BIOLOGIA MOLEKULARNA - Zakład Biologii Molekularnej

Zakład Biologii Molekularnej
Materiały do ćwiczeń z przedmiotu:
„BIOLOGIA MOLEKULARNA”
Zakład Biologii Molekularnej
Wydział Farmaceutyczny, WUM
ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa
tel. 22 572 0735, 606448502
1.Izolacja plazmidowego DNA z hodowli bakteryjnej
Wykonanie:
1. Osad z 1.5-3ml nocnej hodowli bakterii dokładnie przepipetować lub zworteksować i
zawiesić w 200µl roztworu do zawieszania L1
2. Dodać 200 µl alkalicznego roztworu lizującego L2 i po wymieszaniu przez
kilkukrotne odwracanie probówki pozostawić 3min. w RT
Uwaga: Po dodaniu roztworu L2 należy ostrożnie mieszać zawartość probówki, aby nie spowodować
fragmentacji chromosomalnego DNA. Zwykle wystarczy 5-6-cio krotne odwrócenie probówki. Po 3 min.
inkubacji lizat powinien być całkowicie klarowny. Jeżeli nie jest należy odwrócić lizat kilka razy i
przedłużyć czas inkubacji o dalsze 3 minuty.
3. Dodać 400 µl roztworu zobojętniającego GL3 i wymieszać przez kilkukrotne
odwracanie probówki
4. Wirować 10 minut przy 10-15 tys. RPM
5. Ostrożnie wlać supernatant do minikolumny do oczyszczania plazmidowego DNA
6. Wirować 1 minutę przy 10-15 tys. RPM
7. Wyciągnąć minikolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć ją do
probówki.
8. Dodać do kolumny 500 µl pierwszego roztworu płuczącego W
9. Wirować 1 minutę przy 10-15 tys. RPM
10. Wyciągnąć minikolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do
probówki
11. Dodać do kolumny 600 µl drugiego roztworu płuczącego A1
12. Wirować 2 minuty przy 10-15 tys. RPM
13. Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce 1.5ml i do złoża znajdującego się
na dnie kolumny dodać 60 µl roztworu TE lub wody
14. Próbkę inkubować 3 minuty w RT
15. Wirować 1 minutę przy 10-15 tys. RPM
Kolumnę usunąć a oczyszczone plazmidowe DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać
do czasu dalszych analiz.
2. Cięcie plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi
Enzymy restrykcyjne są enzymami izolowanymi z bakterii, zdolnymi do
rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA.
Enzymy restrykcyjne typu II jako substratu wymagają dwuniciowej cząsteczki DNA,
zawierającej najmniej jedną sekwencję rozpoznawaną przez dany enzym oraz jonów
magnezu. DNA zostaje przecięte w obrębie lub w okolicy sekwencji rozpoznawanej.
Większość enzymów restrykcyjnych typu II rozpoznaje palindromowe( posiadające oś
symetrii) sekwencje cztero- lub sześcionukleotydowe. Nacięcia w obu niciach mogą leżeć
naprzeciwko siebie i wówczas powstają tzw. ”tępe końce”.
Wykonanie:
Strawić DNA plazmidowy enzymem: Sma 1
Objętość reakcyjna: 20 µl
Stężenie wyjściowe pDNA (pAAV/LacZ):
Ø
Do reakcji: 1-2 µg pDNA
Cięcie
enzymatyczne
Bufor reakcyjny 10X 1X
Bufor
2 µl
2 µl
Enzym restrykcyjny:10U/µl/reakcję
Sma 1
-
1 µl
H2O
pDNA
Uzupełnić wodą do 20 µl
1. Inkubacja mieszaniny reakcyjnej przez 1h, 30 oC
2. Przygotowanie 1,8% żelu agarozowego (2,52 g agarozy/140 ml buforu 1X TBE (Trisacetate); podgrzać w mikrofalówce do momentu uzyskania klarownego roztworu, co
jakiś czas mieszając zlewkę z płynem; dodać BrEt (5 µg/µl5 µg/ml); przelać roztwór
do saneczek elektroforetycznych, pozostawić żel do zastygnięcia)
3. Elektroforeza agarozowa: nałożyć po 10 µl/studzienkę mieszaniny reakcyjnej
zmieszanej z obciążnikiem (2 µl) + marker wielkości w ilości 4 µl ( na pierwszą z
brzegu studzienkę); 30-40min, 100V; po wskazanym czasie żel sprawdzić
podświetlając go promieniami UV