Wpływ zakażenia wirusem PCV2 na rozród świń Thaïs
advertisement
Wpływ zakażenia wirusem PCV2 na rozród świń Thaïs Vila, EMEA, MERIAL SAS, Francja1 Wstęp Poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający (PMWS) zaobserwowano po raz pierwszy w stadach w Kanadzie i Europie, w latach1995/1996, a jego związek z zakażeniem Cirkowirusem świń typu 2 (PCV2) wykazano w roku 1998.W ciągu kolejnych 10 lat, pojawiły się na świecie także inne choroby związane z zakażeniem PCV2. Wszystkie one określane są wspólnie jako choroby cirkowirusowe (PCVD). W ostatnim opracowaniu przeglądowym dotyczącym chorób cirkowirusowych, zaburzenia rozrodu są ostatnio dodaną, szóstą jednostką chorobową spośród wymienionych (Gillespie, 2007). W jej przebiegu opisane są takie zjawiska jak “poronienia, martwo urodzone czy zmumifikowane płody”. Co zaskakujące, na początku wykazywano obecność zakaźnego PCV2 w nasieniu knurów zakażonych drogą naturalną a kolejno pojawiały się doniesienia o obecności DNA PCV2 (w małej ilości) w nasieniu knurów zakażonych podklinicznie. Wiele zespołów badawczych starało się doświadczalnie wykazać możliwość eksperymentalnego zakażenia PCV2 poprzez inokulację nasienia w macicy. Obecnie przyznają oni zgodnie, iż nasienie może być źródłem zakażenia PCV2, co potwierdzają obserwacje terenowe. Celem niniejszego opracowania jest przedstawienie podsumowania dostępnych danych na temat wpływu zakażenia PCV2 na rozród świń oraz wykazanie korzystnego wpływu szczepienia loch przeciw PCV2 na parametry rozrodu. Odkąd wykazano obecność PCV2 w narządach rozrodczych zdrowych knurów (Ciacci-Zanella, 2007a; Gava, 2008) a także chorych, czy bezpłodnych (Kennedy, 2000; Opriessnig, 2006a) oraz eksperymentalnie zakażonych knurków, (Kennedy, 2000) stało się jasne, iż nasienie powinno stać się przedmiotem badań jako możliwe źródło zakażenia PCV2 Czy PCV2 jest obecny w nasieniu? Pierwsze doniesienie o tym, jakoby wirus PCV2 mógł rozprzestrzeniać się z nasieniem knurów pochodzi z kongresu IPVS z 2000 r. od Renée Larochelle (Quebec, Kanada). Jego badania (Larochelle, 2000a) wykazały iż: - Dorosłe knury bez odporności przeciw PCV2 mogą być eksperymentalnie zakażone tym wirusem; - PCV2 jest wydalany z nasieniem krótko po eksperymentalnym zakażeniu młodych knurów, - Wykrywanie obecności PCV2 w nasieniu jest okresowe i ma miejsce przy jednoczesnej obecności przeciwciał w surowicy (wszystkie zwierzęta wykazały serokonwersję do 18 dni po zakażeniu), - Siewstwo występuje przed pojawieniem się przeciwciał, tak więc status serologiczny knura nie jest wiarygodną informacją na temat ewentualnej obecności wirusa w nasieniu. - Miano wirusa w nasieniu może być tak niskie, że wykrywane jedynie metodą nPCR podczas gdy wynik PCR jest ujemny (obie metody wykazywały obecność wirusa w surowicy). Autor nadmienił, iż czułość nPCR jest większa od klasycznego PCR stosowanego w tamtym czasie o rząd wielkości.2 (Larochelle, 2000b), 1 29, avenue Tony Garnier - BP 7123 - 69348 Lyon Cedex 07 (France). Tel: +33(0)4 72 72 44 27. W przypadku PCR było to 1,000-krotnie, a dla nPCR 10,000 krotnie poniżej poziomu wykrywalności zakażenia kultur komórkowych za pomocą immunofluorescencji pośredniej. 2 2 - Nie zostało wyjaśnione, czy wirus w nasieniu występował w postaci wolnej, czy związany był z plemnikami, czy innymi komórkami obecnymi w nasieniu, ani czy był zakaźny. Pierwsze doniesienie o wykryciu genomu PCV2 w próbkach nasienia (2/34) pochodzi z Kanady (Hamel, 2000). Sześć spośród badanych próbek okazało się pozytywnymi w badaniu nPCR. W rezultacie, “sztuczne unasiennianie oraz krycie naturalne muszą być wzięte pod uwagę jako potencjalne drogi szerzenia zakażenia PCV2 wśród materiału zarodowego ” (Segalés, 2002). Podobne wyniki opublikowano we Francji(Le Tallec, 2001), Korei (Kim, 2001; Kim, 2003), Austrii (Schmoll, 2003 & 2007), Kanadzie (McIntosh, 2006), USA (Opriessnig, 2006a; Reicks, 2007), Brazyli (Ciacci-Zanella, 2007b), oraz Niemczech (Schmoll, 2007). Prewalencja zakażenia kształtowała się od umiarkowanej (15%, Schmoll, 2003) do wysokiej (30%, Kim, 2001). Choć wielu badaczy koncentrowało się na potencjalnej zakaźności nasienia, nie znaleziono jednak na to dowodów (Wallgren, 2002; Wattang, 2002; Nielsen, 2004; Lawton, 2004; Bergström, 2006; Enøe, 2006; Hansen, 2010). Czy PCV2 obecny w nasieniu może spowodować zakażenie? Rzadko cytowane, wczesne badania koreańskie, wykazały obecność zakaźnego PCV2 w mrożonym nasieniu. Pobrano 60 próbek nasienia (od 30 knurów), które zamrożono a następnie odmrożono i odwirowano. Kolejno zakażono wolne od PCV komórki Pk-15 i przeprowadzono 2 pasaże (Kim, 2001). Nie zaobserwowano efektu cytopatycznego po 5 dniach inkubacji. Jednakże w czterech próbkach (6.7%), za pomocą hybrydyzacji in situ wykazano w cytoplaźmie zakażonych komórek obecność kwasów nukleinowych PCV2. W tych samych czterech próbkach wykazano za pomocą klasycznego PCR obecność PCV2 w supernatancie pobranym po 2 pasażu. Następnie udało się z tych czterech próbek wyizolować wirus. Rozstrzygający dowód pochodził z próby biologicznej przeprowadzonej na Stanowym Uniwersytecie w Iowa (USA). Nasienie zawierające wirusa, w wyniku naturalnej infekcji, podawano dootrzewnowo świniom, wolnym od zakażenia PCV2, uzyskując zakażenie (Madson, 2009a). Jednakże dopochwowe zakażenie loch wolnych od zakażenia PCV2 nasieniem zawierającym wirusa nie powiodło się ani w stosunku do samicy jak i potomstwa (2009b). Gdy użyto nasienia zawierającego wirusa (w wyniku celowego skażenia nasienia wirusem), wszystkie zakażone lochy wytworzyły przeciwciała oraz przekazały PCCV2 prosiętom (Madson, 2009b). Inne badania stosujące także model z użyciem nasienia zawierającego wirusa (w wyniku celowego skażenia nasienia wirusem) potwierdziły możliwość zakażenie i wywołania wiremii oraz urodzenia siejących wirusa prosiąt, oraz obecność - PCV2-DNA - pozytywnej siary (Madson, 2009c). Czy PCV2 jest obecny w macicy loszek/loch? W badaniach kanadyjskich skoncentrowano się na analizie występowania PCV2 w obrębie układu rozrodczego oraz oocytów seropozytywnych loszek (Bielanski, 2004).Materiał stanowiły surowice oraz układy rozrodcze pobrane w rzeźni. Pobrano go od 55 loszek w wieku pomiędzy 5 a 8 miesięcy. Wszystkie 55 loszek miało przeciwciała anty PCV2 lecz u 9% otrzymano wynik negatywny w badaniu PCR surowicy oraz w układzie rozrodczym. DNA PCV2 wykryto w różnych odcinkach układu rozrodczego u 78% loszek. Ponad połowa loszek u których stwierdzono wiremię była pozytywna w badaniu PCR komórek jajowodów (31/55: 56%). Ponad jedna trzecia miała DNA wirusa w wypłuczynach z macicy (20/55: 36%), a 6/55 (11%) w oocytach. Pomimo, iż pozostałe 13% loszek było wiremicznych, nie wykryto u nich DNA PCV2 w układzie rozrodczym. Komórki warstwy ziarnistej oraz jajowodu mogą być uważane za potencjalne źródło skażenia materiału PCV2 w czasie procedur zapłodnienia in vitro. Czy istnieje możliwość zakażenia przez łożysko? Liczne badania dowodzą, iż istnieje możliwość zakażenia środmacicznego PCV2 u prośnych loszek i loch. W swojej pracy doktorskiej, Sanchez (2003a) wykorzystał loszki SPF w wieku 8 miesięcy, bez przeciwciał 3 anty PCV2. Zakażano je PCV2 poprzez błony śluzowe jamy nosowej i ustnej. W czasie eksperymentu nie obserwowano klinicznych objawów zakażenia, ale genom PCV2 wykrywany był metodą ilościowego PCR u trzech z czterech świń w ilości 14 do 49 DPI – dni po infekcji - (jedynie u jednej, pozostałej 14 DPI). DNA PCV2 wykryto u wszystkich czterech loszek’ PBMC od 14 do 63 DPI (na końcu badań); dwie loszki były pozytywne od 7 DPI wzwyż. Te wyniki potwierdzają możliwość wiremii u samic zakażonych po raz pierwszy. Choć jej poziom jest niski, a zwierzęta wytwarzają szybką odpowiedź immunologiczną, trwa ona jednak długo. Autor podkreśla, iż:” wiremia jest kluczowym, pierwszym krokiem w pionowym przenoszeniu wirusa od matki do płodu”. Długotrwała wiremia obserwowana podczas badań „potencjalnie sprzyja wystąpieniu takiego zjawiska”. W nowszych badaniach, koncentrujących się na ocenie skuteczności szczepienia matek na replikację PCV2 in vitro, użyto loch SPF bez przeciwciał anty PCV2 pochodzących z jednego źródła (Madson, 2009d). W nieszczepionej grupie kontrolnej zakażenie PCV2 poprzez błony śluzowe jamy nosowej I ustnej w 56 dniu ciąży nie wywołało żadnych objawów klinicznych ani wpływu na miot prosiąt. Jednak u dwóch spośród trzech loch z tej grupy rozwinęła się wiremia PCV2, która trwała od 4 do 7 tygodni a w przypadku jednego zwierzęcia DNA PCV2 w surowicy wykrywalne było jeszcze w momencie odsadzenia. U jednego spośród 35 zbadanych, żywo urodzonych prosiąt (3 mioty), jeszcze przed rozpoczęciem ssania wykryto DNA PCV2. U wszystkich loch natomiast wykryto DNA PCV2 w siarze. Śródmaciczne zakażenie płodów można także podejrzewać w grupie loch szczepionych3 zakażonych doświadczalnie. Wśród prosiąt urodzonych przez te lochy , u 3 z 45 żywo urodzonych(3 mioty) wykrywano DNA PCV2 jeszcze przed rozpoczęciem ssania. Wpływ takiego zakażenia środmacicznego na stan zdrowia i parametry produkcyjne nie został oszacowany, gdyż zwierzęta zostały uśmiercone, by wykonać sekcję zwłok w dniu porodu. “ Podsumowując, zakażenie PCV2 prośnej lochy wolnej od swoistych przeciwciał może nie tyle powodować zaburzenia rozrodu, co związane być może z zakażeniem płodu”. Autorzy podkreślają, iż ich obserwacje dowodzą, że: “przenoszenie zakażenia PCV2 na drodze pionowej zdarza się w warunkach terenowych częściej niż do tej pory sądzono”. Należy zaznaczyć, iż ten sam model eksperymentalny został przez tych samych autorów użyty do oceny wpływu narażenia na zakażenie przed kryciem na przebieg ciąży (Madson, 2009c). Grupę trzech wieloródek SPF, bez przeciwciał dla PCV2, zaszczepiono4 8 tygodni przed unasiennianiem, podczas gdy inna grupę 3 wieloródek SPF, bez przeciwciał dla PCV2, zakażono podając wirus na błony śluzowe jamy ustnej i nosowej 12 tygodni przed unasiennianiem. Tylko dwie z pośród zainfekowanych loch zaszły w ciążę. U jednej z nich stwierdzono wiremię w czasie ciąży oraz wykrywano u niej DNA PCV2 w siarze. U 15 spośród 24 żywo urodzonych prosiąt stwierdzono wiremię jeszcze przed rozpoczęciem ssania. W grupie narażonej na zakażenie skutecznie zainseminowano I doprowadzono do porodu 3 samice. U dwóch z nich stwierdzono w przebiegu ciąży wiremię. U żadnej nie stwierdzono wykrywalnych ilości DNA PCV2 w siarze. Wiremii nie stwierdzono, przed rozpoczęciem ssania, u ani jednego z 25 żywo urodzonych prosiąt. Autorzy potwierdzają, iż:“ odporność przeciw PCV2 indukowana szczepieniem loch nie jest w stanie zapobiec zakażeniu środmacicznemu w modelu w którym stosuje się nasienie zawierające wirusa(w wyniku celowego skażenia nasienia wirusem), co jest w sprzeczności z rezultatami uzyskanymi u matek eksponowanych wcześniej na wirus homologiczny”. 3 Szczepienie wykonano u loch w 28 dniu ciąży podając 1 ml szczepionki CircoFlex® (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.). 4 Szczepienie wykonano u loch podając 1 ml szczepionki CircoFlex® (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.). 4 W innych badaniach, pochodzących z Korei Południowej, badano wpływ śródmacicznego zakażenia PCV2 na biegunkę nowonarodzonych prosiąt wywołaną przez (PEDV)- wirus epidemicznej biegunki świń (Jung, 2006). Sześć prośnych loch podzielono losowo na grupę zakażonych (n=3) oraz grupę kontrolną (n=3). Zwierzęta infekowano donosowo na 3 tygodnie przed spodziewanym wyproszeniem. Trzydzieści prosiąt od loch zakażonych PCV2 podzielono losowo na 2 grupy (A i B) po 15 prosiąt każda. Inna grupa trzydziestu prosiąt od loch niezakażonych została także podzielono losowo na 2 grupy (C i D) po 15 prosiąt każda. Prosięta z grup A oraz C zostały w 3 dniu życia doustnie zakażone PEDV. W grupie A, po 24h od zakażenia, wykryto w tkankach jelit zdecydowanie więcej kwasów nukleinowych PEDV (p<0.05) niż po tym samym czasie, w tych samych tkankach prosiąt z grupy C. Stan ten utrzymywał się po 36, 48, 60, oraz 70 h po zakażeniu (p<0.05). Autorzy wnioskują, iż kliniczny przebieg choroby wywoływanej przez PEDV był wyraźnie modyfikowany w wyniku śródmacicznego zakażenia PCV2. Wpływ PCV2 na zarodki. W badaniach kanadyjskich (Bielanski, 2004) pobrano 120 zarodków, od 6 loch z przeciwciałami dla PCV2, w 3 do 6 dni po kryciu tym samym knurem bez przeciwciał dla PCV2. W badaniu PCR u żadnego z badanych zarodków nie wykazano obecności materiału genetycznego PCV2. Pomimo tego autorzy sugerują, że z powodu małych rozmiarów PCV2 „ma potencjał wbudowania się głęboko w porowatą strukturę osłonki przejrzystej a nawet przekroczyć ją, co opisano w przypadku PPV, który ma nieco większą średnicę niż PCV2”. Później, w kolejnych badaniach, jednak nie zostało to dokładnie zweryfikowane. Przeprowadzono wiele badań na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej w Gent (Belgia), które wykazały, iż tak długo jak osłonka przejrzysta (ZP) płodu pozostaje nietknięta, wniknięcia PCV2 nie stwierdza się nawet po 48h ekspozycji in vitro (Mateusen, 2007). W innych badaniach autorzy pozyskali zarodki od loch z odpornością na PCV2 w 6 dni po unasiennianiu. Hodowali blastocysty, które eksponowali następnie na PCV2. Zakażone (oraz kontrolne niezakażone) zarodki umieszczano następnie w macicach odpowiednio przygotowanych odpornych na PCV2 biorczyń. Lochy biorczynie były po 14 dniach uśmiercane a pozyskane embriony badano za pomocą testu immunoperoksydazowego IPMA 5 (w celu wykrycia obecności antygenu PCV2). W przypadku loch biorczyń współczynnik przeżywalności zarodków drastycznie spadł (6,4% dla narażonych na PCV2 podczas gdy w grupie kontrolnej było to 65,4%, p<0,05). Wszystkie zarodki narażone na zakażenie PCV2 okazały się dodatnie w zastosowanym w teście. Zarodki niezdolne do przeżycia były silnie dodatnie. U czterech spośród siedmiu zdolnych do przeżycia wykryto pojedyncze lub mała liczbę komórek PCV2 pozytywnych w łożysku, zawiązku nerki, cewie nerwowej czy wątrobie. Na tym etapie nie wykazano obecności wirusa w komórkach serca, co stwierdzane jest w późniejszych fazach zakażenia śródmacicznego. U pozostałych trzech zarodków narażonych na zakażenie uzyskano w teście ICH wynik ujemny6. Badania te jednoznacznie wykazały, iż zakażenie zarodków PCV2 może prowadzić do ich zamierania a w rezultacie utraty ciąży. Konsekwencje zakażenia płodów. Najmocniejszych dowodów na wpływ zakażenia sródmacicznego płodów dostarczyli wirusolodzy z Wydziału Medycyny Weterynaryjnej w Ghent (Belgia).U prośnych loch w 57, 75 oraz 92 dniu ciąży zakażano śródmacicznie po 2 . 6 Autorzy nie byli w stanie stwierdzić, czy wynikało to z indywidualnych różnic wwe wrażliwości na zakażenie PCV2 czy embriony te pozbyły się zakażenia przed 14 dniem w wyniku apoptozy. 5 płody (Sanchez, 2003a). Dwadzieścia jeden dni po zakażeniu zwierzęta były uśmiercane a następnie wydobywano macice w celu pozyskania płodów. Jako kontroli pozytywnej użyto czterodniowych prosiąt CDCD (zyskane w wyniku cesarskiego cięcia, które nie otrzymały siary) zakażonych tym samym materiałem (donosowo i dotchawiczo) (Sanchez, 2003b). U wszystkich zakażonych płodów udało się wyizolować PCV2, ale jedynie serce było organem z którego izolacja udała się bez względu na czas trwania ciąży w momencie zakażenia. Antygeny wirusowe były w czasie życia płodowego wykrywane w komórkach mięśnia sercowego, hepatocytach, makrofagach podczas gdy po urodzeniu stwierdzano ich obecność jedynie w makrofagach. Zakażone makrofagi stwierdzane były we wszystkich typach zbadanych tkanek (serca, wątroby, płuc, śledziony oraz węzłów chłonnych pachwinowych) zarówno u płodów, jak i prosiąt. Największą liczbę komórek mięśnia sercowego zakażonych PCV2 stwierdzano u płodów „w wieku 57 dni” a kolejne pomiary w 75 oraz 92 dniu wykazały tendencję spadkową (p<0.05).Także w 57 dniu ciąży zanotowano największą liczbę zakażonych hepatocytów oraz makrofagów (p<0.05), która spadała m miarę trwania ciąży. Większe zaburzenia obserwowano jedynie u płodów zakażonych w dniu 577, co w zestawieniu z bardziej intensywną replikacją wirusa w tym czasie wskazuje na udział PCV2 w ich powstawaniu. Te badania wskazują, iż komórki docelowe dla wirusa zmieniają się stopniowo w czasie życia płodowego od komórek mięśnia sercowego, hepatocytów czy makrofagów do jedynie makrofagów w życiu pozapłodowym. W trwającym dłużej eksperymencie zastosowano te same procedury wobec 3 loch odpowiednio w 57, 75 oraz 104 dniu ciąży (Sanchez, 2003a). Prosięta pozyskano w 114 dniu ciąży w wyniku historektomii lub naturalnego porodu. PCV2 izolowany był z mięśnia sercowego obu prosiąt zakażonych w 57 dniu ciąży, dwóch sąsiadujących z nimi prosiąt8. Dwa prosięta urodzone przez lochę, której płody zakażano w 75 dniu było także dodatnich ale nie można było stwierdzić z całą pewnością, iż były to te płody, które zakazano śródmacicznie. Wszystkie prosięta, zakażane jako płody w 104 dniu ciąży były PCV2 wolne od wirusa. Tak więc, PCV2 jest zdolny do namnażania się w płodzie w różnych stadiach prośności mogąc powodować uszkodzenia płodu a nawet śmierć jeśli do zakażenia dojdzie w połowie ciąży. Powolne rozprzestrzenianie się wirusa w macicy (wirus wykryto jedynie u płodów sąsiadujących z tymi zakażonymi w 57dniu) nie zakłóca przebiegu ciąży. Praktyczne aspektyt zaburzeń w rozrodzie związane z zakażeniem PCV2 Informacje o zaburzeniach w rozrodzie związanych z zakażeniem PCV2 pojawiają się w piśmiennictwie z całego świata. Pierwsze doniesienie o pojawieniu się masowych zaburzeń w rozrodzie na fermie świń pojawiło się w roku 1999 i pochodzi ono z zachodniej KanadyW pracy tej napisano:”PCV2 został wyizolowany z miotu poronionych prosiąt z fermy na której występują problemy w postaci poronień wysokiej ciąży oraz śmierci płodów.” U jednego prosięcia w badaniu IPMA wykazano intensywną reakcję barwną dotyczącą zmian patologicznych w przebiegu rozległego, rozlanego zapalenia mięśnia sercowego. “Obecność antygenu PCV2 stwierdzano także w różnych ilościach, u wielu płodów w wątrobie, płucach oraz nerkach” podczas gdy testy na PPV, PRRSV, EMVC oraz enterowirusy dały wynik negatywny (West, 1999). W tym samym roku opisano kolejny poważny problem z rozrodem na liczącej 3 tysiące loch fermie w zachodniej Kanadzie 7 Jeden był uderzająco blady a 3 inne były obrzęknięte z powiększonym obrysem jamy brzusznej. Zmiany krwotoczne przekrwienie narządów oraz powiększenie wątroby stwierdzono u wszystkich 4 płodów. 8 Prosięta te razem z tymi zakażonymi, miały wady rozwojowe. , 6 (O’Connor, 2001). W Kanadzie stwierdzano więcej podobnych problemów związanych z rozrodem (Josephson and Charbonneau, 2001; Sanford, 2002)9. We wszystkich przypadkach zaburzenia rozrodu były jednoznacznie skorelowane z zakażeniem PCV2 przy jednoczesnym braku innych zakażeń mogących odpowiadać za podobne problemy. U martwych oraz nowonarodzonych prosiąt stwierdzano rozszerzenie oraz wiotkość serca a także martwicowe zmiany zapalne mięśnia sercowego, o dużej intensywności występowania w nich PCV2. W przypadku Stanów Zjednoczonych pierwszy opisany przypadek zaburzeń rozrodu związanych z zakażeniem PCV2 pochodzi ze stanu Iowa (Janke, 2000). Wystąpił on na fermie o zamkniętym cyklu produkcji gdzie zakażone były zarówno knury jak i lochy. Zwierzęta wykazywały objawy: ”bardzo sugerujące zakażenie parwowirusem lecz badania laboratoryjne nie potwierdzały obecności PPV”. Z płodów wyizolowano PVC2 a badaniach histopatologicznych stwierdzono: ”rozlane, zapalenie mięśnia sercowego”, przy braku zmian makroskopowych w sekcji. Problemy z rozrodem trwały przez „około trzy miesiące, po których lochy znów rodziły normalne, duże mioty”. Ukazało się wiele innych doniesień ze Stanów Zjednoczonych (patrz Sorden, 2001; Meehan, 2001, Halbur, 2003 & 2004; Opriessnig, 2006b & 2006c). W roku 2008 pojawiły się masowe problemy z rozrodem na fermie o wieloetapowym systemie produkcji liczącej 2,400 loch. Zaburzenia wyglądały zupełnie jakby spowodowane były przez PPV lecz możliwe iż to PCV2 „odegrał tam znaczącą rolę”. (Woods, 2009). Jedyne udokumentowane doniesienie z Ameryki Południowej pochodzi z Wenezueli (Bermúdez, 2008) z dwóch farm na których nie występuje PRRSV. W roku 2000 w wyniku “badań epidemiologicznych w stadach produkcyjnych w Europie Zachodniej” uzyskano dane wskazujące na to, iż ”PCV2 może zakażać płody śródmacicznie pomiędzy 32 a 114 dniem ciąży”. Zakażenia te prowadzą do 0,5% mumifikacji płodów oraz ronień na różnych etapach ciąży a także zwiększonej częstości rodzenia się słabych czy martwych prosiąt (Ohlinger et al, 2000). W roku 2001 opisano przypadek zakażenia sródmacicznego loszki w Danii (Ladekjaer-Mikkelsen, 2001). Miot prosiąt pochodzący ze stada SPF należącego do Duńskiego Instytutu Weterynaryjnego składający się z 10 martwych prosiąt: jeden płód był zmumifikowany, osiem płodów zmarło w wysokiej ciąży a jedno prosię urodziło się martwe. Stado to było wolne od PPV (oraz innych patogenów). Loszka urodziła w 121 dniu ciąży, bez wyraźnych objawów klinicznych. Izolacja wirusa z tkanek martwych płodów na liniach komórkowych wykazała obecność jedynie PCV2. Badanie IPMA dało taki sam rezultat; wykazano obecność przeciwciał przeciw PCV2 w płynie z otrzewnej od prosiąt „potwierdzając tym samym, iż prosięta zostały zakażone PCV2 śródmacicznie”. Q-PCR ( ilościowymy testem PCR) oszacowano liczbę kopii PCV2 DNA jako 1011 /g tkanki. Stado pozostawało seronegatywne przez lata 1999 oraz 2000. W końcu stycznia roku 2001 całe stado miało wysokie miano przeciwciał, „co wskazywało, iż w stadzie musiało dojść do ostrego zakażenia PCV2 w styczniu”. Nowsze dane pochodzą z Norwegii, gdzie także opisano zamieranie płodów oraz wysoką śmiertelność prosiąt związane z zakażeniem PCV2 w nowo utworzonym stadzie (Brunborg, 2007). Jeszcze bardzie aktualne dane na temat masowych problemów w rozrodzie związanych z PCV2 pochodzą także z Danii (Hansen, 2010). Duńskie stado SPF zostało zlikwidowane w związku z wystąpieniem PMWS, a po oczyszczeniu i dezynfekcji zasiedlone grupą 434 ciężarnych loszek SPF. Były one po inseminacji kupione z jednego źródła. W stadzie pochodzenia wykonano inseminację loszek (nasieniem pochodzącym od 56 knurów) pomiędzy 27 listopada 2005r a 21 stycznia roku 2006. Wydaje się, iż pierwsze płody zaczęły umierać na początku lutego (oceniono na podstawie badania zamarłych w macicy płodów). Loszki trafiły do nowego stada 9 marca 2006 (54% płodów zamarło przed ta datą). 9 Praca ta opisuje 7 stad z czego 2 zostały też opisane przez Josephsona, 2001. 7 Największe nasilenie zaburzeń w rozrodzie rozpoczęło się 23 marca a zakończyło około 20 kwietnia 2006. Parametry dotyczące rozrodu u loszek wróciły do normy w końcu kolejnego miesiąca. W czasie wybuchu epidemii sześć loszek poroniło (pomiędzy 38 a 92 dniem ciąży), podczas gdy 133 loszki urodziły a dwie padły. Pozostałe loszki nie wykazywały żadnych objawów klinicznych. Jednakże parametry hodowlane dla miotu były gorsze niż średnio w Danii (Danish key figures DKF): 10,9 żywo urodzonych (DKF 13), 2,5 martwo urodzonych (DKF 1,6), 1,6 pozostałych było zmumifikowanych. Wszystkie żywo urodzone prosięta wydawały się zdrowe a śmiertelność przed odsadzeniem wyniosła 4,8% (DKF 14%). Po dogłębnych badaniach wyciągnięto wnioski, iż wzrost liczby zmumifikowanych czy martwo urodzonych płodów wraz ze zmianami w mięśniu sercowym i wykazaniu obecności PCV2 in situ spełnia wszystkie kryteria by zakwalifikować te zmiany jak zaburzenia rozrodu związane z zakażeniem PCV2 (patrz poniżej). Najnowsze prace opisują zaburzenia rozrodu wynikające z zakażenia PCV2 we Francji (Müller, 2009; Fily, 2009). We wschodniej oraz środkowej Europie także występowały zaburzenia rozrodu związane z zakażeniem PCV2 (Bilkei G, dane niepublikowane), lecz opublikowano jedynie kilka prac. Jedna z ostatnich prac wykazujących związek pomiędzy problemami związanymi z reprodukcją a zakażeniem PCV2 pochodzi z Republiki Czeskiej (Zizlavsky, 2008). Badania te objęły łącznie 232 poronione płody oraz martwo urodzone prosięta dostarczone do laboratorium w latach 2005 do 2007 w celach diagnostycznych. Obecność PPV w tkankach płodów i prosiąt spadała znacząco z czasem trwania badań (30.4% w 2005; 3.5% w 2007). Podobny, istotny spadek zaobserwowano dla PRRSV (52.2% w 2005; 34.6% w 2006; 5% w 2007). W przypadku PCV2 sytuacja przedstawiała się wprost przeciwnie (21.7% w 2005; 54.1% w 2007). Autorzy pracy podkreślają, iż najczęstszą przyczyną zaburzeń rozrodu u loch w republice Czeskiej jest obecnie PCV2. W Azji PCV2 został wyizolowany od 8 dniowego, słabego w momencie urodzenia prosięcia w czasie epizodu zaburzeń rozrodu w Japonii (Mikami, 2005). W ostatnim czasie pojawiły się, w dwóch kolejnych pracach pochodzących z Indii, doniesienia o poważnych epidemiach problemów związanych z reprodukcją będących skutkiem zakażenia PCV210 (Rinku & Saikumar, 2008 & 2009). Jakie są objawy kliniczne zaburzeń w rozrodzie? W roku 2001 Steve Sorden (Uniwersytet Stanowy Iowa, USA) ogłosił: “mieliśmy wiele przypadków, w których wykazano obecność PCV2 w poronionych płodach świń. Typowe sytuacje to loszki rodzące zmumifikowane płody. Najczęstszą zmianą stwierdzaną w badaniu pośmiertnym było zapalenie mięśnia sercowego z dużą ilością antygenu PCV2 w obrębie zmian. Jednocześnie w badaniu PCR płynu z klatki piersiowej wykazano obecność DNA PCV2. Podobne przypadki były opisywane w piśmiennictwie” (Sorden, 2001). W roku 2003, Halbur i wsp. (Laboratorium wirusologiczne, Uniwersytet Stanowy Iowa) piszą: “zaburzenia rozrodu wynikające z zakażenia PCV2 pozostają często nierozpoznane. Jeśli zostanie zdiagnozowane, to najczęściej stwierdza się u płodu limfohistiocytarne zapalenie mięśnia sercowego oraz/lub jego zwłóknienie. Zmiany te, aby mogły zostać uznane za wywołane przez PCV2, powinny dodatkowo zawierać dużą ilość antygenu tego wirusa. Poronienia związane z zakażeniem PCV2 występują sporadycznie a charakteryzuje je raczej wzrost liczby zmumifikowanych płodów” (Halbur et al, 2003). Opisy te pasują do większości opisów wybuchów tej choroby opublikowanych dotychczas na świecie. W jednej z najnowszych prac Hans Nauwynck (2009) sugeruje zbadanie wpływu zakażenia PCV2 na zespół SMEDI (Stillbirth- rodzenie martwych płodów, Mummificatio -mumifikacja płodów, Embrionic Death- śmiertelność zarodkowa, Infertility- niepłodność). Jak donosi najnowszy artykuł z 10 Autor miał dostęp jedynie do streszczenia obu publikacji. 8 Danii, dotyczący problemów z rozrodem związanych z zakażeniem PCV2 w tym kraju, mniej nasilona forma zburzeń w rozrodzie może jednak pozostać niezauważona (Hansen, 2010). W badaniach tych wykazano, iż PCV2 był wykrywany u płodów w teście IHC, w ciągu 9 dni trwania 8 tygodniowego wybuchu choroby. „Może to wynikać z obiektywnych trudności diagnostycznych w praktyce, gdyż materiał trafia do badania w laboratorium gdy problemy z rozrodem trwają już jakiś czas. W konsekwencji rola PCV2 w zaburzeniach rozrodu może być niedoszacowana.” Jak rozpoznawać zaburzenia w rozrodzie wynikające z zakażenia PCV2? Aby postawić diagnozę, iż problem z rozrodem wynikają z zakażenia PCV2 powinny być spełnione następujące kryteria: (Segalés i wsp., 2006) -wzrost liczby poronień i/lub martwo urodzonych czy zmumifikowanych płodów, -współistniejące włóknikowe i/lub martwicze zmiany w mięśniu sercowym z potwierdzoną obecnością PCV2 w obrębie zmian patologicznych. W badaniach francuskich (Fily, 2009) wykazano, iż w niektórych przypadkach, gdy nie można wykryć PCV2 w mięśniu sercowym płodów za pomocą PCR, można za pomocą testu ELISA stwierdzić obecność przeciwciał przeciw wirusowi w płynie z klatki piersiowej i/lub jamy brzusznej. To uzupełniające narzędzie diagnostyczne może być jednak stosowane jedynie w przypadku prosiąt dłuższych niż 17 cm (gdy płód jest już immunokompetentny, czyli po ok 70 dniu ciąży). W jednej z najnowszych prac (Hansen, 2010) porównano wyniki badania mięśnia sercowego poronionych płodów na obecność PCV2 metodą IPMA z pomiarem ilości DNA wirusa (techniką ilościowego PCR) w tej tkance. U wszystkich płodów, które w badaniu tym okazały się pozytywne uzyskano w qPCR wartości powyżej 108 PCV2 genomów na 500 ng DNA a u większości IPMA negatywnych płodów wartości te były niższe. W konsekwencji autorzy wnioskują iż:” wykrycie więcej niż107 kopii genomu PCV2 w 500ng DNA w tkankach poronionego, martwo urodzonego czy zmumifikowanego płodu, powinno kwalifikować dane zaburzenie rozrodu jako wywołane zakażeniem PCV2,” jednakże już wykrycie104 do 107 kopii genomu PCV2 powinny być traktowane jako przesądzające o rozpoznaniu11. Autorzy sugerują ponadto iż: “oznaczenie metodą ilościowego PCR u jednego płodu więcej niż 107 kopii genomu PCV2 w 500 ng DNA lub wykrycie u przynajmniej dwóch płodów od 104 to 107 kopii genomu PCV2 pozwala postawić rozpoznanie, iż za zaburzenia rozrodu w tym przypadku, odpowiedzialny jest PCV2”. To podejście może okazać się przydatne w praktyce, gdyż PCR jest alternatywą do IHC w przypadku poważnie odwodnionego materiału pochodzącego ze zmumifikowanych płodów. Korzyści wynikające ze szczepienia loch przeciw PCV2. Po tymczasowym zarejstrowaniu szczepionki CIRCOVAC® w Niemczech, w roku 2004 zarówno lekarze, jak i właściciele stad zaczęli obserwować trwałą poprawę parametrów dotyczących rozrodu. By ocenić efekt stosowania szczepionki, przeprowadzono badania terenowe na szeroką skalę, dotyczące 277 stad loch, w których stosowano CIRCOVAC od co najmniej 6 miesięcy (Joisel, 2008). Średnia liczba prosiąt otrzymana w ciągu roku od lochy wzrosła o 1,13 (p=0.0001). Dane za ten sam okres otrzymane od organizacji hodowców nie wykazały żadnego polepszenia się parametrów dotyczących rozrodu w niemieckim przemyśle hodowlanym. Wpływ szczepień przeciw PCV2 badano także w Danii na populacji 14,510 loch pochodzących z 34 stad w których występuje PMWS, analizując dokumentację 11 Autorzy obniżyli próg z 8 do 7 ponieważ nie można było ustalić, czy niski poziom PCV2 wynikał z zanieczyszczenia płodów 10 10 wirusowym DNA w czasie sekcji czy w laboratorium. 9 prowadzoną na farmach. (Kunstmann, 2008). U loch szczepionych liczba odchowanych prosiąt w ciągu roku wzrosła, zrównując się ze średnią ogólnokrajową. Ponadto we Francji przeprowadzono szczegółowe badania na populacji 140 loch pochodzących z chlewni o pełnym cyklu produkcji. W chlewniach tych szczepiono lochy, w celu zwalczania chorób cirkowirusowych (PCVD) u prosiąt i warchlaków a przy okazji zauważono poprawę parametrów dotyczących rozrodu (które uważane były przed szczepieniami za dobre) (Vila, 2009). Szczepienie12 loch rozpoczęto w marcu roku 2008, ponieważ opiekujący się stadem lekarz weterynarii zauważył niejasne, różne objawy kliniczne u prosiąt, mogące być wynikiem spadku odporności na tle PCVD (nie było potwierdzenia laboratoryjnego). Oprócz poprawy statusu zdrowotnego warchlaków oraz tuczników nieoczekiwaną korzyścią ze szczepienia była poprawa parametrów rozrodczych: liczba urodzonych prosiąt w miocie, wzrost liczby żywo urodzonych oraz odsadzonych prosiąt w miocie (około +0.9 prosięcia odsadzonego w miocie). Co więcej, analiza zmiennej liczby prosiąt odsadzonych w poszczególnych miotach wykazała większą jednorodność wielkości miotu w przypadku loch szczepionych. Efekt ten wykazano jako niezależny od zmienności sezonowej. Obserwacje te przyniosły kolejne dowody na to, iż PCV2, może mieć wpływ na procesy rozrodu a immunizacja loch z użyciem szczepionki CIRCOVAC może przynieść znaczące korzyści. Wnioski: Wiedza na temat związku PCV2 z problemami w rozrodzie świń pogłębia się każdego dnia, gdyż wciąż pojawiają się nowe dane z terenu, łączące zakażenie PCV2 z problemami w rozrodzie. Spośród pytań, które wymagają odpowiedzi w najbliższej przyszłości należy wymienić: - Jaka jest minimalna dawka wirusa, w nasieniu zakażonego knura, potrzebna do zakażenia? - Czy szczepienie knurów jest skuteczne w zapobieganiu szerzenia się zakażeń PCV2 z nasieniem (jak do tej pory nie ma odpowiednich danych by uznać za fakt) - Jak prawidłowo diagnozować laboratoryjnie zaburzenia w rozrodzie związane z zakażeniem PCV2? - Jaka jest częstość występowania problemów związanych z reprodukcją trzody chlewnej w następstwie zakażeń prośnych loch PCV2? Piśmiennictwo w redakcji. .
