Wpływ cisplatyny na ekspresję genów związanych z naprawą DNA
advertisement
&ARM0RZEGL.AUK COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. 7PYWCISPLATYNYNAEKSPRESJÃGENÌW ZWIZANYCHZNAPRAW$.! WKOMÌRKACHBIAACZKIPROMIELOCYTARNEJ(, 4HEINFLUENCEOFCISPLATINONEXPRESSIONOFGENES ASSOCIATEDWITH$.!REPAIRINPROMYELOTICLEUKEMIACELLS(, 'RZEGORZ(IBNER%WELINA!LEKSANDER!LICJA:AJDEL-ONIKA0AUL3AMOJEDNY!DAM7ILCZOK +ATEDRAI:AKAD"IOFARMACJI7YDZIA&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH +ATEDRAI:AKAD'ENETYKI-EDYCZNEJ7YDZIA&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH Streszczenie Abstract Cisplatyna (CPT) jest chemioterapeutykiem tworzącym kowalencyjne wiązania z DNA, zarówno wewnątrz- jak i międzyniciowe. Sprawność i funkcjonowanie mechanizmów naprawy DNA pozostają w ścisłym związku z charakterem odpowiedzi komórki na leki uszkadzające genom, włączając CPT. Mechanizmy te pełnią rolę decyzyjną w aspekcie zarówno wejścia komórki na drogę apoptozy, jak i wytworzenia się oporności na lek. Wykorzystanie techniki mikromacierzy oligonukleotydowych (Affymetrix) pozwoliło na porównanie poziomu ekspresji genów związanych z aktywnością mechanizmów naprawy DNA w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 po ekspozycji na CPT w odniesieniu do komórek kontrolnych. Analiza sygnałów fluorescencji 1252 sond, wyselekcjonowanych z bazy NetAffx Analysis Center, wyrażających ekspresję 717 genów, umożliwiła wykazanie wzrostu ekspresji genów SMC3, USP1, TOP2A, TOP1, KRAS, HMGB1 oraz spadku ekspresji genów NQO1, MTF1. Szczegółowa charakterystyka i poznanie genów o zmienionej aktywności są bardzo istotne dla określenia mechanizmu działania leku oraz sposobów wytwarzania oporności. Wiedza taka umożliwia również projektowanie nowych, skutecznych leków oraz zwiększenie efektywności leczenia z wykorzystaniem terapii skojarzonych. Cisplatin (CPT) is a chemotherapy drug, which forms covalent bonds with DNA, both intra- and interstrand. The efficiency and functioning of DNA repair mechanisms are closely related to the nature of cellular response to drugs that damage the genome, including CPT. These mechanisms play a decisive role in terms of entry into the path of cell apoptosis, as well as in the development of drug resistance. The use of oligonucleotide microarray technique (Affymetrix) enabled an expression levels comparison of genes associated with DNA repair mechanisms in promyelocytic leukemia HL-60 cells after exposure to CPT in relation to control cells. Fluorescence signals analysis of 1252 probes, which represented the expression of 717 genes selected from the NetAffx Analysis Center database, demonstrated the increased expression of SMC3, USP1, TOP2A, TOP1, KRAS, HMGB1 and inhibition of NQO1, MTF1. Detailed characterization and recognition of genes with modified activity are important for determining the drug action mechanisms and resistance formation pathways. Such knowledge also enables the design of new, more effective drugs and increases the effectiveness of treatment with combined therapy. Keywords: cisplatin, gene expression, DNA repair, promyelocytic leukemia cells, HL-60 Słowa kluczowe: cisplatyna, ekspresja genów, naprawa DNA, komórki białaczki promielocytarnej, HL-60 Wstęp Wszystkie generowane w DNA defekty, w mniejszym lub większym stopniu, zmieniają strukturę chromosomów i zaburzają procesy ich replikacji. Zatem wszelkie nienaprawione uszkodzenia genomu mogą prowadzić do nieodwracalnego stanu wygaśnięcia aktywności komórki, apoptozy albo niekontrolowanych podziałów, których skutkiem może być powstanie nowotworu [1]. W toku ewolucji komórki wykształciły specjalistyczne detektory uszkodzeń DNA, które po wykryciu zaistniałej nieprawidłowości uruchamiają kilka typów odpowiedzi. Zasadniczą odpowiedzią na wykryte uszkodzenie DNA jest rozpoczęcie procesu naprawy, pozwalające na odtworzenie jego prawidłowej struktury. Wraz z indukcją tego procesu uruchamiane są również mechanizmy zatrzymujące cykl komórkowy, co wydłuża czas potrzebny na naprawę DNA przed replikacją i podziałem chromosomów. Dotychczas poznano i opisano pięć głównych szlaków naprawy DNA w komórkach żywych: bezpośredni (DR – ang. direct repair), poprzez wycinanie &ARM0RZEGL.AUK zasad azotowych (BER – ang. base excision repair), poprzez wycinanie nukleotydów (NER – ang. nucleotide excision repair), naprawę błędnie sparowanych nukleotydów (MMR – ang. mismatch repair) oraz naprawę rekombinacyjną homologiczną (HRR – ang. homologous recombination repair) i niehomologiczną (NHEJ – ang. non-homologous end joining) [2, 3]. Cisplatyna (CPT), będąca powszechnie stosowanym chemioterapeutykiem, należy do leków mających zdolność bezpośredniej interakcji z DNA [4]. Jednakże liczne reakcje z cytoplazmatycznymi białkami zawierającymi grupy sulfhydrylowe, włączając metalotioneiny i glutation (GSH) powodują, że tylko ok. 1% substancji leczniczej jest w stanie dotrzeć do jądra komórkowego i wiązać się z DNA [5]. Powszechnie wiadomo, iż mechanizm NER jest odpowiedzialny za naprawę adduktów Pt-DNA, oraz że ekspresja jedynie 16 genów jest niezbędna do rozpoznania uszkodzenia i przeprowadzenia procesu resekcji wiązania sieciującego dwie sąsiednie guaniny [6]. MMR z kolei jest postreplikacyjnym systemem naprawy korygującym zarówno nukleotydy niesparowane, jak i wszelkie nieprawidłowości strukturalne helisy DNA powstałe w drodze insercji lub delecji. Zależność pomiędzy detekcją uszkodzenia przez białka systemu MMR a efektem cytotoksycznym CPT wciąż pozostaje niejasna, ponieważ kompleks hMutS-α wykrywa, lecz nie jest w stanie usunąć adduktów Pt-DNA [3]. Wciąż dyskutowana jest kwestia, który z omawianych wyżej mechanizmów pełni dominującą rolę w procesie naprawy platynowanego DNA. W przebiegu terapii niektórych nowotworów (m.in. raka jajnika i raka jelita grubego) aktywność szlaku MMR pełni stosunkowo niewielką rolę w powstawaniu fenotypu opornego na CPT, ponieważ sprawny mechanizm naprawy błędnie sparowanych nukleotydów jest konieczny do powiązania uszkodzenia DNA z inicjacją apoptozy. Obecny pogląd bazuje na założeniu, że wielokrotny, nieskuteczny przebieg cyklu MMR, staje się inicjatorem procesu apoptozy [7]. Jak wynika z przeglądu powyżej cytowanych prac, aktywność mechanizmów naprawy DNA pozostaje w ścisłym związku z odpowiedzią komórek nowotworowych na CPT oraz wytwarzaniem trwałej oporności na lek. Brak w nich jednak szczegółowych danych, w jaki sposób zmienia się ekspresja genów związanych z naprawą DNA, gdy na CPT eksponowane są komórki białaczki promielocytarnej HL60. Dlatego w niniejszej pracy poddaliśmy ocenie zmiany profilu ekspresji genów kodujących białka związane z naprawą DNA wykorzystując, hodowane w warunkach laboratoryjnych, komórki ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60 po ich ekspozycji na CPT. Do analizy zmian w ekspresji oraz wyznaczenia tzw. genów różnicujących zastosowano technikę mikromacierzy oligonukleotydowych Human Genome U133A Set (HG-U133A; Affymetrix). Materiał i metody Hodowle komórkowe Materiał do badań aktywności genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych stanowiły hodowle komórek ludzkiej linii nowotworowej białaczki promielocytarnej HL-60. Medium dla hodowli HL-60 stanowiła mieszanina RPMI-1640 (Gibco) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS; Sigma), 100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ ml penicyliny (Sigma), 2 mM glutaminy (Sigma), 1 mM pirogronianu sodu (Sigma) i 4,5 g/l glukozy. Hodowle komórkowe prowadzono w warunkach porównywalnych do warunków fizjologicznych, zgodnie z wymogami hodowli in vitro, w specjalnie do tego przeznaczonych polistyrenowych naczyniach. Po 48 godzinach inkubacji w 37˚C, w wilgotnej atmosferze nasyconej 5% CO2, dodawano pożywkę zawierającą CPT (Sigma) rozpuszczoną w DMSO (Sigma), tak aby w hodowlach uzyskać stężenie 0,22 μg/ml, zgodne z wartością ID30 (Inhibitory Dose 30%). Hodowle stanowiące układ odniesienia prowadzono w identyczny sposób, dodając po 48 godzinach pożywkę z dodatkiem DMSO, tak by jego stężenie było identyczne jak w próbach z CPT. Po 6 godzinach inkubowania hodowli komórki zbierano i przygotowywano do ekstrakcji RNA. Ekstrakcja całkowitego RNA Procedurę ekstrakcji całkowitego RNA wykonano z wykorzystaniem odczynnika TRIZOL (Invitrogen Life Technologies), zgodnie z protokołem producenta. Ekstrakty oczyszczono wykorzystując zestaw RNeasy Mini Kit (Qiagen). Ekstrakty RNA poddano ocenie jakościowej techniką elektroforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny oraz ocenie ilościowej przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia Biotech). Analiza aktywności transkrypcyjnej genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych Po ekstrakcji całkowity RNA, w ilości 8 μg, stanowił matrycę do syntezy dwuniciowego cDNA (Gibco BRL SuperScript Choice system), który następnie został wykorzystany do syntezy biotynylowanego cRNA (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Biotynylowany cRNA, po fragmentacji, poddano hybrydyzacji z mikromacierzą Test3, a następnie, po pozytywnej weryfikacji, hybrydyzacji z mikromacierzą HG-U133A (Affymetrix). Produkty hybrydyzacji znakowano kilkuetapowo kompleksem streptawidyna – fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna – fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGEWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG–U133A w przewodniku Gene Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). W kolejnym etapie płytki mikromacierzy odczytywano używając skanera Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies). Otrzymane wyniki intensywności fluorescencji zapisano i zarchiwizowano w programie Microarray Suite oraz specjalnie do tego celu przygotowanej bazie danych. Wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.7.0, Gnumeric, oraz Microsoft Excel przeprowadzono analizę porównawczą transkryptomów, po uprzedniej normalizacji wyników w programie RMA Express, polegającej na przekształceniu logarytmicznym wartości sygnału fluorescencji dla każdego transkryptu (log2). Geny związane z mechanizmami naprawy genomu wyodrębniono z wykorzystaniem bazy danych Affymetrix NetAffx™ Analysis Center (http:// www.affymetrix.com/analysis/index.affx) po wprowadzeniu, jako kryterium wyszukiwania, kwerendy: „DNA repa- COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. ir”. Sumaryczny zbiór 1252 sond stanowił podstawę do poszukiwania tzw. genów różnicujących o ekspresji różniącej się, co najmniej, o dwukrotną wartość odchylenia standardowego (± 2STD). Wyniki W przedstawionej pracy porównano ekspresję genów związanych z mechanizmami naprawy DNA w hodowanych komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na CPT względem hodowli kontrolnych. Podstawę kwalifikacji wyników wykonanych mikromacierzy do dalszych analiz stanowił prawidłowy rozkład znormalizowanych sygnałów fluorescencji. Wykorzystując aplikację Gnumeric, spośród obecnych na mikromacierzy HG-U133A (Affymetrix) 22283 sond mRNA, wyfiltrowano sygnały fluorescencji dla 1252 transkryptów związanych z mechanizmami naprawy DNA. Po porównaniu ich wartości i wyznaczeniu parametru SLR (stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych próbach, ang. signal log ratio), wyodrębniono zbiór genów różnicujących transkryptomy komórek HL-60 eksponowanych na CPT, których SLR różnił się, co najmniej, ± 2STD w odniesieniu do komórek hodowli kontrolnych. W komórkach HL-60 eksponowanych na CPT w największym stopniu stymulowana była ekspresja genów: SMC3, USP1, TOP2A, TOP1, KRAS, HMGB1, ANP32A, CITED oraz SF3B1. Genami, których ekspresja podlegała największej inhibicji okazały się: NQO1, MTF1, UBE2L6, PSMD1, MARCKS, NR3C1 oraz TNFAIP2. Szczegółowe dane uwzględniające nazwy sond, symbole wyznaczonych genów różnicujących, nazwy kodowanych przez nie białek oraz wartości SLR dla transkryptów różnicujących zestawiono w tabeli I. Dyskusja Funkcjonowanie mechanizmów naprawy DNA warunkuje przetrwanie komórek. Niedostateczne bądź niepoprawne ich działanie, w połączeniu z dysregulacją szlaków apoptotycznych, przyczynia się do gromadzenia uszkodzeń DNA i może sprzyjać wzrostowi komórek nowotworowych. Jednakże nadekspresja genów związanych z mechanizmami naprawy może skutkować zwiększonym poziomem usuwania polekowych uszkodzeń DNA, co może przyczyniać się do rozwoju oporności komórek nowotworowych na stosowane terapie. Obecnie, oprócz poszukiwania nowych, skuteczniejszych leków dzięki rozwojowi narzędzi i technik analitycznych, postępowi w komputerowym przetwarzaniu danych oraz dostępności odpowiednich modeli eksperymentalnych, bieżące badania koncentrują się na bardziej szczegółowym poznaniu molekularnego działania, jak również określeniu alternatywnych zastosowań dla substancji rutynowo wykorzystywanych w terapii przeciwnowotworowej. Mimo że badania wpływu CPT na procesy naprawy DNA prowadzono już w latach 80-tych ubiegłego wieku, wykorzystując jako model badawczy linię komórek ludzkich fibroblastów [8], to jednak z uwagi na niedostępność technik badawczych, jak np. mikromacierze oligonukleotydowe, nie prowadzono analiz zmian w ekspresji transkryptomów związanych z określonymi procesami, czy wyznaczania ge- nów różnicujących. Dotychczas nie prowadzono podobnych badań z wykorzystaniem linii komórek białaczki promielocytarnej HL-60. Przeprowadzona przez nas analiza uwidoczniła znaczący wpływ CPT na zmianę poziomu ekspresji genów związanych z procesami naprawy DNA. Zaobserwowano znaczny wzrost ekspresji genu SMC3 jako komórkową odpowiedź na substancję badaną. Białkowy produkt SMC3, po procesie translacji, występuje w komórkach w kilku postaciach: jako białko cytoplazmatyczne, jądrowe, bądź podlegające sekrecji zewnątrzkomórkowej. Forma występująca w jądrze komórkowym, znana jako białko 3 utrzymujące strukturę chromosomów (ang. structural maintenance of chromosomes 3), stanowi komponent multimerycznego kompleksu – kohezyny, spinającej wzajemnie chromatydy siostrzane podczas mitozy, co umożliwia poprawną segregację chromosomów. Ponadto kohezyna jest wymagana do prawidłowego funkcjonowania w komórkach ssaków punktu restrykcyjnego G2/M indukowanego poziomem uszkodzeń DNA. Modyfikacje potranslacyjne SMC3, polegające na dołączeniu łańcuchów siarczanu chondroityny, powodują powstanie, wydzielanego do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, proteoglikanu – bamakanu, powszechnie występującego w błonach podstawnych [9]. Istnieją doniesienia, że obniżony poziom ekspresji SMC3 prowadzi do zaburzenia stabilności strukturalnej chromosomów, co skutkuje aktywacją mitotycznego punktu restrykcyjnego zależnego od białka p53 [10]. Barber i wsp., w 2008 roku [11], zidentyfikowali SMC3 jako jeden z pięciu genów zawierających 11 mutacji somatycznych w panelu złożonym z próbek raka jelita grubego pochodzących od 132 pacjentów, a następnie w tym samym eksperymencie wykazali, że zmniejszona ekspresja tego genu jest związana z niestabilnością chromosomów i defektami w kohezji chromatyd w komórkach ludzkich. Zaobserwowany, w przedstawianej pracy, nieprawidłowy poziom ekspresji omawianego genu sugeruje występowanie, już po krótkotrwałej ekspozycji komórek na CPT, zmian w przebiegu procesów utrzymania stabilności strukturalnej chromosomów oraz cyklu komórkowego. W opisywanym eksperymencie zaobserwowano wzrost poziomu ekspresji TOP1, kodującego DNA topoizomerazę I, enzym kontrolujący i zmieniający stany topologiczne cząsteczki DNA w przebiegu procesu transkrypcji poprzez katalizowanie pęknięć i połączeń w jednej z nici, co skutkuje relaksacją występujących w niej superskrętów. Wykazano również wzrost poziomu ekspresji TOP2A, kodującego zlokalizowany w jądrze komórkowym enzym DNA topoizomerazę II alfa, dodającą superskręty do cząsteczki DNA. Zmiany w poziomie aktywności transkrypcyjnej omawianych genów pod wpływem różnych związków o działaniu przeciwnowotworowym notuje się w komórkach wielu nowotworów, również w przypadku komórek białaczki promielocytarnej HL-60. Ponieważ TOP1 i TOP2A pełnią istotną rolę w procesach naprawy DNA, zwiększenie ich ekspresji sugeruje jednoczesną intensyfikację przebiegu tych mechanizmów, co może się przyczyniać do występowania pewnego poziomu cisplatynooporności, pojawiającego się już w trakcie krótkotrwałej ekspozycji na badany lek. Poziom ekspresji tych genów, zależny od amplifikacji bądź delecji, może stanowić wartościowy czynnik predykcyjny w przebiegu terapii przeciwnowotworowej [12]. &ARM0RZEGL.AUK Tab. I. Transkrypty genów, związanych z naprawą DNA, różnicujące odpowiedź komórek białaczki promielocytarnej HL-60 hodowli eksponowanej na CPT względem prób odniesienia (komórki eksponowane na DMSO) Nazwa sondy Symbol genu 209257_s_at SMC3 202412_s_at USP1 201291_s_at TOP2A 209258_s_at SMC3 208900_s_at TOP1 214352_s_at KRAS 200679_x_at HMGB1 201043_s_at ANP32A 207980_s_at CITED2 201070_x_at SF3B1 201467_s_at NQO1 202510_s_at TNFAIP2 201865_x_at NR3C1 213002_at MARCKS 210519_s_at NQO1 201199_s_at PSMD1 201649_at UBE2L6 205323_s_at MTF1 201468_s_at NQO1 Nazwa kodowanego białka białko 3 warunkujące segregację chromatyd (structural maintenance of chromosomes 3) specyficzna dla ubikwityny peptydaza 1 (ubiquitin specific peptidase 1) topoizomeraza (DNA) II alfa (topoizomerase (DNA) II alpha) białko 3 warunkujące segregację chromatyd (structural maintenance of chromosomes 3) topoizomeraza (DNA) I (topoizomerase (DNA) I) homolog wirusowego onkogenu szczurzego mięsaka Kirstena v-Ki-ras2 (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) białko wysokiej mobilności B1 (high-mobility group protein B1) kwaśna, bogata w leucynę fosfoproteina jądrowa 32A (acidic (leucine-rich) nuclear phosphoprotein 32 family, member A) oddziałujący z Cbp/p300 transaktywator posiadający bogatą w Glu/Asp domenę 2 końca karboksylowego (Cbp/p300-interacting transactivator, with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain, 2) podjednostka 1, 155kDa czynnika splicingowego 3b (splicing factor 3b, subunit 1, 155kDa) oksydoreduktaza NAD(P)H: chinon 1 (NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1) białko 2 indukowane czynnikiem martwicy nowotworów alfa (tumor necrosis factor, alpha-induced protein 2) jądrowy receptor dla glikokortykosteroidów 1 z grupy C podrodziny 3 (nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1) bogaty w mirystykowaną alaninę substrat kinazy białkowej C (myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate) oksydoreduktaza NAD(P)H: chinon 1 (NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1) podjednostka 26S proteasomu (proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 1) enzym E2L 6 koniugujący z ubikwityną (ubiquitin-conjugating enzyme E2L 6) zależny od metali czynnik transkrypcyjny 1 (metal-regulatory transcription factor 1) oksydoreduktaza NAD(P)H: chinon 1 (NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1) Wartość SLR + 2,63 ↑ + 2,36 ↑ + 2,05 ↑ + 2,04 ↑ + 1,90 ↑ + 1,89 ↑ + 1,36 ↑ + 1,31 ↑ + 1,23 ↑ + 1,21 ↑ - 1,01 ↓ - 1,02 ↓ - 1,03 ↓ - 1,04 ↓ - 1,11 ↓ - 1,12 ↓ - 1,15 ↓ - 1,22 ↓ - 1,59 ↓ SLR – ang. signal log ratio – stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych próbach, strzałka ↑ - nadekspresja, strzałka ↓ - spadek ekspresji genu w komórkach HL-60 eksponowanych na CPT. Rezultaty przeprowadzonego eksperymentu pokazują, że ekspozycja komórek na CPT przyczynia się do wzrostu poziomu ekspresji genu homologu wirusowego onkogenu szczurzego mięsaka Kirstena v-Ki-ras2 (ang. v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog – KRAS). Produkt genu KRAS jest protoonkogenem posiadającym aktywność GTPazy, który poprzez transdukcję sygnału z obszaru zewnątrzkomórkowego do wnętrza jądra komórkowego warunkuje przebieg podziału i różnicowania komórki. Białko KRAS funkcjonuje na zasadzie molekularnego przełącznika, którego status jest zależny od koncentracji cząsteczek GTP i GDP – nieaktywna forma proteiny występuje w połączeniu z GDP. O ile poziom ekspresji KRAS nie pozostaje w bezpośrednim związku z przebiegiem którejkolwiek ze ścieżek naprawy DNA, o tyle najnowsze doniesienia sugerują możliwość pośredniego wpływu KRAS na aktywność transkrypcyjną genów uczestniczących w procesach naprawy. Wykazano, że komórki, hodowane na podłożach trójwy- COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33. miarowych, charakteryzujące się zwiększonym poziomem ekspresji KRAS wykazywały inhibicję ekspresji genów związanych z procesami naprawy DNA, tj. TP53, BRCA1, BRCA2 oraz EXO-1. Wyniki te sugerują, że nadekspresja KRAS może pełnić istotną rolę w procesach akumulacji niekorzystnych zmian w genomie, wynikających z inhibicji transkrypcji genów związanych z prawidłowym przebiegiem naprawy DNA oraz apoptozy [13]. Ponadto, mutacje somatycznie w genie KRAS skorelowane są z rozwojem szeregu rodzajów nowotworów, w tym raka trzustki, płuc oraz jelita grubego [14]. Przeprowadzone przez nas analizy pozwoliły na stwierdzenie, że genem o znamiennie zwiększonej ekspresji w hodowli badanej, względem hodowli kontrolnej, był USP1, kodujący enzym o aktywności peptydazy specyficznej dla ubikwityny, zawierający w swojej strukturze domeny histydynowe i cysteinowe. Enzym ulokowany jest w cytoplazmie, gdzie katalizuje reakcję odcięcia cząsteczki ubikwityny od, oznakowanych w ten sposób, białek. Dotychczas scharakteryzowano szereg wariantów splicingowych USP1 [15]. Komórki białaczki promielocytarnej wyróżniały się także zwiększonym poziomem ekspresji HMGB1, którego produkt białkowy wykazuje aktywność helikazy w procesie naprawy DNA drogą MMR oraz posiada zdolność sekwestracji adduktów CPT-DNA, co przyczynia się do zablokowania przebiegu transkrypcji i replikacji z jednoczesnym ukierunkowaniem komórki na szlak programowanej śmierci [16, 17]. Komórki HL-60, po ekspozycji na CPT cechował ponadto obniżony poziom ekspresji NQO1 oraz MTF1. Produkt białkowy pierwszego z wymienionych genów występuje w postaci homodimerycznej, cytoplazmatycznej reduktazy dwuelektronowej wiążącej dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), katalizującej reakcję redukcji chinonów do hydrochinonów. Aktywność enzymatyczna NQO1 zapobiega przebiegowi jednoelektronowej redukcji chinonów, której skutkiem jest powstawanie wolnych rodników. Spadek ekspresji genu NQO1 może zatem sprzyjać wewnątrzkomórkowej akumulacji rodników, które posiadają potencjalną zdolność generowania uszkodzeń wszystkich struktur komórkowych, w tym DNA [18]. Białko MTF1 pełni rolę czynnika transkrypcyjnego indukującego ekspresję genów metalotionein związanych z opornością na CPT oraz transportera jądrowo-cytoplazmatycznego, gromadzącego się w jądrze komórkowym i mającego zdolność wiązania, obecnych w DNA, sekwencji odpowiedzi na metale [19]. Ponieważ sprawność mechanizmów odpowiedzialnych za naprawę genomu pozostaje w ścisłym związku zarówno z wystąpieniem apoptozy, jak również uzyskaniem przez komórki nowotworowe fenotypu opornego na CPT, wyniki przeprowadzonych analiz mogą okazać się użyteczne w procesach tworzenia nowych pochodnych platyny o zwiększonej skuteczności i obniżonej toksyczności, nie wykazujących ponadto cech oporności krzyżowej. W przedstawionej pracy opisano wyniki badań wczesnych zmian w poziomie ekspresji genów spowodowanych przez CPT dodaną do hodowli komórek HL60 w fazie ekspotencjalnego wzrostu. Przedstawione przez nas wyniki sugerują, że zmienione sygnały ekspresji analizowanych genów, już po pierwszej ekspozycji komórek nowotworowych na CPT, mogą być brane pod uwagę w przewidywaniu molekularnej modulacji procesów naprawy DNA. Wnioski 1. W komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 CPT powoduje zmiany w profilu ekspresji genów związanych z mechanizmami naprawy DNA. 2. Genami o najbardziej stymulowanej ekspresji pod wpływem CPT były: SMC3, USP1, TOP2A, TOP1, KRAS i HMGB1, natomiast największą inhibicję wykazywały: NQO1 oraz MTF1. 3. Analiza genów związanych z naprawą DNA, o zmienionej pod wpływem CPT aktywności transkrypcyjnej, może być istotna dla określenia szczegółowego mechanizmu działania leku i może umożliwić opracowanie metod zwiększających efektywność terapii przeciwnowotworowej z zastosowaniem CPT. Piśmiennictwo 1. Romanowicz-Makowska H i wsp. Znaczenie mechanizmów naprawy DNA w procesie transformacji nowotworowej u kobiet w okresie menopauzy. Przegl Menop 2009; 1: 26-32. 2. Wang G i wsp. The initiative role of XPC protein in cisplatin DNA damaging treatment-mediated cell cycle regulation. Nucleic Acids Res 2004; 32: 2231-2240. 3. Li GM. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res 2008; 18: 85-98. 4. Kostova I. Platinum complexes as anticancer agents. Rec Pat Anti-Cancer Drug Dis 2006; 1: 1-22. 5. Rabik AC, Dolan ME. Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinum agents. Cancer Treat Rev 2007; 33: 9-23. 6. Martin LP, Hamilton TC, Schilder RJ. Platinum resistance: the role of DNA repair pathways. Clin Cancer Res 2008; 14: 1291-1295. 7. Hsieh P, Yamane K. DNA mismatch repair: Molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev 2008; 129: 391-401. 8. Dijt FJ i wsp. Formation and repair of cisplatin-induced adducts to DNA in cultured normal and repair-deficient human fibroblasts. Cancer Res 1988; 48: 6058-6062. 9. Richard RW. An update on cohesin function as a ‘molecular glue’ on chromosomes and spindles. Cell Cycle 2010; 9: 1754-1758. 10. Ghiselli G. SMC3 knockdown triggers genomic instability and p53-dependent apoptosis in human and zebrafish cells. Mol Cancer 2006; 5: 52. 11. Barber TD i wsp. Chromatid cohesion defects may underlie chromosome instability in human colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105: 3443-3448. 12. Huang X i wsp. Assessment of histone H2AX phosphorylation induced by DNA topoisomerase I and II inhibitors topotecan and mitoxantrone and by the DNA crosslinking agent cisplatin. Cytometry A 2004; 58: 99-110. 13. Tsunoda T i wsp. Three-dimensionally specific inhibition of DNA repair-related genes by activated KRAS in colon crypt model. Neoplasia 2010; 12: 397-404. 14. Cejas P i wsp. KRAS mutations in primary colorectal cancer tumors and related metastases: a potential role in prediction of lung metastasis. PLoS One 2009; 4: e8199. &ARM0RZEGL.AUK 15. Nijman SM i wsp. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell 2005; 17: 331-339. 16. Wei M, Burenkova O, Lippard SJ. Cisplatin sensitivity in Hmbg1-/- and Hmbg1+/+ mouse cells. J Biol Chem 2003; 278: 1769-1773. 17. Todd RC, Lippard SJ. Inhibition of transcription by platinum antitumor compounds. Metallomics 2009; 1: 280-291. data otrzymania pracy: 18.07.2010 r. data akceptacji do druku: 12.01.2011 r. Adres do korenspondencji: mgr Grzegorz Hibner Katedra i Zakład Biofarmacji Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec e-mail: [email protected] 18. Marjani HA i wsp. Investigation of NQO1 genetic polymorphism, NQO1 gene expression and PAH-DNA adducts in ESCC. A case-control study from Iran. Genet Mol Res 2010; 9: 239-249. 19. Choi CH i wsp. Molecular mechanisms of heptaplatin effective against cisplatin-resistant cancer cell lines: less involvement of metallothionein. Cancer Cell Int 2004; 4: 6.
