Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) 175343
(13)B1
(21) Numer zgłoszenia: 315513
(22) Data zgłoszenia: 20.01.1994
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
20.01.1994, PCT/IB94/00008
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
27.07.1995, W 095/19780,
PCT Gazette nr 32/95
(54)
A61K 35/14
A61K 38/20
Opis patentowy
przedrukowano ze względu
na zauważone błędy
Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi
obwodowej, kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania
aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
i kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów
(73)
(43)
( 5 1 ) IntCl6:
Uprawniony z patentu:
SCHERING CORPORATION,
Kenilworth, US
Zgłoszenie ogłoszono:
12.11.1996 BUP 23/96
(72)
Twórca wynalazku:
Martin A. Schwarz, Verona, US
(45 )
O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.12.1998 WUP 12/98
(74 )
Pełnomocnik:
Kossowska Janina, PATPOL Spółka z 0.0.
PL 175343 B1
(5 7 )
1. Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek
krwi obwodowej, znamienny tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje
się w obecności samej interleukiny- 1 0 lub interleukiny- 1 0 w kombinacji z interleukiną - 2
i/lub interferonem-a.
6 . Kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, znamienna tym, że zawiera interleukinę - 1 0 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
9. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów, znamienna tym, że zawiera
aktywowane interleukiną-10 (IL-10) jednojądrzaste komórki krwi obwodowej i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Sposób pozaustrojowego wytwarzania
aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej,
kompozycja farmaceutyczna
do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych
komórek krwi obwodowej
i kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek
krwi obwodowej, znamienny tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje
się w obecności samej interleukiny- 1 0 lub interleukiny- 1 0 w kombinacji z interleukiną - 2
i/lub interferonem-a.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje się z samą interleukiną-1 0 .
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje się z interleukiną- 1 0 i interleukiną-2 .
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej inkubuje się z interleukiną- 1 0 i następnie z interleukiną-2 .
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednojądrzaste komórki
krwi obwodowej pochodzące od pacjenta z nowotworem.
6 . Kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych
jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, znamienna tym, że zawiera interleukinę - 1 0 i
farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
7. Kompozycja według zastrz. 6 , znamienna tym, że zawiera dodatkowo interleukinę-2
i/lub interferon-α.
8. Kompozycja według zastrz. 6 albo 7, znamienna tym, że jako interleukinę-10
zawiera ludzką interleukinę-1 0 .
9. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia nowotworów, znamienna tym, że zawiera
aktywowane interleukiną-10 (IL-10) jednojądrzaste komórki krwi obwodowej i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera dodatkowo samą IL-10
lub IL-10 kombinacji z interleukiną-2 i/lub interferonem-α.
11. Kompozycja według zastrz. 9 albo 10, znamienna tym, że jako interleukinę-10
zawiera ludzką interleukinę-1 0 .
*
*
*
Przedmiotem wynalazku jest sposób pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych
jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, kompozycja farmaceutyczna do pozaustrojowego wytwarzania aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i kompozycja
farmaceutyczna do leczenia nowotworów.
Wynalazek niniejszy dotyczy zastosowania interleukiny-10 (IL-10) oraz konwencjonalnych czynników hamujących syntezę cytokin (Cytokine Synthesis Inhibitory Factors - czynniki
hamujące syntezę cytokin, [CSIF]) w immunoterapii adoptywnej stosowanej w leczeniu
chorób nowotworowych poprzez stymulację cytolitycznej aktywności jednojądrzastych
komórek krwi obwodowej (Peripheral Blood Mononuclear Cells - jednojądrzaste komórki
krwi obwodowej, [PBMC]).
Wprowadzenie metod leczenia nowotworów z wykorzystaniem własnego układu immunologicznego organizmu opiera się na obserwacji, że nowotwory w niewytłumaczalny sposób
175 343
3
unikają niszczącego je działania naturalnych mechanizmów obronnych skierowanych
przeciwko nieprawidłowym lub obcym komórkom i cząstkom. Pobudzanie własnej odporności jest wykorzystywane w onkologii, bowiem może prowadzić do zahamowania wzrostu
lub zabijania komórek nowotworu. Metody takie opisał np. Klein (Immunology, WileyInterscience, Nowy Jork, 1982, strony 623-648). Dokonane ostatnio obserwacje dotyczące
bezpośredniego lub pośredniego zahamowania wzrostu guza przez efektorowe mechanizmy
immunologiczne stały się przyczyną ponownego zainteresowania metodami immunoterapii w
onkologii. Wśród prac na uwagę zasługują przede wszystkim następujące: Heberman,
Concepts Immunopathol. 1:96 (1985) [naturalne komórki cytotoksyczne NK (Natural
Killer cells -[NK]) przeciwdziałają wzrostowi nowotworu]; Rosenberg i wsp., Ann. Rev.
Immunol. 4:681 (1988) [zastosowanie aktywowanych przez IL-2 komórek cytotoksycznych
do leczenia nowotworów]; Ralf i wsp., J. Exp. Med. 167:712 (1988) [skierowana przeciwko
nowotworowi cytotoksyczna aktywność stymulowanych limfokinami makrofagów]; Tepper
i wsp., Cell 57:503 (1989)] [interleukina-4 [IL-4] posiada działanie przeciwnowotworowe];
M. Cohen, "Limfokiny i odporność przeciwnowotworowa" ["Lymphokines and Tumor
Immunity"], strony 237-253, w książce pod red. S. Cohen, Lymphokines and the Immune
Response (CRC Press, Boca Raton, 1990).
Odpowiedź immunologiczna na rozwijający się w organizmie nowotwór regulowana
jest przez różnorodne komórki i obejmuje wspólne oddziaływanie limfocytów T oraz
cytokin pochodzących z monocytów. Jedną z metod leczenia, która jak wykazano daje
najbardziej obiecujące wyniki kliniczne, jest tzw. "immunoterapia adoptywna" wykorzystująca aktywowane przez IL-2 naturalne komórki cytotoksyczne [Rosenberg i wsp., Ann.
Rev. Immunol. 4:681 (1988); Rosenberg, Sci. Am., strony: 62-69 (Maj, 1990)]. Jakkolwiek
stosowana w monoterapii lub skojarzeniu z tradycyjnie używanymi cytostatykami interleukina- 2 okazała się skuteczną w leczeniu niektórych nowotworów (np. gruczolakoraka
nerki), to jednak objawy toksyczne, takie jak zespół przesiękania śródnaczyniowego i
obrzęki, związane z podawaniem terapeutycznych dawek IL-2 powodują, że niektórzy z
badaczy uważają, iż ryzyko związane z zastosowaniem IL-2 u chorego może przewyższać
potencjalne korzyści terapeutyczne [Cotran i wsp., J. Immunol. 139:1882 (1987); Edwards
i wsp., Cancer Res. 52:3425 (1992)].
Okazało się że szczególnie wrażliwymi na toksyczne oddziaływanie IL-2 są ludzkie
komórki śródbłonka naczyniowego (komórki endotelialne), czego dowodzą: ich zwiększona
przepuszczalność (np. zespół przesiękania śródnaczyniowego) oraz obrzęki. Jednym z
czynników wpływających na taki przebieg zjawiska może być, obserwowana wcześniej w
badaniach in vitro, zdolność przylegania aktywowanych interleukiną-2 limfocytów T i
granulocytów obojętnochłonnych do warstwy komórek śródbłonka [Edwards i wsp.,
powyżej, Damie i wsp., 138:1779 (1987)].
Alternatywnym postępowaniem do leczenia immunologicznego chorób nowotworowych jest adoptywne przeniesienie komórek immunokompetentnych. "Immunoterapią
adoptywną" określany jest specyficzny sposób leczenia polegający na przeniesieniu do
organizmu, w którym rozwija się nowotwór aktywnych komórek immunokompetentnych,
takich jak np. limfocyty o właściwościach przeciwnowotworowych, które mogą - w sposób
bezpośredni lub pośredni - wywierać działanie przeciwnowotworowe. Immunoterapia adoptywna jest cenną metodą leczenia chorób nowotworowych. Dodatkową jej zaletą jest to,
że dzięki przeniesieniu do organizmu aktywnych komórek immunokompetentnych, układ
immunologiczny biorcy nie musi być w pełni funkcjonalny. Tak więc, związana z rozwojem
nowotworu immunosupresja występująca w ustroju biorcy nie stanowi większego problemu
przy tym postępowaniu leczniczym. Ze względu na to, że pełna immunokompetencja
ustroju nie jest konieczna dla biorcy, a może tylko działać korzystnie, wspomagając adoptywne komórki immunologiczne, immunoterapia adoptywna może być z łatwością stosowana w skojarzeniu z innymi metodami leczenia przedwnowotworowego, takimi jak radio Czy
chemioterapia. Dodatkowo, w przeciwieństwie do innych metod terapii, prawie niemożliwym jest wystąpienie w czasie leczenia adoptywnego immunosupresji.
4
175 343
Chorzy poddani chemioterapii lub radioterapii wskutek wywołanych przez nie zaburzeń
układu immunologicznego nie są w stanie dostarczyć odpowiedniej liczby efektorowych
jednojądrzastych komórek krwi obwodowej [PBMC] koniecznych dla dalszej, pozaustrojowej ich aktywności. Dlatego dla uzyskania korzystnych wyników leczenia u takich
pacjentów powinny zostać wybrane szczególnie te metody terapii, które wykazują skuteczność przy niskim stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych.
Odpowiedź immunologiczna w stosunku do nowotworów podlega regulacji wielu
komórek immunokompetentnych i obejmuje oddziaływanie limfocytów T oraz cytokin
pochodzących z monocytów. Immunoterapia adoptywna, w której stosuje się ludzkie
rekombinowane cytokiny, polega na podawaniu stymulowanych poza organizmem [Phillips i
wsp., J. Clin. Oncol. 5:1933 (1987); Perussia i wsp., Curr. Opin. Immunol. 3:49 (1991)]
jednojądrzastych komórek krwi obwodowej [PBMC] poddanych działaniu IL-2 [Rosenberg i wsp., J. Immunol. 138:1779 (1985)]. Pozaustrojowa stymulacja PBMC powoduje
powstanie aktywowanych limfokinami komórek cytotoksycznych L A K (LymphokineActivated Killer - aktywowane limfokinami cytotoksyczne komórki zabijające [LAK]) oraz
aktywowanych naturalnych komórek cytotoksycznych NK, wykazujących zdolności cytolityczne wobec różnych rodzajów komórek nowotworowych.
Wykazano, że ludzkie rekombinowane cytokiny: IL-5 [Nagasawa i wsp., Cell. Immunol. 133:317 (1991)], IL-7 [Stotter i Lotze, Arch. Surgery 126:1525 (1991)] oraz IL-12
[Gately i wsp., J. Immunol. 147:874 (1991)] posiadają zdolność stymulowania aktywności
cytolitycznej ludzkich PBMC. Interleukina-10 (IL-10), jak w originale opisano mysią cytokinę hamujaca syntezę czynników wydzielanych przez podklasy specyficznych limfocytów
T-pomocniczych, wpływa na różnicowanie mysich komórek T-cytotoksycznych [Chen i
Złotnik, J. Immunol. 147:528 (1991)]. Wykazano również, że ludzkie PBMC inkubowane z
supematantami otrzymanymi z hodowli komórek COS transfekowanych ludzkim komórkowym DNA (cDNA) kodującym strukturę IL-10 (IL-10 cDNA), powodują in vitro lizę
docelowych komórek nowotworu. W doświadczeniu tym udało się także zidentyfikować komórki T o zwiększonym potencjale cytolitycznym odpowiadajace na stymulacyjne
działanie IL-10. Były nimi limfocyty o fenotypie CD56+, charakterystycznym dla komórek
linii NK.
W pewnych warunkach, IL-4 może odwracalnie zaburzać powstawanie komórek
L A K aktywowanych pod wpływem IL-2 [Nagler i wsp., J. Immunol. 141:2349 (1988)].
Dla przykładu, jeśli ludzkie PBMC hodowane są w obecności obu cytokin: IL-2 i IL-4, ilość
zniszczonych docelowych komórek nowotworowych wrażliwych na działanie L A K jest
znacznie obniżona [Spits i wsp., J. Immunol. 141:29 (1988)]. Jednak, jeśli PBMC zostaną
przez 3 dni poddane wstępnej inkubacji w środowisku zawierającym IL-2, a dopiero
następnie poddane działaniu IL-4, obserwuje się wzrost ich aktywności cytolitycznej [Spits
i wsp., J. Immunol. 141:29 (1988)]. Co więcej, wywierana przez IL-4 blokada zależnej od
IL-2 cytotoksyczności może zostać osłabiona poprzez włączenie do wstępnej mieszaniny
inkubacyjnej interferonu alfa (alpha-interferon [α-IFN]) lub czynnika martwicy nowotworów
alfa (Tumor Necrosis Factor-alpha [TNF-a]) [Swisher i wsp., Cell. Immunol. 128:450
(1990)].
Kedar i wsp., [Cancer Immunol. Immunother. 35:63 (1992)] wykazali ostatnio na
modelu mysim, że sekwencyjne podawania IL-2 i α-IFN jest efektywnym sposobem immunoterapii mięsaka linii MCA-105 i raka M-109. Pierwotnym spostrzeżeniem wynikającym
z tej pracy była obserwacja, że jak się wydaje skuteczność sekwencyjnego podawania
każdej z cytolin jest większa niż łączne podawanie ich obu.
Immunoterapię adoptywną jako łatwą do zastosowania i skuteczną metodę leczenia
różnych chorób, zwłaszcza jednak choroby nowotworowej u ludzi, opisano w patencie
nr 4 690 915 (U.S. Patent No. 4 690 915) wydanym Rosenbergowi. Jednak, jak wspomniano o
tym już powyżej, istnieje konieczność wprowadzenia takich modyfikacji omawianej, opartej na
zasadzie immunoterapii adoptywnej techniki leczenia, które byłyby znacznie mniej toksyczne
niż metody wykorzystujące wyłącznie UL-2. Istnieje także konieczność wyboru takiego
175 343
5
sposobu terapii, który byłby skuteczny przy niskich wartościach stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych.
Obecny wynalazek spełnia to zapotrzebowanie poprzez dostarczenie sposobu
wzmocnienia aktywności cytolitycznej PBMC, w szczególności kom órek L A K i NK,
w którym wykorzystuje się jedynie IL-10 lub IL-10 w skojarzeniu z IL-2 i/lub α-IFN.
Sposób według wynalazku polega na tym, że jednojądrzaste komórki krwi obwodowej
inkubuje się w obecności samej interleukiny-10 lub interleukiny- 1 0 w kombinacji z intrleukiną - 2 i/lub interferonem-α.
Wynalazek dotyczy też kompozycji farmaceutycznej do pozaustrojowego wytwarzania
aktywowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, która zawiera interleukinę - 1 0
ewentualnie w skojarzeniu z IL-2 i/lub α-IFN wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym
nośnikiem.
Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej do leczenia nowotworów,
która zawiera aktywowane interleukiną-10 (IL-10) jednojądrzaste komórki krwi obwodowej i
farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Korzystnie IL-10, IL-2 i α-IFN stosowane w sposobie i kompozycjach według wynar
lazku są ludzkiego pochodzenia, jednak najkorzystniej IL-10, IL-2 oraz α-IFN są ludzkimi
rekombinowanymi cytokinami.
Obecny wynalazek stanowi ulepszenie znanych metod, w których w celu indukcji
aktywności cytolitycznej komórek LA K oraz NK stosowano IL-2. Dzięki obecnemu wynalazkowi możliwe jest znaczne zmniejszenie toksyczności towarzyszącej zastosowaniu IL-2,
uzyskiwane przez całkowite jej wyeliminowanie lub znaczące zmniejszenie jej ilości.
Jeżeli nie stwierdzono inaczej, różne stosowane w niniejszym opisie terminy mają
takie same znaczenia jak znane w danej dzidzinie wiedzy. Stosowane tu pojęcie "adoptywna
immunoterapia" oznacza taki rodzaj postępowania, który polega na wprowadzeniu aktywowanych, funkcjonalnych komórek immunolokompetentnych do organizmu pacjenta.
Korzystnie komórkami tymi są komórki L A K oraz NK pochodzące z organizmu tego
chorego, który zostaje w danym momencie poddany leczeniu.
Określenie "regresja" w niniejszym opisie oznacza możliwe do zmierzenia znanym i
sposobami zmniejszenie wielkości guza lub guzów nowotowrowych.
Pojęciem "interleukina-10" lub "IL-10" określa się w niniejszym wynalazku białko,
które odznacza się następującymi cechami: (a) posiada sekwencję aminokwasową dojrzałej IL-10 (to znaczy takiej, która utraciła początkowe aminokwasy tworzące, sekwecję
lidera, charakterystyczną dla niedojrzałej formy sekrecyjnej białka) ujawnioną w zgłoszeniu
patentowym USA nr 07/917,806 zgłoszonym 20 lipca 1992 r., które odpowiada opublikowanemu międzynarodowemu zgłoszeniu nr WO 91/00349 oraz (b) posiada aktywność
biologiczną tożsamą z naturalną IL-10. Dla potrzeb niniejszego wynalazku zarówno forma
glikozylowana IL-10 (np. Produkowana w komórkach eukariotycznych jakimi są np. komórki jajników chomika chińskiego - CHO) jak i jej postać nieglikozylowana (np. otrzymana
na drodze syntezy chemicznej lub produkowane w E. coli) są równoważne i mogą być
stosowane zamiennie. Dodatkowo, dla potrzeb wynalazku mogą być stosowane muteiny
oraz inne analogi IL-10, do których należy między innymi białko BCRF1 [Epstein Barr
Virus viral IL-10 - odpowiadające IL-10 wirusowe białko produkowane przez wirus Epstein-Barra],
posiadające biologiczną aktywność IL-10.
Interleukina-10 odpowiednia do stosowania w niniejszym wynalazku może pochodzić z kilku różnych źródeł. Dla przykładu może zostać wyizolowana z pożywki hodowlanej aktywowanych komórek posiadających zdolność jej sekrecji. Dodatkowo, zarówno
sama IL-10 jak i jej aktywne fragmenty mogą zostać zsyntetyzowane na drodze chemicznej
znanymi w technice metodami. Opis takich metod można znaleźć w publikacji Marrifielda, Scence 233:341 (1986) oraz w książce Athertona i wsp., zatytułowanej "Solid Phase
Peptide Synthesis: A Practical Approach", 1989,1.R.L. Press, Oksford.
Korzystnie białko lub polipeptyd otrzymuje się drogą rekombinacji genetycznej stosując izolowane kwasy nukleinowe kodujące polipeptyd będący EL-10. Ogólne metody
6
175 343
biologii molekularnej, zostały opisane między innymi w drugim wydaniu książki zatytułowanej "Molecular Cloning, a Laboratory M anual", wydanej w 1989 roku pod redakcją
Sambrooka i wsp. przez Cold Spring Harbor, Nowy Jork, a także w "Current Protocols in
Molecular Biology", wydanej przez Green/Woley, Nowy Jork pod redakcją Ausubel i wsp.
(wydanie z 1987 roku wraz z cyklicznymi uzupełnieniami). Odpowiednie sekwencje nukleotydowe można uzyskać stosując standardowe techniki z bibliotek genomowych lub
bibliotek komórkowego DNA (cDNA). Można także stosować metodę PCR (Polymerase
Chain Reaktion - łańcuchowa reakcjapolimerazy [PCR]). Dla zapoznania się z tymi technikami zobacz np. wydaną pod red. Innis i wsp. książkę "PCR Protocols: A Guide to Methods
and Applications", Academic Press, Nowy Jork, Nowy Jork USA, z 1990 r.
Biblioteki DNA tworzą kwasy nukleinowe ekstrahowane z odpowiednich komórek zobacz np. opublikowane międzynarodowe zgłoszenie nr WO 91/00349, w którym zawarto
opis wytwarzania IL-10 metodą rekombinacji. W różnych bazach danych grupujących
sekwenqe genów - np. GenBank oraz BMPL zawierające sekwencje kwasów nukleinowych i
PIR oraz Swiss-Prot z opisami sekwencji dla białek, świadectwo pochodzenia: Intelligenetics,
Mountain View, Kalifornia, USA lub Genetics Computer Group, Centrum Biotechnologii
Uniwersytetu w Wiskonsin, Madison, Wiskonsin, USA - można znaleźć użyteczne sekwencje
genowe.
Klony zawierające sekwencje kodujące ludzką UL-10 zostały zdeponowane w American Type Culture Collection (ATCC) w Rockville, Maryland, USA pod numerami dostępu (Accession Nos.) 68191 i 68192. Identyfikacja innych klonów przenoszących sekwencje
kodujące ludzką IL-10 może się odbywać z zastosowaniem techniki hybrydyzacji kwasów
nukleinowych lub poprzez immunologiczne wykrywanie kodowanego białka, jeśli używano
wektora ekspresyjnego. Szczególnie użyteczne są sondy oligonukleotydowe oparte na zdeponowanych sekwencjach ujawnionych w opublikowanym zgłoszeniu międzynarodowym
nr WO 91/00349. Sondy oligonukleotydowe można także wytwarzać z konserwatywnych
regionów pokrewnych genów różnych innych gatunków. Alternatywnie można wykorzystać zdegenerowane sondy oparte na sekwencjach aminokwasowych interleukiny-1 0 .
Uzyskanie transformowanych linii komórkowych tak prokariotycznych jak i pochodzących od ssaków, drożdży lub owadów, w których w wyniku ekspresji powstają duże
ilości pożądanego polipeptydu, jest możliwe przy zastosowaniu standardowych metod.
Przykładowo, szczepami E. coli użytecznymi zarówno dla uzyskania ekspresji jak i klonowania mogą być linie: W3110 (ATCC Bi, 27325), X1776 (ATCC No. 31244), X2282, RR1
(ATCC Mp/31343). Przykładowymi liniami hodowlanymi komórek pochodzących od ssaków mogą być natomiast: COS-7, mysie komórki L lub komórki CHP [patrz: Sambrook
(1989) oraz Ausubel i wsp., (1987 - uzupełnienia)].
Celem uzyskania ekspresji DNA kodującego EL-10 można stosować różne wektory
ekspresyjne. Dla uzyskania ekspresji rekombinowanego białka w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych można stosować konwencjonalne wektory. Korzystne wektory
pcD opisane przez Okayamę i wsp., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983); oraz Takebe i wsp., Mol.
Cell. Biol. 8:466 (1988). Inne wektory ekspresyjne oparte na wirusie ssaków SV-40 obejmują wektory opisane przez Kaufmana i wsp., Mol. Cell. Biol. 2:1304 (1982) i w patencie
USA nr 4,675,285. Wektory oparte na SV-40 są szczególnie przydatne dla małpiej linii
komórkowej COS-7 (ATCC nr CRL 1651), a także dla innych Unii z komórek ssaków,
takich jak mysiej linii komórek L. Zobacz także w: Pouwels i wsp., (1989 i uzupełnienia)
Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nowy Jork.
Interleukina - 1 0 może zostać wyprodukowana w postaci rozpuszczalnej, jak ma to
miejsce w przypadku sekrecyjnego produktu transformowanych lub transfekowanych komórek drożdży lub ssaków. Peptydy można następnie oczyścić znanymi standardowymi
metodami. Dla przykładu, etapy oczyszczania mogą obejmować wytrącanie siarczanem
amonu, jonowymienną chromatografię, sączenie molekularne, elektroforezę, chromatografię
powinowactwa itp., patrz Methods in Enzymology Purification Principles and Practices,
(Springer-Verlag, Nowy Jork, 1982).
175 343
7
Alternatywnie IL-10 można wytwarzać w formie nierozpuszczalnej w postaci agregatów
lub form inkluzywnych. IL-10 w takiej formie oczyszcza się dobrze znanymi metodami.
Przykładowo, metody oczyszczania obejmują wydzielanie form inkluzyjnych z rozerwanych
komórek gospodarza przez odwirowanie, a następnie ich rozpuszczenie w czynnikach
chaotropowych i redukujących przez o peptydy przybierają konformację biologicznie czynną.
Szczegółowy opis tej techniki znajduje się między innymi w: Winkler i wsp., Biochemistry,
25:4041 (1986); Winkler i wsp., Bio/Technology, 3:9923 (1985); Koths i wsp. i w patencie
USA nr 4,569,790.
Sekwencja nukleotydowa służąca do transfekcji komórek gospodarza może być
modyfikowana zgodnie ze standardowymi technikami po to, aby uzyskać IL-10 lub jej
fragmenty o różnych żądanych właściwościach. Modyfikowane cząsteczki IL-10 mogą się
różnić od endogennego białka strukturą pierwszorzędową, np. poprzez insercje, substytucje,
delecje, lub fuzje aminokwasów. Modyfikacje takie można przeprowadzać w przeróżnych
kombinacjach tak, aby stworzyć ostateczne modyfikowane łańcuchy białka.
Te warianty sekwencji aminokwasowej białka można wytwarzać w różnych celach:
zarówno w celu wydłużenia okresu półtrwania w surowicy, jak i ułatwienia oczyszczania
lub preparatyki, poprawy skuteczności terapeutycznej lub zmniejszenia nasilenia lub ilości
występujących w czasie terapii działań niepożądanych. Zazwyczaj warianty sekwencji aminokwasowej są określonymi wcześniej polipeptydami niespotykanymi w naturze, jednak
mogą być nimi także warianty potranslacyjne jak np. cząsteczki glikozylowane lub białka,
które zostały skoniugowane z glikolem polietylenowym (PEG), itp. Warianty te mogą być
stosowane w niniejszym wynalazku tak długo, jak długo zachowuje biologiczną aktywność
IL-10,
Stosując różnorodne metody, np. technikę ukierunkowanej mutagenezy [Gillman i wsp.,
Gene 8:81 (1987)], można łatwo uzyskać modyfikacje sekwencji kodujących polipeptydy.
Większość z tych modyfikacji można kontrolować stosując rutynowo używane testy przesiewowe.
Dla przykładu, w opublikowanym zgłoszeniu międzynarodowym nr Wo. 91/00349 można
znaleźć opisy kilku testów in vitro odpowiednich do oceny aktywności IL-10.
Korzystnie do leczenia ludzi stosuje się ludzką IL-10 jednak ewentualnie można też
zastosować IL-10 pochodzenia wirusowego lub pochodzącą z komórek innych gatunków
ssaków. Najbardziej korzystnie jako IL-10 stosuje się ludzką rekombinowaną IL-10.
Wytworzenie ludzkiej i mysiej IL-10 opisano w opublikowanym zgłoszeniu międzynarodowym nr Wo 91/00349. Klonowanie i ekspresja wirusowej IL-10 (w postaci białka BCRF1)
uzyskiwanej z wirusa Epsteina-Barra zostały omówione w pracy Moora i wsp., Science
248:1230 (1990). Ludzka rekombinowana IL-10 jest także dostępna w handlu z firmy
PreproTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawierająca komórki jednojądrzaste
krwi obwodowej (PBMC) aktywowane sposobem według wynalazku odpowiednia jest do
leczenia pacjentów z chorobą nowotworową, którzy powinni odnieść korzyść ze stymulacji
cytolitycznej aktywności PBMC, w szczególności aktywacji komórek LA K i NK. Przykłady
nowotworów poddających się takiemu leczeniu można znaleźć w patencie wydanym Rosenbergowi oraz jego pracach opublikowanych w piśmie "Scientific American", cytowanych powyżej.
Opisane standardowe metody i techniki wytwarzania IL-10 dla potrzeb niniejszego
wynalazku mogą zostać z powodzeniem wykorzystane do produkcji IL-2 i α-IFN. IL-2 i
α-IFN stosowane w niniejszym wynalazku są także dostępne w handlu (np. IL-2 z
firmy Cetus Corporation, Emeryville, Kalifornia, USA; natomiast α-IFN - z firmy Schering
Corp., Kenilworth, NJ, USA).
Sposób pozaustrojowej aktywacji PBMC (korzystnie, jeśli te komórki zostaną pobrane w
standardowy sposób od chorego, który zostanie następnie poddany takiej terapii) oraz
metoda wprowadzania ich do organizmu zgodne są zasadniczo z opisem Resenberga
cytowanym powyżej, natomiast jedyny wyjątek stanowi łączne podawanie interleukiny- 1 0
ze zmniejszonymi dawkami IL-2 i/lub α-IFN, tak jak to opisano w obecnym wynalazku.
8
175 343
Liczba aktywowanych PBMC przetaczanych następnie pacjentowi powinna być w zakresie
od około 106 do około 1012. Zaleca się, jednak nie jest to obligatoryjne, aby przetaczać tak
aktywowane komórki wraz z IL-10, którą podaje się równocześnie z PBMC, albo bezpośrednio po ich przetoczeniu.
W jednej z postaci wykonania wynalazku, PBMC aktywuje się poprzez ich wstępną inkubację z IL-10 [np. poprzez trzydniową inkubację w 37°C w obecności 4 ng/ml
(100 jednostek/ml) lub 40 ng/ml ludzkiej IL-10]. Następnie, komórki te przemywa się, aby usunąć
nadmiar wolnej IL-10 i dodaje się IL-2 o niskim stężeniu (typowo około 2 jednostek/ml).
Podanie aktywowanych przez IL-10 komórek posiadających właściwości cytolityczne
samych lub w skojarzeniu z innymi cytokinami w korzystny dla chorego sposób powinno
nastąpić poprzez wlew dożylny. Można tego dokonać wykorzystując cewnik umieszczony
w żyle głównej lub w jednej z większych żył obwodowych lub poprzez przezskómie wprowadzoną do tętnicy wątrobowej kaniulę.
Interleukinę - 1 0 podaje się w postaci kompozycji farmaceutycznej zawierającej farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz skuteczną ilość IL-10 samej lub w kombinacji z
IL-2 i/lub α-IFN. Nośnikiem farmaceutycznym może być każda nietoksyczna, kompatybilna z
aktywnym składnikiem mieszaniny substancja, odpowiednia dla dostarczenia pacjentowi
związku czynnego. Postaci użytkowe przydatne do pozajelitowego podawania takich leków są
dobrze znane i zostały np. opisane w 15 wydaniu książki pt. "Remington’s Pharmaceutical
Science" (Mack Publishing Company, Easton, Filadelfia, USA, 1980 r.). Alternatywnie,
kompozycje według wynalazku można wprowadzić do ustroju pacjenta poprzez implantację
lub podanie w drodze iniekcji systemu przenoszenia leku tak, jak to przykładowo podano:
w Urquhart i wsp., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199 (1984); Lewis (redaktor),
Controlled Release o f Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, Nowy Jork, USA, 1981);
patencie USA nr 3,270,960 itp.
Cytokiny można podawać każdym ze znanych sposobów, w tym przez podawanie
dożylne, dootrzewnowe lub podskórne. Korzystne jest podawanie dożylne.
W celu pozajelitowego wprowadzenia kompozycji farmaceutycznej przygotowuje się
ją w postaci jednostkowej dawki do iniekcji (roztworu, zawiesiny, emulsji) wraz z nośnikiem
farmaceutycznym. Przykładowymi nośnikami mogą być: fizjologiczny roztwór soli, płyn
Ringera, roztwory dekstrozy, roztwór Hanka. Można także stosować niewodne nośniki
takie jak oleje lub oleinian etylu. Korzystnym nośnikiem jest 5% roztwór dekstrozy w
fizjologicznej soli. Nośnik może także zawierać niewielkie ilości dodatków takich jak
substancje zapewniające izotoniczność roztworu lub jego chemiczną stabilność, np. bufory
i środki konserwujące.
IL-10 korzystnie formułuje się w postaci oczyszczonej, zasadniczo wolnej od agregatów i
innych białek, utrzymując stężenie w zakresie około 5 do 20 μg/ml.
Kompozycja według wynalazku może być również dostarczona z zastosowaniem
technik terapii genowej, obejmujących między innymi bezpośrednią iniekcję DNA do
tkanek, zastosowanie rekombinowanych wektorów wirusowych lub implantację transfekowanych komórek. Opisy takich metod można znaleźć np. u Rosenberga, J. Clin. Oncol.
10:180 (1992).z
Skojarzone z IL-10 wprowadzanie jednej lub więcej substancji leczniczych może być
jednoczasowe (jednoczesne z podaniem IL-10) lub sekwencyjne. Korzystnie IL-10 podaje
się przed wprowadzeniem IL-2. Podanie α-IFN może nastąpić w tym samym czasie co
podanie IL-10 i/lub IL-2 lub może on zostać zastosowany w innym czasie (sekwencyjnie).
Wszystkie z podawanych substancji leczniczych powinny występować w organizmie pacjenta w
stężeniach zapewniających skuteczność terapeutyczną mierzoną stopniem regresji guza.
Stosowany w niniejszym opisie termin "skuteczna ilość" oznacza taką ilość IL-10 jaka
z jednej strony zapobiega lub powoduje przynajmniej zmniejszenie działań ubocznych
występujących w immunoterapii adoptywnej, a z drugiej strony zapewnia stymulację cytolitycznej aktywności komórek LAK i NK. Skuteczna ilość cytokiny (cytokin) niezbędna dla
konkretnego pacjenta może być różna, a zależy od takich czynnikówjak stopień zaawansowania
175 343
9
i rodzaj nowotworu jaki podany zostanie leczeniu, ogólnego stanu zdrowia chorego, sposobu
podawania leku, nasilenia objawów niepożądanych, ilości i rodzaju innych, jednoczasowo
stosowanych terapeutyków itp.
Ilość cytokiny "wystarczająca dla wzmocnienia aktywacji komórek LAK" oznacza
ilość cytokiny, ocenianą w doświadczalnym modelu cytolizy opartym na komórkach Daudi,
jaka jest niezbędna aby spowodować co najmniej około 25% wzrost aktywności cytolitycznej,
jaką jest w stanie wyindukować wyłączne podanie IL-10. Korzystny byłby wzrost co najmniej około 50% a najkorzystniejszy co najmniej około 100%.
Korzystnie, IL-10 podaje się w maksymalnej dobrze tolerowanej dawce, a jej zakres
obejmuje ilości leku od 10jedn./kg masy dała na dobę do około 1 0 8jedn./kg masy dała na dobę.
Podobnie, IL-2 oraz α-IFN powinny również być stosowane w maksymalnych dawkach
dobrze przez chorych tolerowanych (np. dawki IL-2 wynoszą 105 jedn./kg masy ciała
podawanych dożylnie co 8 godzin w 50 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej z 5% albuminy
jako nośnika; dla α-IFN wynoszą odpowiednio 106 jedn./kg masy dała podawanych dożylnie
co 8 godzin w 0,9% roztworze soli filologicznej z 5% albuminy jako nośnika). Jak to
wcześniej podano, dawki muszą być dobierane indywidualnie przez prowadzącego pacjenta
lekarza i muszą mieścić się w zakresie tolerancji chorego.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być zastosowana także w
połączeniu z tradycyjnymi metodami terapii nowotworów, takimi jak radioterapia lub
chemioterapia, na którą składają się rutynowo podawane leki cytostatycznej jak np. alkaloidy Vinca, związki platyny i 5-fluorouracyl.
Poddanie ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej działaniu wyłącznie
IL-10 lub IL-10 w skojarzeniu z innymi cytokinami zapewnia wzrost ich aktywności cytolitycznej skierowanej przeciwko determinantom ludzkich nowotworów. Ponieważ skuteczność immunoterapii w znacznym stopniu zależy od masy guza, opisany tu sposób leczenia
wykorzystujący komórki aktywowane sposobem według wynalazku będzie szczególnie
skuteczny wtedy, gdy wcześniej usunie się podstawową masę guza. Odczyn zapalny jaki
typowo towarzyszy postępowaniu chirurgicznemu może w korzystny sposób wpływać na
wyniki leczenia uzyskiwane z zastosowaniem tych metod.
P r z y k ł a d I. Następujący przykład podano w celu zilustrowania wynalazku, nie
ograniczając jego zakresu.
Wpływ I L-10 na aktywność cytolityczną
ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
Badano zdolność IL-10 do indukowania aktywności cytolitycznej ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej in vitro. Wyniki badania można przedstawić następująco:
1. IL-10 pobudza obecne wśród ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
aktywowane limfokinami komórki LAK i NK. Aktywność cytolityczną pobudzona
działaniem IL-10 może zostać zneutralizowane podaniem szczurzych monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko IL-10.
2. IL-10 uzyskane z ekspresji w CHO ja k i E. coli wykazują podobną, zależną od dawki
zdolność stymulowania komórek LAK oraz NK i ze względu na to można je uznawać
za biologicznie ekwiwalentne.
3. Aktywność komórek LAK uzyskana po inkubacji PBMC z zastosowanymi łącznie
IL-10 i w małej dawce IL-2 jest większa niż ta, jaką obserwuje się po stymulacji każdą
z tych cytokin osobno.
4. Komórki PBMC poddane najpierw wstępnej, dwudniowej stymulacji IL-10, wykazują
większą aktywność cytolityczną po dodaniu następnie IL-2.
5. IL-10 wywiera antagonistyczne działanie wobec IL-4, która hamuje stymulowaną
IL-2 aktywność komórek LAK.
6 . Skojarzone podawanie IL-10 oraz IL-2 powoduje zwiększenie aktywności cytolitycznej
komórek LAK przy niskim stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych.
10
175 343
W dodatku do efektu jaki IL-10 wywiera wobec PBMC zaobserwowano, że komórki
śródbłonka hodowane w obecności IL-10 wykazują niezaburzoną zdolność do odpowiedzi na
egzogenne czynniki (tzn. na γ-IFN lub α-TNF), podczas gdy te same komórki inkubowane
w obecności IL-2 pozostawały niezdolne do odpowiedzi ze względu na toksyczne zmiany
jakie w nich zachodziły pod wpływem IL-2.
Materiały i metody
Ludzkie rekombinowane cytokiny i przeciwciała przeciwko IL-10
Ludzką rekombinowaną IL-10 (zarówno produkowaną przez E. coli jak i komórki
CHO) uzyskiwano stosując standardowe metody. Specyficzna aktywność otrzymywanej
tak IL-10, po oczyszczeniu jej przy pomocy standardowych technik, wynosiła odpowiednio:
dla produkowanej przez komórki E. coli - 4,1 x 107 i przez komórki CHO - 2,1 x 107
jednostek/mg. Aktywność tę oceniano stosując test proliferancji komórek linii MC-9
[Thompson-Snipes i wsp., J. Exp. Med. 173:507 (1991)].
W ten sposób oceniono, że około 4 ng całkowicie homogennej EL-10 ma aktywność
biologiczną równą około 1 0 0 jednostkom.
Szczurze przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko ludzkiej IL-10 określane
symbolem 19F1 otrzymano od Dr John Abrams z DNAX Institute of Molecular Biology,
Pało Alto, Kalifornia, USA.
Izolacja ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC)
Krew obwodową uzyskiwano nakłuwając żyłę zdrowych dorosłych dawców. Jako antykoagulantów używano heparyny lub EDTA. PBMC oddzielono stosując dwustopniową technikę.
W pierwszym etapie komórki krwi ulegały sedymentacji w dekstranie, a następnie wirowano je na Ficollu Paque® z prędkością 1250 obrotów na minutę przez 30 minut. Warstwę
interfazy zawierającą głównie limfocyty i monocyty zebrano i przepłukano co najmniej
dwa razy RPMI zawierającą 10% płodową surowicę cielęcą (kompletna pożywka - JRH
Bioscience).
Test cyto toksyczności
Komórki docelowe, Daudi (wrażliwe na LAK) oraz K562 (wrażliwe na NK) otrzymano z American Type Tissue Collection, gdzie są zdeponowane pod numerami odpowiednio: CCL 213 i CCL 243. Komórki linii Daudi i K562 oznakowano radioaktywnym
chromem (5 1 Cr) zgodnie z metodą opisaną przez Spitsa i wsp. [J. Immunol. 141:29 (1989)].
Po okresie hodowli, PBMC zbierano, następnie dwukrotnie płukano i używano jako komórek efektorowych badając uwalnianie 51Cr (zgodnie z powyższym opisem Spitsa i wsp.).
W płytkach hodowlanych zawierających 96 dołków o dnie w kształcie litery V i pojemności
100 μ l mieszano 5 x 103 znakowanych 51Cr komórek docelowych z różną ilością komórek
fektorowych (E/T=20:1; 5:1 i 2:1). Płytki te wirowano przez 5 minut z prędkością 1000
obrotów na minutę, przy czym inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37°C w
wilgotnej atmosferze wzbogaconej 5% CO 2 . Po 4 godzinach płytki ponownie wirowano
przez 5 minut przy 500 x g. Przy zastosowaniu zbieracza SKATRON® (Skatron Instruments)
odciągano następnie supernatanty znad hodowli i liczono je w liczniku-gamma (firmy
LKB-Pharmacia). Całkowitą zdolność lityczną oceniano poprzez inkubację komórek docelowych znakowanych 51Cr z 1% SDS. Otrzymane wyniki prezentowane są jako średnia z
trzech kolejnych pomiarów.
Odsetek komórek ulegających rozpadowi (lizie) obliczano w następujący sposób.
cpm uzyskana w eksperymencie - cpm spontaniczna
% rozpadu = --------------------------------------------------------------------- x 100
cpm przy całkowitym rozpadzie - cpm spontaniczna
przy czym cpm oznacza liczbę impulsów na minutę.
175 343
11
Inkubacja ludzkich PBMC z cytokinami
a. Inkubacja wyłącznie z IL-10
Izolowane zgodnie z powyższym sposobem PBMC utrzymywano w pożywce RPMI-1640
wzbogaconej 10% cielęcą surowicą płodową w stężeniu 1 x 106 komórek/ml z IL-10 lub
ludzką IL-10 (produkowaną przez komórki CHO) przez 3 dni w 37°C (jeśli nie określono
inaczej). Aktywność cytotolityczną oceniano w podany powyżej sposób.
b. Jednoczasowa inkubacja z EL-10 i IL-2
PBMC inkubowano przez 3 dni w 37°C z 4 ng/ml IL-10 bez dodatku lub wraz z
dodatkiem ludzkiej IL-2 (Genzyme) (2 lub 20 jedn./ml).
c. Sekwencyjna inkubacja i IL-10 i EL-2
PBMC inkubowano z 4 ng/ml IL-10 przez 2 dni w kompletnej pożywce. Następnie
do hodowli dodawano ludzką IL-2 do końcowego stężenia 2 lub 20 jedn./ml. Po całonocnej
inkubacji oceniano cytolityczną aktywność komórek LAK i NK.
Wpływ przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko IL-10
na aktywację komórek LAK i NK zależną od IL-10
PBMC inkubowano z 40ng/ml IL-10 przez 3 dni w obecności 2 μ g/ml przeciwciał
monoklonalnych (19F1) skierowanych przeciwko IL-10 lub w obecności przeciwciał izotypowych stosowanych jako kontrola (szczurze przeciwciała klasy IgG2a).
Wpływ IL-10 na aktywność cytolityczną komórek LAK i NK
obecnych w puli ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
Aktywność cytolityczną komórek LAK można odróżnić od aktywności cytolitycznej
Komórek NK stosując różne układy nowotworowych komórek docelowych. Komórki linii
hodowlanej Daudi, ustalonej z komórek ludzkiego chłoniaka złośliwego typu Burkitta, są
już tradycyjnie celem ataku komórek LAK i ulegają wskutek ich działania cytolizie. Komórek linii hodowlanej K562, ustalonej z komórek ludzkiej białaczki układu czerwonokrwinkowego ( erytroleukemii), używa się jako celu dla komórek NK, pod wpływem których
komórki te ulegają cytolizie. W prowadzonych doświadczeniach ludzkie PBMC hodowano
przez 3 dni z różnymi stężeniami EL-10. Aktywność cytolityczną była oceniana w standardowym teście na uwalnianie 51Cr opisanym powyżej. Wyniki uzyskane w odniesieniu do
komórek LAK przedstawiono w tabeli 1. Wartość błędu standardowego umieszczono
poniżej wartości średnich.
12
175 343
Tabela 1
Stymulacyjne działanie IL-10 wobec aktywowanych limfokinami PBMC
(wyrażone w %komórek ulegających liziea)
Stężenie IL-10 (ng/ml)b
a
Dawca
0
0,04
0,4
4
40
100
1
0
4,25
18,3
44
26,2
67,5
2
0
5,5
7,2
10
31,5
27,6
3
18
17,7
29,2
39,1
29,7
55,1
4
0
8,8
10,2
22,2
35,8
35,9
5
4,6
8,1
15,6
20,6
20,1
12,1
6
14,6
19,7
40,7
54,4
42,9
43,4
Średnia:
6,2
10,6
20,2C
31,7c
31,0C
40,2C
±33
±2,6
±5,1
±6,8
±3,2
±8,0
51
-a % poddanych lizie, znakowanych Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu,
przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
k - Przed oceną aktywności cytolitycznej ludzkie PBMC uzyskane od zdrowych dawców poddano przez 3 dni działaniu IL-10.
c - Istotna różnica między próbą traktowaną IL-10 i kontrolną p ≤ 0.05 określona w teście t-Studenta
Wyniki przedstawione w tabeli 1 potwierdzają działanie IL-10 stymulujące aktywność
komórek LAK w PBMC od wszystkich 6 dawców. Jakkolwiek istniały oczywiste różnice
pomiędzy dawcami, to jednak udowodniono, że IL-10 powoduje zależny od stężenia
wzrost zdolności cytolitycznej komórek uzyskanych od wszystkich sześciu dawców.
Znaczącą statystycznie aktywność (p =≤ 0.05) uzyskano przy stężeniach EL-100,4 ng/ml i
większych.
Wykazano także (wyników nie prezentujemy obecnie), że pobrane od dawcy komórki PBMC posiadające podstawową aktywność cytolityczną (tzn. niestymulowaną cytokinami) o wartości 5% lub mniejszą najbardziej reagowały na IL-10 przy wszystkich badanych
stosunkach komórek efektorowych do docelowych.
Podobne wyniki uzyskano stosując w modelu badawczym inne nowotworowe komórki docelowe, w tym: ludzkie komórki gruczolakoraka nerki, dwie różne linie hodowlane
ustalone z ludzkich komórek czerniaka, a także linię ustaloną z ludzkich komórek raka
jelita grubego. Ludzkie komórki gruczolakoraka nerki i czerniaka stosowane były także
przez Rosenberga, który in vivo poddawał adoptywnej immunoterapii z zastosowaniem
IL-2 chorych, u których te nowotwory wystąpiły. We wszystkich przypadkach wykazano
zależność pomiędzy stężeniem EL-10 a odsetkiem komórek docelowych ulegających cytolizie.
W dalszych doświadczeniach wykazano, że IL-10 stosowana w monoterapii lub podawana w skojarzeniu z IL-2 posiada właściwość zwiększania aktywności cytolitycznej
skierowanej przeciwko komórkom U937 (ludzki mięsak histiocytamy), SW620 (ludzki rak
jelita grubego) oraz SKBR3 (ludzki rak sutka). W doświadczeniach, w których jako komórek
docelowych użyto komórek ludzkiego czerniaka HS294T, przy badanych stężeniach IL-10,
nie udało się wykazać wywoływania przez nią odpowiedzi.
Podstawowa aktywność cytolityczną komórek NK (np. zdolność do lizy komórek
docelowych K562 w nieobecności cytokin) była większa niż podstawowa aktywność komórek
LAK. Aktywność komórek NK można było dalej zwiększyć za pomocą cytokin takich jak
IL-2 [Perusia, cytowany powyżej·, Phillips i Lanier, J. Exp. Med. 164:814 (1986).
Działanie LL-10 na aktywność NK oceniano równolegle do badań nad komórkami LAK, w
doświadczeniach prowadzonych z PBMC uzyskanymi do tych samych, co opisano powyżej, 6 dawców.
Wyniki doświadczeń z komórkami NK przedstawiono w tabeli 2. Wartość błędu
ardowego umieszczono poniżej wartości średnich.
stand-
Tabela 2
Wywierana przez IL-10 stymulacja aktywności komórek NK obecnych w puli PBMC
(wyrażona w % komórek ulegających liziea)
Stężenie IL-10 (ng/ml)b
0
0,04
0,4
4
40
100
1
22,4
30,6
25,2
57,2
51,5
49,7
2
20,4
24,7
31,3
56,7
65,6
71,5
3
61,4
55,6
37,9
81,1
80,0
81,5
4
13,8
25,2
23,2
37,5
52,2
54,2
5
13,0
19,9
20,2
25,1
23,5
20,3
6
15,9
253
45,4
66,6
43,7
56,1
Średnia:
24,4
30,2
30,5
52,5c
55,5C
±7,5
±5,2
±3,9
±7,8
±8,5
O
O
a
Dawca
±8,2
51
- % poddanych lizie, znakowanych Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu,
przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
b - Przed oceną aktywności cytolitycznej ludzkie PBMC uzyskane od zdrowych dawców poddano działaniu CL-10 przez 3 dni.
c - Znacząca różnica między próbą traktowaną EL-10 i kontrolną p
≤ 0.05 określona w teście t-Studenta
Wyniki przedstawione w tabeli 2 potwierdzają, że IL-10 indukuje znaczny, zależny
od stężenia wzrost cytotoksyczności komórek NK obecnych w puli PBMC uzyskanych od
dawców. Statystycznie znaczący wzrost aktywności cytolitycznej uzyskano przy stężeniach
IL-10 4 ng/ml i większych. Tak jak w doświadczeniach z zastosowaniem komórek LAK,
wpływ IL-10 na aktywność komórek NK był różny u różnych dawców.
Porównanie oddziaływania EL-2 i EL-10 na komórki endotelialne
Wykonywano także doświadczenia mające na celu ocenę żywotności jednowarstwowej
hodowli komórek endotelialnych po zastosowaniu IL-10. Komórki te, hodowane w
obecności IL-10, wykazywały niezaburzoną zdolność do odpowiedzi na egzogenne cytokiny
(γ-IFN i TNF-ćz), podczas gdy prowadzone równolegle hodowle, podane działaniu równoważnych dawek IL-2 w tym samym czasie inkubacji utraciły zdolność do odpowiedzi na
bodźce pochodzące od egzogennych cytokin ze względu na toksyczność wywieraną przez EL-2.
Wpływ przeciwciał monoklonalnych anty-EL-10 na zależną od EL-10
aktywację komórek LAK i NK
Jak to odpowiednio dla każdej z klasy komórek wykazano w tabelach 3 i 4, w których
przedstawionym średnim wartościom towarzyszą wartości błędu standardowego, zdolność
do pobudzania aktywności cytolitycznej komórek LAK i NK wywierana przez IL-10 podawaną w stężeniu 40 ng/ml została trzykrotnie zmniejszona (p ≤ 0.05) w obecności 2μ g/ml
przeciwciał monoklonalnych 19F1 skierowanych przeciwko IL-10. W przeciwieństwie do tego,
dodanie do hodowli 2 mg/ml kontrolnych szczurzych przeciwciał izotypowych klasy IgG2a
powodowało aktywację cytolityczną, która statystycznie nie różniła się od uzyskanej po
podaniu wyłącznie 40 ng/ml IL-10.
14
175343
Tabela 3
Hamowanie stymulowanej IL-10 aktywności cytolitycznej komórek LAK
za pomocą przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko IL-10
(wyrażone jak % komórek ulegających lizie a)
Warunki hodowlib
pożywka
IL-10
(40 ng/ml)
EL-10+19F1
IL-10+IgG2a
1
5,6
23,5
15,7
28,2
2
4,7
213
11,0
17,5
3
5,4
42,5
0,0
35,8
4
2,1
42,0
12,8
26,5
5
4,7
19,1
0,0
11,65
Średnia:
4,5 ±0,6
29,6±5,3
7,9C±3,3
23,9±4,3
Dawca
a - % poddanych lizie, znakowanych 51Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu,
przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
b - Ludzkie PBMC uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolitycznej przez 3 dni poddano działaniu
40 ng/ml EL-10 w obecności albo 2 mg/ml przeciwciał 19F1 (skierowanych przeciwko ludzkiej IL-10) albo szczurzych przeciwciał
klasy lgG2a (kontrola izotypowa).
c - Statystycznie istotna różnica pomiędzy podawaną jako jedyną IL-10 a IL-10 stosowaną wraz z przeciwciałami skierowanymi
przeciwko niej przy p≤ 0,05 określona za pomocą testu t-Studenta.
Tabela 4
Neutralizacja stymulowanej IL-10 aktywności cytolitycznej komórek NK
uzyskana przez podanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko IL-10
(wyrażona %komórek ulegających liziea)
Warunki inkubacjib
Dawca
czysta pożywka
IL-10 (40 ng/ml)
DL-10+19F1
IL-10+IgG2a
1
21,1
383
20,6
27,2
2
28,0
71,0
22,2
53,2
3
22,2
51,5
0,0
70,5
4
18,0
25,4
12,3
20,8
5
23,2
53,2
54,5
84,9
Średnia:
22,5±1,6
47,9±7,6
19,1c±6,6
513 ±12,7
a - % poddanych lizie, znakowanych 51Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu,
przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
- Ludzkie PBMC uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolitycznej przez 3 dni poddano działaniu 40 ng/ml
IL-10 w obecności albo 2 mg/ml przeciwciał 19F1 (skierowanych przeciwko ludzkiej IL-10) albo szczurzych przeciwciał klasy IgG2a
(kontrola izotypowa).
c - Statystycznie istotna różnica pomiędzy podawaną jako jedyną IL-10 a IL-10 stosowaną wraz z przeciwciałami skierowanymi
przeciwko niej przy p ≤ 0,05 określona za pomocą testu t-Studenta.
175 343
15
Stymulacja aktywności cytolitycznej wywoływana skojarzonym
z innymi cytokinami działaniem IL-10
a. Jednoczesna inkubacja z IL-10 i DL-2
Ludzkie PBMC były inkubowane z IL-2 podawaną w stężeniach submaksymalnych
(2 lub 20 jedn./ml) w obecności IL-10 przy stosunku komórek efektorowych do docelowych (E/T) 5:1.
Wyniki badania przedstawiono w tabeli 5, w której pod wartościami średnimi umieszczono wartości błędu standardowego.
Tabela 5
Indukowanie aktywowanej limfokinami cytolitycznej aktywności
jednojądrzastych komórek krwi obwodowej wywierana przez jednoczasową ich inkubację z IL-10 i IL-2
(wyrażone jako % komórek ulegających liziea)
Warunki inkubacjib
a
Dawca
czysta pożywka
IL-2
(2 jedn,)
IL-10
(4ng)
IL-10+IL-2
IL-2
(20 jedn,)
1
0,0
33
3,7
15,9
24,6
2
2,6
7,6
3,8
23,5
41,0
3
6,1
5,0
133
17,7
11,4
4
3,3
50,1
51,6
68,7
80,0
5
2,4
9,4
12,8
293
45,7
6
9,9
28,9
16,0
38,8
67,1
Średnia:
4,1
17,4
16,8
323
44,9c
±1,42
±7,6
±7,2
±7,2
±10,4
51
- % poddanych lizie, znakowanych 51Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu,
przy stosunku E/T 5:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
b - Ludzkie jednojądrzaste komórki kiwi obwodowej uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolitycznej
przez 3 dni poddano działaniu 4 ng/ml IL-10 i 2 jednostek/ml IL-2.
c - Nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy IL-10 i IL-2 w porównaniu z 20 jednymi IL-2 przy p
≤ 0,05 (ocena wg testu t-Studenta).
Jak wykazano to w tabeli 5, przy stosunku komórek efektorowych do docelowych 5:1
stwierdzono dodatkowy wzrost aktywności komórek LAK poddanych inkubacji z 2 jedn./ml
IL-2 i 4 ng/ml IL-10. Ta wyraźnie większa niż po inkubacji z każdą z cytokin osobno,
indukowana skojarzonym działaniem obu cytokin aktywność, osiąga nawet poziom aktywacji
uzyskiwany przy dziesięciokrotnie większym, stężeniu IL-2. Jak to oceniono w teście t-Studenta, wynik ten był statystycznie istotny przy wartości p ≤ 0,05.
b. Jednoczesna inkubacja z EL-10 i α-EFN
Inkubacja PBMC IL-10 i α-IFN łącznie powodowała podobny do opisanego addytywny wzrost aktywności cytolitycznej wobec komórek Daudi, jednak działanie to nie
obejmowało komórek NK.
Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w tabeli 6 , w której pod wartościami
średnich umieszczono wartości błędu standardowego.
175 343
16
Tabela 6
Indukowanie aktywności komórek LAK
pochodzących z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
przez jednoczasową ich inkubację z IL-10 i α-EFN
(wyrażone jako% komórek ulegających lizie a)
Warunki inkubacjib
Dawca
pożywka
α-IFN
IL-10
IL-10+α-IFN
1
4,4
7,9
17,8
35,7
2
1,0
11,7
15,4
32,0
3
1,6
12,3
5,5
26,4
Średnia:
2,3±1,0
10,6±1,4
12,6±3,8
31,4±2,7
a - % poddanych lizie, znakowanych 51Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu,
przy stosunku E-T 10:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
b - Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolitycznej
przez 3 dni poddano działaniu 4 ng/ml IL-10 i 100 jedn./ml α-IFN.
Jak to oceniono w teście t-Studenta, różnice pomiędzy aktywnością cytolityczną
komórek PBMC dawcy indukowaną przez IL-10 i α-IFN w porównaniu z aktywnością
cytolityczną jaką indukowała każda ze stosowanych osobno cytokin były statystycznie
istotne przy wartości p ≤ 0.05. Natomiast jednoczasowa inkubacja tych komórek z IL-10 i
skojarzonymi z nią innymi cytokinami, takimi jak IL-4, IL-5, GM-CSF lub y-IFN nie
powodowała większej aktywacji komórek PBMC, niż sama IL-10 (wyniki nie prezentowane).
Sekwencyjna inkubacja z IL-10 i IL-2
Stosując opisane powyżej metody, PBMC hodowano w pożywce bez dodatku żadnych cytokin lub w pożywce wzbogaconej IL-10.Po dwóch dniach do hodowli dodawano
IL-2 do końcowego stężenia 2 lub 20 jedn./ml. Po dodatkowej całonocnej inkubacji oceniano aktywność cytotoksyczną PBMC skierowaną przeciwko komórkom Daudi.
Wyniki doświadczenia prowadzonego na puli komórek uzyskanych od 5 dawców
przedstawiono w tabeli 7, w której pod wartościami średnich umieszczono wartości błędu
standardowego.
175 343
17
Tabela 7
Indukowanie aktywności komórek LAK
pochodzących z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
przez wstępną inkubację z IL-10 i następnie IL-2
(wyrażone jako % komórek ulegających liziea)
Warunki hodowli wstępnejb
Dawca
pożywka
IL-10C
IL-2d
IL-10+IL-2e
1
29,7
21,1
44,8
116,0
2
5,5
18,3
12,2
20,7
3
14,7
58,1
74,5
100,0
4
26,2
59,5
543
81,9
5
4,8
28,2
22,5
40,6
Średnia:
16,2±5,1
37,0±9,0
41,7±11,4
71,8 ±17,9
a - % poddanych lizie, znakowanych 51Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu,
przy stosunku E-T 5:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
- Ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej uzyskane od zdrowych dawców przed oceną ich aktywności cytolityczną
przez 2 dni poddano wstępnej inkubacji z 4 ng/ml IL-10, a następnie do pożywki dodano 2 jedn./ml IL-2. Aktywność cytolityczną
oceniano po dodatkowej inkubacji całonocnej.
c - Pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 3 dni z IL-10.
d - Przed dodaniem IL-2 pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 3 dni w czystej pożywce.
e - Przed dodaniem 20 jedn. IL-2 pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 2 dni w obecności IL-10.
Jak to wykazano w tabeli 7, w części doświadczenia, w której PBMC dawcy były
wstępnie inkubowane w obecności IL-10 przed dodaniem IL-2, uzyskano około dwukrotnie większą aktywność cytolityczną tych komórek (71,8± 17,9%), w porównaniu z aktywnością obserwowaną po wstępnej hodowli prowadzonej w pożywce przed dodaniem IL-2.
Obserwowana różnica w wynikach doświadczenia prowadzonego ze wstępną inkubacją z
IL-10 lub bez niej jest statystycznie istotna przy p ≤ 0.14, jak to oceniono w teście
t-Studenta.
Podane wyniki zwiększonej aktywności cytolitycznej uzyskano dla sekwencyjnej inkubacji z EL-10 i następnie inkubacji z α-IFN (wyniki obecnie nie prezentowane).
IL-10 a wywierana przez IL-4 blokada zależnej od I L-2 cytotoksyczności
Uzyskane od 6 ludzi PBMC hodowano w pożywce zawierającej albo wyłącznie 20
jedn./ml EL-2 albo łącznie wprowadzone: 20 jedn./ml IL-2 i 1000 jedn./ml IL-4 lub 20
jedn./ml EL-2,1000 jedn./ml EL-4 i 4 ng/ml IL-10.
Wyniki doświadczenia przedstawiono w tabeli 8 , w której pod wartościami średnich
umieszczono wartości błędu standardowego.
18
175 343
Tabela 8
Antagonistyczne działanie IL-10 wobec zależnej od IL-4 blokady indukowanej
przez EL-2 aktywności cytolitycznej jednojądrzastych komórek krwi obwodowej
(wyrażone odsetkiem komórek ulegających lizie a)
Dawca
pożywka
IL-2b
IL-2c+IL-4
IL-2d+IL-4-f-IL-10
1
12,7
27,6
35,0
45,7
2
5,4
263
17,5
33,7
3
1,7
25,1
14,1
36,0
4
3,8
29,6
14,1
22,1
5
33
47,1
17,1
63,8
6
6,6
49,5
20,6
40,8
Średnia:
5,5 ±1,6
34,2±4,5
19,7±3,2
40,3±5,7
a - % poddanych lizie, znakowanych 51Cr docelowych komórek Daudi badanych w standardowym teście na uwalnianie chromu,
przy stosunku E/T 20:1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech pomiarów.
15 - Ludzkie jednojądizaste komórki krwi obwodowej uzyskane od zdrowych dawców inkubowano przez 3 dni z 20 jedn./ml IL-2.
c - Pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 3 dni z 20 jedn./ml IL-2 i 100 jedn.-m l ludzkiej IL-4.
d - Pochodzące od dawcy PBMC inkubowano przez 3 dni z 20 jednymi IL-2,1000 jednymi ludzkiej IL-4 i 4 ng/ml IL-10.
Przedstawione w tabeli 8 wyniki wskazują, że po inkubacji z 20 jedn./ml samej tylko
IL-2 zdolność lityczna komórek LAK wynosi około 34,2%. Jeżeli od początku komórki te
inkubowano dodatkowo w obecności 1000 jedn./ml ludzkiej IL-4 obserwowano około
dwukrotne zmniejszenie ich zdolności cytolitycznej. Jednakże, jeżeli w czasie pierwszych
24 godzin inkubacji wprowadzono 4 ng/ml IL-10 nie obserwowano już supresyjnego oddziaływania IL-4.
Nie obserwowano statystycznie istotnej różnicy pomiędzy wynikami prób z zastosowaniem wyłącznie IL-2 i wszystkich trzech cytokin razem z p ≤ 0.05, jak to oceniono w
teście t-Studenta, co wskazuje na zdolność IL-10 do całkowitego zahamowania blokującego
aktywację komórek efektorowych działania IL-4.
Przykłady ilustrujące kompozycje farmaceutyczne
P r z y k ł a d II. Kompozycja do pozaustrojowego stymulowania aktywności cytolitycznej jednojądrzastych komórek krwi obwodowej ma postać roztworu i zawiera 4 ng/ml
ludzkiej IL-10 w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
P r z y k ł a d III. Kompozycja do pozaustrojowego stymulowania aktywności
cytolitycznej jednojądrzastych komórek kiwi obwodowej ma postać roztworu i zawiera 40 ng/ml
ludzkiej IL-10 w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
P r z y k ł a d IV. Kompozycja do pozaustrojowego stymulowania aktywności
cytolitycznej jednojądrzastych komórek krwi obwodowej ma postać roztworu i zawiera 4 ng/ml
ludzkiej IL-10 i 2 jednostki (lub 20) EL-2/ml w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
P r z y k ł a d V. Kompozycja do leczenia raka zawiera jednojądrzaste komórki krwi
obwodowej uprzednio inkubowane in vitro z ludzką IL-10 przez 3 dni w 37°C, a następnie
po usunięciu wolnej IL-10 z niewielką ilością IL-2 (około 2 jednostek/ml). Kompozycja
zawiera od około 106 do około 101 2 komórek zawieszonych w roztworze Hank’a. Kompozycja nadaje się do podawania pozajelitowego, korzystnie przez cewnik założony do żyły
centralnej.
Dla specjalisty w tej dziedzinie wiedzy oczywiste jest, iż do metodologii stosowanej w
obecnym wynalazku można wprowadzić wiele zmian wariantowych i modyfikacji, co jednak
175 343
19
nie zmienia w niczym jego istoty i znaczenia. Opisane tu konkretne wykonania wynalazku
zostały przedstawione jedynie przykładowo a wynalazek jest jedynie ograniczony załączonymi
zastrzeżeniami.
175 343
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 4,00 zł