Test mikrojądrowy w badaniach środowiskowych

Otwarte seminaria 2014
Instytut Ekologii Terenów Uprzemysłowionych
w Katowicach
Test mikrojądrowy
w badaniach środowiskowych
mgr Ewa Błaszczyk
Zakład Zarządzania Środowiskowego
Zespół Analiz Ryzyka Środowiskowego
Katowice, 18 września 2014
www.ietu.katowice.pl
Co to są mikrojądra?
Mikrojądra są to struktury zawierające jądrowe DNA
występujące w cytoplazmie, utworzone przez całe
chromosomy lub acentryczne fragmenty chromosomów,
czy też chromatyd.
W mikroskopie obserwowane
są jako mniejsze struktury
zlokalizowane w pobliżu jądra
komórkowego.
Kabalar i wsp. 2012.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Mechanizm powstawania mikrojąder
Bezpośrednie zaburzenia
Złamania
chromosomów
• błędy w naprawie pęknięć DNA;
• brak naprawy pęknięć DNA.
Dysfunkcje aparatu
mitotycznego
• zaburzenia struktury centromeru;
• uszkodzenia włókien wrzeciona
kariokinetycznego;
• zmniejszona produkcja tubuliny.
SKUTEK - Opóźnienie ruchu chromatyd i/lub chromosomów
podczas anafazy, a następnie tworzenie się mikrojąder
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Możliwe konsekwencje powstawania mikrojąder
1) Utrata fragmentów chromosomów z jądra
komórkowego
zwiększa
prawdopodobieństwo
przetasowania genów, co może prowadzić po ich
transpozycji lub amplifikacji do zmiany ekspresji
genów i np. aktywacji różnych onkogenów.
2) Utrata całych chromosomów prowadzi do zmian
liczbowych (aneuploidii) będącej wspólną cechą
wielu nowotworów.
Diler i Celik, 2011.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy
Test mikrojądrowy – metoda służąca do oceny częstości
występowania
mikrojąder
oraz
innych
zmian
cytogenetycznych w warunkach in vitro, in vivo lub in situ,
wykorzystywana w badaniach podstawowych oraz
monitoringu biologicznym środowiska i ludzi .
Pozwala na ocenę:
• uszkodzeń chromosomów i niestabilności genomu;
• zaburzeń procesów cytokinezy;
• zaburzeń potencjału proliferacyjnego;
• procesów śmierci komórkowej.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Materiał do badań
Komórki
Komórki
człowieka
człowieka
Komórki
Komórki
gryzoni
gryzoni
Linie
Linie komórkowe
komórkowe
TEST
TEST
MIKROJĄDROWY
MIKROJĄDROWY
Komórki
Komórki
roślinne
roślinne
Komórki
Komórki ryb
ryb
Komórki
Komórki
mięczaków
mięczaków
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Podstawowe etapy testu mikrojądrowego
1. Przygotowanie materiału
2. Wykonanie preparatów mikroskopowych
3. Utrwalanie materiału
4. Barwienie
5. Analiza mikroskopowa
W zależności od metody i materiału poszczególne etapy
mogą się znacznie różnić!
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy na liniach komórkowych
Materiał do badań:
• linie komórkowe gryzoni - CHO, V79, CHL;
• ludzkie linie komórkowe – BEAS-2B, A549, GM38;
• linie nowotworowe (ludzkie i zwierzęce) – HeLa, HepG2,
Caco-2, TK6 i L5178Y, L41784.
Zastosowanie:
• ocena
właściwości
genotoksycznych
substancji
chemicznych
lub
ich
mieszanin,
produktów
farmaceutycznych (w tym leków), promieniowania,
próbek środowiskowych.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy na liniach komórkowych
Ograniczenia:
• możliwość
prowadzenia
doświadczenia
tylko
na dostępnych liniach komórkowych;
• możliwość prowadzenia badań in vitro tylko na stabilnych
genetycznie liniach komórkowych;
• wymaga
stosowania
aktywacji
metabolicznej
w komórkach nie produkujących enzymów I i II-fazy;
• stosowanie wariantu z cytochalazyną B może wpływać
na uzyskiwane wyniki.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy na liniach komórkowych
Protokoły metodyczne:
• Fenech M. „The in vitro micronucleus technigue”.
Mutation Reserach 455: 81-95, 2000.
• Kirsch-Volders M. i wsp. „Report from the in vitro micronucleus
assay working group”. Mutation Research 540: 153-163, 2003.
• OECD Guideline for the Testing of Chemicals 487.
In vitro mammalian cell micronucleus test, 2010.
• Mosesso P. i wsp. „In vitro cytogenetic assays: Chromosomal
aberrations and micronucleus tests”. Methods in Molecular
Biology 1044: 123-146, 2013.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w limfocytach człowieka
Materiał do badań - limfocyty krwi obwodowej człowieka.
Zastosowanie:
• ocena narażenia zawodowego (metale, WWA, pyły, itp.);
• ocena narażenia środowiskowego (zanieczyszczenia wody, gleby,
powietrza, tj. radon, arsen, pestycydy, metale, formaldehyd, itp.);
• ocena wpływu diety, palenia tytoniu, spożywania alkoholu
i narkotyków, leków i metod leczenia;
• ocena
trwałych
skutków
działania
promieniowania
(tzw. dozymetria biologiczna);
• badania osób chorych z zespołami niestabilności genetycznej
(np. zespół Blooma).
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w limfocytach człowieka
Ograniczenia:
• wymagana jest zgoda Komisji Bioetycznej na badania;
• konieczność poboru próbki krwi od badanego;
• konieczność wprowadzenia i namnożenia limfocytów
w kulturze in vitro;
• stosowanie wariantu z cytochalazyną B może wpływać
na uzyskiwane wyniki.
www.massey.ac.nz
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w limfocytach człowieka
Standaryzacja testu:
• Projekt HUMN (ang. International HUman MicroNucleus Project):
→ powstał
w 1997 r. i dotyczy koordynacji działań światowych
zmierzających
do
zastosowania
testu
mikrojądrowego
w badaniach populacyjnych ludzi;
→ główne cele projektu: wyznaczenie poziomu referencyjnego
częstości mikrojąder, ustalenie czynników wpływających na
zmienność wyników, opracowanie wystandaryzowanego protokołu
metodycznego, wykazanie powiązań między, występowaniem
mikrojąder, a chorobami;
→ koncentruje się na teście mikrojądrowym w limfocytach krwi
obwodowej człowieka.
www.humn.org
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w limfocytach człowieka
Protokoły metodyczne:
• Fenech M. „The in vitro micronucleus technigue”. Mutation Reserach
455: 81-95, 2000.
• Fenech M. „Cytokinesis-block micronucleus cytome assay”. Nature
Protocols 2: 1084-1104, 2007.
• OECD Guideline for the Testing of Chemicals 487. „In vitro mammalian
cell micronucleus test”, 2010.
• Thomas P. i wsp. „Cytokinesis-block micronucleus cytome assay in
lymphocytes”. Methods in Molecular Biology 682: 217-234, 2011.
• Johannes C. i wsp. „Chromosomal aberration test in human
lymphocytes”. Methods in Molecular Biology 1044: 165-178, 2013.
• Bolognesi C. i wsp. „Micronucleus assay in human cells: lymphocytes
and buccal cells”. Methods in Molecular Biology 1044: 191-207, 2013.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych
człowieka
Materiał do badań - komórki nabłonkowe z jamy ustnej,
jamy nosowej, dróg moczowych, pochwy, itp.
Komórka urotelialna
Komórki nabłonkowe z jamy ustnej
Fot. E. Błaszczyk
Salvadori D.M.F. i wsp. 2013.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych
człowieka
Zastosowanie:
• ocena
narażenia
na
czynniki
związane
ze
stylem
życia – palenie tytoniu, picie alkoholu, dieta, higiena jamy ustnej,
promieniowanie elektromagnetyczne;
• ocena narażenia na czynniki obecne w środowisku (WWA, metale,
pestycydy, itd.);
• ocena narażenia zawodowego (WWA, benzen, arsen, pyły,
anestetyki, itd.);
• ocena metod leczenia – radioterapia, chemioterapia i diagnostyką
lekarską – RTG;
• badania osób chorych na nowotwory, z zespołami niestabilności
genetycznej (zespół Blooma) i przedwczesnego starzenia
(zespół Downa, choroba Alzheimera).
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych
człowieka
Ograniczenia:
• wymagana jest zgoda Komisji Bioetycznej na badania;
• ilość i jakość uzyskiwanego materiału;
• mieszanina różnego typu komórek w pobranej próbce;
• ograniczenia metodyczne - trwałość komórek, czas
i warunki przechowywania próbki.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych
człowieka
Standaryzacja testu:
• Projekt HUMNXL (HUman MicroNucleus project on eXfoLiated buccal cells):
→ kontynuacja projektu HUMN dotycząca standaryzacji testu
mikrojądrowego w komórkach nabłonkowych z jamy ustnej;
→ główne cele projektu: wyznaczenie poziomu referencyjnego,
ustalenie czynników wpływających na zmienność, opracowanie
protokołu
metodycznego,
wykazanie
powiązań
między,
występowaniem mikrojąder, a chorobami;
→ wyzwania na przyszłość: określenie czynników genetycznych
wpływających na zmienność występowania mikrojąder, walidacja
systemów do automatycznej analizy wyników, standaryzacja metod
w innych komórkach, badania prospektywne związane z chorobami.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach nabłonkowych
człowieka
Protokoły metodyczne w komórkach nabłonkowych z jamy ustnej:
• Thomas P. i wsp. „Buccal micronucleus cytome assay”. Nature
Protocols 4: 825-837, 2009.
• Thomas P. i wsp. „Buccal micronucleus cytome assay”. Methods in
Molecular Biology 682: 235-248, 2011.
• Bolognesi C. i wsp. „The HUMNXL scoring criteria for different cell
types and nuclear anomalies in the buccal mictonucleus cytome
assay – An update and expanded photogallery”. Mutation
Research 753: 100-113, 2013.
• Bolognesi C. i wsp. „Micronucleus assay in human cells:
lymphocytes and buccal cells”. Methods in Molecular Biology
1044: 191-207, 2013.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach gryzoni
Materiał do badań – głównie komórki szpiku kostnego
i erytrocyty krwi obwodowej myszy lub szczurów.
Zastosowanie:
• ocena toksyczności i mutagenności substancji chemicznych,
związków lub ich mieszanin stosowanych w rolnictwie,
przemyśle oraz farmaceutyków i dodatków do żywności;
• badania
in
vivo
z
zakresu
metabolizmu,
farmakokinetyki,
toksokinetyki oraz procesów naprawy
DNA;
• kolejny etap badań po testach
in vitro.
Shabbar I.M.S. i wsp. 2006.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach gryzoni
Ograniczenia:
• wymagana jest zgoda Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na
Zwierzętach;
• pobór komórek szpiku kostnego oraz z innych narządów
wymaga uśmiercenia zwierzęcia;
• w przypadku badań z wykorzystaniem dojrzałych erytrocytów,
które utraciły jądro komórkowe, należy potwierdzić
niezdolność
śledziony
do
usuwania
erytrocytów
zawierających mikrojądra;
• brak zastosowania w stosunku do substancji, które nie
docierają do szpiku kostnego (bariera krew-mózg).
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach gryzoni
Protokoły metodyczne:
• OECD Guideline for
the Testing of Chemicals 474.
„Mammalian erytrocyte micronucleus test”, 1997; (2013 draft).
• Krishna G. i wsp. „In vitro rodent micronucleus assay: protocol,
conduct and data interpretation”. Mutation Research 455: 155166, 2000.
• Kasamoto S. i wsp. „In vitro micronucleus assay in mouse bone
marrow and peripheral blood”. Methods in Molecular Biology
1044: 179-190, 2013.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach ryb
Materiał do badań:
• głównie erytrocyty
krwi obwodowej, ale również
komórki skrzeli, nerek, wątroby i płetw;
• pozyskiwany od różnych gatunków ryb, w tym karasia, karpia,
troci, pstrąga tęczowego, tilapii nilowej.
Różne typy uszkodzeń w erytrocytach ryb
Kreitsberg R. i wsp. 2012.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach ryb
Zastosowanie:
• ocena w warunkach laboratoryjnych oraz in situ, a także
badania biomonitoringowe z wykorzystaniem rodzimych
gatunków ryb;
• badania wód zanieczyszczonych przez przemysł, sektor
komunalny i rolnictwo (produkty petrochemiczne, WWA,
metale ciężkie, pestycydy, toksyny, chlorowane węglowodory,
pierwiastki promieniotwórcze, itd.).
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach ryb
Ograniczenia:
• wymagana jest zgoda Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na
Zwierzętach;
• uzyskanie erytrocytów lub innych komórek (skrzela, nerki,
wątroba) wymaga uśmiercenia ryby;
• w przypadku komórek wątroby (hepatocytów) ograniczeniem
jest niski indeks mitotyczny;
• różnice wyników związane ze zmienność międzygatunkową;
• wpływ temperatury, zasolenia, pH oraz dostępności pokarmu
na częstość występowania mikrojąder.
Protokoły metodyczne – brak wystandaryzowanego protokołu
metodycznego.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach mięczaków
Materiał do badań – hemolimfa i komórki skrzeli małż,
główne z rodzaju Mytilus (omułki).
Zastosowanie:
• biomonitoring środowiska wodnego;
• ocena wpływu zanieczyszczeń organicznych i nieorganicznych
pochodzących z przemysłu, sektora komunalnego oraz
rolnictwa, itd.;
• ocena wpływu bioakumulacji zanieczyszczeń;
• badania w warunkach laboratoryjnych oraz in situ;
• ocena skutków katastrof i uwolnienia substancji szkodliwych do
środowiska wodnego.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach mięczaków
Ograniczenia:
• dużą zmienność wyników badań in situ;
• sezonowa i geograficzna zmienność występowania mikrojąder
w komórkach mięczaków (temperatura, zasolenie, pH,
dostępność pokarmu);
• heterogenność komórek uzyskiwanych ze skrzeli;
• mniejsza czułość granulocytów obecnych w hemolimfie
w porównaniu do agranulocytów.
Protokół metodyczny:
• Bolognesi C. i wsp. „Mussel micronucleus cytome assay”.
Nature Protocols 7: 1125-1137, 2012.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach mięczaków
Pobór hemolimfy
Bolognesi C. i wsp. 2012.
Różne typy komórek uzyskiwane ze
skrzeli
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach roślin
Materiał do badań:
• komórki stożka wzrostu korzeni cebuli (Allium cepa);
• komórki stożka wzrostu korzeni bobu (Vicia faba);
• komórki ziaren pyłku (tetrady) trzykrotki (Tradescantia).
Fot. E. Błaszczyk
Mišík M. i wsp. 2011.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach roślin
Zastosowanie:
• ocena wpływu substancji i/lub związków oraz mieszanin
występujących w glebie, powietrzu, wodzie (metale,
pierwiastki promieniotwórcze, pestycydy, herbicydy,
nanocząstki, itd.);
• badania próbek wód powierzchniowych i opadowych, wody
do spożycia, wód rzecznych, ścieków, odcieków, osadów,
śniegu i gleby oraz powietrza atmosferycznego i pyłów;
• możliwość stosowania różnych wariantów doświadczeń.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach roślin
Ekspozycja
w glebie
Ekspozycja łodyg
w roztworze
Ekspozycja
na gazy
Ekspozycja
in situ
Ekspozycja na
pływających tratwach
Mišík M. i wsp. 2013.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach roślin
Ograniczenia:
• brak dostępności
dobrze kiełkujących bulw cebuli
(Allium capa) przez cały rok kalendarzowy;
• czasochłonność analizy mikroskopowej;
• zmienność uzyskiwanych wyników;
• brak
silnej
korelacji
pomiędzy
wynikami
testu
mikrojądrowego uzyskanymi na roślinach i zwierzętach.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Test mikrojądrowy w komórkach roślin
Protokoły metodyczne:
• Mišík M. i wsp. „Micronucleus assay with tetrad cells of
Tradescantia”. Methods in Molecular Biology 1044: 405-415,
2013.
• ISO 29200:2013. „Assessment of genotoxic effects on higher
plants - Vicia faba micronucleus test”.
• Tedesco S. i wsp. „Bioindicator of genotoxicity: The Allium cepa
test”. Environmental Contamination 137-156, 2012.
Standaryzacja testu - w ramach międzynarodowego programu
„International Program on Plant Bioassays” przy udziale
Programu Ochrony Środowiska Narodów Zjednoczonych.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Podsumowanie
• Stosunkowo prosta i uniwersalna metoda badawcza.
• Duża dostępność wystandaryzowanych protokołów
metodycznych.
• Szerokie zastosowanie testu mikrojądrowego.
• Możliwość badania wszystkich elementów środowiska.
www.ietu.katowice.pl
www.company.com
Otwarte seminaria 2014
Dziękuję za uwagę
mgr Ewa Błaszczyk
e-mail: [email protected]
Katowice, 18 września 2014
www.ietu.katowice.pl
Otwarte seminaria 2014
Instytut Ekologii Terenów Uprzemysłowionych
w Katowicach
Seminarium było transmitowane on-line przy wykorzystaniu
systemu wideokonferencyjnego zakupionego w projekcie
Rozbudowa infrastruktury informatycznej gromadzenia,
przetwarzania i analizy danych środowiskowych – in2in.
Projekt realizowany w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka i współfinansowany
przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego
www.ietu.katowice.pl