hpv w wycinkach z polipów i raka jelita grubego

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 191 - 196
Beata Młynarczyk*, Magdalena Malejczyk*, Jacek Muszyński**, Sławomir Majewski*
WYSTĘPOWANIE WIRUSÓW BRODAWCZAKA LUDZKIEGO -HPV
W WYCINKACH Z POLIPÓW I RAKA JELITA GRUBEGO
*Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu
Medycznego
Kierownik: prof. dr hab. S. Majewski
**Katedra i Klinika Gastroenterologii i Chorób Przemiany Materii
Kierownik: prof. dr hab. W. Karnafel
Przedstawiono wyniki badań wycinków z jelita grubego, pobranych od
pacjentów z polipami i rakiem, w kierunku obecności onkogennych i nieonkogennych genitalnych typów HPV metodą PCR. Stwierdzono częstsze
występowanie HPV w wycinkach ze zmian patologicznych niż w zdrowej
błonie śluzowej z otoczenia zmian pobranej od tych samych pacjentów.
Wirusy brodawczaka ludzkiego–HPV (human papilloma virus) zaliczane do rodziny
Papillomaviridae posiadają materiał genetyczny w postaci dwuniciowego DNA. Obecnie
znanych jest ponad 100 typów HPV. Zależnie od różnic i podobieństw w sekwencji materiału
genetycznego rodzina Papillomaviridae jest podzielona na grupy alfa, beta i gamma(9).
W przypadku HPV wykazujących powinowactwo do błon śluzowych narządów płciowych
wyróżniamy typy onkogenne (wysokiego ryzyka) i nieonkogenne (niskiego ryzyka)(9).
HPV zakażają głównie naskórek lub nabłonek wielowarstwowy płaski, powodując
zależnie od typu wirusa wiele różnych objawów chorobowych. Onkogenne typy HPV są
odpowiedzialne za niemal wszystkie przypadki raka szyjki macicy (ponad 99%) a także za
50-70% przypadków raka sromu, 50% raka pochwy i 50-70 % raka prącia oraz 85% raka
odbytu. Materiał genetyczny HPV często wykrywany jest również w raku głowy i szyi,
jamy ustnej, przełyku i niektórych postaciach raka skóry (13, 16, 20).
W karcynogenezie związanej z HPV główną rolę odgrywają wytwarzane przez te wirusy
białka E6 i E7. E6 łączy się z białkiem p 53- prowadząc do jego degradacji przez układ
proteolityczny związany z ubikwityną. Zaliczane do antyonkogenów białko p53 odpowiada za indukcję programowanej śmierci komórki (apoptozy), m.in. w sytuacji znacznego
uszkodzenia materiału genetycznego komórki (8). Innym mechanizmem warunkującym
onkogenne działanie E6 jest przyłączanie się i przyśpieszanie degradacji białek zawierających
domenę PDZ tj. hDlg, hScrib, MAGI-1, MUPP-1. Jest to grupa białek odpowiedzialnych za
organizację przestrzenną receptorów i kanałów jonowych w komórce oraz uczestniczących
w połączeniach między komórkami nerwowymi (synapsy) i między komórkami nabłonka.
Degradacja tych białek jest dodatkowym, niezależnym od p53, czynnikiem ułatwiającym
192
B. Młynarczyk i inni
Nr 2
transformację nowotworową. Wykazano że zahamowanie działania hDlg i hScrib prowadzi
do pobudzenia proliferacji komórek (14, 18).
E7 łączy się z pRb (retinoblastoma susceptible protein) co prowadzi do odblokowania
związanego z nim czynnika transkrypcyjnego E2F i w konsekwencji do rozpoczęcia podziału komórki(8).Zwiększone ryzyko transformacji nowotworowej jest również związane
z integracją DNA wirusowego z DNA komórkowym.
Wszystkie powyższe mechanizmy są związane z pobudzeniem proliferacji i zahamowaniem apoptozy. Prowadzi to do „unieśmiertelnienia” zakażonych komórek i nagromadzenia
ważnych uszkodzeń DNA prowadzących do transformacji nowotworowej.
Materiał genetyczny HPV był wykrywany w innych tkankach niż naskórek lub nabłonek wielowarstwowy płaski, w tym, w nabłonku gruczołowym wyściełającym kanał
szyjki macicy i w nabłonku gruczołowym jelit (17). Możliwość zakażania przez HPV
tkanki nabłonkowej jelit nasuwa pytanie o udział tych potencjalnie onkogennych wirusów
w patogenezie raka i innych procesów rozrostowych w obrębie jelita grubego . Istnieje coraz
więcej danych, że zakażenie HPV 16 i/lub HPV 18 wiąże się ze zwiększonym ryzykiem
raka jelita grubego.
MATERIAŁ I METODY
W pracy wykorzystano wycinki pobrane endoskopowo ze zmian chorobowych i zdrowej
tkanki je otaczającej od 9 pacjentów z rakiem jelita grubego w wieku 37- 81 lat: 6 kobiet
i 3 mężczyzn oraz 29 pacjentów z polipami jelita grubego w wieku od 30 do 87 lat - 10
kobiet i 19 mężczyzn. Materiał był przechowywany od momentu pobrania w temperaturze
-70°C. Następnie z próbek izolowano DNA. Do reakcji PCR wykorzystywano jednorazowo 10 ml DNA. Reakcję przeprowadzano z użyciem mieszaniny o całkowitej objętości
50 ml zawierającej 1x bufor PCR, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM USA) oraz 20 pM każdego
z primerów: sensownego i antysensownego (Invitrogen, Szkocja) Do badania HPV 6
i HPV11wykorzystano startery o sekwencji: 5’ATGTTATGGCAGCACAGTTA3’ i 5’TTGCACTATAGGCGTAGCTG3’, a do badania HPV16 5’GTGGACCGGTCGATGTATGT3’
i 5’CATGCAATGTAGGTGTATCT3’. Jako kontrolę dodatnią zastosowano reakcję z użyciem starterów swoistych dla beta-globiny o sekwencji 5’CAACTTCATCCACGTTCACC3’
i 5’GAAGAGCCAAGGACAGGTAC3’
Amplifikację DNA przeprowadzano używając aparatu AB Applied Biosystem. Masę
produktów amplifikacji sprawdzano poddając je elektroforezie w 1,5% żelu agarozowym
zawierającym 0,25 mg/ml bromku etydyny w buforze TBE. Jako punktu odniesienia użyto
wzorców masowych DNA (Gibco).
Żel fotografowano w świetle UV.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
DNA HPV 16/18 wykryto w wycinkach ze zmian chorobowych u 17 z 29 badanych
pacjentów z polipami jelita grubego (59%) i u 6 z 9 badanych pacjentów z rakiem (67%).
W wycinkach ze zdrowej tkanki od tych samych chorych wynik badania PCR w kierunku
HPV16/18 był dodatni u 8 chorych z polipami (28%) i 4 z rakiem jelita grubego. W przy-
Nr 2
193
Występowanie HPV w materiale klinicznym
padku HPV 6/11 dodatnie wyniki PCR stwierdzono w wycinkach z polipów od 6 (24%)
i w wycinkach ze zdrowej tkanki od 7 (28%) spośród 29 chorych. W 2 na tych 7 przypadków DNA HPV 6/11H wykryto w zdrowej tkance u pacjentów, u których wynik badania
wycinków z polipów w kierunku HPV6 był ujemny (Tabela I).
Adenoma
tubulare
Adenoma tubulovillosum
Adenoma
villosum
Polipy
hiperplastyczne
9
29
11
9
2
3
7
1
6
5
0
0
0
1
1
7
3
0
0
1
3
6
17
6
4
2
2
4
4
11
2
5
2
2
3
3
9
4
0
1
1
2
A tubulare +
tubulovillosum
lub + polipy
hiperplastyczne
Polipy jelita
grubego łącznie
Rozpoznanie
Liczba przypadków
HPV6/11 w wycinkach ze
zmian
HPV6/11 w wycinkach z
tkanki zdrowej
HPV16/18 w wycinkach ze
zmian
HPV16/18 w wycinkach z
tkanki zdrowej
St. zapalny w badaniu histpat.
Rak jelita
grubego
Tabela I. Zakażenie HPV 6/11 i 16/18 w wycinkach ze zmian i zdrowej śluzówki u pacjentów
z polipami i rakiem jelita grubego
W zmianach patologicznych w obrębie jelita grubego częściej występował DNA HPV
16/18 niż DNA HPV6/11. HPV 16/18 występowało również częściej w wycinkach ze zmian,
niż w wycinkach z otaczających je tkanek zdrowych. Podobnej zależności nie stwierdzono
w przypadku HPV 6/11. Powyższe wyniki sugerują , że infekcja HPV 16/18 może odgrywać
rolę w patogenezie raka, oraz, nierzadko będących stanami przednowotworowymi, polipów
jelita grubego. Nie wykazano korelacji między obecnością i typami HPV a wiekiem i płcią
badanych pacjentów.
Nieonkogenne typy HPV 6 i 11 nie występowały u badanych przez nas pacjentów
z gruczolakami kosmkowymi i cewkowo- kosmkowymi a wykryto je u około połowy chorych z gruczolakami cewkowymi.
Zakażenie onkogennymi typami HPV 16 i 18 dotyczyło obydwu badanych pacjentów
z gruczolakami kosmkowymi a także 6 spośród 11 pacjentów z gruczolakami cewkowymi
i 4 z 9 pacjentów z gruczolakami cewkowo-kosmkowymi. Do stwierdzenia, czy istnieje
zależność między histopatologicznym obrazem polipów a zakażeniem HPV konieczne
byłoby zbadanie większej grupy chorych.
DYSKUSJA
Istnieje wiele udowodnionych czynników ryzyka rozwoju raka i przednowotworowych
stanów jelita grubego. Należą do nich m.in. rak jelita grubego w rodzinie, polipowatości ro-
194
B. Młynarczyk i inni
Nr 2
dzinne-zespół Gardnera i zespół Turkota, dieta, otyłość, alkohol, palenie tytoniu. Zakażenie
onkogennymi typami HPV mogłoby być dodatkowym czynnikiem ryzyka rozwoju nowotworów jelita grubego działającym niezależnie lub synergistycznie z wymienionymi powyżej.
Jednoznaczne potwierdzenie udziału HPV w patogenezie części przypadków nowotworów złośliwych i stanów przednowotworowych jelita grubego wymaga dalszych badań. Uzyskane dotychczas wyniki znacząco różnią się między sobą, chociaż w większości
opublikowanych badań stwierdzono większy odsetek zakażeń onkogennymi typami HPV
w wycinkach pobranych z raka i polipów jelita grubego niż w wycinkach ze zdrowej tkanki.
Różnice między poszczególnymi wynikami mogą wynikać z różnej czułości i swoistości
stosowanych metod (immunohistochemia, PCR, nested-PCR) oraz z różnic populacyjnych
w występowaniu onkogennych typów HPV. W jednym z badań przeprowadzonym metodami immumohistochemicznymi onkogenne typy HPV wykryto w 97% przypadków raka
okrężnicy, 60% łagodnych polipów i 23% wycinków z prawidłowej śluzówki (12). Jednak
później przeprowadzane w tym samym ośrodku badania przy użyciu PCR dały niższe
wartości -wyniki pozytywne odpowiednio w 32, 38 i 8% (15). Badania przeprowadzone
metodami immunohistochemicznymi w innym ośrodku wykazały obecność HPV6/11 lub
16/18 zaledwie 0,85% z 2351 badanych wycinków z raków jelita grubego (1).Może wynikać
to z niskiej czułości tej metody.
Na potencjalną rolę HPV jaką może odgrywać w patogenezie raka jelita grubego,
wskazują inne badania przeprowadzone metodą nested PCR obejmujące grupę 72 pacjentów z rakiem okrężnicy i 30 osób bez zmian nowotworowych. Różne typy HPV wykryto
u 83,3% osób z rakiem i u żadnej osoby z grupy kontrolnej. Większość osób (68,3% ) była
zakażona HPV16 (7).
Inne badania przeprowadzone metodą nested PCR w grupie 55 chorych z rakiem jelita
grubego wykazały obecność HPV wysokiego ryzyka w 51% przypadków. Najczęściej wykrywanym wirusem był HPV16, rzadziej wykrywano zakażenie HPV18 i HPV45 (2).
W badaniach przeprowadzonych metodą PCR i Southern blotting w innej grupie
pacjentów wykazano obecność HPV 18 w 84% wycinków z raka okrężnicy i odbytnicy
i w 53% wycinków z tkanki zdrowej. Różnica była istotna statystycznie (11). Znaczącą
statystycznie różnicę wykazano również w badaniach przeprowadzonych metodą nested
PCR, obejmujących 54 wycinki z raka gruczołowego okrężnicy i 30 wycinków ze zdrowej
tkanki jelitowej. Zakażenie różnymi typami HPV (6, 11, 16, 18, 33, 34 i 51) stwierdzono
częściej w tkance nowotworowej niż w zdrowej (17).
W badaniach przeprowadzanych na 109 wycinkach od pacjentów z polipami jelita grubego wykazano obecność różnych typów HPV w 28% przypadków. Częstość występowania
DNA HPV różniła się zależnie od wyniku badania histopatologicznego i dotyczyła 21%
gruczolaków cewkowych, 33% cewkowo-kosmkowych i 32% kosmkowych. Wszystkie
przypadki zakażeń HPV 6/11 lub 11 stwierdzano w gruczolakach cewkowych lub cewkowokosmkowych a większość zakażeń onkogennnymi HPV w kosmkowych. Jeszcze wyraźniejsze różnice występowały zależnie od stopnia dysplazji stwierdzanej w badanych wycinkach
. HPV wykryto u 8% chorych z dysplazją niewielkiego stopnia, u 25% z umiarkowaną
dysplazją i 58% z ciężką dysplazją. Wyniki te sugerują możliwość udziału HPV w rozwoju
zmian dysplastycznych i w konsekwencji raka jelita grubego w obrębie gruczolaków (4).
W przeprowadzanych przez tę samą grupę badaniach dotyczących pacjentów z rakiem jelita
grubego, DNA HPV wykryto u 52,9% osób wśród 70 badanych chorych (6).
Nr 2
Występowanie HPV w materiale klinicznym
195
Częstsze wykrywanie wirusa w wycinku z nowotworu lub stanu przednowotworowego
niż w tkance zdrowej nie zawsze musi świadczyć o jego udziale w kancerogenezie. Innym
wyjaśnieniem częstszej obecności wirusa może być większa podatność patologicznej tkanki
proliferującej na zakażenie HPV. Również brak materiału genetycznego wirusa w tkance
nowotworowej nie jest jednoznacznym dowodem, że nie odgrywa on żadnej roli w onkogenezie. Opisano przypadki w których wirus (np. HBV) powodował transformację nowotworową zakażonych komórek a następnie był z nich całkowicie eliminowany. Zjawisko to
jest określane mianem „uderzenia i ucieczki”(hit and run) (10).
Nasze badania potwierdziły częstsze występowanie onkogennych typów HPV w polipach
i raku jelita grubego. Sugeruje to udział tych wirusów w patogenezie części przypadków
nowotworów i przednowotworowych stanów przewodu pokarmowego. Do pełnego potwierdzenia tego udziału konieczne jest wykazanie, że w zakażonym onkogennymi typami HPV
nabłonku jelitowym dochodzi do ekspresji mRNA dla E6/E7 oraz, że zachodzą procesy
prowadzące do pobudzenia proliferacji i zahamowania apoptozy podobne lub analogiczne
do zachodzących w zakażonym nabłonku szyjki macicy. Istnieją dane sugerujące że takie
procesy zachodzą . W jednym z badań wykazano mniejszą ilość mutacji w obrębie genu
kodującego p53 w wycinkach z tkanki nowotworowej od chorych z rakiem okrężnicy zakażonych onkogennymi typami HPV niż u chorych nie zakażonych tymi wirusami (3).
Sugeruje to pośrednio, że w patogenezie raka okrężnicy u osób wysokiego ryzyka zakażonych HPV odgrywa rolę inaktywacja p53 przez wirusowe białko E6 (p 53 jest blokowane
na poziomie białka i nie musi być blokowane na poziomie genu). Podobna korelacja nie
występowała w przypadku częstej w raku jelita grubego mutacji w K-ras, onkogenie na
który nie ma wpływu infekcja HPV (4) W innych badaniach przeprowadzanych na grupie
pacjentów z rakiem jelita grubego zakażonych HPV 16/18 stwierdzono większą ekspresję
wirusowego białka E7 w tkankach nowotworowych niż w tkankach otaczających (19).
B. Młynarczyk, M. Malejczyk, J. Muszyński, S. Majewski
THE OCCURRENCE OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS –HPV IN THE BIOPSIES FROM
COLON POLYPS AND CANCER
SUMMARY
Human papillomaviruses (HPV) infection can be associated with benign (warts) and malignant
(precancer and cancer) genital, perianal and oral lesions. The role of HPV in the pathogenesis of
colonorectal cancer and adenomas is still undetermined. We investigated the occurrence of nononcogenic HPV 6/11 and oncogenic 16/18 DNA in colon cancer, polyps and normal tissue using PCR.
HPV 16/18 were detected more frequently in colon cancers (67%) and adenomas (56%)than in normal
colon mucosa (28%). In case of HPV6/11 the differences were not significant. The results suggest the
possible role of HPV 16/18 in pathogenesis of colon cancers and polyps.
PIŚMIENNICTWO
1. Audeau A, Han HW, Johnston MJ i inni. Does human papilloma virus have a role in squamous
cell carcinoma of the colon and upper rectum? Eur J Surg Oncol 2002; 28: 657-60.
196
B. Młynarczyk i inni
Nr 2
2. Bodaghi S, Yamanegi K, Xiao SY i inni. Colorectal papillomavirus infection in patients with
colorectal cancer. Clin Cancer Res 2005; 15: 2862-7.
3. Buyru N, Budak M, Yazici H, Dalay N. p53 gene mutations are rare in human papillomavirus-associated colon cancer. Oncol Rep 2003; 10: 2089-92.
4. Buyru N, Tezol A, Dalay N. Coexistence of K-ras mutations and HPV infection in colon cancer.
BMC Cancer 2006; 6: 115.
5. Cheng JY, Sheu LF, Lin JC, Meng CL. Detection of human papillomavirus DNA in colorectal
adenomas. Arch Surg 1995; 130: 73-6.
6. Cheng JY, Sheu LF, Meng CL i inni. Detection of human papillomavirus DNA in colorectal carcinomas by polymerase chain reaction. Gut 1995; 37: 87-90.
7. Damin DC, Caetano MB, Rosito MA i inni. Evidence for an association of human papillomavirus
infection and colorectal cancer. Eur J Surg Oncol 2007; 33: 569-74.
8. de Oliveira DE. DNA viruses in human cancer: An integrated overview of fundamental mechanisms of viral carcinogenesis. Cancer Letters 2007, 242: 182-196
9. de Villiers E.-M., Fauquet C., Broker T. R. i inni. Classification of papillomaviruses. Virology
2004; 324: 17-27.
10. Hessein M, Saad el G, Mohamed AA. i inni. Hit-and-run mechanism of HBV-mediated progression to hepatocellular carcinoma. Tumori 2005; 91:241-7.
11. Kirgan D, Manalo P, Hall M, McGregor B. Association of human papillomavirus and colon
neoplasms. Arch Surg 1990; 125: 862-5
12. Lee YM, Leu SY, Chiang H i inni. Human papillomavirus type 18 in colorectal cancer.J Microbiol
Immunol Infect 2001; 34: 87-91.
13. Majewski S, Jablonska S. Immunology of HPV infection and HPV-associated tumors. Int J Dermatol 1998; 37:81-95.
14. Massimi P, Gammoh N, Thomas M, Banks L. HPV E6 specifically targets different cellular pools
of its PDZ domain-containing tumor suppressor substrates for proteasome-mediated degradation.
Oncogene 2004; 21: 8033-9.
15. McGregor B, Byrne P, Kirgan D i inni. Confirmation of the association of human papillomavirus
with human colon cancer. Am J Surg 1993;166(6):738-40
16. Paavonen J. Human papillomavirus infection and the development of cervical cancer and related
genital neoplasias. Int J Infect Dis 2007; 11 Suppl 2: 3-9.
17. Perez LO, Abba MC, Laguens RM, Golijow CD. Analysis of adenocarcinoma of the colon and
rectum: detection of human papillomavirus (HPV) DNA by polymerase chain reaction. Colorectal
Dis 2005; 7: 492-5.
18. Yuan H, Fu F, Zhuo J, Wang W i inni. Human papillomavirus type 16 E6 and E7 oncoproteins
upregulate c-IAP2 gene expression and confer resistance to apoptosis. Oncogene 2005, 25
19. Zhang J, Ding Y, Zhou Z i inni. Expression of human papillomavirus 16 E7 DNA in patients with
colorectal adenocarcinoma. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi 2005; 22: 1024-6.
20. zur Hausen H . Papillomaviruses in the causation of human cancers - a brief historical account.
Virology 2009; 384: 260-5.
Otrzymano: 30 III 2009 r.
Adres Autora: 02-008 Warszawa, ul. Koszykowa 82a,
Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii WUM