Replikacja, naprawa i rekombinacja DNA u eukariontów

Replikacja, naprawa i
rekombinacja DNA u eukariontów
Zasada replikacji DNA
Replikacja DNA jest elementem cyklu komórkowego
U eukariontów DNA występuje w kompleksie zwanym
chromatyną
Replikacja u eukariontów
• Inicjacja, elongacja, terminacja
• Problem końców chromosomów
• Jądro - organelle
Inicjacja
(replikacja zaczyna się jednocześnie w wielu miejscach)
ORI (Origins of replication)
• ARS (Autonomously Replicating Sequence) u drożdży
- Specyficzna sekwencja 200 pz jest minimalną sekwencja
wymaganą do inicjacji replikacji chromosomowego DNA.
U ssaków inicjacja (ORI) obejmuje sekwencję 10 000 pz
U roślin sekwencje ORI nie są zidentyfikowane
W chromosomach istnieje wiele potencjalnych ORI, ale nie wszystkie
funkcjonują w każdej komórce
Fragment DNA replikowany z jednego ORI nosi nazwę replikonu ( u
roślin długość replikonu to przeciętnie 50-70 kb)
Nie wszystkie ORI startują w tym samym momencie, jednak
porządek ich uruchamiania jest w komórkach ściśle kontrolowany i
zależy od stanu kondensacji chromatyny w danym miejscu.
Kontrola inicjacji
• Licencjonowanie (kontrola pozytywna) – zapewnia, że chromosomy
będą się replikować tylko wtedy, gdy w sposób prawidłowy przejdą
przez mitozę i znajdą się w komórce potomnej.
• Aby nastąpiła inicjacja, do ORI musi się przyłączyć Kompleks
Rozpoznający Origin (ORC – Origin Recognition Complex) i
dodatkowe białka (czynniki licencjonujące Cdc-6 i Cdt-1)
umożliwiające ścisłe pokrycie sąsiadującego DNA białkami MCM
(Minichromosome Maintenance). Tylko DNA pokryty białkami MCM
może być replikowany. Białka MCM są usuwane przez
przesuwające się widełki replikacyjne.
Licencjonowanie w ORI
Negatywna kontrola inicjacji - Geminina
• Geminina – białko występujące w komórkach w fazie G2
• Przeciwdziała przyłączaniu się białek MCM do świeżo
zreplikowanego DNA (zablokowanie czynnika Cdt-1)
• Jest degradowana po zakończeniu mitozy
• Gemininy nie wykryto w drożdżach i roślinach!
Kontrola inicjacji w cyklu komórkowym
Elongacja
• Kompleks wielo-enzymatyczny zawierający polimerazę DNA
katalizuje przyłączanie deoksyrybonukleotydów do 3’ końca DNA lub
RNA przyłączonego do nici matrycowej DNA.
• Synteza DNA idzie w kierunku 5’ – 3’, a matryca jest odczytywana w
kierunku 3’-5’.
• Polimeraza DNA może dodawać nukleotydy tylko do już istniejącego
fragmentu kwasu nukleinowego (primera).
• Polimeraza DNA jest nieaktywna w nieobecności primera z wolną
grupą 3’ OH, związanego poprzez wiązania wodorowe z matrycą.
• Primery są syntetyzowane przez specyficzną polimerazę
rybonukleotydową zwaną ‘DNA primazą’. Inicjuje ona syntezę
primera rozpoczynając od rybonukleotydu purynowego.
Przyłączanie deoksyrybonukleotydów przez polimerazę DNA
Elongacja - cd
• Ze względu na asymetrię widełek replikacyjnych *(kierunki!) synteza
DNA jest w połowie nieciągła. Na nici wiodącej (jeden primer)
dodawanie nukleotydów odbywa się w sposób ciągły. Na nici
opóźnionej synteza odbywa się w formie krótkich fragmentów
Okazaki, z których każdy wymaga swojego primera.
• Wytworzenie ciągłej cząsteczki na matrycy nici opóźnionej wymaga
systemu naprawy DNA zawierającego specyficzną rybonukleazę –
RNazę H, który usuwa primery RNA i zastępuje je fragmentami
DNA. Inny enzym – ligaza DNA łączy koniec 3’ nowego fragmentu
DNA z 5’ końcem fragmentu DNA poniżej.
Elongacja - widełki replikacyjne
Elongacja - cd
• W jądrze eukariontów występują trzy główne polimerazy DNA – α, δ
i ε.
• α – głównie funkcja primazy
• δ i ε – synteza DNA na nici prowadzącej i opóźnionej.
• Helikaza DNA (występuje w kompleksie z pol δ i ε ) rozplata
dwuniciowy DNA u nasady widełek.
• Topoizomerazy DNA usuwają napięcia torsyjne powstające w
wyniku rozplatania (są przyłączone przed widełkami).
Elongacja - cd
Wierność replikacji
• Wysoka wierność replikacji (śr. 1 błąd na 10 9 zreplikowanych pz).
• Polimerazy DNA są enzymami z funkcją autokorety (proofreading),
które usuwają własne błędy podczas replikacji.
• Kluczowe dla autokorekty są ich aktywności 3’-5’ egzonukleazy,
dzięki którym usuwają źle sparowane nukleotydy od 3’ końca nowo
zsyntetyzowanego fragmentu DNA. Specjalny system naprawy
uzupełnia następnie brakujące fragmenty nici.
Niektórych błędów nie da się skorygować
Terminacja replikacji
• Terminacja następuje w miejscach, w których spotykają
się nowo syntetyzowane nici DNA powstałe z dwóch
sąsiadujących miejsc ORI.
Aktywność telomerazowa -replikacja końców
chromosomów (telomerów)
Punkty kontrolne (checkpoints) w cyklu komórkowym
Chromosomy politeniczne (Drosophila – 10 rund replikacji bez rozdzielania
cząsteczek = 2048 cząsteczek ułożonych obok siebie)
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)
Produkty PCR (polimeraza Taq)
Przyczyny uszkodzeń DNA i ich efekty
•
•
•
•
Tlen, wolne rodniki
UV
Związki alkilujące
Spontaniczna deaminacja (C do
U)
•
•
•
Przerwanie łańcucha
Modyfikacje chemiczne zasad
włączanie niesparowanych zasad
w trakcie replikacji
Uszkodzenia DNA - przykłady
Systemy naprawy DNA
•
•
Wycięcie nukleotydów
(dimery pirymidyn, aberracje struktury)
•
System helikazy XPA (Xerdoerma
pigmentosum)
•
Naprawa błędnie sparowanych
nukleotydów (mylnie sparowane
zasady)
•
Homologi bakteryjnych białek typu
Mut
•
Naprawa przez wycięcie zasad
(nietypowe – hipoksantyna, uracyl-,
zalkilowane zasady)
Uwaga: demetylacja 5-met-cytozyny!
•
Glikozylaza DNA, polimeraza δ
Naprawa bezpośrednia
(metyloguanina, dimery pirymidyn)
•
Guanino-6-metylotransferaza
•
•
Rekombinacja DNA
• Gra ważną rolę w podziale mejotycznym komórek (zapewnia
zróżnicowanie genetyczne gamet) i, na dłuższą metę - w ewolucji
(rearanżacje sekwencji DNA umożliwiają nowe kombinacje
sekwencji, które mogą generować nowe rodzaje RNA i białek,
wpływając na fenotyp).
• Mechanizmy rekombinacji są powiązane ściśle z mechanizmami
replikacji i naprawy
Rekombinacja w podziałach mejotycznych
Rodzaje rekombinacji
•
Rekombinacja homologiczna występuje pomiędzy długimi sekwencjami,
które zawierają rejony w dużym stopniu do siebie podobne (np.
rekombionacja mejotyczna). Wymaga białek typu RecA; katalizują one
reakcję przeniesienia nici, która umożliwia jednoniciowemu fragmentowi
wniknięcie w strukturę dwuniciową w rejonie homologii (powstaje
przejściowa struktura trójniciowa).
•
Rekombinacja miejscowo specyficzna (np. rearanżacja genów
immunoglobulin) występuje w specyficznych loci, nie wymaga długich
rejonów homologii ani białek typu RecA. Wymaga białka rekombinazy
(integrazy) i krótkich sekwencji palindroomowych w DNA donorowym i
akceptorowym.
•
Rekombinacja nieuprawniona może zachodzić w obecności krótkich
rejonów homologicznych (udział polimerazy RNA), a także przy braku
jakiejkolwiek homologii (np. integracja do genomów roślin) (udział gyrazy, tj.
topoizomerazy II).
Struktura Hollidaya – etap pośredni w rekombinacji
homologicznej