(11) PL/EP 1706493 PL/EP 170 6493 T3

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
18.01.2005 05701017.5
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54)
(19) PL
(11) PL/EP
(13)
(51)
1706493
T3
Int.Cl.
C12P 13/08 (2006.01)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
02.05.2012 Europejski Biuletyn Patentowy 2012/18
EP 1706493 B1
Tytuł wynalazku:
Sposób wytwarzania L-treoniny lub L-lizyny obejmujący rekombinowane enterobacteriaceae o ulepszonej
aktywności enolazy
(30)
(43)
Pierwszeństwo:
23.01.2004 DE 102004003410
Zgłoszenie ogłoszono:
04.10.2006 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/40
(45)
O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
28.09.2012 Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/09
(73)
Uprawniony z patentu:
Evonik Degussa GmbH, Essen, DE
PL/EP 1706493 T3
(72)
Twórca(y) wynalazku:
MECHTHILD RIEPING, Bielefeld, DE
(74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Dorota Rzążewska
JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY
BIURO PATENTÓW
I ZNAKÓW TOWAROWYCH
ul. Żurawia 47/49
00-680 Warszawa
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
14386/12/P-RO/DR /KM
EP 1 706 493
Sposób wytwarzania L-treoniny lub L-lizyny obejmujący rekombinowane
enterobacteriaceae o ulepszonej aktywności enolazy
Opis
Dziedzina wynalazku
[0001] Niniejszy wynalazek odnosi się do sposobu otrzymywania L-treoniny i L-lizyny z
użyciem rekombinowanych mikroorganizmów z rodziny Enterobacteriaceae, które
wzbogacono o gen eno, zwłaszcza ulegający nadekspresji oraz odnoszący się do tych
mikroorganizmów.
Tło wynalazku
[0002] L-aminokwasy, a zwłaszcza L-treonina, są stosowane w medycynie człowieka i w
przemyśle farmaceutycznym, przemyśle spożywczym, a w szczególności w żywieniu
zwierząt.
[0003] Jest wiadome, że L-aminokwasy są przygotowywane przez fermentację szczepów
Enterobacteriaceae, a zwłaszcza Escherichia coli (E. coli) i Serratia marcescens. Ze względu
na ich wielkie znaczenie, cały czas podejmowane są prace mające na celu udoskonalenie
sposobów produkcyjnych. Udoskonalenia sposobu mogą odnosić się do parametrów
fermentacji takich jak np. mieszanie i dostarczanie tlenu lub skład podłoża odżywiającego jak
np. stężenie cukru podczas fermentacji lub oczyszczenie do formy produktu np. za pomocą
chromatografii jonowymiennej lub do samej wydajności mikroorganizmu.
[0004] Do poprawy wydajności tych mikroorganizmów stosowane są metody mutagenezy,
selekcji i selekcji mutantów. W ten sposób uzyskiwane są szczepy oporne na antymetabolity
takie jak np. będący analogiem treoniny kwas α-amino-β-hydroksywalerianowy (AHV) lub są
auksotroficzne dla metabolitów mających znaczenie regulacyjne i wytwarzają L-aminokwasy
takie jak np. L-treonina.
[0005] Metody technik rekombinacji DNA były także stosowane przez szereg lat do
udoskonalenia szczepu lub szczepów z rodziny Enterobacteriaceae, które wytwarzają Laminokwasy przez amplifikację pojedynczych genów biosyntetyzujących aminokwasy i
badanie wpływu na wytwarzanie. Zbiorcze informacje na temat biologii komórki i
molekularnej Escherichia coli oraz Salmonella można znaleźć w publikacji Neidhardt (ed):
Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 2nd Edition, ASM Press,
Washington, D.C., USA (1996).
-2-
[0006] Dokument patentowy EP 1 382 685 A2 (DEGUSSA AG, 21.01.2004) ujawnia sposób
fermentacyjnej produkcji L-treoniny wykorzystujący rekombinowane mikroorganizmy z
rodziny Enterobacteriaceae, gdzie wydajność L-treoniny szczepu Escherichia coli została
udoskonalona dzięki poprawie aktywności białka RseB.
Przedmiot wynalazku
[0007] Przedmiotem wynalazku jest zapewnienie nowych sposobów udoskonalonego
fermentacyjnego przygotowywania L-treoniny i L-lizyny.
Streszczenie wynalazku
[0008] Ujawnione są rekombinowane mikroorganizmy z rodziny Enterobacteriaceae, które
zawierają udoskonalony lub ulegający nadekspresji gen eno kodujący enolazę bądź jego allele
i wytwarzający w udoskonalony sposób L-treoninę i L-lizynę.
[0009] Punktem początkowym porównania są w każdym przypadku mikroorganizmy, które
nie mają rekombinowanego genu eno i nie zawierają ulepszonego genu eno.
[0010] Te mikroorganizmy obejmują w szczególności mikroorganizmy z rodziny
Enterobacteriaceae, w których polinukleotyd kodujący polipeptyd ma sekwencję
aminokwasową identyczną w przynajmniej 90%, zwłaszcza w przynajmniej 95%, korzystnie
w przynajmniej 98% lub przynajmniej 99%, szczególnie korzystnie w przynajmniej 99,7% i
najkorzystniej w 100% z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy obejmującej NR ID
SEKW 4, NR ID SEKW 6, a NR ID SEKW 8 jest ulepszona.
[0011] Korzystne są sekwencje aminokwasowe, które są identyczne do tych o NR ID SEKW
4, NR ID SEKW 6 lub NR ID SEKW 8.
[0012] Wymienione mikroorganizmy zawierają ulepszone lub ulegające nadekspresji
polinukleotydy wybrane z grupy obejmującej:
a) polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej NR ID SEKW 3, NR ID SEKW 5 lub NR ID
SEKW 7;
b) polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej NR ID SEKW 3, NR ID
SEKW 5 lub NR ID SEKW 7 w kontekście degeneracji kodu genetycznego;
c) sekwencję polinukleotydową z sekwencją hybrydyzującą w warunkach
rygorystycznych z sekwencją komplementarną do NR ID SEKW 3, NR ID SEKW 5 lub
NR ID SEKW 7;
d) polinukleotyd o sekwencji NR ID SEKW 3, NR ID SEKW 5 lub NR ID SEKW 7,
która zawiera mutanty sensu neutralne dla funkcji,
gdzie polinukleotydy kodują enolazę.
[0013] Wynalazek zapewnia sposób fermentacyjnego uzyskiwania L-treoniny i L-lizyny z
użyciem rekombinowanych mikroorganizmów z rodziny Enterobacteriaceae, które w
szczególności już wytwarzają L-aminokwasy i gdzie ulepszono przynajmniej gen eno lub
sekwencje nukleotydowe kodujące produkt tego genu.
-3-
Szczegółowy opis wynalazku
[0014] Korzystnie wykorzystywane są opisane mikroorganizmy.
[0015] Jeżeli poniżej wymieniane są L-aminokwasy lub aminokwasy, oznacza to jeden lub
więcej aminokwasów, w tym ich sole, wybrane z grupy obejmującej L-treonię i L-lizynę.
Szczególnie korzystna jest L-treonina.
[0016] Pojęcie „ulepszenie” opisuje zwiększenie aktywności wewnątrzkomórkowej lub
stężenia jednego lub więcej enzymów bądź białek w mikroorganizmie, które są kodowane
przez odpowiednie DNA, na przykład przez zwiększenie liczby kopii genu lub genów o
przynajmniej jedną (1) kopię, działające połączenie silnego promotora z genem lub użycie
genu bądź allelu kodującego odpowiedni enzym lub białko o wysokiej aktywności i
opcjonalne łączenie tych metod.
[0017] Allele są ogólnie rozumiane jako alternatywne formy danego genu. Te formy są
rozróżniane według różnic w sekwencji nukleotydowej.
[0018] Białko kodowane przez sekwencję nukleotydową tj. otwarta ramka odczytu, gen lub
allel lub kwas rybonukleinowy kodowane są ogólnie zwane produktem genu.
[0019] Dzięki metodom ulepszenia aktywność lub stężenie odpowiedniego białka jest ogólnie
zwiększane o przynajmniej 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% lub
500% do maksymalnej wartości 1000% lub 2000% na podstawie białka typu dzikiego lub
aktywności bądź stężenia białka w mikroorganizmie lub szczepie macierzystym, który nie jest
rekombinantem odpowiedniego enzymu lub białka. Mikroorganizm lub szczep macierzysty,
które nie są rekombinantami rozumiane są jako mikroorganizm wobec którego stosowane są
metody.
[0020] Wynalazek zapewnia sposób otrzymywania L-treoniny lub L-lizyny przez fermentację
rekombinowanych mikroorganizmów z rodziny Enterobacteriaceae, znamienny tym, że
a) mikroorganizmy z rodziny Enterobacteriaceae, które wytwarzają żądany Laminokwas i gdzie ulepszany jest/są gen eno lub jego allele, a zwłaszcza ulega(ją)
nadekspresji, są hodowane w podłożu w warunkach odpowiednich do wytwarzania
produktu genu eno,
b) żądany L-aminokwas jest zagęszczany w podłożu lub w komórkach
mikroorganizmu i
c) pożądany L-aminokwas zostaje wyizolowany, znajduje się całkowicie lub
częściowo (≥0 do 100%) w pożywce fermentacyjnej i/lub jej biomasie; opcjonalnie
pozostaje w produkcie, który został wyizolowany lub całkowicie usunięty.
[0021] Rekombinowane mikroorganizmy o ulepszonym genie eno mogą wytwarzać Laminokwasy z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, opcjonalnie skrobi,
opcjonalnie celulozy lub z glicerolu i etanolu. Są to przedstawiciele rodziny
Enterobacteriaceae wybrani z rodzajów Escherichia, Erwinia, Providencia i Serratia.
-4-
Korzystne są rodzaje Escherichia i Serratia. W szczególności należy wymienić z rodziny
Escherichia gatunki Escherichia coli, a z rodzaju Serratia gatunki Serratia marcescens.
[0022] Rekombinowane mikroorganizmy są ogólnie uzyskiwane dzięki transformacji,
transdukcji lub koniugacji bądź połączeniu tych metod, gdzie wektor zawiera żądany gen,
allel tego genu lub jego część i/lub promotor zwiększający ekspresję genu. Ten promotor
może być promotorem pochodzącym z mutacji ulepszającej z endogennej sekwencji
regulacyjnej położonej powyżej genu bądź jest wydanym promotorem poddanym fuzji z
genem.
[0023] Odpowiednie szczepy wytwarzające zwłaszcza L-treoninę z rodzaju Escherichia to na
przykład w szczególności następujące gatunki Escherichia coli
•
Escherichia coli H4581 (EP 0 301 572)
•
Escherichia coli KY10935 (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61(11):18771882 (1997)
•
Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (US-A-4278,765)
•
Escherichia coli VNIIgenetika M1 (US-A-4,321,325)
•
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)
•
Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5,175,107)
•
Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715)
•
Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660).
[0024] Odpowiednie szczepy wytwarzające L-treoninę z rodzaju Serratia to na przykład w
szczególności następujące gatunki Serratia marcescens
•
Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38(6): 10451051 (1979))
•
Serratia marcescens TLr156 (Gene 57(2-3): 151-158 (1987))
•
Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3): 255265 (1992)).
[0025] Szczepy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzające L-treoninę korzystnie posiadają
między innymi jedną lub więcej cech genetycznych lub fenotypowych wybranych z grupy
obejmującej: oporność na kwas α-amino-β-hydroksywalerianowy, oporność na tializynę,
oporność na etioninę, oporność na α-metyloserynę, oporność na kwas diaminobursztynowy,
oporność na kwas α-aminomasłowy, oporność na borelidynę, oporność na kwas
cyklopentanokarboksylowy, oporność na rifampicynę, oporność na analogi waliny takie jak
na przykład hydroksamat waliny, oporność na analogi puryn takie jak na przykład 6dimetyloaminopuryna, wymóg L-metioniny, opcjonalnie częściowo i z możliwością
skompensowania wymóg L-izoleucyny, wymóg kwasu mezo-diaminopimelinowego,
auksotrofia względem dipeptydów zawierających treoninę, oporność na L-treoninę, oporność
na rafinat treoniny, oporność na L-homoserynę, oporność na L-lizynę, oporność na L-
-5-
metioninę, oporność na kwas L-glutaminowy, oporność na L-asparaginian, oporność na Lleucynę, oporność na L-fenyloalaninę, oporność na L-serynę, oporność na L-cysteinę,
oporność na L-walinę, wrażliwość na fluoropirogronian, wadliwa dehydrogenaza treoniny,
opcjonalnie możliwość wykorzystywania sacharozy, ulepszenie operonu treoniny, ulepszenie
dehydrogenazy homoseryny / kinazy I I-asparaginianu, korzystnie formy opornej na
sprzężenie zwrotne, ulepszenie kinazy homoseryny, ulepszenie syntazy treoniny, ulepszenie
kinazy asparaginianowej, opcjonalnie formy opornej na sprzężenie zwrotne, ulepszenie
dehydrogenazy semialdehydu asparaginianu, ulepszenie karboksylazy pirogronianu
fosfoenolu, opcjonalnie formy opornej na sprzężenie zwrotne, ulepszenie syntazy
pirogronianu fosfoenolu, ulepszenie transhydrogenazy, ulepszenie produktu genu RhtB,
ulepszenie produktu genu RhtC, ulepszenie produktu genu YfiK, ulepszenie karboksylazy
pirogronianu i atenuacja tworzenia kwasu octowego.
[0026] Stwierdzono, że mikroorganizmy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzają L-treoninę
i L-lizynę w sposób udoskonalony po ulepszeniu, zwłaszcza nadekspresji genu eno lub jego
alleli.
[0027] Sekwencje nukleotydowe genów Escherichia coli są znane w dziedzinie (patrz
odniesienia poniżej) i można je także znaleźć w sekwencji genomu Escherichia coli
opublikowanym przez Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997)). Jest wiadome, że
endogenne enzymy gospodarza (aminopeptydaza metioniny) mogą odszczepiać N-końcowy
aminokwas metioninę.
[0028] Podobnie sekwencje nukleotydowe genu eno są znane u Shigella flexneri i Salmonella
typhimurium, które także należą do rodziny Enterobacteriaceae.
[0029] Gen eno jest opisany między innymi w następujących danych:
Opis: Funkcja:
enolaza, enolizacja hydratazy fosfopirogronianu (odszczepianie wody): 2fosfoglicerynian do pirogronianu fosfoenolu w glikolizie
Nr EC:
EC 4.2.1.11
Literatura:
Spring TG. and Wold F.; The Journal of Biological Chemistry 246(22):
6797-6802 (1971)
Klein et al.; DNA Sequence 6(6): 351-355 (1996)
Gulick et al.; Biochemistry 40(51): 15716 -15724 (2001)
Kaga et al.; Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 66(10): 22162220 (2002)
Nr dostępowy:
AE000361
-6-
[0030] Gen eno z Salmonella typhimurium jest opisany między innymi w następujących
źródłach: Garrido-Pertierra A.; Revista Espanola de Fisiologia 36(1): 33-39 (1980).
[0031] Sekwencje kwasów nukleinowych można znaleźć w bankach danych National Center
for Biotechnology Information (NCBI) of the National Library of Medicine (Bethesda, MD,
USA), banku danych sekwencji nukleotydowych European Molecular Biologies Laboratories
(EMBL, Heidelberg, Niemcy lub Cambridge, Wielka Brytania) lub banku danych DNA
Japonii (DDBJ, Mishima, Japonia).
[0032] Dla lepszej przejrzystości znana sekwencja nukleotydowa genu eno z Escherichia coli
znajduje się w NR ID SEKW 3, a znane sekwencje genu eno z Shigella flexneri (AE015293) i
Salmonella typhimurium (AE008835) znajdują się pod NR ID SEKW 5 lub NR ID SEKW 7.
Sekwencje aminokwasowe białek kodowanych przez te ramki odczytu przedstawiono jako
NR ID SEKW 4, NR ID SEKW 6 lub NR ID SEKW 8.
[0033] Geny opisane w wymienionej literaturze można użyć według wynalazku. Można także
użyć alleli genów powstałych z degeneracji kodu genetycznego lub z powodu „mutacji sensu”
o neutralnej funkcji. Korzystne jest stosowanie genów endogennych.
[0034] „Geny endogenne” lub „endogenne sekwencje nukleotydowe” są rozumiane jako
geny, allele lub sekwencje nukleotydowe obecne w populacji gatunku.
[0035] Odpowiednie allele genu eno zawierające mutacje sensu neutralne dla funkcji
obejmują między innymi prowadzące do najwyżej 50 lub do najwyżej 40 lub do najwyżej 30
lub do najwyżej 20, korzystnie do najwyżej 10 lub do najwyżej 5, szczególnie korzystnie do
najwyżej 3 lub do najwyżej 2 lub do przynajmniej jednej (1) wymiany konserwatywnego
aminokwasu w kodowanym przez nie białku.
[0036] W przypadku aminokwasów aromatycznych, wymiany konserwatywne oznaczają
wzajemne wymiany fenyloalaniny, tryptofanu i tyrozyny. W przypadku aminokwasów
hydrofobowych, wymiany konserwatywne oznaczają wzajemne wymiany leucyny,
izoleucyny i waliny. W przypadku aminokwasów polarnych, wymiany konserwatywne
oznaczają wzajemne wymiany glutaminy i asparaginy. W przypadku aminokwasów
zasadowych, wymiany konserwatywne oznaczają wzajemne wymiany argininy, lizyny i
histydyny. W przypadku aminokwasów kwaśnych, wymiany konserwatywne oznaczają
wzajemne wymiany kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego. W przypadku
aminokwasów zawierających grupy hydroksylowe, wymiany konserwatywne oznaczają
wzajemne wymiany seryny i treoniny. Wszystkie inne wymiany aminokwasów są zwane
niekonserwatywnymi wymianami aminokwasów.
[0037] W ten sam sposób mogą być także użyte sekwencje nukleotydowe kodujące warianty
wymienionych białek, które są wydłużone lub skrócone o przynajmniej jeden (1) aminokwas
na końcu N lub C. To wydłużenie lub skrócenie nie przekracza 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 lub 2
aminokwasów bądź rodników aminokwasów.
[0038] Odpowiednie allele obejmują także te, które kodują białka, gdzie przynajmniej jeden
(1) aminokwas jest wstawiany (insercja) lub usuwany (delecja). Maksymalna liczba takich
-7-
zmian zwanych indelami może odnosić się do 2, 3, 5, 10, 20 ale w każdej sytuacji nie więcej
niż 30 aminokwasów.
[0039] Ponadto odpowiednie allele obejmują te, które można uzyskać przez hybrydyzację,
zwłaszcza w warunkach rygorystycznych, z użyciem NR ID SEKW 3, NR ID SEKW 5 lub
NR ID SEKW 7 lub ich części, a zwłaszcza regionów kodujących bądź sekwencji do nich
komplementarnych.
[0040] Instrukcje identyfikacji sekwencji DNA przez hybrydyzację można znaleźć między
innymi w podręczniku „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” wydanym
przez Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Niemcy, 1993) i w Liebl et al. (International
Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). Hybrydyzacja przebiega w
warunkach rygorystycznych tj. zachodzi jedynie wówczas, gdy sonda i sekwencja docelowa
tj. polinukleotydy traktowane sondą, mają przynajmniej 80% identyczność. Wiadome jest, że
na rygorystyczność hybrydyzacji, w tym etapy przemywania, wpływa lub określa różny skład
bufora, temperatura i stężenie soli. Reakcja hybrydyzacji ogólnie prowadzona jest w
warunkach względnie niskiej rygorystyczności w porównaniu z etapami przemywania
(Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
[0041] W reakcji hybrydyzacji może być np. użyty bufor odpowiadający buforowi 5x SSC w
temperaturze np. ok. 50–68°C. Sondy mogą tu także hybrydyzować z polinukleotydami, które
są w mniej niż w 80% identyczne z sekwencją sondy. Takie hybrydy są mniej stabilne i
usuwane przez przemywanie w warunkach rygorystycznych. Można to osiągnąć na przykład
obniżając stężenie soli do 2x SSC i opcjonalnie następnie do 0,5x SSC (The DIG System
User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy, 1995)
ustalając temperaturę na poziomie ok. 50–68°C, ok. 52–68°C, ok. 54–68°C, ok. 56–68°C, ok.
58–68°C, ok. 60–68°C, ok. 62–68°C, ok. 64–68°C, ok. 66–68°C. Korzystne są zakresy
temperatur ok. 64–68°C lub ok. 66–68°C. Opcjonalnie możliwe jest obniżenie stężenia soli do
stężenia odpowiadającego 0,2x SSC lub 0,1x SSC. Fragmenty polinukleotydów, które są na
przykład w przynajmniej 80% lub przynajmniej w 90%, przynajmniej w 91%, przynajmniej w
92%, przynajmniej w 93%, przynajmniej w 94%, przynajmniej w 95%, przynajmniej w 96%,
przynajmniej w 97%, przynajmniej w 98% lub przynajmniej w 99% identyczne z sekwencją
użytej sondy lub sekwencjami nukleotydowymi przedstawionymi w NR ID SEKW 3, NR ID
SEKW 5 lub NR ID SEKW 7 mogą być izolowane dzięki stopniowemu zwiększaniu
temperatury hybrydyzacji od 50°C do 68°C w krokach co ok. 1–2°C. Dalsze instrukcje
hybrydyzacji można uzyskać na rynku w postaci tzw. zestawów (np. DIG Easy Hyb z firmy
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy, Nr kat. 1603558). Uzyskane w ten sposób
sekwencje nukleotydowe kodują polipeptydy, które są przynajmniej w 90% identyczne,
zwłaszcza identyczne przynajmniej w 95%, korzystnie identyczne przynajmniej w 98% lub
przynajmniej 99%, szczególnie korzystnie w 99,7% do sekwencji aminokwasowych
przedstawionych na NR ID SEKW 4, NR ID SEKW 6 lub NR ID SEKW 8.
[0042] W celu uzyskania ulepszenia można na przykład zwiększyć ekspresję genów lub
właściwości katalityczne białek enzymu. Opcjonalnie dwie metody można połączyć.
-8-
[0043] Dlatego można na przykład zwiększyć liczbę kopii odpowiednich genów lub poddać
mutacji promotor i region regulacyjny lub miejsce wiążące rybosom powyżej genu
strukturalnego. Tak samo działają kasety ekspresji włączane powyżej genu strukturalnego.
Dzięki indukowalnym promotorom możliwe jest dodatkowo zwiększenie ekspresji przez
fermentacyjne wytwarzanie L-treoniny i korzystne może być także zastosowanie do ekspresji
genu promotorów, które umożliwiają jednoczesną ekspresję innego genu w odniesieniu do
czasu. Ekspresja jest podobnie udoskonalana za pomocą metod wydłużających czas życia
mRNA. Ponadto zwiększana jest także aktywność enzymu, aby zapobiec degradacji białka
enzymu. Geny lub konstrukty genowe mogą być obecne na plazmidach w różnej liczbie kopii
lub integrowane i amplifikowane w chromosomie. Alternatywnie nadekspresję danych genów
można osiągnąć zmieniając skład podłoża i procedurę hodowli.
[0044] Metody nadekspresji są adekwatnie opisane w dziedzinie nauki — na przykład przez
Makrides et al. (Microbiological Reviews 60 (3), 512-538 (1996)). Stosując wektory liczbę
kopii można zwiększyć o przynajmniej jedną (1) kopię. Możliwe do zastosowania wektory to
plazmidy takie jak na przykład opisane w US 5,538,873. Jako wektorów można także użyć
fagów, na przykład faga Mu, jak opisano w EP 0332448 lub faga lambda (λ). Zwiększoną
liczbę kopii można także osiągnąć włączając kolejną kopię do innego miejsca chromosomu
— na przykład do miejsca att faga λ (Yu oraz Court, Gene 223, 77-81 (1998)). Dokument US
5,939,307 ujawnia, że włączając kasety ekspresji lub promotory takie jak na przykład
promotor tac, promotor trp, promotor lpp lub promotor PL i promotor PR faga λ na przykład
powyżej chromosomalnego operonu treoniny można było uzyskać zwiększenie ekspresji. W
ten sam sposób mogą być użyte promotory faga T7, promotory „przekładni” lub promotor
nar. Takie kasety ekspresji lub promotory mogą być także użyte, jak opisano w EP 0 593 792,
do nadekspresji genów związanych z plazmidem. Wykorzystując allel lacIQ można
kontrolować ekspresję genów związanych z plazmidem (Glascock i Weickert, Gene 223, 221231 (1998)). Ponadto możliwe jest zwiększenie aktywności promotorów przez modyfikację
ich sekwencji za pomocą wymiany, insercji lub delecji jednego lub więcej nukleotydów.
Wykorzystując zależny od fazy wzrostu promotor fis można uzyskać jednoczesną ekspresję
innego genu w odniesieniu do czasu, na przykład opisaną przez Walker et al. (Journal of
Bacteriology 181: 1269-80 (1999)).
[0045] Specjalista może znaleźć ogólne instrukcje na ten temat między innymi w publikacji
Chang i Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), w Hartley i Gregori (Gene
13: 347-353 (1981)), w Amann i Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), w de Broer et al.
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25
(1983)), w LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193 (1993)), w PCT/US97/13359,
w Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), w Quandt i Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), w
Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), w Jensen i Hammer
(Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) i w znanych podręcznikach do
genetyki i biologii molekularnej.
[0046] Mogą być użyte wektory plazmidowe mogące ulegać replikacji u Enterobacteriaceae
takie jak np. wektory klonowania pochodzące z pACYC184 (Bartolomé et al.; Gene 102: 75-
-9-
78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) lub pochodne pSC101 (Vocke
i Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21): 6557-6561 (1983)).
Szczep przekształcony za pomocą wektora plazmidowego, który nosi przynajmniej gen eno
lub sekwencję nukleotydową kodującą produkt genu lub allelu może być zastosowany w
sposobie według wynalazku.
[0047] Pojęcie transformacji (przekształcenia) jest rozumiane jako pobieranie izolowanego
kwasu nukleinowego przez gospodarza (mikroorganizm).
[0048] Możliwe jest także przenoszenie mutacji wpływających na ekspresję określonych
genów do różnych szczepów przez wymianę sekwencji (Hamilton et al.; (Journal of
Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), koniugację lub transdukcję.
[0049] Bardziej szczegółowe objaśnienia pojęć z genetyki i biologii molekularnej można
znaleźć w następujących podręcznikach do genetyki i biologii molekularnej jak np. autorstwa
Birge (Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4th ed., Springer Verlag, New York (USA),
2000) lub Berg, Tymoczko i Stryer (Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company, New York
(USA), 2002) lub Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (zestaw 3
tomów), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
[0050] Ponadto oprócz ulepszania genu eno korzystne może być uzyskiwanie L-treoniny ze
szczepów z rodziny Enterobacteriaceae w celu ulepszania jednego lub więcej enzymów
znanego szlaku biosyntezy treoniny lub enzymów metabolizmu anaplerotycznego lub
enzymów
do
wytwarzania
zredukowanego
fosforanu
dinukleotydu
nikotynamidoadeninowego lub enzymów glikolizy lub enzymów PTS lub enzymów
metabolizmu siarki. Ogólnie korzystne jest stosowanie genów endogennych.
[0051] Dlatego można na przykład jednocześnie ulepszyć jeden lub więcej genów z grupy
obejmującej
•
przynajmniej jeden gen operonu thrABC kodującego kinazę asparaginianową,
dehydrogenazę homoseryny, kinazę homoseryny i syntazę treoniny (US-A-4,278,765),
•
gen pyc Corynebacterium glutamicum kodujący karboksylazę pirogronianu (WO
99/18228),
•
gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianu (Molecular and General Genetics
231(2): 332-336 (1992)),
•
gen ppc kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianu (WO 02/064808),
•
geny pntA i pntB kodujące podjednostki transhydrogenazy pirydyny (European
Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
•
gen rhtB kodujący białko nadające oporność na homoserynę (EP-A-O 994 190),
•
gen rhtC kodujący białko nadające oporność na treoninę (EP-A-1 013 765),
•
gen thrE Corynebacterium glutamicum kodujący białko nośnikowe eksportujące
treoninę (WO 01/92545),
- 10 -
•
gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianu (Nucleic Acids Research 11: 52575266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),
•
gen pgm kodujący fosfoglukomutazę (WO 03/004598),
•
gen fba kodujący aldolazę fruktozobisfosforanu (WO 03/004664),
•
gen ptsH operonu ptsHIcrr kodujący białko fosfohistydynowe fosfotransferazy
heksozy układu PTS fosfotransferazy (WO 03/004674),
•
gen ptsI operonu ptsHIcrr kodujący enzym I układu PTS fosfotransferazy (WO
03/004674),
•
gen crr operonu ptsHIcrr kodujący swoisty wobec glukozy komponent IIA układu
PTS fosfotransferazy (WO 03/004674),
•
gen ptsG kodujący swoisty wobec glukozy komponent IIBC (WO 03/004670),
•
gen lrp kodujący regulator regulonu leucyny (WO 03/004665),
•
gen fadR kodujący regulator regulonu fad (WO 03/038106),
•
gen iclR kodujący regulator metabolizmu centralnego produktu pośredniego (WO
03/038106),
•
gen ahpC operonu ahpCF kodujący małą podjednostkę reduktazy wodoronadtlenków
alkilowych (WO 03/004663),
•
gen ahpF operonu ahpCF kodujący dużą podjednostkę reduktazy wodoronadtlenków
alkilowych (WO 03/004663),
•
gen cysK kodujący syntazę A cysteiny (WO 03/006666),
•
gen cysB kodujący regulator regulonu cys (WO 03/006666),
•
gen cysJ operonu cysJIH kodujący flawoproteinę NADPH zależnej reduktazy
siarczynu (WO 03/006666),
•
gen cysI operonu cysJIH kodujący hemoproteinę NADPH zależnej reduktazy
siarczynu (WO 03/006666),
•
gen cysH operonu cysJIH kodujący reduktazę adenylosiarczanową (WO 03/006666),
•
gen rseA operonu rseABC kodujący białko błonowe o aktywności anty-sigmaE (WO
03/008612),
•
gen rseC operonu rseABC kodujący globalny regulator czynnika sigmaE (WO
03/008612),
•
gen sucA operonu sucABCD kodujący podjednostkę dekarboksylazy dehydrogenazy
2-ketoglutaranowej (WO 03/008614),
•
gen
sucB
operonu
sucABCD
kodujący
podjednostkę
E2
dihydrolipoilotransbursztynazy dehydrogenazy 2-ketoglutaranowej (WO 03/008614),
- 11 -
•
gen sucC operonu sucABCD kodujący podjednostkę β syntetazy bursztynylo-CoA
(WO 03/008615),
•
gen sucD operonu sucABCD kodujący podjednostkę α syntetazy bursztynylo-CoA
(WO 03/008615),
•
gen aceE kodujący komponent E1 kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej (WO
03/076635),
•
gen aceF kodujący komponent E2 kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej (WO
03/076635) oraz
•
gen rseB kodujący regulator aktywności czynnika sigmaE (Molecular Microbiology
24(2): 355-371 (1997)),
•
produkt genu otwartej ramki odczytu yodA Escherichia coli (Numer dostępowy
AE000288 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda,
MD, USA), DE10361192.4),
•
produkt genu otwartej ramki odczytu yaaU Escherichia coli (Numer dostępowy
AE005181 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda,
MD, USA), DE10361268.8) oraz
•
gen malT kodujący dodatni aktywator transkrypcyjny regulonu maltozy (Gene 42:
201-208 (1986).
[0052] Ponadto w produkcji L-treoniny korzystne może być, oprócz ulepszenia genu eno,
tłumienie jednego lub więcej genów z grupy obejmującej
•
gen tdh kodujący dehydrogenazę treoniny (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721
(1987)),
•
gen mdh kodujący dehydrogenazę jabłczanową (E.C. 1.1.1.37) (Archives in
Microbiology 149: 36-42 (1987)),
•
produkt genu otwartej ramki odczytu yjfA Escherichia coli (Numer dostępowy
AAC77180 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda,
MD, USA), WO 02/29080)),
•
produkt genu otwartej ramki odczytu ytfP Escherichia coli (Numer dostępowy
AAC77179 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda,
MD, USA), WO 02/29080)),
•
gen pckA kodujący enzym karboksykinazę fosfoenolopirogronianu (WO 02/29080),
•
gen poxB kodujący oksydazę pirogronianu (WO 02/36797),
•
gen dgsA kodujący regulator DgsA układu fosfotransferazy (WO 02/081721) i znany
także pod nazwą genu mlc,
•
gen fruR kodujący represor fruktozowy (WO 02/081698) i znany także pod nazwą
genu cra,
- 12 -
•
gen rpoS kodujący czynnik sigma38 (WO 01/05939) i znany także pod nazwą genu
katF, oraz
•
gen aspA kodujący liazę asparaginianoamonową (WO 03/008603),
zwłaszcza eliminowanego lub takiego, którego ekspresja ma być ograniczona.
[0053] Pojęcie „atenuacja” w tym kontekście opisuje redukowanie lub eliminację aktywności
wewnątrzkomórkowej lub stężenia jednego bądź więcej tych enzymów lub białek w
mikroorganizmie, które są kodowane przez odpowiadające im DNA poprzez na przykład
używanie promotora słabszego niż występuje w mikroorganizmie lub szczepie macierzystym,
który nie jest rekombinantem dla odpowiedniego enzymu lub białka lub genu lub allelu
kodującego odpowiedni enzym lub białko z niską aktywnością lub inaktywowanie
odpowiedniego enzymu (białka) lub otwartej ramki odczytu lub genu i opcjonalnie połączenie
tych metod.
[0054] Dzięki metodom atenuacji aktywność lub stężenie odpowiedniego białka ogólnie
zmniejsza się do od 0% do 75%, od 0% do 50%, od 0% do 25%, od 0% do 10% lub od 0% do
5% aktywności lub stężenia białka typu dzikiego lub aktywności bądź stężenia białka w
mikroorganizmie lub szczepie macierzystym, który nie jest rekombinantem odpowiedniego
enzymu lub białka. Mikroorganizm lub szczep macierzysty, które nie są rekombinantami
rozumiane są jako mikroorganizm wobec którego stosowane są metody.
[0055] W celu uzyskania atenuacji można na przykład ograniczyć lub wyeliminować
ekspresję genów lub otwartych ramek odczytu lub właściwości katalitycznych białek enzymu.
Opcjonalnie dwie metody można połączyć.
[0056] Ograniczenie ekspresji genu może mieć miejsce dzięki odpowiedniej hodowli,
modyfikacji genetycznej (mutacji) struktur sygnałowych ekspresji genu lub technice
antysensownego RNA. Struktury sygnałowe ekspresji genu to na przykład geny represorowe,
geny aktywujące, operatory, promotory, atenuatory, miejsca wiązania rybosomu, kodony start
i terminatory. Fachowiec może znaleźć informacje na ten temat między innymi w publikacji
autorstwa Jensen i Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), Carrier
i Keasling (Biotechnology Progress 15: 58-64 (1999)), Franch i Gerdes (Current Opinion in
Microbiology 3: 159-164 (2000)) i w znanych podręcznikach do genetyki i biologii
molekularnej takich jak podręcznik autorstwa Knippers („Molekulare Genetik [Genetyka
molekularna]”, 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy, 1995) lub autorstwa
Winnacker („Gene und Klone [Geny i klony]”, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim,
Niemcy, 1990).
[0057] Mutacje prowadzące do zmiany lub ograniczenia właściwości katalitycznych białek
enzymatycznych są znane w dziedzinie. Przykładami, które można wymienić są prace Qiu i
Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5511-5515 (1998)),
Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991)).
Zbiorcze opisy można znaleźć w znanych podręcznikach do genetyki i biologii molekularnej
- 13 -
takich jak np. autorstwa Hagemann („Allgemeine Genetik [Genetyka ogólna]”, Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
[0058] Możliwe mutacje to tranzycje, transwersje, insercje i delecje przynajmniej jednej (1)
pary zasad lub nukleotydu. W zależności od wpływu wymiany aminokwasu spowodowanej
przez mutację na aktywność enzymu, mówi się o „mutacjach zmiany sensu” lub „mutacjach
utraty sensu”. Mutacje zmiany sensu powodują wymianę danego aminokwasu w białku na
inny, zwłaszcza niekonserwatywną wymianę aminokwasu. W ten sposób możliwości
funkcjonalne lub aktywność białka są upośledzane i zmniejszane do wartości od 0% do 75%,
od 0% do 50%, od 0% do 25%, od 0% do 10% lub od 0% do 5%. Mutacje utraty sensu
prowadzą do powstania w regionie kodującym genu kodonu stop i tym samym do
przedwczesnego przerwania translacji. Insercje lub delecje przynajmniej jednej pary zasad w
genie prowadzą do mutacji przesunięcia ramki powodującej włączanie nieprawidłowych
aminokwasów lub przedwczesnego przerywania translacji. Jeżeli w konsekwencji mutacji w
regionie kodującym powstanie kodon stop, prowadzi to do przedwczesnego zakończenia
translacji. Delecje przynajmniej jednego (1) lub więcej kodonów zazwyczaj także prowadzą
do całkowitej utraty aktywności enzymu.
[0059] Instrukcje generowania takich mutacji są znane w dziedzinie nauki i można je znaleźć
w znanych podręcznikach do genetyki i biologii molekularnej jak np. podręcznik autorstwa
Knippers („Molekulare Genetik [Genetyka molekularna]”, 6th edition, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Niemcy, 1995) lub autorstwa Winnacker („Gene und Klone [Geny i klony]”, VCH
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Niemcy, 1990) lub autorstwa Hagemann („Allgemeine
Genetik [Genetyka ogólna]”, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
[0060] Odpowiednie mutacje w genach mogą być włączone do odpowiednich szczepów
poprzez zastępowanie genu lub allelu.
[0061] Popularną metodę uzyskania tego opisują Hamilton et al. (Journal of Bacteriology
171: 4617-4622 (1989)), o wymianie genów z pomocą warunkowej replikacji pochodnej
pSC101 pMAK705. Podobnie można użyć innych metod opisanych w dziedzinie nauki takich
jak na przykład przez Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181: 7143-7148
(1999)) lub przez Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182: 842-847 (2000)).
[0062] Możliwe jest także przenoszenie mutacji wpływających w określonych genach lub
mutacji wpływających na ekspresję określonych genów lub otwartych ramek odczytu do
różnych szczepów przez koniugację lub transdukcję.
[0063] Oprócz ulepszania genu eno w produkcji L-treoniny i L-lizyny korzystne może być
także wyeliminowanie niepożądanych reakcji ubocznych (Nakayama: „Breeding of Amino
Acid Producing Microorganisms”, w: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl,
Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
[0064] Uzyskane mikroorganizmy mogą być hodowane w sposobie okresowym (hodowla
okresowa), hodowli półokresowej (sposobie półokresowym), w powtarzanym sposobie
okresowym lub sposobie ciągłym (DE102004028859.3 lub US5,763,230). Podsumowanie
znanych metod hodowli opisuje podręcznik autorstwa Chmi el (Bioprozesstechnik 1.
- 14 -
Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) lub
podręcznik autorstwa Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
[0065] Używane podłoże hodowlane musi w odpowiedni sposób spełniać wymogi
określonych szczepów. Opisy podłoży hodowlanych dla różnych mikroorganizmów znajdują
się w podręczniku „Manual of Methods for General Bacteriology” Amerykańskiego
Towarzystwa Bakteriologicznego (Washington D.C., USA, 1981).
[0066] Jako źródło węgla mogą być używane cukry i węglowodany takie jak np. glukoza,
sacharoza, laktoza, fruktoza, maltoza, melasa, skrobia i opcjonalnie celuloza, oleje i tłuszcze
takie jak np. olej sojowy, olej słonecznikowy, olej z orzeszków ziemnych, tłuszcz z orzecha
kokosowego, kwasy tłuszczowe takie jak np. kwas palmitynowy, kwas stearynowy i kwas
linolowy, alkohole takie jak np. glicerol i etanol oraz kwasy organiczne takie jak np. kwas
octowy. Substancje te mogą być stosowane oddzielnie lub w mieszaninie.
[0067] Jako źródło azotu mogą być używane związki organiczne zawierające azot takie jak
peptony, ekstrakty drożdżowe, ekstrakty mięsne, ekstrakty słodu, wodny namok
kukurydziany, mąka sojowa i mocznik lub związki nieorganiczne takie jak siarczan amonu,
chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu oraz azotan amonu. Źródła azotu mogą być
stosowane oddzielnie lub w mieszaninie.
[0068] Jako źródło fosforu może być użyty kwas fosforowy, diwodorofosforan potasu lub
wodorofosforan dipotasowy lub odpowiednie sole zawierające sód. Podłoże hodowlane musi
także zawierać sole metali takie jak np. siarczan magnezu lub siarczan żelaza, które są
niezbędne do wzrostu. Na koniec oprócz wymienionych wyżej substancji mogą być użyte
substancje niezbędne do wzrostu takie jak aminokwasy i witaminy. Ponadto do podłoża
hodowlanego mogą być dodane odpowiednie prekursory. Wymienione wyżej substancje
wyjściowe mogą być dodane do podłoża jako jedna partia lub mogą być odpowiednio
dodawane podczas hodowli.
[0069] Ogólnie fermentacja jest prowadzona przy pH od 5,5 do 9,0, zwłaszcza od 6,0 do 8,0.
Do kontrolowania pH hodowli mogą być w odpowiedni sposób użyte związki zasadowe takie
jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak lub wodny amoniak, lub związki
kwaśne takie jak kwas fosforowy lub kwas siarkowy. Do kontrolowania tworzenia się piany
mogą być stosowane środki przeciwpieniące takie jak np. estry poliglikolowe kwasów
tłuszczowych. W celu utrzymania stabilności plazmidów do podłoża mogą być dodane
odpowiednie substancje o działaniu selektywnym takie jak np. antybiotyki. W celu
utrzymania warunków tlenowych, do hodowli może być dodawany tlen lub mieszaniny
gazów zawierających tlen jak np. powietrze. Temperatura hodowli wynosi zazwyczaj od 25°C
do 45°C, korzystnie od 30°C do 40°C. Hodowla jest kontynuowana do uzyskania
maksymalnej ilości L-aminokwasów lub L-treoniny. Cel zazwyczaj jest osiągany w czasie od
10 do 160 godzin.
[0070] Analizy L-aminokwasów mogą być przeprowadzane metodą chromatografii
anionowymiennej, po której następuje derywatyzacja ninhydryną zgodnie z opisem przez
- 15 -
Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30: 1190-1206 (1958)) lub HPLC odwróconej fazy
zgodnie z opisem przez Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
[0071] Sposób według wynalazku służy do fermentacyjnego przygotowywania L-treoniny i
L-lizyny, a zwłaszcza L-treoniny.
[0072] Następujący mikroorganizm został zdeponowany w Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = niemiecka kolekcja mikroorganizmów i
hodowli komórkowych, Braunschweig, Niemcy) zgodnie z traktatem budapesztańskim:
•
Escherichia coli szczep E. coli MG442 jako DSM 16574.
[0073] Niniejszy wynalazek jest wyjaśniony bardziej szczegółowo przy pomocy
następujących przykładów wykonania.
[0074] Minimalne (M9) i pełne (LB) podłoże dla Escherichia coli użyto zgodnie z opisem
J.H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory
Press). Izolacja DNA plazmidowego z Escherichia coli i wszystkie techniki restrykcji, ligacji,
Klenowa oraz obróbki fosfatazą alkaliczną przeprowadzono według metody Sambrook et al.
(Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Jeżeli nie opisano inaczej, transformacja Escherichia coli prowadzona jest według metody
Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 86: 2172-2175 (1989)).
[0075] Temperatura inkubacji do przygotowywania szczepów i transformantów wynosi 37°C.
Przykład 1
Konstrukcja plazmidu ekspresji pTrc99Aeno
[0076] Gen eno z E. coli K12 jest poddawany amplifikacji przy użyciu reakcji łańcuchowej
polimerazy (PCR) i syntetycznych oligonukleotydów. Rozpoczynając od sekwencji
nukleotydowej genu eno w E. coli K12 MG1655 (Numer dostępowy AE000361, Blattner et
al. (Science 277: 1453-1474 (1997)), syntetyzowane są startery PCR (MWG Biotech,
Ebersberg, Niemcy). Startery zawierają sekwencje dla enzymów restrykcyjnych, które są
zaznaczone przez podkreślenie na przedstawionej niżej sekwencji nukleotydowej. Starter
eno1 zawiera miejsce cięcia restrykcyjnego dla XabI, starter eno2 zawiera miejsca dla
HindIII.
eno1:
5' - GTTTGTCTAGAGTTTCAGTTTAACTAGTGAC - 3' (NR ID SEKW 1)
eno2:
5' - CCGGAGGCTGGCAAGCTTAAATCAG - 3' (NR ID SEKW 2)
[0077] Chromosomalne DNA E. coli K12 MG1655 użyte do PCR jest izolowane zgodnie z
instrukcjami producenta stosując „Qiagen Genomic-tips 100/G” (QIAGEN, Hilden, Niemcy).
Fragment DNA o około 1381 pz można amplifikować za pomocą swoistych starterów w
standardowych warunkach PCR (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and
- 16 -
Applications, Academic Press) za pomocą polimerazy DNA Vent (New England BioLabs,
Frankfurt, Niemcy) (NR ID SEKW 3).
[0078] Amplifikowany fragment eno jest cięty enzymami restrykcyjnymi HindIII i XbaI i po
oczyszczaniu (Purification Kit, QIAGEN, Hilden, Niemcy) sprawdzany w 0,8% żelu
agarozowym. Wektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja) jest rozszczepiany za
pomocą enzymów HindIII i XbaI, a następnie przeprowadzana jest ligacja z wyciętym
fragmentem eno. Szczep E. coli TOP10 One Shot (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen,
Groningen, Holandia) jest transformowany za pomocą mieszaniny ligacyjnej, a komórki
zawierające plazmid są poddawane selekcji na agarze LB, do którego dodano 50 µg/ml
ampicyliny. Pomyślne klonowanie można wykazać po izolacji DNA plazmidu za pomocą
kontrolnego rozszczepienia enzymami HindIII/XbaI i PvuI. Plazmid nazywa się pTrc99Aeno
(Figura 1).
Przykład 2
Przygotowanie L-treoniny za pomocą szczepu MG442/pTrc99Aeno
[0079] Wytwarzający L-treoninę szczep E. coli MG442 jest opisany w opisie patentowym
US-A-4,278,765 i zdeponowany jako CMIM B-1628 w rosyjskiej narodowej kolekcji
mikroorganizmów przemysłowych (VKPM, Moskwa, Rosja) oraz jako DSM 16574 w
Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = niemiecka kolekcja
mikroorganizmów i hodowli komórkowych, Braunschweig, Niemcy) zgodnie z traktatem
budapesztańskim.
[0080] Szczep MG442 jest transformowany za pomocą plazmidu ekspresji pTrc99Aeno
opisanego w przykładzie 1, a komórki zawierające wektor pTrc99A i plazmid są poddawane
selekcji na agarze LB z dodatkiem 50 µg/ml ampicyliny. Pomyślne transformowanie można
wykazać po izolacji DNA plazmidu za pomocą kontrolnego rozszczepienia enzymami
HindIII/XbaI. W ten sposób powstają szczepy MG442/pTrc99Aeno i MG442/pTrc99A.
Wyselekcjonowane pojedyncze kolonie są następnie namnażane na podłożu minimalnym o
następującym składzie: 3,5 g/l Na2HPO4*2H2O, 1,5 g/l KH2PO4, 1 g/l NH4Cl, 0,1 g/l
MgSO4*7H2O, 2 g/l glukozy, 20 g/l agaru, 50 mg/l ampicyliny. Powstawanie L-treoniny jest
sprawdzane w 10 ml hodowli okresowych umieszczonych w kolbach stożkowych 100 ml. W
tym celu 10 ml podłoża przedhodowlanego o następującym składzie: 2 g/l wyciągu
drożdżowego, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4*7H2O, 15 g/l CaCO3, 20 g/l
glukozy, 50 mg/l ampicyliny jest zaszczepiane i hodowla okresowa jest inkubowana przez 16
godzin w temperaturze 37°C i 180 obr./min. w inkubatorze ESR firmy Kühner AG
(Birsfelden, Szwajcaria).
[0081] 250 µl porcje tego podłoża przedhodowlanego jest poddawane transinokulacji do 10
ml podłoża hodowlanego (25 g/l (NH4)2O4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4*7H2O, 0,03 g/l
FeSO4*7H2O, 0,018 g/l MnSO4*1H2O, 30 g/l CaCO3, 20 g/l glukozy, 50 mg/l ampicyliny) i
hodowla okresowa jest inkubowana przez 48 godzin w temperaturze 37°C. W celu pełnej
indukcji ekspresji genu eno, do równoległych hodowli okresowych dodawane jest 100 mg/l
izopropylo β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Wywarzanie L-treoniny przez szczep
- 17 -
wyjściowy MG442 jest sprawdzane w ten sam sposób, ale do pożywki nie dodaje się
ampicyliny. Po inkubacji oznaczana jest gęstość optyczna (OD) zawiesiny hodowlanej za
pomocą fotometru LP2W firmy Dr. Lange (Düsseldorf, Niemcy) przy długości fali 660 nm.
[0082] Następnie oznaczane jest stężenie powstałej L-treoniny w filtrowanym jałowo
supernatancie hodowli za pomocą analizatora aminokwasów firmy Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Niemcy) metodą chromatografii jonowymiennej i pokolumnowej reakcji
wykrywania ninhydryną.
[0083] Wyniki doświadczenia przedstawiono w Tabeli 1.
Tabela 1
Szczep
Dodatki
Gęstość optyczna (660 nm).
L-treonina g/l
MG442
-
5,6
1,4
MG442/pTrc99A
-
3,8
1,3
MG442/pTrc99Aeno
-
2,6
1,7
MG442/pTrc99Aeno
IPTG
5,1
2,6
Skrócony opis Figury:
Figura 1: Mapa plazmidu pTrc99Aeno zawierającego gen eno
[0084] Dane dotyczące długości są wartościami przybliżonymi. Użyte skróty i oznaczenia
mają następujące znaczenie:
•
Amp: gen oporności na ampicylinę
•
lacI: gen białka represorowego promotora trc
•
Ptrc: region promotora trc, indukowalnego przez IPTG
•
eno: region kodujący gen eno
•
5S: region rRNA 5S
•
rrnBT: region terminatora rRNA
Skróty enzymów restrykcyjnych mają następujące znaczenie
•
HindIII: endonukleaza restrykcyjna z Haemophilus influenzae RC
•
PvuI: endonukleaza restrykcyjna z Proteus vulgaris
•
XbaI: endonukleaza restrykcyjna z Xanthomonas campestris
Lista sekwencji
- 18 -
[0085]
<110> Degussa AG
<120> Sposób otrzymywania L-treoniny lub L-lizyny z użyciem szczepów z rodziny
Enterobacteriaceae
<130> 020479 BT
<160> 8
<170> Wersja 3.2 PatentIn
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<221> Starter
<222> (1)..(31)
<223> eno1
<400> 1
gtttgtctag agtttcagtt taactagtga c
31
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<221> Starter
<222> (1)..(25)
<223> eno2
<400> 2
ccggaggctg gcaagcttaa atcag
<210> 3
<211> 1381
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> Produkt PCR
<222> (1)..(1381)
<220>
<221> CDS
25
- 19 -
<222> (46)..(1344)
<223> gen eno
<400> 3
- 20 -
<210> 4
<211> 432
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
- 21 -
<210> 5
<211> 1299
<212> DNA
<213> Shigella flexneri
- 22 -
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1299)
<223> region kodujący eno
<400> 5
- 23 -
<210> 6
<211> 432
<212> PRT
<213> Shigella flexneri
- 24 -
<400> 6
- 25 -
<210> 7
<211> 1299
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1299)
<223> region kodujący eno
<400> 7
- 26 -
- 27 -
<210> 8
<211> 432
<212> PRT
<213> Salmonella typhimurium
<400> 8
- 28 -
Sporządziła i zweryfikowała
Dorota Rzążewska
Rzecznik patentowy
- 29 -
Zastrzeżenia
1. Sposób otrzymywania L-treoniny lub L-lizyny przez fermentację rekombinowanych
mikroorganizmów z rodziny Enterobacteriaceae, gdzie
a) mikroorganizmy wytwarzające żądany L-aminokwas i u których ulepszono gen eno
lub sekwencje nukleotydowe bądź allele kodujące białko o aktywności enolazy, są
hodowane w podłożu w warunkach powodujących zagęszczanie żądanego Laminokwasu w podłożu lub komórkach i
b) żądany L-aminokwas jest izolowany, znajduje się w całości lub w części (≥0 do
100%) w pożywce fermentacyjnej i/lub biomasie pozostałej w produkcie, który
wyizolowano lub całkowicie usunięto,
gdzie ulepszenie opisuje zwiększoną aktywność wewnątrzkomórkową lub stężenie
wymienionego białka o przynajmniej 10% na podstawie białka typu dzikiego lub szczepu
macierzystego.
2. Sposób według zastrzeżenia 1, gdzie polinukleotyd kodujący polipeptyd o sekwencji
aminokwasowej identycznej w przynajmniej 90% z sekwencją aminokwasową wybraną z
grupy obejmującej NR ID SEKW 4, NR ID SEKW 6, i NR ID SEKW 8 jest ulepszony.
3. Sposób według zastrzeżenia 2, gdzie mikroorganizmy zawierają ulegający nadekspresji lub
ulepszony polinukleotyd odpowiadający genowi eno wybranemu z grupy obejmującej:
a) polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej z NR ID SEKW 3, NR ID SEKW 5 lub
NR ID SEKW 7;
b) polinukleotyd o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej NR ID SEKW 3, NR ID
SEKW 5 lub NR ID SEKW 7 w kontekście degeneracji kodu genetycznego;
c) sekwencję polinukleotydową o sekwencji hybrydyzującej w warunkach
rygorystycznych z sekwencją komplementarną do NR ID SEKW 3, NR ID SEKW 5
lub NR ID SEKW 7;
d) polinukleotyd o sekwencji NR ID SEKW 3, NR ID SEKW 5 lub NR ID SEKW 7,
która obejmuje mutanty sensu neutralne dla funkcji.
4. Sposób według zastrzeżenia 2, gdzie polipeptyd ma sekwencję aminokwasową identyczną
w przynajmniej 95% z jedną z sekwencją wybraną z grupy obejmującej NR ID SEKW 4, NR
ID SEKW 6 i NR ID SEKW 8.
5. Sposób według zastrzeżenia 2, gdzie polipeptyd ma sekwencję aminokwasową identyczną
w 100% z sekwencją o NR ID SEKW 4, NR ID SEKW 6 lub NR ID SEKW 8.
6. Sposób według zastrzeżeń od 1 do 5, gdzie mikroorganizmy są uzyskiwane przez
transformację, transdukcję lub koniugację bądź połączenie tych metod, gdzie wektor zawiera
gen eno, allel tego genu lub jego części i/lub promotor.
7. Sposób według zastrzeżenia 1 lub 6, gdzie liczba kopii genu eno lub alleli jest zwiększana
przynajmniej o 1.
- 30 -
8. Sposób według zastrzeżenia 7, gdzie zwiększenie liczby kopii genu eno przynajmniej o 1
jest spowodowane włączeniem otwartej ramki odczytu lub alleli do chromosomu
mikroorganizmów.
9. Sposób według zastrzeżenia 7, gdzie zwiększenie liczby kopii genu eno przynajmniej o 1
jest uzyskiwane za pomocą wektora, który replikuje pozachromosomalnie.
10. Sposób według zastrzeżenia 1 lub 2, gdzie w celu uzyskania ulepszenia,
a) promotor i region regulacyjny lub miejsce wiążące rybosom powyżej genu eno jest
mutowany lub
b) kasety ekspresji lub promotory są włączane powyżej genu eno.
11. Sposób według zastrzeżenia 1 lub 2, gdzie gen eno znajduje się pod kontrolą promotora,
który ulepsza ekspresję genu.
12. Sposób według zastrzeżeń od 1 do 11, gdzie stężenie lub aktywność produktu genu eno
jest zwiększana przez nadekspresję genu eno lub sekwencje nukleotydowe lub allele kodujące
produkt genu.
13. Sposób według zastrzeżeń od 1 do 12, gdzie mikroorganizmy są wybierane z rodzaju
Escherichia.
14. Sposób według zastrzeżeń od 1 do 13, gdzie mikroorganizmy są wybierane z gatunków
Escherichia coli.
15. Sposób według zastrzeżeń od 1 do 14, gdzie do przygotowania L-treoniny,
mikroorganizmy z rodziny Enterobacteriaceae fermentują przy jednoczesnym ulepszeniu, a
zwłaszcza nadekspresji, jednego lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:
15.1 przynajmniej jeden gen operonu thrABC kodującego kinazę asparaginianową,
dehydrogenazę homoseryny, kinazę homoseryny i syntazę treoniny,
15.2 gen pyc Corynebacterium glutamicum kodujący karboksylazę pirogronianu,
15.3 gen pps kodujący syntazę fosfoenolopirogronianu,
15.4 gen ppc kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianu,
15.5 geny pntA i pntB kodujące podjednostki transhydrogenazy pirydyny,
15.6 gen rhtB kodujący białko nadające oporność na homoserynę,
15.7 gen rhtC kodujący białko nadające oporność na treoninę,
15.8 gen thrE Corynebacterium kodujący białko nośnikowe eksportujące treoninę,
15.9 gen gdhA kodujący dehydrogenazę glutaminianu,
15.10 gen pgm kodujący fosfoglukomutazę,
15.11 gen fba kodujący aldolazę fruktozobisfosforanu,
15.12 gen ptsH kodujący białko fosfohistydynowe fosfotransferazy heksozy,
- 31 -
15.13 gen ptsI kodujący enzym I układu fosfotransferazy,
15.14 gen crr kodujący specyficzny wobec glukozy komponent IIA,
15.15 gen ptsG kodujący specyficzny wobec glukozy komponent IIBC,
15.16 gen lrp kodujący regulator regulonu leucyny,
15.17 gen fadR kodujący regulator regulonu fad,
15.18 gen iclR kodujący regulator metabolizmu centralnego produktu pośredniego,
15.19 gen ahpC kodujący małą podjednostkę reduktazy wodoronadtlenków
alkilowych,
15.20 gen ahpF kodujący dużą podjednostkę reduktazy wodoronadtlenków
alkilowych,
15.21 gen cysK kodujący syntazę A cysteiny,
15.22 gen cysB kodujący regulator regulonu cys,
15.23 gen cysJ kodujący flawoproteinę reduktazy NADPH:siarczyn,
15.24 gen cysI kodujący hemoproteinę reduktazy NADPH:siarczyn,
15.25 gen cysH kodujący reduktazę adenylosiarczanową,
15.26 gen rseA kodujący białko błonowe o aktywności anty-sigmaE,
15.27 gen rseC kodujący globalny regulator czynnika sigmaE,
15.28 gen sucA kodujący podjednostkę dekarboksylazy dehydrogenazy 2ketoglutaranowej,
15.29 gen sucB kodujący podjednostkę
dehydrogenazy 2-ketoglutaranowej,
E2
dihydrolipoilotransbursztynazy
15.30 gen sucC kodujący podjednostkę β syntetazy bursztynylo-CoA,
15.31 gen sucD kodujący podjednostkę α syntetazy bursztynylo-CoA,
15.32 gen aceE kodujący komponent E1 kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej,
15.33 gen aceF kodujący komponent E2 kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej,
15.34 gen rseB kodujący regulator aktywności czynnika sigmaE,
15.35 produkt genu otwartej ramki odczytu yodA Escherichia coli oraz
15.36 produkt genu otwartej ramki odczytu yaaU Escherichia coli.
16. Sposób według zastrzeżeń od 1 do 15, gdzie do przygotowania L-treoniny,
mikroorganizmy z rodziny Enterobacteriaceae fermentują przy jednoczesnym tłumieniu, a
zwłaszcza eliminacji lub ograniczeniu ekspresji, jednego lub więcej genów wybranych z
grupy obejmującej:
16.1 gen tdh kodujący dehydrogenazę treoniny,
- 32 -
16.2 gen mdh kodujący dehydrogenazę jabłczanową,
16.3 produkt genu otwartej ramki odczytu yjfA Escherichia coli
16.4 produkt genu otwartej ramki odczytu ytfP Escherichia coli
16.5 gen pckA kodujący karboksykinazę fosfoenolopirogronianu,
16.6 gen poxB kodujący oksydazę pirogronianu,
16.7 gen dgsA kodujący regulator DgsA układu fosfotransferazy,
16.8 gen fruR kodujący represor fruktozowy,
16.9 gen rpoS kodujący czynnik sigma38 oraz
16.10 gen aspA kodujący liazę asparaginianoamonową.
Sporządziła i zweryfikowała
Dorota Rzążewska
Rzecznik patentowy
- 33 -
Figura 1: Mapa plazmidu pTrc99Aeno
5510 pz