Nowoczesne metody diagnostyczne Nowoczesne metody
advertisement
Nowoczesne metody diagnostyczne Nowoczesne metody diagnostyczne Immunodiagnostyka dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG d k b l Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego Miareczkowanie przeciwciał • W diagnostyce chorób W di t h ób zakaźnych izolacja patogenów nie zawsze jest możliwa, alternatywą jest mierzenie alternatywą jest mierzenie poziomu przeciwciał dla określonego patogena (poziom przeciwciał – „antibody tib d titer”) poprzez tit ”) precypitację • Test serologiczny do T t l i d ilościowego mierzenia stężenia przeciwciał • Precypitacja pojawia się tylko Precypitacja pojawia się tylko wtedy, gdy są optymalne proporcje dwóch reagujących substancji Rys. „Microbiology „Robert W. Bauman Wyd. Pearson Benjamin Cummings Immunodyfuzja Rys. „Microbiology „Robert W. Bauman Wyd. Pearson Benjamin Cummings Linia identyczności i częściowej identyczności tzw. ostroga Linia identyczności i częściowej identyczności tzw ostroga A B C –ekstrakty A,B,C ekstrakty komórek Proteus mirabilis; S komórek Proteus mirabilis; S‐przeciwciała przeciwciała przeciwko Proteus mirabilis przeciwko Proteus mirabilis Rys. „Brock Biology of Microorganisms” Madigan, Martinko, Parker 9Ed. Odmianą precypitacji jest immunodyfuzja (ang. radial immunodiffusion) Rys. „Microbiology „Robert W. Bauman Wyd. Pearson Benjamin Cummings Immunoelektroforeza połączenie elektroforezy i immunodyfuzji ł i l kt f ii d f ji Antygen rozdzielany elektroforetycznie (+) agar () (‐) A. Jest to metoda rozdziału A J tt t d di ł i identyfikacji rozpuszczalnych antygenów w żelu, (białek występujących we krwi, w surowicy lub w moczu) i l b ) surowica precypitat (+) (‐) B. Po elektroforezie białek dodaje się do żelu przeciwciała które dyfundują żelu przeciwciała, które dyfundują bocznie w kierunku antygenu (białka); w miejscu połączenia białka ze swoistym dla niego przeciwciałem następuje precypitacja (wytrącenie) kompleksu precypitacja (wytrącenie) kompleksu antygen – przeciwciało w postaci łuku precypitacyjnego, co pozwala na ocenę charakteru antygenu. Immunofiksacja • Wybrane białka można zidentyfikować przez związanie ich w żelu swoistymi przeciwciałami, a następnie wybarwić je po wypłukaniu wszystkich innych nie związanych białek. • Metoda ta nazywana jest immunofiksacją. Kiedy wykonujemy badanie? Kiedy wykonujemy badanie? Elektroforezę stosuje się w celu wykrycia i identyfikacji nietypowych białek (jeżeli w surowicy lub moczu stwierdza się podwyższony lub obniżony poziom poszczególnych grup białek) poszczególnych grup białek). Aglutynacja • Zachodzi dla antygenów nierozpuszczalnych, obecnych na powierzchni komórki czy innych cząstek • Reakcja antygen‐przeciwciało prowadzi do „wykłaczania” R k j t i i ł d id kł i ” (ang. clump) Aglutynacja Zastosowanie kuleczek lateksowych (związanych z przeciwciałami lub antygenami) • • • • • zwiększona czułość (100 x) w stosunku do precypitacji, pozwala na 100% identyfikację; bardzo szybka 30s; bardzo szybka ‐ 30s; prosta w obsłudze, niedroga; kuleczki lateksowe mają zastosowanie do identyfikacji y j Staphylococcus aureus (wykrywanie czynnika „clumping factor), Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, g , Haemophilus influensae, Campylobacter, Cryptococcus neoformans i Candida albicans niektóre testy aglutynacji niektóre testy aglutynacji używają jako nośnika węgiel aktywny np. testy na wykrywanie wirusa opryszczki Herpes simplex 1. Staphylococcus aureus produkuje zarówno clumping produkuje zarówno „clumping factor” i białko A 2. Staphylococcus aureus produkuje tylko „clumping factor” 3. Staphylococcus aureus produkuje tylko białko A 4. Staphylococcus aureus produkuje „clumping factor” z wolnym białkiem A białkiem A Test komplementacji ( Test komplementacji (ang ang. . complement complement fixation test) Służy do wykrywania obecności specyficznych przeciwciał w surowicy pacjenta, które występują w bardzo małych ilościach, niewykrywalnych testem aglutynacji. Składa się z trzech etapów: 1. Próbka surowicy ogrzewana do 56°C w celu zniszczenia naturalnego komplementu 2. Dodanie znanej ilości antygenu 2 Dodanie znanej ilości antygenu (charakterystycznego dla danego czynnika chorobowego) i standardowej ilości komplementu do surowicy 3. Owcze krwinki czerwone (RBCs) i przeciwciała przeciwko tym krwinkom (przeciwciała anty‐RBC) 4. Wynik negatywny‐liza krwinek czerwonych Rys. „Microbiology „Robert W. Bauman Wyd. Pearson Benjamin Cummings Pojedynczy pomiar przeciwciał nie wskazuje na Pojedynczy pomiar przeciwciał nie wskazuje na aktywną infekcje, trzeba wykonać badania w k i f kj b k ćb d i odstępach czasu • Poziom przeciwciał może wzrastać podczas rekonwalescencji (np. dur brzuszny, brucelloza) • Sama obecność przeciwciał jest wystarczająca do S b ść i i łj t t j d stwierdzenia infekcji np. w przypadku AIDS • Odpowiedź immunologiczna słabo indukowana np. w Odpowiedź immunologiczna słabo indukowana np w przypadku Neisseria Rys. Podstawy biologii komórki, Bruce Alberts i in. PWN 1999 Technika HYBRYDOMA Przeciwciała pochodzące z jednego klonu komórek B (o jednej specyficzności) zwane są monoklonalnymi Rys. „Brock Biology of Microorganisms” Madigan, Martinko, Parker 9Ed. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych 1. Do identyfikacji i rozdziału mieszaniny limfocytów T 1 D id t fik ji i d i ł i i li f tó T 2. Do immunologicznego typowania bakterii i identyfikacji komórek zawierających obce antygeny powierzchniowe np. wirusa infekującego k ók komórki 3. W inżynierii genetycznej do identyfikacji i mierzenia poziomu produktów genów nie wykrywalnych innymi metodami 4. Zastosowania kliniczne i medyczne: ‐ wykrywanie i leczenie nowotworów ‐ w transplantologii w transplantologii ‐ typowanie krwi ‐określenie czynnika reumatoidalnego ‐ testy ciążowe ‐ wykrywanie „in vivo” „ukrytej” miozyny w mięśniu sercowym Mikroskopia immunoelektronowa Mikroskopia immunoelektronowa Mikroskopia • • Zastosowanie do określenia położenia specyficznego antygenu d k śl ł f (przeważnie białka) w odpowiednim regionie komórki. Komórki traktuje się przeciwciałami kowalencyjnie związanymi z metalem j ęp yj ą y ciężkim (złoto, platyna), metal rozprasza elektrony, obecność związanych przeciwciał widać w postaci gęstej plamy na fotografii. Zastosowanie przeciwciał fluorescencyjnych P Przeciwciała są chemicznie zmodyfikowane barwnikiem fluorescencyjnym (rodamina, i i ł h i i d fik b iki fl j ( d i izotiocjanian) służą do wykrywania antygenów powierzchniowych. Zastosowanie w mikroskopii świetlnej Dwie metody znakowania fluorescencyjnego: a. odczyn immunofluorescencji bezpośredniej przeciwciała są wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym b. odczyn immunofluorescencji pośredniej ang. IFA – przeciwciała (nie znakowane) przeciwko antygenom komórkowym wykrywa się stosując przeciwciała znakowane fluorescencyjnie np. FITC znakowane fluorescencyjnie np. FITC Rys. „Brock Biology of Microorganisms” Madigan, Martinko, Parker 9Ed. Zastosowanie wielu warstw przeciwciał (sandwicza) w wielu przypadkach pozwala znacznie zwiększyć czułość testu. dk h l i i k ć ł ść t t Metoda „sandwicza” umożliwia wykrycie mniejszej liczby cząstek antygenu Znakowane drugie przeciwciało (czerwone) wiąże się z pierwszym (czerwone) wiąże się z pierwszym przeciwciałem (fioletowe) antygen Wykorzystanie przeciwciał fluorescencyjnych Wykorzystanie przeciwciał fluorescencyjnych 1. 2. 3. 4. W mikrobiologii środowiskowej W mikrobiologii klinicznej w diagnostyce chorób infekcyjnych do wykrywania markerów komórkowych w chorobach nie infekcyjnych Spektroskopia fluorescencyjna (FACS) Spektroskopia fluorescencyjna (FACS) • • • Służy do wizualizacji, zliczania i rozdziału komórek FACS wykorzystuje promień lasera do aktywacji przeciwciał fluorescencyjnych FACS – wykorzystuje promień lasera do aktywacji przeciwciał fluorescencyjnych związanych z komórkami Użycie przeciwciał wyznakowanych różnymi barwnikami fluorescencyjnymi pozwala na identyfikacje markerów komórkowych np. w identyfikacji białek powierzchniowych CD3 identyfikacje markerów komórkowych np. w identyfikacji białek powierzchniowych CD3 i CD4 na komórkach T osobników chorych na AIDS i zdrowych TcR TcR CD3 CD3 TH CD4 T supressor/T / c CD8 Rys. „Brock Biology of Microorganisms” Madigan, Martinko, Parker 9Ed. Enzymatyczny odczyn Enzymatyczny odczyn immunoadsorpcyjny immunoadsorpcyjny – test ELISA (ang Linked Immunosorbent Assay (ang. Linked (ang. Assay)) Bezpośredni test ELISA „direct ELISA” – detekcja antygenu (np.cz. wirusowe w krwi) 1. Wysoce specyficzny i czuły 2. Stosuje się przeciwciała związane kowalencyjnie z enzymami, których katalityczne, enzymatyczne właściwości i specyficzność pozostają niezmienione. Takimi linkami enzymatycznymi są: peroksydaza, alkaliczna fosfataza beta‐galaktozydaza fosfataza, beta‐galaktozydaza. Powstające produkty są kolorowe i mogą być wykrywane w bardzo małych ilościach Rys. „Brock Biology of Microorganisms” Madigan, Martinko, Parker 9Ed. Pośredni test ELISA „indirect ELISA” Pośredni test ELISA „indirect – wykrywanie przeciwciał wykrywanie przeciwciał Każda studzienka musi zawierać ok. 200ng zniszczonego wirusa HIV. Na początku infekcji Na początku infekcji produkowane są przeciwciała skierowane przeciwko antygenom płaszcza wirusa HIV i te płaszcza wirusa HIV i te przeciwciała są wykrywane w teście ELISA‐HIV. Rys. „Brock Biology of Microorganisms” Madigan, Martinko, Parker 9Ed. Zastosowanie testu ELISA testu ELISA • • • „direct di ELISA” – wykrywanie bakteryjnych toksyn k i b k j h k np. toksyny cholery, toksyny k h l k enteropatogennych szczepów E. coli, enterotoksyny Staphylococcus aureus, wirusów: rotawirusy, Hepatitis wirus, Parainfluensae wirus „indirect indirect ELISA ELISA” – do wykrywania bakterii: do wykrywania bakterii: Salmonella, Yersinia, Brucella, riketsji, Vibrio Salmonella Yersinia Brucella riketsji Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum Wykrywanie przeciwciał na drożdżaki, amebozy, malarię, toksoplazmozę y y p y ę p ę Zalety: ‐ szybki ‐ tani ‐ brak radioaktywności ‐ bardzo wrażliwy Radioimmunoassay (RIA) Zamiast enzymów można wykorzystać radioizotopy jako koniuganty do przeciwciał. Izotop J125 nie niszczy specyficzności białek. Służy do wykrywania poziomu takich białek jak: ludzki hormon wzrostu, glukagon, wazopresyna, testosteron, insulina, do badania nadużycia leków i środków dopingujących. Wzrastające stężenie antygenu Znane stężenie antygenu Surowica pacjenta Wykrywanie poziomu insuliny surowicy pacjenta z zastosowaniem przeciwciał anty‐ insulinowych wyznakowanych radioaktywnie Rys. „Brock Biology of Microorganisms” Madigan, Martinko, Parker 9Ed. Western blot marker radioaktywny wiąże się do kompleksu antygen‐przeciwciało np. białko A Staphylococcus jodynownane J125, białko to wykazuje silne powinowactwo do przeciwciał Dodanie anty‐ludzkich przeciwciał króliczych związanych z enzymem króliczych związanych z enzymem Rys. „Brock Biology of Microorganisms” Madigan, Martinko, Parker 9Ed. Czułość metod immunodiagnostycznych Czułość metod immunodiagnostycznych Test Czułość (μg przeciwciał/ml)a Reakcja precypitacji W roztworze 24‐160 W żelu (podwójna immunodyfuzja) 24‐160 j g y j Reakcja aglutynacji a Bezpośrednia 0,4 Pasywna 0,08 RIA 0,0008‐0,008 ELISA 0,0008‐0,008 Immunofluorescencja 8,0 Najmniejsza ilość przeciwciał, która daje pozytywną reakcję w obecności antygenu Wady metod opartych o analizę białek Wady metod opartych o analizę białek 1. Wadą typowania serologicznego jest potrzeba posiadania odpowiedniego 1 W d t i l i j t t b i d i d i d i zestawu surowic, których otrzymanie wiąże się ze skomplikowaną procedurą. 2. Przeciwciała monoklonalne mogą wchodzić w reakcje krzyżowe z ł kl l h d ć k k antygenami występującymi u innych bakterii, nie będących przedmiotem badań. 3. W metodach elektroforetycznych skomplikowana analiza wzoru prążków, wynikająca z ich dużej ilości przy nieodpowiednim ustaleniu czułości przeprowadzanego procesu. Trudności te można ominąć stosując immunoblotting, w którym specyficzność reakcji jest określana przez strukturę chemiczną wysoko reaktywnych przeciwciał.
