wykorzystanie metody real-time pcr do wykrywania dna ludzkiego

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 259 - 265
Tomasz Dzieciątkowski1, Maciej Przybylski1, Małgorzata Gieryńska2, Mirosław Łuczak1
WYKORZYSTANIE METODY REAL-TIME PCR DO WYKRYWANIA
DNA LUDZKIEGO HERPESWIRUSA TYPU 6
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Kierownik: prof. dr hab. M. Łuczak
2
Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej,
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego
Kierownik: prof. dr hab. M. Niemiałtowski
1
Celem pracy było zaprojektowanie i zbadanie użyteczności metody real-time
PCR do diagnostyki zakażeń ludzkim herpeswirusem typu 6, zwłaszcza
u pacjentów poddanych immunosupresji w wyniku zabiegu przeszczepienia
komórek krwiotwórczych.
Ludzki herpeswirus typu 6 (human herpesvirus type 6; HHV-6) zaliczany jest do podrodziny β-herpesvirinae i wykazuje bliskie pokrewieństwo genetyczne z ludzkimi herpeswirusami typu 7 (HHV-7) oraz 5 (HHV-5, znanym powszechnie jako CMV) (1). Dokładna
analiza genetyczna oraz badanie sekwencji nukleotydów w genomie wirusa pozwoliło na
wyodrębnienie dwóch podtypów: HHV-6A oraz HHV-6B (9). U większości ludzi pierwotne
zakażenie HHV-6 ma miejsce we wczesnym dzieciństwie (19), a wirus jest szeroko rozpowszechniony w populacji, bowiem występowanie specyficznych przeciwciał w klasie IgG
stwierdzono u ponad 90% dorosłych (15). Podobnie jak pozostałe herpeswirusy, HHV-6
ustala stan latencji w śliniankach (6), monocytach (10) lub też komórkach progenitorowych
szpiku (12). Zakażenia herpeswirusem typu 6 zostały powiązane z wieloma jednostkami
chorobowymi (19), począwszy od stanów gorączkowych (4), poprzez neuroinfekcje (16)
do chorób limfoproliferacyjnych włącznie (13).
Reaktywacja latentengo wirusa połącznona z pełną manifestacją kliniczną zdarza się
rzadko u osób ze sprawnym układem odpornościowym (14), lecz może mieć śmiertelny
przebieg u osób poddanych immunosupresji (19). Wykorzystując techniki biologii molekularnej obecność HHV-6 w osoczu stwierdzano u średnio 32% biorców przeszczepów
narządowych oraz 30-48% biorców komórek krwiotwórczych (18). W tej ostatniej grupie
chorych szczyt wiremii występuje zazwyczaj w ciągu pierwszych 4 tygodni po zabiegu
przeszczepienia (5, 17), a czynnikami zwiększającymi ryzyko zakażenia jest przeszczep
allogeniczny, zaawansowana choroba podstawowa oraz leczenie immunosupresyjne z użyciem wysokich dawek kortykosterydów (17).
260
T. Dzieciątkowski i inni
Nr 3
Ze względu na upośledzenie funkcjonowania układu odpornościowego w grupach pacjentów opisanych powyżej, tradycyjne badania serologiczne wyrażają się często zbyt małą
czułością i są zastępowane przez metody biologii molekularnej, zwłaszcza testy PCR (5).
Celem pracy było opracowanie i optymalizacja metody PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania DNA ludzkiego herpeswirusa typu 6, określenie jej czułości
analitycznej oraz porównanie z testem komercyjnym, jako metodą odniesienia.
MATERIAŁ I METODY
Do jakościowych badań techniką real-time PCR (określenie swoistości reakcji) użyto całogenomowego DNA wyizolowanego ze standardowego szczepu SF ludzkiego herpeswirusa
typu 6 (Vircell®). Jako kontrolę ujemną wykorzystano DNA wyekstrahowane z niezakażonej
linii HFFF-2, zaś za kontrole specyficzności reakcji posłużył DNA izolowany z: wirusa
opryszczki typu 1 (HSV-1), wirusa cytomegalii (CMV) oraz wirusa Epsteina-Barr (EBV).
Do określenia czułości metody wykonano seryjne 10-krotne rozcieńczenia wzorcowego DNA
HHV-6 w jałowej, redestylowanej wodzie w zakresie od 100 do 10-6 (50 - 0,00005 ng/µl).
W celu opracowania starterów i sondy do metody real-time PCR wykorzystano sekwencję DNA dostępną w internetowej bazie danych GenBank (NC 001664), kodującego specyficzną wirusową DNA polimerazę. Zaprojektowane do niej startery amplifikują fragment
genomu o długości 74 par zasad (Tabela I). Dodatkowo celem zwiększenia specyficzności
reakcji zastosowano zaprojektowaną sondę fluorescencyjną typu TaqMan wyznakowaną
na końcu 5’ fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym JOE oraz wygaszaczem Dabcyl
na końcu 3’(Oligo®).
Badania techniką real-time PCR wykonywano na aparacie LightCycler 2.0 z użyciem
zestawu amplifikacyjnego LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics®). Mieszanina
reakcyjna zawierała 6 µl DNA; 2,25 µM startera HHV-6-1; 6,75 µM startera HHV-6-2
oraz 1,5 µM sondy HHV-6-JOE w końcowej objętości 20 µl. PCR rozpoczynał się etapem
aktywacji (hot-start) termostabilnej DNA polimerazy przez 10 min w 95oC, po którym
następowało 45 cykli składających się z denaturacji 15 s w 95oC, przyłączania starterów
przez 20 s w 60oC oraz wydłużania nici w temperaturze 72oC przez 15 s. Reakcję kończyło
schłodzenie próbek do 40oC na 30 sekund. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długości
fali 560 nm, typowej dla fluoroforu JOE. Wzrost poziomu fluorescencji był proporcjonalny
do ilości produktu w mieszaninie.
Materiał do badań stanowiło 30 próbek surowicy krwi, pochodzących od pacjentów
z Kliniki Hematologii i Onkologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego z lat 20062007. Izolację DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid
Kit (Roche Diagnostics®), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta, zawieszając
wyizolowane DNA w końcowej objętości 50 µl buforu elucyjnego. Użyte do doświadczeń
Tabela I. Sekwencje użytych starterów i sondy
Nazwa
Sekwencja (5’ – 3’)
HHV6-1
GAA GCA GCA ATC GCA ACA CA
HHV6-2
ACA ACA TGT AAC TCG GTG TAC GGT
HHV6-JOE
JOE - AAC CCG TGC GCC GCT CCC - Dabcyl
Nr 3
Real-time PCR w wykrywaniu DNA wirusa herpes typu 6
261
próbki zostały uprzednio zbadane przy zastosowaniu komercyjnego, ilościowego testu
MutaREAL® HHV-6 Kit (ALPCO®).
Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w trzykrotnych, niezależnych powtórzeniach.
WYNIKI
W metodzie real-time PCR wynik dodatni, wyrażony wykładniczym przyrostem fluorescencji mieszaniny reakcyjnej, osiągnięto we wszystkich próbkach zawierających materiał
genetyczny ludzkiego herpeswiursa typu 6. W pozostałych próbkach, zawierających kontrolne DNA niezakażonej linii HFFF-2, wirusa opryszczki typu 1, wirusa cytomegalii oraz
wirusa Epsteina-Barr, nie zaobserwowano fluorescencji przy badanej długości fali świetlnej
560 nm, co wskazuje na brak w nich swoistej amplifikacji kwasu nukleinowego. Obserwacja
taka poczyniona dla próbek zawierających materiał genetyczny innych wirusów świadczy
o wysokiej specyficzności reakcji (Ryc.1).
Podczas określania zakresu czułości metody technika real-time PCR umożliwiała
Ryc.1
Wynik reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego herpeswirusa typu 6.
Krzywa oznaczona HHV-6 oznacza amplifikację DNA herpeswirusa typu 6. Wykres K (-)
to kontrola ujemna (DNA izolowane z niezakażonej linii HFFF-2), zaś wykresy: HSV-1,
CMV oraz EBV oznaczają kontrole specyficzności reakcji.
wykrycie wszystkich użytych rozcieńczeń DNA ludzkiego herpeswirusa typu 6. Wynik
dodatni w postaci obserwowanego wzrostu fluorescencji wystąpił we wszystkich próbkach
262
T. Dzieciątkowski i inni
Nr 3
Ryc.2
Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego herpeswirusa
typu 6. Poszczególne krzywe oznaczają amplifikację DNA seryjnych rozcieńczeń HHV-6 w
zakresie od 100 do 10-6. K (-) to kontrola ujemna reakcji: DNA izolowane z niezakażonej
linii HFFF-2.
Ryc.3
Krzywa kalibracyjna fluorescencji metody real-time PCR do wykrywania ludzkiego
herpeswirusa typu 6. Poszczególne punkty na krzywej oznaczają fluorescencję seryjnych
rozcieńczeń HHV-6 w zakresie od 100 do 10-6.
zawierających rozcieńczenia DNA HHV-6 w zakresie od 100 do 10-6 (Ryc.2). Podobnie krzywa kalibracyjna fluorescencji wykazywała wysoki współczynnik liniowości, co świadczy
o dobrej powtarzalności zaprojektowanej metody (Ryc.3).
Opisane powyżej próbki kliniczne poddano opracowanej reakcji real-time PCR z użyciem sond fluoroscencyjnych TaqMan. W 17 próbkach materiału klinicznego odnotowano
wzrost poziomu fluorescencji barwnika reporterowego JOE, co jest następstwem wzrostu
ilości produktu w mieszaninie oraz degradacji odpowiednio modyfikowanej sondy TaqMan.
Pozostałe 13 próbek nie zawierało sekwencji DNA typowej dla ludzkiego herpeswirusa
typu 6, o czym świadczy brak wzrostu poziomu fluorescencji. Dodatnie wyniki badań
Nr 3
Real-time PCR w wykrywaniu DNA wirusa herpes typu 6
263
Tabela II. Porównanie wyników uzyskanych za pomocą opracowanej metody i komercyjnego
testu odniesienia
Nr
Próbka
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
surowica 1
surowica 2
surowica 3
surowica 4
surowica 5
surowica 6
surowica 7
surowica 8
surowica 9
surowica 10
surowica 11
surowica 12
surowica 13
surowica 14
surowica 15
surowica 16
surowica 17
surowica 18
surowica 19
surowica 20
surowica 21
surowica 22
surowica 23
surowica 24
surowica 25
surowica 26
surowica 27
surowica 28
surowica 29
surowica 30
Wynik uzyskany za pomocą
opracowanej metody real-time PCR
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
Wynik uzyskany za pomocą
testu komercyjnego (ALPCO)
(-)
(-)
(-)
(+) 800 kopii/ml
(-)
(-)
(+) 1400 kopii/ml
(+) 900 kopii/ml
(-)
(+) 1200 kopii/ml
(+) 800 kopii/ml
(+) 1800 kopii/ml
(-)
(-)
(+) 1700 kopii/ml
(-)
(+) 1100 kopii/ml
(+) 2600 kopii/ml
(-)
(-)
(+) 1800 kopii/ml
(+) 1500 kopii/ml
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(+) 2800 kopii/ml
stwierdzono więc w 13 z 30 (43,3%) badanych próbek. Identyczny wynik osiągnięto za
pomocą komercyjnego testu MutaREAL® HHV-6 Kit, co świadczy o wysokiej wartości
diagnostycznej nowo opracowanej metody (Tabela II).
DYSKUSJA
Ze względu na coraz większe rozpowszechnienie we współczesnej medycynie zabiegów
przeszczepiania zarówno komórek krwiotwórczych, jak i narządów unaczynionych, coraz
większą rolę zaczęła odgrywać diagnostyka wirusowych zakażeń potransplantacyjnych.
264
T. Dzieciątkowski i inni
Nr 3
Zwiększona częstotliwość reaktywacji ze stanu latencji przedstawicieli podrodziny β-herpesvirinae u osób poddanych immunosupresji spowodowała, że zakażenia nimi stały się
jedną z głównych przyczyn zgonów u pacjentów z tej grupy (7). Zakażenia HHV-6 zostały
powiązane z ostrym odrzucaniem przeszczepu (3, 11), zapaleniami płuc (19), wysypką
oraz gorączką (3, 14). Pomimo trudności w bezpośrednim powiązaniu herpeswirusa typu 6
z wymienionymi objawami klinicznymi, zakażenia HHV-6 powinny być brane pod uwagę
u osób z niedoborami immunologicznymi, zwłaszcza gdy rutynowe badania w kierunku
innych herpeswirusów, takich jak CMV i EBV dają wyniki negatywne.
Ograniczona czułość stosowanych testów serologicznych, powiązana z koniecznością
wczesnego zastosowania leczenia przeciwwirusowego zmusiła do rozpowszechnienia
w diagnostyce poprzeszczepowej metod biologii molekularnej (5, 8). Konwencjonalne
testy PCR mają zbyt niską czułość, co wskazuje na konieczność używania metod real-time
PCR w monitorowaniu poziomu DNA β-herpeswirusów u pacjentów z immunosupresją. Ich
wielokrotnie opisywana i podkreślana czułość gwarantuje wykrycie zakażeń pierwotnych
lub reaktywacji wirusa przy niskim poziomie wiremii (8). Zalecana przy zakażeniach herpeswirusem typu 6 terapia z użyciem cidofowiru, niesie za sobą poważne ryzyko nefrotoksyczności (2) - istotne jest więc jak najszybsze ograniczenie podawanych dawek w miarę
spadku liczby wykrywanych kopii wirusa.
Dostępność półilościowych lub ilościowych metod monitorowania wiremii HHV-6 może
znacząco ułatwić szybką diagnostykę zakażenia, a w konsekwencji prawidłowe postępowanie terapeutyczne. Ze względu na opisywaną w Polsce wysoką częstość występowania
herpeswirusa typu 6 u biorców komórek krwiotwórczych (5), wskazane są dalsze badania
dotyczące zakażeń o etiologii HHV-6 u pacjentów poddanych immunosupresji.
T. D z ie c ią tk o w s ki , M. Prz ybyl ski , M. Gi e ryńs ka, M . Łuczak
REAL-TIME PCR AS AN EFFICIENT TOOL FOR INVESTIGATING THE PRESENCE OF
HUMAN HERPESVIRUS 6 DNA
SUMMARY
Human herpesvirus 6 (HHV-6) is a β-herpesvirus widely spread within a population and has
been recognized as a potential significant pathogen in immunocompromised patients. Different clinical manifestations have been described including fever, skin rash, pneumonia, graft rejection and
encephalitis. The goal of the study was development of real-time PCR assay for detection of human
herpesvirus type 6 DNA in clinical samples, using primers targeting a conserved region of the viral
DNA polymerase gene and a specific TaqMan hydrolyzing probe. The analytical sensitivity of assay
was tested using serial dilutions of HHV-6 DNA in range between 100 and 10-6. Thirty plasma samples
taken from a group of adult recipients of allogeneic HSCT were tested for the presence of HHV-6
DNA in the LightCycler® system. For comparison commercial quantitative MutaREAL® HHV-6 kit
(ALPCO) was used, according to the manufacturer’s instructions. Both LightCycler® assays, including
in-house real-time PCR, detected HHV-6 DNA in 13 specimens. The conclusion is that developed TaqMan-based probes real-time PCR test is very reliable and valuable for detection of low-copy viremia
in plasma samples. The high level of sensitivity and accuracy provided by the LightCycler® instrument
is favorable for the use of this method in the detection of HHV-6 DNA in clinical specimens.
Nr 3
Real-time PCR w wykrywaniu DNA wirusa herpes typu 6
265
PIŚMIENNICTWO
1. Davison A, Eberle R, Hayward GS i inni. Herpesviruses. W: Virus taxonomy - classification and
nomenclature of viruses. VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Red.
C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff i inni, Elsevier Academic Press, San Diego 2005, 193-212.
2. De Bolle L, Naesens L, De Clercq E. Update on human herpesvirus 6 biology, clinical features,
and therapy. Clin Microbiol Rev; 2005; 18: 217-45.
3. Dęborska-Materkowska D, Sadowska A, Matłosz B i inni. Zakażenie ludzkim wirusem herpes
typu 6 u biorcy alloprzeszczepu nerki - opis przypadku. Przegl Epidemiol; 2006; 60: 141-6.
4. Dockrell DH: Human herpesvirus 6: molecular biology and clinical features. J Med Microbiol;
2003; 52: 5-18.
5. Dzieciątkowski T, Przybylski M, Torosian T i inni. Prevalence of human herpesvirus 6 antibodies
and DNA in allogeneic stem cell transplant patients: two-year single centre experience. Arch
Immunol Ther Exp; 2008; 56: 201-6.
6. Fox JD, Briggs M, Ward PA i inni. Human herpesvirus 6 in salivary glands. Lancet; 1990; 336: 590-3.
7. Griffiths PD, Clark DA, Emery VC. Betaherpesviruses in transplant recipients. J Microb Chem;
2000; 45: 29-34.
8. Ihira M, Yoshikawa T, Suzuki K i inni. Monitoring of active HHV-6 infection in bone marrow
transplant recipients by real time PCR; comparison to detection of viral DNA in plasma by
qualitative PCR. Microbiol Immunol; 2002; 46: 701-5.
9. Isegawa Y, Mukai T, Nakano K i inni. Comparison of the complete DNA sequences of human
herpesvirus 6 variants A and B. J Virol; 1999; 73: 8053-63.
10. Kondo K, Kondo T, Okuno T i inni: Latent human herpesvirus 6 infection of human monocytes/
macrophages. J Gen Virol; 1991; 72: 1401-8.
11. Ljungman P, Wang F-Z, Clark DA i inni. High levels of human herpesvirus 6 DNA in peripheral
blood leucocytes are correlated to platelet engraftment and disease in allogeneic stem cell transplant patients. Br J Haematol; 2000; 111: 774-81.
12. Luppi M, Barozzi P, Morris C i inni. Human herpesvirus 6 latently infects early bone marrow
progenitors in vivo. J Virol; 1999; 73: 754-9.
13. Salahuddin SZ, Ablashi DV, Markham PD i inni. Isolation of a new virus, HBLV, in patients with
lymphoproliferative disorders. Science; 1986; 234: 596-601.
14. Savolainen H, Lautenschlager I, Piiparinen H i inni. Human herpesvirus-6 and -7 in pediatric
stem cell transplantation. Pediatr Blood Cancer; 2005; 45: 820-5.
15. Saxinger C, Polesky H, Eby N i inni. Antibody reactivity with HBLV (HHV-6) in U.S. populations. J Virol Methods; 1988; 21: 199-208.
16. Singh N, Paterson DL. Encephalitis caused by human herpesvirus-6 in transplant recipients:
relevance of a novel neurotropic virus. Transplantation; 2000; 69: 2474-9.
17. Yoshikawa T, Asano Y, Ihira M i inni: Human herpesvirus 6 viremia in bone marrow transplant
recipients: clinical features and risk factors. J Infect Dis; 2002; 185: 847-53.
18. Zerr DM, Corey L, Kim HW i inni. Clinical outcomes of human herpesvirus 6 reactivation after
hematopoietic stem cell transplantation. Clin Infect Dis; 2005; 40: 932-40.
19. Zerr DM. Human herpesvirus 6: a clinical update. Herpes; 2006; 13: 20-4.
Otrzymano: 14 VII 2008 r.
Adres Autora: 02-004 Warszawa ul. Chałubińskiego 5,
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej,
Warszawski Uniwersytet Medyczny
e-mail: [email protected]