Konstrukcja genetycznie modyfikowanych roślin i zwierząt GMO
advertisement
Konstrukcja genetycznie modyfikowanych roślin Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin • 1953 - Odkrycie struktury DNA • 1958 - Wyizolowanie polimerazy DNA z E. coli (można syntetyzować DNA in vitro) - Kornberg • 1963 - Odkrycie kodu genetycznego (poznanie zasad trójkowego kodowania informacji genetycznej) – Crick Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin • 1967 - Wyizolowanie ligazy DNA (możliwość łączenia między sobą fragmentów DNA) Olivera & Lehman • 1970 - Izolacja nowego rodzaju enzymówenzymów restrykcyjnych (można ciąć fragmenty DNA w miejscach rozpoznawanych przez dany enzym) - Smith & Wilcox Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin • 1972 - Otrzymanie pierwszego rekombinowanego DNA - połączono między sobą fragmenty DNA po ich przecięciu przez ER - Jackson i zespół • 1973 - Wprowadzenie obcego DNA do komórek E. coli przez zrekombinowany plazmid (możliwość namnażania biologicznego zrekombinowanego DNA w kom. bakterii) - Cohen i zespół • 1975 - Praktyczna metoda sekwencjonowania fragmentów DNA (rozpoczął się szybki rozwój metod sekwencjonowania DNA) - Sanger Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin • 1984 - Otrzymanie pierwszej transgenicznej petunii z wykorzystaniem agroinekcji do jej transformacji (pracowanie powszechnie obecnie używanej metody transformacji roślin dwuliściennych) - De Block i in., Horsch i in. • 1984 - Otrzymanie transgenicznego tytoniu metodą PEG (opracowanie metody transformacji poprzez bezpośrednie wprowadzenie DNA do protoplastów) Paszkowski i in. Kroki milowe w badaniach molekularnych i bioinżynierii roślin • 1986 - Odkrycie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) • 1990 - Otrzymanie kukurydzy transgenicznej z zastosowaniem strzelby genowej (opracowanie metody transformacji roślin jednoliściennych) Gordon- Kamm i in. • 1994 - Pomidor transgeniczny Flavr- Savr na rynku USA (pierwsza roślina transgeniczna w uprawie) - Monsanto Zakres, cel i przykłady modyfikacji genetycznej roślin uprawnych • Pożądane zmiany w wegetatywnych częściach roślin bez znaczących zmian składu chemicznego generatywnych części – zwiększenie tolerancji na działanie herbicydów, choroby wirusowe i grzybowe – zmiany architektury roślin oraz terminu kwitnienia i dojrzewania – zwiększenie tolerancji na stres środowiskowy Zakres, cel i przykłady modyfikacji genetycznej roślin uprawnych • Zmiany w składzie chemicznym i wartości użytkowej jadalnych części roślin - zwiększenie zawartości niedoborowych aminokwasów - „projektowanie olejów roślinnych” - poprawa cech sensorycznych produktu Zakres, cel i przykłady modyfikacji genetycznej roślin uprawnych • Synteza specyficznych, zazwyczaj gatunkowo obcych, substancji chemicznych –produkcja farmaceutyków i szczepionek roślinnych –zmiany kompleksu celulozowo-ligninowego oraz właściwości skrobi przydatnych w produkcji naturalnych biodegradowalnych opakowań – zwiększenie zdolności wybranych roślin do kumulowania w glebie składników niepożądanych Produkcja białek SYSTEMY ROŚLINNE • Powstanie biomasy wymaga jedynie – energii słonecznej – podłoża mineralnego Transformacja organizmów wielokomórkowych • Transformacja wszystkich komórek dorosłej rośliny nie jest możliwa. • Transformacji ulegają pojedyncze komórki, z których roślina jest regenerowana SYSTEMY ROŚLINNE • Z 1 ha można otrzymać do 20 kg czystego białka • W przypadkach, gdy preparat białkowy dostarczany jest drogą pokarmową – brak konieczności oczyszczania białka METODY WYTWARZANIA OBCYCH BIAŁEK W KOMÓRKACH ROŚLINNYCH • Ekspresja przejściowa – wymaga wprowadzenia genu do ukształtowanego organizmu • Ekspresja konstytutywna – transformacja komórek roślinnych Ekspresja przejściowa – problemy do rozwiązania • Jak równocześnie dostarczyć obcy gen do wielu komórek czy tkanek? – Wirusy roślinne Wirusy roślinne • 99% wszystkich wirusowych patogenów roślinnych stanowią wirusy RNA • niewielki genom (zwykle 6-10 tysięcy nukleotydów) występuje najczęściej w formie pojedynczej nici (u niektórych wirusów składa się z dwóch, trzech lub nawet czterech jednoniciowych RNA) Wirusy roślinne - zalety • Najprostsze wirusy kodują zaledwie kilka białek: – niezbędną do replikacji genomu zależną od RNA polimerazę RNA (RdRp – ang. RNAdependent RNA polymerase), – białko umożliwiające systemiczną infekcję (MP – ang. movement protein) – strukturalne białko płaszcza (CP - ang. Coat protein) Wirusy roślinne • Dotychczasowe badania sugerują, że najlepszym materiałem do konstrukcji wektorów są wirusy o jednoniciowym genomie • Wysoki poziom ich akumulacji w zainfekowanej tkance (do 8,6 mg wirionu / g świeżej masy) • Naturalna zdolność do rozprzestrzeniania się i przełączania metabolizmu rośliny na wydajną syntezę (synteza miligramowych ilości białka/ g tkanki roślinnej) • Synteza produktu w ilości 0.4-2% rozpuszczalnych białek rośliny Wirusy roślinne – zalety ułatwiające konstrukcję układów • Możliwość manipulowania klonami cDNA genomów wirusowych • Niewielkie wymiary wirusów The structure of cowpea chlorotic mottle virus, a plant virus, in its open and closed forms, with a section of the capsid removed from the closed form to illustrate the interior cavity. This virus serves as a biotemplate for viral-based nanomaterials applications. Wirusy roślinne – zalety • Możliwość wyboru momentu infekcji (podczas dowolnego etapu rozwoju rośliny) – znaczenie przy produkcji białek toksycznych dla gospodarza • Możliwość produkcji białek w roślinach jedno- i dwuliściennych Wektory wirusowe (np. wius mozaiki stokłosy BMV) Genom wirusa mozaiki stokłosy BMV składa się z trzech jednoniciowych cząsteczek RNA (zwanych RNA1, RNA2 i RNA3) o polarności mRNA. Wektory wirusowe (np. wirus mozaiki stokłosy BMV) • RNA1 i RNA2 kodują białka replikazowe odpowiedzialne za namnażanie genomowych RNA • odpowiednie modyfikacje umożliwiające ekspresję obcych genów wprowadzone zostały w RNA3 Brome mosaic virus Wektory wirusowe Wektory wirusowe Photo credit: Ping Xu Drought-stressed rice plants after six days without water. The plant on the right is infected with Brome mosaic virus; the one on the left is "healthy" (i.e., virus free). Ekspresja stała obcych genów w komórkach roślinnych Ekspresja stała obcych genów w komórkach roślinnych • Najbardziej rozpowszechniony sposób wytwarzania białek heterologicznych w roślinach Ekspresja stała obcych genów w komórkach roślinnych • sklonowany wcześniej gen wprowadzony zostaje do specjalnego plazmidu posiadającego zdolność do rekombinacji z genomem roślinnym (Ti-plazmid – ang. Tumor inducing plasmid). Agrobacterium tumefaciens – naturalna transformacja roślin Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego • Wykorzystanie do wprowadzenia materiału genetycznego do komórek roślinnych bakterii z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin. Agrobacterium tumefaciens Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego • Mikroorganizmy posiadają w swojej komórce plazmid, który zawiera zakodowaną informację o białkach niezbędnych do zaatakowania rośliny. To właśnie on wnika do komórki roślinnej, a jeden z jego fragmentów, nazwany odcinkiem T (T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza. Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego Metoda z wykorzystaniem wektora plazmidowego • Usuwając geny znajdujące się wewnątrz fragmentu T, można na ich miejsce wstawić dowolny inny fragment DNA, który może zawierać geny pochodzące z innego organizmu. Obecnie do transformacji roślin używa się plazmidów pochodzących z Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens • Plazmid Ti • 120 kB Plazmidy pochodne plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens Struktura odcinka T-DNA Transfer T-DNA do komórek roślinnych Proces przekazywania T-DNA jest aktywowany, kiedy dochodzi do kontaktu A. tumefaciens z uszkodzoną tkanką roślinną T-DNA jest nacinane w miejscu RB, zachodzi replikacja jednoniciowego DNA do miejsca RB, a następnie powstałe fragmenty wnikają do komórek rośliny (vir) Transfer T-DNA do komórek roślinnych Transfer T-DNA do komórek roślinnych • T-DNA integruje z genomem w przypadkowych miejscach • Komórki, które uległy transformacji zaczynają dzielić się tworząc guzy Comparison of A. tumefaciens-induced crown galls on wild-type tomato (A and C) and the Never ripe (ethylene insensitive) mutant (B and D) stems. Agrobacterium tumefaciens Geny vir i T-DNA mogą być dostarczane w dwóch oddzielnych plazmidach Agrobacterium tumefaciens • Zainfekowane komóki umieszcza się na pożywce zawierającej antybiotyk lub herbicyd • Następnie z pojedynczych transformowanych komórek odtworzone zostają cale rośliny w procesie zwanym regeneracją Badania roślin • Czy gen ulega wydajnej ekspresji? • Czy obecność genu/białka nie wpływa negatywnie na funkcjonowanie roślin (np. Uniemozliwi kwitnienie roślin czy owocowanie? Transformacja roślin • T-DNA integruje się w każdej komórce w innym miejscu genomu • Insercja zachodzi w obrębie tylko jednej części chromosomu (insercja nie jest letalna – rośliny - organizmy diploidalne) W laboratorium Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu: • Otrzymano szereg roślin transgenicznych, w których syntetyzowane są – białka wirusowe (białko powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) – białko otoczki wirusa klasycznego pomoru świń (CSFV) – białka pasożytnicze (proteinaza kodowana przez motylicę wątrobową) W laboratorium Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu: • Wykazano, iż spożycie rośliny transgenicznej zawierającej antygen powierzchniowy HBV indukuje specyficzną odpowiedź immunologiczną mogącą chronić ludzi przed zakażeniem wirusowym. • Obecnie prowadzone są analogiczne eksperymenty dotyczące immunogenności białka pochodzącego z CSFV i z motylicy. Transformacja roślin • Metoda ta ma poważne ograniczenie można ja stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają zarażeniu przez Agrobacterium. Rośliny jednoliścienne, do których należą zboża, nie mogą być transformowane tym sposobem. Metody bez wykorzystania wektora Metody bez wykorzystania wektora 1. Są to metody polegające na bezpośrednim wprowadzeniu DNA do komórek roślinnych. Niezbędnym etapem jest poddanie komórek roślinnych działaniu enzymu usuwającego ścianę komórkową. 2. Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast, którego błona komórkowa stanowi koleją barierę dla transgenu, wprowadzanego do komórek z wykorzystaniem jednej z metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne. Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych • Elektroporacja, fizyczna polega na wykorzystaniu serii impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki. Podejście to może być stosowane też przy wprowadzaniu genów do innych komórek - zwierzęcych, bakteryjnych. Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych • Mikrowstrzeliwanie, fizyczna wykorzystuje mikroskopijne kulki z złota lub wolframu o średnicy 0,5 5 mikrometra (0,00000050,000005 metra). Fragmenty DNA które pragnie się wprowadzić do komórek są opłaszczane na tych kulkach, a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych. Używana jest do tego tzw. "armatka genowa" (ang. particle gun). Wadą metody jest niska wydajność oraz mogące wystąpić uszkodzenia komórek. Zaletą jest to iż komórki nie muszą być pozbawiane ściany komórkowej, można wprowadzać do np. do fragmentu liścia, jak i DNA może zostać wprowadzona także do chloroplastów i mitochondriów. http://www.biotechnolog.pll Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych Metody wprowadzania DNA do protoplastów komórek roślinnych • Fuzja liposomów - tworzone są liposomy, wewnątrz których są cząsteczki DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie - powstają wtedy "kuleczki" błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając do środka DNA • Z użyciem PEG, chemiczna - polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego (PEG od ang. polyethylene glycol), który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez prowadzenia do niej chwilowej, odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wniknięcie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym • Mikroiniekcja - polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco- i czasochłonna. http://www.biotechnolog.pll WPROWADZANIE OBCEGO DNA DO CHLOROPLASTÓW icongenetics.com/html/download.php?ityp=3&id=5913 Informacja genetyczna w roślinach • Jądro komórkowe N • Mitochondria M • Plastydy (w zielonych częściach roślin – chloroplasty) P Genom chloroplastów • Koduje ok. 120 genów • 10000 kopii genomów chloroplastów (komórki liścia – 100 chloroplastów, każdy zawiera 100 kopii) Zalety produkcji białek w plastydach • Nie zachodzi zjawisko wyciszania obcych genów • Możliwość ekspresji kilku białek poprzez konstrukcję sztucznych operonów • Brak możliwości niekontrolowanego przekazywania wprowadzonych genów przez pyłek Transformacja chloroplastowego DNA użyciem systemu Genegun Transformation of the chloroplast genome by bombarding tobacco leaves with microprojectiles coated with DNA. Following bombardment, leaf discs are placed onto antibiotic-containing medium (panel A). Transgenic plants are regenerated from the transformed tissue that is able to develop green chloroplasts (panel B) Transgeniczny ryż Czy r-białka otrzymywane w roślinach są bezpieczne? Transgeniczny bawełna http://129.186.108.103/2005CONF/Conference/ui.pdf Rośliny transgeniczne, GMO przykłady modyfikacji • Modyfikowana sałata produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B – została opracowana przez naukowców z Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierownictwem prof. Legockiego - jest to przykład wykorzystania rośliny jako bioreaktora. W ten sposób można uzyskiwać także inne białka, enzymy, antybiotyki. Aprotinin • Inhibitor proteaz “bovine pancreatic trypsin inhibitor” • Zastosowanie: redukcja ryzyka utraty krwi podczas operacji chirurgicznych • Sposób podania: dożylnie AproliZeanTM – (ProdiGene – maize); ApronexinTM – (produced by Large Scale Biology Corp. for Sigma Aldrich) http://129.186.108.103/2005CONF/Conference/ui.pdf E.coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit (LT-B) • Enterotoxigenic E. coli (ETEC) • B podjednostka (LT-B) nie jest toksyczna. Wywołuje odpowiedź immunologiczną (szczepionka) • LT-B produkowane w kukurydzy ma takie same cechy, jak oczyszczane z E. coli – eksperymenty na zwierzętach – szczepionka LT-B wydajna i bezpieczna – badania kliniczne – dobrze tolerowana http://129.186.108.103/2005CONF/Conference/ui.pdf Charakterystyka potencjalnej możliwości wywoływania alergii http://129.186.108.103/2005CONF/Conference/ui.pdf Laktoferryna • wiąże żelazo, pierwiastek niezbędny do przetrwania dla wielu bakterii • antyutleniacz • aktywność anty-nowotworowa • Ventria Bioscience – ExpressTecTM production system for human LF (using crops of rice and barley); • Meristem® Therapeutics – LF production from maize Tatura from New Zealand construct a new Lactoferrin plant for the manufacture of 15 000 0000 tons Lactoferrin per annum. Trypsyna • produkcja insuliny • hodowla tkankowa TrypZeanTM – bovine trypsin from transgenic maize (ProdiGene) Ocena ewentualnych skutków ubocznych • • • • • • • • • • • Układ krwionośny Układ oddechowy Układ trawienny Układ moczowy Układ nerwowy Wątroba Immunotoksyczność (w tym alergie) Kancerogenność i mutagenność Toksyczność dla poszczególnych organów Skóra Wpływ na zdolności rozrodcze Rośliny transgeniczne –przykłady Soja •Odporność na wirusy, herbicydy, szkodniki •Obniżenie zawartości kw. palmitynowego Rzepak •Odporność na herbicydy, •Zmniejszona zawartość nienasyconych kw. tłuszczowych •Większa zawartość kw. laurynowego Kukurydza •Odporność na owady •„źródło żelaza” Pomidory •Spowolnienie dojrzewania, większa trwałość •Większa zawartość suchej masy, •Intensywniejsza barwa, cieńsza skórka Ziemniaki •Wzrost zawartości skrobi •Odporność na wirusy, herbicydy, stonkę ziemniaczaną •Odporność na ciemnienie pouderzeniowe, większa trwałość Rośliny transgeniczne –przykłady Truskawki • Wyższa słodkość owoców, • Spowolnienie dojrzewania • Odporność na mróz Buraki cukrowe • Odporność na herbicydy, szkodniki • Dłuższy okres przechowywania bez strat w zawartości cukru Ryż • Zwiększona produkcja β-karotenu Sałata • Produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B Pszenica • Zwiększenie zawartości glutenu Dynia • Odporność na grzyby Banany • Odporność na wirusy i grzyby Winogrona • Odmiany bezpestkowe Seler, marchew •Zachowanie kruchości
