Polimeraza poli(ADP-rybozy)-1 i jej udział w patomechanizmie
advertisement
Polimeraza poli(ADP-rybozy)-1 i jej udział w patomechanizmie wybranych chorób Paulina Gil-Kulik Zakład Genetyki Klinicznej Uniwersytet Medyczny w Lublinie Ul. Radziwiłłowska 11, 20-080 Lublin Streszczenie Polimeraza Poli ADP-rybozy (PARP-1) jest jądrowym enzymem regulacyjnym obecnym u eukariontów. Białko to jest ważnym elementem sygnalizacyjnym komórki i uczestniczy w wielu procesach komórkowych takich jak: podział komórki, transkrypcja, replikacja, utrzymanie stabilności genomu, naprawa uszkodzeń DNA, różnicowanie, proliferacja, nekroza oraz apoptoza. Polimeraza Poli(ADP-rybozy)-1 kodowana jest przez gen PARP-1 zlokalizowany w długich ramionach chromosomu 1, należy do rodziny enzymów (PARP), które wykorzystują NAD+ jako substrat do syntezy polimerów ADP-rybozy. Przypuszcza się, że nadmierna aktywacja enzymu PARP-1 powodowana występowaniem stresu oksydacyjnego i genotoksycznego ma udział w patomechanizmie chorób naczyniowych, neurodegeneracyjnych, wstrząsu septycznego, cukrzycy typu I, zaburzeń immunologicznych a także chorób nowotworowych. Dotychczasowe doświadczenia pokazują, że inhibitory PARP-1 w monoterapii oraz połączeniu z innymi cytostatykami mogą być wykorzystane do projektowania nowoczesnych terapii przeciwnowotworowych. Słowa kluczowe: polimeraza Poli(ADP-rybozy)-1, PARP-1, naprawa DNA Polimeraza Poli ADP-rybozy-1 znana również jako syntetaza Poli ADP-rybozy i transferaza Poli ADP-rybozy jest najlepiej poznanym członkiem rodziny 18 enzymów (PARP), które wykorzystują NAD+ jako substrat do syntezy polimerów ADP-rybozy. Enzymy te katalizują transfer 2’(5’’fosforybozylo)-5-AMP na miejsce akceptorowe – grupy karboksylowe kwasu glutaminowego i kwasu asparaginowego, modyfikując funkcjonalne właściwości białek. PARPs syntetyzują polimery PAR o różnej długości, ich przyłączanie do substratów jest istotne dla przebiegu procesów fizjologicznych i patologicznych. Enzym PARP-1 syntetyzuje i przyłącza kowalencyjnie jednostki ADP-rybozy do własnych cząsteczek (automodyfikacja) oraz katalizuje ich transfer na inne białka [5,8,10,11]. Polimeraza Poli(ADP-rybozy) kodowana jest przez gen PARP-1 (ang. Poli (ADP-ribose) polimerase) (ADPRT/PPOL) zlokalizowany w długich ramionach chromosomu 1 (1q41q42) zawiera 23 eksony w przebiegu 43 kpz. Białko hPARP należy do rodziny 18 białek odpowiedzialnych za odwracalne potranslacyjne modyfikacje protein w komórkach Eucaryota, zawierających domeny katalityczne PARP. Jest jądrowym enzymem regulacyjnym o masie cząsteczkowej 113 kDa, składa się z 1014 aminokwasów. Białko to charakteryzuje się obecnością trzech głównych domen: N-końcowej łączącej się z DNA; domeny automodyfikacyjnej oraz domeny Ckońcowej – katalitycznej. N-końcowa (aminokońcowa) domena wiążąca DNA (DBD DNA binding domain), zawiera 2 palce cynkowe, które określają motyw (czujnik przerwy DNA) (masa cząsteczkowa domeny wynosi 46 kDa; 1-373aa). W obrębie DBD wyróżnia się 3 moduły funkcjonalne A-C, moduł B zawiera sygnał lokalizacji jądrowej NLS, w obrębie którego występuje sekwencja aminokwasowa DEVD będąca miejscem ataku kaspazy 3. W procesie apoptozy PARP-1 jest cięty na fragmenty o masie cząsteczkowej 89 i 24 kDa (marker apoptozy). Obecność domeny DBD w strukturze PARP ma znaczenie w łączeniu się enzymu z uszkodzeniami w DNA. Centralna automodyfikacyjna domena (AD – automodification domain) obejmuje motyw BRCT (BRCA1 C-terminal), przez który PARP-1 uczestniczy w interakcjach białko-białko (374-525aa). W obrębie AD występuje domena funkcjonalna D. C-końcowa katalityczna domena (CD–catalytic domain) zawiera podpis PARP, wysokokonserwatywną sekwencję (50aa) w rodzinie białek PARP, która formuje stronę aktywną enzymu (526-1014aa). W domenie tej występuje region odpowiedzialny za oddziaływanie enzymu z kwasami nukleinowymi [5,8,10,11]. Uważa się, że polimeraza Poli (ADP-rybozy) jest ważnym elementem sygnalizacyjnym komórki i uczestniczy w wielu procesach komórkowych takich jak: podział komórki, transkrypcja, replikacja, utrzymanie stabilności genomu, naprawa uszkodzeń DNA, nekroza oraz apoptoza [1,2,5,8,11]. W badaniach wykazano, że aktywacja PARP jest związana jest z naprawą uszkodzeń DNA po destrukcyjnym wpływie promieniowania jonizującego. Pęknięcia nici DNA stymulują katalityczną aktywność PARP-1, dochodzi do wiązania się enzymu z nacięciami w nici oraz syntezy Poli (ADP-rybozy) z dinulkeotydu nikotyno-amidoadeninowego. W trakcie tego procesu z NAD+ uwalniany jest nikotynamid, który z wykorzystaniem innych enzymów i ATP przenoszony jest z powrotem na NAD. Fizjologicznie aktywność PARP jest minimalna, natomiast w warunkach uszkodzenia DNA dochodzi nawet do 500- krotnego wzrostu aktywności enzymu. Katabolizm cząstek PAR aktywowany jest przez PARG (Poli(ADP-rybozo) glikohydrolaza. Zaobserwowano udział PARG w formowaniu wrzeciona mitotycznego, regulacji cyklu komórkowego oraz rozwoju organizmu. Stwierdzono, że polimeraza Poli ADP-rybozy zaangażowana jest w proces naprawy pojedynczych uszkodzeń DNA w mechanizmie wycinania zasad - BER. Enzym rozpoznaje miejsce uszkodzenia i czasowo łączy się z nim, dzięki temu białka odpowiedzialne za naprawę otrzymują informację o uszkodzeniu. Dodatkowo przyłączenie PAR do chromatyny powoduje rozluźnienie jej struktury tym samym ułatwia dostęp enzymów i naprawę uszkodzeń. Wpływ PARP na strukturę chromatyny ma również istotne znaczenie w procesie transkrypcji oraz replikacji DNA. Wykazano również udział PARP-1 w naprawie podwójnych uszkodzeń nici DNA w procesie scalania niehomologicznych końców DNA - NHEJ. Zahamowanie syntezy PARP prowadzi do nagromadzenia uszkodzeń DNA, zatrzymania komórki w podziale oraz destabilizacji genomu. Następnie komórka kierowana jest na drogę apoptozy. Wykazano wzrost aktywności PARP-1 w określonych typach nowotworów m.in.: nowotworów jajnika, piersi, płuc, skóry czy w białaczkach. Ze względu na szczególną rolę polimerazy poliADP-rybozy-1 w procesie naprawy uszkodzonego DNA oraz skutki jakie powoduje zahamowanie aktywności tego enzymu, prowadzone są liczne doświadczenia z zastosowaniem nowych leków, molekularnie ukierunkowanych na hamowanie aktywności enzymu PARP-1 szczególnie w chorobach nowotworowych. Według badaczy zastosowanie inhibitorów PARP-1 może uwrażliwiać tkankę nowotworową na działanie radioterapii oraz nasilić działanie cytostatyków stosowanych w terapii, inhibitory PARP-1 mogą być również stosowane w monoterapii nowotworów. Najbardziej zaawansowane badania dotyczą zastosowania inhibitorów PARP-1 u chorych na raka jajnika oraz raka piersi zwłaszcza ze zmutowanymi genami BRCA1 i BRCA2, wykorzystując w tym przypadku mechanizm „syntetycznej letalności” [2,3,5-8,10,11]. Gen PARP-1 należy do grupy genów podstawowych, jego transkrypcja, niezależnie od stanu komórki przebiega na stałym poziomie. W warunkach normalnych, podstawowa aktywność PARP-1 jest niewielka. Po zadziałaniu czynników patologicznych dochodzi do nadmiernej aktywacji PARP oraz zwiększonego zużycia/wyczerpania NAD+ i ATP co w konsekwencji może spowodować dysfunkcję mitochondriów, uszkodzenie komórki a nawet jej śmierć („katastrofa energetyczna” komórki). W związku z tym PARP-1 może działać również jako mediator śmierci komórkowej. Autorzy podają kilka możliwych mechanizmów kierowania komórki na drogę śmierci przy udziale PARP-1. Przypuszcza się, że nadmierna aktywacja enzymu PARP-1 powodowana występowaniem stresu oksydacyjnego i genotoksycznego ma udział w patomechanizmie neurodegeneracyjnych, immunologicznych i wielu wstrząsu chorób chorób w septycznego, nowotworowych. tym schorzeń cukrzycy typu Zaobserwowano, naczyniowych, I, zaburzeń że aktywne transkrypcyjnie regiony chromatyny wykazują większą aktywność polimerazy, wyniki badań wskazują na ważną rolę PARP-1 w procesie transkrypcji. W odpowiedzi na czynniki stresowe aktywowana polimeraza reguluje transkrypcję genów układu odpornościowego oraz odpowiada za produkcję czynników zapalnych. Zwiększona ekspresja polimerazy Poli(ADP-rybozy)-1 powoduje wzrost wrażliwości komórek na reaktywne formy tlenu (wytwarzane przez zaindukowany proces zapalny), co skutkuje masywnym uszkodzeniem DNA. Dochodzi do nadmiernego gromadzenia się cząstek PAR, będących przekaźnikami sygnału zależnymi od czynnika AIF, komórka zostaje skierowana na drogę śmierci niezależną od kaspaz [1,2,4,5,8,10,11]. Przypuszcza się, PARP ma również udział w patomechanizmie chorób sercowonaczyniowych. W trakcie niedokrwienia mięśnia sercowego, a także uszkodzenia związanego reperfuzją po ustępowaniu zawału, generowane są duże ilości reaktywnych form tlenu. Akumulacja reaktywnych form tlenu powoduje oksydacyjne uszkodzenie DNA komórek i wiąże się ze zwiększoną aktywnością PARP-1. Wzrost aktywności polimerazy z jednej strony wpływa na zwiększone zużycie NAD+ oraz ATP z drugiej strony promuje stan zapalny, co w konsekwencji może doprowadzić do śmierci niedokrwionych komórek. Badania na zwierzętach pokazują, że zastosowanie inhibitorów PARP-1 może wywołać korzystny wpływ w przypadku takich chorób jak: niedokrwienie mięśnia sercowego, wstrząs, kardiomiopatie, powikłania sercowonaczyniowe cukrzycy czy miażdżyca tętnic [1,4,5,8,9]. W literaturze dostępnych jest wiele badań na temat wpływu polimerazy Poli ADP-rybozy-1 na przeżycie neuronów w warunkach stresu genotoksycznego. W związku z zaangażowaniem enzymu PARP-1 w liczne procesy komórkowe m.in. na naprawę uszkodzonego DNA, wpływ na indukcję procesu zapalnego oraz nadmierne zużycie NAD+ w warunkach stresu, enzym ten może być istotnym czynnikiem wpływającym na żywotność komórek nerwowych w przebiegu niedokrwienia. Poza zaangażowaniem w żywotność neuronów po wystąpieniu stresu oksydacyjnego PARP-1 prawdopodobnie ma udział w patomechanizmie innych zaburzeń neurologicznych np. choroba Alzheimera czy choroba Parkinsona. W pracach doświadczalnych odnaleźć można informacje na temat pozytywnego wpływu wyłączenia genu PARP-1, a także farmakologicznego hamowania aktywności PARP-1 na przeżycie neuronów w warunkach zwiększonego stresu oksydacyjnego, wywołanego niedokrwieniem [1,3,5,6,8,11]. Wykazano również bardzo istotną rolę PARP-1 w procesie starzenia. Udział polimerazy Poli ADP-rybozy w mechanizmie starzenia związany jest prawdopodobnie z jego wpływem na aktywność telomerazy. Ostatnie badania pokazują także możliwość wpływu polimerazy Poli ADP rybozy na występowanie otyłości [8,11]. W związku z istotnym wpływem polimerazy poliADP-rybozy-1 na liczne procesy komórkowe oraz prawdopodobny wpływ tego enzymu na patomechanizm wielu chorób konieczne są dalsze badania nad mechanizmem działania PARP-1. Badania nad wykorzystaniem inhibitorów PARP-1 w terapii są obiecujące, dotychczasowe doświadczenia pokazują, że inhibitory PARP-1 w monoterapii oraz połączeniu z cytostatykami czy radioterapią prawdopodobnie mogą być wykorzystane do projektowania nowoczesnych, molekularnie ukierunkowanych terapii przeciwnowotworowych [2,5,6,11]. Piśmiennictwo: 1. Ba X, Garg NJ. Signaling mechanism of poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) in inflammatory diseases. Am J Pathol. 2011;178: 946-55. 2. Dębska S, Kubicka J, Czyżykowski R, Habib M, Potemski P. Inhibitory PARP – odstawy teoretyczne i zastosowanie kliniczne. Postępy Hig Med Dosw 2012; 66: 311-321. 3. Kauppinen TM. Multiple roles for poly(ADP-ribose)polymerase-1 neurological disease. Neurochemistry International 2007; 50: 954–958. in 4. Kauppinen TM, Swanson RA. The role of poly(ADP-ribose) polymerase-1 in CNS disease. Neuroscience. 2007; 145:1267-72. 5. Kiliańska Z, Żołnierczyk J, Węsierska-Gądek J. Biologiczna aktywność polimerazy poli(ADP-rybozy)-1 Postepy Hig Med Dosw 2010; 64: 344-363. 6. Kluzek K, Białkowska A, Koczorowska A, Zdzienicka MZ. Inhibitory polimerazy Poli(ADP-rybozy) (PARP) w terapii nowotworów z mutacjami BRCA1/2. Postępy Hig Med Dosw 2012; 66: 372-384. 7. Kozioł M, PÜSKÜLLÜOGLU M, Zygulska A. Inhibitory PARP i ich rola w terapii potrójnie negatywnego przerzutowego raka piersi. Przegląd Lekarski 2012; 69: 265-270. 8. Morales JC, Li L, Fattah FJ, Dong Y, Bey EA, Patel M, Gao J, Boothman DA. Review of Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) Mechanisms of Action and Rationale for Targeting in Cancer and Other Diseases. Critical ReviewsTM in Eukaryotic Gene Expression 2013, 23:195-208. 9. Pacher P, Szabó C. Role of poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) in cardiovascular diseases: the therapeutic potential of PARP inhibitors Cardiovasc Drug Rev. 2007; 25: 235-60. 10. Ryabokon NI, Cieślar-Pobuda A. Rzeszowska-Wolny J. Inhibition of poly(ADPribose) polymerase activity affects itssubcellular localization and DNA strand break rejoining. Acta Biochemica Polonica 2009; 56: 243–248. 11. Virág L, Szabó C. The Therapeutic Potential of Poly(ADP-Ribose) Polymerase Inhibitors Pharmacological Reviews 2002; 54: 375-429.
