Typowanie szczepów Pseudomonas aeruginosa opornych na

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 211 - 219
Tomasz Bogiel, Eugenia Gospodarek
1
Typowanie szczepów Pseudomonas aeruginosa opornych na karbapenemy
techniką PCR-RAPD
Katedra i Zakład Mikrobiologii
Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy
Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK
W związku ze znacznym wzrostem w 2007 roku liczby izolacji szczepów
Pseudomonas aeruginosa opornych na karbapenemy, przeprowadzono genotypowanie techniką PCR-RAPD 16 wybranych izolatów z materiału od
chorych leczonych w Szpitalu Uniwersyteckim nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. W roku objętym badaniem od 78 chorych izolowano 125 szczepów
P. aeruginosa o fenotypie oporności na imipenem i meropenem. Wykazano,
że wszystkie badane szczepy były odmienne, dowodząc przydatności techniki
PCR-RAPD w typowaniu szczepów pałeczek ropy błękitnej.
Pałeczki P. aeruginosa należą do najczęstszych etiologicznych czynników zakażeń szpitalnych spośród pałeczek niefermentujących (8). Nabywanie przez nie oporności na antybiotyki/chemioterapeutyki, niewrażliwość na czynniki fizyko-chemiczne i zdolność przeżycia
w środowisku szpitala sprzyjają występowaniu zakażeń szpitalnych (8). Szczepy tego gatunku
oporne na karbapenemy (carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa, CRPA) stanowią
wyzwanie terapeutyczne, zarówno ze względu na ograniczoną liczbę opcji terapeutycznych,
trudności w eradykacji oraz rodzaj i lokalizację zakażeń powstających z ich udziałem (8).
Techniką uznawaną za „złoty standard” w typowaniu szczepów i często stosowaną do
takich aplikacji jest genotypowanie polegające na cięciu chromosomalnego DNA enzymami restrykcyjnymi i jego rozdziale z wykorzystaniem elektroforezy w zmiennym polu
elektrycznym (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) (13). Jest to jednak procedura
długotrwała i kosztowna, zwłaszcza w rutynowych badaniach. Alternatywą jest inna metoda
genotypowa oparta na losowej amplifikacji materiału genetycznego i polimorfizmie wielkości
powstających w jej wyniku produktów – PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction-Random
Amplified Polymorphic DNA) (18).
Celem pracy była ocena przydatności techniki PCR-RAPD do wewnątrzgatunkowego
typowania szczepów CRPA. W analizie uwzględniono 16 szczepów CRPA o podobnych
i/lub różnych wzorach lekowrażliwości na antybiotyki/chemioterapeutyki, wyosobnionych od
różnych chorych Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy w 2007 roku.
1
Praca została sfinansowana z Grantu UMK nr 30/2009
212
T. Bogiel, E. Gospodarek
Nr 3
MATERIAŁ I METODY
Przedmiotem badań było 16 szczepów P. aeruginosa niewykazujących stref zahamowania wzrostu wokół krążków z imipenemem (10 μg) i meropenemem (10 μg) (Becton
Dickinson) w metodzie krążkowo-dyfuzyjnej według Kirby-Bauer. Były to izolaty pochodzące od różnych pacjentów, o takich samych i/lub różnych wzorach lekowrażliwości.
Badane szczepy zostały wybrane spośród 125 CRPA, izolowanych w 2007 roku w Zakładzie
Mikrobiologii Klinicznej od 78 chorych Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza
Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy. Identyfikację gatunkową przeprowadzano na podstawie morfologii kolonii na podłożu Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi
baraniej (bioMérieux), podłożu MacConkey Agar (Becton Dickinson, bioMérieux), podłożu
z cetrymidem (Becton Dickinson), zdolności wytwarzania barwników oraz wyników reakcji
biochemicznych ujętych w testach ID 32 GN, ID 32 E lub API 20 NE (bioMérieux) wykonywanych zgodnie z zaleceniami producenta i odczytywanych w systemie komputerowym
ATB Expression V 2.8.8 (bioMérieux).
Lekowrażliwość szczepów P. aeruginosa oznaczano metodą krążkowo–dyfuzyjną
według Kirby–Bauer, zachowując warunki standaryzacji podane przez Krajowy Ośrodek
Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD) (12) oraz interpretacji według
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (5). Używano zawiesiny bakteryjnej
o gęstości 0,5 według skali MacFarlanda i podłoża Mueller-Hinton Agar (bioMérieux).
Krążki z antybiotykami (Becton Dickinson) dobierano zgodnie z zaleceniami KORLD. W
celu kontroli oznaczania lekowrażliwości stosowano szczepy wzorcowe z kolekcji ATCC:
Pseudomonas aeruginosa 27853 i Escherichia coli 25922. Płytki antybiogramowe inkubowano 16-18 godzin w temperaturze 35ºC w atmosferze tlenowej. Wyniki interpretowano
na podstawie wielkości średnic stref zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z antybiotykami stosując aktualne zalecenia CLSI.
Po wykonaniu identyfikacji i ocenie lekowrażliwości, szczepy przeznaczone do genotypowania przechowywano w temperaturze -80°C w podłożu BHI (Brain Heart Infusion,
Becton Dickinson) z dodatkiem glicerolu (POCh). Następnie, izolowano DNA bakteryjne
zgodnie z instrukcją producenta, wykorzystując zestaw Genomic Mini (A&A Biotechnology).
W technice PCR-RAPD zastosowano metodę opisaną przez Mahenthiralingam i wsp.
(18). Reakcję przeprowadzano w probówkach o objętości 200 μl (Eppendorf) w końcowej objętości 25 μl. Stosowano polimerazę Taq w ilości 1 U/reakcję w pięciokrotnie rozcieńczonym
buforze (Green GoTaq® Flexi Buffer), MgCl2 w stężeniu końcowym 3 mM (GoTaq® Flexi
DNA Polymerase, Promega) oraz zestaw dNTP w stężeniu 250 μM (dNTP Mix, Promega).
W dwóch oddzielnych reakcjach użyto w ilości 40 pmoli/reakcję dwóch dziesięcionukleotydowych starterów (Integrated DNA Technologies): 208 o sekwencji 5’– ACGGCCGACC
–3’ i temperaturze topnienia 45,5°C oraz 272 o sekwencji 5’– AGCGGGCCAA –3’ i temperaturze topnienia 43,7°C.
Następnie dodawano wyizolowanego DNA bakteryjnego w ilości 40 ng i do końcowej
objętości dopełniano wodą do aplikacji biologii molekularnej Molecular Biology Grade
Water (Eppendorf).
Wykorzystano termocykler GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems) oraz
następujące warunki reakcji:
1. pre-amplifikacja - 4 cykle, temperatura: 94°C – 5 minut, 36°C – 5 minut, 72°C – 5 minut,
Nr 3
Typowanie P. aeruginosa metodą PCR-RAPD
213
2. amplifikacja właściwa - 30 cykli, temperatura: 94°C – 1 minuta, 36°C – 1 minuta,
72°C – 2 minuty,
3. końcowy etap wydłużania, temperatura 72°C – 10 minut.
Produkt amplifikacji PCR-RAPD w ilości 6 μl rozdzielano elektroforetycznie w 2,5%
żelu agarozowym (Bio-Rad) w 1xTBE (Bio-Rad) pod napięciem 9 V/cm przez 3 godziny
w aparacie do elektroforezy SUB-CELL® GT (BioRad). Wykorzystano wzorzec wielkości
100-3 000 pz (SolisBiodyne). Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwiano przez 30 minut roztworem bromku etydyny, odbarwiano przez 40 minut wodą dejonizowaną. Odczytu
dokonywano w świetle UV i wynik zapisywano korzystając z systemu dokumentacji żeli
GEL DOC 2000 (BioRad) i programu Quantity One 4.1.1 (Bio-Rad).
WYNIKI
Liczba izolacji CRPA w ogólnej liczbie izolacji szczepów gatunku wzrosła z 92 w 2006
roku do 210 w 2007 roku. Wynika to głównie z ogólnie większej liczby izolacji szczepów
P. aeruginosa – 740 w 2006 roku, a 919 w 2007 roku. Zaobserwowano ponadto znaczący
wzrost odsetka izolacji CRPA – z 12,4% w 2006 roku do 22,9% w 2007 roku. Odnotowano
Klinika Anestezjologii i Intensyw nej
Terapii
6,3
6,3
Klinika Chirurgii Dziecięcej
25,0
Klinika Rehabilitacji
6,3
Klinika Nefrologii, Nadciśnienia
Tętniczego i Chorób Wew nętrznych
6,3
Klinika Chirurgii Ogólnej i
Endokrynologicznej
Klinika Transplantologii i Chirurgii
Ogólnej
12,5
18,8
Klinika Neurochirurgii i
Neurotraumatologii
Klinika Chirurgii Ogólnej i Naczyń
18,8
Ryc. 1. Pochodzenie badanych szczepów (n=16)
6,3%
Popłuczyny oskrzelow o-pęcherzykow e
6,3%
25,0%
6,3%
Mocz i mocz z cew nika
Wymaz z rany
Krew
12,5%
Wydzielina z dróg oddechow ych
18,8%
Ryc. 2. 25,0%
Wymaz z odbytu
Kał
Materiał kliniczny, z którego izolowano badane szczepy (n=16)
214
Nr 3
T. Bogiel, E. Gospodarek
również wzrost liczby i odsetka szczepów CRPA z 64 (8,6%) w 2006 roku do 125 (13,6%)
w 2007 roku, izolowanych odpowiednio od 53 w 2006 roku i 78 pacjentów w 2007 roku.
Pochodzenie badanych szczepów oraz rodzaj materiału klinicznego, z którego je wyosobniono zostały przedstawione, odpowiednio na rycinie 1 i 2.
Najwyższy odsetek badanych szczepów pochodził od chorych leczonych w Klinice
Anestezjologii i Intensywnej Terapii (25,0%). Były to najczęściej szczepy izolowane z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (25,0%), moczu (25,0%) i wymazów z ran (18,8%).
Wyniki oceny lekowrażliwości szczepów CRPA przedstawiono na rycinie 3.
Większość badanych szczepów była oporna na doripenem (81,3%) i piperacylinę
(75,0%). Najwyższy odsetek szczepów wrażliwych notowano wobec amikacyny (81,3%),
netilmycyny i norfloksacyny (po 75,0%). Wszystkie badane szczepy CRPA pozostawały
wrażliwe na kolistynę.
Karbenicylina
T ikarcylina
Piperacylina
Piperacylina/tazobaktam
Antybiotyk/chemioterapeutyk
T ikarcylina/kwas
klawulanowy
Cefotaksym
Ceftazydym
Cefepim
Aztreonam
Doripenem
Gentamicyna
T obramycyna
Amikacyna
Netilmycyna
Norfloksacyna
Ciprofloksacyna
0,0%
20,0%
Oporne
Ryc. 3.
40,0%
60,0%
Średniowrażliwe
Lekowrażliwość badanych szczepów (n=16)
80,0%
Wrażliwe
100,0%
Nr 3
Typowanie P. aeruginosa metodą PCR-RAPD
215
W wyniku rozdziału produktu amplifikacji DNA 16 szczepów uzyskano 14 różnych
wzorów prążków z wykorzystaniem startera 208 (Ryc. 4). Podobny układ otrzymano dla
trzech szczepów (numery 8, 9 i 14, Ryc. 4). Szczepy te izolowano od chorych leczonych na
różnych oddziałach szpitala. Dodatkowo, dwa z nich posiadały taki sam wzór lekowrażliwości.
Stosując starter 272 otrzymano 16 układów prążków, różnych dla każdego z badanych
szczepów.
Zdjęcie przedstawiające rozdzielony i wybarwiony bromkiem etydyny efekt rozdziału
produktu PCR-RAPD z wykorzystaniem startera 208 został przedstawiony na rycinie 4.
1 2 3 4 5 6 7 8 M* 9 10 11 12 13 14 15 16
Ryc. 4. Ryc.
Rozdział
produktu
amplifikacji
DNA
badanych
szczepów
PCR-RAPDz
4. Rozdział
produktu
amplifikacji
DNA
badanych
szczepów(n=16)
(n=16)techniką
techniką PCR-RAPD
wykorzystaniem
startera
z wykorzystaniem
startera
208208
*M – wzorzec
wielkości
100-3000
par zasad,
numery
kolejnych
badanych
szczepów
*M – wzorzec
wielkości
100-3000
par zasad,
1-161-16
numery
kolejnych
badanych
szczepów
Na podstawie układów prążków uzyskanych w wyniku rozdziału elektroforetycznego
produktu PCR-RAPD z wykorzystaniem przynajmniej jednego startera nie stwierdzono szczepów powtarzających się, dowodząc przydatności techniki w różnicowaniu szczepów CRPA.
DYSKUSJA
Z każdym rokiem notowany jest wzrost częstości izolacji szczepów P. aeruginosa,
w tym szczepów CRPA. Nabywanie przez nie oporności pod wpływem presji antybiotykowej i przekazywania genów kodujących mechanizmy oporności jest niezwykle groźnym
zjawiskiem. Tymczasem, jak wskazują wykorzystujące technikę PCR-RAPD, badania
Kersulyte i wsp. (17), możliwe jest z jej zastosowaniem potwierdzenie izolacji od jednego
chorego więcej niż jednego szczepu.
216
T. Bogiel, E. Gospodarek
Nr 3
Niezwykle ważna jest wiedza na temat utrzymywania się takich szczepów w środowisku szpitalnym i monitorowanie ich występowania. Szczepy izolowane od pacjenta, jak
dokumentują wyniki badań Nazik i wsp. (19) mają zdolność utrzymywania się nawet przez
kilka miesięcy i rozprzestrzeniania się wśród pacjentów tego samego zakładu leczniczego.
Szybkie wykrycie, izolowanie i zachowanie racjonalnych procedur w odniesieniu do pacjentów, u których doszło do zakażenia lekoopornymi szczepami P. aeruginosa, umożliwia
ograniczenie ich rozprzestrzeniania (3, 16).
W typowaniu szczepów wykorzystywane są metody zarówno fenotypowe, jak i genotypowe (1, 6, 11, 14).
Mało rozpowszechnioną, choć opracowaną już w latach 90. ubiegłego wieku jest technika
PCR-RAPD (22, 23). Mimo tego, że jej przydatność w typowaniu szczepów P. aeruginosa
została wykazana przez Kersulyte i wsp. (17), w dostępnym piśmiennictwie jest niewiele
informacji dotyczących jej wykorzystania w Polsce (2, 9).
Jednak, jak wskazują wyniki uzyskane przez innych autorów, dzięki możliwości
uwidoczniania heterogenności badanej populacji (4), technika ta jest bardzo użyteczna
w typowaniu szczepów P. aeruginosa, także izolatów wielolekoopornych (20). Umożliwia
ponadto stwierdzenie występowania i różnicowania szczepów epidemicznych, stanowiących
szczególne zagrożenie ze względu na lekooporność (3, 20).
Z piśmiennictwa wynika, że technika PCR-RAPD jest przydatna nie tylko w odniesieniu do szczepów klinicznych ale również w badaniach populacyjnych, np. kolonizacji
pacjentów szczepami P. aeruginosa, badań epidemiologicznych wywoływania przez nie
zakażeń krzyżowych (15).
Z dostępnego piśmiennictwa wynika, że porównanie przydatności różnych technik fenotypowych i metody PCR-RAPD, jednoznacznie wskazuje na tę drugą jako lepszą (1, 6, 11, 14).
W badaniach własnych, wykorzystując w niezależnych reakcjach startery 208 i 272,
również wykazano użyteczność tej metody zarówno w stosunku do szczepów o takich
samych, jak i różnych wzorach lekowrażliwości. Na podstawie przedstawionych wyników
w niniejszej pracy po amplifikacji DNA metodą RAPD-PCR odmienny układ prążków dla
każdego szczepu uzyskano tylko dla startera 272. Tymczasem badania Budak i wsp. (2)
wskazują, że badając 31 szczepów tyle samo wzorów PCR-RAPD uzyskano dla obydwu,
wykorzystanych w niniejszej pracy, starterów. Wskazywałoby to na podobną siłę różnicującą
starterów 208 i 272, czego nie zaobserwowano na podstawie badań własnych. Saitou i wsp.
(21) w badaniach z wykorzystaniem startera 208, wykazali natomiast jego przydatność
w potwierdzeniu różnorodności wzorów DNA.
Spośród ocenianych przez Grundmann i wsp. (13) metod molekularnych, technika
rozdziału metodą PFGE poddanego restrykcyjnemu trawieniu materiału genetycznego,
wykazywała najwyższą siłę różnicującą 81 szczepów różnorodnych geograficznie, epidemiologicznie i pod względem czasu izolacji.
Z punktu widzenia konieczności przeprowadzenia dużej liczby badań, PCR-RAPD jest
jednak techniką bardziej efektywną i szybszą.
Niewątpliwym utrudnieniem wykorzystania techniki PCR-RAPD, jak wskazują niektórzy autorzy (10), jest fakt, że duże znaczenie w uzyskiwaniu wyników ma stabilność
genomu pałeczek P. aeruginosa.
Nr 3
Typowanie P. aeruginosa metodą PCR-RAPD
217
W innych badaniach wykazano, że szczepy posiadające takie same wzory RAPD mogą
różnić się cechami fenotypowymi, jak chociażby zdolnością czy obfitością tworzenia biofilmu (7). Stąd, te właściwości szczepów nie są wystarczające do ich różnicowania.
Technika PCR-RAPD jest prostszą i szybszą niż PFGE metodą, której wykorzystanie
dzięki czułości i skuteczności (17) może przyspieszyć dochodzenia epidemiologiczne, ułatwić badanie pokrewieństwa szczepów i uczynić takie badania bardziej celowymi.
WNIOSKI
1. Technika PCR-RAPD jest szybką i prostą metodą, przydatną w typowaniu szczepów
P. aeruginosa opornych na karbapenemy.
2. Na podstawie układu prążków uzyskiwanego po rozdziale produktów amplifikacji
DNA szczepów z wykorzystaniem techniki PCR-RAPD można w pełni odróżnić od
siebie izolaty.
3. Szczepy, zarówno o takim samym, jak i różnym wzorze lekowrażliwości, mogą różnić
się wzorami uzyskanymi techniką PCR-RAPD.
T. B o g ie l, E. G ospoda re k
PCR-RAPD typing of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains
SUMMARY
P. aeruginosa rods are opportunistic pathogens responsible generally for nosocomial infections.
Resistance to carbapenems, observed among them, is a serious threat due to ability to be transmitted between bacterial species. The aim of our study was to evaluate the usefulness of PCR-RAPD
technique in typing of 16 carbapenem-resistant P. aeruginosa strains isolated in 2007 from different
patients of University Hospital No. 1 of dr A. Jurasz Collegium Medicum of L. Rydygier in Bydgoszcz
Nicolaus Copernicus University in Toruń. Study shows increasing frequency of isolation that type
of strains when compared to 2006. Percentage of carbapenem-resistant isolates raised from 12,4% in
2006 to 22,9% in 2007. The majority of examined strains were obtained from patients of the Intensive Care Units (25,0%) and were isolated from bronchoalveolar lavage (25,0%), urine (25,0%) and
wound swabs (18,8%) samples. Examined P. aeruginosa strains demonstrated resistance to doripenem
(81,3%) and piperacillin (75,0%) and susceptibility to colistin (100,0%), amikacin (81,3%), netilmicin
and norfloxacin (75,0% each). Using PCR-RAPD amplification with 208 and 272 primers, 14 and
16 DNA patterns were obtained, respectively. Usefulness of PCR-RAPD in carbapenem-resistant P.
aeruginosa strains typing was proved in case of strains presenting similar and/or different antimicrobials susceptibility patterns.
PIŚMIENNICTWO
1. Ben Haj Khalifa A, Vu-Thien H, Pourcel C i inni. Phenotypic and genotypic (randomly amplified polymorphic DNA analysis and multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis)
charaterization of 96 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in the F. Bourguiba hospital
(Monastir, Tunisia). Pathol Biol (Paris). 2010; 58: 84-8.
218
T. Bogiel, E. Gospodarek
Nr 3
2. Budak A, Paluchowska P, Włodarczyk D i inni. Genetyczna charakterystyka szczepów Acinetobacter baumannii oraz Pseudomonas aeruginosa izolowanych od chorych z zapaleniem płuc
hospitalizowanych w oddziale intensywnej terapii. Med Dosw Mikrobiol. 2010; 62: 67-75.
3. Cardoso O, Alves AF, Leitão R. Metallo-beta-lactamase VIM-2 in Pseudomonas aeruginosa
isolates from a cystic fibrosis patient. Int J Antimicrob Agents. 2008; 31: 375-9.
4. Clarke L, Moore JE, Millar BC, Crowe M i inni. Molecular epidemiology of Pseudomonas
aeruginosa in adult patients with cystic fibrosis in Northern Ireland. Br J Biomed Sci. 2008; 65:
18-21.
5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility
testing. Eighteenth informational supplement (M100-S18). CLSI Wayne, Pa 2008.
6. Coban AY, Ciftci A, Onuk EE i inni. Investigation of biofilm formation and relationship with
genotype and antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patients
with cystic fibrosis. Mikrobiyol Bul. 2009; 43: 563-73.
7. Deligianni E, Pattison S, Berrar D i inni. Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates of
similar RAPD genotype exhibit diversity in biofilm forming ability in vitro. BMC Microbiol.
2010; 10: 38.
8. Dzierżanowska D. Patogeny zakażeń szpitalnych. W: Zakażenia szpitalne. Red. D. Dzierżanowska,
α-medica press, Bielsko-Biała. 2007, 38-59.
9. Fiett J, Trzciński K, Hryniewicz W, Gniadkowski M. The use of molecular biology in the modeling
of Pseudomonas aeruginosa strains recovered from nosocomial infections Przegl Epidemiol.
1998; 52: 427-40.
10. Fothergill JL, White J, Foweraker JE i inni. Impact of Pseudomonas aeruginosa genomic instability on the application of typing methods for chronic cystic fibrosis infections. J Clin Microbiol.
2010; 48: 2053-9.
11. Freitas AL, Barth AL. Typing of Pseudomonas aeruginosa from hospitalized patients: a comparison of susceptibility and biochemical profiles with genotype. Braz J Med Biol Res. 2004;
37: 77-82.
12.Gniadkowski M, Żabicka D, Hryniewicz W. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki 2009. Oznaczanie wrażliwości pałeczek
Gram-ujemnych.
13. Grundmann H, Schneider C, Hartung D i inni. Discriminatory power of three DNA-based typing
techniques for Pseudomonas aeruginosa. J Clin Microbiol. 1995; 33: 528–34.
14. Hafiane A, Ravaoarinoro M. Characterization of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from
cystic fibrosis patients by different typing methods. Pathol Biol (Paris). 2009. (Epub ahead of
print).
15. Hoogkamp-Korstanje JA, Meis JF, Kissing J i inni. Risk of cross-colonization and infection by
Pseudomonas aeruginosa in a holiday camp for cystic fibrosis patients. J Clin Microbiol. 1995;
33: 572–5.
16. Iglesias NG, Marengo JM, Rentería F i inni. Molecular typification of Pseudomonas aeruginosa
strains isolated from patients with cystic fibrosis. Rev Argent Microbiol. 2008; 40: 3-8.
17. Kersulyte D, Struelens MJ, Deplano A, Berg DE. Comparison of arbitrarily primed PCR and
macrorestriction (pulsed-field gel electrophoresis) typing of Pseudomonas aeruginosa strains
from cystic fibrosis patients. J Clin Microbiol. 1995; 33: 2216–9.
18. Mahenthiralingam E, Campbell ME, Foster J i inni. Random amplified polymorphic DNA
typing of Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from patients with cystic fibrosis. J Clin
Microbiol. 1996; 34: 1129-35.
19. Nazik H, Ongen B, Erturan Z, Salcioğlu M. Genotype and antibiotic susceptibility patterns of
Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolated from cystic fibrosis patients.
Jpn J Infect Dis. 2007; 60: 82-6.
Nr 3
Typowanie P. aeruginosa metodą PCR-RAPD
219
20. Pellegrino FL, Casali N, Dos Santos KR i inni. Pseudomonas aeruginosa epidemic strain carrying
bla(SPM) metallo-beta-lactamase detected in Rio de Janeiro, Brazil. J Chemother. 2006; 18:
151-6.
21. Saitou K, Furuhata K, Fukuyama M. Genotyping of Pseudomonas aeruginosa isolated from
cockroaches and human urine. J Infect Chemother. 2010. (Epub ahead of print).
22. Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic
Acids Res. 1990; 18: 7213–8.
23. Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ i inni. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers
are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 1990; 18: 6531–5.
Otrzymano: 19 VII 2010 r.
Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. M. Skłodowskiej-Curie 9,
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum w Bydgoszczy,
Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu