Morfologia bakterii

ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ
I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ
Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej
Wydziału Farmaceutycznego
ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII
I IMMUNOLOGII
DLA STUDENTÓW FARMACJI
POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK
Łódź 2014
1
AUTORZY:
Bożena Dudkiewicz
Wioletta Kmieciak
Anna Kwaszewska
Paweł Lisiecki
Maria Sobiś-Glinkowska
Jadwiga Szarapińska-Kwaszewska
Magdalena Szemraj
Eligia M. Szewczyk
Piotr Wysocki
ISBN:
Wydanie drugie zmienione
2
Spis treści:
MIKROBIOLOGIA
Rozdział 1
Morfologia drobnoustrojów …………………………………………..……….…5
Rozdział 2
Pożywki, morfologia wzrostu bakterii na podłożach………..….…..19
Rozdział 3
Posiew bakterii na podłoża; otrzymywanie czystej hodowli …...33
Rozdział 4 ..
Wymagania wzrostowe bakterii ………………………….…………..……...41
Rozdział 5
Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do ich
Identyfikacji……………………………………………………………………………..51
Rozdział 6
Liczenie bakterii…………………………………………………………….………...69
Rozdział 7
Dezynfekcja i antyseptyka………………………………………………..….…..79
Rozdział 8
Wpływ czynników środowiskowych na wzrost i rozwój bakterii.
Sterylizacja………………..…………………………………………………..…………91
Rozdział 9
Bakterie bytujące na skórze i błonach śluzowych.……………….….103
Rozdział 10
Bakterie w przewodzie pokarmowym.……….………………..…..…....123
Rozdział 11
Inne bakterie bytujące w środowisku człowieka…………………..…145
Rozdział 12
Bakterie wywołujące choroby o swoistym przebiegu,
trudne do hodowli lub identyfikacji…………………………………..……153
Rozdział 13
Wirusologia………………………………………………………………………..……165
3
Rozdział 14
Mikologia…………………………………………………………………………….…..179
Rozdział 15
Bakterie w lekach – kontrola czystości mikrobiologicznej……..…191
Rozdział 16
Schematy identyfikacyjne drobnoustrojów w badaniu leków
wg Farmakopei Polskiej IX…………………………………………………….….205
Rozdział 17
Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenów, przekazywanie
Plazmidów………………………………………………………….……………………211
Rozdział 18
Podstawy wiedzy o antybiotykach i antybiotykoterapii…………..217
IMMUNOLOGIA
Rozdział 1
Podstawy diagnostyki immunologicznej i immunoprofilaktyki…233
4
Rozdział 1
Morfologia drobnoustrojów
Cześć teoretyczna
Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne
Do mikroorganizmów prokariotycznych zaliczamy - bakterie i Archea, a do
eukariotycznych - grzyby, glony i pierwotniaki. Te dwie grupy organizmów
prezentują dwa odmienne typy budowy komórki. Choroby u ludzi
wywołują zarówno drobnoustroje prokariotyczne (bakterie), jak
i eukariotyczne (grzyby i pierwotniaki).
Organizmy eukariotyczne mogą być zbudowane z jednej lub wielu
komórek. Wszystkie drobnoustroje prokariotyczne są organizmami
jednokomórkowymi. Podstawowe różnice w budowie komórki i replikacji
materiału genetycznego pomiędzy komórkami prokariotycznymi
i eukariotycznymi przedstawiono w tabeli 1.
Morfologia komórki bakterii
Wymiar większości komórek bakteryjnych pozwala na ich obserwację
w mikroskopie świetlnym, gdyż mieści się w granicach od 1 do 10 µm.
Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5 µm, a średnica od 1-2 µm.
Jednak rozmiar najmniejszych bakterii wynosi od 0,15 do 0,2 µm i jest na
granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego, ale największych
wynosi od 250 do 600 µm.
Komórki grzybów chorobotwórczych są znacznie większe od komórek
bakteryjnych (do 40 μm). Ich wielkość waha się zależnie od gatunku
i warunków hodowli.
Bakterie różnią się między sobą kształtem. Wyróżniamy kształty: kulisty,
cylindryczny i spiralny.
5
Tabela 1. Podstawowe różnice w strukturze i funkcji komórek prokariotycznych
i eukariotycznych
Cecha
DNA
Rozmnażanie
Komórka prokariotyczna
wolny, zawieszony w
cytoplazmie, zwykle –
jeden chromosom;
plazmidy
tylko bezpłciowe przez
podział komórki
Wymiana materiału poprzez koniugację,
genetycznego
transdukcję i
Ściana komórkowa
Błona
cytoplazmatyczna
Układ błon
wewnętrznych
transformację
zawiera peptydoglikan
(u bakterii) lub inne
polimery (Archea)
brak steroli (poza
mikoplazmami); zawiera
hopanoidy (poza Archea)
brak
Mitochondria
Rybosomy
brak
70 S
Rzęski
z białka - flagelliny
Komórka eukariotyczna
zawarty w jądrze, otoczonym
błoną jądrową; jąderko
podział komórek przez
mitozę; rozmnażanie płciowe
z wytworzeniem gamet
w czasie rozmnażania
płciowego
może zawierać chitynę,
mannany, glukany (grzyby)
lub celulozę
obecne są sterole; organelle
błonowe (lizosomy,
peroksysomy).
retikulum endoplazmatyczne,
aparat Golgiego
obecne
80S (cytoplazmatyczne), 70S
(mitochondrialne)
złożona, tubullarna struktura
Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone
pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstawanie
układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów komórek w trakcie
rozmnażania oraz brakiem ich rozdziałów po podziale. Wśród bakterii
kulistych wyróżniamy następujące układy popodziałowe:
6
 dwoinki (Diplococcus) – komórki po podziale pozostają po dwie,
 ziarniaki czworacze (Tetracocus) – komórki dzielą się w dwóch
płaszczyznach,
 pakietowce (Sarcina) – komórki dzielą się w trzech płaszczyznach
do siebie prostopadłych tworząc sześcianki,
 paciorkowce (Sterptococcus) – komórki układają się w krótsze lub
dłuższe łańcuszki,
 gronkowce (Staphylococcus) – komórki mogą się dzielić w dwóch
lub trzech płaszczyznach, tworząc skupiska przypominające kiście
winogron.
Do form cylindrycznych bakterii zaliczamy: pałeczki (Bacterium),
laseczki
(Bacillus),
maczugowce
(Corynebacterium),
prątki
(Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektóre formy bakterii
cylindrycznych mogą także tworzyć charakterystyczne przestrzenne układy
popodziałowe: dwoinki, krótsze lub dłuższe łańcuszki, palisady,
ugrupowania w kształcie liter V, X, Y.
Do form spiralnych bakterii zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato
zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki
(Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się między sobą liczbą
skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów.
Niektóre gatunki bakterii wykazują tendencję do zmienności
morfologicznej i wielokształtności komórek. Obok kulistych, mogą one
tworzyć formy cylindryczne czy nitkowate. Zjawisko to nazywamy
polimorfizmem (pleomorfizmem).
Strukturami anatomicznymi występującymi w każdej komórce bakteryjnej
są: nukleoid, rybosomy, cytoplazma i błona (membrana)
cytoplazmatyczna. Wszystkie bakterie (z wyjątkiem mykoplazm) mają
złożoną w swej strukturze ścianę komórkową. Niektóre bakterie
wytwarzają warunkujące ruchliwość rzęski czy włókno osiowe, a także
ważne dla kolonizacji fimbrie adhezyjne, dla wymiany materiału
genetycznego – fimbrie
płciowe (pili), albo wpływającą na
chorobotwórczość otoczkę. Niektóre rodzaje bakterii (Clostridium,
Bacillus) mogą także tworzyć przetrwalniki (endospory) czy gromadzić
w cytoplazmie materiały zapasowe, najczęściej kwas poli-β-
7
hydroksymasłowy, ziarnistości poli-metafosforanowe zwane wolutyną, ale
także skrobię, glikogen czy koloidalną siarkę. Wytwarzanie tych struktur
może zależeć od warunków środowiska. Cechy te jednak mają duże
znaczenie dla taksonomii, a tym samym identyfikacji bakterii.
W mikroskopie świetlnym, w „mokrych” preparatach możemy ocenić
kształt i wielkość komórek drobnoustrojów, a także ich ruchliwość
spowodowaną obecnością rzęsek lub włókna osiowego (preparat
w „kropli wiszącej”). Można także obserwować przetrwalniki jako
struktury silniej załamujące światło niż reszta komórki bakteryjnej
(mikroskop fazowo-kontrastowy).
Barwienie trwałych preparatów bakterii metodą Grama wykorzystuje
różnice w budowie ściany komórkowej dwóch grup bakterii. Jedne mają
ścianę złożoną z grubej warstwy peptydoglikanu oraz kwasów
tejchojowych, lipotejchojowych i białek – te nazywamy gramdodatnimi,
a ściana drugiej grupy jest złożona z cienkiej, zawieszonej w peryplazmie
warstwie peptydoglikanu oraz lipopolisacharydu i białek tworzących tzw.
błonę zewnętrzną – te nazywamy gramujemnymi. Różnice w budowie
ściany są przyczyną różnego zatrzymywania przez komórki barwników
stosowanych w metodzie Grama i w efekcie pozwalają na łatwe
przyporządkowanie bakterii do grupy. Ma to ogromne znaczenie dla
identyfikacji bakterii. Ściana komórkowa niektórych bakterii zawiera
dodatkowe składniki, które sprawiają, że barwienie metodą Grama jest
trudne lub niejednoznaczne. Stosowane są wtedy inne metody (np.
Mycobacterium spp.). Metodą Grama barwią się komórki, ale barwników
nie przyjmują przetrwalniki, stąd metoda ta uwidacznia w komórkach te
struktury. Komórka bakteryjna wytwarza tylko jeden przetrwalnik. Może
on mieć kształt kulisty lub owalny i być umieszczony centralnie,
podbiegunowo lub biegunowo. Przetrwalnik może mieć średnicę mniejszą
lub większą od wymiaru poprzecznego komórki. W przypadku, gdy jest
większa, powoduje zniekształcenie komórki i nadaje jej charakterystyczny
kształt.
Wytwarzane przez niektóre bakterie otoczki, także nie zabarwiają się
w metodzie Grama, ale są widoczne, jeśli obok komórki zabarwimy tło metodą pozytywno-negatywną. Otoczki te mają budowę wielocukrową,
wielocukrowo-peptydową lub, najrzadziej, peptydową.
8
Stosując specjalne metody barwienia można zabarwić niektóre struktury
komórkowe: rzęski, nukleoid, przetrwalniki. Dla celów taksonomicznych
zastosowanie znajduje barwienie materiałów zapasowych.
Funkcje jakie spełniają w komórkach poszczególne ich struktury
przedstawiono w tabeli 2.
Tabela 2. Podstawowe funkcje pełnione przez struktury komórki bakteryjnej.
Struktura komórkowa
Pełniona funkcja
Nukleoid, plazmidy
zapis potencjalnych możliwości komórki;
Rybosomy
Błona cytoplazmatyczna
Ściana komórkowa
Otoczka
Rzęski
Fimbrie
Fimbrie płciowe (pili)
Przetrwalniki
genotyp
synteza białek
umożliwia transport do wnętrza i na zewnątrz
komórki; z nią związany jest metabolizm
energetyczny
nadaje kształt, chroni przed uszkodzeniami
mechanicznymi, jest barierą przepuszczalności
dla substancji wielkocząsteczkowych; odgrywa
rolę w patogenezie zakażeń
chroni przed fagocytozą; warunkuje przeżycie
w organizmie gospodarza; bierze udział
w adhezji bakterii do powierzchni
ruch
udział w adhezji bakterii do powierzchni
udział w procesie koniugacji – przekazywania
materiału genetycznego z komórki do komórki
warunkują wyjątkową oporność na działanie
czynników fizyko-chemicznych wytwarzających
je bakterii
9
Metody
Mikroskopowanie
Do obserwacji bakterii wykorzystuje się przede wszystkim mikroskop
z jasnym polem widzenia, którego zdolność rozdzielcza wynosi 0,2 µm.
Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość między
dwoma punktami oglądanego obiektu, przy której widziane są one jako
dwa oddzielne punkty.
Preparaty trwałe barwione należy oglądać przy użyciu obiektywu
immersyjnego dającego powiększenie 100 razy i okularów
powiększających 5-10 razy przy maksymalnie podniesionym kondensorze.
Pozwala to na osiągnięcie największego powiększenia (1000 razy), jakie
możemy uzyskać w mikroskopie świetlnym. Powiększenie mikroskopu jest
iloczynem powiększenia okularu i powiększenia obiektywu.
Obiektyw immersyjny wymaga zastosowania olejku immersyjnego,
w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do
oglądania preparatów. Promienie świetlne po przejściu przez szkiełko
preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość
z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie
olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu
mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku
bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co
grozi jego uszkodzeniem, usuwamy go specjalnym zmywaczem.
Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie ma także wpływ
oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym,
należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym - lusterko
wklęsłe.
Preparaty przyżyciowe tzw. „mokre” oglądamy najczęściej przy pomocy
obiektywów powiększających 40x lub 60x przy obniżonym kondensorze.
Preparat w kropli spłaszczonej jest najłatwiejszy do wykonania. Badany
materiał zawiesza się w kropli wody umieszczonej na szkiełku
podstawowym i przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, które należy
opuścić na szkiełko podstawowe ukośnie tak, aby do kropli nie dostały się
10
pęcherzyki powietrza. Jeśli badany materiał jest płynny, przenosi się
kroplę wprost na szkiełko. Niekiedy stosuje się barwienie przyżyciowe, co
ułatwia obserwację kształtu drobnoustrojów.
Preparat w "kropli wiszącej" umożliwia obserwację ruchu bakterii.
Wykonuje się go używając szkiełka podstawowego z wgłębieniem ("łezką")
i szkiełka nakrywkowego.
Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych
Rozmazy wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach
podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli
stałej, na szkiełko należy najpierw nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie
zawiesić w niej bardzo niewielką ilość masy bakteryjnej. Powstała
zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż
nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem
prawidłowej oceny ich morfologii.
Z hodowli płynnej nanosi się ezą na szkiełko 2-3 krople materiału. Każdą
kroplę, przed naniesieniem następnej należy wysuszyć. Trzeba też
pamiętać o przepaleniu ezy przed powtórnym zanurzeniem jej w hodowli.
Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego
powietrza, trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem.
Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu
szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem
metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania.
W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać
w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek
w trakcie pobierania materiału.
Barwienie preparatów trwałych
Bakterie najczęściej oglądamy w preparatach barwionych. Możemy w nich
zaobserwować cechy morfologiczne komórek bakteryjnych, takie jak
wymiar, kształt, sposób układania się komórek i nieliczne struktury
anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii między
sobą i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują.
11
Barwniki wykorzystywane w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na
barwniki kwaśne i barwniki zasadowe. Barwniki kwaśne to sole, w których
kationem jest metal, a anion jest jonem barwnym. Do najczęściej
wykorzystywanych należą – nigrozyna, tusz chiński, kolargol, zieleń
malachitowa i eozyna. W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest
kation. Do najczęściej wykorzystywanych zaliczamy fiolet krystaliczny,
fuksynę zasadową, safraninę i błękit metylenowy. Mechanizm barwienia
polega na adsorpcji barwnika na powierzchni komórki i na łączeniu się go
ze związkami chemicznymi, głównie białkami, wchodzącymi w skład
komórki bakteryjnej. W pH hodowli – zwykle obojętnym lub lekko
zasadowym – białka bakteryjne mają ładunek ujemny. Kwasy nukleinowe,
z którymi też będą łączyć się barwniki, w tych warunkach również
wykazują ujemne naładowanie. Dlatego właśnie do barwienia bakterii
używa się barwników zasadowych. Barwniki kwaśne stosowane są do
barwienia tła – otoczenia, w którym znajdują bakterie. Barwienie komórek
bakteryjnych określamy barwieniem pozytywnym. Barwienie tła,
otoczenia, w którym znajdują się komórki określamy barwieniem
negatywnym.
Metoda Grama
Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym
stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy:
gramdodatnie i gramujemne.
W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki:
 barwnik podstawowy – fenolowy roztwór fioletu krystalicznego
(gencjana);
 zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola);
 odbarwiacz - alkohol etylowy;
 barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór fuksyny
zasadowej (fuksyna 1:10).
Wykonanie barwienia
- na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę
roztwór gencjany na 2 minuty;
- preparat spłukać wodą;
12
- nalać płyn Lugola na 1 minutę;
- spłukać wodą;
- odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund;
- spłukać wodą;
- dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny;
- spłukać wodą;
- osuszyć lekko odciskając w bibule.
Wynik barwienia:
Bakterie gramdodatnie – fioletowogranatowe, gramujemne - różowe.
O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy
peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii
gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet
krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem
tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor
fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę
cytoplazmatyczną bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną
i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również
odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę
komórkową. Gruba warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich
skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym.
W przypadku bakterii gramujemnych kompleks ten wydostaje się na
zewnątrz przez cienką warstwę peptydoglikanu. Fuksyna jako barwnik
kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo.
Metoda barwienia negatywno-pozytywnego
Barwienie metodą negatywno-pozytywną jest jedną z technik wykrywania
otoczek u bakterii. Komórka bakteryjna zabarwiana jest barwnikiem
zasadowym, a tło kwaśnym. W metodzie tej można używać różnych
barwników. Dla zabarwienia komórki - najczęściej stosuje się fuksynę
z dodatkiem fuksyny karbolowej, dla zabarwienia tła - nigrozynę lub
kolargol.
13
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Mikroskopowanie pod immersją i ocena preparatów
Otrzymujesz gotowy preparat wykonany z hodowli Bacillus subtilis
i zabarwiony metodą Grama.
- Nastaw i obejrzyj go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw
immersyjny.
- Narysuj obraz preparatu widzianego w mikroskopie.
- Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się
komórek bakteryjnych.
- Czy obserwowany przez ciebie drobnoustrój należy do bakterii
gramdodatnich czy gramujemnych?
Powiększenie:
To bakterie gram..................
14
Zadanie 2
Przygotowanie i barwienie preparatów
Otrzymujesz hodowlę stałą Pseudomonas aeruginosa lub Staphylococcus
aureus w płytce Petriego. Bakterie posiane zostały w sposób pasmowy.
- Wykonaj preparat z hodowli jednego z drobnoustrojów i zabarw go
metodą Grama.
- Nastaw i obejrzyj go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw
immersyjny. Narysuj obraz mikroskopowy.
- Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się
komórek bakteryjnych.
- Czy badany przez ciebie drobnoustrój okazał się bakterią gramdodatnią
czy gramujemną ?
Powiększenie:
To bakterie gram..........................
15
Efekty uzyskiwane na poszczególnych etapach barwienia metodą Grama
Wypełnienie poniższej tabeli pozwoli ci zapamiętać sposób reagowania
bakterii na odczynniki wykorzystywane w metodzie Grama. Napisz, jaką
barwę przyjmują komórki lub jakie zachodzą reakcje.
Używane odczynniki
Bakterie gramdodatnie
Bakterie gramujemne
Fenolowy roztwór fioletu
krystalicznego
(Gencjana)
Roztwór jodu w jodku
potasu (płyn Lugola)
Alkohol etylowy
Alkoholowo-wodny
roztwór fuksyny
zasadowej
(Fuksyna 1:10)
16
17
18
Rozdział 2
Pożywki, morfologia wzrostu bakterii na
podłożach
Cześć teoretyczna
Czynniki warunkujące wzrost bakterii na podłożach
Bakterie mogą się rozwijać tylko w takich środowiskach, które zaspokajają
ich wymagania pokarmowe. Pobrane składniki są źródłem substancji
budulcowych komórki oraz energii potrzebnej dla rozmnażania i wzrostu.
Do elementów pokarmowych, bez których wzrost nie jest możliwy należą:
węgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodór (H). Pierwiastki
te wchodzą w skład większości związków organicznych tworzących
komórkę i określane są jako pierwiastki budulcowe lub biogenne.
Pewne grupy bakterii nie są zdolne do wzrostu, jeśli nie dostarczymy im
gotowych związków, które nazywamy czynnikami wzrostowymi. Należą
do nich witaminy szczególnie z grupy B, zasady purynowe
i pirymidynowe, a także niekiedy cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP
i nienasycone kwasy tłuszczowe.
Bakterie do wzrostu wymagają znacznych ilości wody. W wodzie
rozpuszczone są związki odżywcze dla bakterii. Woda jest także
środowiskiem, w którym zachodzą procesy metaboliczne, a także jest
istotnym źródłem wodoru i tlenu. Większość bakterii nie wzrasta, jeśli
zawartość wody w środowisku jest niższa niż 20%. Zawartość wody
w podłożach hodowlanych wynosi 50-90%.
Wzrost bakterii zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony
Mg2+, Fe 2+, Ca2+ , Mn 2+, Zn2+ są aktywatorami niektórych reakcji
enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Sole mineralne są
również czynnikami regulującymi ciśnienie osmotyczne komórki.
19
Podłoża do hodowli bakterii
Pożywki (podłoża) bakteriologiczne służą do hodowli bakterii
w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie składu podłoża
pozwala na przeniesienie bakterii z ich naturalnych środowisk (organizm
człowieka, gleba, woda) i namnożenie. Bakterie hodujemy na stałych lub
w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach
hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Wzrost
i rozwój bakterii na pożywkach pozwala na ich wyodrębnienie i zbadanie
ich
cech
morfologicznych,
fizjologicznych,
biochemicznych
i serologicznych. Większość bakterii rośnie na sztucznych podłożach. Nie
ma jednak uniwersalnej pożywki umożliwiającej wzrost wszystkim
bakteriom.
Pożywki stosowane do namnażania bakterii powinny:
 zawierać odpowiednie składniki pokarmowe,
 mieć odpowiednią wilgotność,
 mieć odpowiednie pH,
 mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,
 być jałowe.
Biorąc pod uwagę ich skład chemiczny, podłoża bakteriologiczne dzielimy
na syntetyczne (ściśle zdefiniowane chemiczne) i złożone (kompleksowe).
Skład pożywek syntetycznych jest dokładnie zdefiniowany i oparty na
syntetycznych związkach organicznych i nieorganicznych. Jest więc zawsze
możliwy do dokładnego odtworzenia. Pożywki te znajdują niekiedy
zastosowanie w laboratoriach badawczych.
Pożywki złożone to podłoża zawierają dodatkowo surowce pochodzenia
naturalnego, których skład nie jest dokładnie określony. Są to ekstrakty
mięsne, hydrolizaty kwaśne i enzymatyczne białek i inne składniki. Podłoża
złożone mają szerokie zastosowanie w laboratoriach diagnostycznych
i naukowych.
Pożywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli
drobnoustrojów o małych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone,
które służą do hodowli drobnoustrojów o dużych wymaganiach
odżywczych.
20
Podstawową pożywką płynną jest bulion odżywczy, a stałą agar odżywczy.
Bulion odżywczy zawiera wyciąg mięsny, pepton i NaCl. Poprzez dodanie
do bulionu odżywczego agaru w stężeniu 1,5-2% otrzymujemy podłoże
stałe. Agar to wielocukier otrzymywany z glonów morskich. Silnie chłonie
wodę, upłynnia się w temperaturze 100°C, a zestala w temperaturze 4548°C. W temperaturze 37°C, a więc optymalnej dla wzrostu większości
bakterii ma konsystencję stałą. Służy on do zestalenia pożywki. Nie jest
wykorzystywany przez bakterie jako składnik odżywczy. Agar odżywczy
przygotowywany jest w postaci skosów agarowych, słupków lub płytek
agarowych.
Podłoża wzbogacone to najczęściej podłoża podstawowe zawierające
dodatkowe składniki odżywcze. Elementami wzbogacającymi mogą być:
węglowodany (np. glukoza), białka zwierzęce (surowica lub krew),
hydrolizaty białek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzystywanym
w badaniach mikrobiologicznych podłożem wzbogaconym jest agar
z krwią. Zawiera on 5-10% odwłóknionej jałowej krwi (najczęściej
baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odżywczym. Po wylaniu na
płytkę Petriego otrzymujemy tak zwaną „płytkę krwawą”. Innym, często
wykorzystywanym podłożem wzbogaconym jest agar czekoladowy.
Zawiera on agar odżywczy i zdenaturowaną termicznie krew. Po zestaleniu
podłoża ma ono barwę czekoladową, stąd jego nazwa.
Pożywki mogą zawierać dodatkowe składniki, które wpływają na rozwój
hodowanych na nich bakterii.
Ze względu na wynikające z ich składu zastosowanie, podłoża możemy
podzielić na:
 namnażające lub namnażająco-wybiórcze,
 wybiórcze (selektywne),
 diagnostyczne (różnicujące),
 transportowe.
Pożywki namnażające lub namnażająco-wybiórcze są to najczęściej
podłoża płynne, wykorzystywane do namnażania bakterii występujących
w niewielkiej ilości w badanej próbce, często jako pojedyncze komórki,
w licznej populacji bakterii towarzyszących. Skład pożywki i warunki
hodowli umożliwiają namnożenie się tylko bakterii poszukiwanych.
21
Pożywki wybiórcze (selektywne) oprócz składników odżywczych zawierają
składniki wybiórcze, które powodują całkowite zahamowanie wzrostu
pewnych gatunków bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu.
Czynnikiem decydującymi o wybiórczości podłoża może być azydek sodu,
sole kwasów żółciowych niektóre barwniki i antybiotyki. Są to najczęściej
podłoża stałe. Przykładem podłoża wybiórczego może być podłoże
Loewensteina-Jensena do hodowli prątków gruźlicy.
Pożywki różnicujące (diagnostyczne) pozwalają na zmierzające do
identyfikacji, różnicowanie
bakterii. Zawierają one substrat
diagnostyczny, który może być rozłożony enzymatycznie tylko przez
określone gatunki bakterii. Do podłoża często dodawany jest wskaźniki,
który, na przykład zmienia swoje zabarwienie w zależności od pH pożywki.
Dlatego właśnie rozkład substratu manifestuje się zmianą zabarwienia
pożywki (podłoża stałe lub podłoża płynne) lub odpowiednim
zabarwieniem wyrosłych kolonii (podłoża stałe).
Stałe podłoża różnicujące mogą być jednocześnie podłożami wybiórczym
dla określonej grupy bakterii i są nazywane wybiórczo-różnicującymi.
Przykładem takiej pożywki może być podłoże SS (Salmonella-Shigella)
służące do izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella oraz podłoże
Chapmana służące do izolacji gronkowców.
Pożywki transportowe nie zawierają składników pokarmowych. Zawierają
składniki optymalne dla przeżycia bakterii, w tym roztwory buforowe
i sole mineralne. Zadaniem tych pożywek jest utrzymanie żywotności
bakterii w próbce, zanim trafi ona do laboratorium mikrobiologicznego.
Na rynku dostępne są podłoża o wystandaryzowanym składzie, jałowe
i gotowe do użycia, w jednorazowych naczyniach, o określonej dacie
przydatności. Zastosowanie gotowych podłoży znacznie skraca czas
przygotowań do badań mikrobiologicznych. Można też je przygotowywać
samodzielnie korzystając z pożywek w proszku o wystandaryzowanym
składzie i innych chemicznych składników. Własnoręczne komponowanie
pożywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniających
powtarzalność ich składu pozwalającą na porównywanie wyników hodowli
otrzymywanych w różnym czasie i w różnych laboratoriach. Bezpośrednio
po przygotowaniu, takie pożywki należy wyjałowić, stanowią bowiem
podłoże wzrostu także dla drobnoustrojów licznie obecnych w użytych
22
składnikach i otoczeniu. Sterylizacji tej dokonuje się najczęściej
w autoklawie lub w aparacie Kocha.
Czas generacji bakterii, optymalny czas hodowli
W podłożu zawierającym niezbędne do wzrostu składniki, bakterie
podwajają swoją masę i replikują swój materiał genetyczny, co
w konsekwencji prowadzi do ich podziału. Wzrost populacji bakterii
odbywa się zgodnie z postępem geometrycznym (20 ,21 ,22 , 23…2n). Czas
generacji (okres międzypodziałowy) jest to czas potrzebny do podwojenia
liczby komórek w populacji. Szybkość wzrostu bakterii jest cechą
charakterystyczną rodzaju (gatunku). Zależy ona także od rodzaju podłoża
wzrostowego oraz warunków środowiskowych. W optymalnych
warunkach wzrostu w laboratorium okres międzypodziałowy większości
bakterii wynosi od 20 do 40 minut, ale może też być znacznie dłuższy - od
kilku do kilkunastu godzin. Stąd, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii
na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem jest różny, ale
dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi 18-24 godziny.
Krzywa wzrostu bakterii w hodowli płynnej
Bakterie na podłożach płynnych można namnażać w warunkach hodowli
okresowej (zwykłej) lub ciągłej. W hodowli okresowej bakterie namnażają
się w systemie zamkniętym (probówki, kolbki, butelki, bioreaktory) do
momentu wyczerpania substancji odżywczych zawartych w pożywce lub
nagromadzenia w niej dużej ilości toksycznych dla bakterii produktów ich
metabolizmu. W hodowli ciągłej, którą prowadzi się w bioreaktorach,
wzrost bakterii można utrzymywać nieskończenie długo. Możliwe jest to
dzięki ciągłemu dostarczaniu do bioreaktora świeżej pożywki
z jednoczesnym odprowadzeniem takiej samej objętości pożywki
zawierającej wyrosłe bakterie i produkty ich metabolizmu. Objętość płynu
hodowlanego w trakcie prowadzenia hodowli utrzymuje się na stałym
poziomie.
23
Wzrost bakterii w hodowli okresowej można przedstawić graficznie pod
postacią krzywej, którą nazywamy krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej.
Jest to krzywa w układzie półlogarytmicznym. Opisuje ona zależność
logarytmu dziesiętnego liczby żywych komórek bakterii od czasu hodowli
i ilustruje wzrost populacji (rycina 1). Obraz krzywej wzrostu dla większości
bakterii jest bardzo podobny i można w nim wyróżnić sześć faz. Czas
trwania poszczególnych faz wzrostu jest zależny od rodzaju bakterii
i warunków hodowli. Poszczególne fazy wzrostu różnią się częstością
podziałów komórek i szybkością ich wymierania.
Faza pierwsza, nazywana jest fazą zastoju. Bakterie przystosowuj swój
metabolizm do nowego środowiska. Wzrasta ilość rybosomów i zawartość
RNA. Pojedyncze komórki powiększają swój wymiar i przygotowują się do
podziału.
Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komórki wykazują intensywny
metabolizm. Rozpoczynają się podziały komórkowe.
Faza trzecia, nazywana fazą wzrostu wykładniczego (logarytmicznego), jest
okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komórek jest
bardzo intensywny. Liczba żywych komórek przyrasta w postępie
geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komórki są żywe. W tej
fazie wzrostu bakterie są najbardziej wrażliwe na działanie fizycznych
i chemicznych czynników środowiskowych.
Faza czwarta jest fazą zwolnionego wzrostu. Rozmiar komórek maleje.
Zmniejsza się ilość rybosomów i zawartość RNA. Zwiększa się liczba
komórek martwych. Częstość podziałów maleje.
Faza piąta, nazywana fazą stacjonarną (równowagi), charakteryzuje się
stałą liczbą żywych komórek w hodowli. Z powodu braku substancji
pokarmowych komórki zużywają własne materiały zapasowe.
Sporadyczne podziały komórkowe rekompensują ubytki komórek
spowodowane ich wymieraniem.
Faza szósta – zamierania. Wzrasta liczba martwych komórek. Zaczynają się
procesy autolizy, czyli samorozpuszczania się bakterii pod wpływem
własnych enzymów. Zmniejsza się liczba żywych komórek i ogólna
biomasa hodowli. Brak podziałów komórkowych.
24
lg liczby żywych komórek
4
5
5
6
3
1
2
czas hodowli
Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju,
2 – faza przyspieszonego wzrostu, 3 – faza wzrostu logarytmicznego,
4 – faza zwolnionego wzrostu, 5 – faza stacjonarna, 6 – faza zamierania
Wzrost bakterii na podłożach płynnych i stałych
Wygląd wzrostu na podłożach może stanowić ważne kryterium przy
identyfikacji bakterii.
Na podłożach płynnych bakterie wyrastają w postaci jednolitego
zmętnienia, osadu na dnie naczynia, kożuszka lub błonki na powierzchni
płynu. Czasami zmętnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagęszczenie
przy powierzchni, a na granicy faz (pożywka-powietrze) tworzy się
przylegająca do ścianek naczynia warstwa biofilmu.
Na podłożach stałych możemy oceniać wygląd kolonii bakteryjnych.
Istotna może być też ocena obfitości wzrostu lub obserwacja zdolności
bakterii do wzrostu mgławicowego.
Kolonię bakteryjną definiujemy jako widoczne makroskopowo na
powierzchni lub w głębi stałej pożywki skupisko bakterii wyrosłe z jednej
jednostki wzrostowej (jtk – jednostka tworząca kolonie; CFU – ang. colony
forming unit). Przez jednostkę wzrostową rozumiemy jedną lub kilka
25
komórek bakteryjnych, które nie rozdzieliły się po podziale (układ
popodziałowy), a także przetrwalnik.
Umiejętność oceny morfologii kolonii jest bardzo ważna, gdyż
w przypadku niektórych bakterii może w istotny sposób ważyć na ich
identyfikacji, jest też istotna przy określaniu czystości hodowli.
W określonych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi
cechami.
Metody
Opis kolonii
Dla celów diagnostycznych opisuje się kolonie wyrosłe na podłożach, które
nie powodują ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaływania
zawartych w nich wskaźników czy barwników. Niekiedy jednak istotny
także bywa opis ich wyglądu na podłożach diagnostycznych.
Należy opisywać kolonie oddalone od pozostałych tak, aby ich wzrost nie
był ograniczony przez zbyt liczne sąsiedztwo.
W opisie kolonii należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy:
 wielkość - średnica (mm);
 kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna, ..;
 brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany, ... ;
 powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona,
grudkowata, ... ;
 wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata,
wrastająca w podłoże, ... ;
 przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna, ... ;
 barwę - biała, kremowa, szara, czerwona, ... ;
 otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża.
26
Metody sterylizacji pożywek
Jednym z podstawowych wymogów, jakie muszą spełniać podłoża
bakteriologiczne, jest ich jałowość (sterylność). Sterylizacja to proces
prowadzący do całkowitego zniszczenia form wegetatywnych
i przetrwalników drobnoustrojów. Do sterylizacji pożywek najczęściej
wykorzystuje się wysoką temperaturę – gorąco wilgotne (para wodna).
Proces sterylizacji prowadzi się w autoklawie w temperaturze 121°C przy
nadciśnieniu 1 atm przez 30 minut, gdy składniki pożywki są względnie
termostabilne lub metodą tyndalizacji w aparacie Kocha, gdy pożywka
zawiera składniki termolabilne. Tyndalizacja polega na trzykrotnym 60minutowym ogrzewaniu pożywki w temperaturze 100°C w odstępach 24
godzinnych.
Szkło laboratoryjne, w którym umieszczamy pożywki wyjaławia się
w suszarce wykorzystując działanie gorącego suchego powietrza. Czas
sterylizacji zależy od zastosowanej temperatury. Najczęściej stosuje się
temperaturę 160°C przez 2 godziny lub 180°C przez 30 minut. Szkło
laboratoryjne można także jałowić w autoklawie.
Metody kontroli urządzeń sterylizujących
Niesterylność pożywek może wynikać z niewłaściwie przeprowadzonego
procesu ich sterylizacji, wadliwie działających urządzeń sterylizujących lub
być wynikiem późniejszego zakażenia w wyniku nieprzestrzegania zasad
aseptyki w trakcie ich przechowywania lub wykonywania posiewów.
Urządzenia sterylizujące muszą podlegać okresowej kontroli. Skuteczność
procesu sterylizacji bada się za pomocą wskaźników fizycznych,
chemicznych i biologicznych.
Wskaźniki fizyczne - termometry, manometry, zegary, mierniki
wilgotności, mierniki zawartości gazu i inne przyrządy wmontowane do
urządzenia sterylizującego informują tylko o jego stanie technicznym.
Mierzą punktowo dany parametr. Oprócz obserwacji wskazań tych
przyrządów, coraz częściej stosuje się system rejestracji podstawowych
parametrów fizycznych w postaci wydruków, wykresów lub raportów.
Wskaźniki chemiczne zawierają substancje chemiczną, która trwale
zmienia swoje zabarwienie, kiedy zostaną osiągnięte właściwe parametry
27
sterylizacji. Testy te mają postać rurek, pasków czy taśm. Wskaźniki
chemiczne informują jedynie, czy w danym cyklu pracy zostały osiągnięte
warunki sterylizacji, nie dają one gwarancji, że poddany sterylizacji
materiał został wyjałowiony. W tak zwanych wskaźnikach
jednoparametrowych zmiana barwy następuje pod wpływem osiągnięcia
jednego z parametrów sterylizacji, najczęściej temperatury. Nie wykazują
one jednak, jak długo ta temperatura utrzymywała. Chemiczne wskaźniki
wieloparametrowe wykazują, że w trakcie sterylizacji zostały osiągnięte
wartości wszystkich lub kilku (przynajmniej dwóch) parametrów
sterylizacji. Informują one zatem o prawidłowości przebiegu procesu
sterylizacji.
Wskaźniki biologiczne - zawierają określoną liczbę żywych, zdolnych do
przejścia w formy wegetatywne, wysoce opornych na działanie
temperatury przetrwalników bakteryjnych. Wykorzystywane są
przetrwalniki Geobacillus stearothermophilus lub Bacillus subtilis zawarte,
odpowiednio, w zestawach testowych Sporal A (kontrola autoklawów)
i Sporal S (kontrola suszarek). Wskaźniki te informują o fakcie zabicia
przetrwalników. Wskaźniki biologiczne dają gwarancję jałowości - jeżeli
użyte w teście przetrwalniki zostały zabite, oznacza to, iż zostały zabite
wszystkie
bardziej
wrażliwe
drobnoustroje
zanieczyszczające
sterylizowany materiał.
Dla uzyskania pełnej informacji o urządzeniu niezbędne jest
monitorowanie procesu sterylizacji za pomocą wszystkich trzech metod.
Skuteczność urządzeń sterylizujących powinna być kontrolowana przy
użyciu wskaźników fizycznych i chemicznych w czasie każdego procesu
sterylizacji. Ponadto okresowo należy je kontrolować przy użyciu
wskaźników biologicznych.
28
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Charakterystyka kolonii bakteryjnej
- Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze
kolonie. Powstały one w wyniku rozmnożenia się komórek bakterii
i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza.
- Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając wszystkie jej cechy.
29
Zadanie 2
Kontrola skuteczności
biologicznego Sporal S
sterylizacji w
suszarce
za pomocą testu
- Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem Sporalu S.
- Sprawdź temperaturę suszarki (180°C) i umieść w niej torebkę
w szklanym otwartym naczyniu. Zanotuj czas.
- Po 30 minutach sterylizacji wyjmij Sporal S z suszarki.
- Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą i jałowo (przy
palniku) przenieś krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą.
- Po inkubacji (37°C, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost
(zmętnienie, kożuch) czy też bulion jest klarowny.
- Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia
Zadanie 3
Kontrola skuteczności sterylizacji w autoklawie za pomocą testu
biologicznego Sporal A
- Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem
Sporalu A.
- Włóż torebkę do probówki i umieść ją w autoklawie. Zamknij pokrywę i
włącz urządzenie.
30
- Po zakończonym cyklu sterylizacji otwórz autoklaw i wyjmij z niego
Sporal A.
- Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą jałowo przenieś
krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą.
- Po inkubacji (55°C, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost
(zmętnienie, kożuch) czy bulion jest klarowny.
Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia
31
32
Rozdział 3
Posiew bakterii na podłoża; otrzymywanie czystej
hodowli
Część teoretyczna
Populację bakterii rosnącą na podłożu stałym lub płynnym nazywamy
hodowlą. Hodowlę składającą się z różnych gatunków bakterii nazywamy
hodowlą mieszaną. Czystą hodowlą nazywamy hodowlę bakterii jednego
rodzaju. Szczep to populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku
wyróżniająca się określonymi cechami. Szczepy wyprowadzone
z pojedynczej komórki nazywamy klonami.
W większości przypadków, przy badaniu bakteriologicznym wody,
żywności, wymazów pobranych od pacjentów, zanieczyszczonych leków,
spodziewamy się w próbce więcej niż jednego rodzaju drobnoustrojów.
Ocena drobnoustrojów występujących w badanym materiale, może
nastąpić dopiero po ich wyodrębnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do
tego celu wykorzystuje się metodę posiewu redukcyjnego. Taki typ
posiewu pozwala na ocenę morfologii wyrosłych kolonii. Zakłada się, choć
jest to pewne uproszczenie, że każda z nich powstaje z jednej komórki
bakterii lub jednej jednostki wzrostowej. A zatem, ile typów kolonii, tyle
rodzajów bakterii w hodowli. Ponieważ morfologia kolonii różnych
gatunków czy nawet rodzajów może być zbliżona, czasem pomocnym
w odróżnieniu kolonii jest posiew redukcyjny na płytkę z podłożem
diagnostycznym. Izolacja pojedynczej kolonii z takiego posiewu prowadzi
zwykle do uzyskania hodowli czystej.
Metody
Posiew bakterii na podłoża
Materiał zawierający bakterie posiewa się na podłoża stałe (skos agarowy,
płytka agarowa) lub płynne (bulion) ezą, pipetą lub wacikiem. Posiewając
ezą, należy ją wyjałowić wyżarzając w płomieniu palnika przed i po
33
wykonaniu posiewu. Używamy też wyjałowionych, odpowiednio
opakowanych pipet szklanych, końcówek do pipet automatycznych lub
wacików.
W trakcie posiewania bakterii na podłoża płynne należy także pamiętać
o opalaniu wylotu naczyń w płomieniu palnika po otwarciu i przed ich
zamknięciem. Ma to zapobiec zakażeniu pożywki drobnoustrojami
z zewnątrz i zapewnić bezpieczeństwo osobie pracującej.
Każda próbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii,
którą zakażamy świeże podłoże stanowi inokulum.
Posiew na podłoże płynne ezą polega na uwolnieniu z niej materiału
stanowiącego inokulum do pożywki przez pocieranie o ścianki naczynia
(probówki lub kolbki).
Przy posiewaniu do naczyń zawierających większe objętości pożywki
konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji między wielkością
inokulum a objętością podłoża. Zwykle stosuje się zasadę, że inokulum
stanowi 5% końcowej objętości pożywki. Posiewu możemy dokonywać
pipetą wprowadzając np. 5 mL hodowli stanowiącej inokulum do 95 mL
pożywki.
Posiewu na podłoża stałe na płytkach Petriego dokonuje w różny sposób
– zależnie od celu takiego posiewu. Ważnym, często stosowanym przy
izolacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych
kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby
w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej
bakterii. Sposób wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1.
W poszczególnych etapach raz naniesiony materiał zostaje rozprowadzany
na kolejne sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem
bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości,
przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci
pojedynczych kolonii.
Czasem wykonuje się posiew redukcyjny z materiału z wacika. Oznacza to,
że pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, którym np. pobrano
materiał kliniczny – wymaz, a następne już w klasyczny sposób ezą
z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu.
Można wykonać na płytce także posiew pasmowy lub punktowy, który
pozwala umieścić na płytce wiele próbek, których cechy chcemy
34
porównywać. Polega on na naniesieniu na płytkę inokulum z ezy w postaci
pasma różnej długości.
Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania
wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać
wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum stanowi zwykle próbka pobrana
z podłoża płynnego (nadmiar płynu z wacika należy w trakcie pobierania
odcisnąć o ścianki naczynia), którą rozprowadza się równomiernie na
powierzchni podłoża w płytce. Czasem zawiesina stanowiąca inokulum
w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposób standaryzowana.
Inokulum o określonej objętości, zwykle 0,1 mL można także rozprowadzić
głaszczką lub odpowiednio zagiętą ezą.
A
B
C
D
Rycina 1. Posiew redukcyjny
35
Przy posiewie na podłoże stałe w postaci skosu agarowego w probówce
należy wprowadzić ezę z inokulum do dna probówki i rozprowadzić na
powierzchni skosu. Prowadzi się w tym celu ezę zygzakowatym ruchem od
ścianki do ścianki próbówki, przesuwając ją ku wylotowi naczynia.
W zależności od rodzaju posiewanego materiału i wykorzystywanego
podłoża spotykamy się z następującymi możliwościami przesiewania
bakterii.
Na pożywkę płynną
(pipeta, eza)
Z pożywki płynnej
Na skos agarowy
(eza)
Na płytkę agarową
(eza, wacik, pipeta)
Na pożywkę płynną
(eza)
Z pożywki stałej
(płytka agarowa,
skos agarowy)
Na skos
(eza)
Na płytkę agarową
(eza)
36
Otrzymywanie czystych hodowli
Postępowanie zmierzające do otrzymania czystych hodowli z nieznanych
próbek sprowadza się do następujących kroków.
 Badany materiał posiewa się redukcyjnie na odpowiednio dobrane
podłoże.
 Po inkubacji (czasem wydłużonej nawet do 5 dni) w temperaturze
optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojów ocenia się
morfologię wyrosłych kolonii. Obecność różnic w ich wyglądzie
wskazuje, że mamy do czynienia z hodowlą mieszaną.
 Izoluje się wtedy pojedyncze kolonie i posiewa się je redukcyjnie na
oddzielne płytki.
 Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla może być uznana za
czystą, jeśli kolonie posiadają jednakową morfologię.
 Namnożona (na skosie, w pożywce płynnej lub w inny sposób)
pojedyncza kolonia z takiej płytki może być materiałem dla
wykonywania prób i posiewów identyfikacyjnych, czy służących do
określenia
właściwości
fizjologicznych,
biochemicznych
i antygenowych bakterii.
Szybką, choć czasem zawodną metodą sprawdzenia czystości hodowli
płynnej jest ocena morfologii komórek tworzących ją bakterii
w preparatach barwionych metodą Grama.
Zadania do wykonania
Zadanie 1.
Otrzymywanie czystej hodowli
- Materiał z otrzymanej hodowli płynnej posiej redukcyjnie na płytkę
agarową.
- Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny).
- Obejrzyj posiew zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie
w trzeciej i czwartej strefie posiewu.
- Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii.
37
-
Wykonaj z każdej z nich preparat barwiony metodą Grama
i uzupełnij opis kolonii o morfologię komórki.
Każdą z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na nową płytkę.
Opisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37°C, 24 godziny).
Kolonia:
Preparat:
Kolonia:
Preparat:
38
Kolonia:
Preparat:
Jeśli na każdej z posianych płytek wyrosną kolonie tylko jednego rodzaju,
o wyglądzie zgodnym z wcześniej wykonanym opisem, otrzymałeś czyste
hodowle tych bakterii – czyli hodowle jednego gatunku pochodzące
z pojedynczej kolonii, a zatem – czyste hodowle poszczególnych szczepów
bakteryjnych.
39
40
Rozdział 4
Wymagania wzrostowe bakterii
Część teoretyczna
Wymagania pokarmowe
Bakterie, podobnie jak inne organizmy żywe, potrzebują dostępu do
odpowiednich składników odżywczych, umożliwiających im prawidłowy
wzrost i rozmnażanie.
Wymagania pokarmowe bakterii są bardzo różnorodne, od bakterii
skrajnie wymagających, które mają najmniejsze zdolności biosyntetyczne
i wymagają do wzrostu związków wielkocząsteczkowych, poprzez
stanowiące największą grupę bakterie o wymaganiach pośrednich, do
których zalicza się większość bakterii chorobotwórczych, aż do skrajnie
niewymagających, które wykorzystują jako źródło węgla CO2. Wymagania
pokarmowe są w dużej mierze związane ze stopniem pasożytnictwa
poszczególnych drobnoustrojów.
Źródła węgla i azotu
Węgiel jest podstawowym pierwiastkiem budulcowym organizmów
żywych. W zależności od źródeł, z jakich bakterie mogą go pozyskiwać
podzielono je na:
 autotrofy czerpiące węgiel tylko z CO2 i przekształcające go do
związków organicznych;
 heterotrofy czerpiące węgiel ze związków organicznych.
Heterotrofy do prawidłowego wzrostu potrzebują w środowisku co
najmniej jednego związku organicznego. Najwięcej drobnoustrojów ma
zdolność do rozkładu glukozy, ale zdarzają się także bakterie mogące
korzystać z mleczanu, bursztynianu, metanu, a także bardziej złożonych
związków, jak lignina czy węglowodory aromatyczne. Heterotrofy zostały
podzielone na:
41
prototrofy – drobnoustroje o małych wymaganiach
pokarmowych, którym do wzrostu wystarczy jeden prosty związek
organiczny i sole mineralne, co świadczy o ich dużych,
gwarantujących szerokie rozprzestrzenienie, możliwościach
enzymatycznych;
- auksotrofy – drobnoustroje o dużych wymaganiach odżywczych,
rosnące jedynie w obecności co najmniej dwóch związków
organicznych stanowiących źródło węgla i azotu, których nie są
w stanie same syntetyzować, co w znacznym stopniu uzależnia je
od środowiska.
Zarówno prototrofizm, jak i auksotrofizm, mogą być wykorzystywane dla
celów diagnostycznych, na przykład w identyfikacji pałeczek z rodziny
Enterobacteriaceae, czy przy ustalaniu gatunku pałeczek z rodzaju
Haemophilus.
Bakterie auksotroficzne często wymagają do wzrostu specjalnych
czynników wzrostowych, którymi mogą być aminokwasy, puryny
i pirymidyny lub witaminy.
Azot, który jest ważnym pierwiastkiem wchodzącym w skład białek
i kwasów nukleinowych, prototrofy mogą pozyskiwać ze związków
nieorganicznych (np. soli amonowych, azotanów i azotynów), a auksotrofy
wykorzystują organiczne źródła azotu.
-
Źródła energii oraz donatory elektronów
Drobnoustroje mają zdolność wykorzystywania energii słonecznej lub
energii chemicznej uwalnianej ze związków wysokoenergetycznych.
Pozwala to wyróżnić wśród bakterii:
 fototrofy – które korzystają z energii słonecznej (bakterie
fotosyntetyzujące),
 chemotrofy – korzystające z energii pochodzącej z rozkładu
związków organicznych i nieorganicznych.
W zależności od donatorów elektronów dzielimy bakterie na:
 litotrofy - korzystające z donatorów nieorganicznych,
 organotrofy - korzystające z donatorów organicznych.
42
Zatem, zależnie od wykorzystywanych przez bakterie źródeł energii
i donatorów elektronów, możemy wyróżnić cztery typy pokarmowe:
fotolitotrofy, fotoorganotrofy, chemolitotrofy i chemoorganotrofy.
Bakterie stanowiące florę człowieka i te, które są dla niego
chorobotwórcze, są chemoorganotrofami pozyskującymi węgiel
ze związków organicznych.
Wymagania tlenowe bakterii
Bakterie różnią się pomiędzy sobą zapotrzebowaniem na tlen.
Bezwzględnie tlenowe rosną tylko w jego obecności, bezwzględnie
beztlenowe rosną przy jego braku, a względnie beztlenowe rosną
zarówno przy dostępie jak i braku tlenu. Różnice te wynikają ze sposobu
pozyskiwania energii przez bakterie w procesie oddychania. Oddychanie
tlenowe jest możliwe tylko u organizmów, u których końcowym
akceptorem przenoszonych przez łańcuch oddechowy elektronów jest tlen
cząsteczkowy. W przypadku oddychania beztlenowego końcowym
akceptorem elektronów w łańcuchu oddechowym są związki
nieorganiczne: azotany, siarczany. Możliwe jest jeszcze pozyskiwanie
energii w procesie fermentacji, gdzie akceptorem elektronów jest związek
organiczny.
Bakteriom bezwzględnie tlenowym tlen jest niezbędny do prawidłowego
wzrostu i rozmnażania. W przypadku braku tlenu giną, gdyż przenoszenie
elektronów łańcucha oddechowego zostaje zahamowane i nie jest
magazynowana energia. Bakterie te mają enzymy, które chronią je przed
toksycznym działaniem tlenu. Dysmutaza nadtlenkowa wiąże wolne
rodniki z wodorem, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru.Jest on
rozkładany przez dwa inne enzymy: katalazę i peroksydazę do wody
i tlenu. Do bezwzględnie tlenowych, chorobotwórczych bakterii zaliczane
są m.in. bakterie z rodzajów Mycobacterium, Bacillus, Nocardia.
Bakterie względnie beztlenowe mogą rosnąć zarówno w obecności tlenu,
jak i przy jego braku w środowisku o obniżonym potencjale oksydacyjnoredukcyjnym. Do tej grupy należy wiele bakterii, w tym też chorobotwórczych. Jeżeli tlen jest obecny w środowisku, mogą korzystać z energii
pozyskiwanej w wyniku oddychania tlenowego. Przy braku tlenu mogą
43
przestawić metabolizm na fermentacyjny, jak np.: Escherichia coli lub na
oddychanie beztlenowe, np.: Pseudomonas denitrificans.
Bakterie bezwzględnie beztlenowe mogą się rozwijać tylko przy braku
dostępu do tlenu. Jest on dla nich toksyczny, ponieważ nie mają żadnych
mechanizmów redukujących jego szkodliwe działanie. Niektóre z nich
mogą rosnąć w obecności tlenu, jednak pod warunkiem obniżenia
potencjału oksydacyjo-redukcyjnego poprzez dodanie do hodowli
glutationu, cystyny bądź tioglikolanu sodu. Do tej grupy należą liczne
bakterie chorobotwórcze dla człowieka m.in. z rodzajów Clostridium,
Bacteroides czy Fusobacterium.
Wymagania temperaturowe bakterii
Temperatura ma istotny wpływ na rozwój bakterii. Każdy ich rodzaj ma
optymalną dla siebie temperaturę, w której wszelkie procesy
metaboliczne prowadzone są najbardziej wydajnie. Temperatury
kardynalne to temperatura minimalna, która wyznacza dolną granicę,
poniżej której wzrost danego rodzaju zanika i maksymalna, która jest
temperaturą, powyżej której bakterie już się nie dzielą. Preferencje
dotyczące temperatury dzielą bakterie na grupy.
Termofile (bakterie ciepłolubne) najlepiej rosną w temperaturze 40°C do
70°C. Bakterie takie jak Geobacillus stearothermophilus, czy
Thermoactinomyces vulgaris żyją w kompoście, glebie, nawozach
organicznych. Znane są także bakterie rosnące w wyższych
temperaturach, np. Thermus aquaticus w 65°C, czy Sulfolobus
acidocaldarius w 80°C. Znane są i takie, które mnożą się w temperaturze
90-110°C. Określane są one jako termofile ekstremalne. Zainteresowanie
nimi wynika z możliwości, jakie stwarzają dla biologii molekularnej
ciepłoodporne enzymy tych bakterii.
Mezofile to największa grupa drobnoustrojów, rosnąca w zakresie
temperatur 25-45°C. Wśród nich są bakterie z optimum rozwoju
w temperaturze 37°C, blisko związane z człowiekiem jako patogeny
i komensale (np. rodzaje Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella).
Niektóre z mezofili mogą rosnąć w szerokim zakresie temperatur, jak na
44
O
przykład dobrze mnożąca się w temperaturze lodówki (+4 C) Listeria spp.
– o spektrum od 1do 45°C .
Psychrofile to bakterie zimnolubne, których metabolizm najefektywniej
funkcjonuje w niskich temperaturach. Są wśród nich psychrofile względne
o optymalnej temperaturze 20°C, ale mogące też rosnąć w 0°C,
występujące w głębi oceanów oraz psychrofile bezwzględne o istotnym
znaczeniu dla człowieka. Rosną one dobrze w 0°C, mnożąc się w żywności
przechowywanej w chłodniach. Powodują jej psucie i mogą być przyczyną
zachorowań. Należą tu m.in. niektóre gatunki Flavobacterium, Aerobacter,
a także Bacillus czy Lactobacillus.
Metody
Badanie zdolności wykorzystywania cytrynianu jako jedynego
źródła węgla
Określenie przynależności bakterii do prototrofów oraz zbadanie zdolności
do metabolizowania określonego związku organicznego jako jedynego
źródła węgla może mieć znaczenie diagnostyczne. Cechę tę można zbadać
na podłożu Simmonsa. Jest to podłoże stałe, które może zawierać
w swoim składzie cytrynian sodowy lub np. malonian jako jedyne źródło
węgła i siarczan amonowy jako źródło azotu.
Do pożywki dodany jest wskaźnik pH – błękit bromotymolowy, który
w środowisku obojętnym, jakie posiada podłoże wyjściowe, ma
zabarwienie zielone. Na podłożu wyrastają jedynie bakterie, które mają
zdolność wykorzystywania organicznego substratu, a alkaliczne produkty
ich metabolizmu – amoniak i aminy zmieniają jego barwę na niebieską.
Badanie zdolności korzystania z soli amonowych lub
aminokwasów jako źródła azotu
Bakterie posiane na stałe podłoże nie zawierające źródła azotu, na które
punktowo (na bibułowych krążkach czy do metalowych cylinderków)
naniesiono roztwory NH4(SO4)2 i aminokwasów wyrosną tylko w pobliżu
tego źródła azotu, który mogą wykorzystywać.
45
Metody hodowli bakterii tlenowych
Tlen jest ważnym czynnikiem warunkującym wzrost bakterii tlenowych
i względnie beztlenowych. Pobierają one tlen rozpuszczony w pożywce.
Dostępność tlenu dla bakterii w hodowlach płynnych możemy zwiększyć
przez ich napowietrzanie. Najprościej osiągnąć to przez energiczne
wstrząsanie lub mieszanie hodowli na tzw. wytrząsarkach. W hodowlach
płynnych prowadzonych na skalę przemysłową stężenie tlenu zwiększa się
przepuszczając powietrze lub tlen przez pożywkę.
Metody hodowli bakterii beztlenowych
Obecność tlenu może uniemożliwić wyhodowanie bakterii bezwzględnie
beztlenowych. Jest wiele sposobów usunięcia tlenu z pożywki.
W przypadku pożywki płynnej najprostszym sposobem jest jej
zagotowanie, szybkie schłodzenie i pokrycie powierzchni podłoża płynną
parafiną. Metoda ta jednak może być zawodna. Najczęściej bakterie
beztlenowe hoduje się w specjalnych, szczelnych słojach, wewnątrz
których atmosferę beztlenową uzyskuje się na drodze reakcji chemicznej
zachodzącej w specjalnych saszetkach (nazwa zależy od jej wytwórcy).
Saszetka zawiera zestaw substancji, z których po jej otwarciu wydzielany
jest wodór. Ten reaguje z tlenem obecnym w słoju tworząc wodę. Reakcja
ta zachodzi szybko i gwarantuje uzyskanie warunków beztlenowych.
Efektywność tego procesu sprawdza się przy pomocy wskaźnika, błękitu
metylenowego, który w warunkach beztlenowych jest bezbarwny.
Odczynniki zawarte w niektórych rodzajach saszetek wymagają do swojej
aktywności zetknięcia z wodą. Aby zwiększyć szybkość łączenia się wodoru
z tlenem, stosuje się wtedy katalizator palladowy umieszczany
w specjalnym pojemniku przytwierdzonym do wieka słoja.
W powietrzu atmosferycznym tlen stanowi 20%. Do namnażania bakterii
mikroaerofilnych stosuje się saszetki, które pozwalają uzyskać środowisko
o niewielkim stężeniu tlenu rzędu 7-10%. Niektóre bakterie wymagają do
swojego optymalnego wzrostu zwiększonego stężenia CO2. Znajdują
wtedy zastosowanie saszetki, które pozwalają na uzyskanie środowiska
o podwyższonym stężeniu CO2 (średnio od 3 do 6%).
46
Wiele bakterii beztlenowych można wyhodować na podłożach
o obniżonym potencjale oksydo-redukcyjnym, co jest osiągane poprzez
dodanie odpowiednich związków chemicznych. W powszechnie
używanych: podłożu Brewera jest to tioglikolan sodu, a w podłożu
Schaedlera – chlorowodorek cysteiny.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Typy pokarmowe bakterii
Uzupełnij poniższą tabelę:
Typ
pokarmowy
Donatory
elektronów
Źródło energii
Źródło węgla
związki
nieorganiczne
CO2 i inne
związki
nieorganiczne
związki
nieorganiczne
światło
związki
nieorganiczne
związki
nieorganiczne
chemoorganotrofy
fotoorganotrofy
Związki
Organiczne
47
Zadanie 2
Wykorzystywanie cytrynianu jako jedynego źródła węgla
- Otrzymujesz hodowle stałe Escherichia coli i Klebsiella mobilis w płytce
Petriego oraz dwie próbówki zawierające podłoże Simmonsa w formie
skosu agarowego.
- Probówki z podłożem Simmonsa podpisz nazwami bakterii, które
będziesz posiewał.
- Każdy z badanych drobnoustrojów posiej na powierzchnię jednego
skosu.
- Inkubuj posiewy w cieplarce (37°C, 24 godziny).
- Na podstawie zmiany zabarwienia podłoża oceń zdolność
wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla przez badane
bakterie.
- Obserwacje zapisz w tabeli.
Escherichia coli
Klebsiella mobilis
Zabarwienie
podłoża
po hodowli
Zdolność wykorzystywania
cytrynianu jako jedynego
źródła węgla
Zadanie 3
Wpływ warunków gazowych na rozwój bakterii w hodowli płynnej
- Otrzymujesz hodowle bulionowe: Clostridium botulinum, Paeudomonas
aeruginosa i Escherichia coli. Każdy z badanych rodzajów bakterii był
hodowany w warunkach tlenowych i w beztlenowych. Warunki
beztlenowe uzyskano poprzez pokrycie hodowli płynną parafiną.
- Posiewy inkubowano w cieplarce (37°C, 48 godzin).
- Wyniki hodowli (wzrost) zaznacz w tabeli.
48
Clostridium
botulinum
Pseudomonas
aeruginosa
Escherichia
coli
Bulion
Bulion
parafiną
Określenie
wymagań
tlenowych
bakterii
pod
49
50
Rozdział 5
Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do
ich identyfikacji
Część teoretyczna
Metabolizm bakterii
Podobnie, jak w innych żywych komórkach, metabolizm bakterii obejmuje
anabolizm (reakcje syntezy) i katabolizm (reakcje rozkładu).
Oba te procesy są ze sobą ściśle powiązane i zachodzą w komórce
jednocześnie. Reakcje rozkładu związków wysokocząsteczkowych
uwalniają energię, która następnie jest magazynowana w ATP.
W pierwszym etapie duże cząsteczki węglowodanów, białek, tłuszczy,
kwasów nukleinowych ulegają degradacji do mniejszych cząstek: heksoz
i pentoz, aminokwasów, glicerolu i kwasów tłuszczowych, nukleotydów.
W dalszych etapach procesów katabolicznych w wyniku licznych przemian
powstają proste cząsteczki, które włączane są w cykl Krebsa, będący
końcowym etapem rozkładu. Ostatecznymi produktami są woda,
dwutlenek węgla i energia. Umożliwia to przebieg procesów
anabolicznych wymagających jej nakładu.
Energia uzyskiwana jest przez bakterie w procesach katabolicznych
polegających na utlenianiu biologicznym substratów oddechowych
i przenoszeniu elektronów na odpowiednie akceptory. Najbardziej
wydajnym energetycznie procesem jest angażujące cykl Krebsa
oddychanie tlenowe, w którym protony i elektrony są przenoszone
poprzez łańcuch oddechowy na tlen atmosferyczny. Zdolność bakterii do
oddychania tlenowego ma istotne znaczenie z punktu widzenia ich
identyfikacji, gdyż liczne próby biochemiczne pozwalają na wykrywanie
metabolitów pośrednich cyklu Krebsa oraz obecność enzymów łańcucha
oddechowego.
51
Oddychanie beztlenowe ma podobny przebieg z tym, że ostatecznym
akceptorem protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym są związki
nieorganiczne, np.: azotany, azotyny, siarczany. Wykrywanie produktów
ich rozkładu, a także enzymów biorących udział w tych procesach także
wykorzystywane jest w identyfikacji bakterii. Przykładem jest wykrywanie
reduktazy azotanowej przekształcającej azotany do azotynów.
Oddychanie azotowe może angażować jeden z dwóch procesów:
 denitryfikację polegającą na redukcji azotanu do podtlenku azotu
(N2O) oraz uwalnianego do środowiska azotu atmosferycznego.
Bakterie posiadające takie zdolności to m.in.: Pseudomonas
denitrificans, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus licheniformis.
 amonifikację polegająca na redukcji azotanów do azotynów,
+
a następnie do amoniaku w formie jonu amonowego NH4 .
Przeprowadzana jest ona m.in. przez: Escherichia coli,
Enterobacter aerogenes.
Oddychanie siarkowe polega na redukcji siarczanów bądź siarki do
siarczków. Zdolność do redukcji siarczanów mają bakterie z rodzaju
Desulfovibrio, natomiast siarkę redukują bakterie z rodzaju
Desulfuromonas.
Trzeci z energiodajnych procesów – fermentacja pozwala na
metabolizowanie substratów bez udziału czynnika utleniającego,
w którym utlenienie jednego związku jest równoważone redukcją innego.
Ostatecznymi akceptorami protonów i elektronów są związki organiczne
powstałe jako produkty pośrednie, np.: etanol, mleczan, maślan,
bursztynian, izopropanol. Od tych produktów tworzone są nazwy
fermentacji. W identyfikacji bakterii znaczenie diagnostyczne mają:
fermentacja mlekowa, propionowa, masłowa i mrówkowa.
 Fermentacja mlekowa jest prowadzona przez bakterie mlekowe
(Lactobacillus spp.), ale także inne bakterie, np. gronkowce. Bakterie
mlekowe stanowią florę fizjologiczną przewodu pokarmowego
niemowląt, są wykorzystywane jako probiotyki. Stanowią też
normalną florę pochwy u kobiet.
 Fermentacja propionowa prowadzona jest przez beztlenowe pałeczki
z rodzaju Propionibacterium bytujące w przewodzie pokarmowym
52
przeżuwaczy, a także na skórze człowieka. Jako produkt podstawowy
tej fermentacji powstaje kwas propionowy.
 Fermentacja masłowa prowadzona jest przez beztlenowe bakterie
przetrwalnikujące z rodzaju Clostridium, w tym laseczki zgorzeli
gazowej. Jako produkty końcowe tego procesu powstają kwasy
masłowy, octowy, alkohole oraz CO2 i H2.
 Fermentacja mrówkowa jest charakterystyczna dla bakterii z rodziny
Enterobacteriaceae. Produktami końcowymi jest wiele związków,
a wśród nich kwasy organiczne, etanol, glicerol, acetoina, 2,3butandiol, a także CO2 i H2. Możliwe są dwa szlaki przemian, a ich
cechy wykrywa się dla celów identyfikacyjnych.
Pierwszy z nich charakteryzuje się powstawaniem silnych kwasów
organicznych, co obniża pH pożywki poniżej 4,5 (próba Metyl-Red).
W innym szlaku kwasy organiczne mogą powstawać w mniejszej ilości,
a głównymi produktami są acetoina i 2,3-butandiol (próba VogesProskauera).
Jako substrat energetyczny bakterie mogą wykorzystywać cukry proste,
oligocukry i cukry złożone. Te ostatnie muszą ulec strawieniu
zewnątrzkomórkowemu przy udziale odpowiednich, produkowanych
przez bakterie enzymów. Dotyczy to m.in. skrobi, glikogenu czy celulozy.
Do komórki transportowane są cukry proste, które wykorzystywane są
jako główne substraty oddechowe. Jeżeli w podłożu znajduje się wiele
substratów, zwykle pierwszym rozkładanym są cukry proste. W przypadku
większości bakterii jest to glukoza.
Także białka i lipidy są zbyt dużymi cząsteczkami, aby w stanie
niezmienionym mogły być przyswajane przez bakterie. Muszą one ulec
degradacji w środowisku przy udziale odpowiednich enzymów
proteolitycznych czy lipolitycznych. W rozkładzie białek biorą udział
endopeptydazy rozkładające je do oligopeptydów i egzopeptydazy
odłączające aminokwasy, które podlegają dalszym przemianom. Lipidy są
zwykle degradowane przez esterazy, o szerokiej swoistości substratowej.
Niektóre bakterie wytwarzają lipazy o wąskiej specyficzności – na
przykład lecytynazę.
53
Cechy wykorzystywane do identyfikacji bakterii
W identyfikacji bakterii przeprowadzanej metodami fenotypowymi, próby
oparte na wykrywaniu cech metabolicznych bakterii odgrywają bardzo
ważną rolę. Bada się źródła węgla i azotu wykorzystywane przez bakterie,
poszukuje enzymów biorących udział w procesach katabolicznych, oznacza
charakterystyczne końcowe produkty metabolizmu. Zwykle diagnostykę
prowadzi się w oparciu o wiele, zwykle kilka lub kilkanaście prób
dobranych specjalnie pod kątem identyfikacji określonych bakterii.
Tworzone są w ten sposób schematy diagnostyczne. Istotne miejsce mogą
w nich mieć także takie cechy, jak morfologia mikroskopowa bakterii
i morfologia kolonii. Dla wielu rodzajów bakterii określa się także
właściwości biologiczne. Wśród nich ważną rolę odgrywa oznaczanie
często występujących u bakterii hemolizyn (typ hemolizy na agarze
z krwią), wytwarzanie enzymów np. katalazy, oksydazy, czy też
charakterystyczne dla mniejszej liczby lub wręcz dla pojedynczych
gatunków próby takie, jak wytwarzanie koagulazy, toksyn i inne. Istotną
pomoc w identyfikacji niektórych bakterii (pałeczki jelitowe, paciorkowce)
stanowią cechy antygenowe wykrywane badaniami serologicznymi. Dla
bakterii długo rosnących lub niehodowalnych standardowymi metodami
mikrobiologicznymi są metody polegające na wykrywaniu ich materiału
genetycznego w próbce.
Metody
Diagnostyka bakteriologiczna
Standardowe postępowanie zależy od rodzaju materiału i spodziewanych
drobnoustrojów. Zwykle rozpoczyna je charakterystyka mikroskopowa
badanej próbki. Barwienie metodą Grama pomaga ocenić materiał
i wybrać rodzaj podłoża do pierwszego posiewu.
Można posłużyć się metodami fenotypowymi, na które składają się:
 charakterystyka wzrostu na podłożach, na których dokonano izolacji
(pierwszego posiewu materiału);
54

otrzymanie czystej hodowli i charakterystyka morfologii kolonii oraz
opis mikroskopowego obrazu komórek bakterii;
 próby biochemiczne badające właściwości sacharolityczne,
proteolityczne, lipolityczne, utleniająco-redukujące;
 badanie
właściwości
serologicznych
(poszukiwanie
charakterystycznych antygenów);
lub metodami genotypowymi (badającymi genom) w których stosuje się
techniki biologii molekularnej i poszukuje charakterystycznych dla danych
bakterii markerów (sekwencji nukleotydów).
Próby biochemiczne wykonywane w celu identyfikacji bakterii
W praktyce określa się następujące właściwości biochemiczne:
 związane z metabolizmem azotowym,
 związane z metabolizmem węglowodanów,
 związane z metabolizmem lipidów,
 związane z procesami oddechowymi (enzymy red-ox).
Podłoża, na których określa się właściwości biochemiczne należą do grupy
pożywek diagnostycznych. Niektóre próby biochemiczne wykrywające
obecność tych samych enzymów lub produktów często możemy wykonać
w różny sposób. Poniżej przedstawiono kilkanaście podstawowych prób
w najczęściej stosowanych wariantach.
Metabolizm azotowy
Właściwości proteolityczne - rozkład żelatyny (metoda probówkowa)
Pożywka z żelatyną w temperaturze pokojowej (ok.22°C) ma konsystencję
stałą, ale w cieplarce (37°C) jest płynna. Posiana bakteriami, które mają
enzym – żelatynazę, po długim zazwyczaj okresie inkubacji, ulega stałemu
upłynnieniu i nie daje się zestalić przez obniżenie temperatury.
Właściwości proteolityczne - rozkład kazeiny mleka
Zdolność do wytwarzania kazeinazy sprawdza się posiewając bakterie na
podłoże agarowe z dodatkiem 10% odtłuszczonego mleka. Po
55
48 godzinach inkubacji w 37°C można zaobserwować przejaśnienie wokół
kolonii produkujących ten enzym.
Wytwarzanie H2S – na podłożu Kliglera
Podłoże Kliglera wykorzystywane jest głównie w diagnostyce bakterii
z rodziny Enterobacteriaceae. Służy ono do oceny wytwarzania przez
bakterie H2S, ale także zdolności rozkładu glukozy i laktozy. Ma ono postać
półskosu o barwie łososiowej. Bakterie należy posiać do słupka
i na skos. Wynik odczytuje się po 24 godzinnej inkubacji w 37°C.
Wytwarzany siarkowodór reaguje z jonami żelaza, a powstający siarczek
żelaza powoduje zaczernienie podłoża.
Wytwarzanie indolu z tryptofanu
Badane bakterie posiewa się na wodę peptonową zawierającą DLtryptofan. Po 24 godzinnej inkubacji w 37°C na podłoże należy nawarstwić
zmodyfikowany odczynnik Ehrlicha. Zawiera on p-di-metyloaminobenzaldehyd, alkohol amylowy i stężony HCl. Jeżeli bakterie rozłożyły
tryptofan, pojawia się ciemnoróżowa obrączka w górnej warstwie
pożywki.
Rozkład mocznika
Zdolność bakterii do wytwarzania ureazy – enzymu rozkładającego
mocznik do amoniaku i dwutlenku węgla bada się na podłożu
Christensena z mocznikiem. W podłożu zawarty jest wskaźnik pH czerwień krezolowa. Powstający amoniak alkalizuje podłoże, co powoduje
zmianę jego zabarwienia z żółtego na różowe.
Deaminacja fenyloalaniny
Zdolność bakterii do rozkładu fenyloalaniny na drodze deaminacji tego
aminokwasu bada się posiewając je na podłoże agarowe z dodatkiem
D-α-fenyloalaniny. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C nakrapla się na
płytkę 10% roztwór chlorku żelazowego. Zielone zabarwienie świadczy
o deaminacji fenyloalaniny.
56
Metabolizm węglowodanów
Wykrywanie zdolności rozkładu cukrów przez bakterie o małych
wymaganiach
Bakterie posiewa się do probówek zawierających wodę peptonową
z dodatkiem 1% cukru oraz wskaźnik pH: purpurę bromokrezolową
(fioletowa w pH obojętnym; żółta w kwaśnym) lub błękit bromotymolowy
(zielony w pH obojętnym; żółty w kwaśnym). Dodatkowo do probówek
wkładane są dnem do góry tzw. rurki Durhama, w których niekiedy
w wyniku rozkładu cukru może zbierać się gaz. Po 24 godzinnej inkubacji
w 37°C rozkład cukru prowadzi do zakwaszenia środowiska i zmiany
zabarwienia podłoża. Zestaw prób dla kilku cukrów nazywa się zwykłym
szeregiem cukrowym.
Wykrywanie drogi rozkładu cukru: fermentacja czy utlenianie, na
podłożu Hugh-Leifsona.
Bakterie posiewa się do dwóch probówek ze świeżo przygotowanym,
wygotowanym bezpośrednio przed użyciem podłożem. Powierzchnia,
jednego z nich pokrywana jest płynną parafiną. Podłoże jako wskaźnik pH
zawiera błękit bromotymolowy. W przypadku bakterii nie rozkładających
cukru barwa podłoża się nie zmienia. Natomiast, jeśli bakterie rozkładają
cukier tylko w warunkach tlenowych, zmienia się barwa pożywki
w probówce bez parafiny. Zmiana barwy w obu probówkach świadczy
o wykorzystywaniu cukru na drodze fermentacji.
Wykorzystanie podłoża stałego dla oceny rozkładu laktozy podłoże MacConkeya
Podłoże MacConkeya służy do izolacji pałeczek gramujemnych. Jest to
podłoże diagnostyczne, ale zawiera też takie składniki, jak sole żółciowe
i fiolet krystaliczny, które decydują o jego słabej wybiórczości i hamują
wzrost bakterii gramdodatnich. Zawarta w podłożu laktoza, jeśli jest
rozkładana (bakterie laktozododatnie), zakwasza środowisko, co
manifestuje się różowym zabarwieniem kolonii zależnym od wskaźnika czerwieni obojętnej. Bakterie laktozoujemne rosną w postaci kolonii
w kolorze nieposianej pożywki.
57
Określanie typu fermentacji glukozy - wykrywanie acetoiny – próba
Voges-Proskauera
Bakterie posiewa się na podłoże Clarka. Zawarta w nim glukoza rozkładana
jest do kwasu pirogronowego, a dalej do różnych produktów końcowych
m.in. do acetoiny. Acetoinę wykrywamy po 48-72 godzinach inkubacji
dodając 0,5 mL roztworu KOH, a po wymieszaniu 0,2 mL alkoholowego
roztworu α-naftolu. Hodowlę po ponownym wymieszaniu odstawia się na
15 minut. Pojawiające się karminowe zabarwienie powstaje w wyniku
utlenienia acetoiny w obecności tlenu do diacetylu, reagującego następnie
w obecności α-naftolu z obecną w peptonie resztą guaninową argininy.
Metabolizm lipidowy
Wytwarzanie lipaz (esteraz) na podłożu z Tween 80
W celu sprawdzenia zdolności bakterii do wytwarzania lipaz posiewa się je
na płytkę z podłożem agarowym z dodatkiem Tween 80
(polietylenosorbitol jednooleinowy) i chlorku wapniowego. Wynik ocenia
się po 48 godzinach inkubacji. Wokół kolonii bakterii wytwarzających
lipazy pojawia się strefa zmętnienia. Jest ona wynikiem reakcji
uwolnionych przez lipazy kwasów tłuszczowych z obecnymi w pożywce
jonami wapnia, powodującej powstanie nierozpuszczalnych mydeł
wapniowych.
Wytwarzanie enzymów utleniająco-redukujących
Wytwarzanie katalazy
Katalaza rozkłada H2O2 do H2O i O2. Jej wytwarzanie sprawdza się poprzez
zawieszenie badanych bakterii w kropli 3% wody utlenionej umieszczonej
na szkiełku podstawowym. Można także dodać wodę utlenioną
bezpośrednio do hodowli. Pojawiające się pęcherzyki tlenu świadczą
o obecności katalazy.
Wytwarzanie reduktazy azotanowej
Zdolność bakterii do redukcji azotanów do azotynów można sprawdzić
metodą sulfanilową, posiewając je na pożywkę zawierającą azotan potasu.
58
Po inkubacji (24 godziny w 37°C) do hodowli dodaje się kilka kropli
odczynnika Griessa. W skład tego odczynnika wchodzą w proporcji 1:1
roztwory kwasu sulfanilowego i α-naftyloaminy w kwasie octowym.
W środowisku kwaśnym kwas sulfanilowy ulega diazowaniu jonami
azotynowymi, po czym łącząc się z α-naftyloaminą daje barwę.
Badanie zdolności hemolitycznych bakterii
Hemolizyny bakteryjne są cytolizynami, które niszczą krwinki czerwone
ludzi i zwierząt. Zdolność wytwarzania ich przez bakterie można wykazać
na podłożu agarowym zawierającym dodatek 5% odwłóknionej krwi
baraniej lub ludzkiej. Podłoże takie jest jednocześnie podłożem
diagnostycznym, jak i wzbogaconym. Bakterie posiewa się redukcyjnie,
inkubuje w optymalnych dla nich warunkach. W pobliżu kolonii
wytwarzających hemolizyny pojawiają się charakterystyczne zmiany.
Wyróżnia się dwa typy hemolizy:
 α hemoliza – widoczna jest na płytce krwawej w postaci zielonej
strefy wokół kolonii, co jest wynikiem częściowego rozpadu
krwinek (przekształcenie hemoglobiny do methemoglobiny);
 β hemoliza – widoczna na płytce krwawej jako pełne
przejaśnienie wokół kolonii, powstałe wskutek całkowitej lizy
krwinek i wyługowania barwnika.
Wielkość stref hemolizy może być różna dla różnych gatunków czy
szczepów.
Zestawy prób biochemicznych do identyfikacji bakterii
W laboratoriach zajmujących się rutynową diagnostyką mikrobiologiczną
do identyfikacji drobnoustrojów stosowane są gotowe, standaryzowane
zestawy testów biochemicznych. Najczęściej mają one postać płytek
pleksiglasowych z dołkami lub galeryjek z pojemniczkami wypełnionymi
substratami dostosowanymi do identyfikacji danej grupy bakterii. Zmiany
barwy zawartości studzienek po dodaniu badanego szczepu, inkubacji
i jeśli trzeba, odpowiednich odczynników, umożliwiają odczytanie
59
wyników i przy użyciu książki kodowej lub
oprogramowania zidentyfikowanie zwykle do gatunku.
odpowiedniego
Techniki biologii molekularnej w diagnostyce bakteriologicznej
Metody genotypowe umożliwiają wykrycie nawet minimalnej ilości kwasu
nukleinowego – genomu poszukiwanych w materiale badanym bakterii.
Znalazły one swoje miejsce w diagnostyce bakterii odpowiedzialnych za
szereg chorób, uzupełniając fenotypowe metody identyfikacyjne,
skracając czas badania, a w przypadku drobnoustrojów wolno rosnących
na podłożach sztucznych czy też w ogóle nie dających się na nich
hodować, stały się niezastąpione.
W diagnostyce mikrobiologicznej wykorzystywane są metody genetyczne,
w których poszukuje się specyficznych dla danego drobnoustroju
sekwencji stanowiących fragment jego genomu. Metody ich wykrywania
oparte są na ich bezpośredniej hybrydyzacji z zastosowaniem swoistych
sond molekularnych lub na amplifikacji (powielaniu) określonych
(poszukiwanych) fragmentów materiału genetycznego.
Najczęściej wykorzystywaną metodą identyfikacji drobnoustrojów jest
metoda amplifikacji poszukiwanych fragmentów genomu bakterii.
Wykorzystywane są tu komplementarne do końców powielanego
fragmentu startery (krótkie sekwencje) genów, często chorobotwórczości,
które wcześniej uznano za wystarczająco odróżniające poszczególne
rodzaje, gatunki lub szczepy. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR Polymerase Chain Reaction) oraz jej odmiany (Multiplex-PCR, real-timePCR, RT-PCR, nested-PCR) oprócz badanego materiału genetycznego
(matryca) oraz starterów wymaga udziału termostabilnej polimerazy Taq,
buforu
zawierającego
jony
magnezu
oraz
trifosforanów
deoksynukleozydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Poszczególne etapy amplifikacji DNA wymagają odpowiedniej
temperatury, dlatego musi być przeprowadzona przy zastosowaniu
termocyklera. Reakcja zachodzi w powtarzających się cyklach (około 30)
składających się z etapów:
- denaturacja kwasów nukleinowych (temperatura 90-95°C),
60
- przyłączanie starterów (temperatura 40-65°C),
- wydłużanie łańcucha DNA (elongacja) katalizowane przez polimerazę
DNA (temperatura 72°C).
Materiał genetyczny powielany jest wykładniczo, a cały proces pozwala na
106-109 -krotne namnożenie poszukiwanego fragmentu genomu, jeśli tylko
matryca (materiał badany) zawiera odpowiednie sekwencje.
Ograniczeniem metod genetycznych jest fakt, że wykrywane jest DNA
także martwych drobnoustrojów (niezagrażających już pacjentowi) oraz,
paradoksalnie, ich wielka czułość. Mogą bowiem wskazać na obecność
drobnoustroju nawet wtedy, gdy jego dawka infekcyjna nie jest
przekroczona i nie on, zapewne, jest przyczyna choroby. Problemy te
rozwiązuje amplifikacja w systemie real-time PCR.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Badanie niektórych cech biochemiczne bakterii wykorzystywanych do ich
identyfikacji
- Otrzymujesz hodowlę bakterii na podłożu MacConkeya.
- Obejrzyj płytkę i odpowiedz na pytania w tabeli.
Czy hodowla jest czysta czy mieszana?
Wygląd kolonii badanych bakterii na podłożu MacConkeya:
61
- Posiej badane bakterie na następujące podłoża:
1. Podłoże do wykrywania redukcji azotanów
2. Podłoże do wykrywania dezaminacji fenyloalaniny
3. Podłoże z mocznikiem
4. Wodę peptonową z tryptofanem
5. Bulion odżywczy (do wykrycia obecności katalazy)
- Posiewy inkubuj w cieplarce (37°C , 48 godzin).
- Wykonaj preparat barwiony metoda Grama z bulionu odżywczego.
Odczytaj wyniki posiewów dodając odpowiednich odczynników. Wyniki
zapisz w tabeli.
Badanie właściwości bakterii z hodowli na podłożu MacConkeya:
Preparat:
Kształt:
Barwienie metodą Grama:
62
Zdolność redukcji azotanów
Dodane odczynniki:
Wynik próby:
Jaka reakcja chemiczna zaszła:
Jaki był jej efekt wizualny:
Deaminacja fenyloalaniny
Dodane odczynniki:
Wynik próby:
Jaka reakcja chemiczna zaszła:
Jaki był jej efekt wizualny:
Wykrywanie ureazy
Jaka reakcja zaszła:
Wynik próby:
Jaki był jej efekt wizualny:
63
Wykrywanie rozkładu tryptofanu
Dodane odczynniki:
Wynik próby:
Jaka reakcja chemiczna zaszła:
Jaki był jej efekt wizualny:
Wykrywanie katalazy
Dodane odczynniki:
Wynik próby:
Jaka reakcja chemiczna zaszła:
Jaki był jej efekt wizualny:
Zadanie 2
Próby biochemiczne i biologiczne stosowane do identyfikacji bakterii
Opisz i narysuj wszystkie demonstracje prób identyfikacyjnych, jakie
zobaczyłeś na ćwiczeniach.
64
65
66
67
68
Rozdział 6
Liczenie bakterii
Część teoretyczna
Oznaczenie liczby bakterii ma zastosowanie w wielu dziedzinach
mikrobiologii. Jest ono przydatne między innymi w ocenie czystości
mikrobiologicznej leków, kosmetyków i żywności, w badaniu
bakteriologicznym wody, ścieków, powierzchni produkcyjnych i powietrza,
przy produkcji szczepionek, w kontroli skuteczności działania środków
myjących i dezynfekujących, a w diagnostyce laboratoryjnej – w ocenie
liczby bakterii w moczu. Oznaczać można całkowitą liczbę bakterii, to
znaczy łącznie komórki żywe i martwe lub tylko liczbę żywych komórek.
Obliczanie całkowitej liczby komórek można wykonać mikroskopowo
przez bezpośrednią obserwację i liczenie komórek bakteryjnych:

w preparacie barwionym,

w hemacytometrach, np. kamerze Thoma,

na sączku membranowym, przez który uprzednio przesączono
badaną próbkę o określonej objętości.
Bakterie obecne na sączku barwi się najczęściej błękitem metylenowym
lub roztworem erytrozyny. Metoda stosowana jest na przykład przy
badaniu wody i ścieków.
Można też posłużyć się metodami turbidymetrycznymi - porównując
zmętnienie badanych zawiesin z odpowiednimi wzorcami o znanej liczbie
komórek - wzrokowo lub za pomocą fotometru. Przy stosowaniu tych
metod potrzebne są krzywe wzorcowe, odnoszące liczbę komórek
(policzonych innymi metodami) do gęstości optycznej zawiesiny.
Całkowitą liczbę bakterii można też określić metodami chemicznymi –
przez oznaczenie całkowitego azotu, fosforu, białek lub kwasów
nukleinowych. Metoda ma zastosowanie głównie w pracach badawczych.
69
Liczbę żywych, to znaczy zdolnych do podziału, komórek bakteryjnych
oznacza się wymienionymi poniżej metodami hodowlanymi.
 Metoda posiewu na podłoże stałe (metoda płytkowa) – polega na
liczeniu kolonii po swobodnym (pod wpływem sił grawitacyjnych - metoda
Kocha) lub wymuszonym (metoda aspiracyjna, uderzeniowo-zderzeniowa)
osiadaniu bakterii na powierzchni podłoża. Metoda stosowana jest przy
badaniu czystości mikrobiologicznej powietrza.
 Metoda płytek odciskowych – wykorzystuje podłoże agarowe,
tworzące w płytce Petriego menisk wypukły, który przykłada się na kilka
sekund do badanej powierzchni. Po inkubacji liczy się wyrosłe kolonie, a
wynik ocenia w zależności od przyjętych kryteriów. Metoda służy do
monitorowania mikrobiologicznego skażenia powierzchni szpitalnych i
przemysłowych (ściany, podłogi, sprzęt).
 Metoda posiewu powierzchniowego lub głębinowego (płytki lane) jest
najczęściej stosowana w praktyce laboratoryjnej. Dotyczy przede
wszystkim preparatów o spodziewanej dużej liczbie drobnoustrojów,
dlatego konieczne jest wstępne wielokrotne rozcieńczenie badanej próbki.
 Metoda posiewu na podłoże płynne (metoda probówkowa) jest
oznaczeniem najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL).
 Metoda filtrów membranowych - polega na przesączeniu określonej
objętości badanego płynnego preparatu przez odpowiedni filtr. Filtr ten
nakłada się następnie na powierzchnię podłoża stałego. Po inkubacji liczy
się wyrosłe na sączku kolonie.
Żywe bakterie można zliczyć także innymi metodami. Jedna z nich jest
metodą mikroskopową (bezpośrednia epifluorescencja), w której barwi się
barwnikiem fluorescencyjnym żywe bakterie na sączku membranowym,
przez który uprzednio przesączono badaną próbkę o określonej objętości.
Metoda ta stosowana jest w przemyśle mleczarskim do oceny
bakteriologicznej surowego mleka.
70
Można także zastosować metody pośrednie. Są to metody szybkie,
ponieważ skracają zwykle 24-48-godzinny (lub dłuższy) okres inkubacji
typowy dla metod hodowlanych, ale wymagają drogiej aparatury
i odczynników.
Jedną z nich jest luminometria - pomiar chemiluminescencji lub
bioluminescencji, będącej efektem hydrolizy adenozynotrójfosforanu ATP, obecnego w każdej żywej komórce. Metoda stosowana jest
w kontroli czystości mikrobiologicznej powierzchni produkcyjnych,
urządzeń i rękawic na rękach pracowników w przemyśle spożywczym,
kosmetycznym, farmaceutycznym, przy badaniu żywności, czystości wody
pitnej, a także kontroli skuteczności działania środków myjących
i dezynfekujących.
Można także zastosować metody manometryczne – dokonując pomiaru
zużycia O2 lub wytwarzania CO2 przez rosnące drobnoustroje.
Metoda hodowlana z użyciem pożywki o zmienionych parametrach
elektrycznych pozwala na szybkie wykrycie drobnoustrojów, które
namnażając się wytwarzają silnie zjonizowane metabolity. Znajduje ona
zastosowanie między innymi w biodetektorach służących do oceny
skażenia mikrobiologicznego środowiska.
Każda z tych metod wymaga odpowiedniej standaryzacji, aby pomiar mógł
być ilościowy.
Metody
Standaryzacja zawiesin bakteryjnych
Badania mikrobiologiczne wymagają niekiedy zastosowania standaryzacji
gęstości zawiesin czy hodowli tak, aby do badań używać próbek
o powtarzalnej liczbie bakterii. Najczęściej stosuje się standaryzację
według powszechnie przyjętego wzorca zmętnienia - skali opracowanej
przez McFarlanda. W skład zestawu tej skali wchodzi kilka probówek
zawierających mieszaniny 1% roztworu chlorku baru i 1% roztworu kwasu
siarkowego. Zmętnienie powstałe w wyniku wytrącenia się osadu
siarczanu baru optycznie przypomina bardzo zmętnienie, jakie tworzy
w wodzie zawiesina bakterii. Odpowiednia standaryzacja uzyskana
71
poprzez liczenie bakterii różnymi metodami pozwoliła przypisać
odpowiedniemu,
określonemu
numerem
zmętnieniu
wzorca,
odpowiednią gęstość zawiesiny bakterii. Porównania zmętnienia badanej
zawiesiny bakteryjnej ze zmętnieniem w probówkach skali McFarlanda
dokonuje się wzrokowo lub przy użyciu prostego, przenośnego
nefelometru. Pozwala ono na oszacowanie liczby bakterii w 1 mL
zawiesiny. Ważnym czynnikiem decydującym o dokładności odczytu jest
przygotowanie badanej zawiesiny w probówce z takiego samego szkła
i o takiej samej średnicy, jak probówki ze wzorcem skali McFarlanda. Ta
metoda określania całkowitej liczby bakterii martwych i żywych jest
wykorzystywana przy standaryzacji zawiesin bakteryjnych przed
wykonaniem antybiogramu czy testów identyfikacyjnych. Wzorce
zmętnienia wg skali McFarlanda można przygotować w każdym
laboratorium mikrobiologicznym przez zmieszanie w odpowiednich
proporcjach roztworu chlorku baru i kwasu siarkowego. Można także
korzystać z gotowych wzorców skali McFarlanda oferowanych przez
różnych producentów.
Rozcieńczanie hodowli bakterii dla potrzeb liczenia bakterii
żywych
Płyny zawierające dużą liczbę bakterii należy przed posiewem rozcieńczyć
metodą seryjnych rozcieńczeń tak, aby zawierały zawiesiny komórek
policzalnych metodą posiewu. Stopień rozcieńczenia musi być znaczny,
gdyż na płytkę o średnicy ok. 9 cm posiewa się 0,1 mL zawiesiny,
2
a jako osobne (policzalne) może się na niej utworzyć najwyżej 300 (3x10 )
kolonii. Tymczasem hodowla płynna większości bakterii zawiera
7
12
przeciętnie 10 -10 komórek bakterii w mililitrze. Najczęściej wykonuje
się szereg kolejnych 10- krotnych rozcieńczeń w postępie geometrycznym.
Rozcieńczenia wykonuje się następująco:
 do szeregu, najczęściej 7 do 12 probówek, nalewa się po 9 mL
fizjologicznego roztworu NaCl;
 do pierwszej dodaje się 1 mL rozcieńczanej zawiesiny;
 następnie przenosi się po 1 mL zawiesiny z probówki do probówki tak
jak pokazuje to schemat na poniższej rycinie;
72
 z ostatniej probówki, po wymieszaniu 1 mL wylewa się do słoja
ze środkiem dezynfekcyjnym.
Rozcieńczenia wykonuje się przy użyciu szklanych jałowych pipet
lub pipet automatycznych z jałowymi końcówkami. Trzeba pamiętać,
aby po wymieszaniu zawartości każdej probówki i przeniesieniu 1 mL
do następnej zmienić pipetę lub końcówkę pipety automatycznej. Unika
się w ten sposób błędu wynikającego z przylegania bakterii do szkła
czy plastiku.
W niektórych sytuacjach wykonuje się szereg 100-krotnych rozcieńczeń.
Wtedy przenosi się po 0,1 mL hodowli do kolejnych probówek
zawierających po 9,9 mL fizjologicznego roztworu NaCl. Ten sposób,
choć wymaga użycia mniejszej liczby probówek, obarczony jest jednak
większym błędem.
Rycina 1. Schemat wykonywania 10-krotnych rozcieńczeń
1 mL hodowli
9 mL roztworu NaCl
wielokrotność
rozcieńczenia
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
10
7
10
8
10
9
Liczenie bakterii żywych metodą posiewów na podłoże stałe
Liczenie żywych bakterii metodą posiewu na podłoże stałe polega
na liczeniu powstających z nich kolonii. Liczba powstających kolonii
odpowiada liczbie żywych komórek lub dokładniej - liczbie jednostek
tworzących kolonie (jtk; CFU – ang. colony forming units). Liczenia bakterii
73
żywych
dokonuje
się
metodą
posiewu
powierzchniowego
lub głębinowego (płytki lane).
Posiew powierzchniowy polega na rozprowadzeniu zagiętą ezą
lub głaszczką na powierzchni płytek z podłożem po 0,1 mL wybranych
rozcieńczeń badanego materiału. Na płytki o średnicy większej niż 10 cm
można nanieść odpowiednio więcej zawiesiny. W wyniku takiego posiewu
uzyskuje się wzrost w postaci kolonii na powierzchni agaru.
Posiew głębinowy polega na wlaniu do jałowych płytek Petriego po 1 mL
zawiesiny z poszczególnych rozcieńczeń, zalaniu roztopionym
i przestudzonym agarem i wymieszaniu. W wyniku takiego posiewu
uzyskuje się wzrost w postaci kolonii zarówno na powierzchni, jak i w głębi
agaru. Kolonie w głębi agaru są znacznie mniejsze i różnią się też kształtem
(często są soczewkowate).
Najczęściej przygotowuje się płytki z trzech ostatnich rozcieńczeń.
Aby zmniejszyć błąd, którym obarczone są obie metody, z każdego
rozcieńczenia sporządza się po trzy płytki, z których wylicza się średnią
liczbę wyrosłych kolonii. Na płytce łatwo odróżnić jako pojedyncze około
300 kolonii, które można policzyć korzystając z licznika kolonii.
Gdy na płytce wyrosło więcej kolonii, należy wyliczyć średnią liczbę kolonii
przypadającą na 1 cm2 (zliczając kolonie z 10 cm2). Liczbę kolonii na całej
płytce oblicza się uwzględniając pole jej powierzchni (P = Пr2).
Liczba kolonii wyrosłych na płytce pomnożona przez rozcieńczenie
i przeliczona na 1 mL materiału wyjściowego daje nam liczbę żywych
komórek bakteryjnych w badanej zawiesinie.
Bakterie w zawiesinie można też policzyć metodą Milesa i Misry’ego.
Jest ona modyfikacją posiewu powierzchniowego zalecaną do badania
próbek zawierających około 100 CFU/mL. Przy spodziewanej większej
liczbie bakterii wymagane jest wstępne rozcieńczenie. Z każdego
rozcieńczenia badanego materiału pobiera się małą jego objętość (np. 550 l) i nakrapla w oznaczonym miejscu powierzchni płytki z odpowiednim
stałym podłożem. Po inkubacji ocenia się wzrost bakterii w miejscu
nakroplenia. W przypadku dużej liczby bakterii będzie to wzrost w postaci
„murawy”. Wraz z kolejnymi rozcieńczeniami uzyskuje się wzrost
pojedynczych kolonii. Znając liczbę kolonii, objętość kropli i współczynnik
74
rozcieńczenia, można obliczyć liczbę żywych bakterii w badanym
materiale.
Liczenie bakterii żywych metodą sączenia przez filtry
membranowe
Metoda ta służy do określania liczby żywych bakterii w płynach
zawierających niewielką ich ilość. Znalazła ona zastosowanie w oznaczaniu
liczby bakterii w wodzie pitnej, płynnych artykułach spożywczych,
kosmetykach czy lekach zawierających substancje przeciwbakteryjne.
Metodą sączenia przez filtry membranowe możemy oznaczać całkowitą
liczbę bakterii lub, gdy zastosujemy odpowiednie podłoża diagnostycznowybiórcze, określone ich grupy – rodzaje, a nawet gatunki.
Przez filtr membranowy sączona jest próbka o określonej objętości. Filtr
następnie przenosi się na powierzchnię podłoża w płytce Petriego.
Składniki podłoża, dyfundując przez pory sączka, umożliwiają wzrost
w postaci kolonii. Po policzeniu wyrosłych kolonii przelicza się otrzymaną
wartość na jednostkę objętości (np. mL) próbki lub określa liczbę bakterii
w całej objętości sączonego płynu.
W celu zatrzymania na sączku wszystkich bakterii obecnych w badanym
materiale należy zastosować filtr membranowy o wielkości porów
0,22 µm. Na filtrze o wielkości porów 0,45 µm zatrzyma się tylko część
bakterii, ale wszystkie komórki i zarodniki grzybów.
Liczenie bakterii żywych metodą posiewów na podłoże płynne
W metodzie tej, zwanej probówkową, liczbę bakterii ocenia
się na podstawie występowania lub braku wzrostu na pożywkach
płynnych, do których uprzednio wprowadzono odpowiednie objętości
rozcieńczeń badanej próbki.
Jest to badanie określające najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL)
(ang. most probable number, MPN) bakterii obecnych w preparacie.
Odczytywanie wyników oparte jest na statystycznym obliczeniu
prawdopodobieństwa
występowania
wzrostu
drobnoustrojów
w zależności od ich liczby w próbce. Dokładność metody NPL jest mniejsza
75
niż innych metod hodowlanych. Metoda NPL jest zalecana tylko w
sytuacji, gdy nie może być zastosowana inna metoda.
Badanie polega na przygotowaniu kolejnych w postępie geometrycznym,
10-krotnych rozcieńczeń badanego preparatu. Następnie próbki każdego
z nich posiewa się, w trzech powtórzeniach, na podłoża płynne.
Na podstawie wzrostu lub jego braku w próbkach z odpowiednich
rozcieńczeń wnioskuje się o ilości bakterii w preparacie. Służą do tego
tablice statystyczne, z których oblicza się najbardziej prawdopodobną
liczbę bakterii (lub grzybów) występującą w jednostce wagowej lub
objętościowej preparatu. Metoda NPL może być zastosowana zarówno do
oceny ogólnej zanieczyszczeń mikrobiologicznych badanego materiału, jak
i w badaniach ukierunkowanych, zmierzających do oznaczenia wybranych
bakterii. Metodę probówkową stosuje się do określenia prawdopodobnej
liczby bakterii grupy coli i/lub Escherichia coli w wodzie. Metoda NPL
wymieniona jest także w Farmakopei Polskiej IX przy badaniu czystości
mikrobiologicznej leków i surowców farmaceutycznych. Stosowana jest
także przy badaniu żywności.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Liczenie bakterii metodą posiewu powierzchniowego
9
Hodowlę płynną Escherichia coli rozcieńczono 10 raza i posiano
powierzchniowo (0,1 mL) na płytkę o średnicy 10 cm. Po 24 godzinach
inkubacji policzono kolonie na 1/4 płytki. Było ich 125. Podaj liczbę
bakterii w 1 mL hodowli wyjściowej.
76
Zadanie 2
Liczenie bakterii metodą sączenia przez filtry membranowe
Używając jałowego zestawu przesączono przez filtr membranowy 100 mL
wody wodociągowej. Filtr położono na powierzchni płytki z podłożem
diagnostycznym Endo w taki sposób, aby górna strona sączka, na której
zostały zatrzymane bakterie zwrócona była ku górze i inkubowano (37°C,
24 godz.).
Policz kolonie wyrosłe na powierzchni sączka i oceń różnice w ich
wyglądzie.
Gramujemne pałeczki z grupy coli: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella
i Enterobacter należące do rodziny Enterobacteriaceae wyrastają
w postaci różowych kolonii. Zwróć uwagę na kolonie o barwie różowokarminowej z metalicznym połyskiem - tak wyrasta Escherichia coli.
Oblicz liczbę bakterii grupy coli w 100 mL wody (norma dla wody pitnej
dopuszczająca jej spożycie to nieobecność bakterii grupy coli i E. coli).
77
78
Rozdział 7
Dezynfekcja i antyseptyka
Część teoretyczna
Drobnoustroje w otoczeniu człowieka mogą stanowić zagrożenie, które
minimalizuje się stosując następujące zabiegi określane wspólnym
mianem dekontaminacji.




Dezynfekcja to proces usuwania drobnoustrojów ze środowiska
i powierzchni przedmiotów. Zakłada się, że w procesie dezynfekcji
giną formy wegetatywne bakterii i grzybów chorobotwórczych,
a ilość pozostałych drobnoustrojów ulega maksymalnemu
zmniejszeniu. Zatem dezynfekcja nie eliminuje wszystkich
niepożądanych drobnoustrojów, w tym przetrwalników czy
niektórych wirusów. Procesem prowadzącym do usunięcia
wszystkich form życia z określonego materiału jest sterylizacja,
której dokonuje się specjalnymi metodami (rozdział 8)
Dezynfekcję, powinna poprzedzać, jeśli to możliwe, sanityzacja.
Polega ona na zmniejszeniu liczby drobnoustrojów na
przedmiotach i skórze za pomocą środków myjących
i czyszczących.
Antyseptyka
to
eliminacja lub hamowanie
rozwoju
drobnoustrojów na żywych tkankach – skórze i błonach
śluzowych.
Aseptyka to zgodne z określonymi procedurami postępowanie,
które ma na celu zapobieganie zakażeniu. Takie postępowanie
obowiązuje w laboratoriach mikrobiologicznych, w medycynie
zabiegowej, aptekach, zakładach farmaceutycznych, oraz
produkujących kosmetyki i żywność, także w gabinetach
kosmetycznych. W pracy aseptycznej wykorzystuje się procesy
sanityzacji, dezynfekcji i sterylizacji.
79

Konserwacja ma na celu zapobieganie rozwojowi drobnoustrojów
i zabezpieczenie produktu przed wtórnym (w czasie użytkowania)
skażeniem. Konserwuje się m.in. żywność, leki, preparaty
biologiczne, produkty stosowane w kosmetologii.
Środki dezynfekcyjne, antyseptyczne i konserwujące to związki chemiczne
mające zdolność niszczenia lub hamowania rozwoju drobnoustrojów.
Metody
Dezynfekcję można przeprowadzać metodami z zastosowaniem
czynników fizycznych (temperatury, promieniowania, filtracji) i przy
użyciu związków chemicznych.
W czasie dekoktacji – gotowania w temperaturze wrzenia wody (100oC) –
w ciągu 10 minut ginie większość form wegetatywnych drobnoustrojów,
ale przeżywają przetrwalniki i niektóre wirusy.
Pasteryzacja – ogrzewanie w temperaturze 62oC przez 30 minut lub
gwałtowne podniesienie temperatury na 15 sekund do 72oC powoduje
zabicie form wegetatywnych drobnoustrojów chorobotwórczych, maleje
także ogólna liczba drobnoustrojów.
Dezynfekcja za pomocą promieniowania UV niszczy przede wszystkim
formy wegetatywne drobnoustrojów, wirusy i przetrwalniki są bardziej
oporne. Ze względu na nieprzenikliwość promieniowania UV skuteczność
tej metody jest ograniczona.
Działanie ultradźwiękami pozwala na dokładne oczyszczenie sprzętu
(sanityzacja), ale usuwane są także drobnoustroje, z których znaczna część
ginie w wyniku zniszczenia osłon komórkowych. Ta metoda czasem
poprzedza sterylizację w autoklawie.
Znaczne ograniczenie liczby drobnoustrojów w płynach lub gazach można
osiągnąć przez filtrację. Stopień oczyszczenia zależy od wielkości porów
zastosowanego filtra. Większość bakterii zatrzymywana jest przez filtry
o średnicy porów 0,45 m.
80
Znanych jest wiele grup związków chemicznych o działaniu
przeciwdrobnoustrojowym. Wybierając najbardziej odpowiedni środek
dezynfekcyjny należy uwzględnić:
- jego właściwości i spektrum działania,
- rodzaj spodziewanych zanieczyszczeń mikrobiologicznych,
- dodatkowe zanieczyszczenie materią organiczną (np. płynami
ustrojowymi, pozostałościami leków, kosmetyków czy żywności),
- stopień toksyczności środka dezynfekcyjnego.
Niektóre środki dezynfekcyjne mogą być również antyseptykami. Dotyczy
to jednak tylko nielicznych, gdyż zastosowane na żywe tkanki, nie mogą
działać drażniąco czy uczulająco.
Ze względu na rodzaj substancji czynnej środki dezynfekcyjne zaliczane są
do różnych grup i mają różne przeznaczenie i skuteczność.
Alkohole działają powierzchniowo niszcząc strukturę błon lipidowobiałkowych. Daje to efekt bójczy w stosunku do form wegetatywnych
bakterii gramujemnych i gramdodatnich, włącznie z prątkami gruźlicy oraz
wirusami mającymi osłonkę. Nie działają na wirusy bezosłonkowe
i przetrwalniki. Mechanizm działania alkoholi polega głównie na
denaturacji białek, a ta zachodzi lepiej w obecności wody. Najczęściej
stosuje się 70% roztwory wodne. Powszechnie stosowane alkohole to
etanol i izopropanol. Oba wykorzystywane są zarówno do dezynfekcji, jak
i antyseptyki, a także jako środki konserwujące w kosmetologii. Służą
również jako rozpuszczalniki innych środków dezynfekcyjnych, wzmagając
ich aktywność przeciwdrobnoustrojową.
Aldehydy to najskuteczniej działające bójczo związki chemiczne,
niszczące także przetrwalniki. Mogą zatem być wykorzystywane do
sterylizacji. Ich działanie polega na alkilowaniu białek i kwasów
nukleinowych. Powszechnie stosowany do dezynfekcji jest aldehyd
glutarowy. Charakteryzuje się on szerokim spektrum działania
przeciwdrobnoustrojowego, działa szybko – w ciągu minuty zabija
większość form wegetatywnych bakterii, jednak przetrwalniki bakterii giną
po znacznie dłuższym czasie ekspozycji. Znacznie silniej działa w pH 8 niż
w środowisku kwaśnym, ale jest wtedy mało stabilny. Stosowany jest do
81
dezynfekcji i sterylizacji narzędzi medycznych. Aldehyd ortoftalowy –
nowy związek tej grupy, ma podobne spektrum do aldehydu glutarowego.
W przeciwieństwie do tego ostatniego, nie wymaga jednak aktywacji, nie
działa drażniąco na oczy i śluzówki nosa i jest stabilny w szerokim zakresie
pH (od 3 do 9). Stosując go uzyskuje się wysoki poziom dezynfekcji
endoskopów i innych narzędzi medycznych. Aldehyd mrówkowy
(formaldehyd) działa na bakterie gramujemne, ale słabiej na bakterie
gramdodatnie i na przetrwalniki. Ma ograniczone zastosowanie ze
względu na przykry zapach, działanie mutagenne i drażniące. Szersze
zastosowanie znalazły jego kondensaty z innymi związkami. Zachowują
one aktywność formaldehydu przy zredukowanym działaniu drażniącym.
Pochodne biguanidyny – chlorheksydyna i aleksydyna to środki, które
znalazły zastosowanie głównie jako antyseptyki. Działają bójczo
uszkadzając błonę cytoplazmatyczną komórek. Chlorheksydyna działa
silniej na bakterie gramdodatnie, słabiej na gramujemne, jest aktywna
w stosunku do wirusów posiadających osłonkę, a nieaktywna w stosunku
do prątków gruźlicy i przetrwalników. Wykazuje ograniczoną aktywność
w stosunku do grzybów. Spektrum aktywności chlorheksydyny poszerza
się w roztworach alkoholowych lub w połączeniu z czwartorzędowymi
związkami amoniowymi. Aleksydyna znalazła zastosowanie jako składnik
preparatów do pielęgnacji jamy ustnej i stosowanych w okulistyce.
Chlorowce, głównie chlor, jod i ich związki działają skutecznie
przeciwdrobnoustrojowo. Chlor jako gaz lub składnik wielu dostępnych
komercyjnie związków jest szeroko stosowany jako środek dezynfekcyjny.
W zetknięciu chloru z wodą tworzy się kwas podchlorawy i właśnie on,
jako silny utleniacz, inaktywuje enzymy komórki. Chlor i jego połączenia
działają na szerokie spektrum drobnoustrojów: bakterie, grzyby i wirusy,
chlor w wysokich stężeniach może nawet eliminować przetrwalniki
bakterii. Skroplony chlor jest używany do dezynfekcji wody i ścieków,
a jego nieorganiczne (np. podchloryn sodu) i organiczne (np. chloraminy,
halazon) połączenia są skutecznymi środkami dezynfekcyjnymi. Jod to
jeden z najaktywniejszych antyseptyków; w postaci J2 działa utleniająco
inaktywując białka i enzymy komórki. Stosowany jest w postaci roztworów
82
alkoholowo-wodnych (jodyna) lub jodoforów. Jodyna ma szerokie
spektrum działania. Wrażliwe na nią są bakterie gramujemne,
gramdodatnie prątki, grzyby i wirusy, a przy przedłużonej ekspozycji także
przetrwalniki bakterii. Działa lepiej od chloru w obecności materii
organicznej. Jodofory to połączenia jodu z nośnikami. Mogą nimi być
organiczne polimery zdolne do kompleksowania jodu i jego jonów lub
związki powierzchniowo czynne. Jod jest powoli uwalniany z tych
połączeń. Jodofory zachowują aktywność przeciwdrobnoustrojową,
eliminują zaś niekorzystne cechy preparatów jodu: przykry zapach,
barwienie skóry, reakcje uczuleniowe czy małą stabilność roztworów.
Związki fenolu są stosowane jako środki dezynfekcyjne i konserwujące.
Silnie i szybko działają bójczo na drobnoustroje z wyjątkiem
przetrwalników. Ich aktywność znacząco maleje po rozcieńczeniu,
zmniejsza się również w obecności materii organicznej. Sam fenol nie jest
używany, gdyż jest toksyczny, działa silnie drażniąco na oczy, skórę i drogi
oddechowe. Dostępnych jest jednak wiele produktów zawierających jego
pochodne: krezole i dwufenole. Są one zwykle przeznaczone do
dezynfekcji podłóg w placówkach służby zdrowia. Zsyntetyzowano też
wiele nowych pochodnych o znacznie korzystniejszych właściwościach.
Dwie z nich, najczęściej wykorzystywane to chlorokrezol – używany jako
środek konserwujący i chloroksylenol – stosowany jednak coraz rzadziej
do dezynfekcji skóry. Trzy inne: 1-benzyl-4-chlorofenol, 2-fenylofenol
i para-amylofenol stanowią substancje czynne wielu środków
dezynfekcyjnych. Dwufenol – triklosan jest stosowany do dezynfekcji
skóry, jest też często składnikiem mydeł i płynów dezynfekcyjnych.
Związki utleniające: nadtlenek wodoru i kwas nadoctowy to silnie
działające środki dezynfekcyjne, które zawdzięczają swą aktywność
tworzeniu wysoce reaktywnych rodników hydroksylowych. Ważną ich
zaletą jest nietoksyczność i zdolność ulegania biodegradacji. Nadtlenek
wodoru (woda utleniona) w roztworach o niskich stężeniach jest
niestabilny. W stężeniu 3% stosowany jest jako słaby antyseptyk.
Stabilizowane roztwory w stężeniach od 3% do 6% działają skutecznie jako
środki dezynfekcyjne. W wysokich stężeniach (do 35%) i w podwyższonej
83
temperaturze nadtlenek wodoru działa również bójczo na przetrwalniki.
Kwas nadoctowy ma szersze spektrum działania. Szybko działa bójczo
na bakterie, także prątki oraz grzyby, wirusy i przetrwalniki. Działa
w obecności materii organicznej. Jest zaliczany do chemicznych środków
sterylizujących. Stosowany jest do sterylizacji np. endoskopów,
a w połączeniu z nadtlenkiem wodoru - do zimnej sterylizacji urządzeń do
dializ. Niestety powoduje korozję niektórych metali i działa drażniąco.
Związki powierzchniowo czynne można podzielić na kilka grup.
Aktywność przeciwdrobnoustrojową wykazują związki o charakterze
amfoterycznym, działające także jako detergenty. Są bardzo często
wykorzystywane w chirurgii do higienicznego i chirurgicznego mycia rąk,
do dezynfekcji instrumentów medycznych i odkażania podłóg
w szpitalach.
Najważniejszą
z
punktu
widzenia
aktywności
przeciwdrobnoustrojowej grupą są związki kationowe. Działają one silnie
bójczo na bakterie gramdodatnie, słabiej na gramujemne. Są również
aktywne wobec grzybów i wirusów posiadających osłonkę. Niestety
obecność materii organicznej zmniejsza ich aktywność. Do najczęściej
stosowanych do dezynfekcji, antyseptyki, a także jako środki
konserwujące należą: chlorek i bromek benzalkoniowy i cetrimid (bromek
cetylotrimetyloamoniowy).
Wśród innych związków o działaniu przeciwdrobnoustrojowym na uwagę
zasługują organiczne związki azotu: dichlorowodorek oktenidyny (anilid)
i izotiocyjanoguanidyna (poliamina). Dichlorowodorek oktenidyny wchodzi
w
skład
preparatów
antyseptycznych
o
silnym
działaniu
przeciwdrobnoustrojowym, a izotiocyjanoguanidyna należy do nielicznych
związków inaktywujących priony.
Na rynku dostępnych jest wiele środków dezynfekcyjnych
i antyseptycznych, zwykle są to połączenia kilku substancji czynnych.
Antyseptyki najczęściej są różnymi połączeniami alkoholi, chlorheksydyny,
bromku lub chlorku benzalkoniowego, w ich skład wchodzą też związki
jodu czy chlorowodorek oktenidyny. Środki dezynfekcyjne zawierają
często związki chloru, a także aldehydy czy fenole. Wiele produktów
84
zawiera te same substancje czynne, choć składniki towarzyszące mogą
wyraźnie podnosić ich skuteczność i nadawać im szczególne cechy.
Skuteczność działania środków odkażających (dezynfekcyjnych,
antyseptycznych) ocenia się metodami mikrobiologicznymi, uwzględniając
różne czynniki wywierające wpływ na działanie tych środków. Ogólne
zasady oceny środków odkażających są regulowane normami krajowymi
i międzynarodowymi (WHO, UE).
Skuteczność dezynfekcji ocenia się pośrednio, przez określenie
zmniejszenia zanieczyszczenie mikrobiologicznego powietrza czy
powierzchni. Najczęściej stosuje się metodę sedymentacji i metodę
odcisków.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Badanie bakteryjnego zanieczyszczenia powietrza metodą sedymentacji
- Ustaw otwartą płytkę agarową w wybranym miejscu i pozostaw przez 30
minut.
o
- Zamknij płytkę i umieść w cieplarce o temperaturze 37 C na 24 do 48
godzin.
- Po inkubacji policz wyrosłe na płytce kolonie i określ liczbę
drobnoustrojów w 1 m3 powietrza podstawiając dane do wzoru:
Liczba drobnoustrojów w 1 m3 powietrza = x · 100 · 100/ Πr2 · t · 1/5
x – liczba kolonii na płytce (średnia z 3 płytek)
Πr2– powierzchnia płytki
t – czas ekspozycji
85
Zadanie 2
Kontrola bakteryjnego zanieczyszczenia powierzchni metodą odcisków
- Płytkę odciskową przyłóż agarem do suchej kontrolowanej powierzchni
na czas 10 sekund (nacisk 500 g).
- Zamkniętą płytkę umieść w cieplarce o temperaturze 30oC lub 25oC
i inkubuj 72 godziny, gdy chcesz wyhodować grzyby przedłuż inkubację do
7 dni.
- Po inkubacji policz kolonie wyrosłe na płytce (powierzchnia płytki wynosi
25 cm2). Porównaj wyniki z normami dla różnych powierzchni.
Zadanie 3
Określanie skuteczności działania środka antyseptycznego w stosunku do
flory bakteryjnej skóry dłoni
Badanie działania środka antyseptycznego i kontrola liczby bakterii na
skórze nie odkażanej musi być wykonane przez jedną osobę (ilość bakterii
na skórze jest cechą osobniczą zależną od wielu czynników i może wahać
się w znacznym stopniu). Zatem jedna osoba bada kolejno lewą i prawą
rękę.
Ocena liczby bakterii na skórze nie odkażanej:
- Wlej 10 mL bulionu do jałowej płytki Petriego, płucz w nim opuszki
palców jednej ręki przez 1 minutę.
86
- Policz żywe bakterie uwolnione ze skóry do bulionu metodą posiewu
powierzchniowego przenosząc 0,1 mL bulionu na płytkę krwawą
i równomiernie rozprowadź zagiętą ezą.
Ocena liczby bakterii na skórze dłoni po zastosowaniu środka
antyseptycznego (np. 1% Sterinolu, 0,5% Abacilu w etanolu, 2%
Chloraminy lub Manusanu).
- Wlej 10 mL środka antyseptycznego do jałowej płytki Petriego.
- Wlej 10 mL bulionu do drugiej płytki.
- Płucz w środku antyseptycznym opuszki palców nie badanej wcześniej
ręki przez 1 minutę.
- Opłucz palce polewając je jałową wodą i wysusz w jałowym powietrzu
(w pobliżu zapalonego palnika).
- Zanurz opuszki palców w płytce z bulionem i płucz je przez 1 minutę.
- Policz żywe bakterie uwolnione do tego bulionu metodą posiewu
powierzchniowego tak jak poprzednio.
- Opróżnij płytki z płynów, a pożywki z posiewami umieść w cieplarce
(37oC, ok. 20 godzin).
- Po inkubacji policz wszystkie kolonie wyrosłe na obu płytkach.
- Porównaj liczbę bakterii przed i po działaniu środka antyseptycznego.
- Oceń jego skuteczność:
87
Zadanie 4
Wrażliwość różnych form bakterii na działanie środków dezynfekcyjnych
Do probówek zawierających przetrwalniki Bacillus subtilis dodaj po 0,5 mL
następujących roztworów środków dezynfekcyjnych:
0,5% glukonian chlorheksydyny w 70% etanolu
0,5% glukonian chlorheksydyny w H2O
0,5% fenol
70% etanol
2% aldehyd glutarowy
-Inkubuj 60 minut w temperaturze pokojowej.
-Odsiej ezą zawartość poszczególnych probówek do bulionów
podpisanych nazwą środka dezynfekcyjnego.
o
-Wstaw buliony do cieplarki 37 C na ok. 20 godzin.
-Oceń, w których probówkach pojawił się wzrost zapisz w tabeli.
Środek dezynfekcyjny
Żywotność przetrwalników po ekspozycji
na środki dezynfekcyjne (wzrost)
0,5% chlorheksydyna
w 70% etanolu
0,5% chlorheksydyna
w H2O
0,5% fenol
70% etanol
2% aldehyd glutarowy
88
Zadanie 5.
Wpływ materii organicznej na aktywność przeciwbakteryjną środków
dezynfekcyjnych
W tym doświadczeniu materię organiczną reprezentować będą
inaktywowane komórki drożdży. W zależności od rodzaju badań zadanie
to spełniać może także albumina, mleko lub wyciąg drożdżowy.
- Dostajesz dwie płytki agarowe, na które odsiejesz zawiesiny po kontakcie
ze środkiem dezynfekcyjnym trwającym 1, 5, 10 i 20 minut (dla mieszaniny
testowej i dla kontroli) - każdą z nich opisz, dzieląc na 4 sektory.
- Dostajesz dwie probówki zawierające po 0,5 mL hodowli bulionowej
S. aureus:
- do tej, w której będziesz badać same bakterie dodaj 0,5 mL roztworu
NaCl - kontrola,
- do tej, w której będą one chronione przez materię organiczną dodaj
0,5 mL zawiesiny inaktywowanych drożdży - mieszanina testowa.
- Do probówki z mieszaniną testową i do kontroli dodaj po 0,5 mL środka
dezynfekcyjnego.
Wymieszaj delikatnie zawartość probówek. Po 1, 5, 10 i 20 minutach
odsiej materiał na odpowiednie sektory płytek. Używaj ezy o oczku tej
samej wielkości i dbaj o pobranie pełnego oczka materiału.
o
- Płytki wstaw do cieplarki 37 C na ok. 20 godzin.
- Oceń wyniki i wpisz je do tabeli używając następujących symboli:
1 - 15 lub mniej kolonii w sektorze,
2 - więcej niż 15 kolonii, ale mniej niż wzrost zlewny,
3 - wzrost zlewny lub niepoliczalna liczba kolonii.
1 minuta
5 minut
10 minut
20 minut
Mieszanina
testowa
Kontrola
89
90
Rozdział 8
Wpływ czynników środowiskowych na wzrost
i rozwój bakterii. Sterylizacja.
Część teoretyczna
Środowisko wywiera bezpośredni wpływ na drobnoustroje. Ważnymi
czynnikami abiotycznymi kształtującymi skład ekosystemów są:
temperatura, pH, wilgotność, ciśnienie osmotyczne, potencjał
oksydacyjno-redukcyjny, a także promieniowanie. Znajomość stopnia
indywidualnej wrażliwości poszczególnych gatunków bakterii na te
czynniki pozwala je namnażać w warunkach laboratoryjnych, ale także
ograniczać ich rozprzestrzenianie.
Temperatura jest jednym z czynników najsilniej oddziałujących na
drobnoustroje. Temperatury kardynalne: minimalna, która wyznacza
dolną granicę, poniżej której wzrost danego rodzaju zanika i maksymalna,
temperatura, powyżej której bakterie już się nie dzielą, określają
indywidualne warunki życia bakterii, a tym samym ich hodowli.
 Dla większości bakterii temperatura nieco poniżej 0oC jest bójcza, gdyż
tworzące się kryształki lodu niszczą struktury komórki. Nagłe obniżenie
temperatury do kilkudziesięciu stopni poniżej zera (–70oC), szczególnie
w obecności glicerolu nie uszkadza komórek i pozwala zachować
żywotność przez długie okresy czasu. Takie zamrożenie drobnoustrojów
z jednoczesnym ich wysuszeniem w próżni (liofilizacja) pozwala na
długotrwałe przechowywanie szczepów bakterii dla celów naukowych czy
diagnostycznych.
 Podwyższenie temperatury otoczenia powyżej maksymalnej
temperatury kardynalnej powoduje śmierć drobnoustrojów. Jest ona
spowodowana denaturacją enzymów i uszkodzeniem ważnych składników
komórki. Drobnoustroje różnią się wrażliwością na podwyższoną
temperaturę, większość z nich ginie po 30 minutach ogrzewania w
temperaturze około 60oC, jednak niektóre z nich, a także zarodniki
grzybów czy przetrwalniki bakterii, znoszą nawet bardzo wysokie
temperatury.
91
Wyznaczenie czasu śmierci cieplnej i punktu śmierci cieplnej pozwala
scharakteryzować ciepłowrażliwość określonych drobnoustrojów. Punkt
śmierci cieplnej to najniższa temperatura zabijająca drobnoustroje w ciągu
10 minut. Czas śmierci cieplnej to najkrótszy czas niezbędny dla zabicia
określonych drobnoustrojów w danej temperaturze.
Inne warunki środowiskowe mogą wpływać na skutek działania wysokiej
temperatury na drobnoustroje. W środowisku wodnym są one bardziej
wrażliwe na wysoką temperaturę niż w stanie wysuszenia. Obecność
węglowodanów, białek i tłuszczów chroni je przed działaniem ciepła, zaś
sole obecne w środowisku mogą podwyższać lub obniżać ciepłooporność,
zależy to od rodzaju soli i drobnoustroju.
Kwasowość środowiska może stymulować lub hamować rozwój
drobnoustrojów. Optymalne dla rozwoju większości drobnoustrojów pH
mieści się w granicach 6,5-7,5. Bakterie chorobotwórcze rozwijają się
najlepiej w pH obojętnym lub lekko alkalicznym, grzyby preferują
środowisko lekko kwaśne, a wirusy zachowują zakaźność w pH 5 do 8.
Niekorzystny dla bakterii odczyn środowiska jest często czynnikiem
wspomagającym procesy dekontaminacji np. pod wpływem temperatury.
Woda to podstawowy składnik i warunek rozwoju drobnoustrojów, ale
niektóre z nich mogą w stanie wysuszenia przetrwać wiele lat. Oporność
komórek wegetatywnych na wysychanie zależy od gatunku drobnoustroju
i innych warunków środowiska. Do bardzo wrażliwych na wysychanie
należą np. krętki blade czy dwoinki rzeżączki ginące odpowiednio w ciągu
kilku minut lub godziny bez dostępu wilgoci. Prątki gruźlicy pozostają żywe
miesiącami, zaś najbardziej oporne na wysuszenie są przetrwalniki.
Oporność drobnoustrojów na wysychanie zwiększa obecność
w środowisku materii organicznej (materiał kliniczny, żywność,
kosmetyki).Wilgotne środowisko sprzyja procesom dekontaminacji.
92
Dla ciśnienia osmotycznego drobnoustroje wykazują dużą tolerancję,
ale tylko nieliczne bakterie mogą przeżywać i rozwijać się w środowisku
hipertonicznym, i fakt ten wykorzystuje się w praktyce do konserwacji
produktów spożywczych. Niektóre bakterie mogą żyć i mnożyć się
w warunkach zwiększonego stężenia soli – to halotoleranty. Bakterie
wymagające do wzrostu zwiększonego stężenia soli – to halofile. Wysokie
ciśnienie osmotyczne może stanowić o wybiórczości podłóż np. do
hodowli grzybów .
Potencjał oksydacyjno-redukcyjny środowiska o swobodnym dostępie
tlenu jest wysoki, a środowiska słabo przewietrzanego – niski.
W środowisku o wysokim potencjale mogą się rozwijać drobnoustroje
tlenowe, względnie beztlenowe, a także mikroaerofile. Drobnoustroje
bezwzględnie beztlenowe dobrze rozwijają się w środowiskach o niskim
potencjale oksydacyjno-redukcyjnym (np. w przewodzie pokarmowym).
Fakt ten wykorzystuje się konstruując odpowiednie dla ich hodowli
pożywki.
Promieniowanie
ultrafioletowe (UV) i jonizujące działa
na
drobnoustroje w zależności od dawki i czasu ekspozycji mutagennie lub
letalnie. Promieniowanie ultrafioletowe (dł. fali 230 - 270 nm) działa
najsilniej przy długości fali 260 nm. Jest ono wybiórczo pochłaniane przez
zasady purynowe i pirymidynowe kwasów nukleinowych, pod jego
wpływem tworzą się wiązania między sąsiadującymi w tym samym
łańcuchu DNA cząsteczkami tyminy. Powstające dimery hamują
prawidłową replikację DNA, co może prowadzić do śmierci komórki
bakteryjnej. Największą, chociaż zróżnicowaną, wrażliwość na działanie
promieniowania UV wykazują formy wegetatywne bakterii, znacznie
bardziej oporne są wirusy i przetrwalniki bakterii, a najbardziej oporne są
zarodniki pleśni. Promieniowanie jonizujące to promieniowanie
elektromagnetyczne o bardzo małej długości fali wywierające bardzo silne
działanie biologiczne. Pod wpływem promieni jonizujących dochodzi do
pękania nici i wypadania odcinków drobnoustrojowego DNA. Pęknięcie
obu nici jest zawsze letalne, jednej może być mutagenne. Dodatkowo
93
promienie jonizujące mogą powodować zmiany w strukturze zasad
purynowych i pirymidynowych. Pośrednie działanie promieni jonizujących
to radioliza wody w środowisku i w komórce w wyniku, której powstają
wolne rodniki i nadtlenki działające toksycznie. Najwrażliwsze na działanie
tego promieniowania są bakterie gramujemne, średnio wrażliwe wirusy
i grzyby, a najbardziej oporne są przetrwalniki bakterii.
Sterylizacja
Wyjaławianie (sterylizacja) to proces, którego celem jest uwolnienie
wyjaławianego materiału od form życia w każdej postaci. Oznacza zatem
dekontaminację obejmującą wszystkie drobnoustroje i ich formy.
Wyjaławianie ma podstawowe znaczenie w medycynie, farmacji
i kosmetologii. W medycynie sterylizacji podlegają wszystkie przedmioty
tzw. wysokiego i średniego ryzyka przeniesienia zakażenia: narzędzia
chirurgiczne, cewniki, wszczepy oraz sprzęt diagnostyczny mający kontakt
z błonami śluzowymi i uszkodzonymi powłokami.
Zabiegi sterylizacji wymagają często odpowiedniego wstępnego
przygotowania materiałów. Ważny jest też wybór właściwej metody,
stosowanie jej zgodne z procedurami oraz systematyczna kontrola
sprawności urządzeń. Sterylizowane przedmioty muszą być odpowiednio
zabezpieczone (zapakowane), aby po zakończeniu procesu można je było
bezpiecznie przenieść i przechować do chwili użycia.
Metody
Sterylizację wykonuje się stosując metody z wykorzystaniem wysokiej
temperatury (wysokotemperaturowe).
Sterylizacja bieżąca parą wodną – tyndalizacja
Do sterylizacji płynów zawierających termolabilne składniki stosuje się
wyjaławianie parą wodną w ciśnieniu atmosferycznym. Przeprowadza się
je w aparacie Kocha, w którym, w bieżącej parze wodnej osiąga się
temperaturę 100oC. W tej temperaturze w ciągu 60 minut giną wszystkie
formy wegetatywne drobnoustrojów, a przetrwalniki ulegają termicznej
aktywacji i następnie, pozostawione w temperaturze pokojowej, kiełkują.
94
Po upływie doby, już jako formy wegetatywne, zostają zabite w kolejnym
cyklu sterylizacyjnym. Aby uzyskać pewność, że materiał jest jałowy,
ogrzewamy go po raz trzeci. Metoda ta jest stosowana prawie wyłącznie
do wyjaławiania pożywek mikrobiologicznych.
Sterylizacja parą wodną w nadciśnieniu
Jest to najczęściej stosowana metoda sterylizacji przeprowadzanej
w specjalnych urządzeniach – autoklawach. Zastosowanie nasyconej pary
o
wodnej w nadciśnieniu 1 Atm. pozwala osiągnąć temperaturę 121 C. Czas
sterylizacji w tych warunkach wynosi 15-20 minut. W ten sposób
sterylizuje się wiele pożywek, a także przedmioty z gumy i tworzyw
sztucznych. Przy nadciśnieniu 2 Atm. temperatura pary osiąga 134oC,
a czas potrzebny na wysterylizowanie materiałów wynosi od 3,5 do
7 minut. W tych warunkach jałowi się narzędzia chirurgiczne, bieliznę
operacyjną, szkło i materiały opatrunkowe oraz niektóre pożywki do
hodowli drobnoustrojów.
W autoklawie można wyjaławiać wszystkie termostabilne materiały, do
których ma szansę przeniknąć para wodna. Ma ona właściwości głęboko
penetrujące i w krótkim czasie prowadzi do zabicia drobnoustrojów,
w tym najbardziej opornych na temperaturę wirusów (HBV) oraz
zarodników grzybów i przetrwalników bakterii.
Stosowane jeszcze niekiedy (np. w gabinetach stomatologicznych czy
kosmetycznych) autoklawy przepływowe (grawitacyjne), w których
powietrze wypierane jest przez parę wodną, są zawodne i przestarzałe.
Zastępowane są one przez autoklawy próżniowe. Skuteczność sterylizacji
zależy w nich od całkowitego usunięcia powietrza z komory i od jakości
pary wodnej (wody).
Sterylizacja gorącem suchym
Wyjaławianie gorącym suchym powietrzem przeprowadza się
w suszarkach z wymuszonym obiegiem powietrza. Suche powietrze jest
złym przewodnikiem ciepła, sterylizację należy prowadzić w wyższej niż
w autoklawie temperaturze i w dłuższym czasie. Zwykle stosuje się
o
temperaturę w granicach 160-180 C w czasie do dwóch godzin.
Najczęściej stosuje się temperaturę 170oC przez 2 godziny. W takich
95
warunkach giną wszystkie drobnoustroje i ich przetrwalniki. Metoda ta
służy do wyjaławiania szkła, termostabilnych substancji sypkich oraz
olejów i podstaw maściowych. Sterylizacja suchym powietrzem ma
ograniczone zastosowanie i jest kosztowna. Uważana jest za przestarzałą
i w wielu krajach Unii Europejskiej jest już prawie całkowicie wycofana.
Może być z powodzeniem zastąpiona przez inne metody. Skutecznym
sposobem sterylizacji jest spalanie w płomieniu, ale ma ono wąskie
zastosowanie (np. do wyjaławiania ezy, czy niszczenia materiału
zakaźnego).
Sterylizacja promieniowaniem podczerwonym
Jest to sposób sterylizacji o zastosowaniu przemysłowym, ale
konstruowane są nowe urządzenia, które pozwolą na wykorzystanie tego
promieniowania w mniejszej skali. Sterylizacja promieniowaniem
podczerwonym IR o długości fali 700 nm do 1 mm (ang. infrared
sterilization) wykazuje bardzo dużą skuteczność w stosunku do wszystkich
drobnoustrojów, w tym wirusów zapalenia wątroby, najbardziej opornych
przetrwalników (tężca, jadu kiełbasianego, Geobacillus stearothermophilus), grzybów i ich zarodników oraz prionów. Sterylizowane przedmioty
umieszczane są w specjalnych metalowych pojemnikach. Cykl
sterylizacyjny nie przekracza kilku minut w temperaturze ok. 190oC.
Sterylizowane mogą być praktycznie wszystkie materiały.
Procesy sterylizacji mogą być przeprowadzane także w niskich
temperaturach (metody niskotemperaturowe).
Sterylizacja gazowa
W przemyśle medycznym sterylizacja gazowa jest stosowana do
wyjaławiania różnego sprzętu medycznego, w tym jednorazowego użytku
wykonanego z materiałów termolabilnych. Przy zastosowaniu tlenku
etylenu w przeszłości stosowano mieszaninę tego gazu z nośnikiem (np.
CO2) Obecnie urządzenia wykorzystują czysty (100%) tlenek etylenu,
a proces zachodzi w podciśnieniu, co zwiększa jego bezpieczeństwo. Wadą
procesu jest bowiem toksyczność gazu i stosunkowo długi czas trwania
96
procesu. Zaletą metody jest dobra penetracja gazu zapewniająca dużą
skuteczność oraz trwałość tworzyw sztucznych w warunkach sterylizacji.
Sterylizację można także przeprowadzać formaldehydem. Stosuje się jego
mieszaninę z parą wodną. Zwykle stosuje się 2-5% formaldehydu oraz
parę wodną do wilgotności przekraczającej 70%. W urządzeniach nowej
generacji proces zachodzi w temperaturze około 45oC w czasie 2-4 godzin.
Metoda ta wykorzystywana jest w warunkach szpitalnych do sterylizacji
giętkich endoskopów. Formaldehyd ma jednak słabe właściwości
penetrujące i niszczy niektóre materiały, np. gumę.
Sterylizacja radiacyjna
Źródłem wykorzystywanego w tej metodzie promieniowania gamma są
zazwyczaj izotopy promieniotwórcze. Promieniowanie stosowane
w dużych dawkach nieodwracalnie niszczy DNA i błony komórkowe
drobnoustrojów. Proces zachodzi w temperaturze pokojowej, ale dla
preparatów labilnych można temperaturę znacznie obniżyć. Metoda jest
kosztowna, ale często stosowana w przemysłowej sterylizacji sprzętu
medycznego, materiałów opatrunkowych, materiałów implantacyjnych.
Sterylizacja plazmowa
Wytwarzana w warunkach próżni w polu magnetycznym plazma jest
zjonizowanym gazem, otrzymywanym z nadtlenku wodoru. Proces
odbywa się w temperaturze 40-60oC, co pozwala na sterylizację sprzętu
medycznego wrażliwego na wysokie temperatury, a więc trudnego do
wysterylizowania innymi metodami. Penetracja plazmy do wnętrza
urządzeń nie jest jednak najlepsza i na przykład dla sterylizacji endoskopu
trzeba wprowadzać porcje plazmy bezpośrednio do światła przewodu. Po
około godzinie sprzęt jest gotowy do użycia, co jest ważną zaletą tej
metody.
Filtracja
Filtracja to przepuszczanie płynów lub gazów przez filtry o porach na tyle
małych, aby zatrzymać drobnoustroje. Metoda ta jest powszechnie
stosowana, a szczególnie przydatna do wyjaławiania ciepłochwiejnych
płynów. Jej zaletą jest usuwanie żywych i martwych drobnoustrojów i ich
97
przetrwalników, a także zanieczyszczeń mechanicznych. Najczęściej
wykorzystywane są sączki membranowe. Najbardziej popularne filtry
o średnicy porów od 0,22 μm i 0,45 μm zatrzymują tylko grzyby i bakterie,
ale są i filtry o porach mniejszych (aż do 0,01 μm), które mogą także
zatrzymywać wirusy, dając gwarancję sterylności. Filtry membranowe
znalazły zastosowanie w aptekach, zakładach farmaceutycznych,
szpitalach, także do filtracji powietrza w salach operacyjnych, gabinetach
zabiegowych czy boksach do pracy aseptycznej.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Oznaczanie czasu śmierci cieplnej bakterii
W tym doświadczeniu bakterie będą eksponowane na temperaturę 60oC,
a środowiskiem inkubacji będzie bulion. Badane bakterie to: Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtilis i Enterococcus faecalis. Przeżycie bakterii
w tych warunkach będzie sprawdzane przez posiew na płytkę agarową.
- Wykonaj preparaty barwione metodą Grama z badanych hodowli.
- Wyznacz i opisz sektory na płytkach (po jednej płytce dla każdego
drobnoustroju): K (kontrola), 15, 30, 45, 60 (odpowiednio: ekspozycja od
15-60 minut).
- Rozcieńcz hodowle przez dodanie do nich bulionu (1mL hodowli+2 mL
bulionu).
- Posiej rozcieńczoną hodowlę na sektor kontrolny (K), sprawdzając
żywotność bakterii przed ogrzewaniem.
o
- Umieść rozcieńczone hodowle w łaźni wodnej o temperaturze 60 C.
- Odsiewaj oczko ezy z poszczególnych hodowli na odpowiednie sektory
płytek agarowych po 15, 30, 45, i 60 minutach ogrzewania. Wyjmując ezę
z probówki, nie dotykaj jej ścianek.
- Umieść płytki w cieplarce (37oC, ok. 20 godzin).
- Po inkubacji oceń wzrost na płytkach. Wyniki wpisz do tabeli.
98
0
K
15
minut
30
minut
45
minut
60
Czas śmierci
minut cieplnej
P. aeruginosa
B. subtilis
E. faecalis
Jaki jest czas śmierci cieplnej każdego z trzech badanych
drobnoustrojów?
Czym możesz wytłumaczyć różną wartość czasu śmierci cieplnej
badanych bakterii?
99
Zadanie 2
Wpływ promieniowania UV na bakterie
W tym doświadczeniu bakterie (Escherichia coli) będą eksponowane na
działanie promieniowania UV przez okres 1 minuty i przez 30 minut.
- Opisz dwie płytki agarowe (nazwa bakterii, czas naświetlania – 1 min.,
30 min.)
- Zanurz waciki w hodowli płynnej Escherichia coli, odciśnij nadmiar płynu
o ścianki probówki i zasiej nimi gęsto całą powierzchnię płytek agarowych.
- Przykryj część posianej powierzchni płytki układając na niej jałową pęsetą
papierowy szablon.
- Naświetlaj pod lampą UV powierzchnię otwartych płytek: jednej przez
1 minutę, drugiej przez 30 minut.
- Po naświetlaniu zdejmij jałową pęsetą szablony i wrzuć je do słoja
z chloraminą.
- Umieść płytki w cieplarce (37oC na ok. 20 godzin).
- Po inkubacji oceń działanie promieniowania UV na Escherichia coli po
różnym czasie ekspozycji.
Jaki czas naświetlania jest konieczny do zabicia bakterii?
Jakie są jego zalety i wady tego promieniowania?
100
Zadanie 3
Wpływ ciśnienia osmotycznego na bakterie
W tym doświadczeniu sprawdzisz czy badane bakterie – Enterococcus
faecalis, Staphylococcus aureus i Escherichia coli w jednakowym stopniu są
oporne na wysokie stężenie zawartych w podłożu soli.
- Podziel płytki: zwykłą agarową i agarową zawierającą 7% NaCl na
3 sektory i opisz je nazwami badanych bakterii
- Na obie płytki posiej pasmowo badane bakterie z hodowli płynnych
w odpowiednich sektorach
o
- Umieść płytki w cieplarce (37 C na ok. 20 godzin).
- Po inkubacji oceń które bakterie wyrosły na poszczególnych płytkach.
- Które z badanych bakterii dobrze tolerują wysokie ciśnienie osmotyczne?
Zadanie 4.
Wpływ pH na wzrost bakterii
Zadanie to pozwoli ocenić, które z badanych bakterii – Staphylococcus
aureus czy Enterococcus faecalis – mają zdolność wzrostu w szerokim
zakresie pH.
- Buliony o pH 7,2 i 9,6 opisz nazwami bakterii.
o
- Posiej bakterie na buliony za pomocą ezy i umieść je w cieplarce (37 C na
ok. 20 godzin).
- Po inkubacji oceń stopień tolerancji pH obu gatunków.
Wzrost w pH 7,2
Wzrost w pH 9,6
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
101
102
Rozdział 9
Bakterie bytujące na skórze i błonach śluzowych
Część teoretyczna
Skóra, błony śluzowe jamy ustnej, górnych dróg oddechowych (nos,
gardło, krtań) oraz układu moczowo-płciowego (cewka moczowa,
pochwa) zasiedlane są naturalnie przez liczne gatunki bakterii stanowiąc
o chroniącej przed rozwojem patogenów tzw. odporności kolonizacyjnej.
Na powierzchni skóry dominują bakterie gramdodatnie – ziarenkowce
(rodzaj Staphylococcus) i pałeczki (rodzaje Corynebacterium
i Propionibacterium). Skład mikroflory skóry ściśle zależy od
rozmieszczenia na niej poszczególnych gruczołów. Miejsca suche są
zasiedlane głównie przez Staphylococcus spp. W miejscach z licznymi
gruczołami potowymi występują przede wszystkim Corynebacterium spp.,
a także nieliczne bakterie gramujemne, zaś miejsca bogate w gruczoły
łojowe zasiedlają Propionibacterium spp.
Na błonach śluzowych bytują zarówno bakterie gramdodatnie jak
i gramujemne. Na przykład w drogach oddechowych są to przede
wszystkim gramdodatnie ziarenkowce (rodzaje Staphylococcus
i Streptococcus) i pałeczki Corynebacterium spp., ale także gramujemne:
ziarenkowce (rodzaje Neisseria i Moraxella) i pałeczki (rodzaje
Haemophilus i Bordetella).
Większość gatunków bytujących na skórze i błonach śluzowych stanowi
florę fizjologiczną, lecz mogą tam się znaleźć również gatunki
chorobotwórcze. Występowanie ich u osób zdrowych nazywamy
nosicielstwem.
W przebiegu infekcji powodowanych przez bakterie może dojść do
bakteriemii – przedostania się bakterii do krwi. Może to być sytuacja
przejściowa i bezobjawowa, ale może również doprowadzić do
niebezpiecznej dla życia posocznicy (sepsy). Jest to ogólnoustrojowa
103
reakcja zapalna organizmu na zakażenie, która może prowadzić do
wstrząsu septycznego, czyli zespołu niewydolności wielonarządowej
MODS (ang. multiple organ dysfunction syndrome) objawiającego się
m.in. niewydolnością krążenia, oddychania, czynności wątroby i nerek.
Rodzaj Staphylococcus – gronkowce
S. aureus (gronkowiec złocisty) – chorobotwórczy, występuje u nosicieli
na skórze (głównie przedsionek nosa) i śluzówkach, w środowisku
nieożywionym (żywność, kurz).
S. epidermidis (gronkowiec naskórkowy) – komensal, składnik
fizjologicznej mikroflory skóry i błon śluzowych, patogen oportunistyczny.
S. saprophyticus (gronkowiec saprofityczny) - występuje w środowisku
nieożywionym i na skórze – patogen oportunistyczny.
Liczne inne gatunki gronkowców – komensale i saprofity, mogą być
patogenami oportunistycznymi.

Komórki gronkowców są formami kulistymi, często tworzącymi
nieregularne układy przypominające grona. Są gramdodatnie.
 Gronkowce namnażają się dobrze na prostych pożywkach (np. bulion,
agar odżywczy), w warunkach normalnej atmosfery. Są względnymi
beztlenowcami i wytwarzają katalazę. Kolonie S. aureus mają często
barwę żółtą do pomarańczowej, kolonie pozostałych gatunków są
białe lub szarawe. Na agarze z krwią kolonie S. aureus otoczone są
strefą hemolizy typu β, pozostałe gatunki przeważnie nie hemolizują
krwinek.
Gronkowce tolerują duże stężenia NaCl i innych soli w pożywce
(halotoleranty), co wykorzystuje się do ich izolacji z materiałów
klinicznych, próbek żywności i preparatów farmaceutycznych. Pożywki
stosowane w tym celu to podłoża: Chapmana i Baird Parkera. Gronkowce
mogą długo przeżywać w środowisku, są oporne na wysychanie.
104
Gronkowiec złocisty wytwarza koagulazę – enzym powodujący krzepnięcie
osocza „cytrynianowego”, w którym normalny proces krzepnięcia jest
zahamowany związaniem jonów wapnia przez cytrynian. Wykrywanie
koagulazy jest najważniejszą cechą odróżniającą S.aureus od innych
gatunków tego rodzaju, które nazywane są gronkowcami
koagulazoujemnymi CNS (ang. coagulase-negative staphylococci).
 Staphylococcus
aureus
może
wytwarzać
liczne
czynniki
chorobotwórczości związane ze strukturą komórki (np. białko A) oraz
zewnątrzkomórkowe enzymy pełniące rolę inwazyn (np. koagulaza,
leukocydyna, hemolizyny) jak też toksyny immunomodulujące.
Poszczególne szczepy mogą różnić się zdolnością wytwarzania
czynników chorobotwórczości lub stopniem ich ekspresji.
S.aureus wywołuje: ropne zapalenia skóry i tkanki podskórnej (liszajec
zakaźny, czyraki, ropnie), infekcje głębokie (sepsa, zapalenie płuc,
zapalenie szpiku kostnego) oraz choroby o charakterystycznym obrazie
wynikającym z działania odpowiednich toksyn immunomodulujących:
enterotoksyny, toksyny epidermolitycznej i toksyny zespołu wstrząsu
toksycznego TSST-1 (ang. toxic shock syndrome toxin).
Enterotoksyny gronkowcowe są przyczyną zatruć pokarmowych
objawiających się wymiotami i biegunką (rzadziej), już w kilka godzin
po spożyciu pokarmu zawierającego jedną lub kilka tych toksyn. Są one
ciepłostabilne i niewrażliwe na działanie enzymów żołądka i jelit.
Toksyna epidermolityczna (eksfoliatyna) powoduje zespół skóry oparzonej
noworodków SSS (ang. scalded skin syndrome). Są to rozległe zapalne
zmiany na skórze pod postacią rumieni i pęcherzy spotykane także
u starszych dzieci i osób dorosłych.
Toksyna TSST-1 wywołuje zespół wstrząsu toksycznego TSS (ang. toxic
shock syndrome), zespół ciężkich objawów, który może prowadzić do
śmierci.
 Gronkowce złociste występujące u nosicieli mogą być przyczyną
zakażeń endogennych, a także przenosić się na inne osoby lub
przedostawać do żywności, kosmetyków bądź preparatów
farmaceutycznych podczas ich produkcji.
105


Staphylococcus epidermidis może być przyczyną, najczęściej
szpitalnych, infekcji oportunistycznych (zapalenie wsierdzia i sepsa)
szczególnie u osób z implantami z tworzyw sztucznych (np. sztuczne
zastawki serca).
Staphylococcus saprophyticus bywa przyczyną infekcji układu
moczowego przeważnie u młodych kobiet, których źródłem może być
kolonizacja tymi bakteriami przewodu pokarmowego.,
Rodzaj Streptococcus – paciorkowce
S. pyogenes (paciorkowiec ropotwórczy) – chorobotwórczy, może
występować u nosicieli na błonach śluzowych jamy nosowo-gardłowej.
S. agalactiae (paciorkowiec bezmleczności) – chorobotwórczy, występuje
jako komensal na śluzówce układu oddechowego i dróg rodnych kobiet.
S. pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc, pneumokok) – chorobotwórczy,
występuje u nosicieli na błonach śluzowych układu oddechowego.
Paciorkowce jamy ustnej – szereg gatunków bytujących jako komensale
na śluzówce jamy ustnej i układu oddechowego należących do kilku
odrębnych genetycznie grup (Mitis, Mutans, Salivarius, Anginosus);
patogeny oportunistyczne.


Komórki paciorkowców są okrągłe lub owalne, tworzą układy
w postaci łańcuszków lub dwoinek. Są gramdodatnie. S. pneumoniae
tworzy w organizmie zakażonym wielocukrową otoczkę obejmującą
dwie komórki.
Paciorkowce wymagają do wzrostu pożywek wzbogaconych (np. agar
z krwią). Są względnymi beztlenowcami, nie wytwarzają katalazy, co
odróżnia je od gronkowców. Na agarze z krwią kolonie S. pyogenes
i S. agalactiae otoczone są strefą hemolizy typu β, natomiast
S. pneumoniae i większość paciorkowców jamy ustnej powoduje
106

hemolizę typu α. Te ostatnie popularnie nazywane są z tego względu
„paciorkowcami zieleniącymi”.
Na podstawie budowy antygenowej składników ściany komórkowej
został stworzony podział paciorkowców na oznaczone literami
alfabetu grupy serologiczne (schemat wg Lancefield), bardzo pomocny
w identyfikacji tych bakterii.

Streptococcus pyogenes (grupa A) wytwarza szereg czynników
warunkujących chorobotwórczość: główny czynnik zjadliwości –
związane
z komórką białko M, hialuronową otoczkę,
zewnątrzkomórkowe
enzymy
(streptokinazę,
hialuronidazę,
deoksyrybonukleazę) i toksyny: hemolizyny (streptolizyna O
i streptolizyna S) oraz toksyny pirogenne (erytrogenne) SPE (ang.
streptococcal pyrogenic exotoxins).
Streptococcus pyogenes powoduje różnorodne choroby. Są to ropne
zapalenia skóry i tkanki podskórnej (liszajec zakaźny, róża, martwicze
zapalenie powięzi), zapalenie gardła i migdałków (angina), ucha
środkowego, płuc, sepsa, gorączka połogowa (zakażenie macicy po
porodzie), płonica (szkarlatyna). Jest także przyczyną chorób wtórnych,
nieropnych,
będących
następstwem
pierwotnych
infekcji
paciorkowcowych. Są to gorączka reumatyczna (zapalenie mięśnia
i zastawek serca, zapalenie stawów), ostre kłębuszkowe zapalenie nerek
oraz rumień guzowaty (guzkowate zmiany podskórne). Następstwem
wymienionych chorób wtórnych, które są efektem reakcji
immunologicznych organizmu na antygeny paciorkowcowe, mogą być
m.in. wady zastawkowe serca i niewydolność nerek.
Liszajec zakaźny objawia się jako ropne pęcherzyki przekształcające się
w miodowożółte strupy na powierzchni skóry, najczęściej twarzy, karku
i rąk. Często jest to infekcja mieszana powodowana jednocześnie przez
S. pyogenes i S. aureus.
Róża objawia się żywoczerwonym rumieniem i obrzękiem skóry i tkanki
podskórnej, umiejscowionym najczęściej na kończynach dolnych lub
twarzy. Towarzyszy temu bardzo wysoka gorączka.
Martwicze zapalenie powięzi to groźne dla życia ropne zapalenie tkanki
łącznej podskórnej obejmujące powięź, ścięgna i czasem mięśnie,
107
powodowane przez szczepy S.pyogenes wytwarzające toksynę
erytrogenną B (SPE B).
Płonica (szkarlatyna) jest zakaźną chorobą wieku dziecięcego, przenoszącą
się podobnie jak angina, drogą kropelkową lub pokarmową. Oprócz
objawów zapalenia gardła występuje tu drobnoplamista wysypka, za którą
odpowiedzialna jest toksyna erytrogenna A (SPE A). Ta sama toksyna
powoduje objawy wstrząsu toksycznego, podobne do objawów TSS
wywołanego przez S. aureus.

Streptococcus agalactiae (grupa B) – czynniki chorobotwórczości tego
paciorkowca to: otoczka, zewnątrzkomórkowe enzymy i hemolizyny.
S. agalactiae jest przede wszystkim przyczyną groźnych zakażeń
u noworodków i niemowląt – sepsy, zapalenia opon mózgowordzeniowych i płuc, dlatego powinien być eliminowany u kobiet
ciężarnych przed porodem. U zwierząt hodowlanych powoduje on
ropne zapalenie gruczołu mlekowego, stąd jego nazwa.

Streptococcus pneumoniae – głównym czynnikiem chorobotwórczości
jest wielocukrowa otoczka. Inne ważne czynniki to: hemolizyna
(pneumolizyna) oraz enzymy pełniące funkcje inwazyn.
Choroby wywoływane przez pneumokoki to: płatowe zapalenie płuc,
zapalenie oskrzeli, zatok, ucha środkowego, bakteryjne (ropne) zapalenie
opon mózgowo-rdzeniowych (jest obok Haemophilus influenzae
i Neisseria meningitidis jego najczęstszą przyczyną) i sepsa. Według
najnowszych danych infekcje powodowane przez S.pneumoniae są
odpowiedzialne za najwięcej zgonów na świecie (spośród chorób
infekcyjnych). U dorosłych jest to zapalenie płuc, a u dzieci poniżej
drugiego roku życia ropne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i sepsa.

Paciorkowce jamy ustnej mogą wywoływać oportunistyczne
zakażenia, najczęściej sepsę i zapalenie wsierdzia u osób z obniżoną
odpornością, zwykle po inwazyjnych zabiegach w obrębie jamy ustnej
(usunięcie zęba, migdałków). Paciorkowce z grupy Mutans biorą udział
w powstawaniu płytki nazębnej i próchnicy zębów.
108
Rodzaj Corynebacterium – maczugowce
C. diphtheriae (maczugowiec błonicy) - chorobotwórczy, może
występować u nosicieli na skórze, śluzówkach nosa i gardła.
C. pseudodiphtheriticum (maczugowiec rzekomobłoniczy) - komensal
bytujący na błonach śluzowych układu oddechowego (flora fizjologiczna),
może być oportunistycznym patogenem.
C. urealyticum – bytuje na skórze i błonach śluzowych górnych dróg
oddechowych, może być przyczyną zakażeń układu moczowego;
wielooporne szczepy mogą być przyczyną zakażeń szpitalnych.
C. jeikeium – występuje na skórze stanowiąc naturalną florę, ale może też
być przyczyną ciężkich infekcji szpitalnych (szczepy wielooporne).



Komórki maczugowców mają postać pałeczek czasem zgrubiałych na
końcu. Są gramdodatnie. Tworzą układy przypominające litery X,V,Y
lub palisady (komórki ułożone równolegle). Charakterystyczna jest
obecność
w
komórkach
metachromatycznych
ziaren
polifosforanowych (wolutyna), które można obserwować, barwiąc
preparat metodą Neissera.
Maczugowce wymagają do wzrostu pożywek wzbogaconych. Najlepiej
namnażają się na podłożu Loefflera. Większość gatunków to względne
beztlenowce. Wszystkie wytwarzają katalazę.
Corynebacterium
diphtheriae
wytwarza
zewnątrzkomórkową
cytotoksynę (toksynę błoniczą) uszkadzającą mięsień, sercowy, nerki
i nerwy obwodowe. C. diphtheriae wywołuje błonicę (dyfteryt) układu
oddechowego lub skóry. Najczęściej zmiany zapalne (szare naloty –
błony rzekome) dotyczą błony śluzowej gardła, migdałków, czasem
krtani. Maczugowce namnażają się w miejscu wtargnięcia, a toksyna
przenika do krwiobiegu, uszkadzając funkcje narządów wewnętrznych.
Do zakażenia dochodzi drogą kropelkową od osób chorych lub
nosicieli. W Polsce obecnie błonica występuje rzadko. Zachorowania
109
najczęściej notuje się w krajach słabo rozwiniętych, gdzie nie
wprowadzono powszechnie szczepień.

Corynebacterium pseudodiphtheriticum jest składnikiem fizjologicznej
flory błon śluzowych nosa i gardła, ale może też być przyczyną
groźnych zakażeń oportunistycznych (zapalenie wsierdzia po
wszczepieniu sztucznych zastawek serca, błoniczopodobne zapalenie
gardła, zapalenia układu oddechowego i układu krążenia).
Liczne gatunki zasiedlające skórę, układ moczowo-płciowy i układ
oddechowy (flora fizjologiczna); mogą być przyczyną różnych zakażeń
oportunistycznych, a także zakażeń szpitalnych, gdyż łatwo pozyskują geny
oporności. Należą do nich lipofilne gatunki:
 Corynebacterium urealyticum, który wytwarza bardzo aktywną ureazę,
powodującą silną alkalizację moczu i wytrącanie się odkładających się
w pęcherzu kryształów fosforanowych. Może on też przyczyniać się do
powstawania kamieni nerkowych. Szczepy wielooporne powodować
mogą szpitalne zakażenia układu moczowego, wsierdzia, szpiku i kości,
ran oraz tkanek miękkich.

Corynebacterium jeikeium, którego wielooporne szczepy mogą być
przyczyną posocznicy, zapalenia kości i szpiku, zakażeń ran i otrzewnej
spotykanych głównie u pacjentów z obniżona odpornością.
Rodzaj Propionibacterium
P. acnes – komensal, składnik fizjologicznej mikroflory skóry, szczególnie
okolic bogatych w gruczoły łojowe. Patogen oportunistyczny.

Polimorficzne, pałeczkowate komórki P. acnes tworzą układy przypominające litery X,V,Y, podobne do maczugowców. Są gramdodatnie.
110

Pałeczki Propionibacterium wymagają do wzrostu pożywek
wzbogaconych (np. agar z krwią). Są mikroaerofilami, lecz najlepiej
namnażają się w warunkach beztlenowych. Większość szczepów
wytwarza katalazę.

Propionibacterium acnes wytwarza szereg zewnątrzkomórkowych
enzymów (np. lipaza) odpowiedzialnych za zmiany chorobowe.
P. acnes wywołuje zapalenie mieszków włosowych oraz trądzik
pospolity, może też być przyczyną zakażeń oportunistycznych
w obrębie układu krążenia (np. zapalenie wsierdzia), spowodowanych
wszczepieniem biomateriałów (sztuczne zastawki serca, endoprotezy,
cewniki wewnątrznaczyniowe), które łatwo mogą być kolonizowane
przez te bakterie pochodzące ze źródeł endogennych.
Rodzaj Neisseria
N. gonorrhoeae (dwoinka rzeżączki, gonokok) – chorobotwórcza.
N. meningitidis (dwoinka nagminnego zapalenia opon mózgowordzeniowych, meningokok) – chorobotwórcza; występuje u nosicieli
na śluzówkach gardła.
Inne gatunki bytujące na błonach śluzowych dróg oddechowych i układu
moczowo-płciowego są w składzie normalnej flory.


Komórki rodzaju Neisseria są owalne (fasolkowate), ułożone
równolegle tworzą pary (dwoinki) lub układy nieregularne.
Są gramujemne. Preparaty mikroskopowe z materiałów klinicznych
(np. wydzielina ropna z cewki moczowej, płyn mózgowo-rdzeniowy)
mają charakterystyczny wygląd - liczne dwoinki wewnątrz
granulocytów.
Gonokoki i meningokoki mają duże wymagania pokarmowe. Hoduje
się je na specjalnych pożywkach bogatych w białko (podłoże Roiron –
gonokoki) lub agarze z krwią, agarze czekoladowym – meningokoki
111
w atmosferze tlenowej wzbogaconej dodatkiem CO2. Są tlenowcami,
wytwarzają katalazę i oksydazę. Są bardzo wrażliwe na wysychanie.

Chorobotwórczość Neisseria gonorrhoeae determinują: fimbrie, białka
błonowe, otoczka, lipooligosacharyd LOS i enzymy (proteaza IgA1).
N. gonorrhoeae wywołuje rzeżączkę – chorobę szerzącą się głównie drogą
płciową. U noworodków może występować rzeżączkowe zapalenie gałki
ocznej (choroba przeniesiona od matki podczas porodu).
Rzeżączka ostra jest ropnym zapaleniem błony śluzowej narządów
moczowo-płciowych, któremu towarzyszy ropna wydzielina. Rzeżączka
u mężczyzn wywołuje znaczne dolegliwości bólowe, u kobiet natomiast
przebieg choroby może być bezobjawowy. Rzeżączka nie leczona
przechodzi w postać przewlekłą. Zakażenie szerzy się na inne narządy
miednicy małej i może doprowadzić do bezpłodności. Bardzo rzadko
dochodzi do rzeżączkowego ropnego zapalenia stawów i uogólnionej
infekcji organizmu.

Chorobotwórczość Neisseria meningitidis warunkują również składniki
strukturalne komórki: fimbrie, białka błony zewnętrznej, LOS oraz
proteaza IgA1, a także ujemny ładunek powierzchni.
N. meningitidis przenosi się drogą kropelkową od osób chorych i nosicieli.
Jest ona, obok Haemophilus influaenzae i Streptococcus pneumoniae,
najczęstszym czynnikiem etiologicznym bakteryjnego (ropnego) zapalenia
opon mózgowo-rdzeniowych, często przebiegającego z uogólnionym
zakażeniem organizmu – sepsą meningokokową i wstrząsem septycznym.
Choroba ta może szerzyć się epidemicznie i charakteryzuje się bardzo dużą
śmiertelnością. Sepsę meningokokową charakteryzuje krwotoczna
wysypka (z wybroczynami); mogą również wystąpić zmiany martwicze w
skórze. W Polsce w zakażeniach meningokokami dominują serotypy B i C
(epidemiczny).
112
Rodzaj Moraxella
M. catarrhalis – komensal, składnik fizjologicznej mikroflory śluzówek
górnych dróg oddechowych i układu moczowo-płciowego – patogen
oportunistyczny.

Komórki Moraxella spp. mają postać owalnych ziarenek lub krótkich
pałeczek. Są gramujemne. Układają się w pary podobne do
Neisseria spp.
 Mogą się mnożyć na prostych podłożach w warunkach tlenowych. Są
tlenowcami, wytwarzają katalazę i oksydazę.
 Podobnie jak u Neisseria spp., chorobotwórczość Moraxella spp.
determinują elementy struktury komórki (fimbrie, otoczka, białka
błonowe, LOS). Poza tym większość szczepów klinicznych wytwarza
β-laktamazy.
Moraxella catarrhalis może wywoływać zapalenie górnych dróg
oddechowych i oskrzeli, najczęściej jako infekcje wtórne po chorobach
wirusowych, rzadziej inne oportunistyczne infekcje.
Rodzaj Haemophilus
H. influenzae (pałeczka grypy) – komensal, składnik normalnej mikroflory
śluzówek górnych dróg oddechowych (szczepy bezotoczkowe);
chorobotwórczy (szczepy otoczkowe, głównie serotyp b).
H. parainfluenzae – komensal składnik normalnej mikroflory śluzówek
górnych dróg oddechowych, rzadko oportunistyczny patogen.

Haemophilus to polimorficzne pałeczki (od form ziarenkowatych do
nitkowatych). Są gramujemne Niektóre szczepy H. influenzae mają
113


otoczkę polisacharydową; wyróżnia się 6 głównych serotypów
otoczkowych (od a do f).
Pałeczki Haemophilus wymagają do wzrostu specjalnych pożywek
zawierających czynniki wzrostowe: X – hemina lub hematyna i V –
nukleotyd difosfopirydynowy (NAD), np. agar czekoladowy.
H. influenzae wymaga obu czynników, a H. parainfluenzae tylko
czynnika V. Haemophilus spp. są względnymi beztlenowcami.
Chorobotwórczość Haemophilus influenzae jest uwarunkowana
głównie obecnością otoczki, fimbrii, lipooligosacharydu (LOS) oraz
proteaz IgA. Szczepy otoczkowe (przede wszystkim serotyp b)
wywołują ciężkie w przebiegu choroby, przeważnie u małych dzieci. Są
to: ropne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (obok Streptococcus
pneumoniae i Neisseria meningitidis) z sepsą, zapalenie nagłośni,
zapalenie stawów, kości i szpiku. Zapalenie nagłośni jest szczególnie
niebezpieczne dla małych dzieci (poniżej 7. roku życia), ponieważ grozi
uduszeniem.
Szczepy bezotoczkowe bywają przyczyną zapaleń
oskrzeli i płuc oraz ucha i zatok. Na ogół są to powikłania po
przebytych wcześniej infekcjach wirusowych, np. po grypie.
Rodzaj Bordetella
B. pertussis (pałeczka krztuśca) – chorobotwórcza.
B. parapertussis (pałeczka rzekomokrztuścowa) - chorobotwórcza.
B. bronchiseptica (pałeczka oskrzelowa) - chorobotwórcza.


Pałeczki Bordetella są bardzo drobne, prawie ziarenkowate. Są
gramujemne. Świeżo wyizolowane od chorego mają otoczkę.
Bordetella pertussis wymaga do wzrostu podłoży wzbogaconych
dodatkiem krwi (np. podłoże Bordeta-Gengou). Pozostałe gatunki
można hodować na podłożach prostych. Są tlenowcami. Są bardzo
wrażliwe na wysychanie.
114

Chorobotwórczość Bordetella pertussis jest głównie uwarunkowana
białkową toksyną krztuścową (pertussigen). Bakterie te wytwarzają
także czynnik warunkujący kolonizację śluzówek oskrzeli - pertaktynę
oraz inne toksyny odpowiedzialne za obraz kliniczny choroby w tym:
cytotoksynę tchawiczą i LPS.
B.pertussis wywołuje krztusiec (koklusz). Pozostałe gatunki są przyczyną
krztuścopodobnego zapalenia oskrzeli o łagodniejszym przebiegu.
Krztusiec jest zakaźną chorobą wieku dziecięcego. Przenosi się drogą
kropelkową. Choroba charakteryzuje się gwałtownymi napadami kaszlu,
prowadzącymi często do wymiotów.
Metody
Podłoża do izolacji gronkowców
Podłoże Chapmana - zawiera 7,5% NaCl, co hamuje wzrost licznych
bakterii, głównie gramujemnych. Rozkład zawartego w podłożu mannitolu
pozwala na różnicowanie gatunków wewnątrz rodzaju Staphylococcus.
Gatunki rozkładające mannitol (np. S. aureus) tworzą żółte kolonie
i zabarwiają na żółto wyjściowo różowe podłoże. Podłoże stosowane jest
do poszukiwania gronkowców w materiałach klinicznych.
Podłoże Baird–Parkera - zawiera chlorek litu i telluryn sodu powodujące
częściowe zahamowanie wzrostu większości bakterii gramujemnych
i gram dodatnich, poza gronkowcami. Redukcja tellurynu sodowego
powoduje czarne zabarwienie kolonii S. aureus, w odróżnieniu od innych
gatunków tego rodzaju, których kolonie mają barwę szarą. Dodatek
zemulgowanego żółtka jaja kurzego pozwala na wykrycie zdolności do
wytwarzania przez szczepy gronkowców enzymów takich, jak lipaza
i fosfolipaza (zmętnienie pożywki wokół kolonii) oraz proteazy (strefa
przejaśnienia wokół kolonii). Podłoże to stosowane jest głównie do
wykrywania gronkowców w żywności i w preparatach farmaceutycznych.
Próba na koagulazę
Identyfikacja gatunków gronkowców sprowadza się najczęściej do ich
różnicowania na koagulazododatnie (wytwarzające koagulazę) gronkowce
115
złociste (S. aureus) i gronkowce koagulazoujemne (np. S.epidermidis,
S.saprophyticus). Koagulaza to enzym przekształcający fibrynogen osocza
krwi w fibrynę.
Wykonanie próby
 Pełne oczko ezy badanych gronkowców należy zawiesić w niewielkiej
ilości (np. 0,5 mL) rozcieńczonego 1:5 w roztworze NaCl osocza króliczego
znajdującego się w wąskiej probówce.
 Inkubować w cieplarce 37˚C.
 Odczytywać wynik (powstanie skrzepu) po 1, 2 , 3 i 24 godzinach.
Wynik dodatni próby: postępujące w czasie wykrzepianie osocza.
Próbę tę można również wykonać przez zmieszanie 0,25mL hodowli
płynnej gronkowca z 0,25mL nierozcieńczonego osocza. Próby kontrolne
ze znanym szczepem koagulazododatnim i koagulazoujemnym należy
wykonać dla każdej nowej partii osocza.
Wytwarzanie czynnika skupiania (CF – ang. clumping factor)
Staphylococcus aureus wytwarza tzw. czynnik skupiania – związany
z powierzchnią komórki receptor dla fibrynogenu osocza. Ten,
przekształcając się w fibrynę, tworzy nici zlepiające komórki w widoczne
makroskopowo agregaty.
Wykonanie próby
 Na szkiełko podstawowe należy nanieść dwie krople wody lub
roztworu NaCl.
 W obu kroplach należy zawiesić pobrane ezą z hodowli stałej
gronkowce (zawiesina powinna wyglądać jak kropla mleka).
 Do jednej z kropli dodać uszko ezy nierozcieńczonego osocza
króliczego i zamieszać ezą.
 Wynik odczytać po 10–15 sekundach, a następnie po 3 minutach.
Wynik: pojawienie się agregatów komórek w zawiesinie z dodatkiem
osocza – próba dodatnia (obecność czynnika skupiania); brak zlepiania
komórek – próba ujemna.
Zawiesina w kropli roztworu NaCl na szkiełku powinna zostać homogenna
– jest to kontrola zawieszalności szczepu. Niektóre gronkowce zlepiają się
samoistnie w roztworze NaCl lub wodzie (tworzenie agregatów w kropli
kontrolnej) i u takich szczepów nie bada się wytwarzania CF.
116
Barwienie preparatów bakteryjnych metodą Neissera
Barwienie metodą Neissera umożliwia wykrycie w komórkach bakterii
polifosforanowych (wolutynowych) ziarnistości zapasowych. Ziarnistości
takie są charakterystyczne dla bakterii z rodzaju Corynebacterium.
W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki:
 barwnik Neissera złożony z dwóch składników łączonych bezpośrednio
przed barwieniem: alkoholowo-wodnego roztworu błękitu metylenowego
(Neisser I) i alkoholowo-wodnego roztworu fioletu krystalicznego (Neisser
II);
 wodny roztwór chryzoidyny.
Wykonanie barwienia
W barwieniu tym nie spłukujemy barwników wodą.
- Przed przystąpieniem do barwienia należy przygotować barwnik Neissera
przez zmieszanie w cylinderku: dwóch części barwnika Neisser I i jednej
części barwnika Neisser II;
- na utrwalony preparat należy nalać wymieszany barwnik;
- po 5 minutach dokładnie zlać barwnik, nie spłukiwać wodą;
- nalać na szkiełko roztwór chryzoidyny na 10-15 sekund;
- po zlaniu barwnika preparat od razu odcisnąć w bibule.
Wynik barwienia:
Ziarnistości wolutynowe są granatowoczarne, komórki – żółte.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Wykonanie próby na katalazę
- Nanieś na szkiełko podstawowe kroplę 3% H2O2.
- Zawieś w tej kropli pobrane ezą z hodowli stałej gronkowce.
Wynik próby:
Intensywne wydzielanie się pęcherzyków gazu (O2) świadczy o rozkładzie
H2O2 przez enzym katalazę.
W taki sam sposób wykonaj tę próbę z koloniami bakterii wyizolowanych
z własnych posiewów.
117
Zadanie 2
Wykonanie i badanie wymazu z nosa
- Jałowy wacik (wymazówkę) zwilż w jałowym roztworze NaCl.
- Wykonaj wymaz pocierając watką o ściany przedsionka nosa.
- Posiej pobrany materiał z wacika na agar z krwią metodą redukcyjną.
o
- Płytkę inkubuj w cieplarce w 37 C przez około 20 godzin.
- Opisz kolonie wyrosłe na płytce:
- Jaki rodzaj hemolizy wytwarzają (α, β).
Które z nich wytwarzają katalazę?
Zadanie 3
Wykonanie i badanie wymazu z jamy ustnej (badanie śliny)
- Jałową wymazówkę zwilż obficie w ślinie, dokonaj też wymazu
z powierzchni języka, dziąseł i błony śluzowej policzków.
- Posiej pobrany materiał z wacika na agar z krwią metodą redukcyjną.
Płytkę inkubuj w cieplarce w 37oC przez około 20 godzin.
118
- Opisz kolonie wyrosłe na płytce.
- Jaki rodzaj hemolizy wytwarzają (α, β).
- Które z nich wytwarzają katalazę?
Zadanie 4
Morfologia mikroskopowa bakterii izolowanych z nosa i śliny
- Wykonaj preparaty barwione metodą Grama z pierwszej strefy posiewu
(ślina)
- Wykonaj preparaty barwione metodą Grama z wybranych kolonii
(wymaz z nosa).
- Oceń bogactwo flory bakteryjnej i jej zróżnicowanie w badanych
materiałach.
119
Preparat z bakterii wyhodowanych ze śliny:
Preparat z bakterii wyhodowanych z wymazu z przedsionka nosa:
120
121
122
Rozdział 10
Bakterie w przewodzie pokarmowym
Część teoretyczna
Przewód pokarmowy człowieka w warunkach zdrowia jest zasiedlany
przez ponad 300 gatunków bakterii stanowiących florę fizjologiczną.
Właściwy skład tej flory warunkuje prawidłowe funkcjonowanie
organizmu, ponieważ bakterie te wydzielają liczne metabolity hamujące
rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych oraz zapobiegają ich
kolonizacji w jelicie, wspomagają też trawienie pokarmów wydzielając
różne enzymy, a także mają udział w syntezie niektórych witamin z grupy
B (B2, B6, B12),
witaminy K, kwasu foliowego oraz niektórych
aminokwasów.
Przełyk, żołądek i dwunastnica, a także początkowy odcinek jelita
cienkiego, nie mają stałej flory bakteryjnej. W przełyku i żołądku bakterie
pojawiają się przejściowo i pochodzą z jamy ustnej, gardła i spożywanych
pokarmów, ale nie stanowią one flory fizjologicznej. W dwunastnicy
i jelicie czczym występują tylko nieliczne bakterie ze względu na kwaśny
odczyn środowiska i szybką perystaltykę. Liczne bakterie pojawiają się
w jelicie krętym i przede wszystkim w jelicie grubym. W 1 gramie kału
znajduje się 1010-1011 komórek bakterii.
Układ pokarmowy noworodka wkrótce po porodzie zasiedlany jest przez
gramdodatnie bakterie beztlenowe i mikroaerofilne (Bifidobacterium spp.,
Lactobacillus spp.) pochodzące z dróg rodnych matki. U dzieci karmionych
naturalnie flora ta dominuje przez kilka miesięcy. Skład mikroflory
jelitowej ustala się w wieku 7-10 lat i pozostaje prawie niezmieniony
u danej osoby do starości. W jelicie grubym bytują liczne drobnoustroje,
z których około 90% to bakterie bezwzględnie beztlenowe:
 pałeczki gramujemne (dominuje tu rodzaj Bacteroides),
 ziarenkowce gramdodatnie (Peptococcus spp., Peptostreptococcus
spp.),
 pałeczki gramdodatnie (Bifidobacterium spp.),
123

laseczki (Clostridium spp.).
Pozostały odsetek stanowią bakterie względnie beztlenowe:
 pałeczki Enterobacteriaceae – rodzaje Escherichia (występuje u 100%
zdrowych ludzi), Proteus, Enterobacter, Klebsiella i inne
 paciorkowce kałowe – enterokoki – rodzaj Enterococcus.
Oprócz tych drobnoustrojów, które wchodzą w skład naturalnej flory
przewodu pokarmowego, mogą znaleźć się tam patogeny takie
jak: pałeczki Enterobacteriaceae z rodzajów Salmonella, Shigella, Yersinia,
inne bakterie chorobotwórcze z rodzajów Campylobacter, Helicobacter,
Vibrio oraz wirusy i pasożyty. Do zakażenia nimi dochodzi drogą fekalnooralną (pokarmową). Mogą one występować u osób chorych, a także
u nosicieli po przebytych infekcjach objawowych lub bezobjawowych.
Pałeczki jelitowe z rodziny Enterobacteriaceae
Jest to licząca wiele rodzajów i ponad 200 gatunków grupa pałeczek
gramujemnych, charakteryzujących się szeregiem podobieństw
i wspólnych cech dotyczących morfologii komórek i kolonii oraz cech
metabolicznych. Komórki ich są dość duże, często urzęsione (liczne
rodzaje), niektóre rodzaje mają otoczki. Większość rodzajów (np.
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella) zasiedla jelita zdrowych ludzi
i zwierząt. Inne zaś (Salmonella, Shigella, Yersinia) obejmują gatunki
bezwzględnie chorobotwórcze.
Pałeczki te mają małe wymagania pokarmowe (prototrofy), są względnymi
beztlenowcami. Można je hodować na prostych podłożach, w warunkach
normalnej atmosfery. Wszystkie rodzaje tej rodziny fermentują glukozę,
nie wytwarzają oksydazy cytochromowej i redukują azotany do azotynów.
Identyfikacja opiera się na badaniu właściwości metabolicznych
(różnicowanie rodzajów i gatunków) i określaniu cech antygenowych
lipopolisacharydu (antygen O), rzęsek (antygen H) i otoczki (antygen K).
Różnice w budowie tych antygenów pozwalają identyfikować gatunki,
serotypy lub serowary. Najważniejsze cechy metaboliczne bada się
posiewając na tzw. szereg izolacyjny – szereg pożywek pozwalających
wykryć: fermentację laktozy (laktoza pod parafiną), wytwarzanie indolu
124
z tryptofanu, rozkład mocznika (ureaza), wytwarzanie siarkowodoru
i dodatkowo fermentację laktozy i glukozy na podłożu Kliglera
(powtórzenie próby na rozkład laktozy na różnych podłożach pozwala
ocenić tę cechę w warunkach zróżnicowanego dostępu do tlenu). Do
izolacji pałeczek jelitowych wykorzystuje się pożywki stałe zawierające
najczęściej laktozę. Zdolność fermentacji tego cukru jest najważniejszą
cechą różnicującą między sobą rodzaje należące do rodziny
Enterobacteriaceae.
Rodzaj Escherichia
E. coli (pałeczka okrężnicy) – jest komensalem, czyli stałym, choć
nie najliczniejszym składnikiem flory jelitowej u ludzi i zwierząt.
Z powodu występowania E. coli w każdej próbce kału, pałeczka ta jest
uznawana za drobnoustrój wskaźnikowy w mikrobiologii sanitarnej,
badaniach żywności i w mikrobiologii farmaceutycznej (badanie czystości
mikrobiologicznej leków).
E. coli rozkłada laktozę i wytwarza indol, co ułatwia jej wykrywanie
i identyfikację.
 Szczepy
zasiedlające
jelito
mogą
wywoływać
zakażenia
oportunistyczne, gdy znajdą się w organizmie poza naturalnym
miejscem bytowania. Najczęściej powodują infekcje w obrębie układu
moczowego (szczepy uropatogenne) oraz (rzadziej) zapalenie opon
mózgowo-rdzeniowych u noworodków, zapalenie pęcherzyka
żółciowego, ucha środkowego i płuc.
 Szczepy uropatogenne – UPEC (ang. uropathogenic E. coli) mają
szczególną zdolność przylegania do nabłonka dróg moczowych (fimbrie P).
Dysponują też cytolizyną (hemolizyna).
O zakażeniu układu moczowego świadczy bakteriuria znamienna, tzn. taka
liczba żywych bakterii w 1 mL moczu, którą przyjmuje się jako kryterium
trwającej infekcji. Dla E. coli, u pacjentów z objawami klinicznymi jest to
wartość równa lub większa niż 103 komórek/mL. Po stwierdzeniu
125
bakteriurii znamiennej należy zidentyfikować wyhodowane bakterie
i określić ich wrażliwość na antybiotyki.
 W obrębie gatunku E. coli występują serotypy chorobotwórcze,
wywołujące różne postacie biegunek, zależne od wytwarzanych przez
poszczególne serotypy toksyn i innych czynników chorobotwórczości.
Chorobotwórcze serotypy Escherichia coli to:
 ETEC (enterotoksynogenne) – wytwarzają ciepłochwiejne (LT-I
i LT-II) i ciepłostałe (ST-I i ST-II) enterotoksyny oraz adhezyny (CFA/I, CFA/II
i adhezyna „tworząca wiązki”), kolonizują jelito cienkie, wywołują tzw.
biegunki podróżnych i biegunki u dzieci (tzw. cholerę dzieci) – wodnista
biegunka, wymioty;

EIEC (enteroinwazyjne) – nie wytwarzają toksyny, wnikają do
komórek nabłonka jelita grubego i mnożąc się w nich, wywołują biegunki
czerwonko-podobne – biegunka wodnista z krwią, wymioty, gorączka;

EPEC (enteropatogenne) – wnikają do komórek nabłonka jelita
cienkiego, uszkadzając ich strukturę; są odpowiedzialne za biegunki
niemowląt – biegunka śluzowo-wodnista, gorączka;

VTEK/STEK (werotoksynogenne dawniej EHEC enterokrwotoczne)
– wytwarzają ciepłostałą cytolizynę - werotoksynę VT podobną do
toksyny pałeczki czerwonki; powodują zagrażające życiu: krwotoczne
zapalenie jelita grubego, zespół mocznicowo-hemolityczny, niewydolność
nerek, zaburzenia neurologiczne,

EAEC, EAggEC (enteroagregacyjne) – wytwarzają toksynę, ulegają
autoagregacji, kolonizują jelito cienkie i pobudzają je do wytwarzania
znacznych ilości śluzu; wywołują przewlekłe biegunki u dzieci i dorosłych
w krajach słabo rozwiniętych.
126
Rodzaj Shigella
S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei (pałeczki czerwonki) –
chorobotwórcze, mogą występować w jelicie grubym u nosicieli.
Nie rozkładają laktozy. Mają zdolność przeżywania przez wiele godzin
w pH 2,5. W identyfikacji gatunków wykorzystuje się testy serologiczne
oparte o różnice w budowie antygenu somatycznego O. Nie mają rzęsek.
 Chorobotwórczość pałeczek czerwonki jest związana z ich zdolnością
wnikania i niszczenia komórek nabłonka jelita grubego, co prowadzi
do powstawania owrzodzeń i biegunki. Kał zawiera krew (stąd nazwa
choroby – czerwonka), śluz i ropę. Biegunce towarzyszą silne bóle
brzucha i gorączka. S. dysenteriae wytwarza silną toksynę, podobną
w działaniu do toksyny E. coli VTEC i toksyny Vibrio cholerae. W Polsce
czerwonkę wywołuje najczęściej S. sonnei. Pałeczki Shigella atakują
wyłącznie ludzi, przenosząc się drogą fekalno-oralną („choroba
brudnych rąk”).
Rodzaj Salmonella
Spośród dwóch wyodrębnionych na podstawie badań genetycznych
gatunków, choroby u ludzi wywołują szczepy należące do S. enterica
subsp. enterica, który obejmuje ponad 2500 odmian serologicznych
zwanych serowarami. Tradycyjnie serowary te często noszą nazwy
dawnych gatunków, lecz inaczej się je zapisuje:
Salmonella Typhi (pałeczka duru brzusznego),
Salmonella Typhimurium (pałeczka duru mysiego),
Salmonella Enteritidis (pałeczka salmonelozy).
Pałeczki te są chorobotwórcze, mogą występować też w przewodzie
pokarmowym u nosicieli. Nosicielstwo może trwać wiele lat.
127
Pałeczki Salmonella są urzęsione, nie rozkładają laktozy, nie wytwarzają
indolu, wytwarzają siarkowodór. Identyfikacja serowarów wymaga
zastosowania testów serologicznych.
 Głównym czynnikiem chorobotwórczości pałeczek Salmonella jest LPS;
ważną rolę spełniają cechy metaboliczne umożliwiające przeżycie
w kwaśnym środowisku żołądka i w komórkach makrofagów oraz
inwazyny warunkujące kolonizację i penetrację nabłonka jelita
cienkiego. Do zakażenia dochodzi drogą fekalno-oralną od osoby
chorej lub nosiciela, a także poprzez zakażoną fekaliami wodę albo
żywność produkowaną w niehigienicznych warunkach. Źródłem
pałeczek Salmonella mogą być też skażone produkty spożywcze
(mięso, jaja, produkty mleczne) pochodzące od zwierząt hodowlanych,
u których bakterie te bytują w przewodzie pokarmowym.
 S. Typhi wywołuje dur brzuszny – chorobę uogólnioną, o specyficznej
patogenezie i przebiegu klinicznym, występującą tylko u ludzi.
 Pozostałe serowary wywołują salmonelozy: zapalenia błony śluzowej
jelita cienkiego i grubego w postaci inwazyjnych zatruć pokarmowych
tzw. toksykoinfekcji. Objawiają się one śluzowo-krwawą biegunką,
której towarzyszy wysoka gorączka, często znaczne odwodnienie oraz
zaburzenia elektrolitowe. Niekiedy może dojść do sepsy (u dzieci),
zapalenia płuc, opon mózgowo-rdzeniowych i kości. Pałeczki
Salmonella są najczęstszym czynnikiem etiologicznym zatruć
pokarmowych w Polsce, dur brzuszny natomiast występuje rzadko.
Rodzaj Yersinia
Y. pestis (pałeczka dżumy) – chorobotwórcza.
Y. enterocolitica subsp. enterocolitica (pałeczka
chorobotwórcza.
Naturalnym rezerwuarem tych bakterii są zwierzęta.
jersiniozy)
–
128
Yersinia to najmniejsze pałeczki spośród rodziny Enterobacteriaceae,
często mają postać ziarenek. Nie rozkładają laktozy.
 Czynnikami chorobotwórczości u obu gatunków są adhezyny Yad oraz
toksyczne i transportowe białka ściany komórkowej YOP (ang. Yersinia
outer proteins).
 Yersinia pestis wytwarza ponadto pestycynę, aktywator plazminogenu
i koagulazę odpowiedzialne za dramatyczny przebieg choroby –
dżumy, która jest śmiertelną chorobą („czarna śmierć”). Pałeczka
dżumy jest zaliczana do czynników biologicznych największego
zagrożenia (kategoria A). Była w przeszłości i może być wykorzystana
jako broń biologiczna. Dżuma obecnie nie występuje w Europie.
 Yersinia enterocolitica wytwarza enterotoksynę ST i inwazyny.
Y. enterocolitica wywołuje biegunki, którym towarzyszy gorączka
i zapalenie węzłów chłonnych jamy brzusznej. Choroba ta częściej
występuje u niemowląt i małych dzieci.
 Choroby wywoływane przez pałeczki Yersinia są zoonozami. Dżuma
jest przenoszona na ludzi przez pchły od gryzoni (głównie szczury),
a od osób chorych drogą kropelkową. Y. enterocolitica może
występować w produktach spożywczych pochodzenia zwierzęcego
(mleko) i zakażenie nią dokonuje się droga pokarmową. Pałeczki te
mają zdolność mnożenia się w żywności przechowywanej w lodówce.
Rodzaj Klebsiella
K. pneumoniae subsp. pneumoniae (pałeczka zapalenia płuc) i K. oxytoca
– oba gatunki występują w składzie normalnej flory jelita grubego; bywają
przyczyną zakażeń oportunistycznych.
Pałeczki Klebsiella charakteryzuje obecność grubej wielocukrowej otoczki
(pałeczki otoczkowe), wytwarzanej również w hodowli na pożywkach.
Można ją wykryć barwiąc preparat metodą pozytywno-negatywną.
Pałeczki Klebsiella rozkładają laktozę.
129

Czynniki chorobotwórczości tych pałeczek to otoczka, LPS, białkowe
adhezyny. Bakterie te wywołują zakażenia oportunistyczne:
odoskrzelowe zapalenie płuc, infekcje dróg moczowych. Szczególnie
groźne są zakażenia szpitalne noworodków przebiegające pod
postacią sepsy.
Rodzaj Enterobacter
Pałeczki te rozkładają laktozę. Bakterie tego rodzaju występują
w środowisku nieożywionym, rzadziej w przewodzie pokarmowym u ludzi.
Są oportunistycznymi patogenami, będącymi jednym z częstych czynników
etiologicznych zakażeń szpitalnych (szczególnie Enterobacter cloacae),
takich jak sepsa, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zakażenia ran,
ponieważ często są oporne na środki dezynfekcyjne.
Rodzaj Serratia
S. marcescens (pałeczka cudowna) – bytuje głównie w środowisku jako
saprofit, lecz może być również składnikiem flory jelitowej ludzi i zwierząt
(komensal). Wywołuje oportunistyczne zakażenia szpitalne.
Serratia marcescens nie rozkłada laktozy. Hodowana w temperaturze
pokojowej wytwarza czerwony barwnik – prodigiozynę, zabarwiający
kolonie. Pałeczki z rodzaju Serratia są urzęsione.
 Przyczyną infekcji tymi pałeczkami (sepsa, infekcje dróg moczowych,
zapalenie wsierdzia) może być skażenie sprzętu szpitalnego (np.
cewniki, rurki tracheostomijne), roztworów środków dezynfekcyjnych
i płynów do mycia rąk.
130
Rodzaj Proteus - pałeczki odmieńca
P. mirabilis, P.vulgaris – komensale zasiedlające przewód pokarmowy
zdrowych ludzi i zwierząt; występują też w środowisku (woda, gleba).
Są oportunistycznymi patogenami.
Pałeczki te charakteryzują się, dzięki obecności licznych rzęsek, aktywnym
ruchem. Na pożywkach stałych wzrost pałeczek odmieńca jest rozpełzliwy
(mgławicowy), zasnuwający całą powierzchnię płytki. Pałeczki te nie
rozkładają laktozy, wytwarzają siarkowodór i ureazę (hydrolizują mocznik).
Ureaza jest jednym z głównych czynników chorobotwórczości pałeczek
Proteus. Wytwarzają też hemolizyny, proteazy rozkładające przeciwciała
IgA i IgG oraz składniki dopełniacza. Charakteryzują się również bardzo
szybkim namnażaniem. Najczęstszą przyczyną zakażeń klinicznych,
głównie dróg moczowych, jest P. mirabilis. Pałeczki odmieńca powodują
także zakażenia ran pooperacyjnych i pooparzeniowych.
Bakterie z innych rodzin związane z przewodem pokarmowym
Rodzaj Vibrio – przecinkowce
V. cholerae (przecinkowiec cholery) – chorobotwórczy, może występować
u nosicieli.
V. parahaemolyticus – chorobotwórczy.
Oba gatunki bytują naturalnie w zbiornikach wód słodkich
i słonych oraz organizmach w nich żyjących (ryby, skorupiaki itp.).
Przecinkowce są gramujemnymi, ruchliwymi pałeczkami o małych
wymaganiach pokarmowych. Do hodowli stosuje się pożywki proste,
131
o alkalicznym pH, które przecinkowce preferują. Są również
halotolerantami (V. cholerae) lub halofilami (V. parahaemolyticus).
Wytwarzają oksydazę w odróżnieniu od pałeczek Enterobacteriaceae.
 Najważniejszym czynnikiem chorobotwórczości Vibrio cholerae jest
enterotoksyna (choleragen) odpowiedzialna za obraz choroby –
cholery. Choroba ta jest ostrym zapaleniem błony śluzowej jelita
cienkiego manifestującym się wodnisto-śluzową biegunką („ryżowe
stolce”), bez bólów brzucha, prowadzącą do odwodnienia i zaburzeń
elektrolitowych w organizmie. Do zakażenia dochodzi drogą
pokarmową (woda, skażona żywność). Cholera charakteryzuje się
dużą śmiertelnością. Chorobę tą wywołują szczepy V. cholerae
należące do serogrupy O1, wytwarzające enterotoksynę. Cholera
występuje tylko u ludzi. Pojawia się endemicznie w niektórych krajach
Afryki, południowej Azji i Ameryki.
 Do czynników chorobotwórczości V. parahaemolyticus zalicza się m.in:
hemolizynę (hemolizyna Kanagawy), proteazy i mucynazę. Bakterie te
powodują wodnistą biegunkę, której towarzyszą wymioty, bóle
brzucha i gorączka. Przecinkowiec ten może być także przyczyną
zakażenia ran. Do biegunki dochodzi najczęściej po spożyciu surowych
skażonych „owoców morza” (ryby, kraby, ostrygi).
Rodzaj Campylobacter
C. jejuni subsp. jejuni (pałeczka kampylobakteriozy) – chorobotwórcza dla
człowieka. Naturalnym miejscem jej bytowania jest przewód pokarmowy
zwierząt
hodowlanych
(bydło,
drób)
i
dzikich.
Zdarza
się nosicielstwo u dzieci (epidemie w przedszkolach).
Campylobacter spp. są esowato zakrzywionymi, gramujemnymi
pałeczkami. Tworzą układy dwóch komórek przypominające wyglądem
skrzydło mewy. Pałeczki te hoduje się na pożywkach zawierających krew
(np. agar czekoladowy) w warunkach mikroaerofilnych i optymalnej
temperaturze 43˚C.Wytwarzają katalazę i oksydazę.
132

Chorobotwórczość Campylobacter jejuni subsp. jejuni jest
determinowana znaczną ruchliwością, oraz wytwarzaniem
enterotoksyny i cytotoksyny. C. jejuni wywołuje kampylobakteriozę –
ostre zapalenie żołądka i jelit, manifestujące się krwawą biegunką,
bólami brzucha i gorączką. Rzadziej bywa przyczyną sepsy.
Kampylobakterioza jest zoonozą. Źródłem zakażenia jest najczęściej
żywność pochodzenia zwierzęcego. Campylobacter spp. może też
przenosić się z człowieka (nosiciela lub chorego) na człowieka drogą
fekalno-oralną.
Rodzaj Helicobacter
H. pylori - może występować na błonach śluzowych żołądka i dwunastnicy
u zdrowych ludzi; jest odpowiedzialny za chorobę wrzodową żołądka
i dwunastnicy.
Są to zakrzywione gramujemne pałeczki, trudne do hodowli – wymagają
warunków mikroaerofilnych i pożywek wzbogaconych krwią oraz
temperatury 43oC.
 Chorobotwórczość Helicobacter pylori jest związana m.in. z ich
ruchliwością, adhezynami, wytwarzaniem ureazy i mucynazy oraz
działających cytotoksycznie: antygenem Cag (onkoproteina) i toksyną
wakuolizującą VacA. H.pylori jest uznany za czynnik etiologiczny
nieżytów i choroby wrzodowej żołądka oraz dwunastnicy,
w następstwie których może dojść do powstania nowotworów (np.
raka żołądka).
Rodzaj Bacteroides
B. fragilis - stanowi główny składnik (około 90%) fizjologicznej flory jelita
grubego. Jest patogenem oportunistycznym.
133
B. fragilis są drobnymi, gramujemnymi pałeczkami, posiadającymi otoczki.
Są beztlenowcami, wymagają do hodowli wzbogaconych pożywek
specjalnych (np. podłoże Schaedlera z krwią) i warunków beztlenowych.
 Chorobotwórczość B. fragilis jest uwarunkowana specyfiką warstw
powierzchniowych ich komórek, wytwarzaniem enzymów (np.
kolagenaza, hialuronidaza, lecytynaza) i toksyn (hemolizyny,
enterotoksyna – fragilizyna). B. fragilis wywołuje ropne i zgorzelinowe
stany zapalne, gdy przedostanie się z jelita grubego do innych
narządów (zapalenie wyrostka robaczkowego, otrzewnej, ropnie płuc,
jajników, wątroby), a także sepsę. Są to zakażenia endogenne. Szczepy
wytwarzające enterotoksynę powodują zatrucia pokarmowe.
Rodzaje Bifidobacterium i Lactobacillus -pałeczki kwasu
mlekowego
L. acidophilus, L. casei; Bifidobacterium spp. - komensale, składniki flory
fizjologicznej przewodu pokarmowego (głównie u niemowląt) i pochwy
dorosłych kobiet.
Oba rodzaje to gramdodatnie polimorficzne pałeczki. Bifidobacterium spp.
to bakterie beztlenowe, Lactobacillus spp. są względnymi beztlenowcami
lub mikroaerofilami. Oba rodzaje preferują środowisko kwaśne.
Metabolity tych pałeczek – kwasy organiczne zakwaszają środowisko
przewodu pokarmowego oraz pochwy, zapobiegając namnażaniu się
bakterii i
grzybów chorobotwórczych. Gatunki Lactobacillus
i Bifidobacterium bytujące w pochwie tradycyjnie nazywane są pałeczkami
Doederleina. U zdrowej kobiety pałeczki te występują wyłącznie lub
dominują.
Wytwarzany w przewodzie pokarmowym kwas mlekowy sprzyja
wchłanianiu wapnia. Pałeczki Bifidobacterium syntetyzują witaminy B1, B2
i K oraz uwalniają kwas mlekowy w wyniku rozkładu glikogenu ze
złuszczonego nabłonka pochwy. Pałeczki obu rodzajów wchodzą w skład
134
różnych probiotyków (np. Lakcid) stosowanych w leczeniu i profilaktyce
biegunek o różnej etiologii (m.in. po terapii antybiotykami) oraz zakażeń
pochwy.
Probiotyczne szczepy pałeczek Lactobacillus wykazują działanie
antagonistyczne wobec innych (chorobotwórczych) drobnoustrojów. Mają
też udział w regulacji mechanizmów odpornościowych, zarówno
działających miejscowo w jelicie, jak i ogólnoustrojowych. W leczeniu
zakażeń pochwy preparaty probiotyczne przywracają prawidłowy skład
mikroflory. Preparaty Lakcid i Lactovaginal zawierają pałeczki z rodzaju
Lactobacillus.
Rodzaj Clostridium – laseczki beztlenowe
Wśród licznych gatunków laseczek z rodzaju Clostridium są saprofity
bytujące w środowisku (gleba, woda, ścieki), komensale – składniki
fizjologicznej flory jelitowej ludzi i zwierząt oraz patogeny człowieka.
i zwierząt.
C. botulinum (laseczka jadu kiełbasianego)
C. tetani (laseczka tężca)
C. difficile (laseczka rzekomobłoniastego, poantybiotykowego zapalenia
jelit)
C. perfringens (laseczka zgorzeli gazowej)
Są to wytwarzające przetrwalniki pałeczki gramdodatnie. W preparatach
mikroskopowych mają często charakterystyczny wygląd powodowany
przez obecność okrągłych lub owalnych przetrwalników. W zależności od
umiejscowienia nadają one komórkom kształt „rakiety tenisowej”,
„pałeczki dobosza” lub „osełki”. Laseczki Clostridium hoduje się na
pożywkach specjalnych w warunkach beztlenowych. Większość gatunków
jest urzęsiona a na agarze z krwią daje hemolizę typu β .

Clostridium botulinum wytwarza w warunkach beztlenowych (np.
w konserwach) białkowe toksyny (jad kiełbasiany), które są
135
neurotoksynami powodującymi wiotkie porażenia mięśni. Toksyna
botulinowa jest ciepłochwiejna (ulega inaktywacji w temperaturze
80ºC
w ciągu 20 minut).
Choroba: botulizm jest najczęściej skutkiem zatrucia pokarmowego
toksyną obecną w produktach spożywczych, w których mnożyły się
laseczki (botulizm klasyczny). Wyróżnia się też botulizm niemowląt,
botulizm przyranny i botulizm aerogenny (po inhalacji aerozolu toksyny).
Jad kiełbasiany jest jedną z najsilniejszych trucizn, które mogą mieć
zastosowanie jako broń biologiczna. Doustna dawka śmiertelna to 1 µg/kg
masy ciała. Toksyna ta (w bardzo małych dawkach) jest stosowana
również jako pomocniczy środek leczniczy w medycynie oraz
w kosmetologii. Podaje się ją m.in. w celu zmniejszenia przykurczy mięśni
w porażeniu mózgowym i kręczu karku. W medycynie kosmetycznej
toksyna ta ma zastosowanie w likwidacji zmarszczek, a także nadmiernej
potliwości.
 Clostridium tetani wytwarza dwie toksyny: hemolizynę (tetanolizynę)
i neurotoksynę (tetanospazminę), która jest głównym czynnikiem
chorobotwórczości tych laseczek i powoduje porażenia spastyczne
mięśni szkieletowych.
Tężec jest chorobą o bardzo dużej śmiertelności. Rozwija się w wyniku
namnożenia się laseczek w ranie pourazowej zanieczyszczonej glebą, w
której znajdowały się ich przetrwalniki. Toksyna z rany przenika do
centralnego układu nerwowego i powoduje niekontrolowane, bolesne
skurcze mięśni szkieletowych całego ciała, które mogą prowadzić do
uduszenia.
Clostridium difficile bytuje w jelicie grubym u zdrowych ludzi jako składnik
normalnej flory (w niewielkiej ilości). U chorych poddawanych
długotrwałej antybiotykoterapii może dojść do namnożenia
toksynotwórczych szczepów C. difficile i choroby – poantybiotykowego
rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego.
 Chorobotwórczość tych laseczek warunkują przede wszystkim toksyny:
enterotoksyna – toksyna A i cytotoksyna – toksyna B oraz białkowa
toksyna binarna CDT. Nie wszystkie szczepy je produkują.
136
Clostridium perfringens jest gatunkiem najczęściej izolowanym spośród
grupy laseczek wywołujących zgorzel gazową. Dochodzi do niej w wyniku
przedostania się przetrwalników do rozległych ran urazowych. Zgorzel
gazowa polega na rozpływnej martwicy mięśni i/lub tkanki łącznej
z tworzeniem gazu i ogólną toksemią.
 Główną toksyną laseczek C. perfringens jest α-toksyna (lecytynaza
– fosfolipaza C), a dla ich inwazyjności duże znaczenie mają bardzo
aktywne enzymy: kolagenaza, proteinazy, hialuronidaza,
deoksyrybonukleinaza, i neuraminidaza. C. perfringens wytwarza
też toksynę immunomodulującą (enterotoksynę) powodującą
zatrucia pokarmowe.
Wiele innych gatunków Clostridium wchodzi w skład flory fizjologicznej
jelita grubego u ludzi i zwierząt. Obecność laseczek Clostridium spp.
w wodzie może świadczyć o skażeniu jej ściekami.
Rodzaj Enterococcus – paciorkowce kałowe (enterokoki)
E. faecalis, E. faecium – najczęściej izolowane od człowieka enterokoki. Są
one komensalami bytującymi w jelicie grubym człowieka i zwierząt.
Bywają często oportunistycznymi patogenami.
Komórki enterokoków to gramdodatnie, duże, owalne ziarenkowce. Mają
małe wymagania pokarmowe. Są względnymi beztlenowcami. Nie
wytwarzają katalazy (podobnie jak inne paciorkowce). W schemacie wg
Lancefield są zaliczane do grupy serologicznej D.
Enterokoki hydrolizują eskulinę i wyrastają w obecności 40% żółci, co
wykorzystuje się do ich izolacji i identyfikacji. Są halotolerantami. Mogą
wyrastać w szerokim zakresie temperatur (10-45˚C) i przeżywają
ogrzewanie w temperaturze 60˚C przez 30 minut. Cechują się naturalną
opornością na wiele grup antybiotyków.
 Chorobotwórczość tych ziarenkowców wiąże się z substancjami
warunkującymi kolonizację tkanek gospodarza (adhezyny,
enzymy) oraz z cytolizyną o aktywności bakteriocyny.
137
Enterokoki mogą być przyczyną infekcji oportunistycznych układu
moczowego, układu krążenia (sepsa), dróg żółciowych, wsierdzia,
zakażają też rany pooparzeniowe. Są to zwykle zakażenia szpitalne.
Obecność enterokoków w wodzie świadczy o jej skażeniu kałem ludzi
lub zwierząt.
Metody
Badanie bakteriologiczne kału
Materiałem klinicznym, w którym poszukujemy patogenów jelitowych jest
kał. Oglądanie barwionych metodą Grama preparatów mikroskopowych,
wykonanych bezpośrednio z badanego materiału ma niewielkie znaczenie
w diagnostyce. Ocena bezpośrednich preparatów jest ważna
w diagnostyce chorób pasożytniczych. Rutynowe badanie bakteriologiczne
kału osób chorych i nosicieli najczęściej polega na serii posiewów
zmierzających do wykrycia w nim obecności chorobotwórczych pałeczek
z rodziny Enterobacteriaceae, głównie z rodzaju Shigella, Salmonella,
Yersinia. Badania w kierunku nosicielstwa Shigella i Salmonella są
obowiązkowe przy podejmowaniu i w trakcie pracy w różnych zawodach.
W celu eliminacji bakterii flory fizjologicznej (dominujących w materiale)
próbkę kału posiewa się na pożywki diagnostyczno–wybiórcze i inkubuje
w obecności tlenu atmosferycznego (brak wzrostu beztlenowców).
Podłoże MacConkeya używane jest, kiedy wystarczy niska selektywność
pożywki. Podłoże to umożliwia wzrost wszystkich pałeczek gramujemnych
tlenowych i względnie beztlenowych (rodzina Enterobacteriaceae)
o małych wymaganiach pokarmowych (prototrofy); obecność w pożywce
fioletu krystalicznego i soli żółciowych hamuje całkowicie wzrost bakterii
gramdodatnich i tylko tych gramujemnych, które mają duże wymagania
odżywcze. Zawarta w pożywce laktoza umożliwia różnicowanie pałeczek
na
rozkładające
laktozę:
laktozododatnie
(kolonie
różowe)
i laktozoujemne (kolonie w kolorze podłoża).
138
Podłoże SS (Salmonella–Shigella) jest pożywką o silnej wybiórczości
i służy do wykrywania i izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella.
Zawarte w pożywce cytryniany i wysokie stężenie soli kwasów żółciowych
hamują wzrost bakterii gramdodatnich i częściowo także wzrost
gramujemnych: Escherichia coli oraz innych fizjologicznie występujących
w jelicie pałeczek. Pożywka zawiera laktozę; kolonie pałeczek
rozkładających laktozę (laktozododatnie) są różowe, nierozkładających
laktozy (laktozoujemne) m. in. pałeczek z rodzajów Salmonella, Shigella
i Yersinia, są bezbarwne. Podłoże SS zawiera również sole żelaza, które
pozwalają na ujawnienie wytwarzania siarkowodoru – kolonie są wtedy
czarne lub bezbarwne z czarnym środkiem.
Metody badania bakteriologicznego moczu
Czynnikiem etiologicznym zakażeń dróg moczowych jest najczęściej
Escherichia coli i rzadziej inne pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae.
W moczu oddawanym w sposób naturalny zawsze znajduje się pewna
ilość bakterii wypłukanych z cewki moczowej, dlatego diagnostyka opiera
się nie tylko na stwierdzeniu obecności bakterii w moczu, ale także
określeniu ich liczby w 1 mL odpowiednio pobranej próbki materiału.
Sposób pobrania próbki moczu do badania bakteriologicznego
 Należy dokładnie umyć wodą z mydłem okolice cewki moczowej.
 Pierwszą porcję moczu oddać do toalety.
 Nie przerywając mikcji (oddawania moczu) zebrać kilka mililitrów do
jałowego pojemniczka (tzw. mocz ze środkowego strumienia).
 Pozostałą zawartość pęcherza oddać do toalety.
Tak pobrany mocz powinien zostać zbadany w ciągu 2 godzin.
Liczbę żywych, zdolnych do tworzenia kolonii komórek bakteryjnych
w 1 mL moczu określa się stosując metodę rozcieńczeń i posiew
powierzchniowy na płytki z odpowiednią pożywką np. MacConkeya lub
agar z krwią. Zliczenie kolonii i uwzględnienie rozcieńczenia próbki
pozwala na obliczenie ich liczby (rozdział 9).
139
Metodą oznaczania liczby bakterii w moczu o mniejszej wartości
diagnostycznej jest technika zanurzeniowa. Jest dość popularna gdyż,
stosuje się w niej dostępne w aptece gotowe zestawy transportowo–
wzrostowe typu Uromedium, Uricult lub inne. Zestaw zawiera plastikową
płytkę pokrytą z dwóch stron warstwą pożywek: Mac Conkeya i CLED
(bezelektrolitowe, nieselektywne podłoże zapobiegające rozpełzliwemu
wzrostowi pałeczek Proteus), umocowaną w nakrętce wewnątrz jałowego
pojemnika. Płytkę tę zanurza się na kilka sekund w badanym moczu lub
zwilża środkowym strumieniem moczu podczas mikcji i ponownie
umieszcza w pojemniku. Po inkubacji w cieplarce ocenia się wzrost
bakterii ilościowo przez porównanie z dołączonymi do zestawu wzorcami.
Metoda ta jest jednak mało dokładna.
3
Interpretacja wyników. Przyjmuje się, że liczba 10 lub więcej komórek/mL
wskazuje na znamienną bakteriurię. Dokładna wartość zależy od rodzaju
bakterii i objawów klinicznych – np. wartość 103 kom./mL E. coli u kobiety
z objawami stanu zapalnego układu moczowego wskazuje na znamienną
3
bakteriurię. Zatem przy liczbie równej lub większej niż 10 kom./mL należy
zawsze zidentyfikować wyhodowane bakterie i określić ich wrażliwość na
antybiotyki.
Badanie bakteriologiczne wody pitnej
W wodzie mogą się znaleźć właściwe bakterie wodne i glebowe
(psychrofile – niechorobotwórcze dla człowieka) i drobnoustroje
ściekowe: bakterie, wirusy, pasożyty (cysty, jaja), które są potencjalnie
chorobotwórcze dla człowieka.
Sanitarno–epidemiologiczna ocena wody obejmuje oznaczenie:
 ogólnej liczby żywych bakterii psychrofilnych (nie może być więcej niż
102/mL),
 ogólnej liczby bakterii mezofilnych (nie może być więcej niż 5x
1
10 /mL),
 wykluczenie obecności żywych bakterii wskaźnikowych,
 wykluczenie obecności beztlenowych laseczek Clostridium perfringens
(formy wegetatywne i przetrwalniki).
140
Bakterie wskaźnikowe czystości mikrobiologicznej wody to te
mikroorganizmy, które stanowią stały składnik flory jelitowej człowieka i
zwierząt. Do środowiska zewnętrznego dostają się wraz z odchodami, a
więc ich obecność w wodzie wskazuje na zanieczyszczenie jej ściekami
komunalnymi lub bezpośrednio fekaliami. W wodzie tak zanieczyszczonej
mogą potencjalnie znaleźć się drobnoustroje chorobotwórcze (bakterie,
wirusy, pierwotniaki) oraz jaja pasożytów, wydalane z organizmu wraz z
kałem. Do bakterii wskaźnikowych zaliczamy pałeczkę okrężnicy (E. coli),
która występuje w dużych ilościach w jelicie grubym (ok. 108 komórek/g
kału) oraz paciorkowce kałowe (enterokoki). Badania prowadzi się też w
kierunku obecności w wodzie bakterii tzw. grupy coli (fermentujące
laktozę do kwasu i gazu pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae – E. coli,
Enterobacter spp., Citrobacter spp. i Klebsiella spp.).
W 100 mL wody pitnej nie powinno być ani jednej komórki bakterii
wskaźnikowych (Escherichia coli, bakterie grupy coli, ziarenkowce
z rodzaju Enterococcus).
Badanie wody w kierunku obecności bakterii wskaźnikowych wykonuje
się najczęściej techniką filtrów membranowych, które po przesączeniu
przez nie próbki wody układa się na odpowiedniej pożywce.
Dla grupy coli może to być np. podłoże Endo – diagnostyczno-wybiórcza
pożywka zawierająca laktozę oraz siarczyn sodu i fuksynę, które hamują
wzrost bakterii gramdodatnich. Kolonie bakterii laktozododatnich mają
barwę od różowej po intensywnie czerwoną, ale kolor kolonii E. coli jest
wyjątkowo intensywny - ciemnoczerwony z charakterystycznym
zielonkawym, metalicznym połyskiem. Kolonie jasnoróżowe, dla
potwierdzenia fermentacji laktozy, posiewa się np. na płynną pożywkę
z tym cukrem, wskaźnikiem barwnym i rurką Durhama (podłoże Andrade)
o
i inkubuje równolegle w temperaturze 37 C (24-48 godzin) i 44°C
(24 godziny). Dla kolonii laktozododatnich należy wykonać próbę na
obecność oksydazy cytochromowej oraz zdolność wytwarzania
tryptofanazy w temperaturze 44°C (inkubacja 24 godziny). Najważniejszą
próbą potwierdzającą obecność E.coli jest test na wytwarzanie
β-D-glukuronidazy.
141
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Ocena mikroskopowa próbki kału
- Nanieś na szkiełko podstawowe kroplę wody.
- Zawieś w tej kropli niewielką ilość kału pobranego ezą z pojemnika.
- Wykonaj rozmaz na szkiełku.
- Wysusz preparat i utrwal w płomieniu palnika.
- Zabarw preparat metodą Grama.
Zadanie 2
Wykonanie posiewu próbki kału
- Pobierz jałową ezą próbkę kału z pojemnika transportowego.
- Posiej techniką redukcyjną na:
- płytkę MacConkeya,
- płytkę z podłożem SS
- Inkubuj w cieplarce 37oC przez około 20 godzin.
- Oceń wygląd wyrosłych kolonii.
142
Zadanie 3
Bakterie w przewodzie pokarmowym
- Uzupełnij tabelę wpisując z pamięci nazwy przynajmniej 10 rodzajów
bakterii, których gatunki bytując w przewodzie pokarmowym pasują do
opisu
Bakterie (rodzaje) stanowiące
florę fizjologiczną przewodu
pokarmowego
Bakterie chorobotwórcze
(spotykane tylko u chorych lub
nosicieli)
Bakterie spotykane u nosicieli
Bakterie wytwarzające
zewnątrzkomórkowe toksyny
odpowiedzialne za obraz kliniczny
choroby
143
144
Rozdział 11
Inne bakterie bytujące w środowisku człowieka
Część teoretyczna
Środowisko przyrodnicze jest miejscem bytowania licznych rodzajów
bakterii saprofitycznych i chorobotwórczych. Naturalnym siedliskiem
bakterii saprofitycznych są woda, gleba i ścieki. Bakterie te mogą unosić
się w powietrzu na cząstkach kurzu i w formie aerozoli. Mogą
przedostawać się na powierzchnie przedmiotów, do żywności, leków,
a przez to do organizmu ludzkiego stając się niekiedy przyczyną różnych
infekcji oportunistycznych. Bakterie chorobotwórcze dostają się do
środowiska najczęściej wraz z wydzielinami i wydalinami ludzi chorych
i nosicieli oraz chorych i zdrowych zwierząt, u których są składnikami flory
fizjologicznej.
Rodzaj Listeria
L. monocytogenes (pałeczka listeriozy)
Fakultatywny pasożyt wewnątrzkomórkowy.
Głównym siedliskiem pałeczek Listeria jest gleba i gnijące rośliny oraz
zbiorniki wodne i ścieki. Stąd bakterie te dostają się do organizmów
różnych zwierząt. Wszystkie produkty żywnościowe są potencjalnie
zakażone tymi pałeczkami.
Komórki Listeria spp. to krótkie, gramdodatnie pałeczki, często układające
się w łańcuszki. Są ruchliwe, rosną na prostych podłożach, są względnymi
beztlenowcami, wytwarzają katalazę. Hydrolizują eskulinę, co
wykorzystuje się w ich identyfikacji. Pałeczki Listeria mogą rosnąć
w obecności nawet 10% soli i namnażać się w temperaturze 4˚C, a więc
mnożą się w żywności przechowywanej w chłodni.
145
Pałeczki te są oporne na działanie niskiego pH soku żołądkowego,
enzymów proteolitycznych i kwasów żółciowych co ułatwia im kolonizacje
organizmu.
 Listeria monocytogenes jest fakultatywnym pasożytem wewnątrzkomórkowym. Wytwarza adhezyny (internaliny), enzymy i toksynę
(listeriolizynę O), które pozwalają na przeżycie bakterii w makrofagach
i ich rozprzestrzenianie się w organizmie.
L. monocytogenes wywołuje listeriozę, która może występować w trzech
klinicznych postaciach: jako listerioza noworodków, listerioza starszych
dzieci i dorosłych oraz listerioza pracowników laboratoriów i weterynarzy
– ta zwykle w postaci infekcji skóry i oczu. Listerioza noworodków jest
uogólnioną infekcją o bardzo dużej śmiertelności. Do zakażenia może
dojść od matki lub ze środowiska szpitalnego. Listerioza dzieci starszych
i osób dorosłych może przebiegać łagodnie, ale także jako groźne dla życia
zapalenie mózgu i opon mózgowo-rdzeniowych z sepsą. Do zakażenia
dochodzi drogą pokarmową.
Rodzaj Bacillus – laseczki tlenowe
B. anthracis (laseczka wąglika) – chorobotwórcza.
B. cereus (laseczka woskowa) – komensal, patogen oportunistyczny,
odpowiedzialna za zatrucia pokarmowe.
B. subtilis (laseczka sienna) – saprofit, patogen oportunistyczny (rzadko).
Laseczki Bacillus spp. występują powszechnie. Są wśród nich gatunki
chorobotwórcze dla ludzi, innych ssaków, owadów i roślin, komensale
bytujące w układzie pokarmowym ludzi i zwierząt oraz wolno żyjące
saprofity. Powszechność występowania tych laseczek w przyrodzie jest
związana m.in. z wytwarzaniem przez nie przetrwalników. Przetrwalniki
B. subtilis subsp. subtilis i Geobacillus stearothermophilus (dawniej –
Bacillus stearothermophilus), ze względu na wyjątkowo dużą
ciepłooporność, są stosowane w testach biologicznych do kontroli
działania aparatów sterylizujących. Niektóre gatunki tych laseczek
146
(B. brevis, B. licheniformis, B. polymyxa) wytwarzają antybiotyki, co
wykorzystuje się w przemyśle farmaceutycznym.
Komórki laseczek, o różnej wielkości, są cylindryczne (pałeczkowate),
układają się często w łańcuszki. Są gramdodatnie. Przetrwalniki nie
wpływają na kształt komórek. Laseczka wąglika w organizmie zakażonym
wytwarza polipeptydową otoczkę.
Laseczki dobrze namnażają się na prostych pożywkach, tolerują wysokie
stężenie NaCl (do 10%), szeroki zakres pH i temperatury (5-75°C). Są
tlenowcami lub względnymi beztlenowcami. Na agarze z krwią większość
gatunków powoduje hemolizę typu β, zwykle bardzo dużą strefę wokół
kolonii. Wytwarzają katalazę.
 Chorobotwórczość Bacillus anthracis jest związana z działaniem
trójskładnikowej białkowej toksyny oraz obecnością otoczki.
Wąglik jest śmiertelną chorobą o piorunującym przebiegu, występującą
głównie u zwierząt trawożernych. Człowiek zakaża się przetrwalnikami
znajdującymi się w produktach pochodzących od padłych zwierząt (skóry,
futra, wełna, mączka kostna). Przetrwalniki B. anthracis mogą być użyte
(już były) jako broń biologiczna. Laseczka wąglika człowieka mogą
wystąpić trzy postacie choroby (zależnie od drogi wtargnięcia
przetrwalników): postać skórna (tzw. czarna krosta) – najłagodniejsza,
postać płucna („choroba sortowaczy wełny”) i rzadko postać jelitowa.
Postać płucna i jelitowa, zbyt późno rozpoznane, przeważnie kończą się
śmiercią. Choroba ta występuje głównie w Azji i Afryce, wśród zwierząt
hodowlanych i dzikich.
 B. cereus wytwarza toksyny odpowiedzialne za objawy zatruć pokarmowych: termostabilną toksynę „wymiotną” (cereulid) i wrażliwą na
wysoką temperaturę toksynę „biegunkową”- podobną do
enterotoksyn LT przecinkowca cholery i pałeczki okrężnicy.
Enterotoksyna „biegunkowa” wytwarzana jest w jelicie cienkim przez
mnożące się laseczki, które dostały się tam wraz ze spożywanym
pokarmem. Objawy zatrucia pojawiają się bardzo szybko. Wymioty
występują w czasie od 15 minut do 4 godzin po spożyciu potrawy
zawierającej toksynę „wymiotną”, a wodnista biegunka po 8-12
godzinach po zatruciu toksyną „biegunkową”.
147
Przetrwalniki Bacillus cereus bardzo często są spotykane w różnych
artykułach spożywczych (np. w ryżu). Laseczka ta może w niewielkich
ilościach wchodzić w skład normalnej flory jelita grubego u ludzi.
Wśród zakażeń oportunistycznych wywołanych przez laseczkę woskową,
szczególnie niebezpieczne są zapalenia gałki ocznej (zwykle pourazowe),
grożące nawet utratą wzroku.
Rodzaje Pseudomonas, Stenotrophomonas i Acinetobacter
P. aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej) – komensal, patogen
oportunistyczny.
S. maltophilia – patogen oportunistyczny, może występować
w środowisku szpitalnym.
Acinetobacter spp. – powszechne w środowisku (ścieki), kilka gatunków
patogenów oportunistycznych, mogą się znaleźć wśród fizjologicznej
mikroflory skóry człowieka.
Pałeczki te charakteryzuje naturalna oporność na wiele antybiotyków,
a ich wielooporne szczepy są częstą przyczyną zakażeń szpitalnych.
Naturalnym siedliskiem tych pałeczek są gleba, woda i ścieki.
P. aeruginosa może bytować jako komensal w przewodzie pokarmowym
ludzi i zwierząt. Pałeczki wymienionych rodzajów spotyka się często
w szpitalach, gdzie zamieszkują w miejscach wilgotnych, jak np. syfony
umywalek, natryski, zlewy itp.
Te gramujemne pałeczki są podobne morfologicznie, wiele jest
obdarzonych ruchem. Ich wymagania pokarmowe są bardzo małe. Mają
zdolność wykorzystywania różnorodnych substratów energetycznych,
nawet takich (tzw. niekonwencjonalnych), jak leki, środki dezynfekcyjne,
środki czystości, produkty naftowe, w których mogą się namnażać.
W laboratorium hoduje się te pałeczki na prostych pożywkach. Wszystkie
są tlenowcami. Pałeczki Pseudomonas wytwarzają oksydazę
cytochromową, pozostałe rodzaje są oksydazoujemne. Pałeczki te mogą
namnażać się w szerokim zakresie temperatur (5-45˚C).
148
Ważną cechą identyfikacyjną Pseudomonas aeruginosa jest wytwarzanie
rozpuszczalnych w wodzie barwników: np. niebieskiej piocjaniny, czy
żółtozielonej fluoresceiny, które zabarwiają podłoża hodowlane.
 P. aeruginosa wytwarza szereg czynników determinujących jej
chorobotwórczość – otoczkę, fimbrie i LPS oraz enzymy (proteazy,
fosfolipaza C) i cytotoksyny (egzotoksyna A, egzoenzym S).
Pałeczki te szczególnie często wywołują infekcje u pacjentów z obniżoną
odpornością, u chorych z oparzeniami bądź poddawanych inwazyjnym
zabiegom. P. aeruginosa są ważnymi czynnikami etiologicznymi zapalenia
oskrzeli i płuc u chorych na mukowiscydozę. Mukowiscydoza jest chorobą
genetyczną, w której zaburzone jest wydzielanie gruczołów
egzokrynowych (potowych, śluzowych, trzustki). Wydzielina tych
gruczołów jest skąpa, gęsta i lepka, co hamuje ruch rzęsek nabłonka
i ułatwia inwazję przez drobnoustroje.
Skażenie leków ocznych pałeczką ropy błękitnej stanowi duże zagrożenie
utratą wzroku wskutek uszkodzenia rogówki przez proteazy.
Rodzaj Legionella
L. pneumophila subsp. pneumophila – wewnątrzkomórkowe patogeny
wywołujące infekcje dróg oddechowych.
Są to gramujemne pałeczki, których naturalnym siedliskiem jest gleba
i woda otwartych zbiorników oraz domowych urządzeń wodociągowych
(rury, natryski) i urządzeń klimatyzacyjnych. Bakterie te długo przeżywają
w środowisku wilgotnym, nawet w temperaturze 60˚C. Są oporne na
działanie chloru (np. zawartego w wodzie wodociągowej). Większość
szczepów charakteryzuje się naturalną opornością na antybiotyki
β-laktamowe.
149
Komórki Legionella są polimorficzne. Pałeczki te są trudnymi w hodowli
laboratoryjnej auksotrofami. Są tlenowcami wytwarzającymi katalazę.
Rosną wolno i są mało aktywne metabolicznie, co utrudnia identyfikację.
 Pałeczki Legionella mają zdolność przeżywania i mnożenia się
wewnątrz makrofagów. Bakterie te hamują odpowiedź komórkową
organizmu. Najczęściej przyczyną infekcji u ludzi jest L. pneumophila
subsp. pneumophila. Do zakażenia dochodzi poprzez wdychanie
aerozoli zawierających te bakterie.
Wywołują legionelozę - chorobę legionistów, która jest ciężkim
w przebiegu zapaleniem płuc lub gorączkę Pontiac – łagodniejszą,
grypopodobną infekcję, nie zajmującą płuc. Zachorowaniom na
legionelozy sprzyjają: obniżenie odporności organizmu, palenie tytoniu,
przewlekłe choroby płuc, praca w środowisku, gdzie tworzą się aerozole
wodno-powietrzne (SPA, myjnie samochodów, gabinety stomatologiczne,
klimatyzowane pomieszczenia itp.). Obecnie w szpitalach obowiązuje
badanie ciepłej wody w kierunku obecności tych pałeczek.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Cechy rodzajów Pseudomonas, Bacillus, Listeria, Legionella
Uzupełnij tabelę wpisując samodzielnie z pamięci nazwę gatunku lub
rodzaju bakterii obdarzonych danymi cechami
Cecha bakterii
Wytwarza barwniki dyfundujące do
podłoża
Gatunek lub rodzaj
Wywołuje wąglik
150
Może namnażać się w lodówce
Obecność w lekach ocznych
niebezpieczna dla wzroku
Wywołuje zakażenia okołoporodowe
u noworodków
Wytwarza toksynę „wymiotną”
Może namnażać się w środkach
dezynfekcyjnych
Przetrwalniki stosowane są do
kontroli aparatów do sterylizacji
Bytuje w urządzeniach
klimatyzacyjnych
Powoduje infekcje układu
oddechowego
u osób z mukowiscydozą
151
152
Rozdział 12
Bakterie wywołujące choroby o swoistym
przebiegu, trudne do hodowli lub identyfikacji
Część teoretyczna
Rodzaj Mycobacterium – prątki
M .tuberculosis subsp. tuberculosis (prątek gruźlicy ludzki)
M. bovis subsp. bovis (prątek gruźlicy bydlęcy)
M. bovis BCG (atenuowany/niezjadliwy prątek bydlęcy)
M. avium (prątek ptasi) – MOTT
M. intracellulare (prątek mikobakteriozy) – MOTT
M. kansasii (prątek mikobakteriozy) – MOTT
M. leprae (prątek trądu)
Prątki to szczególna grupa różniąca się szeregiem cech od innych bakterii.
Są wśród nich gatunki chorobotwórcze dla ludzi i zwierząt, ale także
saprofity bytujące w glebie i wodzie.
Ściana komórkowa prątków zawiera bardzo dużo lipidów (około 60%
suchej masy). Są to kwasy mikolowe, woski, glikolipidy. Z obecnością tych
związków wiąże się kwaso-alkoholo-oporność, hydrofobowość, oporność
na detergenty i barwniki anilinowe, niewrażliwość na wysychanie oraz
cechy chorobotwórczości.
Prątki dzielą się na dwie grupy:
 wolno rosnące – wzrost staje się widoczny makroskopowo po
czasie dłuższym niż 7 dni (przeważnie po 2–6 tygodniach); do tej
grupy należą prątki wywołujące gruźlicę u ludzi (M. tuberculosis
i M. bovis), niechorobotwórczy prątek BCG oraz prątek ptasi
i wymienione tu gatunki prątków wywołujących mikobakteriozy;
 szybko rosnące – wzrost pojawia się przed upływem 7 dni (w ciągu
2–3 dni); prątki saprofityczne.
153
Prątki wywołujące mikobakteriozy i prątki saprofityczne nazywane są (ze
względów praktycznych) grupą MOTT (ang. Mycobacterium other than
tuberculosis – „prątki inne, niż gruźlicze”).
Prątki są bakteriami gramdodatnimi, lecz źle się barwią metodą Grama. Do
ich barwienia stosuje się metodę Ziehla-Neelsena, w której wykorzystuje
się cechę kwaso-alkoholo-oporności prątków. Komórki prątków są
cienkimi pałeczkami, czasem układającymi się równolegle.
Prątki hoduje się najczęściej na podłożu Loewensteina-Jensena
zawierającym, oprócz składników odżywczych (jaja kurze, glicerol,
asparagina, mąka ziemniaczana), zieleń malachitową, której zadaniem jest
hamowanie wzrostu innych, szybko rosnących bakterii, mogących trafić
przypadkowo do podłoża. Kolonie prątków gruźlicy na tym podłożu są
suche, kalafiorowate. Prątki MOTT często wytwarzają barwniki
karotenoidowe zabarwiające kolonie na żółto lub pomarańczowo.
W nowoczesnych, automatycznych metodach hodowli prątków stosuje się
płynne pożywki syntetyczne. Prątki są tlenowcami, wytwarzają katalazę.
Są oporne na penicylinę.
Mycobacterium leprae nie rośnie na pożywkach. Jest obligatoryjnym
(bezwzględnym) pasożytem wewnątrzkomórkowym. Można go namnożyć
zakażając materiałem od chorego jedyne zwierzę wrażliwe na te prątki pancernika.

Chorobotwórczość prątków wynika z ich zdolności do przeżywania
i namnażania się w makrofagach oraz wyzwalania w organizmie
gospodarza reakcji nadwrażliwości typu opóźnionego. Efektem tego
jest tworzenie w zakażonych tkankach (najczęściej w płucach)
ziarniniaków gruźliczych (gruzełków). Za przeżywanie prątków
w makrofagach i tworzenie zmian patologicznych odpowiedzialne są
zewnątrzkomórkowe enzymy (katalaza, peroksydaza) oraz składniki
ściany komórkowej – glikolipidy – m.in. 6’, 6’–dimikolan α-trehalozy
(tzw. czynnik sznurowy). M. tuberculosis i M. bovis wywołują gruźlicę
u ludzi. Najczęściej choroba dotyczy płuc, lecz może atakować także
inne narządy (gruźlica pozapłucna). Prątki MOTT wywołują
mikobakteriozy, które również przeważnie dotyczą układu
oddechowego i są klinicznie podobne do gruźlicy. Mikobakteriozy
154
występują głównie u osób z predyspozycjami (inne przewlekłe
choroby płuc, praca w zawodzie rolnika, hodowcy drobiu). Prątki
przenoszą się drogą kropelkową od chorego lub pyłową ze
środowiska. Niektóre gatunki MOTT mogą być przyczyną infekcji skóry
i tkanki podskórnej. Drogą zakażenia są wówczas rany kłute i drobne
skaleczenia.
Mycobacterium bovis BCG (Bacille Calmette–Guerin) jest atenuowanym,
niezjadliwym prątkiem bydlęcym stosowanym powszechnie do szczepień
profilaktycznych przeciw gruźlicy u ludzi i bydła. Prątek ten może
wywoływać oportunistyczne infekcje u osób z niedoborami
immunologicznymi, np. u chorych na AIDS.
Stan nadwrażliwości późnej u osób, w których organizmie znajdują się
żywe prątki gruźlicy (po szczepieniu, w czasie i po chorobie) można wykryć
próbą tuberkulinową Mantoux.

Prątek trądu dysponuje podobnymi czynnikami chorobotwórczości,
jak prątki gruźlicy. Mycobacterium leprae wywołuje trąd – przewlekłą
chorobę, występującą głównie w krajach strefy tropikalnej Afryki i Azji.
Zmiany chorobowe obejmują przede wszystkim skórę i nerwy
czuciowe.
Rodzaj Borrelia
B. burgdorferi (krętek boreliozy z Lyme) – wywołuje chorobę z Lyme;
wektorem przenoszącym są kleszcze z rodzaju Ixodes
B. recurrentis (krętek duru powrotnego) – wywołuje dur powrotny
epidemiczny; wektorem przenoszącym jest wesz ludzka.
Krętki Borrelia są gramujemnymi bakteriami spiralnymi, o nieregularnych
skrętach. Hoduje się je na specjalnych pożywkach zawierających m.in.
155
surowicę. Są mikroaerofilami. Rosną bardzo wolno (od 2 do 6 tygodni).
Postępowanie diagnostyczne opiera się na testach serologicznych.
 Czynnikami chorobotwórczości tych krętków są: toksyczny LPS
i peptydoglikan, mające działanie immunomodulujące.
Borelioza z Lyme (miasto w USA) występuje u ludzi po ukąszeniu przez
kleszcza zakażonego krętkiem Borrelia burgdorferi. Naturalnym miejscem
bytowania tych krętków są organizmy kleszczy, gryzoni i jeleni. Krętki,
mnożąc się w organizmie, powodują uogólnioną infekcję z zapaleniem
stawów, zaburzeniami neurologicznymi (zapalenie opon mózgowordzeniowych) oraz kardiologicznymi. Pierwszym objawem choroby często,
ale nie zawsze, jest rumień w miejscu ukąszenia - tzw. „rumień wędrujący”
(szerzący się koncentrycznie od punktu ukąszenia).
Borrelia recurrentis wywołuje przenoszony przez wesz dur powrotny
epidemiczny. Rezerwuarem krętków jest człowiek. Choroba
charakteryzuje się nawrotami wysokiej gorączki i występującym przy tym
odurzeniem.
Rodzaj Treponema
T. pallidum subsp. pallidum (krętek blady) – występuje tylko
w organizmie ludzi chorych na kiłę (syfilis).
Komórki mają postać sprężynek o regularnych skrętach. Krętki te są
gramujemne, lecz słabo barwią się barwnikami anilinowymi („blady”). Do
barwienia preparatów używa się metody negatywnej lub ogląda żywe,
poruszające się krętki w mikroskopie z ciemnym polem widzenia albo
kontrastowo-fazowym. Krętek blady nie daje się hodować na pożywkach.
Do celów doświadczalnych namnaża się krętki wprowadzając badany
materiał do jąder królika.
 Czynniki chorobotwórczości krętka bladego są słabo poznane. Są to
białka odpowiedzialne za adhezję do komórek gospodarza (głównie
156
śródbłonka naczyniowego) oraz hialuronidaza warunkująca
rozprzestrzenianie w organizmie.
Kiła jest przewlekłą chorobą, przenoszoną głównie drogą płciową.
Nieleczona przebiega w czterech etapach. Objawy kiły pierwotnej
pojawiają się po upływie 3-4 tygodni od zakażenia i mają postać
niebolesnego owrzodzenia w miejscu wtargnięcia krętków do organizmu
oraz powiększenia okolicznych węzłów chłonnych. Owrzodzenie goi się
bez pozostawienia blizny. Kiła II okresu (wtórna) charakteryzuje się
uogólnionym powiększeniem węzłów chłonnych, wysypką plamistogrudkową, obejmującą również dłonie i podeszwy stóp. Występują też
objawy przypominające grypę. To stadium choroby trwa do około
6 miesięcy od chwili zakażenia. W tym czasie krętki mnożą się i rozsiewają
drogą krwi po całym organizmie. W kile III (po 2-5 latach) i IV okresu (po
10-20 latach od zakażenia) są już trwałe zmiany w licznych narządach
i leczenie jest nieskuteczne. Wskutek zaatakowania układu nerwowego,
pojawiają się liczne objawy neurologiczne (porażenia, zaburzenia czucia)
oraz zaburzenia psychiczne. U dzieci urodzonych przez matki chore na kiłę
występuje kiła wrodzona.
Rodzaj Brucella – pałeczki brucelozy
Bakterie te występują w organizmach przewlekle chorych zwierząt
hodowlanych (kozy, owce, bydło, świnie).
Są to gramujemne, bardzo drobne (ziarenkowate) pałeczki. Hoduje się je
na pożywkach wzbogaconych. Są tlenowcami; niektóre gatunki wymagają
do hodowli zwiększonej ilości dwutlenku węgla (10%). Wytwarzają
oksydazę cytochromową, katalazę i ureazę.
 Pałeczki Brucella spp. mają zdolność przeżywania i mnożenia się
w makrofagach – są fakultatywnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi.
U zwierząt hodowlanych powodują zakaźne poronienia. U ludzi wywołują
przewlekłą chorobę – brucelozę, atakującą głównie układ kostno-stawowy
i narządy wewnętrzne (śledziona, wątroba, węzły chłonne). Bruceloza jest
zoonozą. Człowiek zakaża się przez kontakt z chorymi zwierzętami
157
(weterynarze, hodowcy) bądź przez spożywanie surowych produktów
spożywczych (mleko, mięso).
Rodzaje Mycoplasma i Ureaplasma – mikoplazmy
M. pneumoniae – wywołuje „atypowe” zapalenia płuc.
M. hominis, U. urealyticum – odpowiedzialne są za oportunistyczne
infekcje dróg moczowo-płciowych.
Mikoplazmy są bakteriami charakteryzującymi się brakiem ściany
komórkowej. Są polimorficzne, od bardzo drobnych ziarenek do długich
nitek.
Do wzrostu wymagają wzbogaconych pożywek, zawierających cholesterol.
Rosną wolno w warunkach tlenowych lub mikroaerofilnych. Kolonie
mikoplazm przypominają wyglądem sadzone jaja. Są bardzo drobne,
ogląda się je przy użyciu lupy.
 Największą rolę w chorobotwórczości mikoplazm odgrywa adhezja do
komórek błon śluzowych układu oddechowego (M. pneumoniae)
układu moczowo-płciowego (M. hominis, U. urealyticum). Pewne
znaczenie mają też enzymy: ureaza, proteazy – proteaza IgA1.
Mycoplasma pneumoniae wywołuje „atypowe” śródmiąższowe zapalenie
płuc, które może być powikłane zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych,
zapaleniem mięśnia sercowego, zapaleniem stawów. Po przebytych
chorobach może pozostawiać nosicielstwo.
Mycoplasma hominis i Ureaplasma urealyticum kolonizują często układ
moczowo-płciowy osób aktywnych seksualnie. Mogą wywoływać
oportunistyczne infekcje układu moczowo-płciowego: odmiedniczkowe
zapalenie nerek, zapalenie jajników i jajowodów, najądrzy i gruczołu
krokowego, nierzeżączkowe zapalenie cewki moczowej u mężczyzn. Mogą
również być przyczyną gorączki połogowej i poronień. Mikoplazmy te
przenoszą się drogą płciową.
158
Rodzaj Chlamydia i Chlamydophila - chlamydie
Chlamydia trachomatis - wywołuje jaglicę i choroby przenoszone drogą
płciową.
Chlamydophila pneumoniae – powoduje zakażenia układu oddechowego.
Chlamydie są obligatoryjnymi (bezwzględnymi) pasożytami wewnątrzkomórkowymi. Mogą namnażać się tylko wewnątrz komórek gospodarza.
Są nazywane pasożytami „energetycznymi”, ponieważ nie mogą
syntetyzować ATP i czerpią ten związek z zakażonej komórki. Ściana
komórkowa chlamydii zawiera lipopolisacharyd, lecz brak w niej
peptydoglikanu.
Chlamydie charakteryzuje specyficzny cykl życiowy, w którym występują
w dwóch podstawowych postaciach:
 ciałko elementarne – zewnątrzkomórkowa forma zakaźna, która
wnika do komórki docelowej;
 ciałko siateczkowate – wewnątrzkomórkowa, niezakaźna forma
replikacyjna, która powstaje w komórce po kilku godzinach od
wniknięcia ciałka elementarnego.
Z ciałek siateczkowatych, przez ich skupienie, tworzy się ciałko pośrednie.
Ciałka siateczkowate dzielą się i powstają z nich ciałka elementarne.
Wypełniony nimi fagosom nazywany jest ciałkiem wtrętowym, które
można zobaczyć pod mikroskopem. Ciałka elementarne opuszczają
komórkę, która ulega zniszczeniu (działanie cytotoksyczne) i zakażają
kolejne komórki organizmu lub nowego gospodarza.
 Gatunek Chlamydia trachomatis dzieli się na dwa biotypy. Szczepy
należące do biotypu TRACHOMA wywołują ciężką chorobę oczu –
jaglicę, wtrętowe zapalenie spojówek, a także zapalenie płuc
i spojówek u noworodków (zakażonych podczas porodu). Powodują
także choroby przenoszone drogą płciową: nierzeżączkowe
i porzeżączkowe zapalenie cewki moczowej oraz inne stany zapalne
narządów płciowych wewnętrznych u kobiet i mężczyzn. Szczepy
biotypu LGV wywołują również chorobę przenoszoną przez kontakt
płciowy – ziarniniak weneryczny.
159
Chlamydophila pneumoniae jest czynnikiem etiologicznym zapalenia
oskrzeli i płuc oraz gardła i zatok o atypowym przebiegu. Częste infekcje
tymi bakteriami mogą przyczyniać się do rozwoju astmy i nowotworów
płuc. Ostatnio przypisuje się temu gatunkowi udział w powstawaniu
chorób układu krążenia (miażdżyca, choroba wieńcowa) i układu
nerwowego (choroba Alzheimera, stwardnienie rozsiane). C. pneumoniae
przenosi się drogą kropelkową.
Rodzaj Rickettsia – riketsje
Grupa duru wysypkowego:
R. prowazekii – wywołuje dur wysypkowy/plamisty epidemiczny,
R. typhi – wywołuje dur wysypkowy/plamisty endemiczny (szczurzy).
Grupa gorączek plamistych:
wiele gatunków
Riketsje są obligatoryjnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi.
Powodują choroby ludzi i zwierząt (ssaki i stawonogi).
Są to bardzo drobne, polimorficzne, gramujemne pałeczki. Źle barwią się
metodą Grama, stosuje się do ich barwienia metodę Giemsy lub
Gimeneza. Riketsje nie rosną na pożywkach bakteriologicznych. Można je
jedynie namnażać w zarodkach kurzych albo w hodowlach komórek (np.
kurze fibroblasty).
 Riketsje działają cytotoksycznie na komórki, szczególnie na śródbłonek
naczyń krwionośnych.
Riketsje są przenoszone na człowieka od chorych ludzi lub zwierząt przez
wszy, pchły, kleszcze i roztocza, które także mogą być rezerwuarem tych
bakterii. Do zakażenia dochodzi wskutek ukąszenia lub wtarcia
w uszkodzoną skórę wydalin zakażonych stawonogów.
Choroby wywoływane przez rodzaj Rickettsia dzielą się na dwie grupy:
grupę duru wysypkowego i grupę gorączek plamistych. Dury wysypkowe
to: dur plamisty epidemiczny (R. prowazekii) przenoszony przez wszy
160
odzieżowe (rezerwuarem zarazka jest człowiek) i dur plamisty
endemiczny/szczurzy (R. typhi), przenoszony przez pchły szczurze
(rezerwuarem są szczury i inne gryzonie). Choroby te występują na całym
świecie. Gorączki plamiste, przenoszone przez kleszcze lub roztocza,
przypisane są zwykle do określonych regionów geograficznych,
np. gorączka plamista Gór Skalistych. W Polsce pojawiła się ostatnio
przenoszona przez kleszcze gorączka plamista wywoływana przez R.
helvetica.
Metody
Metoda barwienia preparatów bakteryjnych Ziehla-Neelsena
Barwienie metodą Ziehla-Neelsena umożliwia wykrycie bakterii kwasoalkoholo-opornych (Mycobacterium, Nocardia). Jedynie one przyjmują
i utrzymują w toku barwienia barwnik podstawowy.
W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki:
 barwnik podstawowy - fenolowy roztwór fuksyny zasadowej
(fuksyna karbolowa)
 odbarwiacz - alkohol etylowy z dodatkiem 3% HCl (alkohol
zakwaszony)
 barwnik kontrastowy- alkoholowo-wodny roztwór błękitu
metylenowego (błękit metylenowy)
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Cechy bakterii z rodzajów opisanych w tym rozdziale.
161
Uzupełnij tabelę wpisując nazwy gatunków lub rodzajów bakterii
Cecha
Gatunek lub rodzaj
Przenoszone przez wszy
Nie hoduje się na pożywkach
Kwasooporne
Przenoszone drogą płciową
Namnaża się tylko w komórkach
żywego organizmu
Wywołuje gruźlicę
Wywołuje kiłę
Wywołuje zoonozę, w której źródłem
zakażenia jest mleko i mięso
Charakteryzuje się specyficznym
cyklem rozwojowym
Nie ma ściany komórkowej
Przenoszone przez kleszcze
162
163
164
Rozdział 13
Wirusologia
Część teoretyczna
Cechy wirusów zwierzęcych
Poza komórką gospodarza wirusy są tworami nieożywionymi; kompletne,
zdolne do zakażania ich cząstki nazywamy wirionami. Są bezwzględnymi
(obligatoryjnymi) pasożytami wewnątrzkomórkowymi, odtwarzają się
wyłącznie wewnątrz żywej komórki gospodarza. Nie wykazują organizacji
komórkowej. Nośnikiem informacji genetycznej jest kwas nukleinowy
jedno- (ss) lub dwuniciowy (ds) DNA lub RNA.
Wymiary wirionów zawierają się w granicach od 20 nm do 300 nm. Rdzeń
wirusa jest nukleoproteiną, którą tworzy odpowiedni dla określonego
wirusa kwas nukleinowy i związany z nim kapsyd. Budują go
polipeptydowe jednostki morfologiczne – kapsomery. Architektura
kapsydu określa kształt wirusa. Kapsomery mogą być ułożone w symetrii
kubicznej (ikosaedralnej) lub spiralnej (helikalnej). Niektóre wirusy mają
białkowo-lipidową osłonkę. Pochodzi ona z błony jądrowej lub
cytoplazmatycznej komórki gospodarza, ale jest zmodyfikowana przez
glikoproteiny kodowane genomem wirusa. Z cząsteczką wirionu
(nukleokapsydem bądź osłonką) mogą być związane enzymy (np.
odwrotna transkryptaza) i inne białka (np. hemaglutynina) istotne dla
replikacji i chorobotwórczości wirusów.
W zakażeniu produktywnym komórki zwierzęcej, prowadzącym do
powstania wirionów potomnych, wyróżnia się następujące fazy: adsorpcji,
penetracji, odpłaszczania, eklipsy, dojrzewania i elucji.
Bakteriofagi
Bakteriofagi są grupą wirusów rozwijających się wyłącznie w komórkach
bakteryjnych. Charakteryzują się wysoką swoistością do gospodarza.
W wielu przypadkach ograniczona jest ona do kilku szczepów w obrębie
165
gatunku bakterii. Cecha ta związana jest z obecnością na powierzchni
komórki bakteryjnej specyficznych receptorów i ma ogromne znaczenie
praktyczne.
Wysoką specyficzność łączenia z receptorami wykorzystuje się dla
wewnątrzgatunkowej
identyfikacji
bakterii
w
dochodzeniach
epidemiologicznych - typowania bakteriofagowego. W ostatnich latach
powrócono do idei wykorzystywania bakteriofagów w leczeniu chorób
infekcyjnych powodowanych przez niektóre bakterie
Bakteriofagi ze względu na typy symetrii i kształty, które wykazują
podzielono na grupy. Znane są fagi nitkowe o symetrii spiralnej oraz fagi
o symetrii kubicznej. Genom większości bakteriofagów zbudowany jest
z dsDNA.
Bakteriofagi mogą atakować komórki bakterii według dwóch scenariuszy.
 Bakteriofagi zjadliwe po wniknięciu i namnożeniu się w komórce
wywołują jej lizę. Cykl ten nazywany jest litycznym. Jest to zakażenie
produktywne, gdyż tworzone są liczne potomne bakteriofagi.
Komórka gospodarza ulega rozpadowi (lizie).
 Bakteriofagi mogą po zakażeniu komórki bakteryjnej włączać swoje
DNA do jej genomu, nie wytwarzać potomnych bakteriofagów i nie
uszkadzać w widoczny sposób komórki gospodarza. Wszystkie
potomne pokolenia zakażonej komórki bakterii będą zawierać kopie
genomu bakteriofaga. Stan ten nazywamy lizogenią, a zintegrowany
z genomem komórki gospodarza genom wirusa – profagiem. Pod
wpływem różnych bodźców taki cykl może jednak przekształcić się
w cykl lityczny.
Zakażając komórki i uwalniając się z nich bakteriofagi mogą uczestniczyć
w procesie transdukcji - horyzontalnego przenoszenia genów
bakteryjnych.
Hodowla wirusów
Obligatoryjne pasożyty wewnątrzkomórkowe, jakimi są wirusy, nie mogą
być hodowane na sztucznych pożywkach. Aby je namnożyć trzeba użyć
żywych komórek, uwzględniając powinowactwo wirusów do określonych
komórek gospodarzy.
166

Bakteriofagi mnoży się w hodowlach odpowiednich szczepów bakterii
na podłożach płynnych lub stałych. W hodowli płynnej wskutek lizy
bakterii obserwuje się zanik jej mętności, w przesączu są obecne liczne
bakteriofagi. Na podłożu stałym zniszczenie komórek bakteryjnych
objawia się powstaniem tzw. „łysinek” w murawie bakterii rosnących
na powierzchni płytki.

Wirusy zwierzęce można namnażać wykorzystując zwierzęta
doświadczalne, zarodki ptasie lub hodowle komórek eukariotycznych.
Metody namnażania wirusów w organizmach zwierząt laboratoryjnych
zostały prawie całkowicie zastąpione przez hodowle komórkowe
(tkankowe).
Zarodki ptasie najczęściej kurze, czasem kacze, zakażane są poprzez
wprowadzenie zawiesiny wirusów do jamy owodniowej, jamy
omoczniowej, woreczka żółtkowego lub na błonę kosmówkowoomoczniową. Metoda ta stosowana była do namnażania wirusów świnki,
grypy oraz grypy rzekomej.
Zakażanie hodowli komórek eukariotycznych stało się najczęściej
stosowaną metodą namnażania wirusów. Hodowle tych komórek in vitro
prowadzone są na powierzchni ścianek odpowiednich naczyń. Komórki
przylegają do nich, a dzieląc się, tworzą zwykle jednolitą warstwę (ang.
monolayer).
Wykorzystuje się hodowle tkankowe pierwotne, półciągłe i ciągłe.
Hodowle pierwotne przygotowywane są ze świeżo izolowanych komórek,
nie można ich pasażować (przenosić z naczynia do naczynia w celu
uzyskania świeżej hodowli).
Hodowle półciągłe przygotowywane są z komórek diploidalnych, które
można pasażować od 20 do 30 razy.
Hodowle ciągłe są sporządzane z ustabilizowanych linii komórek
heteroploidalnych wywodzących się z różnych tkanek zarodków
zwierzęcych lub tkanek nowotworowych. Te komórki mogą być
pasażowane nieskończoną ilość razy.
167
Metody wykrywania i identyfikacji wirusów
Dzięki mikroskopii elektronowej można wprawdzie bezpośrednio oglądać
wirusy, jednak ta technika nie ma rutynowego zastosowania. Diagnostyka
wirusologiczna może się opierać na izolacji i hodowli wirusów,
poszukiwaniu antygenów wirusowych metodami serologicznymi,
metodach opartych na biologii molekularnej (poszukiwaniu genów
wirusowych) lub oznaczaniu przeciwciał przeciwwirusowych w surowicach
chorych.
Wykrywanie obecności wirusów w hodowlach
Najbardziej powszechna metoda polega na ocenie obrazu zmian
degeneracyjnych komórek zakażonej hodowli obserwowanych
w mikroskopie świetlnym. Zmiany te określane są jako efekt cytopatyczny
(CPE). Widoczny pod mikroskopem charakter tych zmian może sugerować
zakażenie komórek wirusem należącym do określonej rodziny. Zakażone
komórki mogą zmieniać swój kształt, ulegać zaokrągleniu, kurczyć się,
oddzielać od siebie, tworzyć skupiska komórek przypominające grona,
łączyć się tworząc wielojądrzaste twory, zwane syncytium. Wewnątrz
komórek mogą pojawiać się ciała wtrętowe, będące agregatami wirusów.
Nie wszystkie wirusy powodują takie zmiany mimo zakażenia i mnożenia
się w komórkach tkanki. Jeżeli badany wirus nie wywołuje efektu
cytopatycznego, jego obecność w hodowli komórkowej możemy ujawnić
dzięki zjawisku interferencji wirusowej, która wynika z faktu, że dwa różne
wirusy nie mogą rozwijać się w tej samej komórce. Do hodowli
komórkowej zakażanej materiałem podejrzanym o obecność
poszukiwanego wirusa, o którym wiadomo, że nie wywołuje efektu
cytopatycznego (np. wirus różyczki), wprowadzany jest wirus
wskaźnikowy, który posiada tę zdolność (np. ECHO). Jeżeli po określonym
okresie inkubacji w hodowli komórkowej nie pojawią się efekty
cytopatyczne charakterystyczne dla wirusa ECHO, można wnioskować, że
wirus obecny w badanym materiale nie dopuścił do zakażenia komórek
wirusem wskaźnikowym.
Wirusy, których osłonki zawierają hemaglutyniny mogą być pośrednio
wykrywane za pomocą techniki hemadsorbcji. W czasie replikacji, przed
168
uwolnieniem, wirusy wbudowują swe hemaglutyniny w błonę zakażonej
komórki. Gdy po kilku dniach od momentu zakażenia hodowli
komórkowej wirusami dodać do niej zawiesinę erytrocytów, przylegają
one do komórek zakażonych wirusami, za pośrednictwem tych
hemaglutynin. Zjawisko to można obserwować gołym okiem.
Gdy wirusy, które mają w swojej osłonce hemaglutyniny, zostaną
uwolnione z zakażonych komórek do podłoża płynnego, po dodaniu do
niego zawiesiny erytrocytów nastąpi hemaglutynacja. Metoda ta pozwala
nie tylko na wykrycie obecności wirusa w badanym materiale, ale także
umożliwia określenie jego ilości przez wyznaczenie miana. Jest to
odwrotność największego rozcieńczenia tego płynu, w którym widoczne
będzie gołym okiem zlepienie krwinek.
W celu identyfikacji namnożonego w hodowli wirusa należy jednak
przeprowadzić dodatkowe badania.
Identyfikacja antygenów wirusowych metodami serologicznymi
Dokładną identyfikację wirusów można osiągnąć metodami
serologicznymi, wykrywając w badanej próbce antygeny wirusowe.
Stosuje się znane wzorcowe surowice zawierające przeciwciała przeciwko
określonym gatunkom wirusów. Przeciwciała te mogą znosić zdolności
zakaźne wirionów lub bezpośrednio reagować z antygenami wirusa jeśli
jest on obecny w badanym materiale.
 Odczyny serologiczne polegające na zniesieniu zdolności zakażania.
Odczyn neutralizacji polega na połączeniu znanych przeciwciał z zawiesiną
wirusów namnożonych w hodowli komórkowej, powodujących w niej
określone zmiany. Po inkubacji mieszaniny zakaża się nią nową, wrażliwą
hodowlę komórkową. Brak efektu cytopatycznego uznaje się za wynik
wskazujący na właściwie wybraną surowicę (swoiste przeciwciała)
i pozwala zidentyfikować te wirusy.
Odczyn zahamowania hemadsorpcji wykonuje się podobnie jak odczyn
neutralizacji. Łączy się odpowiednią surowicę odpornościową z zawiesiną
wirusów wykazujących właściwości hemadsorpcyjne. Mieszaniną tą zakaża
się hodowlę komórkową. O wyniku dodatnim odczynu świadczy brak
przylegania krwinek do komórek w tej hodowli.
169
W odczynie zahamowania hemaglutynacji po dodaniu do zawiesiny
wirusów odpowiednich znanych przeciwciał nie obserwuje się zjawiska
aglutynacji erytrocytów.
Odczyny te stosuje się jednak coraz rzadziej, gdyż obecnie większość
odczynów serologicznych opiera się na odpowiednio zwizualizowanych
reakcjach bezpośrednich.
 Odczyny w których następuje bezpośrednie wiązanie się przeciwciał
z antygenami wirusowymi.
W odczynie immunofluorescencji bezpośredniej wykorzystywane są
surowice zawierające przeciwciała znakowane fluorochromem. Badany
materiał, umieszczony na szkiełku podstawowym, inkubuje się ze znaną,
znakowaną tak surowicą. Po odpłukaniu nadmiaru surowicy preparat
ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym. O obecności wirusów
w badanym materiale świadczą świecące punkty obserwowane w polu
widzenia mikroskopu fluorescencyjnego.
W odczynach lateksowych swoiste przeciwciała przeciwwirusowe są
związane z cząsteczkami lateksu. Dodanie do zawiesiny tych cząsteczek
kropli badanego materiału, w którym znajduje się poszukiwany wirus
powoduje związanie wirionów z przeciwciałami, co można ocenić gołym
okiem, obserwując aglutynację cząstek lateksu.
Odczyny immunoenzymatyczne mogą być wykorzystywane do
wykrywania w materiale badanym zarówno antygenów wirusa, jak
i swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko danemu wirusowi.
Identyfikacja wirusów metodami molekularnymi
Nowoczesne techniki biologii molekularnej pozwalają na dokładną
identyfikację przez wykrywanie i analizę genomów wirusów izolowanych
z zakażonych komórek pacjenta. Stosowane są miedzy innymi metody
hybrydyzacji wirusowego kwasu nukleinowego z sondami genetycznymi.
Sondą jest tu nić DNA lub RNA o znanej sekwencji, komplementarnej do
sekwencji poszukiwanych wirusów. Sondę znakuje się np. fluorochromem
lub enzymami. Komplementarne nici ulegają spontanicznej hybrydyzacji,
co uwidacznia się odpowiednimi technikami.
Nawet niewielką ilość kwasu nukleinowego wirusa w materiale klinicznym
można wykryć wykorzystując metodę amplifikacji odpowiednich sekwencji
170
z wykorzystaniem łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR; ang. polimerase
chain reaction) i metod pokrewnych (np. RT-PCR). W poszukiwaniach
nieznanego wirusa wywołującego zakażenie w obrębie określonego
układu (oddechowego, moczo-płciowego i in.) stosuje się PCR z kilkoma
starterami: Multiplex PCR. Metody molekularne pozwalają też na
oznaczenia ilościowe w oparciu o Real-time PCR co pozwala monitorować
przebieg chorób: np. cytomegalii czy zapalenia wątroby. Wykonuje się też
badania specjalne jak określanie lekooporności wirusów czy ich
genotypowanie.
Wykrywanie
chorych
przeciwciał
przeciwwirusowych
w
surowicach
W rozpoznawaniu infekcji wirusowej niezwykle istotne znaczenie mają
charakterystyczne objawy kliniczne. Diagnostyka laboratoryjna zwykle
potwierdza rozpoznanie przez wykrycie specyficznych przeciwciał
przeciwwirusowych w surowicy pacjenta. Określane są miana przeciwciał
w surowicy otrzymanej z krwi w ostrym okresie choroby oraz po upływie
10-14 dni od czasu pobrania pierwszej próbki. Czterokrotny wzrost miana
przeciwciał w drugiej próbce surowicy przyjmuje się jako wynik dodatni.
Takie badanie daje jednak dane retrospektywne, przydatne przede
wszystkim dla celów epidemiologicznych.
Informację o świeżym lub dawno przebytym zakażeniu wirusowym, ważną
dla postępowania leczniczego, można uzyskać poszukując w surowicy
specyficznych przeciwciał określonej klasy. Wykrycie wysokiego miana
IgM świadczy o nowej infekcji, podczas, gdy niskie miano IgM i wysokie
IgG świadczy o odporności uzyskanej w wyniku wcześniejszej choroby lub
szczepienia. Rozpoznanie świeżego zakażenia może być też dokonane
w oparciu o określenie awidności przeciwciał IgG. W obu tych przypadkach
wystarczy wtedy jedna próbka krwi pacjenta.
Do klasycznych metod serologicznych, w których wykrywa się przeciwciała
przeciwwirusowe zalicza się odczyn neutralizacji, odczyn zahamowania
hemaglutynacji, odczyn zahamowania hemadsorpcji oraz odczyn wiązania
dopełniacza. W metodach tych wykorzystywane są znane antygeny
wirusowe do poszukiwania skierowanych przeciwko nim przeciwciał
w surowicy pacjenta.
171
Obecnie w diagnostyce chorób wirusowych najczęściej wykorzystywane są
jednak: odczyn immunofluorescencji pośredniej, enzymatyczny odczyn
adsorpcyjny (ELISA), odczyn immunoenzymatyczny (EIA) oraz metoda
immunoblottingu (Western blotting).
Wrażliwość wirusów na czynniki chemiczne
Wrażliwość wirusów na środki dezynfekcyjne zależy od szeregu
czynników:
 struktury wirionu, przede wszystkim obecności lipoproteinowej
osłonki,
 zdolności do tworzenia agregatów,
 zdolności adsorpcji do powierzchni,
 stabilności w różnych warunkach środowiska,
 zachowania zakaźności na suchej powierzchni,
 obecności w środowisku substancji białkowych.
Rozpuszczalniki organiczne (chloroform, czterochlorek węgla, etery)
niszczą wirusy osłonkowe. Bezosłonkowe są niewrażliwe, także na alkohol.
Ze względu na zależną od struktury wrażliwość wirionów na wpływ
warunków środowiska wyróżnia się trzy ich grupy:
 wirusy silnie hydrofilne, bezosłonkowe: wirus polio, parvowirusy,
wirus zapalenia wątroby HAV, wirusy Coxsackie, które są najbardziej
oporne na działanie warunków środowiska;
 wirusy słabo hydrofilne, bardziej wrażliwe od poprzednich na wpływ
środowiska: adenowirusy, rotawirusy, kaliciwirusy;
 wirusy lipofilne, osłonkowe, które ulegają inaktywacji pod wpływem
czynników chemicznych: wirusy herpes, wirusy zapalenia wątroby HBV
i HCV oraz wirus HIV.
Komitet Europejski ds. Standaryzacji ustanowił, że w badaniach
skuteczności wirusobójczej preparatów dezynfekcyjnych i antyseptyków
wzorcowymi będą wirusy polio oraz adenowirusy. Kryterium decydującym
o aktywności wirusobójczej danego preparatu jest jego zdolność do
-4
obniżenia miana zakaźnego wirusa o log 4 (10 ), co oznacza utratę
zakaźności w 99,99% w czasie nie przekraczającym jednej minuty.
172
Środki dezynfekcyjne aktywne wobec wirusów można podzielić na trzy
grupy.
 Silne działające w stosunku do wszystkich wirusów – aldehydy :
glutarowy, mrówkowy, ortoftalowy oraz kwas nadoctowy;
 Umiarkowane działające – chlor i jego pochodne, alkohol etylowy
w stężeniu 75%, fenol i jego pochodne (chlorokrezol, chloroksylenol,
dwufenol – triklosan, 1-benzyl-4-chlorofenol, 2-fenylofenol, paraamylofenol) oraz jodyna;
 Słabo działające (działające tylko na wirusy osłonkowe) – chlorek
i bromek benzalkoniowy i cetrimid, dichlorowodorek oktenidyny,
chlorheksydyna i aleksydyna i jodofory.
Wrażliwość wirusów na czynniki fizyczne
Większość wirusów traci zakaźność po 30 minutach inkubacji
w temperaturze
60°C.
Obecność
w
środowisku
kationów
dwuwartościowych zmniejsza negatywny wpływ wyższych temperatur.
Oporny na wysokie temperatury jest wirus zapalenia wątroby typu B
(HBV), który nie ginie nawet w temperaturze 100°C. Wirusy dobrze
tolerują niskie temperatury. W temperaturze 4°C wirusy mogą zachować
swoją aktywność nawet przez wiele miesięcy, a w stanie zamrożenia przez
wiele lat.
Poza organizmem gospodarza wiriony dłużej zachowują zakaźność
w środowisku wilgotnym. Większość wirionów jest stabilna w środowisku
o pH w granicach od 5 do 8.
Promienie UV o długości fali 260 nm, w zależności od dawki i czasu
ekspozycji, mogą działać na genom wirusa letalnie lub mutagennie.
Promieniowanie jonizujące powoduje nieodwracalne uszkodzenie genomu
wirusa.
173
Szczepionki przeciwwirusowe
Przyczynowe leczenie infekcji wirusowych jest często trudne ze względu
na niewielką liczbę swoiście działających leków. Skuteczną metodą
zapobiegania tym zakażeniom jest stosowanie szczepień ochronnych.
Część z nich wchodzi w skład kalendarza szczepień obowiązkowych dzieci
i młodzieży. Szczepionki przeciwwirusowe zawierają materiał antygenowy,
zdolny wywołać odpowiedź immunologiczną i pozostawić w organizmie
komórki pamięci immunologicznej pozwalające na szybką reakcję
odpornościową w sytuacji ponownego spotkania z wirusami. Tym samym
zapobiegają one chorobom wirusowym, często groźnym nawet dla życia.
Szczepionki mogą zawierać żywe atenuowane wirusy, które pozbawione
są cech zjadliwości, a mogą mnożyć się w organizmie stymulując
odporność. Atenuację uzyskuje się obecnie metodami genetycznymi,
wywołując mutacje – wielopunktowe delecje. Szczepionki mogą zawierać
także wirusy zabite (szczepionki inaktywowane). Coraz częściej konstruuje
się szczepionki podjednostkowe – zawierające tylko fragmenty wirionów
lub odpowiednie białka wirusowe mające właściwości protekcyjne.
Metody
Hemaglutynacja wirusowa
Odczyn hemaglutynacji wirusowej nastawiany jest zwykle w mikroskali –
na pleksiglasowych płytkach titracyjnych o wgłębieniach o pojemności ok.
100 L.
- W dołkach płytki dokonuje się szeregu dwukrotnych rozcieńczeń
badanego materiału zawierającego wirusy w roztworze fizjologicznym
NaCl.
- Następnie do dołków dodaje się zawiesinę krwinek ludzkich grupy 0.
- Inkubacja płytki w temperaturze pokojowej już po ok. 2 godzinach
ujawnia powstawanie aglutynatów krwinek. Są one widoczne jako
ziarnisty osad pokrywający dno zagłębienia.
174
- Brak hemaglutynacji objawia się opadnięciem krwinek na dno dołka.
- Znajdując największe rozcieńczenie, w którym hemaglutynacja wystąpiła
określa się miano wirusa. Wartość ta we względny sposób określa liczbę
cząstek wirusa w badanym płynie.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Odczytanie odczynu hemaglutynacji wirusowej
Należy obliczyć miano hemaglutynacyjne wirusa grypy w płynie pobranym
z zakażonego doowodniowo zarodka kurzego.
Zadanie 2
Szczepionki przeciwwirusowe
Uzupełnij poniższą tabelę:
Wirus
Genom
DNA/RNA
Szczepionka
atenuowana/
inaktywowana/
podjednostkowa
Szczepienia
obowiązkowe/
zalecane
Zapalenie
wątroby typu A
Zapalenie
wątroby typu B
Różyczka
175
Odra
Brodawczaki
narządów
płciowych
Zapalenie
przyusznic
Poliomyelitis
Grypa
Odkleszczowe
zapalenie
mózgu
Wścieklizna
Ospa wietrzna
i półpasiec
Biegunka
rotawirusowa
176
177
178
Rozdział 14
Mikologia
Część teoretyczna
Budowa grzybów
Grzyby są organizmami eukariotycznymi. Unikatowa ściana komórkowa
grzybów zawiera m. in. chitynę, mannany i glukany. W błonie
cytoplazmatycznej grzybów obecne są sterole (ergosterol). Substancje
zapasowe gromadzone w komórce grzybów to głównie tłuszcze i glikogen.
Komórki grzybów są większe od komórek bakteryjnych (2-40 μm).
Na podstawie budowy oraz ze względów praktycznych i klinicznych grzyby
dzieli się na cztery grupy: drożdże i grzyby drożdżopodobne, pleśniowe
(nitkowate), dermatofity oraz grzyby dimorficzne.
Grzyby występują w postaci strzępek, pseudostrzępek, lub luźno
ułożonych komórek wegetatywnych.
Rozgałęzione strzępki tworzą plechę (grzybnię). Jej górną warstwę stanowi
grzybnia rozrodcza (reprodukcyjna), na której powstają zarodniki płciowe
lub bezpłciowe. Wzrastające w formie mycelialnej grzyby mające udział w
patogenezie chorób u człowieka wytwarzające grzybnię, na podłożach
sztucznych dają puszyste kolonie. Grzyby rosnące w postaci wolnych
pojedynczych komórek wegetatywnych należą głównie do drożdży lub
grzybów drożdżopodobnych (drożdżaków). W hodowlach na podłożach
stałych dają one płaskie kolonie, podobne do bakteryjnych. Niektóre
drożdżaki (np. Candida albicans) w zakażonym organizmie mogą
wytwarzać pseudostrzępki, które ułatwiają penetrację zajętych tkanek.
Niektóre grzyby mogą wykazywać zróżnicowany wzrost, w zależności od
warunków środowiska. Grzyby dimorficzne (dwupostaciowe, dwufazowe)
występują często w postaci grzybni w środowisku, a w zakażonych
tkankach przyjmują formę drożdżaków.
179
Rozmnażanie grzybów
Stadium rozmnażania płciowego u grzybów nazywane jest stadium
teleomorficznym (doskonałym). Większość grzybów chorobotwórczych w
zakażonym organizmie występuje jedynie w formie anamorficznej
(niedoskonałej).
Rozmnażanie bezpłciowe grzybów obejmuje tworzenie zarodników lub
fragmentację grzybni.
 Zarodniki mogą mieć charakter endogeniczny, a powstające w
workopodobnej zarodni (sporangium) umieszczonej na strzępkach
zarodnionośnych (sporangiofory) noszą nazwę zarodników sporangialnych
(sporangiospory).
 Zarodniki egzogenicznie tworzone są na strzępkach (aleurospory),
pseudostrzępkach i komórkach wegetatywnych (blastospory) czy
specjalnych strukturach - konidioforach (fialospory).
 Przez fragmentację grzybni uwalniane są artrospory (konidia
plechowe).
 Konidia przetrwalne (chlamydospory) mają grubą ścianę oporną na
działanie czynników zewnętrznych i uwalniane są w warunkach
niekorzystnych, np. głodu, ale mogą wchodzić również w cykl rozwojowy
niektórych rodzajów.
Klasyfikacja grzybów i ich znaczenie kliniczne
Klasyfikacja grzybów ulega ciągłej zmianie, opiera się ona zarówno na ich
rzeczywistym pokrewieństwie genetycznym, jak i na cechach
fenotypowych.
Tylko niewielka część opisanych gatunków grzybów jest chorobotwórcza
dla człowieka. Grzyby wywołujące zakażenia u ludzi należą do
następujących, niżej wymienionych klas.
 Ascomycetes (workowce) stanowią największą grupę grzybów,
obejmującą 80% gatunków chorobotwórczych i oportunistycznych. Klasa
ta obejmuje pleśnie (Penicillum, Aspergillus), dermatofity (Trichophyton,
Epidermophyton i Microsporum), grzyby dimorficzne (Histoplasma,
180
Coccidioides, Sporothrix) oraz Pneumocystis Jirovenci (daw. P. carinii –
przez długi czas zaliczane do pierwotniaków).
 Wśród klasy Basidiomycetes (podstawczaki) najważniejszymi
rodzajami są drożdżopodobne grzyby Cryptococcus (oportunistyczny
patogen układu oddechowego i ośrodkowego układu nerwowego),
Malassezia (Pityrosporum) i Trichosporon (głównie odpowiedzialne za
typowe grzybice powierzchniowe).
 Klasa Zygomycetes obejmują gatunki występujące w żywności, glebie
i powietrzu. Najważniejsze z medycznego punktu widzenia są rodzaje
Rhizopus, Mucor i Absidia. Są one typowymi patogenami
oportunistycznymi. Wywołują zygomikozę (mukormikozę) nosowomózgową oraz innych narządów i tkanek. Infekcje te występują przede
wszystkim u pacjentów chorujących na cukrzycę, a także choroby
upośledzające mechanizmy odporności immunologicznej.
 Deuteromycetes (grzyby niedoskonałe; Fungi imperfecti) są sztuczną
jednostką taksonomiczną obejmującą grzyby występujące jedynie
w formie anamorficznej. Szeroko zakrojone badania taksonomiczne
pozwoliły również na odnalezienie w środowisku teleomorficznych form
większości chorobotwórczych gatunków pierwotnie przynależnych do
grzybów niedoskonałych
Hodowla grzybów chorobotwórczych
Grzyby są organizmami heterotroficznymi i do swojego wzrostu wymagają
związków organicznych. Mają niewielkie wymagania pokarmowe i rosną
dobrze na podłożach zawierających pepton i węglowodan. Są mezofilami,
ale rosną w szerokim zakresie temperatur (10-48°C), co związane jest
z miejscem ich naturalnego bytowania. Grzyby izolowane ze skóry osiągną
optimum wzrostu w temperaturze 25-35°C, podczas gdy te, izolowane
z zakażeń narządów wewnętrznych będą lepiej rosły w temperaturze 37°C.
Organizmy te są tlenowcami lub względnymi beztlenowcami. Optymalna
wartość pH podłoża wynosi 5,0-6,0, jednak wiele gatunków może rosnąć
w bardzo szerokim zakresie pH.
Ze względu na stosunkowo wolny wzrost grzybów (szczególne
nitkowatych), hodowane są one na podłożach wybiórczych względem
181
bakterii, np. zawierających wysokie stężenia sacharozy (nawet 50%) lub
antybiotyki przeciwbakteryjne.
Klasyczną pożywką do izolacji lub hodowli grzybów jest podłoże
Sabouraud (płynne lub stałe), zawierające pepton i 4% glukozy lub
maltozy.
Chorobotwórczość grzybów
Zakażenia grzybicze mogą mieć charakter endogenny bądź egzogenny.
Niektóre grzyby, np. Candida, wchodzą w skład naturalnej flory organizmu
ludzkiego i mogą one stanowić źródło zakażeń endogennych. Infekcje
egzogenne mogą być nabywane drogą wziewną (aspergiloza,
kryptokokoza), kontakt bezpośredni z zakażoną osobą, zwierzęciem,
przedmiotem czy glebą (dermatofitozy).
Ze względu na drogi wnikania, powinowactwo do tkanek oraz na obraz
kliniczny grzybice dzieli się na następujące omówione poniżej kategorie.
Grzybice powierzchowne
Wywołujące je grzyby nie wnikają pod powierzchowne, martwe warstwy
naskórka, włosów i paznokci. Zmianom nie towarzyszy też na ogół
odpowiedź zapalna lub jest ona niewielka. Grzybicą powierzchowną,
występującą często na całym świecie, jest łupież pstry wywoływany przez
lipofilny grzyb drożdżopodobny Malassezia furfur. Łupież pstry
manifestuje się złuszczającymi wykwitami w kolorze od białego do
brązowego, zajmującymi głównie skórę klatki piersiowej, szyi i ramion.
Innym przykładem grzybicy powierzchownej jest biała piedra (łupież biały)
wywoływana przez Trichosporon beigelli (syn T.cutaneum). Schorzenie
cechuje tworzenie białych złogów na włosach, głównie twarzy, pachowych
i łonowych.
Gatunki te opisywane były również jako czynniki etiologiczne rozsianych
zakażeń oportunistycznych u pacjentów z zaburzoną odpowiedzią
immunologiczną. Wywoływane przez nie fungemie związane są z wysoką
śmiertelnością.
182
Grzybice skóry i błon śluzowych
Grzybice skóry i jej przydatków wywoływane są przez dermatofity, ale
również grzyby drożdżopodobne oraz pleśnie.
Dermatofity są grzybami mającymi zdolność atakowania zrogowaciałych
tkanek gospodarza. Grzyby te dysponują zespołem enzymów
keratynolitycznych, dzięki czemu penetrują te tkanki. Do dermatofitów
należą trzy rodzaje: Trichophyton, Epidermophyton i Microsporum.
Wykazują one podobieństwo morfologiczne, fizjologiczne oraz patogenne,
a ich różnicowanie często oparte jest na klasyfikacji ekologicznej.
Zakażenia wywoływane przez dermatofity (dermatofitozy) dotyczą skóry
gładkiej, owłosionej oraz paznokci. Gatunkami najczęściej opisywanymi są
T. rubrum i T. mentagrophytes. T. rubrum jest najczęstszym czynnikiem
etiologicznym grzybicy stóp i paznokci. Rodzaj Trichophyton może
wywoływać grzybice zlokalizowane w dowolnych miejscach skóry i na jej
przydatkach. Grzybice stóp i paznokci, a także pachwin i tułowia często
wywoływane są przez Epidermophyton floccosum spotykany często
w dużych skupiskach ludzi (akademiki, koszary, kąpieliska). Najczęściej
opisywany gatunek Microsporum to M. canis. Atakuje on najczęściej skórę
owłosioną, a do infekcji tych szczególnie predysponowane są dzieci.
Pleśnice skóry są rzadziej opisywane i często towarzyszą one innym
zakażeniom grzybiczym. Pleśnice paznokci stóp wywoływane są
najczęściej przez Scopulariopsis brevicaulis
Grzybice wywoływane przez grzyby drożdżopodobne dotyczą skóry,
paznokci, a także błon śluzowych. Głównym czynnikiem etiologicznym
tego rodzaju infekcji jest Candida albicans, ale również inne gatunki
należące do tego rodzaju (C. tropicalis). Zmiany skórne pojawiają się
najczęściej w miejscach wilgotnych, jak pachwiny, pachy, fałdy skórne,
krocze. Szczególnie predysponowane są osoby starsze, otyłe, obarczone
dodatkowymi chorobami oraz pracujące w wilgoci. Drożdżakowe
zakażenia błon śluzowych mogą rozwijać się w obrębie jamy ustnej,
dalszych odcinków przewodu pokarmowego, a także narządów płciowych.
Czynnikami predysponującym są protezy zębowe, szerokowidmowa
antybiotykoterapia, cukrzyca, ciąża. Infekcja pochwy u ciężarnej może
doprowadzić do zakażenia wewnątrzmacicznego i kandydozy wrodzonej
płodu. Do zakażenia tymi grzybami może dojść również w czasie porodu.
183
Zmiany skórne mogą mieć również charakter wtórny, kiedy powstają na
skutek rozsiewu grzybów drogą krwi w przebiegu grzybicy rozsianej
(Aspergillus, Fusarium, Penicillium marneffei, Candida).
Grzybice tkanki podskórnej
Grzybice tkanki podskórnej spotykane są głównie w strefie tropikalnej
i subtropikalnej. Grzyby wywołujące te schorzenia bytują w glebie
i dostają się do organizmu przez uszkodzoną skórę. Początkowo powstaje
niewielki guz, następnie obrzęk oraz przetoki, z których wypływa ropa
zawierająca elementy grzyba. Choroba szerzy się na tkanki głębiej
położone – powięzi, mięśnie, a nawet kości. Przykładem jest sporotrichoza
wywoływana przez Sporothtix schenkii.
Grzybice układowe
Grzybice układowe obejmują dwa typy schorzeń.
 Zakażenia patogenami układu oddechowego (histoplazmoza,
blastomikoza). Wywoływane są one przez grzyby dimorficzne bytujące
w glebie. Do zakażenia dochodzi przez wdychanie kurzu z zarodnikami
grzybów. Obraz kliniczny jest wysoce zróżnicowany - od zakażeń
bezobjawowych, niewymagających leczenia, przez objawy płucne
przypominające gruźlicę, aż do rozsianych zakażeń o wysokiej
śmiertelności.
 Drugi typ to grzybice oportunistyczne (kandydoza, aspergiloza,
zygomikoza, kryptokokoza), wywoływane przez grzyby o niewielkim
potencjale chorobotwórczości, rozwijające się u pacjentów z upośledzoną
odpornością immunologiczną.
Najczęściej występują kandydozy (przede wszystkim zakażenia
C. albicans). Infekcje te mogą mieć charakter endogenny, a źródłem jest
głównie przewód pokarmowy. Stąd często rozpoczyna się zakażenie, które
następnie drogą krwi może objąć każdy narząd (nerki, wątrobę, serce,
OUN).
Aspergiloza najczęściej wywoływana jest przez A. fumigatus i A. flavus
poprzez wdychanie ich zarodników. Dostają się one do płuc, ale również
zatok, ośrodkowego układu nerwowego. W aspergilozie inwazyjnej może
dojść do zajęcia większości narządów wewnętrznych.
184
Zygomikoza (mukormikoza) wywoływana grzyby Mucor, Rhizopus, Absidia.
Najczęściej dochodzi do zygomikozy układu oddechowego lub zygomikozy
układu pokarmowego. Zygomikoza nosowo-mózgowa występuje
najczęściej u pacjentów z cukrzycową kwasicą ketonową. Kryptokokoza
wywoływana jest przez Cryptococcus neoformans – drożdże bytujące
w odchodach kur i gołębi. Do zakażenia dochodzi drogą inhalacyjną
izakażenie najczęściej obejmuje płuca, w dalszej kolejności opony
mózgowo-rdzeniowe i mózg, gdyż grzyb ten wykazuje silne
powinowactwo do ośrodkowego układu nerwowego.
Nadwrażliwość na antygeny grzybów
Najczęściej opisywana jest alergia na zarodniki grzybów pleśniowych.
Nadwrażliwość organizmu na antygeny grzybów może przybrać obraz
kliniczny astmy oskrzelowej czy alergicznego nieżytu nosa i zatok. Również
antygeny Candida czy Trichophyton mogą działać uczulająco, zmieniając
przebieg toczącej się typowej dla nich infekcji grzybiczej.
Mikotoksykozy
Są to zatrucia mikotoksynami - wtórnymi metabolitami grzybów
pleśniowych (Aspergillus, Penicillium) oraz tzw. czarnych grzybów. Nie
towarzyszy im inwazja grzybów do organizmu człowieka. Do
najważniejszych mikotoksyn należą aflatoksyny, ochratoksyna A.
Mikotoksyny mogą znajdować się w produktach roślinnych (zielony
groszek, kukurydza, orzeszki ziemne), a także mleku i mięsie zwierząt
żywionych spleśniałą paszą. Ostre zatrucia najczęściej dotyczą zaburzeń
funkcji wątroby, nerek oraz szpiku kostnego i mogą prowadzić nawet do
śmierci. Mikotoksyny mogą również działać uczulająco, neurotoksycznie
oraz karcynogennie i teratogenne. Długotrwałe spożywanie nawet małych
dawek mikotoksyn może prowadzić do zmian nowotworowych, głównie
wątroby.
185
Znaczenie grzybów dla człowieka
Chorobotwórczość grzybów może dotyczyć również zwierząt i roślin.
Patogeny te mogą powodować straty w rolnictwie i hodowli.
Korzystne cechy grzybów zostały wykorzystane przez człowieka
w biotechnologii żywności i medycyny. Zdolność prowadzenia wydajnej
fermentacji alkoholowej przez Saccharomyces cerevisiae od wieków jest
szeroko wykorzystywana w przemyśle piekarniczym i alkoholowym. Dzięki
inżynierii genetycznej gatunek ten wykorzystywany jest również przy
produkcji np. szczepionek. Aspergillus niger jest wykorzystywany jako
producent kwasów organicznych (kwas cytrynowy). Liczne gatunki
Penicillium są ważnymi producentami antybiotyków (np. P. griseofulvus
jest producentem gryzeofulwiny; P. chrysogemum penicyliny G). Specjalne
tzw. kultury grzybów wykorzystywane są w przemyśle mleczarskim.
Identyfikacja grzybów chorobotwórczych
W rozpoznawaniu grzybów nitkowatych istotnym elementem jest ocena
mikroskopowa. W przypadku materiału klinicznego wykonuje się tzw.
preparat
rozjaśniony,
poddany
działaniu KOH lub DMSO
(dwumetylosulfotlenek), które rozpuszczają zanieczyszczenia. Ocena
mikroskopowa preparatów bezpośrednich bywa niewystarczająca i wtedy
pomocne są mikrohodowle zakładane na szkiełkach podstawowych.
Istotne znaczenie mają cechy morfologiczne hodowli grzybów nitkowatych
takie, jak wygląd grzybni, kształt, barwa, wielkość i wydzielany barwnik do
podłoża, stopień puszystości.
W przypadku grzybów drożdżopodobnych ocena makroskopowa hodowli
i mikroskopowa ma znacznie mniejsze znaczenie. W identyfikacji
wykorzystuje się różnicujące grzyby drożdzopodobne cechy metaboliczne:
zdolność przyswajania węgla lub azotu z różnych źródeł. Dla zbadania tej
cechy wykonuje się auksanogram. Na podłożu minimalnym nie
zawierającym źródeł węgla lub azotu, posiewa się badany szczep
i umieszcza krążki nasączone związkami węglowodanowymi lub
azotowymi. Wzrost wokół krążka świadczy o zdolności asymilacji węgla lub
azotu z tego związku. Wykorzystuje się też zdolność grzybów
186
drożdżopodobnych do fermentacji rożnych węglowodanów. Zestaw
podłoży zawierających węglowodany i wskaźnik barwny stanowi
zymogram pozwalający na ocenę tych zdolności. Zmiana barwy podłoża w
wyniku zakwaszenia środowiska świadczy o fermentacji.
W różnicowaniu dermatofitów wykorzystuje się preparat rozjaśniony
i mikrohodowle. Zakłada się też hodowle
na podłożach stałych.
Dermatofity rosną wolno (do 6 tygodni), ale wygląd ich kolonii jest bardzo
charakterystyczny. W różnicowaniu dermatofitów znaczenie ma również
tzw. test perforacji włosa. Test polega na ocenie zdolności uszkadzania
powierzchni włosa np. przez Trichophyton mentagrophytes.
Różnicowanie grzybów dimorficznych opiera się także na cechach
mikroskopowych oraz na hodowli i ocenie wyglądu makroskopowego
grzybni.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Preparat w kropli spłaszczonej z hodowli drożdży
- Umieść na szkiełku podstawowym kroplę wody.
- Zawieś w tej kropli niewielką ilość drożdży pobranych ezą z hodowli na
stałym podłożu Sabouraud.
- Przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym.
- Oglądaj preparat pod mikroskopem (powiększenie 200-400x).
187
Zadanie 2
Preparat w kropli spłaszczonej z hodowli grzybów nitkowatych
- Z hodowli na podłożu Sabouraud pobierz ezą grzybnię lub jej fragment
i umieść w jałowej płytce Petriego.
- Posługując się igłami preparacyjnymi delikatnie rozerwij grzybnię na
małe fragmenty.
- Przenieś kawałek grzybni na szkiełko podstawowe.
- Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i oglądaj preparat pod mikroskopem
(powiększenie 200-400x); staraj się odnaleźć fragmenty grzybni rozrodczej
(konidiofory i konidia).
Zadanie 3
Odczytanie zymogramu
Otrzymujesz zymogramy posiane Candida albicans
pseudotropicalis. Odczytaj wyniki i wpisz je do tabeli.
Węglowodan
C. albicans
i
Candida
C. pseudotropicalis
188
Zadanie 4
Cechy morfologii grzybów
Otrzymujesz hodowle na podłożu płynnym i stałym różnych grzybów.
Przyporządkuj je do grup i wpisz do tabelki ich cechy.
Grzyby
Hodowla na
podłożu
płynnym
Hodowla na
Obraz
podłożu
mikroskopowy
stałym
Wywoływane
choroby lub
cechy
wykorzystywanie
przez człowieka
Drożdże
Nitkowate
189
Dermatofity
190
Rozdział 15
Bakterie w lekach – kontrola czystości
mikrobiologicznej
Część teoretyczna
Przyczyny zanieczyszczenia mikrobiologicznego leków
Czystość mikrobiologiczna leków zależy od:
 zanieczyszczenia surowców,
 technologii produkcji,
 zanieczyszczenia urządzeń produkcyjnych i powietrza,
 higieny personelu,
 sposobu konfekcjonowania, czystości opakowań
i warunków
przechowywania gotowych preparatów.
Głównym źródłem zanieczyszczenia leków produkowanych zarówno przez
przemysł, jak i w aptece są surowce farmaceutyczne, substancje
pomocnicze oraz woda destylowana. Stwierdzono na przykład, że
podstawowym źródłem obecności Escherichia coli w tabletkach
i drażetkach jest skrobia. Drobnoustrój ten znajdowano także w wielu
innych surowcach pochodzenia roślinnego. Znaczne ilości bakterii
zawierają surowce pochodzenia zwierzęcego, na przykład te, które służą
do produkcji organopreparatów. Typowymi są tu bakterie z rodzaju
Clostridium, Escherichia coli, Enterococcus faecalis.
Na poziom zanieczyszczenia leków drobnoustrojami duży wpływ ma także
technologia ich produkcji. Przykładem mogą być leki w postaci
granulatów. Temperatura 40°C, w jakiej przebiega proces granulowania
i duża wilgotność sprzyjają mnożeniu się drobnoustrojów, które mogą
znaleźć się w łączonych składnikach. Niektóre preparaty, na przykład
maści, stwarzają szczególnie dogodne warunki dla przetrwania
drobnoustrojów, a inne przeszkadzają skutecznej sterylizacji.
191
Zagrożenia ze strony drobnoustrojów obecnych w lekach
Obecność drobnoustrojów w leku może być przyczyną zakażenia
pierwotnego lub wtórnego. W lekach niebezpieczeństwo stanowią
zarówno bakterie chorobotwórcze, jak i oportunistyczne. Do najczęściej
spotykanych należą bakterie z rodzaju Escherichia, Pseudomonas,
Staphylococcus, Klebsiella, Salmonella i Clostridium. Niebezpieczeństwo,
jakie stwarza obecność tych bakterii w lekach, zależy między innymi od
sposobu podania leku, a wraz z nim, drogi wprowadzenia bakterii do
organizmu. W lekach doustnych szczególnie groźne są pałeczki z rodziny
Enterobacteriaceae. W lekach do użytku zewnętrznego szczególne
niebezpieczeństwo stanowią bakterie z rodzajów Pseudomonas
i Staphylococcus.
Drobnoustroje wytwarzają toksyny i enzymy, które są wydzielane do
środowiska lub uwalniane w wyniku rozpadu komórki. Nagromadzenie
lipopolisacharydu (endotoksyny)
w lekach parenteralnych może
prowadzić do wystąpienia groźnego dla życia pacjenta wstrząsu
endotoksycznego. Pseudomonas aeruginosa namnażając się w lekach do
oczu wytwarza enzymy proteolityczne, niszczące kolagen rogówki oka.
Możliwość wywołania zakażenia przez lek zawierający drobnoustroje jest
tylko jednym z aspektów szkodliwego ich działania. Drobnoustroje mogą
również rozkładać substancje lecznicze, inaktywując je lub zmieniając ich
działanie farmakologiczne. Wiele bakterii znanych jest ze zdolności
przebudowywania cząsteczki sterydów, rozkładu glikozydów, a nawet
alkaloidów.
Szereg
antybiotyków,
środków
dezynfekujących
i konserwujących ulega degradacji w wyniku działania drobnoustrojów,
tracąc swą aktywność biologiczną. Obecności bakterii w leku można zatem
przypisywać niepowodzenia w terapii.
Leki należy zatem wytwarzać w warunkach aseptycznych. Zasada ta musi
dotyczyć nie tylko leków, dla których wymagana jest jałowość (np.
preparaty parenteralne i do oczu), ale także leków, dla których przepisy
nie wymagają jałowości (np. leki doustne lub stosowane zewnętrznie).
Postępowanie aseptyczne jest konieczne nawet w przypadku tych leków,
które są następnie poddawane wyjaławianiu, z obawy przed produktami
192
metabolizmu drobnoustrojów lub związków uwalnianych w wyniku
rozpadu komórek.
Normy (wymagania) czystości mikrobiologicznej leków
Biorąc pod uwagę zastosowanie oraz drogę podawania leków wymagania
dotyczące ich czystości mikrobiologicznej są różne. Pewne leki powinny
być jałowe - całkowicie wolne od żywych drobnoustrojów, inne
mikrobiologicznie czyste we wskazanym dla kategorii zakresie.
Tabela 1. Kryteria akceptacji dla mikrobiologicznej jakości niejałowych
produktów farmaceutycznych i substancji do celów farmaceutycznych
wg FP IX
Grupa preparatów
Preparaty doustne nie
zawierające wody
Preparaty doustne
zawierające wodę
Wymagania
3
2
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL
2
1
3
2
2
1
2
1
2
1
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL
Preparaty
doodbytnicze
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
Preparaty:
-na skórę i błony
śluzowe
-do nosa, uszu i gardła
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL
Nieobecność Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa w 1 g lub 1 mL.
Preparaty
dopochwowe
Systemy
transdermalne
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL
Nieobecność Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa , Candida albicans w 1 g lub 1 mL.
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów (na jeden
plaster łącznie z warstwą adhezyjną i zewnętrzną
warstwą nośną). Nieobecność Staphylococcus aureus
i Pseudomonas aeruginosa
193
Preparaty wziewne
(jeżeli nie mają
wymagań jałowości)
Leki doustne
zawierające surowce
pochodzenia
naturalnego
(zwierzęcego,
roślinnego lub
mineralnego),
których nie poddaje
się wstępnej obróbce
zmniejszającej liczbę
drobnoustrojów i dla
których dopuszcza
się zanieczyszczenie
mikrobiologiczne
surowców większe
3
niż 10
drobnoustrojów w
1g lub 1mL
Roślinne produkty
lecznicze,
zawierające
substancje roślinne,
z dodatkiem lub bez
substancji
pomocniczych,
poddawane przed
użyciem działaniu
wrzącej wody.
2
1
4
2
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
Nieobecność Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa w 1 g lub 1 mL.
Nieobecność bakterii gramujemnych tolerujących żółć
w 1 g lub 1 mL
Nie więcej niż 10 bakterii i 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
2
Nie więcej niż 10 bakterii gramujemnych tolerujących
żółć w 1 g lub 1 mL.
Nieobecność Salmonella w 10 g lub 10 mL.
Nieobecność Escherichia coli, Staphylococcus aureus
w 1 mL
7
Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g. Maksymalna
7
dopuszczalna liczba bakterii 5x10 CFU/g.
3
Nie więcej niż 10 Escherichia coli w 1 g.
Nieobecność Salmonella w 25 g.
5
Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g.
5
Maksymalna dopuszczalna liczba grzybów 5x10 CFU/g.
194
Roślinne produkty
lecznicze, zawierające
np. wyciągi i/lub
substancje roślinne,
z dodatkiem lub bez
substancji
pomocniczych, dla
których metoda
wytwarzania
(np. ekstrakcja) lub
wstępne postępowanie,
prowadzi do obniżenia
liczby drobnoustrojów
Roślinne produkty
lecznicze, zawierające
np. wyciągi i/lub
substancje roślinne,
z dodatkiem lub bez
substancji
pomocniczych, dla
których metoda
wytwarzania
(np. ekstrakcja) lub
wstępne postępowanie,
nie prowadzi do
wystarczającego
obniżenia liczby
drobnoustrojów
Substancje do celów
farmaceutycznych
4
Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g lub 1 mL.
4
Maksymalna dopuszczalna liczba bakterii 5x10 CFU
w 1 g lub 1 mL.
2
Nie więcej niż 10 bakterii gramujemnych tolerujących
żółć w 1 g lub 1 mL.
Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL
Nieobecność Salmonella w 25 g lub 25 mL.
2
Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
2
Maksymalna dopuszczalna liczba grzybów 5x10 CFU
w 1g lub 1 mL.
5
Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g lub 1 mL.
5
Maksymalna dopuszczalna liczba bakterii 5x10 CFU
w 1 g lub 1 mL.
4
Nie więcej niż 10 bakterii gramujemnych tolerujących
żółć w 1 g lub 1 mL.
Nieobecność Escherichia coli w 1 g lub 1 mL
Nieobecność Salmonella w 25 g lub 25 mL.
4
Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
4
Maksymalna dopuszczalna liczba grzybów 5x10 CFU
w 1 g lub 1 mL.
3
Nie więcej niż 10 bakterii w 1 g lub 1 mL.
2
Nie więcej niż 10 grzybów w 1 g lub 1 mL.
W mikrobiologicznej ocenie leków jałowych obowiązuje analiza jałowości
określana metodami farmakopealnymi (Farmakopea Polska IX). Dla
195
pozostałych leków/produktów stopień skażenia drobnoustrojami określa
się ilościowo i przeprowadza ich identyfikację.
Metody
Badanie jałowości leków
Definicja jałowości jest trudna do weryfikacji doświadczalnej, a wyniki
kontroli jałowości są względne, gdyż dają odpowiedź tylko w ścisłych
granicach zastosowanych metod.
Lekami, które muszą być jałowe, są wszystkie leki podawane
parenteralnie i leki stosowane w okulistyce. Jałowe muszą być także
materiały opatrunkowe, nici chirurgiczne, igły, strzykawki, cewniki,
zestawy kroplówkowe, narzędzia chirurgiczne.
W badaniu jałowości można wyróżnić kilka podstawowych zasad, od
których zależy uzyskanie wiarygodnych danych. Są to:
 aseptyczne postępowanie w czasie badania, w celu uniknięcia
wprowadzenia wtórnych zakażeń do pierwotnie jałowego materiału;
 ustalenie odpowiedniej wielkości badanej próbki, reprezentatywnej
dla całości badanego materiału;
 właściwy dobór pożywek wzrostowych, warunków inkubacji oraz
usunięcie wszystkich czynników hamujących rozwój drobnoustrojów,
gdyż podstawą badania jałowości jest obserwacja wzrostu
drobnoustrojów.
Standardowe badanie jałowości bierze pod uwagę tylko część bakterii
tlenowych, beztlenowych i grzybów i nie obejmuje wirusów ze względu na
trudną i kosztowną technikę.
Tabela 2 pokazuje wielkość próbek, które muszą być pobrane do kontroli
jałowości. Zależy ona od objętości pojemnika i liczebności tzw. serii
bakteriologicznej. Seria bakteriologiczna jest to partia pojemników
określonego
leku
wyjaławianych
podczas
jednego
procesu
sterylizacyjnego lub zawierających lek sterylizowany drogą filtracji
bakteriologicznej przez jeden sączek.
196
Tabela 2. Minimalna ilość leku posiewana na każde podłoże wg FP IX
Ilość w pojemniku
Wielkość próbki do badania
Płyny:
Mniej niż 1 mL
Cała zawartość pojemnika
Połowa zawartości każdego
1 mL-40 mL
pojemnika, jednak nie mniej niż
1 mL
Więcej niż 40 mL, lecz nie więcej
20 mL
niż 100 mL
10% zawartości każdego pojemnika,
Więcej niż 100 mL
jednak nie mniej niż 20 mL
Płynne preparaty antybiotyków
1 mL
Nierozpuszczalne preparaty, kremy
Cała zawartość każdego pojemnika,
i maści, które zawiesza się lub
nie mniej niż 200 mg
emulguje
Substancje stałe:
Mniej niż 50 mg
Cała zawartość każdego pojemnika
Połowa zawartości każdego
50 mg lub więcej, lecz mniej niż 300
pojemnika, jednak nie mniej niż
mg
50 mg
Od 300 mg do 5g
150 mg
Więcej niż 5g
500 mg
Katgut i inne nici do użytku
3 odcinki zwoju (każdy o długości
weterynaryjnego
30 cm)
Pożywki stosowane w kontroli jałowości muszą spełniać następujące
warunki:
 zapewniać rozwój możliwie szerokiego zakresu bakterii i grzybów,
 umożliwiać rozwój bakterii tlenowych i beztlenowych,
 umożliwiać szybki rozwój drobnoustrojów.
Używa się dwóch podstawowych pożywek płynnych: tioglikolanowej
(Brewera), zapewniającej wzrost bakterii beztlenowych i tlenowych oraz
kazeinowo-sojowej, odpowiedniej zarówno dla grzybów, jak i bakterii
tlenowych.
197
Kontrole, które musza towarzyszyć każdemu badaniu jałowości to:
 kontrola jałowości pożywek polegająca na inkubacji przez 14 dni
nieposianych pożywek: tioglikolanowej w temp. 30-35°C, kazeinowosojowej w temp. 20-25°C;
 kontrola przydatności pożywek uzyskana przez posianie na pożywki
szczepów wzorcowych w zawiesinach zawierających około 100
CFU/mL; na podłoże tioglikolanowe należy posiać: Clostridium
sporogenes, Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, a na
podłoże kazeinowo-sojowe: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis
i Candida albicans, a następnie je inkubować nie dłużej niż 3 dni
w przypadku bakterii i nie dłużej niż 5 dni w przypadku grzybów;
 kontrola wzrostu drobnoustrojów w obecności leku – walidacja
badania, polegająca na posianiu wyżej wymienionych szczepów
wzorcowych na pożywki zawierające badany lek. Kontrola ma na celu
sprawdzenie, czy lek nie hamuje wzrostu bakterii lub grzybów i pozwala na
wybór odpowiedniej metody badawczej. Po wykonaniu prób wszystkie
pożywki należy inkubować nie dłużej niż 5 dni.
Metody badania jałowości:
Posiew bezpośredni polega na wprowadzeniu do podłoża hodowlanego
produktu badanego tak, aby objętość produktu stanowiła nie więcej niż
10% objętości podłoża, o ile nie ma innych wymagań. Jeżeli badany
produkt posiada właściwości przeciwdrobnoustrojowe, należy je najpierw
zneutralizować odpowiednią substancją neutralizującą lub rozcieńczyć lek
w wystarczająco dużej objętości podłoża. Maści, kremy i płyny olejowe
należy przenieść do podłoża emulgującego, np. pożywki z Tweenem 80.
Sączeniem przez filtry membranowe bada się preparaty wodne,
alkoholowe i olejowe oraz preparaty rozpuszczalne w wodzie lub
rozpuszczalnikach olejowych pod warunkiem, że rozpuszczalniki te nie
wykazują w warunkach badania działania przeciwdrobnoustrojowego.
Metoda ta zalecana jest także w przypadku badania leków, które ze
względu na wielkość pojemnika, muszą być zbadane w dużej objętości –
powyżej 100 mL. Próbkę leku należy przesączyć przez filtr bakteriologiczny
o wielkości porów nie większej niż 0,45 μm. Jeżeli produkt posiada
198
właściwości przeciwdrobnoustrojowe, po przesączeniu leku filtr należy
przepłukać co najmniej trzema porcjami (po 100 mL) jałowego
rozcieńczalnika (np. obojętny roztwór peptonu). Sączek należy przenieść
do jednej z pożywek lub po przecięciu na dwie równe części do dwóch
różnych podłoży.
Badane leki, których jałowość bada się jedną z wymienionych metod
powinny być posiane na pożywki dla bakterii i grzybów. Czas inkubacji
wynosi 14 dni. Warunki hodowli próbek przedstawia Tabela 3.
Tabela 3.Temperatura i czas inkubacji pożywek
Pożywka
Temperatura inkubacji Czas inkubacji
Tioglikolanowa
30 – 35°C
14 dni
(Brewera)
Podłoże z hydrolizatem
20 – 25°C
14 dni
kazeiny i soi
O wyniku badania świadczy obecność lub brak wzrostu drobnoustrojów
w pożywce. Wzrost objawia się zmętnieniem, obecnością kożucha na
powierzchni pożywki lub osadu na dnie naczynia. Nie zawsze zmętnienie
lub osad jest wynikiem wzrostu. Mogą one powstawać wskutek
reagowania składników pożywki z lekiem. Aby uniknąć błędnej oceny,
należy wykonać preparat barwiony metodą Grama oraz dokonać
przesiewu z danego podłoża (przynajmniej 1 mL) na nową pożywkę.
Próbka powinna być inkubowana co najmniej 4 dni. Jeżeli w tym czasie nie
będzie wzrostu drobnoustrojów, badany produkt spełnia wymagania
jałowości.
W przypadku obecności drobnoustrojów należy, w miarę możliwości
przeprowadzić ich identyfikację. Jeżeli niekorzystny wynik badania budzi
wątpliwości, należy przeprowadzić ponowne badanie używając takiej
samej liczby pojemników, jak w badaniu pierwotnym. Jeżeli
w powtórzonym badaniu brak wzrostu drobnoustrojów, badany produkt
jest jałowy.
199
Badanie mikrobiologiczne leków, które muszą spełniać określone
kryteria czystości mikrobiologicznej
Podobnie, jak w badaniach jałowości, wyniki tych oznaczeń są względne,
uzależnione z jednej strony od wybranych warunków hodowli, z drugiej
zaś od charakteru zanieczyszczeń mikrobiologicznych znajdujących się
w badanym materiale.
Celem tych badań jest określenie liczby żywych bakterii i grzybów,
tzn. drobnoustrojów zdolnych do wzrostu i rozmnażania w zastosowanych
warunkach hodowli w niejałowych produktach farmaceutycznych
(Tabela 1). Ukierunkowane badania identyfikacyjne, muszą wykluczyć
obecność wskazanych dla danej grupy bakterii oportunistycznych lub
wskaźnikowych dla stanu higienicznego (Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella spp., bakterie
gramujemne tolerujące żółć) oraz Candida albicans.
Licząc żywe drobnoustroje wykorzystuje się fakt, że z jednej jednostki
wzrostowej (jtk, CFU) powstaje na pożywce stałej jedna kolonia. Zatem
liczba powstających kolonii odpowiada liczbie CFU wprowadzonych
z lekiem na płytkę (patrz rozdział 6).
Porównanie otrzymanego wyniku z kryterium określonym dla danej grupy
leków pozwala na ocenę badanej partii leków.
Podobnie, jak przy badaniu jałowości, wszystkie czynności w przebiegu
określania czystości mikrobiologicznej leków powinny być wykonane
w aseptycznym pomieszczeniu lub boksie z laminarnym przepływem
powietrza.
Jeżeli badany produkt posiada aktywność przeciwdrobnoustrojową, musi
być ona zneutralizowana. W przypadku zastosowania substancji
neutralizującej, należy sprawdzić jej skuteczność oraz brak działania
toksycznego w stosunku do drobnoustrojów.
Sposób pobrania i wielkość próbki są, podobnie jak w badaniu jałowości,
określone pewnymi zasadami. W analizie czystości mikrobiologicznej
konieczne jest pobranie 10 g lub 10 mL próbki. Próbkę należy pobrać
losowo z materiału przed rozporcjowaniem lub spośród dostępnych
pojemników z preparatem.
200
Produkty rozpuszczalne w wodzie należy rozpuścić lub rozcieńczyć
w jałowym rozcieńczalniku (np. w zbuforowanym roztworze chlorku sodu
z peptonem o pH 7,0) przygotowując rozcieńczenie 1:10. Jeżeli to
konieczne, można użyć innych rozcieńczeń. Jeżeli wiadomo, że produkt ma
aktywność przeciwdrobnoustrojową, do rozcieńczalnika powinna być
dodana substancja neutralizująca. W przypadku produktów
nierozpuszczalnych w wodzie do rozcieńczalnika można dodać substancję
powierzchniowo czynną, np. Tween 80. Produkty zawierające tłuszcze
wymagają wstępnego zhomogenizowania np. z Tweenem 80 i dodatkowo
ogrzania do temp. 40-45°C.
W przypadku płynów lub substancji stałych w postaci aerozoli należy
pobrać 10 opakowań.
Do badania systemów transdermalnych konieczna jest próbka licząca
10 sztuk. Po usunięciu osłonki chroniącej warstwę adhezyjną systemy
transdermalne przenosi się do 500 mL zbuforowanego roztworu NaCl
z peptonem o pH 7,0, zawierającego odpowiednią substancję
neutralizującą, np. Tween 80 i/lub lecytynę i wytrząsa przez około
30 minut.
Podłoża i warunki hodowli badanych próbek muszą być tak dobrane, aby
wynik analizy dawał możliwie pełną informację o stopniu zanieczyszczenia
leku drobnoustrojami rosnącymi w warunkach tlenowych (bakteriami
i grzybami). Dla bakterii stosuje się agar z hydrolizatem kazeiny i soi,
umożliwiający wzrost drobnoustrojów o typowych wymaganiach
odżywczych. Dla grzybów jest to stałe podłoże Sabouraud z dekstrozą.
Inkubację agaru z hydrolizatem kazeiny i soi przeprowadza
się w ciągu 3-5 dni, w temperaturze 30-35°C, aby umożliwić wzrost
bakterii, a podłoża Sabouraud z dekstrozą 5-7 dni w temperaturze 2025°C.
Wybór metody badania zależy od rodzaju produktu i spodziewanej liczby
drobnoustrojów. Stosuje się ogólnie przyjęte metody liczenia
drobnoustrojów (patrz rozdział 6).
W metodzie płytkowej po odpowiednim rozcieńczeniu badanej próbki
dokonuje się posiewu powierzchniowego lub głębinowego znanej
objętości materiału. Należy przygotować co najmniej po dwie płytki na
201
każde rozcieńczenie i każde podłoże. Po inkubacji zlicza się kolonie,
a uwzględniając współczynnik rozcieńczenia, określa się liczbę CFU
w 1 mL lub 1 g leku.
W metodzie filtracji używa się dwóch sączków membranowych o średnicy
porów nie większej niż 0,45μm. Wybór materiału, z którego wykonany jest
sączek, zależy od rodzaju sączonej substancji (roztwory wodne, olejowe,
etanolowe). Po przesączeniu próbek preparatu każdy z dwóch sączków
należy przemyć jałowym rozcieńczalnikiem (np. zbuforowanym
roztworem NaCl). Jeśli to potrzebne, dodaje się Tweenu 80 lub
związków inaktywujących działanie przeciwdrobnoustrojowe. Każdy
z sączków należy następnie przenieść na powierzchnię odpowiedniego
podłoża (dla bakterii i grzybów) tak, aby powierzchnia, na której osadziły
się drobnoustroje, była zwrócona ku górze. Po inkubacji liczy się wyrosłe
na sączku kolonie. Ich liczba odpowiada liczbie CFU w 1 g lub 1 mL leku.
Przy badaniu systemów transdermalnych należy przesączyć dwie porcje
po 50 mL przygotowanej próbki.
Metodę oznaczania najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów
(NPL) (patrz rozdział 6) stosuje się tylko wtedy, gdy nie jest możliwe
wykonanie badania innymi metodami. Należy przygotować co najmniej
trzy kolejne 10-krotne rozcieńczenia produktu, a następnie z każdego
z nich pobrać po trzy próbki odpowiadające 0,1 g/1mL, 0,01 g/mL,
0,001 g/mL, wprowadzić do probówek zawierających bulion
z hydrolizatem kazeiny i soi. Inkubować w temp. 30-35°C przez 3-5 dni. Na
podstawie obliczeń statystycznych uważa się, że wzrost drobnoustrojów
w pożywce, przy wprowadzeniu znanej wielkości próby jest miarą
określonej liczby drobnoustrojów w jednostce wagowej lub objętościowej
preparatu.
Badanie
czystości
mikrobiologicznej
obejmuje
postępowanie
identyfikacyjne. W badaniach identyfikacyjnych bakterii i grzybów
izolowanych z leków poszukuje się drobnoustrojów, których obecność nie
jest dozwolona: S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, Salmonella spp., pałeczki
gramujemne tolerujące żółć oraz Candida albicans. Próbki do badania
przygotowuje się w taki sam sposób, jak do oznaczania liczby
202
drobnoustrojów. Badanie wykonuje się metodą bezpośredniego posiewu
lub metodą filtracji. W pierwszym etapie badania próbkę leku wprowadza
się do odpowiedniej płynnej pożywki namnażającej. Jeżeli korzystano
z metody filtracji próbki leku, sączek przenosi się do właściwej płynnej
pożywki namnażającej. Po uzyskaniu wzrostu bakterii na pożywkach
namnażających dokonuje się przesiewu na pożywki diagnostycznowybiórcze. Szczegółową identyfikację przeprowadza się za pomocą testów
biochemicznych i serologicznych.
Wykonanie każdego badania czystości mikrobiologicznej musi poprzedzić
walidacja metody oznaczania. Celem walidacji jest potwierdzenie, że
badany produkt nie hamuje wzrostu drobnoustrojów, a wybrana metoda
badania nie wpłynie na wynik analizy.
Walidacja polega na porównaniu wzrostu szczepów testowych
w obecności badanych leków i bez leków. Jako testowe wykorzystuje się
trzy wzorcowe szczepy bakterii: Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtilis, posiewane na podłoże kazeinowo-sojowe
i dwa wzorcowe szczepy grzybów: Candida albicans i Aspergillus
brasiliensis, posiewane na podłoże Sabouraud z dekstrozą. Po wykonaniu
posiewów pożywki dla bakterii inkubuje się w temp. 30-35°C, a pożywki
dla grzybów w temp. 20-25°C przez 5 dni.
Metodę uznaje się za zwalidowaną, jeżeli liczba drobnoustrojów (CFU)
w zawiesinach z próbkami jest najwyżej dwukrotnie większa od liczby
każdego z drobnoustrojów testowych w zawiesinach w chwili ich dodania
(drobnoustrój się swobodnie mnoży), a jeśli jest mniejsza, to nie mniej niż
dwukrotnie (drobnoustrój przeżywa w leku, ale się nie mnoży).
203
204
Rozdział 16
Schematy identyfikacyjne drobnoustrojów
w badaniu leków wg Farmakopei Polskiej IX
Schemat identyfikacji Staphylococcus aureus
0
18-24 godzinna hodowla w temp. 30-35 C
na bulionie kazeinowo-sojowym
↓
Posiew na podłoże agarowe z mannitolem i chlorkiem sodu
0
inkubacja 18-72 godziny w temp. 30-35 C
↓
Wzrost w postaci żółtych lub białych kolonii otoczonych żółtą strefą
↓
Preparat barwiony metodą Grama
↓
Ziarenkowce gramdodatnie
↓
Próba na koagulazę
↓
próba dodatnia
↓
Staphylococcus aureus
205
Schemat identyfikacji tolerujących żółć pałeczek z rodziny
Enterobacteriaceae
Hodowla 2-5 godzinna w temp. 20-250C
na bulionie kazeinowo-sojowym
↓
Posiew na bulion Mossela z żółcią i zieloną brylantową.
Inkubacja 24 – 48 godzin w temp. 30 – 350C
↓
Posiew na agar z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią
i glukozą.
Inkubacja 18-24 godziny w temp. 30-350C
↓
Wzrost kolonii
czerwonych lub
Brak wzrostu bakterii
czerwonawych
↓
↓
Preparat
barwiony
Brak poszukiwanej rodziny
metodą Grama
Enterobacteriaceae
↓
Pałeczki gramujemne
↓
Rodzina Enterobacteriaceae
Uwaga!
W przypadku obecności pałeczek z rodziny Enterobacterioceae należy
wykonać oznaczenie ilościowe tych bakterii w leku.
206
Schemat identyfikacji Escherichia coli
0
Hodowla 18-24 godzinna w temp. 30 – 35 C
na bulionie kazeinowo-sojowym
↓
Posiew 1 mL na bulion MacConkeya
Inkubacja 24 – 48 godzin w temp. 42 – 440C
↓
Posiew na agar MacConkeya
0
Inkubacja 18 – 72 godziny w temp. 30 – 35 C
↓
Wzrost w postaci czerwonych kolonii
↓
Preparat barwiony metodą Grama
↓
Gramujemne pałeczki
↓
Próba na indol (+)
↓
Prawdopodobnie Escherichia coli
↓
Potwierdzenie wyniku badaniami biochemicznymi
207
Schemat identyfikacji Salmonella
0
Hodowla 18-24 godzinna w temp. 30-35 C na bulionie kazeinowosojowym
↓
Posiew objętości 1 mL do 10 mL bulionu wzbogaconego Rappaporta
Vassiliadisa z zielenią malachitową
Inkubacja 18 – 48 godzin w temp. 30-350C
↓
Posiew na podłoża agarowe:
z ksylozą, lizyną
i dezoksycholanem
Inkubacja 18-48 godzin w temp. 30-350C
↓
Kolonie czerwone
z czarnymi środkami
lub czerwone
↓
Preparat barwiony metodą Grama
↓
Gramujemne pałeczki
↓
Prawdopodobnie rodzaj Salmonella
↓
Potwierdzenie wyniku badaniami biochemicznymi i serologicznymi
208
Schemat identyfikacji Pseudomonas aeruginosa
18-24 godzinna hodowla w temp. 30-350C
na bulionie kazeinowo-sojowym
↓
Posiew na agar z cetrimidem
Inkubacja 18-72 godziny w temp. 30-350C
↓
Kolonie dające fluoryzujące zielono zabarwienie podłoża lub bezbarwne
↓
Preparat barwiony metodą Grama z różnych morfologicznie kolonii
↓
Pałeczki gramujemne
↓
Próba na oksydazę cytochromową (+)
↓
Prawdopodobnie Pseudomonas aeruginosa
↓
Potwierdzenie wyniku metodami biochemicznymi
209
Schemat identyfikacji laseczek z rodzaju Clostridium
48 godzinna hodowla w temperaturze 30-350C w warunkach
beztlenowych na bulionie wzbogaconym dla beztlenowców
po posiewie ogrzanego przez 10 minut w temp. 800C
homogenatu leku w buforowanym roztworze NaCl pH 7
↓
Posiew na agar Columbia z gentamicyną.
Inkubacja 48-72 godziny w temp. 30-350C w warunkach beztlenowych
↓
↓
Wzrost
Brak wzrostu
↓
↓
Posiew na agar Columbia
Brak Clostridium spp.
Inkubacja 48 godzin w temp. 30-350C
↓
↓
Warunki
Warunki
tlenowe
beztlenowe
↓
↓
wzrost
wzrost
↓
↓
Preparat barwiony metodą Grama
↓
Pałeczki gramdodatnie
↓
Próba na katalazę
↓
+
↓
Laseczki Baciilus spp.
↓
↓
Laseczki Clostridium spp.
210
Rozdział 17
Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenów,
przekazywanie plazmidów.
Część teoretyczna
Genom bakterii stanowi jego pojedynczy chromosom – nukleoid, a także
elementy pozachromosomalne – plazmidy.
Stanowiące wyposażenie genowe sekwencje DNA bakterii stanowią ich
genotyp. Jest to zapis informacji o wszystkich potencjalnych
możliwościach komórki. Fenotyp to obserwowana, objawiająca się
w określonym środowisku forma ekspresji tego genotypu. Genotyp zatem,
określa granice fenotypu. Bakterie, w odróżnieniu od organizmów
eukariotycznych, mają tylko jedną kopię swego materiału genetycznego,
co sprawia, że jest on bardzo podatny na wszelkie zmiany. Źródłem zmian
w obrębie genomu i nowej aranżacji genów bakteryjnych jest
horyzontalny transfer genów związany z rekombinacją, a także mutacje
oraz ruchome elementy genetyczne takie, jak plazmidy, bakteriofagi czy
elementy transpozycyjne.
Mutacje i ich naprawa
Mutant to zmieniona postać bakterii, różna od organizmu wyjściowego –
postaci dzikiej. Różnica dotyczy genotypu i może być widoczna także na
poziomie fenotypu.
Zmiany mutacyjne mogą polegać na drobnych uszkodzeniach
pojedynczych nukleotydów (mutacje punktowe), mogą także dotyczyć
dłuższych fragmentów łańcucha DNA (mutacje chromosomowe).
Mutacje punktowe mogą prowadzić do zmiany sensu kodu genetycznego
i powodować wbudowanie innego aminokwasu do białka. Mogą one także
być nonsensowne i niespodziewanie kończyć syntezę białka, ale mogą
także zmieniać ramki odczytu, powodując duże zmiany w syntetyzowanym
białku. Te dwa ostatnie rodzaje mutacji punktowych prawie zawsze
objawiają się fenotypowo.
211
Mutacje chromosomalne prowadzą do zmian w obrębie dużych odcinków
DNA i zazwyczaj są letalne – prowadzą do śmierci komórek.
W czasie replikacji DNA może dojść do mutacji wynikających ze
wstawienia błędnych nukleotydów, czy przesunięcia matrycy w stosunku
do nowo syntetyzowanej nici. Są to mutacje spontaniczne. Występują one
dość rzadko – w jednej na kilka milionów komórek.
Częstość mutacji ulega znacznemu zwiększeniu pod wpływem różnych
czynników, zarówno fizycznych, jak i chemicznych, nazywanych
mutagenami. Ten rodzaj mutacji to mutacje indukowane. Mutacje takie
zachodzą ze znacznie większą częstością – zmutować może nawet jedna
na tysiąc komórek.
Czynnikami mutagennymi mogą być różne związki chemiczne jak też
czynniki fizyczne.
Mutacja, która utrwaliła się w komórce, może ulec odwróceniu – mamy
wtedy do czynienia z mutacją powrotną. Może ona zajść na drodze
rewersji, czyli odtworzenia pierwotnego genotypu lub supresji, czyli
zmiany prowadzącej do odtworzenia jedynie efektu fenotypowego.
Bakterie wykształciły wiele systemów naprawczych i potrafią bardzo
skutecznie bronić się przed uszkodzeniami DNA. Jest kilka mechanizmów
tej naprawy. Wśród nich jest obarczony największymi błędami system
nazywany SOS. System ten kontrolowany jest przez wiele genów. Ich
produkty naprawiają DNA generując jednak wiele błędów i prowadząc do
nowych zmian mutacyjnych. Często są one letalne, ale mogą też być
korzystne, umożliwiając adaptację do nowych warunków. W systemie tym
działa polimeraza DNA V zdolna do syntezy krótkich odcinków DNA bez
udziału matrycy.
Metody
Badanie kancerogenności z wykorzystaniem bakterii
Ze względu na dużą wrażliwość bakterii na czynniki mutagenne i łatwość
manipulacji genami tych organizmów, wykorzystuje się je do wykrywania
czy związki, które mają być wprowadzone do użytku człowieka nie mają
212
właściwości rakotwórczych (kancerogennych). Właściwości te bowiem
ściśle korelują ze zdolnością do powodowania mutacji (prowokowania
mutagenezy).
Popularnym testem stosowanym w takich badaniach jest test
skonstruowany w latach 70-tych przez Ames’a – amerykańskiego
genetyka. Pozwala on ocenić czy badany związek jest mutagenem, a
nawet określić siłę działania mutagennego. Podstawą testu są
odpowiednio skonstruowane szczepy Salmonella Typhimurium (np.TA97a,
TA98 i TA102) mające mutacje różnych typów, uniemożliwiające im
wytwarzanie w komórkach histydyny (są więc auksotrofami określanymi
+
jako His ). W formie dzikiej bakterie te są prototrofami (His ) zdolnymi do
syntezy tego niezbędnego do życia aminokwasu.
Mutacje w szczepach są różnych typów: punktowe, dotyczące
pojedynczych nukleotydów albo przesuwające otwartą ramkę odczytu.
Mutanty te są ponadto szczególnie wrażliwe na działanie mutagenów ze
względu na zwiększoną przepuszczalność ściany i upośledzenie
mechanizmów naprawczych.
W warunkach doświadczenia hodowle tych szczepów miesza się
z badanym związkiem w środowisku, w którym nie ma histydyny. Jeżeli
działanie badanej substancji spowoduje mutacje, będą one
wielokierunkowe, a wśród nich pojawią się i takie, które zniosą działanie
pierwotnej mutacji na drodze rewersji lub supresji i dadzą szansę syntezy
histydyny, a tym samym wzrostu kolonii tego szczepu na podłożu bez tego
aminokwasu. Im więcej takich kolonii, tym silniejsze działanie mutagenne
badanego związku.
W teście Ames’a do badanych mieszanin dodaje się frakcję mikrosomalną
wątroby, zawierającą enzymy zdolne przekształcać badaną substancję tak,
jak to się dzieje w organizmie człowieka. Pozwala to wykryć
kancerogenność także tych związków, które cechę tę zyskują dopiero po
transformacji metabolicznej.
W badaniu stosuje się kontrolę pozwalającą każdorazowo obliczyć liczbę
rewertantów powstających spontanicznie, bez obecności badanej
substancji.
Test Ames’a można przeprowadzić w sposób klasyczny posiewając
zawiesiny bakterii na stałe podłoże minimalne bez histydyny w szalkach
213
Petriego. O mutacji powrotnej świadczy zdolność wyrastania bakterii
w postaci kolonii.
Inną odmianą jest test Ames’a fluktuacyjny, który przeprowadza się
w minimalnym podłożu płynnym, nie zawierającym histydyny, w 96 lub
384-dołkowych płytkach titracyjnych. Do podłoża dodany jest wskaźnik
barwny wskazujący na zdolność wzrostu szczepu. O rewersji świadczy
zmiana barwy podłoża w dołku.
Oprócz testu Ames’a są także systemy badania mutagenności
wykorzystujące inne bakterie, np. Escherichia coli i jej mutanty niezdolne
do rozkładania laktozy i tym samym wykorzystywania jej jako jedynego
źródła węgla lub mutanty, które utraciły zdolność do syntezy tryptofanu.
Zadania do wykonania
Zadanie 1.
Wykrywanie mutagenów chemicznych. Test Ames’a (wersja uproszczona)
- Trzy płytki z podłożem minimalnym (bez histydyny) opisano 1, 2 i K.
- Do dwóch probówek z roztopionym i ochłodzonym do temperatury
ok. 50°C agarem powierzchniowym dodano:
- do pierwszej: 0,1 mL badanej substancji I,
- do drugiej: 0,1 mL badanej substancji II.
Trzecia probówka stanowiła kontrolę (nie dodano żadnej substancji).
Do wszystkich trzech probówek dodano po 0,1 mL hodowli bulionowej
szczepu testowego Salmonella Typhimurium His-..
- Wylano zawartość probówek na odpowiednie płytki (płytka „K”- kontrola
bez badanej substancji).
- Po zestaleniu inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C.
+
- Policz wyrosłe kolonie rewertantów His na płytkach 1, 2 i K i oblicz
indeks mutagenności (I) dla badanych substancji:
I= Mi/ Ms
Mi- liczba kolonii rewertantów indukowanych
Ms - liczba kolonii rewertantów spontanicznych
214
Wiedząc, że:
I < 1,7 – substancja nie działająca mutagennie
1,7 ≤ I ≤ 1,9 – substancja o potencjalnym działaniu mutagennym
I > 1,9 – substancja o działaniu mutagennym
wydaj opinię o badanych substancjach.
Zadanie 4.
Wykrywanie mutagenów chemicznych. Test reperacji DNA (wersja
uproszczona)
- Materiał z hodowli bulionowej Escherichia coli PolA+ (posiadającej
polimerazę DNA) i hodowli Escherichia coli PolA- (bez genu polimerazy)
posiano wacikiem na całe powierzchnie dwóch płytek agarowych.
- Podzielono płytki na trzy sektory i oznaczono je: K+, K- i Bz.
- W sektorach na powierzchni zasianego agaru ułożono krążki bibułowe:
K+ (kontrola pozytywna) – krążek z mitomycyną C (mutagen hamujący
replikację DNA)
K- (kontrola negatywna) – krążek z cefalotyną (antybiotyk blokujący
syntezę ściany komórkowej, nie jest mutagenem)
Bz – badany związek
215
- Płytki pozostawiono na około 30 minut w temperaturze pokojowej
w celu dyfuzji związków do podłoża, a następnie inkubowano
w temperaturze 37°C ok. 20 godzin.
Podaj i zinterpretuj wynik doświadczenia
216
Rozdział 18
Podstawy wiedzy o antybiotykach
i antybiotykoterapii
Część teoretyczna
Leki przeciwbakteryjne i ich stosowanie
Leki przeciwbakteryjne to duża grupa antybiotyków (będących produktem
naturalnym drobnoustrojów) i chemioterapeutyków (zsyntetyzowanych
chemicznie). Najliczniejsze i najczęściej wykorzystywane w lecznictwie ich
grupy to antybiotyki -laktamowe, aminoglikozydy, tetracykliny,
makrolidy, fluorochinolony. Te preparaty, których znajomość jest
niezbędna dla uczestnictwa w ćwiczeniach pokazano w poniższej tabeli.
Grupa / klasa
Antybiotyk
Mechanizm
działania
penicylina G
amoksycylina, ampicylina
penicyliny
cefalosporyny
monobaktamy
karbapenemy
aminoglikozydy
ko-amoksyklaw (amoksycylina
+ kwas klawulanowy)
kloksacylina
cefradyna, cefaklor (I)
cefuroksym
(II)
ceftazydym
(III)
ceftriakson
(III)
aztreonam
meropenem
gentamicyna
tobramycyna
netilmicyna
amikacyna
streptomycyna
hamowanie
syntezy ściany
komórkowej
hamowanie
syntezy białka
217
makrolidy
tetracykliny
fluorochinolony
erytromycyna
klaritromycyna
azitromycyna
oksytetracyklina
doksycyklina
ciprofloksacyna
ofloksacyna
hamowanie
syntezy DNA
Leki przeciwbakteryjne stosowane są w monoterapii (leczenie jednym
lekiem) lub w terapii skojarzonej (kilkoma lekami). Zaletami tej drugiej
jest poszerzenie zakresu ich działania i wzmocnienie aktywności, jeśli
skojarzone leki działają synergistycznie. Synergizm jest wzmożeniem
działania leków, większym niż to, jakiego można się spodziewać jako sumy
ich działań. Nie należy kojarzyć leków które charakteryzuje antagonizm –
gdy ich mechanizm działania wzajemnie się znosi lub wyklucza.
Zastosowanie terapii skojarzonej często zmniejsza potrzebne dawki, a tym
samym toksyczność leków, a także w dużym stopniu zmniejsza
niebezpieczeństwo selekcji szczepów o nabytej oporności.
Leki przeciwbakteryjne mogą powstrzymywać mnożenie się bakterii, ale
nie powodować ich śmierci (działać bakteriostatycznie). Zwykle pozwala
to układowi odpornościowemu skutecznie zwalczyć infekcję. Niektóre z
nich działają jednak bakteriobójczo, powodując śmierć bakterii, ale tym
samym powodując ich rozpad i uwolnienie toksycznych elementów
komórek.
Leki przeciwbakteryjne wykazują różny zakres (spektrum) działania.
Wynika to z ich zdolności do interferowania z określonymi elementami
budowy lub metabolizmu, charakterystycznymi dla wielu lub tylko dla
nielicznych bakterii. Stąd każdy gatunek bakterii charakteryzuje oporność
naturalna na niektóre z tych leków, która jest genetycznie determinowana
genami
chromosomowymi.
Jej
mechanizm
jest
związany
z występowaniem barier w przenikaniu antybiotyku przez osłony bakterii,
brakiem systemu aktywnego transportu lub nieobecnością struktur
lub/i szlaków metabolicznych, będących celem działania tego antybiotyku.
Ta oporność decyduje o tym, czy antybiotyk lub chemioterapeutyk
218
nazwiemy szerokowidmowym (działającym na wiele grup bakterii, w tym
gramdodatnie i gramujemne) czy wąskowidmowym (działającym na
wąską grupę, jak tylko na gramujemne pałeczki albo prątki). Spośród
wymienionych tutaj, do ważnych terapeutycznie, szerokowidmowych
leków należą niektóre penicyliny półsyntetyczne (amoksycylina
i ampicylina), cefalosporyny, tetracykliny i karbapenemy. Nieco węższe
spektrum mają aminoglikozydy i makrolidy. Wąskowidmowe są penicyliny
naturalne (penicylina G) i kloksacylina, a także monobaktamy.
Obok oporności naturalnej, bakterie fenotypowo prezentują też oporność
nabytą. Powstaje ona w wyniku pozyskania przez nie genów oporności na
antybiotyki – poprzez transfer odpowiednich fragmentów DNA (np. na
plazmidach) z komórek innych bakterii. Ponieważ nie sposób przewidzieć
tych procesów, konieczne jest wykonywanie badań mikrobiologicznych
określających działanie wytypowanych grup leków na szczep izolowany od
pacjenta uznany za czynnik etiologiczny jego choroby. Wybierane są leki,
które ze względu na naturalną wrażliwość tych bakterii powinny być
skuteczne, ale oporność nabyta mogła zmienić ten stan rzeczy. Bada się
wrażliwość wyizolowanych od pacjenta bakterii uzyskanych w postaci
czystej hodowli.
Najczęściej stosowanym sposobem określania zakresu (profilu)
wrażliwości bakterii na antybiotyki in vitro jest metoda krążkowodyfuzyjna, zwana popularnie antybiogramem.
W metodzie tej antybiotyk dyfunduje z krążka ułożonego na powierzchni
posianego badanym szczepem agaru i hamuje jego wzrost. Wielkość strefy
zahamowania jest wyznacznikiem wrażliwości. Metoda wymaga bardzo
starannej standaryzacji, aby wyniki były porównywalne w obrębie danej
pracowni i miedzy ośrodkami.
Pełniejsze dane na temat poziomu wrażliwości badanych bakterii uzyskuje
się ustalając in vitro stężenie antybiotyku, które zabija lub hamuje wzrost
bakterii. Oznacza się najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii – MIC
(ang. minimum inhibitory concentration) i/lub najmniejsze stężenie
bakteriobójcze (zabijające 99,9% bakterii) – MBC (ang. minimum
bactericidal concentration). Stężenie określa się w µg lub jednostkach leku
na mL lub mg/L. Takie badania dają znacznie więcej informacji, które
219
mogą przyczynić się do podjęcia właściwej terapii pacjenta. Oznaczenia te
wykonuje się także przy ocenie nowych leków. Zazwyczaj testuje się
wtedy wrażliwość wielu rodzajów izolowanych klinicznie drobnoustrojów,
a wśród nich dużej grupy szczepów każdego z gatunków, określając
wartość MIC90. Wartość ta określa najmniejsze stężenie na które było
wrażliwe 90% badanych szczepów.
W badaniach antybiotykowrażliwości bakterii izolowanych z przypadków
klinicznych w Polsce stosuje się procedury oparte o wytyczne Krajowego
Ośrodka Referencyjnego d/s Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD)
oparte na danych z terenu Polski (np. dobór antybiotyków) zgodnych
z określającą metodologię dla krajów europejskich normą EUCAST
(European Committee on Antimicrobial Susceptobility Testing).
Poszukiwanie i badanie nowych antybiotyków
i chemioterapeutyków
Szerokie stosowanie leków przeciwbakteryjnych powoduje powstawanie
i narastanie zjawiska oporności. Dlatego też mimo, że w lecznictwie ma
obecnie zastosowanie około 100 preparatów, stale poszukuje się nowych,
o lepszym spektrum, działających na szczepy wielooporne, czy mających
lepsze właściwości farmakologiczne. Nowe leki przeciwbakteryjne są
najczęściej modyfikacją chemiczną znanych produktów naturalnych,
bowiem poszukiwanie nowych aktywnych substancji z bakterii glebowych
i grzybów wymaga ogromnych nakładów finansowych. Prowadzone są
również badania substancji wytwarzanych przez glony, porosty, rośliny
wyższe (alkaloidy, diterpenoidy), a nawet organizmy zwierzęce
(polipeptydy wytwarzane przez bezkręgowce, płazy i ssaki).
Procedury badania leków opisane są w bieżących wydaniach Farmakopei.
Aktywność nowych leków określa się opisaną wyżej metodą wyznaczania
wartości MIC. W tym wypadku jednak badanie przeprowadza się
w stosunku do zestawu szczepów wzorcowych o znanej wrażliwości.
Szczepy te mają cechy ich oporności naturalnej, ale nie mają genów
oporności nabytej. Są one ściśle oznakowane i przechowywane
w specjalnych kolekcjach w warunkach gwarantujących zachowanie ich
genotypu i fenotypu.
220
Jeśli nowy lek wykaże obiecujące cechy w postaci niskich wartości MIC
i/lub MBC wobec jednego (wąskowidmowy) czy wielu (szerokowidmowy)
szczepów wzorcowych, w następnym etapie prowadzi się badania ze
szczepami klinicznymi tych gatunków wyznaczając wartości MIC50
(częściej) i MIC90 mówiące odpowiednio o stężeniu hamującym wzrost
50% i 90% szczepów. Im wartość MIC niższa, tym lek jest skuteczniejszy.
Im większa jest grupa badanych szczepów tym wynik jest bardziej
miarodajny. W praktyce oznacza to, że jeśli zbadaliśmy kolekcję 106
szczepów klinicznych i uszeregowaliśmy je od najniższej do najwyższej
otrzymanej wartości MIC to wartość MIC50 wyznacza nam (106x0.5=53)
53 szczep tej kolekcji.
Aktywność nowych preparatów określa się zawsze równolegle
z oznaczaniem wzorca – zwykle dobrze znanego, najlepszego antybiotyku
z tej samej grupy.
W tego typu badaniach częściej korzysta się z metody wyznaczania MIC
z użyciem rozcieńczeń w podłożu stałym.
Preparaty surowe mogą być wstępnie oceniane metodą dyfuzyjną,
w której w cylinderkach lub wgłębieniach w agarze na płytce (rzadziej na
krążkach) na posianym wzorcowymi bakteriami podłożu umieszcza się
badany preparat. Strefę zahamowania wzrostu wokół cylinderka z nowym
preparatem ocenia się względem 2-5 rozcieńczeń wzorca zbadanych na tej
samej płytce.
Metody
Antybiogram
Oznaczenie wykonuje się w ściśle standaryzowanych warunkach, używając
atestowanych krążków bibułowych nasączonych antybiotykami
pamiętając, że na wynik antybiogramu, obok wrażliwości bakterii, ma
wpływ szereg czynników związanych z jego wykonaniem.
Wykonanie:
221

Zebrać 1-3 takich samych kolonii z płytki ze świeżą czystą hodowlą
wcześniej zidentyfikowanego szczepu i przygotować zawiesinę
w fizjologicznym roztworze NaCl o gęstości odpowiadającej wzorcowi
8
nr 0,5 wg skali McFarlanda (tj. 1,5x 10 CFU/mL);
 posiać ją wacikiem na powierzchnię płytki z podłożem MuelleraHinton;
 wybrać odpowiednie krążki z lekami (korzystając z instrukcji Ośrodka
Referencyjnego) i ułożyć je na płytce, używając jałowej pęsety lub
dyspensera (na płytce 90 mm nie więcej niż 5-6);
 płytki umieścić w ciągu 15 minut w cieplarce 37°C i inkubować przez
20 godzin;
 zmierzyć przezroczystą linijką strefy zahamowania wzrostu wokół
krążków (mm); mierzy się poprzez krążek od jednej do drugiej
krawędzi koła tej strefy;
 sprawdzić w tabeli stopień wrażliwości, korzystając z odpowiednich
tabel.
Oznaczanie MIC i MBC metodą rozcieńczeniową
Oznaczenie to można przeprowadzić na podłożu płynnym lub stałym. Ta
pierwsza metoda ma szersze zastosowanie i została tu opisana.
Oznaczenie MIC. Przygotowuje się stanowiącą inokulum zawiesinę
badanego szczepu bakterii w roztworze fizjologicznym NaCl o gęstości
odpowiadającej nr 0,5 wg skali McFarlanda tj. 1,5x 108 CFU/mL
i rozcieńcza się ją w pożywce 10-cio krotnie.
Wykonanie:
 Przygotować szereg kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń antybiotyku
w pożywce płynnej, ostatnia probówka szeregu stanowi kontrolę
wzrostu i nie zawiera antybiotyku.
 Dodać 50 μl wcześniej przygotowanego inokulum bakterii do
probówek z kolejnymi rozcieńczeniami antybiotyku i probówki
kontrolnej (bez antybiotyku).
 Inkubować w cieplarce 37°C 20 godzin. Po tym czasie ocenić
makroskopowo wzrost.
222

Stężenie antybiotyku w ostatniej probówce w szeregu, w której brak
jest wzrostu bakterii, określa wartość MIC.
Oznaczenie MBC jest kontynuacją oznaczenia MIC. Po jego odczytaniu
z probówek, w których brak widocznego wzrostu oraz probówki
kontrolnej odsiewa się standaryzowaną ezą próbki punktowo na pożywkę
stałą, odpowiednią dla badanych bakterii (np. podłoże MacConkeya dla
pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae). Po inkubacji ocenia się wzrost na
płytkach. Wzrost będzie niewidoczny tylko przy subkulturze z probówki
z takim rozcieńczeniem antybiotyku, które jest bójcze dla tych bakterii.
Jest ono wartością MBC.
Antybiotyki bakteriostatyczne w większym od terapeutycznego stężeniu
mogą działać bójczo, wtedy MIC<MBC. Antybiotyki bakteriobójcze mają
zwykle wartości MIC i MBC zbliżone do siebie.
Oznaczenie MIC metodą E-testu
E-test jest paskiem nasączonym antybiotykiem. W pasku tym utworzono
gradient stężeń; ich wartości opisane są liczbowo na jego powierzchni
(wartości MIC). Paski układa się na odpowiednim podłożu zasianym
standaryzowaną zawiesiną badanego szczepu podobnie, jak krążki
w antybiogramie. Podczas inkubacji w cieplarce (37°C 20 godzin)
antybiotyk, dyfundując z paska do podłoża, spowoduje zahamowanie
wzrostu bakterii. Strefa zahamowania wzrostu maleje wraz ze
zmniejszaniem się stężenia antybiotyku. Wartość najmniejszego stężenia
hamującego – MIC wskazuje dotykająca paska krawędź strefy
zahamowania.
Techniki biologii molekularnej stosowane w poszukiwaniu genów
oporności na antybiotyki
Oporność nabyta na antybiotyki jest wynikiem mutacji w genach lub
pojawieniem się nowego genu. Geny oporności mogą zlokalizowane być w
chromosomie lub na ruchomych elementach genetycznych (np. na
plazmidach, transpozonach) i mogą być przenoszone pomiędzy
komórkami bakterii w wyniku horyzontalnego transferu genów.
223
Do bezpośredniego wykrywania obecności w badanym szczepie bakterii
(np. izolowanym z materiału klinicznego) genów oporności na substancje
przeciwdrobnoustrojowe można wykorzystywać techniki molekularne.
Przykładem może być wykrywanie u gronkowców genu mecA kodującego
oporność na meticylinę czy genów z grupy erm odpowiedzialnych za
mechanizm oporności krzyżowej na makrolidy, linkozamidy
i streptograminę B (MLSB).
Najczęściej wykorzystywaną metodą w poszukiwaniu genów oporności na
antybiotyki i chemioterapeutyki u bakterii jest łańcuchowa reakcja
polimerazy (PCR – ang. Polymerase Chain Reaction) oraz jej odmiany (np.
Multiplex-PCR).
Zadania do wykonania
Zadanie 1.
Oznaczanie MIC i MBC antybiotyków
Odczytaj wynik gotowego oznaczenia MIC, wykonanego wcześniej metodą
rozcieńczeń w pożywce płynnej.
- Zaznacz w poniższej tabeli, w których probówkach obserwujesz wzrost.
- Czy wynik kontroli jest prawidłowy?
- Wpisz w tabeli jakie było stężenie antybiotyków w kolejnych probówkach
- Oblicz MIC gentamicyny i tetracykliny dla badanego szczepu E. coli.
- Z probówek, w których brak widocznego wzrostu i probówki kontrolnej
pobierz po 1 oczku ezy i posiej pasmowo na oznaczone sektory płytki
z podłożem MacConkeya.
- Inkubuj w cieplarce 37°C przez ok. 20 godzin.
- Oblicz wartość MBC i zinterpretuj wynik.
224
Nr probówki
1
2
3 4
Wzrost
szczepu
badanego
Stężenie
gentamicyny
(μg/mL)
MIC gentamicyny dla tego szczepu =
MBC =
Wzrost
szczepu
badanego
Stężenie
tetracykliny
(μg/mL)
MIC tetracykliny dla tego szczepu =
MBC =
5
6
7
8
9
kontrola
Zadanie 2.
Odczytanie i interpretacja antybiogramów demonstracyjnych. Ocena
spektrum działania antybiotyków
Przygotowano antybiogramy dla szczepów wzorcowych czyli takich które
wykazują naturalną wrażliwość i nie zawierają genów oporności nabytej.
- Zmierz średnice stref zahamowania wzrostu tych szczepów wokół
ułożonych na płytce krążków.
- Oceń działanie badanych antybiotyków względem naturalnie
wrażliwych/opornych szczepów. Zapisz w tabeli:
Antybiotyk
S. aureus
(strefa mm)
E. coli
(strefa mm)
Wrażliwość wg tabeli
225
Antybiogramy wykonane dla szczepów wzorcowych pozwalają ocenić
spektrum antybiotyków.
Wąskowidmowe antybiotyki to:
Szerokowidmowe antybiotyki to:
Do badania wrażliwości gronkowców nie należało używać krążków z:
gdyż bakterie te naturalnie są na nie oporne. Leczenie tymi
antybiotykami zawsze będzie nieskuteczne.
226
Do badania wrażliwości pałeczki okrężnicy nie należy używać krążków z:
gdyż bakterie te naturalnie są na nie oporne. Leczenie tymi
antybiotykami zawsze będzie nieskuteczne.
Zadanie 3.
Wykonanie antybiogramu krążkowego dla bakterii wyhodowanych od
chorego
- Otrzymujesz czystą hodowlę bakterii na płytce.
- Pobierz wacikiem materiał z kilku kolonii i przygotuj zawiesinę
o właściwej gęstości.
- Posiej bakterie na płytkę.
- Ułóż przy pomocy pęsety krążki antybiotykowe odpowiednie dla
badanego rodzaju bakterii dobrane wg zaleceń KORLD.
- Po inkubacji w cieplarce odczytaj i zapisz wynik antybiogramu.
Antybiotyk
Strefa zahamowania
wzrostu
Wrażliwość wg tabeli
227
Zadanie 4.
Działanie antybiotyków
Wpisz w tabelę antybiotyki zastosowane w zadaniu 2 i 3. Zaklasyfikuj je do
grup i podaj mechanizm i spektrum działania.
Antybiotyk Grupa
Mechanizm działania
Spektrum
antybiotyku
228
Zadanie 5.
Poszukiwanie genu ermX u Corynebacterium jeikeium
- Do probówki Eppendorfa dodaj następujące składniki reakcji:
 12,5 µL Mastermix (Taq DNA polimeraza, MgCl2, dNTPs)
 po 0,5 µL starterów (erm1, erm2) specyficznych dla genu ermX
 1 µL lizatu komórkowego szczepu C. jeikeium
 10,5 µL wody wolnej od nukleaz
- Wykonaj kontrolę dodatnią – lizat szczepu ermX+.
- Wykonaj kontrolę ujemną – matryce zastąp wodą wolną od nukleaz.
- Wstaw probówki do termocyklera ustawionego na 30 cykli
o następujących parametrach:
 denaturacja 94°C
 przyłączanie starterów 56°C
 wydłużanie nici DNA 72°C
- Po reakcji nanieś próbki na żel agarozowy w celu ich rozdziału
elektroforetycznego (1h, 70V).
- Po rozdziale odczytaj wyniki w kamerze UV i je zinterpretuj.
Wyniki:
229
230
231
232
IMMUNOLOGIA
Rozdział 1
Podstawy diagnostyki immunologicznej
i immunoprofilaktyki
Część teoretyczna
Antygeny to substancje stymulujące układ immunologiczny organizmu do
odpowiedzi w postaci produkcji swoistych przeciwciał i uczulonych
limfocytów (immunogenność) i reagujące z nimi (swoistość). Hapteny to
antygeny niepełnowartościowe, bez cechy immunogenności, ale mające
podobnie, jak antygeny epitopy (determinanty antygenowe) warunkujące
swoistość.
Przeciwciała (immunoglobuliny, Ig) to białka produkowane przez
aktywowane obecnością antygenu limfocyty B i komórki plazmatyczne.
Mają zdolność swoistego łączenia się z antygenem. Występują w płynach
ustrojowych, na powierzchni błon śluzowych i komórek. Są elementem
swoistej, nabytej odporności, kształtującej się w czasie życia.
Ze względu na udział w procesach immunologicznych wyróżniamy:
 aglutyniny – powodują zlepianie bakterii w ustroju, zmniejszając
ich zdolność do mnożenia i rozprzestrzeniania, przy czym bakterie
zachowują swoją zjadliwość;
 lizyny – po przyłączeniu dopełniacza powodują lizę komórki;
 opsoniny – ułatwiają zajście fagocytozy, opłaszczając wirusy
i bakterie, ułatwiają łączenie z makrofagami i dopełniaczem;
 antytoksyny (neutralizyny) – mają zdolność zobojętniania
bakteryjnych toksyn białkowych i lipopolisacharydowych;
 neutralizyny przeciwwirusowe – zobojętniają wirusy, znosząc ich
zakaźność.
Przeciwciała często są wielofunkcyjne.
233
Fagocytoza to proces pochłaniania przez komórkę całych obcych cząstek,
np. drobnoustrojów lub ich fragmentów. Zdolność taką posiadają głównie
makrofagi i granulocyty obojętnochłonne. Stanowi element naturalnej,
wrodzonej, nieswoistej odporności człowieka. Efektywność tego procesu
ulega zwiększeniu, jeśli cząstki antygenów zostaną opłaszczone swoistymi
przeciwciałami – opsoninami, które aktywnie wiążą komórkę i stymulują
układ dopełniacza.
Dopełniacz (komplement) to grupa około 30 białek surowicy i płynów
tkankowych w postaci proenzymów aktywowanych w ściśle określonej
kolejności. Dopełniacz pełni ważną funkcję w procesach zapalnych, będąc
ważnym elementem nieswoistych mechanizmów obronnych organizmu.
Dopełniacz uczestniczy też w reakcjach immunologicznych aktywowanych
przez swoiste kompleksy antygen–przeciwciało i dokonuje lizy
połączonych z przeciwciałami komórek uznanych przez układ
immunologiczny za wrogie.
Diagnostyka metodami immunologicznymi.
Reakcje
antygen–przeciwciało
zaaranżowane
w
warunkach
laboratoryjnych in vitro nazywane są odczynami serologicznymi. Odczyny
te służą identyfikacji jednego bądź drugiego składnika reakcji,
a w medycynie są wykorzystywane w diagnostyce różnych chorób:
infekcyjnych, metabolicznych, nowotworowych i innych. Większość
odczynów, szczególnie tych służących poszukiwaniu przeciwciał, może być
wykonana metodą jakościową lub ilościową, która pozwala na
wyznaczenie miana surowicy. Najczęściej stosowane odczyny serologiczne
omówiono w części: Metody.
Immunoprofilaktyka
Szczepionki to preparaty zawierające patogeny lub ich elementy (antygeny
protekcyjne) tak zmienione, że są nieszkodliwe, ale wyzwalają swoistą
odpowiedź immunologiczną i pozwalają uzyskać po szczepieniu
długotrwałą ochronę przed zakażeniem. Powtórny kontakt z antygenem
234
(drobnoustrojem chorobotwórczym) powoduje natychmiastową i znacznie
silniejszą odpowiedź układu immunologicznego, niż by to miało miejsce
przy pierwszym kontakcie, co chroni przed chorobą, albo znacząco łagodzi
jej przebieg.
Tabela 1. Podział szczepionek ze względu na ich skład
Typ szczepionki
Skład szczepionki
atenuowane
żywe drobnoustroje
inaktywowane
pełne, zabite
drobnoustroje
toksoid, pertaktyna,
hemaglutynina,
antygeny fimbrii
toksoidy
Podjednostkowe,
acelularne –
wielocukry otoczkowe
zawierające tylko
elementy patogenów
antygeny
powierzchniowe
wirusa (rozszczepione
wiriony)
DNA (w fazie
doświadczalnej)
DNA (nagi)
Szczepionka przeciw
poliomyelitis (Sabina; doustna),
odrze, śwince, różyczce, ospie
wietrznej i półpaścowi, biegunce
rotawirusowej,
gruźlicy
poliomyelitis (Salka), zapaleniu
wątroby HAV, wściekliźnie,
kleszczowemu zapaleniu mózgu
krztuścowi, cholerze, dżumie
krztuścowi
błonicy, tężcowi
meningokokom, pneumokokom,
Haemophilus influenzae typ b
zapaleniu wątroby HBV, grypie
zimnicy, leiszmaniozie, gruźlicy
Szczepienia ochronne są dokonywane począwszy od urodzenia dziecka
zgodnie z ustalonym kalendarzem tak, aby odpowiedź immunologiczna
i jej siła były optymalne i chroniły przed zakażeniami.
235
Tabela 2. Kalendarz szczepień ochronnych obowiązkowych i zalecanych
w Polsce (2014)
Wiek
1 r.ż.
2 r.ż.
Obowiązkowe
w ciągu 24
godzin po
urodzeniu
2 miesiąc życia
(6 tyg. od
poprzedniego
szczepienia)
przełom 3 i 4
miesiąca życia
(po 6-8 tyg. od
poprzedniego
szczepienia)
5-6 miesiąc życia
(po 6-8 tyg. od
poprzedniego
szczepienia)
HBV, gruźlica
HBV, błonica, tężec i krztusiec,
Haemophilus influenzae typu b
rotawirusy
błonica, tężec i krztusiec,
poliomyelitis (inaktywowana),
Haemophilus influenzae typ b
rotawirusy
błonica, tężec i krztusiec
polio (inaktywowana)
Haemophilus influenzae typ b
7 miesiąc życia
HBV
13-14 miesięcy
odra, świnka i różyczka
16-18 miesiąc
życia
błonica, tężec i krztusiec
poliomyelitis (inaktywowana)
Haemophilus influenzae typ b
szkoła
podstawowa,
gimnazjum
ospa
wietrzna
HAV*
(schemat
0,6-12)
3 rok życia
okres przedszkolny
Zalecane
6 rok życia
błonica, tężec i krztusiec
(acelularna)
poliomyelitis (atenuowana)
10 rok życia
odra, świnka i różyczka
HAV*
(schemat
0,6-12)
236
11 rok życia
12 rok życia
14 rok życia
19 rok życia
odra, świnka i różyczka (tylko
dziewczęta nie szczepione
w 10 rż)
odra, świnka i różyczka (tylko
dziewczęta nie szczepione w
10 lub 11 rż)
HBV (schemat 0, 1, 6 u osób
wcześniej nie szczepionych)
błonica, tężec
błonica, tężec
* u dzieci dotychczas nieuodpornionych
Kalendarz szczepień nie obejmuje wszystkich dostępnych na rynku
szczepionek. Wśród nich pozostają szczepionki przeznaczone dla osób
narażonych w sposób szczególny na zakażenie oraz zalecane
w określonych sytuacjach, jak np. w obszarach endemicznych, podczas
epidemii czy wyjazdu za granicę. Należą do nich m.in. szczepienie przeciw
wściekliźnie, durowi brzusznemu, grypie, meningokokom, pneumokokom,
kleszczowemu zapaleniu mózgu czy żółtej gorączce.
Obecnie jest możliwość realizacji szczepień obowiązkowych szczepionkami
skojarzonymi nowej generacji. Są one płatne, ale znacznie zmniejszają
liczbę wkłuć oraz minimalizują niepożądane odczyny poszczepienne.
Immunodiagnostyka onkologiczna
Markery nowotworowe są to substancje, których obecność lub
zwiększone stężenie można wiązać z rozwojem choroby nowotworowej.
Mogą one być wydzielane przez komórki nowotworowe do płynów
ustrojowych, pozostawać związane na powierzchni tych komórek lub być
uwalniane z komórek prawidłowych w odpowiedzi na proces rozrostowy.
Immunodiagnostyka onkologiczna wykorzystuje substancje uwalniane do
krwi lub innych płynów ustrojowych przez nowotwór - swoiste antygeny
nowotworowe TSA oraz związane z obecnością nowotworu (TAA)
w stężeniach niespotykanych u osób zdrowych. Mogą one mieć charakter
antygenów, białek, enzymów lub hormonów. Najbardziej użyteczne
w diagnostyce są te uwalniane do krwi, charakteryzujące się wysoką
237
czułością (liczba pozytywnych wyników do rzeczywistej choroby)
i swoistością (liczba negatywnych wyników, gdy brak choroby).
Zastosowanie markerów:
 wykrywanie nowotworu, badania przesiewowe, wznowy choroby;
 monitorowanie leczenia;
 ocena zaawansowania choroby.
W diagnostyce markerów nowotworowych szczególne zastosowanie mają
techniki immunoenzymatyczne oraz cytometria przepływowa pozwalająca
na ocenę subpopulacji komórek krwi obwodowej, co jest szczególnie
przydatne w diagnostyce białaczek czy chłoniaków.
Tabela 2. Najczęściej oznaczane markery nowotworowe
Marker
Nowotwór
Ca 19-9
wątroby, trzustki i dróg żółciowych
Ca 15-3
sutka
Ca 125
jajnika
SCC
szyjki macicy
Ca 72-4
żołądka
S 100
mózgu
21-1
płaskonabłonkowy nowotwór płuc
NSE
drobnokomórkowy nowotwór płuc
CEA
jelita grubego
PSA
gruczołu krokowego
β-2-mikroglobulina
chłoniak, białaczki
Metody
Odczyn aglutynacji
Odczyn aglutynacji oparty jest na immunologicznej, specyficznej reakcji
między swoistymi przeciwciałami a wielowartościowymi cząsteczkowymi
antygenami. W odczynie tym cząstki antygenu – aglutynogenu
opłaszczane są przeciwciałami – aglutyninami, co prowadzi do tworzenia
238
agregatów – aglutynatu wypadającego w postaci osadu w obecności
roztworu NaCl.
Aglutynogen może być w postaci komórek: bakterie, grzyby, krwinki
(aglutynacja bezpośrednia) lub być małocząsteczkowymi antygenami (lub
haptenami) osadzonymi sztucznie na biernych w tym odczynie nośnikach:
cząstkach lateksu, bentonitu czy specjalnie przygotowanych erytrocytach
(aglutynacja pośrednia).
Odczyny aglutynacyjne, niegdyś bardzo popularne, obecnie straciły na
znaczeniu. Aglutynację wykorzystuje się w najszerszym zakresie
w mikrobiologii do identyfikacji nieznanych antygenów, np. identyfikacji
bakterii lub ich antygenów (aglutynacja pośrednia) lub w określania
poziomu przeciwciał (np. odczyn Widala w durze brzusznym, Weila-Felixa
w durze plamistym, Wrighta w tularemii).
Aglutynacja bezpośrednia może być nastawiona w probówkach lub na
szkiełkach podstawowych.
Aglutynację probówkową stosuje się do wykrywania w surowicy
przeciwciał. Ma ona zastosowanie w diagnostyce serologicznej chorób
zakaźnych. Przykładem jest odczyn Widala stosowany w rozpoznawaniu
duru brzusznego i durów rzekomych. Ilość przeciwciał w badanej surowicy
wyrażana jest jako miano surowicy, czyli odwrotność największego jej
rozcieńczenia, w którym wystąpiła aglutynacja. Antygen stanowią
odpowiednio spreparowane komórki Salmonella, na których
wyeksponowane są odpowiednie antygeny (O, H, Vi). Sporządza się szereg
dwukrotnych rozcieńczeń surowicy badanej w 0,85% roztworze NaCl. Do
każdej z probówek dodaje się taką samą objętość zawiesiny antygenu.
Ostatnia probówka jest kontrolą jego zawieszalności. Po inkubacji
odnajduje się probówkę z rozcieńczeniem stanowiącym miano tej
surowicy. Aglutynacja obłoczkowa (luźne, łatwo ulegających rozbiciu
agregaty) pojawi się jeżeli surowica zawierała swoiste przeciwciała
przeciwko, antygenom rzęskowym (H), aglutynacja grudkowa (O), w której
bierze udział antygen somatyczny (O), jeśli w surowicy są dla niego
przeciwciała (agregaty grudkowate, trudno rozbijalne).
Aglutynacja szkiełkowa bezpośrednia wykonywana jest na szkiełkach
podstawowych zwykle w celu identyfikacji antygenów zlokalizowanych na
powierzchni dużych, nierozpuszczalnych cząstek (np. komórek).Odczyn ma
239
zastosowanie w oznaczaniu grup krwi oraz w identyfikacji bakterii przy
użyciu surowic zawierających przeciwciała dla znanych antygenów
bakteryjnych.
Aglutynacja pośrednia, w której antygen lub hapten osadzony jest na
sztucznych nośnikach (lateks, spreparowane krwinki), może być
przeprowadzona techniką probówkową lub szkiełkową.
Technika probówkowa wykorzystywana jest na przykład do wykrywania w
surowicy przeciwciał antytoksycznych dla toksyny tężcowej (toksyna jest
absorbowana na powierzchni krwinek). W przypadku zastosowania jako
nośnika krwinek mówimy o hemaglutynacji biernej.
Technika szkiełkowa jest wykorzystywana w tzw. odczynach lateksowych.
Służyć mogą zarówno wykrywaniu antygenów, jak i przeciwciał. Próbę
wykonuję się analogicznie jak odczyn aglutynacji szkiełkowej, przy czym
kropla opłaszczonego antygenami lateksu zastępuje zawiesinę komórek.
Różnego rodzaju testy zawierają zazwyczaj w opakowaniu własne
instrukcje wykonania dołączone przez producenta.
Aglutynacja pośrednia jest też metodą dla wykonania odczynu
antyglobulinowego Coombsa. Aglutynacja ze specyficzną surowicą
pozwala na wykrywanie przeciwciał niekompletnych opłaszczających
komórki np. erytrocyty w nabytej niedokrwistości hemolitycznej
noworodków (przeciwciał jednowartościowych).
Odczyn precypitacji
Odczyn precypitacji wykorzystuje reakcje, jakie zachodzącą pomiędzy
swoistymi przeciwciałami a antygenami w formie rozpuszczalnej.
W wyniku zetknięcia się tych składników, w obecności roztworu NaCl,
powstaje widoczny strąt – precypitat. Jego powstanie i wielkość zależy od
składników reakcji, które muszą osiągnąć optymalny stan równowagi.
Precypitacja jest bardzo czułym odczynem służącym ocenie czystości
różnych preparatów, w tym antygenów i przeciwciał używanych w innych
odczynach.
240
Odczyn można wykonać w środowisku płynnym i żelowym. W środowisku
płynnym precypitacja może być wykonana za pomocą próby
pierścieniowej i próby flokulacyjnej (kłaczkującej).
Precypitacja w środowisku płynnym wykonywana jest sporadycznie,
natomiast precypitacja w środowisku żelowym jest podstawą szeregu
bardzo czułych testów służących ocenie czystości różnych preparatów.
Odczyn nosi miano immunodyfuzji. Precypitat powstaje w miejscu
zetknięcia się dwóch reagentów, będących w optymalnym stosunku
ilościowym i powstaje w postaci linii, łuku lub pierścienia. Odczyn ten,
dzięki różnej szybkości dyfundowania w żelu poszczególnych składników
reakcji, pozwala stwierdzić czy powstający precypitat jest jednorodny, tzn.
czy występuje w nim jeden czy wiele kompleksów antygen–przeciwciało.
Odczyn immunodyfuzji można przeprowadzić w probówkach metodą
Oudina (immunodyfuzja prosta) lub na płytkach metodą Outcherlon’ego
(immunodyfuzja podwójna)
Immunodyfuzja radialna wg Manciniego umożliwia ilościowe określenie
składników reakcji. Żel zmieszany z surowicą odpornościową wylewa się
na płytkę. Po zakrzepnięciu wycinany jest zbiorniczek, do którego nalewa
się roztwór antygenu. Ten dyfunduje do żelu i w strefie zrównoważenia
stężeń składników reakcji tworzy się pierścieniowa strefa precypitatu.
Pomiar jej średnicy i odniesienie do krzywej wzorcowej pozwala wyliczyć
stężenie badanego antygenu.
Immunodyfuzja podwójna polega na dyfuzji w żelu dwóch składników
antygenu i przeciwciała. W obszarze równowagi stężeń powstaje
precypitat w postaci linii precypitacyjnej. Jeżeli składniki reakcji są
niejednorodne, to powstaje więcej precypitatów, wiele linii
precypitacyjnych.
Technika, która stanowi połączenie immunodyfuzji i elektroforezy jest
immunoelektroforeza. W pierwszym etapie następuje wstępny rozdział
antygenów w polu elektrycznym, a następnie immunodyfuzja
rozdzielonych elektroforetycznie antygenów i naniesionej później do
równoległego do linii rozdziału dołka mieszaniny odpowiednich
przeciwciał. Metoda ta stosowana jest do kontroli jednorodności, składu
jakościowego oraz swoistości antygenów i przeciwciał lub w badaniu
składu białek surowicy i zmian, jakie mogą w nich następować
w niedoborach odpornościowych.
241
Połączenie immunodufuzji radialnej i elektroforezy służące ilościowemu
oznaczaniu antygenów jest testem rakietkowym wg Laurella. Nazwa
pochodzi od kształtu strefy precypitacji powstającej w wyniku reakcji
zawartych w żelu przeciwciał z rozdzielonym w polu elektrycznym
antygenem.
Odczyn neutralizacji
Odczyn neutralizacji odwzorowuje zjawiska zachodzące w ustroju.
W następstwie połączenia przeciwciał neutralizujących z odpowiednimi
antygenami dochodzi do zniesienia ich aktywności biologicznej.
Zobojętnione wirusy nie mnożą się w hodowli komórek i nie wywierają
efektu cytopatycznego. Cytotoksyny nie niszczą wrażliwych komórek, np.
nie hemolizują krwinek. Fakt ten jest wykazywany przez zastosowanie jako
wskaźnika układów biologicznych: krwinek, hodowli tkankowych
reagujących na działanie niezwiązanego antygenu w widoczny dla oka
sposób.
Oznaczanie antystreptolizyny O - odczyn ASO
Antystreptolizyny O są przeciwciałami powstającymi w organizmie
w przebiegu zakażenia paciorkowcem ropotwórczym (Streptococcus
pyogenes) neutralizującymi wytwarzaną przez te bakterie toksynę
streptolizynę O. Streptolizyna ta jest hemolizyną. Oznaczanie poziomu
(miana) antystreptolizyn jest bardzo przydatne diagnostycznie, szczególnie
w różnicowaniu chorób reumatycznych.
Miano surowicy o wartości mniejszej lub równej 200, zatem
odpowiadające ilości przeciwciał potrzebnych do neutralizacji nie więcej
niż 200 j.m. (jednostek międzynarodowych) streptolizyny O, uznawane
jest za prawidłowe. Dowodem rozwijającego się zakażenia paciorkowcami
jest stwierdzenie narastania miana przeciwciał w badaniu powtórzonym w
odstępie dwóch tygodni.
Dokładny sposób wykonania oznaczenia jest zwykle załączony w postaci
instrukcji do handlowego preparatu „Streptolizyny O”, którą należy
zakupić w celu jego wykonania. Potrzebne są także erytrocyty królicze.
Odczyn wykonuje się zazwyczaj dwuetapowo. Najpierw określa się
242
przybliżone miano w szerokim zakresie. Potem zawęża się zakres badania
i ustala dokładnie wartość miana.
Dla oznaczenia poziomu przeciwciał dla streptolizyny O (> 200 j.m.) używa
się powszechnie odczynu lateksowego, w którym cząstki lateksu
opłaszczone są streptolizyną O. Z zawierającą przeciwciała, odpowiednio
rozcieńczoną surowicą pacjenta cząstki takie tworzą aglutynaty
wykrywane w aglutynacji szkiełkowej. Dokładny przepis wykonania
zawierają zestawy oferowane przez producentów.
Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)
Odczyn wiązania dopełniacza służy wykrywaniu tych przeciwciał, które po
połączeniu z antygenami dla których są swoiste, wiążą i aktywują system
dopełniacza. Reakcja ta jest bardzo czuła i pozwala na wykrycie bardzo
małych ilości poszukiwanego składnika. W odczynie mogą brać udział
antygeny w postaci cząstek – bakterie, wirusy lub antygeny rozpuszczalne.
Wskaźnikiem w OWD są krwinki baranie połączone ze swoistymi
przeciwciałami. Przyłączenie do nich niezwiązanego wcześniej dopełniacza
manifestuje się ich hemolizą.
Odczyn wiązania dopełniacza znalazł zastosowanie w serodiagnostyce kiły,
w diagnostyce serologicznej wielu chorób wirusowych: opryszczki,
półpaśca i kleszczowego zapalenia mózgu.
Odczyn przebiega w dwóch fazach.
 W pierwszej fazie miesza się w określonych proporcjach antygen
z badaną surowicą oraz dopełniaczem. Jeżeli w surowicy znajdują
się swoiste dla danego antygenu przeciwciała, wówczas tworzy się
kompleks immunologiczny. Wiąże on dodany dopełniacz, gdy brak
swoistych przeciwciał dopełniacz pozostanie wolny.
 W drugiej fazie dodaje się układ wskaźnikowy, jest nim inny
kompleks antygen–przeciwciało (uczulone krwinki baranie
połączone ze swoistymi przeciwciałami), przyłączenie dopełniacza
powoduje hemolizę.
Jeżeli hemoliza nie wystąpi, znaczy to, że dopełniacz został związany
w pierwszej fazie odczynu. Surowica zawierała, więc poszukiwane
przeciwciała – OWD dodatni. Wystąpienie hemolizy oznacza, że w badanej
243
surowicy przeciwciał nie było, a dopełniacz został przyłączony do układu
wskaźnikowego – OWD ujemny.
Nastawia się szereg kontroli:
 kontrola antygenu i kontrola surowicy – mają na celu wykluczenie
działania antykomplementarnego, czyli zdolność do nieswoistego
wiązania dopełniacza;
 kontrola układu hemolitycznego, czy następuje liza krwinek w układzie
hemolitycznym zawierającym dopełniacz;
 kontrola krwinek uczulonych mająca wykazać, że krwinki bez udziału
dopełniacza nie hemolizują.
Odczyn immunofluorescencji
Odczyn ten wykorzystuje antygeny bądź przeciwciała oznakowane
barwnikami fluoryzującymi, tj.: izotiocyjanianem fluoresceiny lub
rodaminy. Związki te absorbują UV, w wyniku czego w mikroskopie
fluorescencyjnym świecą zielonkawym lub czerwonawym światłem.
W odczynie immunofluorescencji bezpośredniej znakuje się fluoryzującym
barwnikiem jeden ze składników reakcji i za jego pomocą wykrywa się
składnik poszukiwany. Metoda ta pozwala bezpośrednio badać wycinki
tkanek, wymazy czy komórki, bez potrzeby ich utrwalania.
W immunofluorescencji pośredniej znane antygeny osadzane są na
szkiełku, a łączące się z nimi poszukiwane w materiale przeciwciała
wykrywa się stosując oznakowane fluorochromem przeciwciała
antygammaglobulinowe. Dzięki temu niewidoczny początkowo kompleks
można obserwować pod mikroskopem
Znacznie doskonalszą technologicznie odmianą odczynu jest zastosowanie
w nim cytometrii przepływowej. Detektory optyczne aparatu mierzą
emisję światła o określonej długości fali i określają jego intensywność, co
pozwala na mierzenie obecności kilku markerów jednocześnie. Mieszanina
pochodzących z organizmu pacjenta komórek oznakowana przez
przyłączenie do ich antygenów swoistych fluoryzujących przeciwciał może
być automatycznie analizowana ilościowo i sortowana.
244
Odczyn immunoenzymatyczny
Odczyny immunoenzymatyczne (ELISA – ang. enzyme linked
immunosorbent assay) wykorzystują antygeny lub przeciwciała
znakowane znacznikiem w postaci aktywnego enzymu. Najczęściej jest
używana peroksydaza chrzanowa lub alkaliczna fosfataza. Enzymy te
katalizują reakcje, których produkt, przy odpowiednim doborze substratu
(zwanego chromogenem), jest barwny. Pozwala to zauważyć wiązanie
przeciwciał z antygenami, a także określać ich ilość, gdyż natężenie barwy
jest wprost proporcjonalne do stężenia enzymu. Podobnie, jak
w immunofluorescencji, odczyn immunoenzymatyczny może być
wykonywany bezpośrednio lub pośrednio, gdy wykrywa się poszukiwane
przeciwciała, przyłączone do znanego antygenu, z użyciem znakowanych
enzymatycznie przeciwciał antygammaglobulinowych. Odczyn jest bardzo
czuły, pozwala na oznaczenia ilościowe, jest w pełni zautomatyzowany.
Odczyny
immunoenzymatyczne
mają
szerokie
zastosowanie
w diagnostyce chorób zakaźnych i pasożytniczych. Można za ich pomocą
wykrywać antygeny nowotworowe, hormony, antygeny i przeciwciała
w chorobach autoimmunizacyjnych oraz oznaczać stężenie antybiotyków
w surowicy.
W teście ELISA znane: antygen bądź przeciwciało związane jest z tzw. fazą
stałą – nośnikiem np. płytką polistyrenową. Każdy kolejny etap jest
przeprowadzony po uprzednim odmyciu niezwiązanych składników
poprzedniego. Dzięki temu technika jest bardzo dokładna i czuła.
Antygeny oznacza się najczęściej metodą podwójnych przeciwciał.
Przeciwciała dla poszukiwanych antygenów adsorbowane są na
polistyrenowym nośniku. Z nimi, w kolejnym etapie, wiążą się antygeny
zawarte w badanym materiale. Następnie antygeny te łączą się ze
swoistymi przeciwciałami połączonymi z markerem w postaci enzymu.
Dodanie chromogenu czyni reakcje widoczną. Absorbancję mierzy się
spektrofotometrycznie.
245
Przeciwciała w teście ELISA oznacza się stosując technikę pośrednią.
Zaadsorbowane na nośniku znane antygeny wychwytują z badanego
materiału poszukiwane przeciwciała. Te zaś, w kolejnym etapie łączą się
z homologicznymi przeciwciałami surowicy antygammaglobulinowej
oznakowanymi enzymem. Efekt reakcji enzymu z chromogenem oceniany
jest spektrofotometrycznie.
Odczyn radioimmunologiczny
Odczyny radioimmunologiczne (RIA, ang. radioimmune assay) do
znakowania znanego składnika reakcji wykorzystują izotopy
promieniotwórcze (najczęściej 125I). Odczyny te są najczulszymi metodami
ilościowego określania składników reakcji immunologicznej. Możliwe jest
oznaczenie tymi metodami haptenów oraz poszukiwanie przeciwciał o
określonym izotypie. Metodą tą określa się na przykład swoiste dla
danego alergenu IgE w odczynie radioalergosorpcji – RAST (ang. radioallergosorbent test).
Immunoblotting jest techniką, w której rozdzielone w żelu w polu
elektrycznym (elektroforeza) antygeny lub przeciwciała są przenoszone
następnie na specjalną błonę, na której wykonuje się odczyn
immunologiczny testem ELISA lub RIA.
Ta technika znajduje zastosowanie w badaniach wirusologicznych oraz
w alergologii.
Zadania do wykonania
Zadanie 1
Wykonanie aglutynacji szkiełkowej bakterii.
Wykonaj aglutynację dla hodowli pałeczek jelitowych. Pamiętaj
o zachowaniu zasad obowiązujących w pracy z bakteriami. Pracuj przy
palniku.
 Użyj świeżej hodowli bakterii na podłożu stałym.
 Na szkiełko podstawowe nanieś dwie osobne krople:
246
- kroplę fizjologicznego roztworu NaCl (kontrola zawieszalności),
- kroplę znanej surowicy odpornościowej (właściwy odczyn).
 Pobierz bakterie ezą i dodaj najpierw do jednej kropli, a potem
nową porcję do drugiej kropli. Nie zapomnij opalać ezy.
 Jeśli bakterie są poszukiwanymi, w kropli surowicy powinny
w ciągu 5 minut powstać zlepy – aglutynaty. W kontroli zawiesina
powinna być homogenna.
Zadanie 2
Wykonanie aglutynacji szkiełkowej krwinek.
Wykonaj aglutynację szkiełkową z krwinkami barana.
- Umieść kroplę z zawiesiną krwinek na szkiełku; przyjrzyj się, czy
samoistnie nie aglutynują.
-Dodaj kroplę surowicy odpornościowej i obserwuj powstające aglutynaty.
Zadanie 3
Odczytanie miana w odczynie aglutynacji probówkowej
W aglutynacji probówkowej wstępnie rozcieńczoną surowicę rozcieńcza
się dalej, zazwyczaj metodą kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń
w roztworze fizjologicznym NaCl.
W poniższych tabelkach napisz, jakie rozcieńczenie surowicy uzyskano
w kolejnych probówkach. Zaznacz wynik aglutynacji. Zapisz oznaczone
w ten sposób miano surowicy.
247
Aglutynacja z antygenem somatycznym (O):
Próbówka
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 K
5
6
7
8
9
10 K
Uzyskane
rozcieńczenie
surowicy
Aglutynacja
Miano tej surowicy wynosi:
Aglutynacja z antygenem rzęskowym (H):
Próbówka
1
2
3
4
Uzyskane
rozcieńczenie
surowicy
Aglutynacja
Miano tej surowicy wynosi:
Zadanie 4
Odczyn neutralizacji streptolizyny O przez przeciwciała osób badanych
Oblicz miano antystreptolizyny O w badanej surowicy.
- W statywie znajduje się 10 probówek tzw. widalowskich, z których trzy
ostatnie stanowią kontrole (KI, KII, KIII).
- W pierwszych siedmiu probówkach (odczyn główny) dokonuje się
szeregu dwukrotnych rozcieńczeń badanej surowicy w roztworze
fizjologicznym NaCl.
248
- Do pierwszej kontroli (kontrola surowicy) nalewa się 0.5 mL roztworu
NaCl oraz 1 mL surowicy.
- Do drugiej (kontrola aktywności hemolitycznej streptolizyny O) i trzeciej
kontroli (kontrola krwinek) nalewa się odpowiednio: 1.0 i 1.5 mL roztworu
NaCl.
- Następnie do wszystkich probówek, z wyjątkiem KI i KIII, dodaje się po
0.5 mL streptolizyny (1 j.m.).
-Inkubuje w łaźni wodnej 37°C przez 15 minut.
-Następnie do wszystkich probówek dodaje się po 0.5 mL krwinek
króliczych.
-Na koniec probówki inkubuje się w łaźni wodnej 37oC przez 60 minut
Rozpoznaj obecność lub brak hemolizy w kolejnych probówkach - wyniki
zapisz w tabeli.
Probówka
1
2
3
4
5
6
7
8
KI
9
K II
10
K III
Uzyskane
rozcieńczenie
surowicy
Hemoliza
Jedna jednostka Streptolizyny O jest całkowicie zobojętniona (przez jedną
jednostkę antystreptolizyny O) w probówce nr:
1 mL nierozcieńczonej surowicy zawiera j.m. antystreptolizyny O.
249
Zadanie 5
Szczepionki przeciwbakteryjne i przeciwwirusowe
Uzupełnij poniższą tabelę odnoszącą się do szczepionek przeciwbakteryjnych.
Choroba
Bakterie
Typ i/lub skład
szczepionki
Rodzaj szczepienia
(obowiązkowe/
zalecane)
Mycobacterium
tuberculosis
Haemophilus
influenzae typ b
tężec
anatoksyna błonicza
(toksoid)
Bordetella
pertusis
krztusiec
(acelularna)
250
Uzupełnij
poniższą
przeciwwirusowych.
Wirus
tabelę
Genom
(DNA/
RNA)
odnoszącą
się
Rodzaj szczepionki
(atenuowana/
inaktywowana/
podjednostkowa)
do
szczepionek
Rodzaj
szczepienia
(obowiązkowe/
zalecane)
Zapalenie
wątroby typu A
Zapalenie
wątroby typu B
Zapalenie
wątroby typu C
Różyczka
Odra
Świnka
Poliomyelitis
Grypa
251
Odkleszczowe
zapalenie
mózgu
Wścieklizna
Ospa wietrzna i
półpasiec
Biegunka
rotawirusowa
HIV
Zadanie 6
Szczepionki przeciwbakteryjne.
Rozwiń skróty popularnych szczepionek:
DTP –
DTPa –
Td –
BCG –
Hib -
252
Zadanie 7
Immunodiagnostyka onkologiczna
Rozszyfruj skróty:
TSA –
TAA –
CEA –
AFP –
CD10, CD13, CD19 -
253
254