząsteczek tłuszczu i pozostawia szary osad. Według obowiązującej zasady kontrastowości, należy stosować biały SPR – na powierzchnie o ciemnym zabarwieniu, ciemny SPR – na powierzchnie o jasnym zabarwieniu oraz SPR UV – na powierzchnie mieszane, co pozwoli z większą dokładnością i zdecydowanie lepszym efektem na ujawnienie pozostawionych śladów [5]. 6.3. Kleje cyjanoakrylowe Do ujawniania śladów na powierzchniach niechłonnych służą także kleje cyjanoakrylowe- są to substancje reagujące z wodą wydzieliny potowo-łojowej, tworzące na powierzchni badanego obiektu białoszarawy osad. Aby dodatkowo skontrastować słabo czytelne ślady linii papilarnych, po użyciu kleju cyjanoakrylowego używa się różnorodne barwniki np.: chellat europu, ardrox, safranina 0, Basic red 28, rodamina 6g, yellow basic 40, które ujawniają ślady przy użyciu technik fluorescencyjnych oraz fiolet krystaliczny i czerń sudanową, które pozwalają na wzmocnienie kontrastu w świetle dziennym [4, 5]. 202 Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych Rys.8. Metoda cyjanoakrylowa [9] 6.4. Środki chemiczne stosowane na papierach termoczułych Papiery termoczułe mają szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach życia, m.in. wykorzystuje się je do wyrobu metek cenowych, wyciągów z kont bankowych, bonów kasowych, biletów, kart wstępu itp. W celu ujawnienia na powierzchni papierów termoczułych śladów linii papilarnych stosuje się metody wykorzystujące: aldehyd 4-dimetylaminocynamonowy, stężony kwas azotowy, kwas solny, thermaniny, RTX. Zastosowanie metody kwasów stężonych: azotowego i solnego pozwala na ujawnienie śladów linii papilarnych tylko i wyłącznie na powierzchni termoczułej papieru, a fundamentem tego procesu jest barwna reakcja substancji potowo-tłuszczowej z oparami tych kwasów. Zastosowanie natomiast metod bazujących na zastosowaniu: thermaniny, aldehydu 4dimetylaminocynamonowego (DMAC), RTX oraz pozwala na ujawnienie śladów linii papilarnych zarówno na powierzchni termoczułej jak i na powierzchni papierowej. Ujawnione ślady linii papilarnych za pomocą metod bazujących na zastosowaniu: thermaniny, RTX, kwasów stężonych azotowego i solnego są widoczne w świetle widzialnym. Metody wykorzystujące: aldehyd 4-dimetylaminocynamonowy (DMAC) to metody fluorescencyjne. W świetle dziennym ślady linii papilarnych ujawnione za pomocą tych metod są niewidoczne, dopiero zastosowanie odpowiednich technik fluorescencyjnych pozwala na ich wizualizację [4,5]. 203 Mateusz Niścior, Katarzyna Tarnawska, Monika Adamczyk 6.5. Środki chemiczne stosowane na taśmach samoprzylepnych W celu ujawnienia na powierzchniach klejących taśm samoprzylepnych śladów linii papilarnych stosuje się metody: Sticky-Side (roztwór koloru ciemnego lub białego), Wet Powder, Liqui-drox fioletu krystalicznego oraz Tape-Glo. Dobór odpowiedniej metody badawczej uzależniony jest między innymi od właściwości taśm samoprzylepnych. Niektóre z nich przy wzbudzaniu promieniowaniem UV mogą wykazywać własną fluorescencję. Dzięki użyciu roztworów: Sticky-Side (roztwór koloru białego lub ciemnego), Wet Powder oraz fioletu krystalicznego, możliwe jest ujawnienie śladów linii papilarnych widocznych w świetle dziennym. Metody: Liqui - drox oraz Tape-Glo to metody fluorescencyjne. W świetle dziennym ślady linii papilarnych ujawnione za pomocą tych metod są niezauważalne, dopiero właściwe zastosowanie technik fluorescencyjnych pozwala na ich wizualizację [5]. Rys. 9. Ujawnianie śladów na taśmie [9] Rys. 10. Wet Powder [9] 6.6. Czerń amidowa Chemiczne metody ujawniania krwawych śladów linii papilarnych opierają się na reakcjach związków chemicznych (w zależności od zastosowanej metody) ze składnikami krwi. W rezultacie powstają barwne związki kompleksowe, a w następstwie wizualizacja niewidocznych krwawych śladów linii papilarnych. W warunkach laboratoryjnych stosuje się następujące metody: fuksyny kwaśnej, tartrazyny, czerwieni węgierskiej, fioletu leukokrystalicznego (LCV) oraz czerni amidowej. Metody te mogą być z powodzeniem stosowane zarówno na podłoża niechłonne (np. ceramikę, szkło, metale, folię aluminiową, powierzchnie nieklejące folii i taśm samoprzylepnych, gumę, lakierowane drewno, skórę) jak i na podłoża chłonne (np. powierzchnie gładkie, błyszczące, matowe). Roztwory: fuksyny kwaśnej, czerni amidowej, fioletuleukokrystalicznego (LCV) oraz czerwieni węgierskiej, są stosowane na powierzchnie jasnego koloru, natomiast na powierzchnie ciemnego koloru stosuje się roztwór 204 Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych tartrazyny (zgodnie z obowiązującą zasadą kontrastowości). Metody te umożliwiają wykrycie krwawych śladów linii papilarnych widocznych w świetle dziennym [5]. Inną korzyścią metody czerwieni węgierskiej jest fakt, iż ujawnione krwawe ślady linii papilarnych wykazują fluorescencję i dlatego można ją z powodzeniem stosować zarówno na powierzchnie o jasnym, jak również o ciemnym zabarwieniu. 6.7. Genypina Badania nad udoskonaleniem metod wizualizacji śladów linii papilarnych, doprowadziły do odkrycia nowego środka do ujawniania śladów na podłożach chłonnych zwanego genypiną. Genypina - pochodna cukru genopozydu, jest to bezbarwny naturalny ekstrakt uzyskiwany z owoców gardenii (Gardenia jasminoides Ellis), wykorzystywany przez plemiona indiańskie do wykonywania tatuaży, gdyż po zetknięciu ze skórą barwi ją na niebieskofioletowo, trudno ją też usunąć. Podobna reakcja zachodzi również z aminokwasami [7]. Genypinę po raz pierwszy zsyntetyzowano w 1967r. Następnie Hahn i wsp. (2004) używając genypiny przeprowadzili badania nad kolorymetrycznym oznaczaniem aminokwasów oraz badania porównawcze z roztworem ninhidryny stosowanym w daktyloskopii do ujawniania śladów linii papilarnych [14]. Doszli do wniosku, że produkt reakcji aminokwasów z genypiną barwi intensywniej na niebieskofioletowo ujawnione odwzorowania linii papilarnych niż purpura Ruhemanna, powstająca w reakcji aminokwasów z ninhydryną. Zaobserwowali również, że przebieg ujawniania śladów roztworem genypiny zachodzi szybciej niż roztworem ninhydryny. Te pomyślne wyniki, skłoniły naukowców do dalszych badań nad możliwościami wykorzystania genypiny do wizualizacji śladów linii papilarnych [5,7]. Przeprowadzono badania, które wykazały, że ślad ujawniony genypiną nie tylko ma bardzo intensywną barwę w świetle dziennym w postaci niebieskofioletowych odwzorowań, a także wykazuje silną fluorescencję po oświetleniu badanej powierzchni w świetle niebieskozielonym o długości fali 555 nm. Należy pamiętać, że oglądając badaną powierzchnię trzeba zastosować filtr (okulary) czerwony (630nm), który pozwoli na uwidocznienie fluorescencji ujawnionych śladów linii papilarnych. Obecnie prowadzi się badania nad tą metodą wizualizacji [5]. 7. Zabezpieczenie techniczne śladów linii papilarnych W przypadku śladów linii papilarnych wykorzystuje się następujące sposoby technicznego utrwalenia: wykonanie zdjęcia fotograficznego, 205 Mateusz Niścior, Katarzyna Tarnawska, Monika Adamczyk przeniesienie na folię daktyloskopijną, sporządzenie repliki silikonowej bądź zabezpieczenie w całości [5]. Zabezpieczenie technicznie z wykorzystaniem np. folii daktyloskopijnej polega na zastosowaniu folii, o odpowiedniej barwie i kontraście, którą przykłada się żelem do podłoża. Dociskając folię dokładnie zabezpieczamy ślad. Zabezpieczenie techniczne z użyciem pasty silikonowej polega na nałożeniu pasty silikonowej na powierzchnię z ujawnionym śladem. Niskie napięcie powierzchniowe pasty powoduje, że wpływa ona w najdrobniejsze szczeliny. Pasta nie niszczy i nie zniekształca śladów. Ślad można dodatkowo napylić proszkiem daktyloskopijnym [5]. 8. Podsumowanie Dzięki wykorzystaniu wiedzy z zakresu daktyloskopii możemy z niemal całą pewnością zidentyfikować osobę podejrzaną o dokonanie przestępstwa. W tym celu powstają coraz nowsze metody i chemiczne środki ujawniające ślady linii papilarnych z biegiem czasu udoskonalając tę dziedzinę kryminalistyki będzie niemal w stu procentach możliwe wskazanie sprawcy przestępstwa. Opisane chemiczne metody ujawniania śladów linii papilarnych dają ogromne możliwości w zakresie identyfikacji tych śladów. Zastosowanie tradycyjnych proszków daktyloskopijnych może dać negatywne rezultaty, ale nie muszą oznaczać, że na danej powierzchni nie pozostawiono śladów linii papilarnych. Natomiast odpowiednie zabezpieczenie badanego przedmiotu w całości i poddanie jego powierzchnie działaniu środków chemicznych niejednokrotnie pozwala na ujawnienie rozpatrywanych śladów. Genypina jest skutecznym środkiem do ujawniania „świeżych śladów linii papilarnych. Zaletą genypiny jest uzyskanie trwałej niebieskofioletowej barwy odwzorowań linii papilarnych widocznych w świetle białym. Genypina mogłaby być alternatywą dla ninhydryny i chlorku cynku w stosunku do śladów świeżych. Literatura 1. 2. 3. Kulicki M., Kwiatkowska-Darul V., Stępka L., Kryminalistyka - Wybrane zagadnienia teorii i praktyki śledczo-sądowej, wyd. UMK Toruń 2005 Thern N. Czy systemy identyfikacji biometrycznej podbiją rynek zabezpieczeń? Cz.II – Daktyloskopia [Źródło internetowe]: http://www.northern.pl/d38,czy_systemy_identyfikacji_biometrycznej_podbij a_rynek_zabezpieczen_czii_-_daktyloskopia.html [Dostęp]: 07.11.2014 N. Halverson Biometric First: Touchscreen Recognizes Fingerprints [Źródło internetowe]: http://news.discovery.com/tech/gear-and-gadgets/biometric-firsttouchscreen-recognizes-fingerprints-130719.htm [Dostęp]: 08.11.2014 206 Chemiczne środki do ujawniania śladów linii papilarnych 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Jerzewska J., Ślady linii papilarnych w praktyce technika kryminalistyki, Legionowo 2007 Zubański S., Raport z badań dotyczących wizualizacji śladów linii papilarnych metodami chemicznymi, Szczytno 2006r. Rybczyńska-Królik M., Pękaty M. Przewodnik po metodach wizualizacji śladów daktyloskopijnych – Substancja śladotwórcza - substancja tworząca obraz linii papilarnych na dotykanym podłożu. Przykłady substancji śladotwórczej: substancja potowo - tłuszczowa, substancje pyliste (np. mąka, pył wapienny), płynne, półpłynne (np. smary, tłuszcze) albo biologiczne (np. krew) - str. 10, wyd. CLK KGP W-wa, 2006 Rogoża E., Wudarczyk M., Genypina- nowy środek do ujawniania śladów linii papilarnych, Kraków 2006 Moszczyński J., Daktyloskopia. [Źródło internetowe]: https://scholar.google.pl/scholar?as_q=daktyloskopia&as_epq=&as_oq=&as_e q=&as_occt=any&as_sauthors=moszczy%C5%84ski&as_publication=&as_yl o=&as_yhi=&btnG=&hl=pl&as_sdt=0%2C5 [Dostęp]: 08.11.2014 Králík M., Nejman L., and others, Fingerprints on artefacts and historical items: examples and comments, J. Anc. Fingerpr., vol. 1, pp. 4-15, 2007 M. M. D. Sierra, M. Giovanela, E. Parlanti, and E. J. Soriano-Sierra, Fluorescence fingerprint of fulvic and humic acids from varied origins as viewed by single-scan and excitation/emission matrix techniques, Chemosphere, vol. 58, no. 6, pp. 715-733, 2005 Tan F.L., Moravec C. S., Li J., Apperson-Hansen C., McCarthy P. M., Young J. B., Bond M., The gene expression fingerprint of human heart failure, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 99, no. 17, pp. 11387-11392, 200 Odén S., Von Hofsten B. Detection of fingerprints by the ninhydrin reaction, 1954 Jain A., Ross A. Fingerprint mosaicking, in Acoustics, Speech, and Signal Processing (ICASSP), 2002 IEEE International Conference on, 2002, vol. 4, pp. IV-4064 Almog J., Cohen Y., Azoury M., Hahn T.R. Genipin-A novel fingerprint reagent with colorimetric and fluorogenic activity, J. Forensic Sci., vol. 49, no. 2, pp. 255-257, 2004 Chemical agents to reveal latent fingerprints Dactyloscopy is a very important area of forensic science which takes part in the studies of latent fingerprints. It allows to identify the perpetrator of the crime or the identity the human corpses beside which not found any documents. The article has briefly described fingerprinting technique, its origins and further development. It also focuses on the characteristics of the fingerprint evidence, their properties, and the system of identification. The Henry Classification System is described in this article as the only one that distinguishes three basic patterns of the line: loop, whirl and bow. The most important features of the fingerprints (minutiae), which are the set of basic features such as the origins, hooks, or the end of the mesh are described.. The article also describes methods for disclosing latent fingerprints using optical, adsorption and chemical properties of the adhesives and traces. The article presents several examples to disclose the chemical fingerprint marks and briefly characterizes them, inter alia: ninhydrin, cyanoacrylate glue, SPR, black amide and genypina. Behind the chemicals already in use, the scientists still seek for better substances to easier and more efficiently reveal traces of fingerprints to prove one's crime or identity. 207 Robert Karpiński1, Mariusz Walczak2, Joanna Śliwa3 Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały Poniższe opracowanie zawiera informacje dotyczące stopów kobaltu stosowanych w stomatologii oraz medycynie. Praca zawiera przegląd literatury opisujący ogólne właściwości stopów kobaltu. Opisano także wpływ warunków wytwarzania i wykorzystywanych dodatków stopowych na strukturę oraz właściwości mechaniczne tych stopów. W opracowaniu umieszczona została metodyka przeprowadzonych badań oraz uzyskane wyniki. Do badań wybrane zostały dwa stopy na osnowie kobaltu Co-CrMo-W oraz Co-Cr-Ni-Mo. Pierwszy z nich wytworzony został techniką odlewniczą drugi natomiast wyniku obróbki plastycznej. Przeprowadzona została analiza składu chemicznego, a następnie badania tribologiczne in vitro zrealizowane na tribotesterze typu „ball-on-disc”. Przedstawiona została porównawcza charakterystyka tribologiczna tych stopów. 1. Wprowadzenie Do najczęściej używanych stopów metali nieszlachetnych w medycynie i stomatologii należą stopy kobaltu z chromem. Powszechnie w stomatologii używane są do wykonywania koron, odlewania mostów, inlayów oraz na protezy szkieletowe [1-3]. Natomiast w medycynie stopy Co-Cr stosowane są głównie do produkcji endoprotez stawów biodrowych i kolanowych [4]. Stopy kobaltu cechują się wytrzymałością ok. 800÷900 MPa, granicą plastyczności 600÷700 MPa i twardością 300÷400HV oraz wydłużeniem w próbie rozciągania na poziomie 2÷5%. W pomiarach właściwości mechanicznych wybrane odlewy mogą wykazywać małą ciągliwość, co może przekładać się na zmniejszenie wytrzymałości zmęczeniowej[5]. Stopy Co–Cr–Mo w stanie odlanym są używane na szeroką skalę w produkcji implantów wykonywanych przy użyciu technik wytapianych modeli. Z uwagi na trudności w zakresie obróbki tych stopów oraz złożoność kształtów protez, proces ten obniża wysokie koszty operacji obróbki skrawaniem dzięki wytwarzaniu części, których wymiary są zbliżone do wymiarów finalnych[6]. Jednakże ta metoda wytwarzania 1 [email protected], Koło Naukowe Technologii Materiałów, Wydział Mechaniczny, Politechnika Lubelska 2 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Lubelska 3 [email protected], Koło Naukowe Inżynierii Biomedycznej, Wydział Mechaniczny, Politechnika Lubelska 208 Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały prowadzi go niskich właściwości mechanicznych w porównaniu do innych procesów produkcyjnych takich jak metalurgia proszków [7] albo kucie [8]. Komorek i współ [9] badali wpływ warunków wytwarzania, na jakość odlewów stomatologicznych wykonanych metodą odśrodkową w atmosferze powietrza oraz odlewania ciśnieniowo-próżniowego w atmosferze argonowowodorowej. Stwierdzili oni, że zastosowanie odlewania ciśnieniowopróżniowego zapewniło dobrą czystość metalurgiczną odlewów. Badania strukturalne nie ujawniły w tych próbkach rzadzizn oraz pustek. Natomiast odlewanie w atmosferze powietrza spowodowało natomiast wystąpienie licznych rzadzizn, występujących szczególnie w strefie odcinka pomiarowego próbek wytrzymałościowych. Interesującą alternatywę dla odlewów i stopów do przeróbki plastycznej stwarza tu technika metalurgii proszków [10-13]. Pozwala ona wyeliminować szereg wad typowych dla odlewniczych i przerabianych plastycznie implantów metalicznych, m.in. ograniczyć mikrosegregację oraz zmniejszyć ilość bądź zwiększyć dyspersję wydzieleń obcych faz (głównie węglików). Dobór odpowiednich klas ziarnowych proszku pozwala na zwiększenie drobnoziarnistości struktury, korzystnej z punktu widzenia właściwości mechanicznych takich materiałów [12, 14, 15].Według Henriques’a [16] metalurgia proszków stanowi alternatywną metodę w produkcji koron dentystycznych w stosunku do odlewania, gdyż prasowane na gorąco próbki charakteryzują się znacznie większą twardością niż odlewane (odpowiednio 438±24HV i 324±8HV), a ponadto wykazują lepszą odporność na korozję. Jak wiadomo, do głównych wad występujących w stanie odlanym należą: porowatość, niejednorodność chemiczna, duża wielkość ziarna a także mikrostruktura zawierająca twarde substancje wytrącone w strefach międzydendrytycznych [17, 18]. Ponadto niejednorodności morfologii węglików, a także ich wielkość oraz rozkład mogą prowadzić niskiej ciągliwości oraz niskiej wytrzymałości zmęczeniowej [6]. Niemniej jednak możliwa jest poprawa właściwości mechanicznych przy użyciu technik obróbki cieplnej na drodze rozpuszczania dużej sieci węglików oraz stworzenia struktury bardziej jednorodnej. Wykazano [19], że w wyniku rozpuszczenia struktury dendrytycznej uzyskano własności izotropowe, w szczególności w zakresie odkształceń plastycznych. 1.1 Struktura Wiele właściwości stopów kobaltu wynika z jego krystalograficznej budowy [20]. Czysty kobalt posiada strukturę heksagonalną ciasno upakowaną (hcp) w temperaturze pokojowej oraz wykazuje transformację alotropową do postaci struktury regularnej płasko centrowanej (fcc) 209 Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa w temperaturze 400 °C. Dodatek pierwiastków stopowych takich jak chrom (Cr) oraz wolfram (W) zwiększa tę temperaturę transformacji [6]. Zawartość węgla w standardowych odlewniczych stopach kobaltu wg norm ASTM może osiągnąć 0,35% i jest ona określana jako maksymalna [21,22]. Typowe stopy noszące miano wysokowęglowych zawierają zazwyczaj ok 0,15÷0,25% C [22,23]. Natomiast według danych literaturowych zawartość stopów określanych mianem niskowęglowych wynosi zazwyczaj poniżej 0,07% C [24], a według innych danych nawet poniżej 0,06% C [23]. Marciniak i współ [1] podają, że stopy stosowane w stomatologii są stopami niskowęglowymi. W stopach kobaltu dla stomatologii występują dodatki Mo i W, które wpływają na umocnienie roztworu stałego [20,21]. Stąd też, obok popularnej grupy stopów Co-CrMo stosowane są stopy stomatologiczne Co-Cr-W-Mo oraz Co-Cr-Mo-W. Stopy, które zawierają wolfram cechują się w porównaniu do stopów CoCr-Mo, niższą grubością warstwy utlenionej podczas wypalania ceramiki [25], co w końcowym efekcie sprzyja trwalszemu połączeniu układu metalceramika. Obecność Cr w stopach Co-Cr-Mo zapewnia odporność na korozję. Dodatkowo molibden pomaga obniżyć współczynnik rozszerzalności, co nie jest bez znaczenia w przypadku stopów stosowanych do uzupełnień metalowo-ceramicznych [16]. Potencjalnie uznaje się, że w stopach kobaltu, w zależności od składu chemicznego i warunków przetwarzania mogą powstać węgliki o zróżnicowanej budowie -od MC poprzez M 23C6. M6C, M3C2 aż do M7C3. Jednak w stopach znajdujących przemysłowe wykorzystanie najbardziej prawdopodobne jest powstanie węglików M23C6, M6C i M7C3 [26].W stanie lanym cząstki węglików wykazują dwoistą budowę – występują w postaci wydzieleń masywnych (ciągłych) lub w formie wydzieleń płytkowych (lamelamych) [27]. Stopy na bazie kobaltu wykazują metastabilną osnowę dendrytyczną α-fcc z powodu powolnego charakteru transformacji fcc → hcp [28], a także substancji wytrąconej złożonej głównie z węglików M 23C6 międzymetalicznej fazy σ a także fazy płytkowej złożonej z płytek międzywarstwowych węglika M23C6 a także z fazy, której dotychczas jasno nie zidentyfikowano, ewentualnie fazy σ, obydwu faz α oraz σ oraz α albo M6C faz węglików, co zaproponowało kilku autorów [29-33]. Ta struktura płytkowa powstaje w trakcie chłodzenia w temperaturach poniżej 990 °C, stwierdzono, że jest to najbardziej niekorzystna cecha mikrostruktury [34]ponieważ po rozpuszczeniu tej substancji wytrąconej na granicy ziarna następuje poprawa trwałości zmęczeniowej[6]. Wytrącanie węglika na granicach ziarna oraz regiony międzydendrytyczne stanowią główny mechanizm wzmacniający w stanie odlanym [35] ale także przez oddziaływania dyslokacji z przecięciami 210 Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały błędu ułożenia [36,37]. Gruboziarniste węgliki w formie bloków spełniają ważna rolę jako źródła dyslokacji oraz błędów ułożenia po przyłożeniu naprężenia [37]. Z uwagi na specyficzne niskie prędkości chłodzenia w procesie produkcji, możliwe jest jednoczesne istnienie dwu morfologii węglików tzn. „typu blokowego” oraz typu „perlitycznego” w wyniku reakcji eutektycznej [38,39]. Inni autorzy stwierdzili, że powstawanie płytkowych węglików „eutektoidalnych” ma miejsce w zakresie prędkości chłodzenia od 8 do 16 °C/min [40] a na podstawie wcześniejszych wyników ustalono, że maksymalna prędkość chłodzenia umożliwiająca wytrącanie fazy eutektycznej wynosi 35 °C/min [29]. Stwierdzono także wzrost wielkości substancji wytrącanej oraz gęstości zarówno fazy blokowej jak i płytkowej wraz z zawartością węgla [39], przy czym nie miało to istotnego wpływu na ciągliwość. Z drugiej strony analiza metalograficzna wykazała [6], iż zawartość azotu ma niewielki wpływ na wielkość ziarna. Kiedy zawartość azotu wzrasta, sprzyja to powstawaniu drobniejszych ziaren węglików M 6C zamiast węglików M23C6 mających tendencję do gromadzenia się na granicach ziarna. W przypadku obecności w roztworze, azot może oddziaływać jako umacniacz roztworu stałego, co powoduje poprawę właściwości mechanicznych [8], kosztem innych własności, które często okazują się niewystarczające aby spełnić wymagania normy ASTM F75 [6]. Kilner i współ [41], sugerowali możliwość wytrącania węglika M 7C3 podczas krzepnięcia stopu ASTM F75 oraz jego rozpuszczania na drodze dyfuzji w trakcie chłodzenia, ponieważ nie zaobserwowano tego w temperaturze pokojowej. Clemow and Daniell [42]stwierdzili, że reakcje podczas operacji obróbki cieplnej roztworu w temperaturach powyżej 1300°C obejmowały topienie węglika oraz że początkowo obecny w stopie węglik M23C6 wykazywał tendencję do transformacji do postaci węglika M6C oraz fazy σ. Istotny jest fakt, iż ten typ obróbki cieplnej wymaga precyzyjnej regulacji zmiennych występujących w procesie z powodu wąskiego zakresu temperatur, w których ma miejsce rozpuszczania węglika [43]. Z drugiej strony, Opris i współ [28] stwierdzili obecność kompleksowej kombinacji węglików Co3Mo/W3C, M23C6 oraz Cr7C3 osadzonych w osnowie o bogatej zawartości Co, ponieważ węgliki metalu mogą w rzeczywistości mieć skład potrójnego roztworu stałego ternary [44]. Oprócz faz międzydendrytycznych, należy unikać niektórych z nich, ponieważ mają negatywny wpływ na niektóre właściwości mechaniczne, występuje mikrosegregacja, co ewentualnie sprzyja powstawaniu faz nierównowagi [38]. 211 Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa W stopach kobaltu występują międzymetaliczne fazy o topologicznie zwartej upakowanej strukturze z ang. topologically closed-paced structure [45-47], takie jak wcześniej przytoczona faza σ, Lavesa (o wzorze stechiometrycznym A2B), faza π (krystalizująca w układzie tetragonalnym) i faza µ (identyfikowana jako faza Co 7Mo6 [45,48]) [20]. Według Górnego [20] fazy te tworzyć się mogą przeważnie w niskowęglowych stopach Co, gdzie stosunek zawartości metali trudnotopliwych i Cr do łącznej zawartości Co i Cr przekracza graniczną rozpuszczalność w austenicie w danej temperaturze. Możliwa jest także modyfikacja mikrostruktury stopów kobaltu w stanie odlanym w wyniku zmiany pierwiastków stopowych. Zastąpienie wolframu taką sama ilością molibdenu powoduje poprawę ciągliwości, zwiększa zakres krzepnięcia oraz zmienia morfologię wytrąconej substancji przez segregację [29] wytwarzając dodatkowe ilości węglików eutektycznych [6]. Jednocześnie wzrost zawartości wolframu zmniejsza gęstość błędu ułożenia oraz jednocześnie zwiększa frakcję objętości związku międzymetalicznego σ w stopach Co–Cr–Mo [49]. Podobne zachowanie stwierdzili Zhuang i współ [50]w przypadku dodatków niklu. Dodanie stabilizatorów fazy fcc, takich jak Fe, Ni, Mn oraz C, ułatwia retencję fcc w temperaturze pokojowej w wyniku spowolnienia transformacji fcc → hcp [6]. Odlewane stopy Co-Cr-Mo są poddawane obróbce cieplnej w celu wyeliminowania wad odlewniczych oraz poprawy własności mechanicznych [51]. W związku z tym zachowanie węglików utworzonych w stopach Co-Cr-Mo podczas obróbki cieplnej było przedmiotem niektórych badań [19,29,31,34,39,41-43,52,53]. Wiele badań skupiało się na charakterystyce rozpuszczania węglików w trakcie procesu rozpuszczania [19,29,31,34,39,41-43]. Znajomość wytrącania lub rozpuszczania węglików ma zasadnicze znaczenie dla ustalenia efektywnego oraz ekonomicznego procesu produkcji stopów Co-Cr-Mo [51]. Odlewnicze stopy podlegają przeważnie przesycaniu, ale w celu usuwania naprężeń mogą podlegać wyżarzaniu odprężającemu. Natomiast normalne wyżarzanie przeprowadza się w temperaturze 760 °C i prowadzi ono do zwiększenia tworzenia oddzielnych cząstek węglika Cr 23C6. Wyższe temperatury wyżarzania mogą spowodować iglaste i/lub płytkowe wydzielenia opisane powyżej [20]. Właściwe przesycanie jest rzadko stosowane. Pozwala na uzyskanie znaczących efektów w mikrostrukturze przy temperaturach powyżej 1175°C; przeważnie są to temperatury ok. 1205÷1260 °C. Natomiast starzenie przeprowadza się poniżej 760 °C. Nie mniej jednak obróbkę cieplną dostosowuje się do konkretnych stopów i efektów jakie chce się uzyskać [20]. 212 Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały Badania Montero-Ocampo i współ [19]dotyczące wstępnego podgrzewania różnych stopów Co-Cr-Mo-C poddawanych następnie pełnej obróbce normalizującej na końcową wytrzymałość i ciągliwość odlewów wykazały znaczną poprawę właściwości mechanicznych w stosunku do własności materiału niepoddanego obróbce. Zmiana temperatury odlewania nawet o ok.10÷20°C w stosunku do tego, co zaleca producent dentystycznych stopów może powodować zmianę właściwości mechanicznych odlewu. Reimann i Dobrzański [54] badali wpływ temperatury odlewania na właściwości mechaniczne komercyjnych stopów Remanium 2000+ i Wirobond LFC. Wykazali oni, że jeżeli następuje wzrost temperatury odlewania, to zmienia się granica plastyczności i wytrzymałości na ściskanie w porównaniu do wartości uzyskanych dla temperatury domyślnej z danej instrukcji podawanej przez producenta stopów. Uzyskana umowna granica plastyczności była mniejsza o około 10%, a wytrzymałość na ściskanie około 25%. Odporność na procesy tribologiczne stopów na osnowie kobaltu w głównej mierze zależy od struktury i sposobu kształtowania materiału, a także ośrodka w jakim przebywają [55, 56]. Według Iijima i współ [57] współczynnik zużycia jest ważnym czynnikiem określającym właściwości tribologiczne materiałów stosowanych w medycynie i stomatologii. Dodatkowo autorzy [57] zwracają uwagę, że w większości prac badawczych dotyczących biomateriałów naukowcy zbyt bardzo skupiają się na badaniu właściwości wytrzymałościowych i korozyjnych, a pomijają właściwości tribologiczne. Dlatego też, celem naukowym tej pracy była porównawcza charakterystyka tribologiczna w warunkach in vitro dwóch stopów na osnowie kobaltu wytworzonych techniką odlewniczą i w wyniku obróbki plastycznej. 2. Metodyka badań Do badań wybrano dwa różne stopy na osnowie kobaltu stosowane jako biomateriały. Stop Co-Cr-Mo-W wytworzony były w wyniku odlewania próżniowo-ciśnieniowego techniką wytapianych modeli, natomiast stop Co-Cr-Ni-Mo uzyskany był w wyniku obróbki plastycznej z jednokrotnie walcowanej blachy. Próbki użyte do badań posiadały kształt krążków o średnicy Ø 25 mm i grubości 2 mm. Podano je szlifowaniu na wodnych papierach ściernych o ziarnistości odpowiednio 220, 600 i 1200. Następnie próbki polerowano mechanicznie przy użyciu zawiesiny diamentowej 3 m i zawiesiny tlenków 0,05m, a po zakończeniu polerowania przemywano je acetonem i suszono. 213 Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa Analizę składu chemicznego wykonano na iskrowym spektrometrze emisyjnym Q4 Tasman 130 (Bruker, Niemcy). Badania realizowano na globalnym kanale badawczym Co100, w którym dokonano po 5 analiz (iskrzeń) dla każdej z próbek. Badania tribologiczne in vitro zrealizowano na tribotesterze typu „ballon-disc” firmy CSM Instruments, w temperaturze 37ºC w roztworze Ringera (firmy Braun). Jako przeciwpróbki (ball) użyto kulek o średnicy 6 mm wykonanych z Al2O3 o twardości 2000HV (firmy CSM Instruments). Badania realizowano pod obciążeniem 10N z prędkością liniową 1,88 cm/s na promieniu 4,5 mm. Całkowita droga testu wynosiła 100 m podczas, której rejestrowano zmianę współczynnika tarcia. Miarą zużycia był ubytek objętościowy próbki powstały, jako ślad wytarcia w wyniku współpracy próbki i przeciwpróbki. W tym celu za pomocą profilometru stykowego Dektak 150 firmy Veeco Instruments, po obwodzie próbki (w 10 miejscach) mierzono pole profilu wytarcia próbki. Promień zaokrąglenia igły pomiarowej wynosił 2 µm. Zużycie objętościowe wyznaczono, jako iloczyn średniej wartości pola wytarcia próbki i obwodu koła śladu wytarcia powstałego w teście ball-on-disc. Dodatkowo jako porównawczą miarę zużycia, która uwzględniałaby obciążenie oraz przebieg dystansu stosowany podczas testu wyznaczono tzw. współczynnik zużycia K [55]: 3. Rezultaty i wyniki badań Wyniki (średnia ± SD)analizy składu chemicznego badanych materiałów przedstawiono w tabeli 1. Warto zwrócić uwagę, że producenci nie wykazują w swoich danych informacji o stężeniach pierwiastków poniżej 1%. Zawartość węgla w zakresie 0,007÷0,069% wskazuje, że analizowane materiały należą do grupy stopów niskowęglowych. W przypadku odlewanego stop3.u Co-Cr-Mo-W obserwuje się wyższą zawartości węgla w porównaniu do stopu walcowanego Co-Cr-Ni-Mo, co może dodatkowo determinować wzrost twardości dla tej grupy materiałów. Według Karaali i współ [49] zarówno w stopach kobaltu dla medycyny jak i stomatologii mogą się tworzyć węgliki takie jak MC, M7C3,M23C6 oraz M6C.W przypadku stopu Co-Cr-Mo-W odnotowano wyższą zawartość molibdenu i wolframu. Molibden i wolfram powoduje umocnienie roztworu stałego stopu oraz Mo może powodować dodatkowo tworzenie się faz międzymetalicznych [20, 21]. Dodatkowo większa zawartość Mo sprzyja większej odporności na korozję wżerową [58], a na powierzchni stopu tworzyć się mogą korzystne tlenki MoO3 [59]. 214 Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały W przypadku walcowanego stopu Co-Cr-Ni-Mo duża zawartość Ni może wpływać uczulająco na pacjentów – co poświadczają dane literaturowe [60]. Mn P S Cr Mo Ni Odlewa-ny Co-CrMo-W 0,069 1,189 0,137 0,0086 <0,002 21,38 8,538 0,213 SD 0,008 0,018 0,003 0,001 - 0,511 0,008 0,003 Walcowany Co-Cr-Ni-Mo 0,007 0,210 0,015 <0,001 <0,002 20,82 3,437 20,55 SD Stop 0,001 W 0,005 Fe 0,001 Al - - Cu Nb 0,523 N 0,052 Ti 0,102 Co Odlewa-ny Co-Cr-Mo-W 4,599 0,0039 0,045 0,0088 <0,005 0,204 0,004 5 63,57 SD 0,112 0,001 0,019 0,007 - 0,069 0,000 3 0,303 Walco-wany Co-Cr-Ni-Mo Tabela 1. Skład chemicznych badanych stopów (mas. %) Stop C Si 0,054 0,568 0,002 0,014 0,373 0,080 0,017 54,79 SD 0,009 0,025 0,0005 0,001 0,005 0,034 0,000 7 0,455 Testy badań tribologicznych w roztworze Ringera wykazały wyższy średni współczynnik tarcia dla materiału odlewanego (tabela 2 i rys. 1). Sytuacja taka zwiana jest z twardością materiałów. Zmierzona średnia twardość odlewanego stopu Co-Cr-Mo-W wyniosła 370±8 HV10, a przerobionego plastycznie stopu Co-Cr-Ni-Mo 325±3 HV10. Według [55] zużycie ścierne stopów kobaltu determinowane jest przez twarde cząsteczki węglika lub twarde występy, które są dociskane przez 215 Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa przeciwpróbkę, a następnie przesuwają się względem współpracujących powierzchni. Dane literaturowe [23] wskazują, że wysokowęglowe stopy CoCrMo zużywają się znacznie słabiej niż stopy niskowęglowe. Tendencja taka wynika stąd, że CoCrMo o niskiej zawartości węgla charakteryzują się niskim udziałem objętościowy węglików. Wpływ na wartość współczynnika tarcia ma środowisko (ośrodek płynny), który stykając się z aktywną powierzchnią wchodzi z nią w interakcję. I tak na przykład środowisko 0,36% NaCl powoduje podwyższenie współczynnika tarcia dla odlewniczych wysokowęglowych stopów kobaltu, obniżenie dla niskowęglowych [55]. Natomiast w innym medium, – w 50% surowicy bydlęcej lub Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium trend ten jest całkowicie odwrotny. Wielkość uzyskanych przez autorów tego artykułu współczynników tarcia jest zbliżona do danych literaturowych [55], gdzie badania były prowadzone dla stopów wysokowęglowych (na poziomie µ=0,19÷0,25) i dla niskowęglowych (na poziomie µ=0,27÷0,28) w różnych ośrodkach płynnych. Tabela 2. Zestawienie wyznaczonych wartości współczynników tarcia badanych materiałów we współpracy z przeciwpróbką z Al2O3 Materiał Odlewany Co-Cr-Mo-W Walcowany Co-Cr-Ni-Mo Średni współczynnik tarcia µ Odchylenie standardowe 0,317 0,028 0,260 0,047 Na rys. 2 przedstawiono zmiany zużycia objętościowego badanych materiałów. Wynika z niego, że stop odlewniczy Co-Cr-M-W charakteryzuje się o ponad czterokrotnie mniejszym zużyciem. Wyższemu współczynnikowi tarcia towarzyszy mniejsze zużycie w teście tribologicznym ball-on-disc. Analiza statystyczna testem Shapiro-Wilka pomiaru zużycia objętościowego wykazała, że otrzymane wyniki nie mają rozkładu normalnego p=<0,05. Natomiast test istotności U Manna-Whitneya (dla α=0,05) wykazał, że różnice w zużyciu są istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy dwoma badanymi materiałami (dla których p=0,00077) Dla obu materiałów wyznaczono wartości współczynników zużycia i tak dla odlewanego stopu CoCr-Mo-W współczynnik K=9,01×10-7mm3N-1m-1, a dla stopu CoCr-Ni-Mo po obróbce plastycznej K=4,33×10-7mm3N-1m-1. 216 Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały a) b) Rys. 1. Wykres zmian współczynnika tarcia w funkcji przebytej drogi przy obciążeniu 10N dla materiałów: (a)odlewany Co-Cr-Mo-W, (b) walcowany Co-Cr-Ni-Mo. 217 Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa Rys. 2.Wykres zużycia objętościowego badanych materiałów uzyskany na dystansie 100m Analiza powierzchni torów po testach tribologicznych – zdjęcia SEM (rys. 3) wskazują na abrazyjny mechanizm zużycia. Wydzielenia twardych węglików w przypadku odlewniczego stopu Co-Cr-Mo-W stanowią naturalną przeszkodę dla materiału przeciwpróbki. Dominującym czynnikiem w przypadku obu materiałów jest mikroskrawanie w postaci ciągłych rys wzdłuż śladów zużycia oraz zużycie ścierne. Intensyfikacja procesu zużycia zachodzi poprzez dodatkowe oddziaływanie luźno przetaczających się twardej fazy (szczególnie widoczne w przypadku stopu Co-Cr-Ni-Mo) między współpracującymi powierzchniami próbki i przeciwpróbki z powierzchniami trącymi. Zachowanie takie determinuje zwiększenie efektu abrazyjnego zużycia badanych stopów. Przetaczające się węgliki powodują powstawanie zarysowań na powierzchni współpracującej próbki lub plastyczną deformację fragmentów osnowy pozostawiając charakterystyczne ślady w postaci bruzd. Autorzy prac [24, 55], także potwierdzają w swoich badaniach, że zużycie abrazyjne stanowi dominujący czynnik powodujący niszczenie warstwy wierzchniej odlewniczych stopów CoCrMo. 218 Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały a) b) Rys. 3.Mikrostruktura SEM śladu zużycia: (a) odlewany Co-Cr-Mo-W, (b) walcowany Co-Cr-Ni-Mo. 219 Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa 4. Podsumowanie Badania składu chemicznego wykazały, że stop odlewniczy Co-Cr-Mo-W charakteryzuje się nieco wyższą zawartością węgla. Co przekłada się na większą twardość tego stopu. Generalnie obydwa materiały kobaltowe należ do grupy stopów niskowęglowych. Uzyskany w teście tribologicznym ball-on-disc niższy współczynnik tarcia dla walcowanego stopu Co-Cr-Ni-Mo przekłada się na większe zużycie. Porównując właściwości obydwu materiałów to w przypadku doboru materiałów na biomateriały, które będą pracowały w warunkach zużycia tribologicznego lepiej sprawdzi się stop odlewniczy Co-Cr-Mo-W. Literatura Marciniak J., Kaczmarek M., Ziembowicz A., Biomateriały w stomatologii, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, Gliwice, 2008 2. Dobrzański L.A., Reimann Ł., Krawczyk C., Effect of age hardening on corrosion resistance and hardness of CoCrMo alloys used in dental engineering, Archives of Materials Science and Engineering, Vol. 57/ Issue 1 (2012) 5-12 3. Dobrzański L.A., Reimann Ł., Influence of Cr and Co on hardness and corrosion resistance CoCrMo alloys used on dentures, Journal of Achievements in Materials and Manufacturing Engineering 49/2 (2011) 193-199 4. Surowska B., Kształtowanie składu chemicznego i struktury stopów Co-Cr-Ni-Mo jako biomateriałów, Wydawnictwo Uczelniane Politechniki Lubelskiej, ISBN 83-87270-46-6, Lublin 1997, 134 5. Leda H., Materiały inżynierskie w zastosowaniach biomedycznych, Wydawnictwo Politechniki Poznańskiej, Poznań, 2012 6. Giacchi J.V., Morando C.N., Fornaro O., Palacio H.A., Microstructural characterization of as-cast biocompatible Co–Cr–Mo alloys, Materials Characterization, 62 (2011) 53-61 7. Grądzka-Dahlke M., Dąbrowski J.R., Dąbrowski B. Modification of mechanical properties of sintered implant materials on the base of Co–Cr– Mo alloy, Journal of Materials Processing Technology, 204 (2008) 199-205 8. Escobedo J., Méndez J., Cortés D., Gómez J., Méndez M., Mancha H., Effect of nitrogen on the microstructure and mechanical properties of a CoCrMo alloy, Mater Des, 17 (1996) 79-83 9. Komorek Z., Jóźwiak S., Kuchta M., Wpływ warunków wytwarzania na właściwości mechaniczne stopu stomatologicznego Co-Cr-Mo-C, Archiwum Odlewnictwa, Vol. 6, No. 18 (2006) 279-282 10. Becker B.S., Bolton J.D., Youseffi M., Production of porous sintered Co-Cr-Mo alloys for possible surgical implants application, Powder Metalurgy, 3 (1995) 201-208 11. Dąbrowski J.R., Oksiuta Z., Porowaty materiał implantacyjny z proszku stopu Vitalium, Inżynieria Materiałowa, 4 (2000) 174-179 1. 220 Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały 12. Dąbrowski J.R., Sidun J., Piszczatowski Sz., Sterna J., Porowate kompozyty ceramiczno-metaliczne na bazie stopu Co-Cr-Mo – potencjalne biomateriały na implanty kostne, Kompozyty, 2/4 (2002) 167-170 13. Krasicka-Cydzik E., Okisiuta Z., Dąbrowski J.R., Corrosion testing of sintered samples made of the Co-Cr-Mo alloy for surgical applications, Journal Materials Science: Materials in Medicine, 2005; 16: 197-202 14. Cordey J., Biofunctionality and biomechanics of implant, (w:) Biomaterialshard tissue repair and replacement, Elsevier Science Publ. 1992, 235-245 15. Marciniak J., Biomateriały w chirurgii kostnej, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, Gliwice, 1992 16. Henriques B. Bond strength enhancement of metal-ceramic dental restorations by FGM design, Tese de Doutoramento Engenharia Mecânica, Universidade do Minho Escola de Engenharia, Minho, 2012 17. Campbell J., Castings: The new metallurgy of cast metals. 2nd edition, Oxford/GB: Elsevier Science & Technology; 2003 18. Stefanescu D.M., Science and engineering of casting solidification. 2nd edition, USA: Springer US; 2009 19. Montero Ocampo C., Talavera M., Lopez H., Effect of alloy preheating on the mechanical properties of as-cast CoCrMoC alloys, Metall Mater Trans A , 30 (1999) 611-620 20. Górny Z., Odlewnicze stopy kobaltu, Instytut Odlewnictwa, Kraków, 2008 21. Podrez-Radziszewska M., Haimann K., Dudziński W., Morawska-Sołtysik M., Characteristic of intermetallic phases in cast dental CoCrMo alloy, Archives of Foundry Engineering, Vol. 10, Issue 3 (2010) 51-56 22. Metcalf J.E.P., Cawley J., Band T.J., Cobalt Chromium Molybdenum Metalon-Metal Resurfacing Orthopaedic Hip Devices, Business Briefing, Medical Device Manufacturing & Technology, 2004, 1-7 23. Yan Y., Neville A., Dowson D., Tribo-corrosion properties of cobalt-based medical implant alloys in simulated biological environments, Wear, Vol. 263 (7-12), (2007) 1417-1422 24. Balagna C., Spriano S., Faga M.G., Characterization of Co–Cr–Mo alloys after a thermal treatment for high wear resistance, Materials Science and Engineering C 32 (2012) 1868-1877 25. Surowska B., Biomateriały metalowe oraz połączenia metal-ceramika w zastosowaniach stomatologicznych, Wydawnictwo Politechniki Lubelskiej, Lublin, 2009 26. Bojar Z., Analiza morfologii i składu chemicznego węglików w odlewniczych stopach kobaltu, Krzepniecie Metali i Stopów, 27/13 (1996) 85-92 27. Bojar Z., Korpikiewicz J., Wpływ niklu na morfologię i skład chemiczny węglików w odlewniczych stopach kobaltu, Krzepnięcie Metali i Stopów, 36/21 (1998) 159-166 28. Opris C.D., Liu R., Yao M.X., Wu X.J.. Development of Stellite alloy composites with sintering/HIPing technique for wear-resistant applications, Mater Des 2007;28:581-91 221 Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa 29. Ramírez LE, Castro M, Méndez M, Lacaze J, Herrrera M, Lesoult G. Precipitation path of secondary phases during solidification of the CoCrMoC alloy, Scripta Materialia, 2002;47:811-816 30. Weeton JW, Clauss FJ. Effect of heat treatment upon microstructures microconstituents and hardness of a wrought cobalt-base alloy, Stellite 21. National Advisory Committee for Aeronautics, Technical Note 3107; March 1954 31. Weeton JW, Signorelli RA. Effect of heat treatment upon microstructures microconstituents and hardness of a wrought cobalt-base alloy, Trans ASM 1955;47:815-45 32. Silverman R, Arbiter W, Hodi F. Effect of sigma phase on Co–Cr–Mo base alloys, Trans ASM 1957;49:805-22 33. Sims CT. Contemporary view of cobalt-base alloys, J Met 1969;21:27–42 34. Dobbs H.S., Robertson J.L.M., Heat treatment of cast Co–Cr–Mo for orthopaedic implant use, J Mater Sci 1983;18:391-401 35. Asgar K., Peyton F.A., Effect of casting conditions on some mechanical properties of cobalt-case alloys, J Dent Res 1961;40:73-86 36. Rajan K., Vander Sande J.B., Room temperature strengthening mechanisms in a Co–Cr–Mo–C alloy, J Mater Sci 1982;17: 769-778 37. Sims C.T., Hagel W., Stoloff N., The Superalloys II: High temperature materials for aerospace and industrial power, 2nd edition. Wiley & Sons Inc.; 1987. Chapter 5 38. Montero Ocampo C., Salinas A., Effect of carbon content on the resistance to localized corrosion of as-cast cobalt-based alloys in an aqueous chloride solution, J Biomed Mater Res 1995; Vol. 29, Issue 4, 441-453 39. Herrera Trejo M., Espinoza A., Méndez J., Castro M., López J., Rendón J., Effect of C content on the mechanical properties of solution treated as-cast ASTM F75 alloys, J Mater Sci Mater Med. 2005;16:607-611 40. Ramírez-Vidaurri L.E., Castro-Román M., Herrera-Trejo M., García-López C.V., Almanza-Casas E., Cooling rate and carbon content effect on the fraction of secondary phases precipitate in as-cast microstructure of ASTM F75 alloy, J Mater Process Technol 2009;209:1681-1687 41. Kilner T., Pilliar R.M., Weatherly G.C., Alibert C., Phase identification and incipient melting in a cast CoCr surgical implant alloy, J Biomed Mater Res 1982;16:63-79 42. Clemow A.J., Daniell B.L., Solution treatment behavior of CoCrMo alloy, J Biomed Mater Res 1979;13:265-79 43. Mancha H., Carranza E., Escalante J.I., Mendoza G., Méndez M., Cepeda F., et al. M23C6 carbide dissolution mechanisms during heat treatment of ASTM F75 implant alloys, Metall Mater Trans A 2001;32A:979-84 44. Vandamme N.S., Que L., Topoleski L.D.T., Carbide surface coating of Co–Cr–Mo implant alloys by a microwave plasma-assisted reaction, J Mater Sci 1999;34:3535-3521 45. Narushima T., Mineta S., Kurihara Y., Ueda K., Precipitates in Biomedical CoCr Alloys, JOM, Vol. 65, No. 4 (2013) 489-504 46. Pohl M., Storz O., Sigma phase in duplex-stainless steels, Z. Metallkd. 95 (2004)631-638 222 Badania tribologiczne stopów kobaltu stosowanych jako biomateriały 47. Joubert J.M., Crystal chemistry and Calphad modelling of the sigma phase, Prog. Mater. Sci. 53 (3) (2008) 528-583 48. Huang P., Liu R., Wu X. J., Yao M. X., Effects of molybdenum content and heat treatment on mechanical and tribological properties of a low-carbon Stellite alloy, Journal of Engineering Materials and Technology, 129(4) (2007), 523-529 49. Karaali A., Mirouh K., Hamamda S., Guiraldenq P., Microstructural study of tungsten influence on CoCr alloys, Mater Sci Eng, A 2005;390:255-299 50. Zhuang L., Langer E.W., Effects of alloy additions on the fatigue properties of cast Co-Cr–Mo alloy used for surgical implants, J Mater Sci 1990; 25:683-689 51. Mineta S., Namba S., Yoneda T., Ueda K., Narushima T., Carbide formation and dissolution in biomedical Co-Cr-Mo alloys with different carbon contents during solution treatment, Metallurgical and Materials Transactions A, Vol. 41A (2010) 2010-2129 52. Caudillo M., Herrera-Trejo M., Castro M.R., Ramírez E., González C.R., Juárez J.I.: J. Biomed. Mater. Res., 59 (2002) 378-385 53. Taylor R.N.J., Waterhouse R.B.: J. Mater. Sci., 18 (1983) 3265–3280. 54. Reimann L., Dobrzański L.A., Influence of the casting temperature on dental Co-base alloys properties, Archives of Materials Science and Engineering 60/1 (2013) 5-12 55. Yan Y., Neville A., Dowson D., Williams S., Tribocorrosion in implants – assessing high carbon and low carbon Co–Cr–Mo alloys by in situ electrochemical measurements, Tribology International. 2006; 39: 1509-1517 56. Walczak M., Pieniak D., Niewczas A.M., Effect of recasting on the useful properties CoCrMoW alloy, Eksploatacja i Niezawodnosc – Maintenance and Reliability, 16, 2014, 330-336 57. Iijima D., Yoneyama T., Doi H., Hamanaka H., Kurosaki N., Wear properties of Ti and Ti–6Al–7Nb castings for dental prostheses, Biomaterials, 2003; 24: 1519-1524 58. Geis-Gerstorfer J., Weber H., In vitro corrosion behaviour of four Ni–Cr dental alloys in lactic acid and sodium chloride solutions, Dental Materials 1987;3:289-295 59. Igual-Muñoz A., Mischler S., Interactive effects of albumin and phosphate ions on the corrosion of a CoCrMo implant alloy, Journal of the Electrochemical Society, Vol. 154 (10), (2007) C562-C570 60. Niinomi M., Recent metallic materials for biomedical applications, Metallurgical and Materials Transactions A, 33A, 2002, 477-486 223 Robert Karpiński, Mariusz Walczak, Joanna Śliwa Tribological research of cobalt alloys used as biomaterials Abstract This study provides information about the cobalt alloys used in dentistry and medicine. The work includes a review of the literature describing the general properties of cobalt alloys. In addition it describes the impact of the manufacturing conditions and alloy additives used , on the structure and mechanical properties of these alloys. The research methodology and the results obtained has been presented in the study. Two cobalt-based alloys Co-Cr-Mo-W and Co-Cr-Ni-Mo were selected for the tests. The first one was prepared with the use of casting technique whereas the second was obtained due to plastic forming. An analysis of the chemical composition and in vitro tribological tests with the use of tribotester of "ball-on-disc" type was conducted. Comparative tribological characteristics of these alloys has been presented. 224 Aleksandra Kuźmińska1, Beata Butruk-Raszeja2 Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka Wysoka umieralność z powodu chorób sercowo-naczyniowych generuje ogromne zapotrzebowanie na sztuczne naczynia krwionośne. Protezy naczyniowe najczęściej wytwarzane są z polimerów. Jednak ciągle nie znaleziono materiału, który w pełni spełniałby wszystkie wymagania stawiane przed biokompatybilnym materiałem. Dlategoaby zminimalizować negatywną odpowiedź organizmu przeprowadza się odpowiednie modyfikacje powierzchni materiału. Idealnym rozwiązaniem może okazać się hybrydowy implant – polimer pokryty komórkami śródbłonka ludzkiego. 1. Zapotrzebowanie na protezy naczyniowe Ludzki układ krwionośny składa się z serca, naczyń krwionośnych oraz krwi. Naczynia krwionośne dzieli się na 3 grupy: tętnice, naczynia włosowate oraz żyły.Tętnice transportują krew z serca do tkanek, gdzie rozgałęziają się na tętniczki. Te transportują krew do najmniejszych naczyń krwionośnych – naczyń włosowatych. Po przejściu przez organ, kapilary łączą się w żyły, które transportują krew do serca [1, 2]. Stan naczyń krwionośnychjak i przepływ krwi mają istotny wpływ na jakość życia. Dostarczają substancji odżywczych do tkanek, a ich zaburzenia lub urazy mogą spowodować krwawienie i zakrzepicę [3]. Umieralność z powodu schorzeń układu krążenia spada, jednak ciągle jest to najczęstszy powód zgonów w Polsce. Na początku lat 90-tych 52% zgonów w Polsce było z powodów chorób układu krążenia. Obecnie (dane z roku 2013) umieralność wynosi 46%.Do chorób układu krążenia zalicza się wszystkie schorzenia, których przyczyną jest nadciśnienie, wysoki poziom cholesterolu, cukrzyca i palenie papierosów. Najczęstszą przyczyną zgonów w Polsce (26,9% wszystkich zgonów) jest choroba wieńcowa serca [4]. Istnieją różne metody leczenia chorób układu krążenia – leki lub metody inwazyjne, np. angioplastyka wieńcowa, pomostowanie tętnic wieńcowych. Jednakże, w przypadku ostrej niewydolności może być konieczny 1 [email protected], Laboratorium Inżynierii Biomedycznej, Zakład Biotechnologii i Inżynierii Bioprocesowej, Wydział Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Politechnika Warszawska 2 [email protected], Laboratorium Inżynierii Biomedycznej, Zakład Biotechnologii i Inżynierii Bioprocesowej, Wydział Inżynierii Chemicznej i Procesowej, Politechnika Warszawska 225 Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja przeszczep naczyń krwionośnych. Jest to trudne do wykonania ze względu na ograniczonąliczbę dawców, dlatego szuka się rozwiązania, które zastąpi tę procedurę. Z pomocą przychodziinżynieria biomateriałowa, ponieważ sztuczne narządy są wytrzymałe mechanicznie i odporne na degradację, jednak muszą być również w odpowiednim stopniu biokompatybilne. Aktualnym celem inżynierii sercowo-naczyniowej jest uzyskanie powłoki, która nie wywołujenegatywnych odpowiedzi organizmu, tak by zmniejszyć potrzebę stosowania antykoagulantów i ryzyko zakrzepicy [5, 6]. Może to doprowadzić do stworzenia protezy naczyniowej o małej średnicy pokrytej komórkami śródbłonka tak, aby jak najbardziej odwzorowywała naturalne naczynie krwionośne. 2. Biomateriały Biomateriałem jest każda powierzchnia lub materiał, która wchodzi w interakcję z żywą tkanką [7]. Biomateriały można podzielić na trzy główne grupy: metale, ceramikę i polimery. Polimery są znacznie bardziej wszechstronne niż metale czy ceramika. Fizyczne, mechaniczne i chemiczne właściwości polimerów mogą stanowić pomoc dla dalszych badań i rozwoju aplikacji biomateriałów polimerowych [8]. Tabela 1 przedstawia wymagania dla biomateriałów, które muszą być spełnione. Tabela 2. Specyfikacja materiału do zastosowań biomedycznych [9] Własność Biokompatybilność Zdolność do sterylizacji Cechy fizyczne Pożądane cechy Niepowodujący stanów zapalnych, nietoksyczny, nie rakotwórczy, kompatybilny z krwią, niealergiczny Niezniszczony przez typowe techniki sterylizujące jak autoklawowanie, tlenek etylenu, promieniowanie Wytrzymałość, elastyczność, odporność 2.1. Metale Metale są nieorganicznymi materiałami z metalicznymi wiązaniami [9]. Ich właściwości zależą od metody produkcji i czystości, aczkolwiek zawsze zapewniają wysoką wytrzymałość i odporność na uszkodzenia. Ze względu na to, metalowe implanty wykorzystywane są głównie do całkowitej wymiany stawów (biodrowego, kolanowego, barkowego) lub do stabilizacji złamań. Materiały metalowe muszą być nie tylko biokompatybilne, ale także odporne na korozję, aby uniknąć uszkodzeń w organizmie. W tabeli 2 przedstawione są metale najczęściej używane w zastosowaniach biomedycznych. 226 Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka Tabela 3. Metale używane, jako implanty [9] Metal Kobalt - stopy chromu Stal nierdzewna Stopy tytanu Złoto, platyna Stopy srebra, cyny i miedzi Zastosowanie Sztuczne zastawki serca, protezy stomatologiczne, ortopedyczne płytki mocujące, stenty naczyniowe Protezy stomatologiczne, ortopedyczne płytki mocujące, stenty naczyniowe Sztuczne zastawki serca, implanty stomatologiczne, śruby ortopedyczne, stenty naczyniowe Plomby dentystyczne, elektrody dla implantów ślimakowych Amalgamat stomatologiczny 2.2. Ceramika Ceramika i szkło są rozumiane, jako nieorganiczne lub metalowe kompozycje z bezkierunkowymi wiązaniami jonowymi lub kowalencyjnymi. Są one wysoko obojętne, twarde i kruche [9]. Materiały ceramiczne mają szerokie zastosowanie takie jak sprzęt diagnostyczny, produkty chemiczne, termometry i inne. Ze względu na odporność na drobnoustroje, zmiany pH i temperatury, a także rodzaj rozpuszczalnika, nierozpuszczalne szkła porowate są używane, jako nośniki enzymów, przeciwciał i antygenów. Ceramika jest również stosowana w stomatologii, jako np. materiał do odbudowy czy wypełnienia stomatologiczne [10]. W tabeli numer 3 przedstawione są zastosowania najczęściej stosowanych ceramicznych biomateriałów. Tabela 4. Zastosowanie najczęściej używanych rodzajów ceramiki [9] Ceramika Tlenki aluminium Tlenki cyrkonu Fosforany wapniowe Bioaktywne szkła Zastosowanie Ortopedyczna proteza stawu, implanty stomatologiczne, powłoki implantów Ortopedyczna proteza stawu, implanty stomatologiczne Powłoki implantów ortopedycznych i stomatologicznych, materiały stomatologiczne Powłoki implantów ortopedycznych i stomatologicznych, implanty stomatologiczne, elementy rekonstrukcji twarzowej, cementy kostne 227 Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja 2.3. Polimery Polimery są organicznymi, syntetycznymi lub naturalnymi materiałami składającymi się z wielu łańcuchów z dużą liczbą (1.000-100.000) małocząsteczkowych powtarzających podjednostek (monomerów), które są połączone wiązaniami kowalencyjnymi. Polimery, dzięki swoim właściwościom fizycznym i chemicznym, znalazły szeroką gamę zastosowań. Jednakże stosując materiał polimerowy należy pamiętać, że polimer może absorbować płyny i cząsteczki z otoczenia. Ponadto, może być konieczne dodanie kilku stabilizatorów zapobiegających ich rozkładowi. Substancje te mogą być niebezpieczne dla organizmu, dlatego ważne jest, aby zapobiec ich wymywaniu[9]. W tabeli 4 zostały przedstawione przykłady polimerów i ich zastosowanie. Tabela 5. Polimery i ich biomedyczne zastosowanie [9] Polimer Polietylen Polipropylen Polidimetylosiloksan (PDMS) Polietylenotereftalan (PET) Chitozan Zastosowanie Ortopedyczna proteza stawu, strzykawki Zastawki serca, szwy, strzykawki Implanty piersi, soczewki kontaktowe, zastawki serca, sztuczne serce Sztuczne naczynia krwionośne, szwy Opatrunki Wiele urządzeń stosowanych w leczeniu chorób układu krążenia jak protezy zastawki serca, protezy naczyniowe wykonane są z polimerów, głównie z poliuretanu oraz politereftalanu etylenu (PET) [8]. 3. Odpowiedź organizmu na materiał Wszystkie materiały wszczepiane do żywego organizmu powodują odpowiedź otaczających tkanek, zwłaszcza materiały będące w kontakcie z krwią. W przeciwieństwie do naturalnej tkanki, powierzchnia biomateriału nie utrzymuje stanu homeostazy. Dlatego tuż po wszczepieniu implantu, zachodzi adsorpcja niespecyficznego białka na powierzchni biomateriału. Inicjuje to reakcje prowadzące do powstawania zakrzepów [11]. Po uszkodzeniu naczynia proces hemostazy ma na celu najpierw stworzenie skrzepu i zatrzymanie nieciągłości naczynia krwionośnego a następnie doprowadzenie do ponownej drożności naczynia [3,12-14]. 3.1. Zjawiska zachodzące po implantacji biomateriału Gdy biomateriał jest wprowadzany do ciała, w otaczającej tkance rozpoczyna się sekwencja zdarzeń, która ostatecznie kończy się tworzeniem olbrzymichwielojądrzastychkomórek na granicy faz 228 Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka tkanka/materiał. Konsekwencje reakcji na powierzchni materiału mogą być katastrofalne. Naukowcy dążą do stworzenia biomateriału połączonego z komórkami, białkami i/lub innymi składnikamibiologicznych, abystworzyć hybrydowy implant, odpowiedni do funkcjonalnej regeneracji uszkodzonych lub chorych tkanek[15]. Zapalenie jest definiowane, jako reakcja żywej unaczynionej tkanki na lokalne uszkodzenie. Zapalenie można podzielić naostre i przewlekłe. Ostre zapalenie jest trwa stosunkowo krótko - od kilku minut, przez kilka godzin do kilku dni,w zależności od stopnia uszkodzenia. Jego główne cechy to wysięk płynu i białek osocza,a także leukocytów (głównie neutrofili). Neutrofile, leukocyty i inne ruchliwe białe ciałka wydostają sięlub są przenoszone z naczyń krwionośnych do tkanki. Natomiast przewlekłe zapalenie jest mniej jednorodne histologicznie od ostrego zapalenia. Na ogół, przewlekłe zapalenie charakteryzuje się obecnością makrofagów, monocytów i limfocytów, przy proliferacji naczyń krwionośnych i tkanki łącznej [16]. Natychmiast po uszkodzeniu następują zmiany przepływu, kalibru i przepuszczalności naczyń. Płyny, białka i krwinki wydostają się z układu naczyniowego do uszkodzonej tkanki. Interakcje krew-materiał i reakcje zapalne są ściśle ze sobą związane, w rzeczywistości wczesne reagowanie na uszkodzenia obejmują głównie krew i naczynia krwionośne. Początkowa reakcja zapalna jest aktywowana przez zranienie unaczynionej tkanki. Przez zaangażowanie krwi i jej składników w początkową reakcję zapalną, może wystąpić wytworzenie skrzepu krwi[16]. Uraz unaczynionej tkanki przez implantację biomateriału prowadzi do natychmiastowego rozwoju tymczasowej matrycy na powierzchni implantu. Składa się ona z fibryny, wytwarzanej przez aktywację układu krzepnięcia, aktywowanych płytek krwi, komórek układu odpornościowego oraz komórek śródbłonka. Zdarzenia te występują wcześnie, w ciągu kilku minut do kilku godzin po implantacji materiału. Elementy wewnątrz lub uwolnione z tymczasowej matrycy, np. sieć fibryny (skrzep), inicjują procesy reorganizacji i naprawy. Kompleks trójwymiarowej struktury sieci fibryny z przyłączonymi białkami adhezyjnymi zapewnia podłoże dla adhezji i migracji komórek [16]. Wielkość, kształt i właściwości fizyczne i chemiczne biomateriału mogą być odpowiedzialne za różnice w intensywności i czasu trwania procesu zapalnego i gojenia ran. A zatem, intensywność i/lub czas trwania reakcji zapalnej może charakteryzować biozgodność biomateriału [16]. 229 Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja 4. Komórki śródbłonka Ściany naczyń krwionośnych składają się z trzech warstw. Najbardziej zewnętrzna, przydanka, zbudowana jest głównie z włókien kolagenowych, które przytwierdzają naczynie do otoczenia. Media, czyli warstwa środkowa zbudowana jest z okrężnej mięśniówki gładkiej, włókien kolagenowych i sprężystych. Natomiast wewnętrzna warstwa, intima, zbudowana jest ze śródbłonka i niewielkiej ilości wiotkiej tkanki łącznej [1]. 4.1. Endotelium Endotelium (śródbłonek) składa się z jednej warstwy komórek płaskich o grubości 0,2-0,3 µm. Biorąc pod uwagę liczbę komórek śródbłonka obecnych w organizmie dorosłego człowieka (około 1x1012), jego masę (1-2 kg), powierzchnię (700-2000 m2), syntezę i uwalnianie substancji ze zróżnicowanym wpływem biologicznym, endotelium można rozpatrywać jako integralny narząd [17÷20]. Od strony światła naczynia krwionośnego komórki śródbłonka są pokryte warstwą glikokaliksu, utworzoną głównie z glikozoami-noglikanów, z dominacją siarczanu heparanu. Glikokaliks, z uwagi na obecność grup siarczanowych, daje wewnętrznej ścianie naczynia krwionośnego ujemny ładunek elektrostatyczny. Zapewnia dzięki temu niezwilżalność powierzchni w procesie elektrostatycznego odpychania elektroujemnych cząsteczek, włącznie z albuminą. Glikokaliks bierze także udział w transporcie przez błonowym, odpowiada za procesy immunologiczne [17]. Cechą charakterystyczną komórek śródbłonka jest obecność znacznej ilości pęcherzyków pinocytarnych i białek transportowych, co wskazuje na wysoką aktywność metaboliczną. Śródbłonek wytwarza również tlenek azotu (śródbłonkowy czynnik rozkurczowy), który bierze udział w relaksacji mięśni gładkich naczyń [17]. Tlenek azotu jest uwalniany z komórek śródbłonka w odpowiedzi na siły ścinające działające na ścianę naczynia [21]. Komórki śródbłonka tworzą barierę między krwią a mięśniami gładkimi naczyń. Odgrywają również ważną rolę w regulacji hemostazy, angiogenezy, procesów zapalnych oraz immunologicznych. Komórki śródbłonka, ze względu na swoje położenie, są w pierwszej linii styku z komórkami i substancjami, które przechodzą z krwi do tkanek zarówno w czasie biernej dyfuzji jak i transportu aktywnego [3, 17, 22]. Endotelium jest również zaangażowane w proces kontrolowania przepuszczalności naczyń dla białek i substancji rozpuszczalnych, regulowania ciśnienia krwi[22÷24]. W warunkach fizjologicznych, śródbłonek zapewnia przewagę związków przeciwzakrzepowych nad pro koagulacyjnymi. Śródbłonek 230 Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka zapewnia również braku dostępu dla leukocytów i receptorów płytek, dzięki czemu zapobiega ich aktywacji [17]. Śródbłonek jest strukturą łatwą do pobudzenia i szybko reagującą na bodźce, które wynikają z jego aktywacji oraz zmian w funkcjonowaniu. Uszkodzenia mechaniczne lub utrata integralności funkcjonalnej zakłóca stan równowagi zapewnianej przez te komórki, co prowadzi do rozwoju wielu zmian chorobowych, takich jak wysokie ciśnienie krwi, miażdżycy, tworzenia zakrzepów. Endotelium produkuje szereg czynników wzrostu, które wpływają na podstawową warstwę mięśniówki gładkiej, regulują jej metabolizm i migrację, proliferacji jak i apoptozę komórek. Śródbłonek bierze również udział w syntezie składników macierzy zewnątrzkomórkowej [17]. 5. Poprawa biokompatybilności implantów Nie ma jednej właściwej definicji pojęcia biokompatybilności i tego jak można ją zmierzyć [7]. Jednakże może być zdefiniowana, jako zdolność materiału do prawidłowego działania z odpowiednią odpowiedzią organizmu w specyficznym zastosowaniu [25]. Oznacza to, że materiał biokompatybilny nie może powodować śmierci komórki, przewlekłego stanu zapalnego ani zaburzać funkcji komórek czy tkanek. Materiał nie może być cytotoksyczny, musi być stabilny i bezpieczny, szczególnie w przypadku degradacji. Ważną rzeczą w materiałach biozgodnych jest ich powierzchnia - jest w stałym kontakcie z organizmem. Zwłaszcza w materiałach będących w kontakcie z krwią, ponieważ oddziaływania ich powierzchni z krwią są czynnikiem krytycznym [11].W związku z tym, właściwości fizyczne i chemiczne implantowanego materiału powinny być zgodne z otaczającą tkanką. Projektując implant tworzy się kształt i strukturę dostosowaną do charakterystyki wymienianej tkanki [6, 9]. Celem inżynierii powierzchniowej, oprócz uniknięcia szkodliwego wpływu implantacji materiału, jest poprawienie oddziaływania między badanym materiałem a otaczającymi go tkankami[9, 26]. W związku z tym, że ciągle nie znaleziono materiału, który w pełni spełniałby wszystkie te wymagania, poprawa na biokompatybilności w ostatnich latach stała się bardzo popularnym tematem; naukowcy zaproponowali wiele metod jej polepszania. Powierzchnie materiałów mogą być modyfikowane, aby być biopasywne (czyli bierne/neutralne dla otaczającego środowiska) lub aktywne, co oznacza, że mogą wchodzić w interakcje z cząsteczkami w organizmie[11]. 231 Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja 5.1. Powierzchnie biopasywne Jak sama nazwa wskazuje, biopasywne powierzchnie się biologicznie neutralne.Przy projektowaniu takiego materiału, główną zasadą jest ograniczenie negatywnych reakcji immunologicznych organizmu [27]. Biopasywne powierzchnie zmniejszają przyczepianie się komórek i adsorpcję protein. Może to być dobre rozwiązanie dla materiałów będących w kontakcie z krwią, ponieważ może zapobiec tworzeniu się skrzepu [11]. Dodatkowo biopasywne powierzchnie zapobiegają adhezji bakterii [28]. Jedną z dobrze znanych cząsteczek służących do modyfikacji powierzchni jest poli(tlenek etylenu) (PEG). Cząsteczka ta jest powszechnie stosowana ze względu na swoje unikalne właściwości, w tym hydrofilowość oraz brak toksyczności. PEG jest znany także z zapobiegania adsorpcji protein do powierzchni biomateriału [29, 30]. PEG może być wprowadzony na powierzchnię materiału na wiele sposobów – poprzez fizyczną adsorpcję lub procesy chemiczne. Kowalencyjne przyczepianie jest najbardziej korzystną ze stosowanych metod ze względu na długą stabilności zmodyfikowanej powierzchni [29, 31]. Innym podejściem do biopasywnych powierzchni są hydrożele. Hydrożele są materiałami usieciowanymi przestrzennie, które pęcznieją w środowisku wodnym. Są zbudowane z hydrofilowych polimerów naturalnych, syntetycznych lub półsyntetycznych zawierających grupy hydroksylowe, aminowe, amidowe, eterowe i sulfonowych. Podczas pochłaniania dużej ilości wody, hydrożele utrzymują swoją trójwymiarową strukturę [32]. Hydrożele mają podobne właściwości fizyczne do żywych tkanek. Charakteryzują się wysoką zawartością wody, plastycznością i miękkością. Ponadto, białka z płynów ustrojowych są minimalnie adsorbowane do ich powierzchni [32]. Hydrożele można stworzyć metodami fizycznymi (np. sieciowania przez oddziaływania jonowe) i chemicznymi (np. sieciowania przez polimeryzacje rodnikowe lub przy użyciu enzymów) [33, 34]. 5.2. Powierzchnie bioaktywne Alternatywnym podejściem jest umieszczenie na powierzchni materiału bioaktywnej cząsteczki, która będzie promować lub podtrzymywać pozytywną reakcję otaczających tkanek [27, 35]. Biomimiczne materiały są w stanie spowodować specyficzną odpowiedź komórkową [35]. Duża grupa biomateriałów (np. polimery, metale i szkło) może być modyfikowana poprzez wprowadzenie białka na ich powierzchnie. Ponadto, jest duża różnorodność technik modyfikacji powierzchni, 232 Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka na przykład wprowadzenie cząsteczki spacera na powierzchnię materiału lub fotochemiczna immobilizacja [35÷38]. Tabela 6. Selektywne syntetyczne sekwencje peptydowe używane w modyfikacji powierzchniowej [35] Syntetyczna sekwencja RGD YIGSR REDV KQAGDV Funkcja Adhezja komórek Adhezja komórek Adhezja komórek śródbłonka Adhezja komórek mięśniowych Jak można zauważyć w tabeli 5, głównym celem większości modyfikacji powierzchniowych jest zwiększenie adhezji komórek i ich proliferacji. Pierwsze bioaktywne powierzchnie opierały się na długich łańcuchach białkowych (np. fibronektyna). Obecnie stwierdzono, że krótkie syntetyczne sekwencje również mogą być stosowane w celu zwiększenia adhezji komórek. Zastosowanie krótkich sekwencji zapobiega losowemu ułożenia łańcuchów w przestrzeni i pozwala uniknąć niepożądanych reakcji immunologicznych, ponieważ zostały one wyizolowane z innych żywych organizmów [35, 36]. Ponadto wprowadzenie bioaktywnych cząsteczek równocześnie zmienia hydrofilowość powierzchni, co również prowadzi do zwiększenia adhezji komórek [39, 40]. Opracowanie odpowiedniej bioaktywnej może doprowadzić do stworzenia hybrydowej protezy naczynia krwionośnego – polimerowego szkieletu pokrytego ludzkimi komórkami śródbłonka. Użycie sekwencji peptydowej może pozwolić na wprowadzenie na materiał selektywnie komórek endotelialnych. Ta selektywność pozwoli na zasiedlenie materiału tylko tymi komórkami, tak jak w naturalnych naczyniach krwionośnych. Dzięki pokryciu materiału przez komórki, nie będzie on narażony na kontakt z krwią, co zmniejszy możliwość powstania skrzepu w miejscu implantacji. 5.2.1. Heparyna W literaturze jedną z najszerzej opisanych immobilizowanych cząsteczek jest cząsteczka heparyny – jest to polisacharyd o działaniu przeciwzakrzepowym. Heparyna na powierzchni implantu naczyń krwionośnych katalizuje tworzenie kompleksu pomiędzy białkami obecnymi w osoczu krwi, które pozostają nieaktywne i nie prowadzą do uruchomienia kaskady krzepnięcia [2, 41]. Stosuje się różne fizyczne, jonowe i kowalencyjne techniki immobilizacji heparyny na powierzchni materiału. Sposób fizycznego wiązania jest najmniej skuteczny ze względu na dużą szybkość wymywania heparyny z powierzchni. Najbardziej 233 Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja powszechnie stosuje się metodę pośredniego kowalencyjnego wiązania heparyny z użyciem cząsteczki linkera [42]. 5.2.2. Trombomodulina Trombomodulina jest glikoproteiną obecną na powierzchni komórek. Cząsteczka ta odgrywa ważną rolę w utrzymywaniu homeostazy naczyń krwionośnych przez wiązanie się z trombiną oraz hamowanie tworzenia skrzepu [43-45]. Trombomodulina ma jeszcze bardziej skuteczne działanie przeciwzakrzepowe niż heparyna [44]. Materiały pokryte trombomoduliną redukują aktywacje procesu krzepnięcia krwi [45]. 5.2.3. Tlenek azotu Tlenek azotu jest związkiem chemicznym produkowanym przez komórki śródbłonka [17]. Jego zadaniem jest zapobieganie aktywacji i adhezji leukocytów oraz zmniejszenie agregacji płytek krwi, tworzeniu się zakrzepów, a także przeciwdziałanie proliferacji komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych [46]. Materiały modyfikowane są głównie w celu opracowania powierzchni zdolnej do przekształcenia proleku L-argininy do aktywnego leku tlenku azotu [46]. 5.2.4. Peptydy Biomimetyczne materiały są zaprojektowane tak, aby przypominać zewnątrzkomórkową macierz komórkową (ECM). ECM jest wytwarzany przez komórki, wypełniając przestrzeń między nimi. ECM tworzą białka, glikoproteiny i proteoglikany. Ponadto, aby zapewnić strukturalne wsparcie dla komórek, ECM wspiera ich podział, wzrost oraz rozwój [46]. Wyizolowano izidentyfikowano różne sekwencje peptydowe pochodzące z ECM, które mają wpływ na zachowanie się komórek.Używa się ich do modyfikacji powierzchniowej materiałów w celu polepszenia ich właściwości biologicznych, głównie do promowania adhezji komórek (Tabela 5) [46]. Sekwencja RGD RGD (Arg-Gly-Asp) jest sekwencją najczęściej używaną do modyfikacji biomateriałów. Sekwencja ta jest główną domeną wiążącą integryny obecną w różnych białkach ECM. RGD jest stosowana w celu promowania adhezji wszystkich typów komórek, nie tylko komórek śródbłonka [35, 47]. 234 Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka Rysunek 4 Struktura sekwencji peptydowej RGD Sekwencja REDV Tetrapeptyd REDV, Arg-Glu-Asp-Val, jest peptydem pochodzącym z fibronektyny. Jest znany z właściwości adhezyjnych - pozwala na adhezję i proliferację komórek śródbłonka, ale ogranicza adhezję innych komórek i płytek krwi [35, 47-52]. Rysunek 5. Struktura sekwencji peptydowej REDV Sekwencja IKVAV Peptyd IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val) pochodzi z α-łańcucha lamininy. Dowiedziono, że promuje proces adhezji komórek śródbłonka a także stymuluje migrację komórek i tworzenie sieci naczyń włosowatych[53]. 235 Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja Rysunek 6. Struktura sekwencji peptydowej IKVAV 6. Podsumowanie Jak dowiedziono, jest ogromne zapotrzebowanie na protezy naczyń krwionośnych. Tworzy się je z różnych materiałów, wśród których prym wiodą polimery, jakie jak poliuretan czy PET. Tworzywa te same w sobie są biokompatybilne, jednak niewystarczająco. Jest szereg metod modyfikacji, które pozwalają na poprawienie biokompatybilności, m.in. przez stworzenie bioaktywnej powierzchni, która promuje adhezję komórek, przede wszystkim komórek śródbłonka. Modyfikacje z użyciem sekwencji peptydowych są popularnych kierunkiem badań. Ta modyfikacja jest prostym procesem do przeprowadzenia oraz trwały sposób wiązania peptydu do powierzchni.Najczęściej używaną sekwencją jest sekwencja REDV z powodu selektywności tylko względem komórek śródbłonka. Dodatkowo użycie tego rodzaju komórek pozwoli na odtworzenie naturalnego naczynia krwionośnego. Pozwoli to także w znacznym stopniu zminimalizować negatywną odpowiedź organizmu, ponieważ śródbłonek bierze udział w utrzymaniuhomeostazy ustrojowej. 236 Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka Literatura 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Seal B. L., Otero T.C., Panitch A. Polymeric biomaterials for tissue and organ regeneration, Materials Science and Engineering,34 (2001) Solomon E., Berg L., Martin D., Villee C. Biologia,Warszawa: Multico Oficyna Wydawnicza (2000) Rasche H. Haemostasis and thrombosis: an overview. European Heart Journal Supplements, 3 (2001) Główny urząd statystyczny Departament Badań Demograficznych i Rynku PracyNotatka Informacyjna.Podstawowe informacjeo rozwoju demograficznym Polski do 2014roku,2701 2015 Anderson J.M. Biological Responses to Materials,Annual Reviews, 31(2001) Kohane D.S., Langer R. Polymeric Biomaterials in Tissue Engineering,Pediatric Research, 63(2008) Ratner B.D., Hoffman A.S., Schoen F.J., Lemons J. Biomaterials Science: A Multidisciplinary Endeavor,Biomaterials Science,Academic Press (2012) He W., Benson R. Handbook of Biopolymers and Biodegradable Plastics,Elsevier (2012),Polymeric Biomaterials Bauer S., Schmuki P., von der Mark K., Park J. Engineering biocompatible implant surfaces, Part I: Materials and surfaces,Progress in Materials Science, 58(2013) Hench L.L., Best S.M. Biomaterials Science, An Introduction to Materials in Medicine, Academic Press (2012), Ceramics, Glasses and Glass-Ceramics: Basic Principles Yu K., Mei Y., Hadjesfandiari N., Kizhakkedathu J.N. Engineering biomaterials surfaces to modulate the host response,Colloids Surf. B (2014) Sokołowska B. Newer concept of blood coagulationZamojskie Studia i Materiały, 34(2011) Kapłon A., Biskup P. Farmakoterapia przeciwzakrzepowa i fibrynolityczna aspekty praktyczne,Studia Medyczne Akademii Świtokrzystkiej, 4(2006) Sokołowska B.The physiological function of hemostasis,Acta Haematologica Polonica, 41(2010) Anderson J.M., Rodriguez A., Chang D.T. Foreign body reaction to biomaterials,Seminars in Immunology, 20 (2008) Anderson J.M. Biomaterials Science An Introduction to Materials in Medicine Elsevier (2013), Inflammation, Wound Healing, And The Foreign-Body Response Wnuczko K., Szczepański M. Endothelium – characteristics and functions,Polski Merkuriusz Lekarski, 133(2007) d’Alessio P. Aging and the endothelium,Experimental Gerontology,39 (2004) Blann A.D. Assessment of Endothelial Dysfunction: Focus on Atherothrombotic Disease,Pathophysiol Haemost Thromb,33 (2003/2004), Sumpio B.E., Riley J.T., Dardik A. Cells in focus: endothelial cell, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 34(2002) 237 Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja 21. Obońska K., Grąbczewska Z., Fisz J. Ocena czynności śródbłonka naczyniowego - gdzie jesteśmy, dokąd zmierzamy? Folia Cardiologica Excerpta, 5(2010) 22. Sagripantil A., Carpi A. Antithrombotic and prothrombotic activities of the vascular endothelium,Biomed & Pharmacother, 54(200) 23. Vestweber D., Winderlich M., Cagna G., Nottebaum A.F. Cell adhesion dynamics at endothelial junctions: VE-cadherin as a major player, Trends in Cell Biology, 19 (2008) 24. Razakandrainibea R., Combesb V., Graub G. E., Jamboua R. Crossing the wall: The opening of endothelial cell junctions during infectious diseases,The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 45(2013) 25. Williams D.F.Definitions in biomaterials: proceedings of a consensus conference of the European Society for Biomaterials Elsevier (1987) 26. Ma P. X. Biomimetic materials for tissue engineering,Advanced Drug Delivery Reviews,60 (2008) 27. Chena H., Yuana L., Songa W., Wu Z., Li D. Biocompatible polymer materials: Role of protein–surface interactions,Progress in Polymer Science, 33 (2008). 28. Charnley M., Textor M., Acikgoz C. Designed polymer structures with antifouling–antimicrobial properties,Reactive & Functional Polymers, 71(2011) 29. Jo S., Park K. Surface modifcation using silanated poly(ethylene glycol)s,Biomaterials, 21(2001) 30. Sharma S., Johnson R., Desai T. Ultrathin poly(ethylene glycol) films for silicon-based microdevices,Applied Surface Science, 26 (2003) 31. Gombotz W., Guanghui W., Horbett T., Hoffman A. Protein adsorption to poly(ethylene oxide) surfaces,J Biomed Mater Res, 25 (1991) 32. Gupta P., Vermani K., Garg S. Hydrogels: from controlled release to pH responsive drug delivery, Drug Discovery Today, 10 (2002) 33. Pluta J., Karolewicz B. Hydrogels: properties and application in the technology of drug form. I. The characteristic hydrogels, Polimers in medicine, 34(2004) 34. Hennink W.E., van Nostrum C.F. Novel crosslinking methods to design hydrogels,Advanced Drug Delivery Reviews. 64(2012) 35. Shin H., Jo S., Mikos A.G. Biomimetic materials for tissue engineering,Biomaterials, 24(2003) 36. Hersel U., Dahmen C., Kessler H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond,Biomaterials, 24(2003) 37. Dee K.C., Andersen T.T, Biziosa R. Osteoblast population migration characteristics on substrates modified with immobilized adhesive peptides, Biomaterials, 20 (1999) 38. Sugawara T., Matsuda T. Photochemical surface derivatization of a peptide containing Arg-Gly-Asp (RGD),J Biomed Mater Res,29 (1995) 39. Grinnell F.Cellular adhesiveness and extracellular substrata,International Review of Cytology, 53(1978) 238 Bioaktywne powierzchnie promujące proces adhezji komórek śródbłonka 40. van Wachem P.B., Beugeling T., Feijen J., Bantjes A., Detmers J.P., van Aken W.G. Interaction of cultured human endothelialc ellsw ith polymerics urfaces of different wettabilities, Biomaterials,6 (1985) 41. Sobczak M., Olędzka E., Kołodziejski W.L., Kuźmicz R. Polymers For Pharmaceutical Applications,Polimery,52 (2007) 42. Michanetzis G.P.A., Katsala N., Missirlis Y.F. Comparison of haemocompatibility improvement of four polymeric biomaterials by two heparinization techniques,Biomaterials, 24(2003) 43. Rochfort K.D., Cummins P.M. Thrombomodulin regulation in human brain microvascular endothelial cells in vitro: Role of cytokines and shear stress, Microvascular Research,97 (2015) 44. Vasilets V.N., Hermel G., Konig U., Werner C., Muller M., Simon F., Grundke K., Ikada Y., Jacobasch H.J. Microwave CO2 plasma-initiated vapour phase graft polymerization of acrylic acid onto polytetrafluoroethylene for immobilization of human thrombomodulin, Biomaterials, 18(1997) 45. Sperling C., Salchert K., Streller U., Werner C. Covalently immobilized thrombomodulin inhibits coagulation and complement activation ofartificial surfaces in vitro,Biomaterials, 25 (2004) 46. de Mel A., Jell G., Stevens M.M., Seifalian A.M. Biofunctionalization of Biomaterials for Accelerated in Situ Endothelialization: A Review, Biomacromolecules,9 (2008) 47. Lei Y., Re´my M., Labruge`re C., Durrieu M. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration,J Mater Sci: Mater Med., 23 (2012) 48. Ji Y., Wei Y., Liu X., Wang J., Ren K., Ji J. Zwitterionic polycarboxybetaine coating functionalized with REDV peptide to improve selectivity for endothelial cells,J Biomed Mater Res Part A, 100A(2012) 49. Andukuri A., Minor W.P., Kushwaha M., Anderson J.M., Jun H. Effect of endothelium mimicking self-assembled nanomatrices on cell adhesion and spreading of human endothelial cells and smooth muscle cells,Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 6 (2010) 50. Wei Y., Ji Y., Xiao L., Lin Q., Ji J. Different complex surfaces of polyethyleneglycol (PEG) and REDV ligand to enhance the endothelial cells selectivity over smooth muscle cells,Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,84 (2011) 51. Lin Q., Hou Y., Ren K., Ji J. Selective endothelial cells adhesion to Arg-Glu-AspVal peptide functionalized polysaccharide multilayer,Thin Solid Films, 520(2012) 52. Wei Y., Ji Y., Xiao L., Lin Q., Xu J., Ren K., Ji J. Surface engineering of cardiovascular stent with endothelial cell selectivity for in vivo reendothelialisation,Biomaterials,34 (2013) 53. Ali S., Saik J., Gould D.J., Dickinson M.E., West J.L. Immobilization of CellAdhesive Laminin Peptides in Degradable PEGDA Hydrogels Influences Endothelial Cell Tubulogenesis,BioResearch Open Access, 2 (2013) 239 Aleksandra Kuźmińska, Beata Butruk-Raszeja Bioactive surfaces promoting endothelial cell adhesion process Huge demand for artificial blood vessels is caused by high mortality due to the cardiovascular diseases. Polymers are most commonly used material for prosthesis fabrication. Unfortunately fully biocompatible material has still not been found. Therefore, in order to minimize the negative organism response material surface modifications are carried out. The optimal solution might be a hybrid implant - polymer coated with human endothelial cells. 240
