CYFRA 21-1 – ocena metod oznaczeń
advertisement
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 • Volume 47 • Number 3 • 275-284 Praca oryginalna • Original Article CYFRA 21-1 – ocena metod oznaczeń CYFRA 21-1 – comparison of determination methods Ewa Wójcik, Krystyna Sobolewska, Jadwiga Tarapacz, Zofia Stasik, Urszula Rychlik, Jan Kanty Kulpa Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie Streszczenie Wprowadzenie: W diagnostyce biochemicznej chorób nowotworowych istotną pozycję zajmują markery pochodne cytokeratyn, zwłaszcza cytokeratyny 8, 18 i 19, których wzmożoną ekspresję wykazano w szeregu nowotworów. Jednym z tych markerów jest CYFRA 21-1. Stosowane w zestawach odczynnikowych do oznaczeń tego markera przeciwciała monoklonalne reagują swoiście z cytokeratyną 19. Wyniki badań CYFRA 21-1 cechują się dużą użytecznością w diagnostyce niedrobnokomórkowego raka płuca, ale są również przydatne w diagnostyce szeregu innych nowotworów, zwłaszcza rozwijających się komórek płaskonabłonkowych. Cel: Porównanie wyników oznaczeń CYFRA 21-1 wykonywanych przy użyciu zestawów odczynnikowych pochodzących od dwóch różnych wytwórców. Materiał i metody: Dokonano oceny parametrów analitycznych zestawu odczynnikowego będącego przedmiotem badań. Następnie w 150 próbkach surowic pochodzących od ludzi zdrowych, chorych z niezłośliwymi zmianami w płucach i od chorych na raka płuca wykonano oznaczenia CYFRA 21-1 przy pomocy ocenianych zestawów odczynnikowych firmy Abbott oraz przy użyciu odczynników firmy Roche stosowanych od szeregu lat w laboratorium jako układu odniesienia. Wyniki: Obie metody cechuje wysoka precyzja i poprawność. Wyniki oznaczeń stężenia CYFRA 21-1 obu porównywanymi metodami są bardzo zbliżone. Obserwowano, szczególnie w zakresie niskich stężeń markera tendencję do niższych wyników uzyskiwanych ocenianą metodą Architect CYFRA 21-1 w porównaniu do metody odniesienia Cobas CYFRA 21-1. Stąd wartości odcinające wykorzystywane w interpretacji wyników uzyskiwanych obu metodami wynoszą odpowiednio: 2,11 ng/ml i 2,58 ng/ml (Abbott i Roche). Jednak analiza przebiegu krzywych ROC dla niedrobnokomórkowego raka płuca względem grupy odniesienia wykazała brak istotnych różnic pomiędzy AUC dla obu metod. Wniosek: Badania porównawcze potwierdziły podobną użyteczność diagnostyczną wyników oznaczeń CYFRA 21-1 wykonywanych zestawami odczynnikowymi ARCHITECT CYFRA 21-1 oraz ROCHE cobas CYFRA 21-1 u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca. Summary Introduction: In the biochemical diagnostics of neoplastic diseases, an important position is occupied by tumor marker derived cytokeratins, especially cytokeratin 8, 18 and 19. One of these markers is CYFRA 21-1. The antibodies used in reagent kits for determination of this marker react specifically with cytokeratin 19. The results of CYFRA 21-1 determination are highly useful in the diagnostics of non-small cell lung cancer, but can be also applied in the diagnostics of other malignancies, particularly originating from squamous cells. Aim: The comparison of CYFRA 21-1 determinations performed by using reagent kits from two different manufacturers. Material and methods: First, there was performed an evaluation of analytical characteristics of reagent kit under study. Next, CYFRA 21-1 levels were determined in 156 serum samples from healthy persons, patients with benign lung disease and patients with lung cancer, using evaluated reagent kits and, as reference system, reagents routinely used in our laboratory. Results: Both methods are characterized by high precision and accuracy. The results of determinations of CYFRA 21-1 concentrations compared by the two methods, are very similar. There was observed, especially in the low concentrations of a marker, a tendency to lower results obtained by Architect CYFRA 21-1 in comparison to the reference method. Hence the cut-off values used in the interpretation of the results obtained by both methods are as follows: 2,11 ng/mL i 2,58 ng/mL (Abbott i Roche). However, analysis of ROC curves for small cell lung cancer against the reference group, showed no significant differences between the AUC for both methods. Conclusion: Comparative studies have confirmed a similar diagnostic utility of CYFRA 21-1 determinations performed with ARCHITECT CYFRA 21-1 and Roche cobas CYFRA 21-1 reagent kits in patients with non-small cell lung cancer. 275 CYFRA 21-1 – ocena metod oznaczeń Słowa kluczowe:niedrobnokomórkowy i drobnokomórkowy rak płuca, CYFRA 21-1, porównanie metod Key words:non-small cell and small cell lung cancer, CYFRA 21-1, methods comparison Wstęp Przedmiotem licznych badań jest weryfikacja możliwości wykorzystania badań krążących markerów nowotworowych pochodnych cytokeratyn w diagnostyce, kontroli chorych po leczeniu podstawowym, monitorowaniu leczenia uzupełniającego a także w ocenie rokowania chorych na nowotwory złośliwe. Cytokeratyny stanowią podstawowy element składowy filamentów pośrednich, który obok mikrofilamentów oraz mikrotubul, wchodzą w skład struktur włóknistych cytoszkieletu komórek eukariotycznych. W zależności od rodzaju komórek w których występują wyodrębniono 5 typów filamentów pośrednich: typ I i II to filamenty keratynowe tworzące tonofibryle w komórkach nabłonkowych, typ III to filamenty wimentynowe występujące głównie w komórkach tkanki łącznej, desminowe występujące w tkance mięśniowej, glejowe występujące w komórkach glejowych, typ IV to neurofilamenty występujące w neuronach, oraz typ V to filamenty laminowe występujące prawie wyłącznie w jądrach komórkowych. Cytokeratyny stanowiące podstawowe białko strukturalne komórek nabłonkowych, to ok. 20 różnych polipeptydów o masie cząsteczkowej 40-67 kDa, wśród których ze względu na ruchliwość w polu elektrycznym wyróżnia się 2 podgrupy: typ I (CK9-CK20) – cytokeratyny kwaśne, o punktach izoelektrycznych (pI) 4,9 - 5,7 i ciężarze cząsteczkowym 40-56.5 kDA oraz typ II (CK1-CK8) – cytokeratyny obojętne lub zasadowe, o punktach izoelektrycznych (pI): 6,0 - 7,8 i ciężarze cząsteczkowym 53-67 kDa. Podstawową jednostką strukturalną filamentu pośredniego są tetramery zbudowane z cytokreatyn typu I i II połączonych w stechiometrycznych ilościach.. Ekspresja cytokeratyn zależy od rodzaju komórek, stopnia ich dojrzałości oraz zróżnicowania histologicznego. W nabłonku gruczołowym, prostym przeważają cytokeratyny 7, 8, 18, 19 natomiast w wielowarstwowych nabłonkach stwierdza się głównie obecność cytokeratyn 1 – 6 oraz 9 -17 [12,18]. Komórki nowotworowe w przeważającej części zachowują ekspresję cytokeratyn komórek macierzystych. Pomimo różnic w zależności od histologicznego typu w komórkach nowotworowych dominująca jest ekspresja cytokeretyn 8, 18 i 19. Cytokeratyny nie są zasadniczo rozpuszczalne w płynach ustrojowych. Mechanizmy prowadzące do uwalniania rozpuszczalnych fragmentów cytokeratynowych do krążenia są złożone i nie do końca poznane. Uważa się, że jedną z przyczyn jest martwica komórek [2,27]. Wśród innych przyczyn zwiększonej ilości fragmentów cytokeratynowych w krążeniu, zwłaszcza w chorobach nowotworowych, wymienia się nieprawidłowe podziały komórkowe, możliwość przechodzenia monomerycznych polipeptdów cytokeratynowych z proliferujących komórek, jak i potranslacyjne modyfikacje N i C-końcowych regionów cytokeratyn [1,4]. Opracowanie szeregu przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych umożliwiło potwierdzenie homologiczności niektórych markerów 276 nowotworowych z cytokeratynami 8, 18 i 19, a także przyczyniło się do opracowania nowych markerów nowotworowych z rodziny cytoketratyn. Do tej grupy zalicza się: TPA - polipeptydowy antygen tkankowy (cytokeratyny 8, 18 i 19), TPS - swoisty polipeptydowy antygen tkankowy (cytokeratyna 18), MonoTotal (cytokeratyny 8, 18 i 19) oraz antygen CYFRA 21-1 rozpuszczalny w osoczu fragment cytokeratyny 19. Zwłaszcza ten ostatni marker budzi szczególne zainteresowanie w aspekcie wykorzystania wyników jego oznaczeń u chorych na nowotwory, szczególnie niedrobnokomórkowego raka płuca. Ekspresję cytokeratyny 19 wykazano metodami immunohistochemicznymi w nabłonkach płaskich m.in. przewodów żółciowych, trzustkowych, śliniankach, jelita cienkiego i grubego, kanału szyjki macicy i endometrium, a także w nabłonkach pseudowielowarstwowych, oskrzeli, dróg moczowych jak również w komórkach nierogowaciejącego wielowarstwowego nabłonka płaskiego. Nasiloną ekspresję tej właśnie cytokeratyny wykazano w rozwijających się z tych komórek nowotworach głowy i szyi, szyjki macicy oraz płuca [11, 12, 29]. O ile w surowicy krwi ludzi zdrowych stężenie CYFRA21-1 nie przekracza 2,5 ng/ml, to miernie podwyższone stężenie markera,, nie przekraczając jednak prawie nigdy 9,5 ng/ml, obserwuje się w stanach zapalnych jak i niezłośliwych chorobach płuc, wątroby, trzustki, czy chorobach reumatycznych. Podwyższone stężenia CYFRA 21-1 są spotykane u 40 – 70% chorych na niedrobnokomorkowego raka płuca, przy czym ich częstość wykazuje wyraźną zależność od histologicznego typu nowotworu, najwyższe odsetki podwyższonych wyników spotykane są u chorych na płaskonabłonkowego raka płuca, szczególnie niskozróżnicowanego [6, 8, 16]. Należy zwrócić uwagę, że CYFRA 21-1 nie jest markerem swoistym dla niedrobnokomórkowego raka płuca, ale podwyższone stężenia tego markera spotyka się również u szeregu chorych na drobnokomórkowego raka płuca, a także w nowotworach o innej lokalizacji narządowej [19, 21, 24]. O ile oznaczenia CYFRA 21-1 są rekomendowane, głównie w aspekcie wartości prognostycznej wyników ich oznaczeń u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca, przez National Academy of Clinical Biochemistry (NACB), European Group on Tumor Markers (EGTM) oraz Societe de Pneumologie de Langue Francaise (SPL), to HealthCare Medicare Administration prezentuje odmienną opinię, w związku z czym zestawy odczynnikowe do oznaczeń tego markera nie były dostępne do niedawna na rynku amerykańskim [32]. Przez stosunkowo długi okres na rynku dostępne były dla oznaczeń stężenia CYFRA 21-1 zestawy odczynnikowe produkcji CIS bio international i ROCHE Diagnostics. Obecnie firma Abbott Laboratories we współpracy z Fujirebio Diagnostics Inc. wprowadziła zestawy do oznaczeń tego markera metodą chemiluminiscencyjną na analizatorze ARCHITECT. Celem prezentowanych badań była zgodna z protokołem E. Wójcik i inni badania poprawności ocena precyzji oznaczeń oraz porównanie wyników oznaczeń antygenu CYFRA 21-1 uzyskanych przy użyciu odczynników i analizatora firmy Abbott z wynikami oznaczeń wykonywanymi rutynowo na analizatorze cobas e411 z wykorzystaniem odczynników firmy Roche Diagnostics. Materiał i metody Przed rozpoczęciem ewaluacji przeprowadzono 6-punkową kalibrację testu ARCHITECT CYFRA 21-1, wykorzystując kalibratory o stężeniach 0; 2,5; 10,0; 25,0; 50,0 i 100,0 ng/ml, zawierające antygen wyizolowany z ludzkich linii komórkowych. Dostarczane kalibratory są rozpuszczone w sztucznej matrycy (bufor fosforanowy, albumina bydlęca) z dodatkiem środków konserwujących ProClin 300 i ProClin 900, zawierających zmodyfikowany glikol. Próbki kontrolne są monoparametryczne, zawierają pochodzący z ludzkich linii komórkowych antygen, w sztucznej matrycy z dodatkiem środków konserwujących ProClin 300 i ProClin 900. Badanie precyzji przeprowadzano zgodnie z wytycznymi CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): poziom antygenu w 3 próbkach kontrolnych mierzono 2-krotnie, w co najmniej w 2-godzinnych odstępach czasu przez 5 kolejnych dni. W ocenie poprawności wyników oznaczeń oceniono stopień zgodności pomiędzy wartością średnią z serii wyników badań a przyjętą wartością odniesienia, tj. nominalnym stężeniem podanym przez wytwórcę. Badania porównawcze oznaczeń CYFRA 21-1 na analizatorach Architect oraz cobas e411 wykonano w 156 próbkach surowicy, pochodzących od 30 zdrowych osób, 30 z zapaleniem płuc i 96 chorych na raka płuca, w tym u 59 chorych na raka drobnokomórkowego (37 z ograniczoną do jednej połowy klatki piersiowej postacią nowotworu i 22 z uogólnioną postacią nowotworu) oraz u 37 chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca (17 w stopniu IIIB + IV przed rozpoczęciem leczenia, 15 ze stwierdzoną wznową lub rozsiewem procesu nowotworowego oraz 5 chorych po zabiegu chirurgicznym przed radioterapią). Użyte do badań porównawczych próbki surowic stanowiły materiał resztkowy po wykonanych oznaczeniach usługowych. Próbki surowic do momentu wykonania badań przechowywano zamrożone w temp. – 70o C. W badaniach na analizatorze Architect i1000 stosowano metodę chemiluminescencyjną. Fazę stałą stanowiły zawieszone w buforze TRIS mikrocząsteczki paramagnetyczne opłaszczone przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko jednej determinancie antygenu CYFRA 21-1, ich rola polega na wychwyceniu antygenu CYFRA 21-1 z badanej próby. W drugim etapie dodawano zawieszone w buforze MES znakowane estrem akrydyny monoklonalne przeciwciało detekcyjne, specyficzne dla determinanty antygenowej zlokalizowanej w innym regionie cytokeratyny 19. Po separacji powstałych kompleksów: przeciwciało kompetycyjne – CYFRA 21-1- przeciwciało detekcyjne, za pomocą elektromagnesu w kolejnym etapie, dodawany jest nadtlenek wodoru utleniający ester akrydyny do ketonokwasu. W środowisku alkalicznym dochodzi do jego hydrolizy, a powstały nietrwały związek N-metykoakrydonu ulega rozpadowi, co prowadzi do emisji światła. System optyczny dokonuje pomiaru wyemitowanych fotonów światła przez ustalony okres czasu, a uzyskane względne jednostki luminescencji (RLU) służą do obliczeń stężenia antygenu CYFRA 21-1 w badanej próbce. Do wykreślenia krzywej kalibracyjnej wykorzystywany był 4-parametrowy model logarytmiczno-logitowy. Do oznaczeń antygenu CYFRA 21-1 na analizatorze cobas e411 wykorzystywana była technika elektrochemiluminescencji. W pierwszym etapie zawarte w buforze fosforanowym (pH = 7,2) znakowane kompleksem rutenu biotynylowane monoklonalne przeciwciała przeciwko cytokeratynie 19 (KS 19.1) oraz swoiste dla epitopu BM 19.21 tej cytokeratyny, wiążą antygen obecny w badanej próbce. W kolejnym etapie dodawane są cząsteczki paramagnetyczne (w postaci koloidów tlenku żelaza) sprzężone ze streptawidyną wykazującą duże powinowactwo do biotyny, dzięki czemu powstałe kompleksy wiązane są na fazie stałej. Następnie mieszanina reakcyjna zawierająca w/w kompleksy zostaje przetransportowana do cel pomiarowych, gdzie po wypłukiwaniu nadmiaru nieprzereagowanych odczynników, kompleksy immunologiczne zostają wyłapywane poprzez magnes znajdujący się pod elektrodą platynową. Stymulacja elektryczna rozpoczyna reakcje utleniania i redukcji kompleksów rutenu w obecności trijpropyloaminy. Kation rutenu Ru+2 powracając ze stanu wzbudzonego do stanu podstawowego emituje światło o długości fali 620 nm, które rejestrowane jest przez fotopowielacz. Poziom antygenu CYFRA 21-1 w badanej próbce wyliczany jest w oparciu o krzywą wzorcową zakodowaną w kodzie paskowym odczynnika oraz dwupunktową rekalibrację, wykonaną przez użytkownika. Dostarczone przez firmę Roche Diagnostics kalibratory zawierają cytokeratynę 19 pochodzącą z ludzkich hodowlanych linii komórkowych MCF-7 w środowisku surowicy ludzkiej, a próbki kontrolne przygotowane na bazie surowicy ludzkiej są wieloparametrowe. W opracowaniu statystycznym wyników w celu obliczeń wartości średnich, odchyleń standardowych wartości bias, oceny istotności różnic testem t-Studenta dla par zależnych jak i wykreślenia krzywych ROC korzystano z pakietu statystycznego StatSoft 9.0, podczas gdy do porównania zgodności wyników pomiędzy metodami zastosowano analizę regresji wg Passing and Bablocka, a do analizy charakteru różnic pomiędzy wynikami graficzną analizę wg Bland i Altnman oraz „Mountain plot”, wykorzystując program MedCalc 7.0. Wyniki Zgodnie z zaleceniami CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) ocenę precyzji dokonano w oparciu o wyniki oznaczeń próbek kontrolnych, wykonywane każdorazowo w 2 seriach z dwukrotnym ich powtórzeniem każdego dnia w 5 kolejnych dniach (n = 20). Dla obu porównywanych metod, niezależnie od zakresu mierzonych stężeń, uzyskano 277 CYFRA 21-1 – ocena metod oznaczeń w pełni satysfakcjonujące rezultaty, współczynniki zmienności kształtowały się wyraźnie poniżej wartości 5%, powszechnie przyjmowanej jako dopuszczalna w badaniach immunochemicznych. Wyliczana na podstawie porównania średnich z wyników 20 oznaczeń w próbkach kontrolnych, z podanymi przez wytwórców wartościami nominalnymi poprawność wyników była w pełni zadowalająca, zarówno dla zestawów odczynnikowych ARCHITECT CYFRA 21-1 jak i ROCHE cobas CYFRA 21-1, mieściła się w granicach błędu dopuszczalnego (tab. I). Wyniki precyzji i poprawności oznaczeń CYFRA 21-1 na analizatorze Architect i1000 oraz cobas e411 przedstawiono w tabeli I. Wyniki równoczasowo wykonanych na obu analizatorach oznaczeń stężenia antygenu CYFRA 21-1 w próbkach surowic nie różniły się istotnie i wynosiły odpowiednio 4,84 ± 12,07 ng/ml dla analizatora cobas e411 i 5,16 + 13,85 ng/ml dla Architect i1000. Analiza regresji wg Passing i Bablock wykazała liniową zależność pomiędzy wynikami oznaczeń wykonanych na obu analizatorach, współczynnik nachyleniowy wynosił 1,0236 i nie różnił się istotnie od jedności, natomiast współczynnik odcinający był bliski zera i wynosił 0,16. Porównanie wyników w wyodrębnionych podgrupach: osoby zdrowe, pacjenci ze stanem zapalnym płuc, chorzy na drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego raka płuca wykazało w odniesieniu do dwóch pierwszych podgrup istotnie wyższe stężenia CYFRA 21-1 uzyskane przy użyciu zestawów odczynnikowych i analizatora cobas e411 aniżeli z Architect i1000, a zatem w zakresie niższych poziomów markera, u badanych zaliczanych do grupy referencyjnej Brak było natomiast takich różnic pomiędzy wynikami oznaczeń uzyskanymi obu porównywanymi metodami dla chorych na drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego raka płuca (tabela II). W grupie osób zdrowych obserwowano liniową zależność pomiędzy wynikam oznaczeń CYFRA 21-1 uzyskanymi obu metodami, jednak wykazała ona, że o ile współczynnik odcinający był nieznacznie różny od zera (– 0,0497), to współczynnik nachyleniowy równania regresji był niższy od jedności i wynosił tylko 0,857 (ryc.1a). Potwierdzenie tendencji do istotnie niższych wyników uzyskiwanych zestawami odczyn- Rycina 1a. Ocena zgodności wyników oznaczeń CYFRA 21-1 porównywanymi metodami w grupie osób zdrowych. Tabela I. Wyniki precyzji i poprawności oznaczeń CYFRA 21-1 na analizatorze Architect i1000 oraz cobas e411. Próbka kontrolna Wartość nominalna C L1 5,00 C L2 C L3 Precyzja średnia min max Poprawność SD CV% bias bias% 0,21 4,20 ARCHITECT CYFRA 21-1 5,21 4,68 5,49 0,173 3,31 15,00 15,12 14,47 16,14 0,459 3,03 0,12 0,80 35,00 34, 50 32,40 36,78 1,247 3,61 - 0,50 -1,43 PCTM 1 3,18 3,08 2,92 3,21 0,076 2,46 - 0,10 -3,14 PCTM 2 28,10 26,26 24,55 26,99 0,70 2,69 -1,84 - 6,54 ROCHE cobas CYFRA 21-1 Tabela II. Wyniki testu t dla par zależnych. GRUPA ZDROWI N Mediana Zakres wahań średnia SD p Architect 30 0,895 0,32 – 2,25 0,998 0,484 0,0000 cobas 30 1,110 0,51 – 2,74 1,219 0,572 ZAPALENIE PŁUC Architect 30 1,835 0,52 – 7,55 2,262 1,782 cobas 30 2,115 0,63 – 7,08 2,439 1,774 GRUPA REFEREN. Architect 60 1,065 0,32 – 7,55 1,631 1,443 cobas 60 1,235 0,50 – 7,08 1,829 1,445 Architect 59 1,77 0,46 – 8,25 1,986 1,190 cobas 59 1,79 0,46 – 7,15 1,978 1,086 Architect 37 6,19 1,00 – 101,50 15,95 25,76 cobas 37 6,31 1,21 – 100,60 14,30 22,39 DRP NDRP 278 analizator 0,0007 0,000 N.S N.S E. Wójcik i inni nikowymi Architect CYFRA 21-1 w porównaniu do zestawów Roche Diagnostics stanowi dokonana metodą graficzną wg Bland i Altman’ ocena zależności pomiędzy wielkością różnic w wynikach uzyskiwanych obu metodami a zakresem mierzonych stężeń różnic, współczynnik nachyleniowy wynosił 0,1672 i był istotnie różny od zera (ryc.1b). Niesymetryczność percentylowego rozkładu różnic pomiędzy wynikami Rycina 1b. Zależność różnic pomiędzy wynikami oznaczeń CYFRA 21-1 porównywanymi metodami od średnich stężeń markera w grupie osób zdrowych - wykres wg Bland i Altman. (ryc. 2b) Percentylowy rozkład różnic pomiędzy wynikami uzyskanymi na analizatorze cobas e411 i Architect i1000 oceniany metodą „mountain plot” był prawie symetryczny, 95% zakres różnic wahał się w przedziale od -0,39 do 0,795 ng/ml, przy medianie wynoszącej 0,17 ng/ml (ryc. 2c). W grupie chorych na drobnokomórkowego raka płuca stwier- Rycina 2a. Ocena zgodnosci wyników oznaczeń CYFRA 21-1 porównywanymi metodami w grupie chorych z zapaleniem płuc. uzyskanymi obu porównywanymi metodami znajduje swoje odbicie również w wynikach analizy „mountain plot”, 95% wartości różnic mieściło się w granicach od -0,0807 do 0,485 ng/ml, przy medianie różnic wynoszącej 0,201 (ryc.1c). Rycina 2b. Zależność różnic pomiędzy wynikami oznaczeń CYFRA 21-1 porównywanymi metodami od średnich stężeń markera w chorych z zapaleniem płuc - wykres wg Bland i Altman. Rycina 1c. Skumulowany rozkład różnic pomiędzy wynikami oznaczeń CYFRA 21-1 wykonywanymi obu metodami w grupie osób zdrowych („mountain plot”). W grupie chorych z zapaleniem płuc zakres wahań stężenia antygenu CYFRA 21-1 był szerszy aniżeli u osób zdrowych. Analiza regresji wg Passing i Bablock wykazała liniową zależność pomiędzy wynikami uzyskanymi obu metodami, współczynnik nachyleniowy równania regresji wynosił 0,937 i nie różnił się istotnie od jedności, a współczynnik odcinający (- 0,0461) był bliski zera (ryc. 2a). Analiza graficzna wg Bland i Altman’ nie wykazywała istotnych różnic pomiędzy wynikami oznaczeń CYFRA 21-1 w zależności od zakresu mierzonych stężeń; współczynnik nachyleniowy (0,0043) był bliski zeru Rycina 2c. Grupa chorych z zapaleniem płuc - skumulowany rozkład różnic stężeń CYFRA 21-1 pomiędzy wynikami uzyskanymi porównywanymi metodami (mountain plot). 279 CYFRA 21-1 – ocena metod oznaczeń dzano liniową zależność pomiędzy wynikami uzyskanymi z obu metod, współczynnik nachyleniowy równania regresji wynosił 1,030 i nie różnił się istotnie od jedności, a współczynnik odcinający, który wynosił – 0,0398 był bliski zeru (ryc.3.A). Analiza graficzna wg Bland i Altman wykazała brak różnic pomiędzy wynikami oznaczeń CYFRA 21-1 w zależności od zakresu mierzonych stężeń; współczynnik nachyleniowy (– 0,0293) nie różnił się istotnie od zera (ryc. 3b). Potwierdzenie tego stanu uzyskano metodą „mountain plot”, Rycina 3a. Ocena zgodności wyników oznaczeń CYFRA 21-1 porównywanymi metodami w grupie chorych na drobnokomórkowego raka płuc. 95% percentylowy zakres różnic wahał się w przedziale od -0,67 do 0,41 ng/ml, przy medianie różnic (-0,004 ng/ml) bliskiej zera (ryc. 3c). W grupie chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca stwierdzano liniową zależność pomiędzy wynikami uzyskanymi dla obu metod, współczynnik nachyleniowy równania regresji wg Passing’a i Bablock’a wynosił 1,1314, a współczynnik odcinający był ujemny i wynosił - 0,720 (ryc. 4a). Można to wiązać ze znacznymi różnicami w wynikach uzyskanych obu metodami przy wysokich stężeniach markera stwierdzanymi u pięciu chorych z rozpoznaniem raka płaskonabłonkowego. W 4 przypadkach stężenia CYFRA 21-1 były wyższe na analizatorze Architect i1000 aniżeli na cobas e411, a różnice przekraczały 6 ng/ml. Analiza graficzna wg Bland i Altmana potwierdziła występowanie istotnych różnic pomiędzy wynikami oznaczeń CYFRA 21-1 w zależności od zakresu mierzonych stężeń; współczynnik nachyleniowy wynosił 0,141 i istotnie różnił się od zera (ryc. 4b). 95% różnic pomiędzy stężeniami CYFRA 21-1 uzyskanymi porównywanymi metodami zawartych było w przedziale od -26,16 do 6,16 ng/ml, przy medianie równej 0,13, a zatem percentylowy rozkład różnic pomiędzy wynikami uzyskanymi dla obu testów był wyraźnie lewoskośny (ryc. 4c). Analiza wyników uzyskanych przy użyciu zestawów odczyn- Rycina 3b. Zależność różnic pomiędzy wynikami oznaczeń CYFRA 21-1 porównywanymi metodami od średnich stężeń markera u chorych na drobnokomórkowego raka płuca - wykres wg Bland i Altman. Rycina 4a. Ocena zgodności wyników oznaczeń CYFRA 21-1 porównywanymi metodami w grupie chorych na niedrobnokomórkowego raka płuc. Rycina 3c. Drobnokomórkowy rak płuca - skumulowany rozkład różnic stężeń CYFRA 21-1 pomiędzy wynikami uzyskanymi porównywanymi metodami (mountain plot). Rycina 4b. Zależność różnic pomiędzy wynikami oznaczeń CYFRA 21-1 porównywanymi metodami od średnich stężeń markera u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca - wykres wg Bland i Altman. 280 E. Wójcik i inni Rycina 4c. Niedrobnokomórkowy rak płuca - skumulowany rozkład różnic stężeń CYFRA 21-1 pomiędzy wynikami uzyskanymi porównywanymi metodami (mountain plot). nikowych Roche Diagnostics i analizatora immunochemicznego cobas e411, a zatem w tym wypadku stanowiących metodę odniesienia, wykazała u osób zdrowych stężenia CYFRA 21-1 istotnie niższe aniżeli u chorych z zapaleniem płuc (p = 0,0042), drobnokomórkowym jak i niedrobnokomórkowym rakiem płuca (w obu przypadkach p = 0,0001). Nie obserwowano natomiast istotnych różnic w stężeniach markera pomiędzy grupą z zapaleniem płuc i chorymi na drobnokomórkowego raka płuca, podczas gdy u chorych na raka niedrobnokomórkowego stężenia markera były istotnie wyższe zarówno w porównaniu do chorych na zapalenie płuc jak i chorych na raka dronokomórkowego (w obu przypadkach p = 0,0001). Wartość odcinająca wyznaczona jako 95 percentyl zakresu stężeń oznaczonych metodą odniesienia w grupie osób zdrowych wynosiła 2,58 ng/ml. Odsetki podwyższonych wyników w grupie chorych z zapaleniem płuc, na drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego raka płuca kształtowały się odpowiednio: 36,7%, 18,6% i 81,1%. Identyczny układ istotnych różnic pomiędzy badanymi grupami stwierdzano również dla stężenia CYFRA 21-1 oznaczanych przy użyciu zestawów odczynnikowych Architect CYFRA 21-1 i analizatora Architect i1000. Wartość odcinająca wyznaczona jako 95 percentyl wahań stężenia markera w grupie osób zdrowych dla tej metody pomiarowej wynosiła 2,11 ng/ml, a odsetki podwyższonych stężeń CYFRA 21-1 w grupie chorych z zapaleniem płuc, na drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego raka płuca kształtowały się odpowiednio: 36,7%, 27,1% i 83,8%. Oceniając różnice w stężeniach CYFRA 21-1 pomiędzy drobnokomórkowym i niedrobnokomórkowym rakiem płuca a grupą referencyjną, obejmującą zarówno osoby zdrowe jak i chorych z niezłośliwymi chorobami płuc, stwierdzano istotnie wyższe stężenie antygenu CYFRA 21-1 zarówno u chorych na raka drobnokomórkowego (p = 0,0226 i p = 0,0011 odpowiednio dla metody odniesienia i metody ocenianej) jak i niedrobnokomórkowego (p = 0,000 i p = 0,0001 odpowiednio Roche i Abbott). Wartości odcinające wyznaczone przy tak skonstruowanej grupie referencyjnej wynosiły 5,04 ng/ml i 4,84 ng/ml (odpowiednio CYFRA 21-1 cobas e 411 i Architect CYFRA 21-1) a odsetki podwyższonych wyników u chorych na raka drobnokomórkowego wynosiły odpowiednio 1,7% i 1,7%, podczas gdy u chorych na raka niedrobnokomórkowego wynosiły 64,8% i 56,8%. Ocena użyteczności diagnostycznej wyników oznaczeń stężenia CYFRA 21-1 w oparciu o analizę krzywych ROC, wykreślonych dla chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca względem grupy referencyjnej, wykazała brak istotnych różnic w powierzchni pól pod tymi krzywymi pomiędzy obu porównywanymi metodami tj. CYFRA 21-1 cobas e411 i Architect i 1000 CYFRA 21-1 (ryc. 5). Wyznaczone w oparciu o krzywe ROC dla obu metod oznaczeń punkty odcięcia naj- Rycina 5. Krzywe ROC dla niedrobnokomórkowego raka płuc względem grupy referencyjnej. lepiej różnicujące chorych na raka niedrobnokomórkowego od grupy referencyjnej wynosi odpowiednio 3,07 ng/ml i 2,73 ng/ml (Roche i Abbott), a wyliczone dla tych wartości odcinających optymalne wartości czułości i swoistości diagnostycznej wynosiły odpowiednio 81,1% i 78,4% oraz 88,1% i 90%. Natomiast dla wyników CYFRA 21-1 oznaczonych przy użyciu zestawów odczynnikowych i analizatora Architect i1000 powierzchnia pola pod krzywą ROC wykreśloną dla drobnokomórkowego raka płuca względem grupy referencyjnej była istotnie większa aniżeli dla wyników uzyskanych metodą odniesienia (ryc. 6). Pole powierzchni pod krzywą ROC wykreśloną dla niedrobnokomórkowego raka płuca względem raka drobnokomórkowego dla wyników uzyskanych na analizatorze cobas e411 było istotnie wyższe aniżeli dla uzyskanych z analizatora Architect i1000 ( p = 0,0036) (ryc. 7). Dyskusja Diagnostyka chorób nowotworowych ma charakter kompleksowy, oprócz badania przedmiotowego i podmiotowego, wykorzystywanych jest w niej wiele technik diagnostyki obrazowej, metody endoskopowe, ale także badań laboratoryjnych, a szczególnie różnych markerów nowotworowych. 281 CYFRA 21-1 – ocena metod oznaczeń Rycina 6. Krzywe ROC dla drobnokomórkowego raka płuca względem grupy referencyjnej. Rycina 7. Krzywe ROC dla niedrobnokomórkowego raka płuc względem chorych na raka drobnokomórkowego. Decydujące znaczenie odnośnie użyteczności tych ostatnich w tym zakresie ma czułość i swoistość diagnostyczna wyników ich oznaczeń. Niestety dla większości dotychczas poznanych markerów jest ona niezadowalająca, stąd badania markerów mają ograniczoną przydatność w diagnostyce nowotworów złośliwych, stanowią zazwyczaj informację o charakterze dodatkowym. Jednak badania markerów mają obecnie ustaloną już pozycję w kontroli chorych na nowotwory po leczeniu podstawowym dla wczesnego wykrycia ewentualnego nawrotu choroby, w monitorowaniu leczenia uzupełniającego i w ocenie reakcji chorych na to leczenie. Coraz większe zainteresowanie budzą możliwości wykorzystania wyników oznaczeń markerów w ocenie rokowania chorych, ich wartość prognostyczna i predykcyjna [5]. Szereg danych klinicznych wskazuje, że klasyczne czynniki prognostyczne takie jak stopień zaawansowania, typ histologiczny, stopień złośliwości nowotworu czy stan sprawności chorych mają ograniczoną użyteczność w ocenie prawdo282 podobieństwa przeżycia chorych na raka płuca. Sytuacja ta wymusza poszukiwania innych wskaźników, które mogłyby być pomocne w kwalifikacji chorych do określonych form terapii, przeżycia bezobjawowego i całkowitego chorych jak również ryzyka reaktywizacji procesu chorobowego. W tym względzie ocenie poddaje się wiele różnych wskaźników m.in. z zakresu biologii molekularnej, genetyki, a także diagnostyki biochemicznej, w tym również krążących markerów nowotworowych [17]. W znacznej mierze te ogólne uwagi odnośnie użyteczności badań markerów nowotworowych na różnych etapach diagnozowania i leczenia chorych na nowotwory złośliwe dotyczą również wykorzystania wyników ich badań u chorych na raka płuca, który należy do najczęstszych nowotworów złośliwych na świecie. Liczba zachorowań na ten nowotwór przekroczyła już milion osób rocznie. Nowotwór występuje 3-krotnie częściej u mężczyzn aniżeli u kobiet. W Polsce w 2008 r stwierdzono ok. 14160 nowych zachorowań na raka płuca u mężczyzn i ok.5332 u kobiet. O ile współczynniki zachorowalności u mężczyzn w ostatnich 13 latach nieznacznie spadają (77,9 vs. 52,4/100 tys.), to u kobiet obserwuje się tendencje wzrostową (13,2 vs. 15,4/100 tys.) [33]. Pomimo systematycznego doskonalenia metod terapeutycznych w Polsce podobnie jak w wielu innych krajach Unii Europejskiej, wskaźniki przeżyć 5 –letnich są niskie i kształtują się na poziomie ok. 14%. Znaczna liczba typów histologicznych nowotworów płuc i wynikające stąd w szeregu przypadków zróżnicowanie własności były przyczyną, że w diagnostyce biochemicznej raka płuca poddano weryfikacji, w tym również w aspekcie przydatności wyników ich oznaczeń dla oceny rokowania chorych, szeroki panel markerów m.in. antygen karcynoembrionalny (CEA), antygen raka płaskonabłonkowego (SCC-Ag), tkankowy polipeptydowy antygen (TPA), swoisty polipeptydowy antygen tkankowy (TPS), antygen pochodny cytokeratyny 19 (CYFRA 21-1), antygen nowotworowy 125 (CA 125), dehydrogenazę pleczanowaą (LDH), chromograninę A, swoistą enolazę neuronową (NSE) oraz propeptyd uwalniający gastrynę (ProGRP). Dane pochodzące z różnych ośrodków wskazują na NSE i ProGRP jako markery pomocne w ocenie przeżycia chorych na raka drobnokomorkowego [10,25,34], a CEA, SCC-Ag, CYFRA 21-1 jako przydatne w ocenie przeżycia chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca, nie tylko w zaawansowanym ale również we wczesnych stadiach procesu nowotworowego [3,8,9,22]. W 1998 r. grupa badaczy z ISOBM dla cytokeratyny 19 zidentyfikowała 10 przeciwciał monoklonalnych, charakterystycznych dla dwóch determinant antygenowych znajdujących się w odległych rejonach cząsteczki. Przeciwciała 179,195, 197 i 204 opisujące epitop zlokalizowany pomiędzy 311 a 335 aminokwasem rdzeniowej domeny filamentu cytokeratynowego znane są pod nazwą KS 19.1, natomiast przeciwciała 182, 183, 187, 194 i 201 opisujące epitop umiejscowiony pomiędzy 346 a 367 aminokwasem i przeciwciało 231 wykazujące reaktywność w stosunku do epitopu znajdującego E. Wójcik i inni się pomiędzy 356 a 370 aminokwasem cytokeratyny 19 znane są pod nazwą BM 19.21 [26]. Przeciwciała te znalazły zastosowanie w zestawach odczynnikowych do oznaczeń antygenu CYFRA 21-1. Stężenie markera w surowicy krwi ludzi zdrowych według danych pochodzących z różnych ośrodków nie przekracza zasadniczo 2,5 ng/ml i nie wykazuje zależności od płci, wieku, i nałogu palenia tytoniu. Wyniki uzyskane w prezentowanych badaniach pozostają w pełnej zgodności z powyższymi ustaleniami [15, 27]. Podwyższone stężenia antygenu CYFRA 21-1 stwierdza się w stanach zapalnych wątroby i trzustki, w chorobach reumatycznych oraz w śródmiąższowych chorobach płuc. Poziom CYFRA 21-1 w surowicy krwi osób z idiopatycznym włóknieniem płuc, czy ze zwłóknieniem płuc towarzyszącym kolagenozom, a także u chorych z rozstrzeniem oskrzeli, na gruźlicę i zapalenie płuc zasadniczo nie przekracza 10 ng/ml, a 95 percentyl zakresu stężeń wynosi 6,2 ng/ml [15]. Nieznacznie niższą wartość odcinającą (5,04 ng/ml) stwierdzono w badanej grupie chorych z zapaleniem płuc. Odsetek chorych na zapalenie płuc ze stężeniem CYFRA 21-1 wyższym od 3,5 ng/ml w badaniach Nakayama M i wsp. wynosił 17,9%, podczas gdy w badanej grupie dla optymalnej wartości odcinającej, wyznaczonej z krzywej ROC i równej 3,07 ng/ml wynosił 23%. Wysuwa się sugestie, że antygen CYFRA 2-1 może być specyficznym markerem uszkodzenia komórek nabłonka oskrzelowego, na co wskazywać mogłyby m.in. wyższe aniżeli u zdrowych poziomy CYFRA 21-1 w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL) uzyskanych podczas bronchofiberoskopii u chorych z przewlekłym zapaleniem dróg oddechowych. Stężenie antygenu CYFRA 21-1 w płynie jest wysoce skorelowane z liczbą neutrofili, stwierdza się w nich ponadto wysoką aktywność elastazy neutrofili, jednej z proteaz indukującej m.in. syntezę cytokin w komórkach nabłonka oskrzelowego. Autorzy dowodzą, że elastaza neutrofili może pełnić rolę ważnego stymulatora odpowiedzialnego za wzmożone uwalnianie fragmentów cytokeratyny 19 z komórek nabłonka oskrzelowego, zatem poziom antygenu CYFRA 21-1 w BAL odzwierciedla w pewien sposób stopień jego uszkodzenia [7, 14]. Sugeruje się ponadto, że istotny wpływ na stężenie cytokeratyn w surowicy ma aktywność proteaz w komórkach nowotworowych jak również dostępność do naczyń krwionośnych w obrębie guza nowotworowego [27]. Od 1999r Europejska Grupa do badań Markerów Nowotworowych (EGTM) zaleca wykonywanie oznaczeń CYFRA 21-1 przed leczeniem we wszystkich podtypach histologicznych chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca [23]. Czułość diagnostyczna oznaczeń tego antygenu u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca kształtuje się w granicach 40% do 69%, wykazując znaczne zróżnicowanie w zależności od typu histologicznego nowotworu. W gruczolakoraku wynosi tylko ok.30%, natomiast w raku płaskonabłonkowym jest wysoka, waha się od 52 do 70 % [6,8,24,30], z tego powodu CYFRA 21-1 uznawany jest za marker z wyboru dla tego typu histologicznego raka płuca. Częstość podwyż- szonych wyników CYFRA 21-1 wzrasta wyraźnie wraz ze stopniem zaawansowania procesu chorobowego. Wyjściowo podwyższony poziom markera ma niekorzystny wpływ na rokowanie, co udowodniono zarówno w grupie chorych z zaawansowanym nowotworem jak i we wczesnych stadiach [13,20]. U chorych w I stopniu zaawansowania w sytuacji, gdy podwyższony przed operacją poziom markera nie uległ po zabiegu obniżeniu do wartości prawidłowych w czasie wynikającym z biologicznego półokresu zaniku rozważa się nawet celowość wdrożenia leczenia uzupełniającego [28]. W opinii niektórych badaczy CYFRA 21-1 może być także czynnikiem predykcyjnym u chorych w zaawansowanym stadium nowotworu. Ponad 18,5% spadek poziomu wyjściowego, w 6-8 tygodni po terapii, uznawany jest wykładnik dobrej reakcji na leczenie chemiczne [31]. Obserwowana w prezentowanych badaniach, identyczność pól powierzchni pod krzywymi ROC dla oznaczeń CYFRA 21-1 u chorych na niedrobnokomórkowegpo raka płuca względem grupy referencyjnej oraz zbliżona względem chorych na raka drobnokomórkowego, potwierdza wysoką użyteczność markera w diagnostyce różnicowej chorych na raka płuca. Różnice w wartościach odcinających ustalonych na podstawie badań stężenia CYFRA 21-1 u ludzi zdrowych, jak i różnice w powierzchni pół pod krzywymi ROC dla raka drobnokomórkowego względem grupy referencyjnej mogą sugerować, że zależność pomiędzy obu porównywanymi metodami w pewnej mierze zależą od zakresu mierzonych stężeń markera. Ta sugestia znajduje swoje odzwierciedlenie w wartościach współczynników nachyleniowych równań regresji opisujących zależności pomiędzy wynikami uzyskiwanymi obu porównywanymi metodami pomiędzy wyodrębnionymi podgrupami badanych. Powszechnie wiadomo, że poziom zmierzonego metodami immunochemicznymi analitu zależy nie tylko od właściwości standardów wykorzystywanych do skonstruowania krzywej kalibracyjnej, właściwości i rodzaju przeciwciał, które służą jako odczynniki, ale również od zastosowanej matrycy, samej techniki pomiarowej, a nawet metod obliczeniowych zastosowanych przy wyznaczaniu krzywej wzorcowej. W badaniu porównywano zgodność wyników oznaczeń antygenu CYFRA 21-1 za pomocą zestawów odczynnikowych i analizatorów immunochemicznych dwóch wytwórców (Roche Diagnostics i Abbott Diagnostics). W zestawach odczynnikowych użyto jako kompetycyjne i detekcyjne tych samych przeciwciał monoklonalnych, ale zastosowane techniki pomiarowe były różne, różne były też zastosowane materiały kontrolne. Nie miało jednak to znaczącego wpływu na uzyskiwane obu metodami wyniki, cechowała je w obu przypadkach wysoka precyzja i poprawność. Pomimo stwierdzanych nieznacznie niższych stężeń markera przy użyciu odczynników i systemu pomiarowego firmy Abbott aniżeli Roche obserwowanych w grupie referencyjnej, badania porównawcze potwierdziły podobną użyteczność diagnostyczną testów ARCHITECT CYFRA 21-1 i ROCHE cobas CYFRA 21-1 u chorych na niedrobnokomórkowego raka płuca. 283 CYFRA 21-1 – ocena metod oznaczeń Piśmiennictwo 1. Barak V, Goike H, Panaretakis KW i wsp. Clinical utility of cytokeratins as tumor markers. Clin Biochem 2004; 37: 529-540. 2. Bodenmuller H. The biochemistry of CYFRA 21-1 and other cytokeratin-tests. Scand J Clin Lab Invest 1995; 55 Suppl 221: 60-66. 3. Buccheri G, Ferrigno.D. Lung tumor markers of cytokeratin origin: an overview. Lung Cancer 200;, 34: S65-S69. 4. Dohmoto K, Hojo S, Fujita J i wsp. Mechanisms of the release of CUFRA 21-1 in human lung cancer cell lines. Lung Cancer 2000; 30: 55-63. 5. Duffy MJ. Clinical utility of tumor markers: what the guidelines recommend. Diag Lab 2010; 46: 283- 291. 6. Ebert W, Dienemann H, Fateh-Moghadam A i wsp. Cytokeratin 19 fragment CYFRA 21-1 compared with carcinoembryonic antigen, squamous cell carcinoma antigen and neuron-specific enolase in lung cancer. Results of an international multicentre study. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1994; 32: 189-199. 7. Kanazawa H, Yoshikawa T, Yamada M i wsp. CYFRA 21-1, a cytokeratin subnit 19 fragment, in bronchoalveolar lavage fluid from patients with interstitial lung disease. Clin Sci 1998; 94 (5): 531-535. 8. Kulpa J, Wójcik E, Reinfuss M, i wsp. Carcinoembryonic Antygen, Squamous Cell Carcinoma Antygen, CYFRA 21-1 and Neuron Specific Enolase in squamous cell lung cancer patients. Clin Chem 2002; 48 (11), 1931-1937. 9. Lamy PJ, Grenier J, Kramar A i wsp. Pro-gastrin releasing peptide, neuron specific enolase and chromogranin A as serum markers of small cell lung cancer. Lung Cancer 2000; 29: 197203. 10. Molina R, Auge JM, Bosch X i wsp: Usefulness of serum tumor markers, including Progastrin-releasing peptide, in patients with lung cancer: correlation with histology. Tumor Biol 2009; 30: 121-129. 11. Moll R, Franke WW, Schiller DL: The katalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell, 1982, 31: 11-24 12. Moll R.: Cytokeratins in the histological diagnosis of malignant tumors. Int. J. Biol Markers 1994; 9: 63-69. 13. Muley T, Dienemann H, Ebert W. Increased CYFRA 21-1 and CEA levels are negative predictors of outcome in p-stage I NSCLC. Anticancer Res 2003; 23: 4085-4094. 14. Nakamura H, Abe S, Shibata Y, i wsp. Elevated level of cytokeratin 19 in bronchoalveolar lavage fluid of patients with chronic airway inflammatory diseases- a specific marker for bronchial epithelial injury. Am J Respir Crit Care Med 1997; 155: 12171221. 15. Nakayama M, Satoh H, Ishikawa H, Fujiwara M et al Cytokeratin fragment 19 in patients with nonmalignant respiratory diseases. Chest 2003; 123: 2001-06. 16. Nisman B, Lafair J, Heching N, i wsp. Evaluation of tissue polypeptide specific antigen, CYFRA 21-1, and carcinoembryonic antigen in nonsmall cell lung carcinoma. Does the combined use of cytokeratin markers give any additional information? Cancer 1998; 82: 1850-1859. 17. Paci M, Rapicetta C, Maramotti S:. New biomarkers in lung cancer. Expert Opin Med Diagn 2010; 4: 201-224. 18. Pendlenton N, Occleston NL, Walshaw MJ, i wsp.: Simple cytokeratines in the serum of patients with lung cancer: realationship to cell death. Eur J Cancer 1994; 30A: 93-96. 19. Pujol J-L, Grenier J, Parrat E i wsp. Cytokeratins as serum markers in lung cancer: a comparison of CYFRA 21-1 and TPS. Am J Respir Crit Med 1996; 154: 725-733. 20. Pujol J-L, Molinier O, Ebert W i wsp. CYFRA 21-1 is a prognostic determinant in non-small-cell lung cancer: results of metaanalysis in 2063 patients. Br J Cancer 2004; 90: 2097-2105. 284 21. Rastel D, Ramaioli A, Cornillie F i wsp. CYFRA 21-1, a sensitive and specific new tumour marker for squamous cell lung camcer. Report of the first European Multicentre evaluation. Eur J Cancer 1994; 30A: 601-606. 22. Shibayama T, Ueoka H, Nishii K, i wsp. Complementary roles of pro-gastrin-releasing peptide (ProGRP) and neuron specific enolase (NSE) in diagnosis and prognosis of small cell lung cancer (SCLC). Lung Cancer 2001; 32: 61-69. 23. Stieber P, Aronsson A-C, Bialk P, i wsp. Tumor markers in lung cancer: EGTM recommendation. Anticancer Res 1999; 19: 2785-2820. 24. Stieber P., Bodenmuller H., Banauch D i wsp. Cytokeratin 19 fragments: a new marker for non-small-cell lung cancer. Clin Biochem 1993; 26, 301-304. 25. Stieber P, Dienemann H, Schalhorn A i wsp.: Pro-gastrin-releasing peptide (ProGRP) – a useful marker in small cell lung carcinomas. Anticancer Res 1999; 19: 2673-2678. 26. Stigbrand T, Andres C, Bellanger L i wsp. Epitope specificity of 30 monoclonal antibodies against cytokeratin antigens: The ISOBM TD-5-1 Workshop. Tumor Biol 1998, 19: 132-152. 27. Sugama Y, Kitamura S, Kawai T, i wsp. Clinical usefulness of CYFRA assay in diagnosing lung cancer: Measurement of serum cytokeratin fragment. Jpn J Cancer Res, 1994; 85: 11781184. 28. Suzuki H, Ishikawa S, Satoh H i wsp. Preoperative CYFRA 21-1 levels as a prognostic factor in c-stage I non-small cell lung cancer. Eur J Cardio-Thorac Surg 2007; 32: 648-652. 29. Ueda Y, Fujita J, Bandoch S i wsp: Expression of cytokeratin 19 mRNA in human cancer cell lines. Int J Cancer 1999; 81: 939-943. 30. van der Gaast A, Schoenmarkers CHH, Kok TC i wsp. Evaluation of new tumour marker in patients with non-small-cell lung cancer: CYFRA 21.1. Br J Cancer 1994; 69: 525-528. 31. Wang J, Zhang N, Li B, Wang Z i wsp. Decline of serum CYFRA 21-1 during chemotherapy of NSCLC: a probable predictive factor for tumor response. Tumor Biol 2011; 32: 689-95. 32. Watine J, Friedberg B, Nagy E, i wsp. Conflict between guidelines methodologic quality and recommendation validity: a potential problem for practitioners. Clin Chem 2006; 52: 65-72. 33. Wojciechowska U, Didkowska J, Zatoński W: Nowotwory złośliwe w Polsce w 2008r. biuletyn Centrum Onkologii, Warszawa 2010. 34. Wójcik E, Kulpa JK, Sas-Korczyńska B, i wsp. ProGRP and NSE in therapy monitoring in patients with small cell lung cancer. Anticancer Res 2008; 28: 3027-34. Adres do korespondencji: Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie 31-115 Krakow, ul. Garncarska 11 [email protected] Zaakceptowano do publikacji: 28.08.2011
