Amplifikacja genu metodą PCR, trawienie

Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii
Biologia i Biologia medyczna II rok
Katedra Biologii Molekularnej
Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią
=================================================================
Ćwiczenie 3
Amplifikacja genu metodą PCR, trawienie enzymami restrykcyjnymi
Prowadzący: mgr Paulina Jędrak, mgr Anna Krajewska,
mgr Małgorzata Bohdanowicz, mgr Olga Rodzik
I.
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR - ang. polymerase chain reaction)
Jest to technika dzięki której możliwe jest otrzymanie dużej liczby kopii określonego fragmentu DNA.
Technika została opracowana w 1983 przez Kary’ego Mullisa za co w 1993 otrzymał on Nagrodę Nobla.
Metoda ta opiera się na powieleniu (amplifikacji) zdefiniowanego odcinka DNA, oflankowanego przez
regiony o znanej sekwencji, przez polimerazę DNA in vitro. Reakcja przeprowadzana jest w
termocyklerze. Urządzenie to pozwala na sterowanie temperaturą (w zależności od etapu cyklu próbki
są podgrzewane lub chłodzone)
Do reakcji PCR potrzebne są:
 Dwuniciowa cząsteczka DNA, której fragment jest powielaną matrycą
 Para starterów (primery), czyli chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy o długości ok. 10-30
par zasad, o sekwencji komplementarnej do matrycowego DNA
 Termostabilna polimeraza DNA
 Mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
 Bufor reakcyjny zapewniający odpowiednie warunki reakcji
1. matryca - dwuniciowa cząsteczka DNA, której fragment chcemy powielić;
Matrycą do syntezy DNA może być DNA liniowy, plazmidowy (ccc), całego genomu np. bakterii. Matryca
DNA używana w reakcji PCR musi być czysta (OD 260/280 1,8 - 2,0). Ilość matrycy zależy od wielkości
DNA i może się wahać w granicach rzędu pg (dla plazmidowego oraz fagowego DNA) do µg (dla
genomowego DNA). DNA używane w reakcji PCR powinno być wolne od substancji mogących wywołać
inhibicję reakcji PCR, np. EDTA/EGTA.
2. startery - zazwyczaj chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy o długości ok.10-30 par zasad o
sekwencji komplementarnej do matrycowego DNA.
Należy zaprojektować je tak, aby:
- zawierały ok. 50% par GC,
- nie tworzyły struktur typu spinki do włosow (ang. hairpin),
- nie zawierały fragmentow komplementarnych do drugiego startera,
- temperatura obu primerów topnienia wynosiła ok. 50-60oC;
3. termostabilna polimeraza DNA.
Jedną z najczęściej obecnie stosowanych polimeraz jest termostabilna polimeraza DNA wyizolowana z
termofilnej bakterii Thermus aquaticus (Taq polimeraza) - nie traci aktywności w temperaturze wymaganej
do denaturacji DNA - produkt PCR posiada na końcu 3’ dA**. Innym przykładem częściej stosowanej
polimerazy może być termostabilna polimeraza Pfu, odznaczająca się większą wiernością kopiowania produkt PCR posiada tępe końce.
4. dNTP (trójfosforany deoksynukleotydów) - stężenie każdego z dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
powinno wynosić 200 µM. Zbyt wysoka ilość dNTP może wpływać inhibicyjnie na reakcję PCR.
5. Bufor reakcyjny – zawierający odpowiednie pH i stężenie jonów niezbędnych do prawidłowego
funkcjonowania enzymów biorących udział w reakcji.
Szczególną uwagę należy zwrócić na zawartość MgCl2 i MgSO4, których stężenie silnie wpływa na
wydajność i specyficzność reakcji PCR. Optymalne stężenie dla różnego rodzaju PCR może być różne. Zbyt
niskie stężenie jonów Mg2+ może skutkować niską wydajnością. Jednak nadmiar wolnych jonów Mg2+ może
spowodować powstawanie niespecyficznych produktów. Powstające kompleksy jonów Mg2+ z wolnymi
dNTP mogą hamować aktywność polimerazy.
Każdy cykl składa się z następujących etapów:
1) denaturacji matrycowego DNA w temperaturze 94-95oC, w obecności dNTP oraz nadmiaru primerów
2) hybrydyzacji (przyłączania) primerów do sekwencji homologicznych w matrycowym DNA, co
następuje po ochłodzeniu mieszaniny do temperatury 45-65oC (ang. annealing)
3) wydłużania primerów przez polimerazę DNA w temperaturze 72oC, co w rezultacie pozwala na syntezę
fragmentu DNA.
denaturacja
Każdy cykl, składający się z denaturacji, przyłączania i syntezy,
powtarzany jest wielokrotnie (od 25 do 40 razy). DNA będący
produktem każdego cyklu, służy jako matryca w następnych
cyklach, czego skutkiem jest szybkie powiększenie puli
syntetyzowanego DNA.
hybrydyzacja
wydłużanie
Zastosowanie PCR:
- diagnostyka molekularna,
- wykrywanie DNA w próbkach klinicznych, identyfikacja próbek w medycynie sądowej, analiza mutacji
w chorobach nowotworowych,
- synteza specyficznych sond,
- tworzenie bibliotek genomów
Schemat przyrostu ilości amplifikowanego fragmentu DNA w kolejnych cyklach
reakcji PCR; gwiazdką zaznaczono właściwy produkt reakcji.
Przykładowe odmiany techniki PCR
Technika PCR – RFLP (ang. Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment LengthPolymorphism)
pozwala na przykład odkryć niektóre mutacje w interesującej nas sekwencji DNA. Po namnożeniu
odpowiedniego fragmentu (np. genu, którego mutacja wywołuje jakąś chorobę), trawi się go za pomocą tak
zwanych enzymów restrykcyjnych. Są to białka, które rozpoznają, a następnie przecinają określoną krótką
sekwencję. Jeśli w obrębie takiej sekwencji nastąpi zmiana (mutacja) - miejsce cięcia zniknie i uwidoczni
się to we wzorze prążków, powstałych po rozdziale produktów reakcji PCR – RFLP w żelu. Może się
również zdarzyć, że w skutek mutacji powstaną nowe miejsca restrykcyjne, co również uwidoczni się za
pomocą tej metody.
Powielenie RNA umożliwia technika RT – PCR (ang. Reverse Transcription – Polymerase Chain
Reaction). Polega ona na przepisaniu badanego RNA na DNA za pomocą enzymu – odwrotnej
transkryptazy. Tak otrzymany odcinek określa się jako cDNA. Może on dalej być powielony jak podczas
zwykłej reakcji PCR. Technika RT – PCR jest szczególnie przydatna w diagnostyce chorób wirusowych
gdyż
wiele
wirusów
ma
genomy
zbudowane
z
RNA.
Skrót RT – PCR jest niekiedy używany także w odniesieniu do innej techniki Real Time PCR ( PCR w
czasie rzeczywistym) jednak poprawny skrót nazwy tej techniki to qPCR, z ang. quantitative PCR ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy DNA. Jest to metoda pozwalająca uzyskać dane o ilości
badanego DNA (lub RNA, jeśli połączy się ją z techniką opisaną powyżej – nazywana QRT-PCR). Jest to
możliwe dzięki zastosowaniu barwników fluorescencyjnych, które reagują zmianami w emisji światła w
zależności od ilości produktu w mieszaninie reakcyjnej.
II. Analiza restrykcyjna wektora oraz produktu reakcji PCR
Enzymy restrykcyjne zostały wyizolowane z wielu gatunków bakterii, w których pełnią
funkcję obrony przed obcym DNA (np. wirusami). Są to enzymy należące do grupy endonukleaz, czyli
enzymów przecinających nici DNA w środku cząsteczki. Dzięki ich obecności obcy DNA po znalezieniu się
w komórce bakterii zostaje pocięty, natomiast DNA bakteryjny unika degradacji dzięki metylacji przez
specyficzną metylazę.
Nazewnictwo – enzymy restrykcyjne określa się za pomocą symboli,
np.
EcoRI – oznacza enzym wyizolowany ze szczepu R Escherichia coli,
Hind III – enzym wyizolowany ze szczepu Hemophilus influenzae serotyp d.
Liczba rzymska wynika z chronologii izolowania enzymów z tych samych mikroorganizmów. Pierwsza
litera oznacza rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, druga i trzecia - gatunek, a kolejna z nich
pochodzi od szczepu lub typu bakterii. Następujące po niej cyfry rzymskie odpowiadają kolejnym enzymom
wyizolowanym z określonego szczepu.
Izoschizomery – enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające tę samą sekwencję w
DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia.
Neoschizomery - restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję w DNA,
ale wprowadzające odmienny typ cięcia.
Rozróżniamy trzy klasy enzymów restrykcyjnych, różniące się mechanizmem cięcia, rodzajem
substratu, produktu i kofaktorami:
Klasa I – białka multimeryczne wymagające jako kofaktorów ATP, S-adenylometioniny i
Mg2+
● działają zarówno jako restryktazy oraz kodyfikacyjne metylazy
● substrat to dwuniciowy DNA zawierający zdefiniowaną sekwencję kilkunastu nukleotydów
● enzym rozpoznaje sekwencje i w pewnej odległości od niej nacina obie nici DNA, nie
uzyskuje się ściśle określonych fragmentów DNA
Klasa II – białka proste, występują w postaci dimerów i tetramerów, in vitro aktywowane
przez Mg2+
● substratem jest dwuniciowy DNA zawierający kilku nukleotydową sekwencję specyficznie
rozpoznawaną przez dany enzym
● cięcie obu nici zachodzi w obrębie rozpoznanej sekwencji lub jej pobliżu (klasa IIS)
● większość enzymów rozpoznaje palindromowe sekwencje (posiadające oś symetrii) cztero-,
sześcio-, lub ośmionukleotydowe.
● enzymy te znalazły największe zastosowanie w biologii molekularnej
Klasa III – aktywowane przez jony Mg2+ i ATP, czasem potrzebna jest S-adenylometionina. Endonukleazy
restrykcyjne klasy III rozpoznają niesymetryczną sekwencję DNA, np.: AGACC – EcoPI; CAGCAG –
EcoP15I; CGAAT – HinfIII; CAGAG – StyLTI i przecinają cząsteczkę DNA w odległości 25-26 pz na
prawo od rozpoznawanej sekwencji.
Wszystkie enzymy restrykcyjne po trawieniu dwuniciowego DNA pozostawiają grupę fosforanową na
końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'. Wydaje się, że przecięcie dwóch nici w obrębie rozpoznanej
sekwencji nie zachodzi jednocześnie, lecz jest wynikiem dwóch niezależnych reakcji katalitycznych.
Stosując odpowiednio niskie stężenie enzymu w stosunku do stężenia DNA można uzyskać cząsteczki z
tylko jedną przeciętą nicią.
W inżynierii genetycznej wykorzystywane są głownie enzymy restrykcyjne klasy II czyli takie,
które tną dwuniciowy DNA w obrębie lub w określonym miejscu w pobliżu rozpoznawanej sekwencji
nukleotydowej. Rozpoznawane sekwencje są palindromowe i obejmują zwykle 4 lub 6 nukleotydów, ale
znane są enzymy, które rozpoznają sekwencje 5, 7
lub 8 nukleotydów. Dany rodzaj enzymu przecina DNA zawsze w taki sam sposób. Używając
enzymu „czwórkowego” (rozpoznającego sekwencję czterech nukleotydów) otrzymuje się niewielkie
fragmenty DNA (statystycznie dana sekwencja czterech nukleotydów występuje w
DNA raz na 256 zasad). Enzym „szóstkowy” tnie DNA na znacznie większe fragmenty (dana
sekwencja sześciu nukleotydów występuje raz na 4096 zasad). Produkty trawienia enzymami
restrykcyjnymi analizuje się zazwyczaj stosując rozdział elektroforetyczny w żelach agarozowych,
wykorzystując ujemny ładunek cząsteczek DNA. DNA uwidacznia się poprzez
barwienie bromkiem etydyny, który świeci w świetle UV, a wielkość fragmentów określa poprzez
porównanie z DNA wzorcowym.
W sekwencji nukleotydowej danej cząsteczki DNA znajdują się miejsca rozpoznawane przez określony
zbiór enzymów restrykcyjnych. Wzajemne ułożenie tych miejsc to mapa restrykcyjna, a wielkość
fragmentów uzyskiwanych po trawieniu wybranymi spośród tych enzymów stanowi wzór restrykcyjny.
Każda cząsteczka DNA ma określoną mapę i wzór restrykcyjny.
Miejsce cięcia przez enzym restrykcyjny obu nici DNA może znajdować się naprzeciwko lub z
przesunięciem o kilka nukleotydów. W pierwszym przypadku powstają tak
zwane „tępe”, a w drugim „lepkie” końce, które mogą być różnej długości (zwykle są 2 lub 4 nt, ale mogą
być także 1 lub 3 nt) i mogą mieć nadmierności typu 5’ lub 3’, w zależności od użytego enzymu
restrykcyjnego.
Np.
SmaI
5`…CCCGGG…3`
3`…GGGCCC…5`
„tępe końce”
5`…CCC
3`…GGG
GGG…3`
CCC…5`
5`…GAATTC…3`
3`…CTTAAG…5`
“lepkie końce” 5`…G
AATTC…3`
3`…CTTAA
G…5`
EcoRI



Możliwa jest także modyfikacja końców w celu uzyskania optymalnego fragmentu do klonowania, np.
tępych, poprzez dołączenie adaptorów (krótkich fragmentów DNA zakończonych z jednej strony na tępo
z drugiej na lepko, specyficznie dla danej restryktazy) lub linkerów (krótkich fragmentów DNA
zawierających określone miejsce restrykcyjne, zakończonych na tępo), przed dołączeniem tych ostatnich
należy zmetylować genomowy DNA odpowiednią metylazą a po ligacji strawić DNA daną restryktazą
uzyskując lepkie końce
lepkich, które mają cofniętą nić 3` - można je wypełnić przy pomocy fragmentu Klenowa polimerazy I
DNA E. coli i kompletu nukleotydów.
lepkich, które mają cofniętą nić 5`- można je „wytępić”, obcinając wysunięty jednoniciowy odcinek
DNA przy użyciu nukleazy S1 lub polimerazy I E. coli wykorzystując jej aktywność egzonukleolityczną
3`→5`.
Enzymy restrykcyjne są podstawowym narzędziem służącym do klonowania genów. Ich właściwości
umożliwiają tworzenie fizycznych map DNA, izolację i identyfikację genów oraz diagnostykę molekularną.
Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która kompletnie trawi 1 µg DNA wzorcowego (np.
fag λ) w czasie 1 godziny w temperaturze optymalnej.
Aktywność niespecyficzna (Star activity) pojawia się w przypadku, gdy warunki reakcji znacznie różnią
się od optymalnych. Efektem jest zmiana (utrata) specyficzności enzymu
• Wysoka koncentracja glicerolu w mieszaninie reakcyjnej (>5% obj)
• Wysokie stężenie enzymu (pow. 100u)
• Niezoptymalizowany bufor (zasadowe ph; za wysokazawartość jonów)
• Przedłużony czas reakcji enzymatycznej
• Obecność związków organicznych takich jak: DMSO, etanol, glikol etylenowy…
• Zastąpienie (lub zwiększona koncentracja) jonów magnezu innymi dwudodatnimi jonami Mn2+, Cu2+,
Co2+ lub Zn2+
III.
Część praktyczna - klonowanie fragmentu plazmidu pCB104 do wektora pUC19 niosącego gen
oporności na Ampicylinę (ampR) oraz gen kodujący N-terminalną domenę β-galaktozydazy (lacZ) .
UWAGA!
Aby część praktyczna się powiodła i by nie dopuścić do zanieczyszczenia próbki całość pracy laboratoryjnej
należy przeprowadzać pamiętając:
- wszystkie czynności wykonywać w rękawiczkach (jeżeli rękawiczki w między czasie zostaną
zabrudzone, należy je natychmiastowo zmienić na nowe)
- używać buforów przeznaczonych wyłącznie do reakcji PCR
- używać wyłącznie jałowych odczynników, tipsów i probówek Eppendorfa, pakowanych do jałowienia
w rękawiczkach
- nie chlapać roztworami DNA !!!
- bardzo dokładnie pipetować
1.
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej (do reakcji PCR)
Matryca –fragment plazmidu pCB104 unieaktywniający gen lacZ, a z tym β-galaktozydazę
Reakcja odbywa się w całkowitej objętości 25 μl.
Przepis praktyczny na 1 reakcję (1 probówkę):
UWAGA! Kolejność dodawania poszczególnych składników jest istotna!
Probówka podczas dodawania poszczególnych składników powinna znajdować się w lodzie.
Stock
Objętość na 1 próbkę
Stężenie końcowe
Bufor
(10x)
2,5 μl
(1x)
mieszanina dNTP
(10mM)
0,5 μl
(200µM)
primer Forvard
(10µM)
0,25 μl
(0,1µM)
primer Revers
(10µM)
0,25 μl
(0,1µM)
matrycowe DNA
1 μl
polimeraza DNA
(5U/µl)
0,1 μl
woda destylowana
dopełnić do 25 μl
2.
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)
Program reakcji PCR:
1 – denaturacja wstępna – 95oC, 5 min
Cykl PCR:
2 – denaturacja
– 95oC, 30 sekund
3 – przyłączenie primera – xoC, 30 sekund
4 – wydłużanie
– 72oC, 30 sekund
6 – końcowe wydłużanie – 72oC, 5 min
30 cykli
3. Trawienie restrykcyjne wektora PUC19 enzymem BamHI oraz PstI
BamHI
5’--G↓GATCC—-3’
3’--CCTAG↓G—5’
PstI
5'--CTGCA↓G--3'
3'--G↓ACGTC—5'
Mieszanina reakcyjna o całkowitej objętości 20 μl (dla trawienia pojedynczym enzymem):
1 μl enzym (FastDigest)
2 μl bufor (10X FastDigest Green Buffer)
2 μl DNA plazmidowego
15 ul wody
Delikatnie wymieszać, krótko zwirować.
Trawienie w 37o C przez 5 minut – inaktywacja 5 min 80 o C
4. Analiza produktu amplifikacji
1.
2.
3.
4.
Przygotować agarozę 1% w buforze 0.5x TAE
Wylać żel w odpowiednim aparacie, poczekać do zastygnięcia agarozy
Do komór aparatu nalać bufor 0.5x TAE , tak aby pokrywał on powierzchnię żelu
Do studzienek żelu nanieść próbki DNA – po 10 μl z każdej reakcji PCR zmieszane z buforem
obciążającym w proporcji 5:1
5. Rozdział prowadzić przy stałym napięciu 5V/cm długości żelu
6. Żel barwić w roztworze bromku etydyny i oglądać w świetle ultrafioletowym.
Zagadnienia do samodzielnego opracowania:
1. Budowa kwasów nukleinowych.
2. Typy PCR.
3. Zastosowanie technik PCR.
4. Enzymy restrykcyjne (klasy, nazewnictwo, zastosowanie).
Literatura:
1. Sęktas M. „Zastosowanie inżynierii genetycznej w biotechnologii. Molekularne podstawy ekspresji
genów”
2. P.C.Turner, A.G. McLennan i inni “Biologia molekularna – krótkie wykłady”
3. Ryszard Słomski (red.) „Przykłady analiz DNA”
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=hmg&part=A551#A552 – „Human Molecular
Genetics”