Opis - Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
PL
(21) Numer zgłoszenia: 403748
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(22) Data zgłoszenia: 02.05.2013
222834
(13) B1
(11)
(51) Int.Cl.
C12Q 1/14 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
C12R 1/46 (2006.01)
C07D 213/81 (2006.01)
Sposób hamowania wzrostu szczepów bakteryjnych
(54)
(73) Uprawniony z patentu:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
10.11.2014 BUP 23/14
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
PL 222834 B1
30.09.2016 WUP 09/16
POLITECHNIKA POZNAŃSKA, Poznań, PL
WIELKOPOLSKIE CENTRUM ONKOLOGII
IM. M. SKŁODOWSKIEJ-CURIE, Poznań, PL
(72) Twórca(y) wynalazku:
ALEKSANDRA BOROWIAK-RESTERNA,
Poznań, PL
ZEFIRYN CYBULSKI, Poznań, PL
EWA KACZOREK, Borówiec, PL
2
PL 222 834 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania wzrostu szczepów wzorcowych S. pneumoniae ATCC 6303, S. pneumoniae ATCC 49619 i S. pyogenes ATCC 19615 z wykorzystaniem związku
chemicznego N,N-diheksylopirydyno-3-karboksyamidu.
Hydrofobowe amidy kwasów pirydynokarboksylowych zostały zaproponowane do wydzielania jonów
szeregu metali (Cu, Co, Zn, Ni, Pd i innych) z kwaśnych roztworów chlorkowych przez Dalton R.F., Price
R., Quan P.M., Stewart D., Process for the extraction of metal values and novel metal extractants. Eur.
Patent Spec. 57, 797 (1982, 1986), US Patent 4,923,686 (1990). Spośród tej grupy związków na szczególną uwagę zasługuje N,N-diheksylopirydyno-3-karboksyamid (DH3), który został otrzymany z dobrą wydajnością (65%) i czystością (98%) przez Borowiak-Resterna A., Extraction of copper from acid chloride solutions by N-alkyl- and N,N-dialkyl-3-pyridinecarboxamides. Solvent Extr. Ion Exch. 1994, 12, 557–569.
Związek ten bardzo dobrze ekstrahuje miedź(ll) z słabo kwaśnych roztworów chlorkowych, co zostało
przedstawione przez Borowiak-Resterna A., Extraction of copper from acid chloride solutions by
N-dodecyl- and N,N-dihexylpyridinecarboxamides. Solvent Extr. Ion Exch. 1999, 17, 133–148; Borowiak-Resterna A., Lenarcik B., Effect of the alkyl chain length in N,N-dialkylpyridine-3-carboxamides upon their
extraction of copper(ll) from aqueous chloride solutions. Solvent Extr. Ion Exch. 2004, 22, 913–931. DH3
wykazuje także bardzo dobre właściwości ekstrakcyjne w silnie kwaśnych układach chlorkowych w stosunku do jonów kadmu (Tomaszewska M., Borowiak-Resterna A., Olszanowski A., Cadmium extraction from
chloride solutions with model N-alkyl- and N,N-dialkyl-pyridinecarboxamides. Hydrometallurgy 2007, 85,
116–126), cynku (Borowiak-Resterna A., Chlebowska H., Giezek M., Zinc extraction from chloride solutions
with model N-alkyl- and N,N-dialkylpyridinecarboxamides. Hydrometallurgy 2010, 103, 158–166), a także
palladu (Szczepańska I., Borowiak-Resterna A., Wiśniewski M., New pyridine-carboxamides for rapid extraction of palladium from acidic chloride media. Hydrometallurgy 2003, 68, 159–170).
Nieoczekiwanie stwierdzono, że N,N-diheksylopirydyno-3-karboksyamid (DH3) powoduje zahamowanie wzrostu niektórych bakterii. W probówkach zawierających 10 mL podłoża, do których dodano 10 L 50% roztworu DH3 w sulfotlenku dimetylu (DMSO) następuje zahamowanie wzrostu takich bakterii, jak: S. pneumoniae ATCC49619, S. pneumoniae ATCC6303 i S. pyogenes ATCC
19615. Ponadto stwierdzono, że rozcieńczalnik DMSO nie powoduje zahamowania wzrostu wymienionych szczepów bakteryjnych.
Stwierdzono, że DH3 nie ulega rozkładowi w DMSO. Powtórne badania dla pneumokoków
i S. pyogenes wykonywane po 3 miesiącach dały identyczne wyniki.
Bakterie S. pneumoniae i S. pyogenes są chorobotwórcze dla ludzi i zwierząt, co stwierdzili
McGee, L, McDougal L, Zhou J., Spratt B.G., Tenover F.C., George, R., Hakenbeck R., Hryniewicz
W., Lefevre J.C., Tomasz A., Klugman K.P. Nomenclature of major antimicrobial-resistant clones of
Streptococcus pneumoniae defined by the Pneumococcal Molecular Epidemiological Network
(PMEN). J. Clin. Microbiol. 2001, 39, 2565–2571; Minami M., Ichikawa M, Hata N, Hasegawa T. Protective effect of hainosankyuto, a traditional Japanese medicine, on Streptococcus pyogenes infection
in murine model. PLoS One. 2011, 6(7): e22188. Epub 2011 Jul 22.
S. pyogenes wywołuje następujące choroby: zapalenie gardła i migdałków (angina paciorkowcowa), płonica, zapalenie ucha środkowego, zapalenie zatok, ropne zapalenie skóry i tkanki podskórnej (cellulitis), liszajec (impetigo), róża, zakażenie pępka u noworodków, gorączka połogowa, martwicze zapalenie powięzi, zapalenie węzłów i naczyń limfatycznych, paciorkowcowy zespół wstrząsu
toksycznego (TSLS – toxic Streptococcal like syndrome).
Rzadszymi zakażeniami są: zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (pourazowe), zapalenie wsierdzia, zapalenie płuc, bakteriemia, zapalenie stawów i zapalenie kości i szpiku.
Powikłania zakażeń:
Ropne: ropień okołomigdałkowy, ropień pozagardłowy, zapalenie węzłów chłonnych.
Nieropne: gorączka reumatyczna, kłębuszkowe zapalenie nerek S. pneumoniae może wywoływać: zapalenie ucha środkowego, zapalenie zatok, zapalenie oskrzeli, zapalenie płuc, posocznicę
(często w przebiegu zapalenia płuc), zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie wyrostka sutkowatego, zapalenie stawów, samoistne zapalenie otrzewnej (w przebiegu marskości wątroby),
a także zakażenia dróg oddechowych u zwierząt.
Ze względu na narastającą oporność S. pneumoniae i S. pyogenes na związki przeciwbakteryjne, co stwierdzili McGee, L., McDougal L., Zhou J., Spratt B.G., Tenover F.C., George, R., Hakenbeck
R., Hryniewicz W., Lefevre J.C., Tomasz A., Klugman K.P. Nomenclature of major antimicrobial-
PL 222 834 B1
3
-resistant clones of Streptococcus pneumoniae defined by the Pneumococcal Molecular Epidemiological Network (PMEN). J. Clin. Microbiol. 2001, 39, 2565–2571; Minami M., Ichikawa M, Hata N, Hasegawa T. Protective effect of hainosankyuto, a traditional Japanese medicine, on Streptococcus pyogenes infection in murine model. PLoS One. 2011, 6(7): e22188. Epub 2011 Jul 22, istotne są badania,
które mają na celu znalezienie nowych substancji, na które bakterie te są wrażliwe.
Istotą wynalazku jest sposób zahamowania wzrostu szczepów bakteryjnych S. pneumoniae ATCC
6303, S. pneumoniae ATCC 49619 i S. pyogenes ATCC 19615, który polega na tym, że do zawiesiny
zawierającej badane szczepy bakteryjne wprowadza się związek chemiczny N,N-diheksylopirydyno-3-karboksyamid (DH3) w takiej ilości, aby jego stężenie w układzie było nie mniejsze niż 90 mg/L.
Dzięki zastosowaniu sposobu według wynalazku uzyskano następujący efekt techniczno-użytkowy: N,N-diheksylopirydyno-3-karboksyamid (DH3) zastępuje inne substancje, na które przebadane szczepy bakteryjne są już oporne, przy czym związek ten ulega biodegradacji pod wpływem
bakterii środowiskowych z rodzaju Pseudomonas i Aeromonas.
W badaniu wrażliwości bakterii na związki chemiczne o działaniu bakteriobójczym i bakteriostatycznym wykorzystuje się postępowanie, które ma określić najmniejsze stężenie hamujące (minimal
inhibitory concentration – MIC) metodą seryjnych rozcieńczeń.
Jak wynika z zaleceń Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST) MIC
penicyliny benzylowej (gdy stosowana jest w leczeniu zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych) wynosi
0,06 mg/L dla S. pneumoniae podczas gdy MIC chloramfenikolu – 8 mg/L (również dla S. pneumoniae)
http://www.korld.edu.pl/pdf/eucast/EUCAST breakpoints tłumaczenie v2-2012.pdf, co wskazuje
na występowanie relatywnie szerokiego zakresu MIC w zależności od antybiotyku i jednostki chorobowej, w której jest podawany.
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady:
Przykład I
W badaniu wrażliwości bakterii S. pneumoniae ATCC 6303 na związek DH3 określono najmniejsze stężenie hamujące (minimal inhibitory concentration – MIC) metodą seryjnych rozcieńczeń.
Przygotowano serię siedmiu probówek z płynnym podłożem wzrostowym dla bakterii. Użyto podłoża
BHI firmy bioMerieux – 10 mL podłoża w każdej probówce. Do pierwszej i siódmej probówki dodano
0,02 mL DH3 w DMSO. Z pierwszej probówki przeniesiono jałową pipetą 1 mL roztworu do drugiej
probówki. Z kolei z drugiej probówki przeniesiono 1 mL do trzeciej probówki, z trzeciej do czwartej
probówki, a z probówki czwartej do probówki piątej. Z piątej probówki usunięto 1 mL roztworu. Następnie do probówek od jeden do sześć dodano pipetą pasterowską po 10 kropli zawiesiny S. pneumoniae ATCC 6303 w Suspension Medium (firmy bioMerieux) o gęstości 0,5 Mc Farlanda. Zawiesinę
przygotowano bezpośrednio przed wykonaniem badania wrażliwości przenosząc ezą jednorazową
firmy bioMerieux drobnoustroje z 24 godzinnej hodowli szczepu na podłożu Columbia agar firmy
bioMerieux. Bezpośrednio przed dodaniem zawiesiny drobnoustrojów i natychmiast po dodaniu zawiesiny do probówek 1–6 przeprowadzono wytrząsanie probówek w ciągu 10 sekund na wytrząsarce
Vortex VI Plus firmy Biosan. Po 24 godzinnej inkubacji w temperaturze 35°C stwierdzono w probówkach 3–6 wzrost bakterii. Probówka „szósta" stanowiła kontrolę dodatnią, tzn. zawierała płynne podłoże wzrostowe dla bakterii oraz zawiesinę S. pyogenes ATCC 19615 w Suspension Medium, w ilościach identycznych jak w probówkach 1–5. Natomiast probówka „siódma" stanowiła kontrolę ujemną,
tzn. zawierała identyczną jak w probówkach 1–6 ilość płynnego podłoża wzrostowego dla bakterii oraz
identyczną jak w probówce „pierwszej" ilość roztworu DH3 w DMSO. Inkubację kontynuowano przez
następne 24 godziny. Wynik nie uległ zmianie. Wartość MIC określono jako 90 mg/L.
P r z y k ł a d II
W badaniu wrażliwości bakterii S. pneumoniae ATCC 49619 na związek DH3 określono najmniejsze stężenie hamujące (minimal inhibitory concentration – MIC) metodą seryjnych rozcieńczeń.
Przygotowano serię siedmiu probówek z płynnym podłożem wzrostowym dla bakterii. Użyto podłoża
BHI firmy bioMerieux – 10 mL podłoża w każdej probówce. Do pierwszej i siódmej probówki dodano
0,02 mL DH3 w DMSO. Z pierwszej probówki przeniesiono jałową pipetą 1 mL roztworu do drugiej
probówki. Z kolei z drugiej probówki przeniesiono 1 mL do trzeciej probówki, z trzeciej do czwartej
probówki, a z probówki czwartej do probówki piątej. Z piątej probówki usunięto 1 mL roztworu. Następnie do probówek od jeden do sześć dodano pipetą pasterowską po 10 kropli zawiesiny S. pneumoniae ATCC 49619 w Suspension Medium (firmy bioMerieux) o gęstości 0,5 Mc Farlanda. Zawiesinę
przygotowano bezpośrednio przed wykonaniem badania wrażliwości przenosząc ezą jednorazową
firmy bioMerieux drobnoustroje z 24 godzinnej hodowli szczepu na podłożu Columbia agar firmy
4
PL 222 834 B1
bioMerieux. Bezpośrednio przed dodaniem zawiesiny drobnoustrojów i natychmiast po dodaniu zawiesiny do probówek 1–6 przeprowadzono wytrząsanie probówek w ciągu 10 sekund na wytrząsarce
Vortex VI Plus firmy Biosan. Po 24 godzinnej inkubacji w temperaturze 35°C stwierdzono w probówkach 3–6 wzrost bakterii. Probówka „szósta" stanowiła kontrolę dodatnią, tzn. zawierała płynne podłoże wzrostowe dla bakterii oraz zawiesinę S. pyogenes ATCC 19615 w Suspension Medium, w ilościach identycznych jak w probówkach 1–5. Natomiast probówka „siódma" stanowiła kontrolę ujemną,
tzn. zawierała identyczną jak w probówkach 1–6 ilość płynnego podłoża wzrostowego dla bakterii oraz
identyczną jak w probówce „pierwszej" ilość roztworu DH3 w DMSO. Inkubację kontynuowano przez
następne 24 godziny. Wynik nie uległ zmianie. Wartość MIC określono jako 90 mg/L.
P r z y k ł a d III
W badaniu wrażliwości bakterii S. pyogenes ATCC 19615 na związek DH3 określono najmniejsze
stężenie hamujące (minimal inhibitory concentration – MIC) metodą seryjnych rozcieńczeń. Przygotowano
serię siedmiu probówek z płynnym podłożem wzrostowym dla bakterii. Użyto podłoża BHI firmy bioMerieux
– 10 mL podłoża w każdej probówce. Do pierwszej i siódmej probówki dodano 0,02 mL DH3 w DMSO.
Z pierwszej probówki przeniesiono jałową pipetą 1 mL roztworu do drugiej probówki. Z kolei z drugiej probówki przeniesiono 1 mL do trzeciej probówki, z trzeciej do czwartej probówki, a z probówki czwartej do
probówki piątej. Z piątej probówki usunięto 1 mL roztworu. Następnie do probówek od jeden do sześć dodano pipetą pasterowską po 10 kropli zawiesiny S. pyogenes ATCC 19615 w Suspension Medium (firmy
bioMerieux) o gęstości 0,5 Mc Farlanda. Zawiesinę przygotowano bezpośrednio przed wykonaniem badania wrażliwości przenosząc ezą jednorazową firmy bioMerieux drobnoustroje z 24 godzinnej hodowli
szczepu na podłożu Columbia agar firmy bioMerieux. Bezpośrednio przed dodaniem zawiesiny drobnoustrojów i natychmiast po dodaniu zawiesiny do probówek 1–6 przeprowadzono wytrząsanie probówek
w ciągu 10 sekund na wytrząsarce Vortex VI Plus firmy Biosan. Po 24 godzinnej inkubacji w temperaturze
35°C stwierdzono w probówkach 3–6 wzrost bakterii. Probówka „szósta" stanowiła kontrolę dodatnią, tzn.
zawierała płynne podłoże wzrostowe dla bakterii oraz zawiesinę S. pyogenes ATCC 19615 w Suspension
Medium, w ilościach identycznych jak w probówkach 1–5. Natomiast probówka „siódma" stanowiła kontrolę
ujemną, tzn. zawierała identyczną jak w probówkach 1–6 ilość płynnego podłoża wzrostowego dla bakterii
oraz identyczną jak w probówce „pierwszej" ilość roztworu DH3 w DMSO. Inkubację kontynuowano przez
następne 24 godziny. Wynik nie uległ zmianie. Wartość MIC określono jako 90 mg/L.
Dla przykładu I, II, III wykonano badania mające na celu wykrycie ewentualnego wpływu sulfotlenku dimetylu (DMSO) na szczepy S. pneumoniae ATCC 49619 i S. pneumoniae ATCC 6303 oraz
S. pyogenes ATCC 19615.
Dla każdego przykładu przygotowano trzy probówki z płynnym podłożem wzrostowym dla bakterii. Użyto podłoża BHI firmy bioMerieux – 10 mL podłoża w każdej probówce. Do pierwszej i trzeciej
probówki dodano 0,1 mL DMSO, a następnie do probówki pierwszej i drugiej dodano pipetą pasterowską po 10 kropli zawiesiny odpowiedniego szczepu bakteryjnego w Suspension Medium (firmy
bioMerieux) o gęstości 0,5 Mc Farlanda. Zawiesinę przygotowano bezpośrednio przed wykonaniem
badania wrażliwości przenosząc ezą jednorazową firmy bioMerieux drobnoustroje z 24 godzinnej hodowli szczepu na podłożu Columbia agar firmy bioMerieux. Bezpośrednio przed dodaniem zawiesiny
drobnoustrojów i natychmiast po dodaniu zawiesiny przeprowadzono wytrząsanie probówek w ciągu
10 sekund na wytrząsarce Vortex VI Plus firmy Biosan. Po 24 godzinnej inkubacji w temperaturze
35°C stwierdzono w probówkach 1 i 2 wzrost bakterii. W probówce trzeciej nie stwierdzono wzrostu
drobnoustrojów. Probówka druga stanowiła kontrolę dodatnią, a probówka trzecia kontrolę ujemną.
Probówka druga stanowiła kontrolę dodatnią, tzn. zawierała płynne podłoże wzrostowe dla bakterii
oraz zawiesinę odpowiedniego szczepu bakteryjnego w Suspension Medium, w ilościach identycznych jak w probówce pierwszej. Natomiast probówka trzecia stanowiła kontrolę ujemną, tzn. zawierała
identyczną jak w probówkach 1–2 ilość płynnego podłoża wzrostowego dla bakterii oraz identyczną
jak w probówce pierwszej ilość DMSO.
Zastrzeżenie patentowe
Sposób hamowania wzrostu szczepów bakteryjnych S. pneumoniae ATCC 6303, S. pneumoniae ATCC 49619 i S. pyogenes ATCC 19615, znamienny tym, że do zawiesiny zawierającej badane
szczepy bakteryjne wprowadza się związek chemiczny N,N-diheksylopirydyno-3-karboksyamid (DH3)
w takiej ilości, aby jego stężenie w układzie było nie mniejsze niż 90 mg/L.
Departament Wydawnictw UPRP
Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)