hydrofobowe i hemaglutynacyjne właściwości pałeczek klebsiella

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 45 - 50
Alicja Sękowska, Eugenia Gospodarek
HYDROFOBOWE I HEMAGLUTYNACYJNE WŁAŚCIWOŚCI
PAŁECZEK KLEBSIELLA PNEUMONIAE I KLEBSIELLA OXYTOCA
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera Uniwersytetu
Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik: dr hab. E. Gospodarek prof. UMK
Oceniono hydrofobowe i hemaglutynacyjne właściwości 100 szczepów
K. pneumoniae i 88 szczepów K. oxytoca izolowanych z próbek materiału
klinicznego. Dokonano także analizy związku pomiędzy hydrofobowymi
i hemaglutynacyjnymi właściwościami badanych izolatów.
Najczęstsze zakażenia powodowane przez pałeczki Klebsiella sp. to zakażenia dróg
oddechowych, układu moczowego, ran oraz zakażenia ogólnoustrojowe (15). W każdym
z tych rodzajów zakażeń, bez względu na lokalizację, bakterie wchodzą w kontakt z komórkami gospodarza. Zaobserwowano, że pałeczki Klebsiella sp. mogą przylegać do komórek
nabłonkowych (3, 20), erytrocytów (16), a także komórek roślin (6).
Z niespecyficznych mechanizmów bakteryjnej adhezji hydrofobowość powierzchni
komórki jest podstawowym czynnikiem warunkującym adhezję (10). Następstwem adhezji
niespecyficznej są swoiste procesy przylegania związane z interakcjami receptor-ligand,
wspomagane przez udział nie receptorowych struktur występujących na powierzchni komórek bakteryjnych (18). Specyficznie wiązane cukry, białka i lektyny działają jak adhezyny
lub hemaglutyniny, które przylegają do erytrocytów i powodują hemaglutynację (13).
Wydaje się słuszne określenie, że szczepy o powierzchni hydrofobowej częściej przylegają
do erytrocytów.
Celem pracy była ocena hydrofobowych i hemaglutynacyjnych właściwości pałeczek
K. pneumoniae i K. oxytoca oraz analiza związku między badanymi właściwościami.
MATERIAŁ I METODY
Przedmiot badań stanowiło 100 szczepów Klebsiella pneumoniae i 88 Klebsiella oxytoca izolowanych z próbek materiału klinicznego. Identyfikację izolatów przeprowadzono
przy użyciu testów biochemicznych ID32E (bioMérieux). Szczepy hodowano 24 godziny
na podłożu Tryptic Soy Agar (Becton-Dickinson) wzbogaconym 5% krwi.
Hydrofobowość powierzchni komórek Klebsiella sp. oceniono metodą Rosenberga
i wsp. (17). Na podstawie uzyskanych wyników szczepy bakteryjne podzielono na dwie
46
A. Sękowska, E. Gospodarek
Nr 1
grupy: hydrofobowe - powyżej 25% komórek przylegających do p-ksylenu i hydrofilowe
- poniżej 25% komórek przylegających do p-ksylenu.
Ocenę hemaglutynacyjnych właściwości pałeczek Klebsiella sp. przeprowadzono według metody Blanco i wsp. (1). W doświadczeniu zastosowano czerwone krwinki ludzkie
grupy O i baranie w dwóch układach: hemaglutynacja naturalnych krwinek ludzkich (L)
i baranich (B) oraz hemaglutynacja krwinek poddanych działaniu kwasu taninowego (Merck)
(ludzkie krwinki taninowane - LT, baranie krwinki taninowane - BT). Ze szczepami, które
dawały dodatnią reakcję hemaglutynacji przeprowadzono test zahamowania hemaglutynacji z wybranymi cukrami. Jako inhibitorów hemaglutynacji użyto 0,1 M roztworów
następujących cukrów: D-glukozy, D-mannozy, D-rybozy, L-fukozy, α -laktozy, sacharozy,
D-galaktozy i D-ksylozy (Sigma). Przygotowanie i taninowanie krwinek przeprowadzono
według metody Gałązki i Sporzyńskiej (4).
WYNIKI
Spośród badanych szczepów K. pneumoniae 30 (30,0%) posiadało hydrofobowe właściwości. Wśród szczepów K. oxytoca u 17 (19,3%) wykryto powierzchnię hydrofobową.
Hemaglutynacyjne właściwości wykazano u 45 (45,0%) szczepów K. pneumoniae i 20
(22,7%) szczepów K. oxytoca. Krwinki taninowane częściej ulegały hemaglutynacji pod
wpływem szczepów K. pneumoniae (66,0%) i K. oxytoca (25,0%) niż krwinki naturalne.
Krwinki baranie taninowane najczęściej ulegały hemaglutynacji pod wpływem badanych
szczepów, najrzadziej krwinki ludzkie. Pod wpływem szczepów K. pneumoniae odnotowano
9 wzorów hemaglutynacji (najczęstszy wzór L(-)LT(+)B(-)BT(+), a pod wpływem szczepów
K. oxytoca 4 wzory (najczęstszy wzór L(-)LT(-)B(-)BT(+) (Tab. I).
Tabela I. Wzory hemaglutynacyjnej aktywności pałeczek Klebsiella sp. (n=65)
Liczba szczepów
Wzór hemaglutynacji
K. pneumoniae (n=45)
K. oxytoca (n=20)
L(-)LT(+)B(-)BT(+)
15
5
L(-)LT(-)B(-)BT(+)
12
9
L(+)LT(+)B(+)BT(+)
6
0
L(-)LT(+)B(-)BT(-)
5
0
L(-)LT(-)B(+)BT(+)
3
0
L(+)LT(-)B(+)BT(-)
1
3
L(-)LT(+)B(+)BT(+)
1
0
L(+)LT(-)B(+)BT(+)
1
0
L(-)LT(+)B(+)BT(-)
1
3
Ze szczepami wykazującymi hemaglutynacyjne właściwości wykonano test zahamowania hemaglutynacji. Pod wpływem szczepów K. pneumoniae odnotowano 19 wzorów
zahamowania hemaglutynacji. Najczęściej zahamowanie hemaglutynacji następowało w
obecności wszystkich badanych cukrów. Pod wpływem szczepów K. oxytoca odnotowano
7 wzorów zahamowania hemaglutynacji. Najczęściej obserwowano wzór D-glukoza Dmannoza. Zahamowanie hemaglutynacji krwinek przez szczepy obu badanych gatunków
najczęściej obserwowano w obecności D-glukozy i D-mannozy (Tab. II).
Nr 1
Hydrofobowe i hemaglutynacyjne właściwości K. pneumoniae i K. oxytoca
47
Tabela II. Wzory zahamowania hemaglutynacyjnej aktywności pałeczek Klebsiella sp. pod wpływem
cukrów.
Liczba szczepów
Wzór zahamowania hemaglutynacji
K. pneumoniae
K. oxytoca
W
23
0
D-glu D-man
16
8
D-glu D-man D-gal D-ksyl
8
0
D-glu D-man L-fuc
6
1
L-fuc sach
4
0
D-glu D-ryb α-lakt
3
0
D-glu D-man D-gal
3
1
D-glu L-fuc
2
5
D-man
2
0
D-glu D-man D-ryb L-fuc α-lakt
1
0
D-glu D-ryb L-fuc α-lakt sach
1
0
D-glu D-man sach
1
0
D-man L-fuc sach
1
0
D-ryb L-fuc α-lakt
1
0
D-glu α-lakt
1
0
D-glu D-gal
1
0
D-glu
1
6
L-fuc α-lakt
1
0
L-fuc
1
2
α-lakt
0
1
W – wszystkie badane cukry
Analizując związek pomiędzy hydrofobowymi a hemaglutynacyjnymi właściwościami
odnotowano, że 27 (36,0%) szczepów K. pneumoniae i 15 (40,5%) szczepów K. oxytoca
posiadało obie badane właściwości.
DYSKUSJA
Adhezja jest ważnym początkowym etapem w patogenezie zakażeń bakteryjnych.
Bakterie zazwyczaj tworzą na swojej powierzchni struktury, których pierwszą funkcją jest
interakcja z receptorem w błonach komórek docelowych. Mogą też aglutynować erytrocyty
zwierząt. Interakcje z nimi mogą mieć związek z patogenezą zakażeń.
Według Okamoto i wsp. (14) hydrofobowość powierzchni komórki i obecność hemaglutynin są jednymi z ważniejszych czynników wirulencji różnych bakterii. W obecnej pracy
odnotowano ponad 20% szczepów Klebsiella sp. o powierzchni hydrofobowej. Otrzymane wyniki są zbliżone do uzyskanych przez Hoštacká i Klokočniková (7) w odniesieniu
do szczepów K. oxytoca. Natomiast różnią się w przypadku szczepów K. pneumoniae.
W przedstawianej pracy nie odnotowano szczepów Klebsiella sp. silnie hydrofobowych,
co potwierdzają badania innych autorów (2, 7).
48
A. Sękowska, E. Gospodarek
Nr 1
Hemaglutynacyjne właściwości pałeczek Gram-ujemnych były tematem wcześniejszych
opracowań (5, 11, 12). Szczepy badane w prezentowanej pracy wykazywały zdolność adhezji
do komórek żywych (ludzkich i baranich), chociaż w mniejszym stopniu niż do komórek
poddanych działaniu garbnika. Podobne wyniki uzyskała Janicka i wsp. (8) badając hemaglutynacyjne właściwości szczepów E. coli. Autorzy powyższej pracy tłumaczą ten fakt
odsłonięciem przez garbnik receptorów głębszych warstw ścian krwinki lub modyfikacją
przy użyciu garbnika struktur chemicznych istniejących już na powierzchni krwinki. Spośród
badanych szczepów ponad 30% posiadało hemaglutynacyjne właściwości. W obecnej pracy
częściej obserwowano szczepy hemaglutynujące krwinki baranie niż ludzkie. Przondo-Hessek i Pulverer (16) badając zdolność do hemaglutynacji ponad 300 szczepów Klebsiella sp.
nie zaobserwowali szczepów aglutynujących krwinki baranie, a aglutynację krwinek ludzkich
odnotowali tylko pod wpływem dwóch szczepów. Rozbieżności mogą wynikać z odmienności osobniczej szczepów, a także właściwości ludzi i zwierząt, od których pochodziła
krew. Właściwości te mogą być związane z ekspresją różnych receptorów krwinkowych,
co może tłumaczyć zaobserwowane różnice.
Analizując wzory zahamowania hemaglutynacji zaobserwowano duże zróżnicowanie
receptorów cukrowych na powierzchni komórek Klebsiella sp. Większe zróżnicowane
wzorów zahamowania hemaglutynacji krwinek odnotowano dla szczepów K. pneumoniae
niż K. oxytoca. U bakterii Gram-ujemnych wykazano, że specyficzne interakcje lektynareceptor mogą mieć znaczenie w patogenezie chorób (wg 19). Być może obecność tak wielu
różnych receptorów wiąże się z większą chorobotwórczością K. pneumoniae i częstszym
powodowaniem zakażeń. W przedstawianej pracy wykazano, że szczepy należące do tego
samego gatunku mogą posiadać receptory dla wielu różnych cukrów.
Według Garber i wsp. (5) hemaglutynacja zależy od stopnia hydrofobowości komórki
bakteryjnej. W obecnej pracy ponad 30% szczepów K. pneumoniae i ponad 40% szczepów
K. oxytoca ocenionych jako hydrofobowe posiadało właściwości hemaglutynacyjne. Uzyskane wyniki częściowo wydają się potwierdzać doniesienia Garbera i wsp. (5). Jednak
odnotowano szczepy, które posiadały powierzchnię hydrofilową i hemaglutynowały krwinki.
Można więc przypuszczać, że przyleganie pałeczek Klebsiella sp. do komórek żywych może
być związane z hydrofobowością powierzchni, ale może również wynikać z obecności
swoistych receptorów o charakterze lektyn lub adhezyn.
PODSUMOWANIE
Baranie krwinki taninowane najczęściej ulegały hemaglutynacji pod wpływem pałeczek
Klebsiella sp.
Zahamowanie hemaglutynacji krwinek przez szczepy K. pneumoniae najczęściej
obserwowano w obecności D-glukozy i D-mannozy, natomiast przez szczepy K. oxytoca
w obecności D-glukozy.
Nr 1
Hydrofobowe i hemaglutynacyjne właściwości K. pneumoniae i K. oxytoca
49
A. S ę k o w s k a , E. Gospoda re k
HYDROPHOBIC AND HEMAGGLUTINATING PROPERTIES OF KLEBSIELLA
PNEUMONIAE AND KLEBSIELLA OXYTOCA
SUMMARY
The aim of this study was to estimated hydrophobic and hemnagglutinating properties of Klebsiella
pneumoniae and Klebsiella oxytoca rods. The hydrophobcity was evaluated according to the method
of Rosenberg et al. The hemagglutinating properties were estimated by method of Blanco et al.
Forty seven hydrophobic Klebsiella strains (30 K. pneumoniae strains and 17 K. oxytoca strains)
were detected. Hemagglutinating properties were observed in 65 Klebsiella strains (45 K. pneumoniae
strains and 20 K. oxytoca strains).
Hemagglutination of sheep tannined erythrocytes the most frequently was observed. Inhibition of
hemagglutination of erythrocytes by K. pneumoniae strains was most frequently observed in presence
of D-glucose and D-mannose and by K. oxytoca strains in presence of D-glucose.
PIŚMIENNICTWO
1. Blanco M, Blanco JE, Alonso MP i inni. Virulence factors and O groups of Escherichia coli
isolates from patients with acute pyelonephritis, cystitis and asymptomatic bacteriuria. Eur J
Epidemiol 1996, 12: 191.
2. Camprubi S, Merino S, Benedi J i inni. Physicochemical surface properties of Klebsiella pneumoniae. Curr Microbiol 1992; 24: 31-3.
3. Cortés G, Borrel N, de Astorza B i inni. Molecular analysis of the contribution of the capsular
polysaccharide and the lipopolysaccharide O side chain to the virulence of Klebsiella pneumoniae
in a murine model pneumonia. Infect Immun 2002; 70: 2583-90.
4. Gałązka A, Sporzyńska Z. Odczyn biernej hemaglutynacji. Wydawnictwo PZH. Warszawa
1975
5. Garber N, Sharon N, Shohet D i inni. Contribution of hydrophobicity to hemagglutination reactions
of Pseudomonas aeruginosa. Infect Immun 1985; 50: 336-7.
6. Haahtela KE, Tarkka E, Korhonen TK. Type 1 fimbrie-mediated adhesion of enteric bacteria to
grass roots. Appl Environ Microbiol 1985; 49: 1182-5.
7. Hoštacká A, Klokočniková L. Antibiotic susceptibility, serum response and surfce properties of
Klebsiella species Microbios 2001; 104: 115-24.
8. Janicka G, Białek M, Kruszyńska E i inni. Właściwości hemaglutynacyjne Escherichia coli. Diagn
Lab 1998; 34: 285-9.
9. Lemke MJ, Churchill PF, Wetzel RG. Effect of substrate and cell surface hydrophobicity on
phosphate utilization in bacteria. Appl Environ Microbiol 1995; 61: 913-9.
10. Malm A, Biernasiuk A, Łoś R i inni. Slime production and cell surface hydrophobicity of nasopharyngeal and skin staphylococci isolated from healthy people. Pol J Microbiol 2005; 54: 117-21.
11. Mikcha JMG, Piantino Ferreira AJ i inni. Hemagglutinating properties of Salmonella enterica
serovar Enteritidis isolated from different sources. Braz J Microbiol 2004; 35: 1
12. Mishra M, Thakar YS, Pathan AA. Haemagglutination, haemolysin production and serum resistance of Proteus and related species isolated from clinical sources. Ind J Med Microbiol 2001;
19: 5-11.
13. Møller JD, Larsen JL, Madsen L i inni. Involvment of a sialic acid-binding lectin with hemagglutination and hydrophobicity of Flavobacterium psychrophilum. Appl Environ Microbiol 2003;
69: 5275-80.
50
A. Sękowska, E. Gospodarek
Nr 1
14. Okamoto K, Inoue T, Ichikawa H i inni. Adherence of Yersinia enterocolitica to mammalian
epithelial cell lines. Microbiol Immunol 1980; 24: 1013-22.
15. Podschun R, Ullmann U. Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy,
typing methods and pathogenicity factors. Clin Microbiol Rev 1998; 11: 589-603.
16. Przondo-Hessek A, Pulverer G. Hemagglutinins of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca.
Zbl Bakt Hyg 1983; 255: 472-8.
17. Rosenberg M, Gutnick D, Rosenberg E. Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method
for measuring cell-surface hydrophobicity. FEMS Microbiol Lett 1980; 9: 29-33.
18. Różalska B. Infekcje towarzyszące stosowaniu w medycynie biomateriałów. Post Hig Med Dośw
1994; 48: 143-60.
19. Rupp ME, Archer GL. Hemagglutination and adherence to plastic by Staphylococcus epidermidis.
Infect Immun 1992; 60: 4322-7.
20. Sahly H, Podschun R, Oelschlaeger TA i inni. Capsule impedes adhesion to and invasion of
epithelial cells by Klebsiella pneumoniae. Infect Immun 2000; 68: 6744-9.
Otrzymano: 10 X 2007 r.
Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9,
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medium Uniwersytetu
Mikołaja Kopernika w Toruniu