biochemia v1.0 - Serwis materiałów dla studentów medycyny

BIOCHEMIA
Skrypt dla studentów medycyny
opracowany na podstawie
„Biochemii Harpera”
Michu®
Wrocław 2008
Wersja 1.0
- 2-
SPIS TREŚCI
Rozdział I – Aminokwasy, peptydy, białka
1. Aminokwasy
a) budowa, b) nazewnictwo i wzory, c) klasyfikacja, d) funkcje, e) właściwości fizyczne, f) właściwości
chemiczne – reakcje aa, g) techniki rozdziału
2. Peptydy
a) synteza i właściwości wiązania peptydowego, b) nazewnictwo, podział i funkcje peptydów,
c) przykłady peptydów aktywnych biologicznie
3. Białka
a) klasyfikacja, b) identyfikacja, c) poziomy organizacji i fałdowanie, d) rozdział i określanie struktury
białek, e) związek budowy i funkcji białek fibrylarnych i globularnych
Rozdział II – Struktura i funkcje enzymów
1. Ogóle właściwości enzymów
a) klasyfikacja i nazewnictwo, b) centrum katalityczne, c) koenzymy i witaminy będące ich
prekursorami, d) swoistość działania enzymów, e) aktywność enzymów, jednostki aktywności,
f) kompartmentacja komórkowa enzymów, g) izoenzymy, h) izolacja enzymów
2. Mechanizmy działania enzymów
a) typy reakcji enzymatycznych przy dwóch substratach, b) mechanizm działania chymotrypsyny,
c) mechanizm działania fruktozo-2,6-bisfosfatazy, d) mechanizm działania transaminaz, e) kataliza
kwasowo – zasadowa (k-z), f) enzymy wymagające atomów metali
3. Kinetyka reakcji enzymatycznych
a) ogólne zasady kinetyki reakcji chemicznych, b) kinetyka katalizy enzymatycznej; czynniki
wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej, c) wpływ stęŜenia substratu na szybkość reakcji,
d) zjawisko kooperatywności, e) inhibicja odwracalna i nieodwracalna
4. Regulacja aktywności enzymów
a) regulacja ilości enzymu, b) regulacja aktywności katalitycznej enzymu
5. Znaczenie diagnostyczne pomiarów aktywności enzymów
a) enzymy indykatorowe, ekskrecyjne i sekrecyjne, b) enzymy najczęściej oznaczane w praktyce
klinicznej, c) panele enzymatyczne, d) diagnostyka enzymatyczna w onkologii
Rozdział III – Transport przez błony i utleniania biologiczne
1. Budowa i funkcje błon biologicznych
a) skład błon, b) funkcje błon
2. Transport przez błony biologiczne – klasy białek transportujących
a) kanały jonowe, b) przenośniki transbłonowe – translokazy, c) pompy jonowe, d) wymienniki
3. Oksydoreduktazy, ich kofaktory i grupy prostetyczne
a) klasyfikacja oksydoreduktaz, b) kofaktory i grupy prostetyczne przenoszące protony i elektrony
4. Transport atomów wodoru przez błonę mitochondrialną
5. Łańcuch oddechowy
6. Fosforylacja oksydacyjna
7. Reaktywne formy tlenu (RFT)
8. Utlenianie mikrosomalne
9. Cykl kwasów trójkarboksylowych (TCA)
a) reakcje cyklu, b) bilans energetyczny cyklu, c) powiązania z innymi szlakami – amfiboliczność
cyklu, d) regulacja cyklu
10. Kompleks oksydazy α-ketokwasów
Rozdział IV – Węglowodany
1. Budowa chemiczna, właściwości i funkcje cukrów prostych i złoŜonych
a) monosacharydy, b) disacharydy, c) polisacharydy
2. Trawienie węglowodanów i jego zaburzenia
3. Wchłanianie i transport węglowodanów
a) transport aktywny i bierny, białka transportujące, b) zróŜnicowanie tkankowe transportu, c) rola
insuliny, d) rola fosforylacji monosacharydów
4. Metabolizm glukozy
- 3-
5.
6.
7.
8.
a) glikoliza (szlak EMP), b) glukoneogeneza, c) szlak pentozofosforanowy (szlak WDH, PPP),
d) niektóre zaburzenie przemian glukozy
Metabolizm glikogenu
a) glikogenogeneza, b) glikogenoliza, c) regulacja glikogenogenezy i glikogenolizy, d) glikogenozy
Inne szlaki metabolizmu monosacharydów
a) szlak kwasu uronowego, b) metabolizm fruktozy, c) metabolizm galaktozy
Metabolizm heteroglikanów
a) aminocukry – heksozoaminy, b) glikoproteiny, c) proteoglikany, d) mukopolisacharydozy
Regulacja przemiany węglowodanów
a) zróŜnicowanie tkankowe przemiany węglowodanowej i integracyjna rola wątroby,
b) kontrola stęŜenie glukozy we krwi i hormonalna regulacja metabolizmu węglowodanów
Rozdział IV – Lipidy
1. Budowa chemiczna, podział i rola tłuszczów prostych i złoŜonych
a) funkcje tłuszczów, b) podział lipidów, c) kwasy tłuszczowe, d) triglicerydy (TG), e) fosfolipidy,
f) glikolipidy, g) steroidy, h) poliprenoidy
2. Trawienie i wchłanianie lipidów
3. Transport lipidów w chłonce i w osoczu
a) budowa lipoprotein, b) transport lipidów w lipoproteinach osocza, c) zaburzenia transportu
lipoproteinowego, d) rola wątroby w metabolizmie lipidów
4. Tkanka tłuszczowa – rola w metabolizmie lipidów
a) metabolizm adipocytów, b) regulacja, c) brunatna tkanka tłuszczowa
5. Utlenianie kwasów tłuszczowych
a) lokalizacja komórkowa i tkankowa, b) aktywacja i transport KT do mitochondrium, c) β-oksydacja
nasyconych KT, d) oksydacja nienasyconych KT, e) ketogeneza, f) zaburzenia oksydacji KT
6. Lipogeneza – synteza kwasów tłuszczowych
a) lokalizacja i transport substratów, b) przebieg lipogenezy, c) synteza nienasyconych KT,
d) metabolizm eikozanoidów
7. Synteza trójglicerydów
a) lokalizacja tkankowa i komórkowa, b) przebieg syntezy
8. Cholesterol
a) biosynteza cholesterolu, b) trawienie i wchłanianie cholesterolu, c) równowaga cholesterolu i
endocytoza LDL, d) wydalanie cholesterolu, e) miaŜdŜyca
9. Kwasy Ŝółciowe
10. Kalcyferole
11. Hormony sterydowe
Rozdział VI – Przemiana azotowa: aminokwasy, nukleotydy, porfiryny
1. Trawienie białek w przewodzie pokarmowym
a) enzymy i ich specyficzność, b) transport azotu pomiędzy tkankami
2. Ogólna przemiana aminokwasów i metabolizm grupy aminowej
a) transaminacja, b) dezaminacja, c) transport, d) eliminacja
3. Metabolizm poszczególnych aminokwasów
a) Asp, b) Asn, c) Glu, d) Gln, e) Ala, f) Gly, g) Ser, h) Pro, i) Hyp, j) Arg, k) Orn, l) Cys, m) Phe,
n) Tyr, o) Lys, p) Hyl, q) His, r) Thr, s) Met, t) Trp, u) Val, Leu i Ile
4. Przemiana nukleotydów
a) trawienie kwasów nukleinowych w przewodzie pokarmowym, b) budowa nukleotydów,
c) biosynteza nukleotydów purynowych, d) degradacja puryn, e) odzysk puryn, f) synteza nukleotydów
pirymidynowych, g) degradacja pirymidyn, h) kwas foliowy; zaburzenia przemiany nukleotydów
5. Metabolizm porfiryn
a) synteza hemu, b) rozkład hemu, c) zaburzenia metabolizmu porfiryn
Rozdział VII – Biochemia funkcjonalna tkanek
1. Endogenne regulatory procesów metabolicznych
a) regulacja metabolizmu przez hormony, mechanizmy regulacji, receptory, przekaźniki wtórne,
b) eikozanoidy – budowa, powstawanie i funkcje metaboliczne
2. Gospodarka wapniowo – fosforanowa w organizmie i jej regulacja
a) rola wapnia oraz białek wiąŜących wapń, b) regulacja przemiany wapniowej, c) rola fosforanu
nieorganicznego, regulacja przemiany fosforanowej, powiązania z gospodarką wapniową
3. Gospodarka Ŝelazem w organizmie – wchłanianie, regulacja, zaburzenia przemiany
- 4-
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Biochemia krwi
a) białka osocza i ich rola, b) struktura i funkcja erytrocytów, c) budowa i metabolizm leukocytów na
przykładzie neutrofili, d) budowa i metabolizm trombocytów, e) hemostaza osoczowa
Biochemia wątroby
a) rola tkanki wątrobowej, b) przemiana węglowodanowa, lipidowa i azotowa w wątrobie, c) wątroba
jako gruczoł zewnątrzwydzielniczy, d) procesy biotransformacji i detoksykacji
Biochemia nerek
a) funkcje i regulacja, b) skład i właściwości moczu w normie i w patologii
Biochemia mięśni
a) budowa i charakterystyka białek mięśni, b) mechanizm skurczu mięśnia
Biochemia tkanki łącznej
a) składniki tkanki łącznej, ich budowa i funkcja, b) synteza kolagenu – reakcje i regulacja procesu,
c) biochemia kości
Biochemia zmysłu wzroku
a) rola i przemiany karotenoidów w organizmie człowieka,
b) reakcje zachodzące w procesie fotorecepcji
Rozdział VIII – Kwasy nukleinowe i biosynteza białek
1. Budowa i właściwości kwasów nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny
a) elementy składowe kwasów nukleinowych – zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy, b) budowa
przestrzenna i właściwości DNA, c) budowa, właściwości i klasyfikacja RNA, d) budowa chromatyny,
e) chromatyna aktywna i nieaktywna, f) sekwencje powtarzające; mutacje dynamiczne; konwersja genu,
g) rekombinacja (crossing-over); wymiana chromatyd siostrzanych, h) gen i jego ekspresja; genom,
i) transpozony; geny przekształcone, j) motywy funkcjonalne białek wiąŜących się z DNA
2. Replikacja i naprawa DNA; cykl komórkowy i jego regulacja
a) inicjacja, b) elongacja, c) terminacja, d) regulacja replikacji i cykl komórkowy, e) naprawa DNA
3. Synteza RNA (transkrypcja) i jego modyfikacje
a) transkrypcja u Procariota, b) róŜnice w transkrypcji u Eucariota, c) geny podzielone; snRNA;
składanie mRNA, d) modyfikacje potranskrypcyjne mRNA; redagowanie RNA, e) transkrypcja genów
tRNA i rRNA
4. Translacja – biosynteza białek
a) kod genetyczny, b) budowa tRNA i aktywacja aa, c) budowa i funkcje rybosomów, d) etapy
translacji, e) regulacja i inhibitory translacji, f) potranslacyjne modyfikacje białek
5. Mitochondrialne DNA (mtDNA)
- 5-
- 6-
ROZDZIAŁ I – AMINOKWASY, PEPTYDY I BIAŁKA
1.
Aminokwasy
a)
budowa
Aminokwasy (ang. aminoacids = aa), jak sama nazwa wskazuje, naleŜą do dwufunkcyjnych pochodnych
węglowodorów, zawierających w cząsteczce grupę karboksylową oraz aminową. Ogólnie rzecz biorąc, względne
połoŜenie obu tych grup moŜe być dowolne, jednak zdecydowanie największe znaczenie posiadają α-Laminokwasy, ze względu na to, iŜ wchodzą w skład peptydów i białek. Określenie α-aminokwasy oznacza, iŜ
obie główne grupy funkcyjne przyłączone są do tego samego, I-rzędowego atomu węgla; wynika stąd ich wzór
ogólny postaci: H2N-CH(R)-COOH, gdzie R jest fragmentem zmiennym, charakterystycznym dla kaŜdego aa i
decydującym o jego właściwościach. Aa mogą równieŜ ulegać w organizmie rozmaitym modyfikacjom, np.
hydroksylacji (4-hydroksy-Pro, 5-hydroksy-Lys), karboksylacji (γ-karboksy-Glu), metylacji, formylacji,
acetylacji (N-Ac-Glu), prenylacji, fosforylacji i innym.
b) nazewnictwo i wzory
KaŜdy aa białkowy posiada nazwę systematyczną, wynikającą z jego budowy chemicznej, jak równieŜ
zwyczajową. W praktyce posługuje się wyłącznie tymi drugimi, jak równieŜ ich skrótami – trój- oraz
jednoliterowymi. Nazwy zwyczajowe aa białkowych, ich skróty oraz wzory strukturalne przedstawia poniŜsza
tabela.
Lp.
Nazwa zwyczajowa i skróty
1.
glicyna, Gly, G
2.
alanina, Ala, A
3.
walina, Val, V
4.
leucyna, Leu, L
5.
izoleucyna, Ile, I
6.
seryna, Ser, S
7.
treonina, Thr, T
8.
cysteina, Cys, C
Wzór strukturalny
- 7-
c)
•
9.
metionina, Met, M
10.
kwas asparaginowy, Asp, D
11.
asparagina, Asn, N
12.
kwas glutaminowy, Glu, E
13.
glutamina, Gln, Q
14.
arginina, Arg, R
15.
lizyna, Lys, K
16.
histydyna, His, H
17.
fenyloalanina, Phe, F
18.
tyrozyna, Tyr, Y
19.
tryptofan, Trp, W
20.
prolina, Pro,
klasyfikacja
Aa klasyfikuje się ze względu na rozmaite kryteria:
Ze względu na udział w syntezie peptydów wyróŜnia się aa białkowe i niebiałkowe. KaŜdy aa białkowy
posiada co najmniej jeden kodon – kodujący go układ 3 nukleotydów w mRNA; listę 20 aa białkowych
zawiera powyŜsza tabela. Aa niebiałkowe nie są zawarte w informacji genetycznej, powstają zaś w
wyniku modyfikacji aa białkowych. Dalsze kryteria klasyfikacji odnoszą się wyłącznie do aa
białkowych.
- 8-
•
•
•
•
Ze względu na polarność rodnika (R) aa białkowe dzieli się na:
aa z R niepolarnym: G, A, V, L, I, P, F,
aa z R polarnym niejonizującym: S, T, Y, C, M, Q, N, W,
aa z R polarnym jonizującym:
kwaśne: D, E,
zasadowe: K, R, H.
Ze względu na budowę chemiczną R:
aa z R alifatycznym: G, A, V, L, I,
aa z R zawierającym grupę hydroksylową: S, T, Y,
aa z R zawierającym atom siarki: C, M,
aa z R zawierającym grupy kwasowe lub ich amidy: D, E, N, Q,
aa z R zawierającym grupy zasadowe: K, R, H,
aa z R zawierającym pierścień aromatyczny: F, Y, W, H,
aa o charakterze iminokwasów: P.
Ze względu na zdolność organizmu ludzkiego do ich syntezy, aa dzieli się na endo- i egzogenne.
Aa endogenne są syntetyzowane przez ludzkie hepatocyty i nie wymagają dostarczania ich z
pokarmem. NaleŜą do nich: G, A, P, S, Y, D, E, N, Q.
Aa egzogenne (niezbędne, niezastąpione) nie są syntetyzowane w ludzkim ustroju, a ich obecność i
odpowiednie stęŜenie w białkach spoŜywczych decyduje o ich wartości odŜywczej. Są to: V, L, I, F, T,
M, W, K, R, H (histydyna jest niezbędna dla dzieci do lat 12, ale nie jest niezbędna dla dorosłych).
Ze względu na produkty metabolizmu wyróŜnia się: aa glikogenne, metabolizowane do prekursorów
węglowodanów oraz aa ketogenne, metabolizowane do ciał ketonowych. (patrz równieŜ punkt V-3)
d) funkcje
NajwaŜniejszą funkcją aa jest wzajemne łączenie się, w wyniku czego powstają cząsteczki o wyŜszych
poziomach organizacji – peptydy, polipeptydy oraz białka (tworzenie wiązania peptydowego omówione jest
dalej). Ponadto aa biorą udział w takich procesach fizjologicznych jak: przekaźnictwo w układzie nerwowym
(Gly, Glu, Asp, GABA), regulacja procesów wzrostu komórki (Phe i Tyr – substraty do syntezy T3/4), biosynteza
zasad azotowych, porfiryn i mocznika (Orn, Cyt, Arg-bursztynian) oraz transdukcja sygnałów
wewnątrzkomórkowych (odwracalna fosforylacja Ser, Thr i Tyr).
e)
właściwości fizyczne
W warunkach naturalnych aa mają postać krystalicznych ciał stałych; nie absorbują światła widzialnego,
dlatego są bezbarwne (moŜna je wybarwić i uwidocznić specjalnymi metodami, o czym później).
Z wyjątkiem glicyny wszystkie α-aa wykazują czynność optyczna, tzn. ich roztwory skręcają płaszczyznę
świata spolaryzowanego. Wykazują równieŜ izomerię optyczną, tworząc szeregi konfiguracyjne D i L.
Składnikami białek są wyłącznie L-aa, co oznacza, iŜ numeracja podstawników przy chiralnym atomie węgla
(Cα) wg kryterium masy rośnie przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Choć wykazano występowanie D-aa
(Ser, Asp), w układzie nerwowym ssaków, to nie wchodzą one w skład peptydów i białek; ponadto D-aa
występują w ścianach komórkowych niektórych bakterii (Ala, Glu) oraz w antybiotykach.
Większość aa jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i tworzy roztwory, w których wykazuje charakter na
ogół obojętny. Dzięki obecności w cząsteczce zarówno grupy karboksylowej – o charakterze kwaśnym, jak i
aminowej – o charakterze zasadowym, aa mogą tworzyć wewnętrzne sole – występować w postaci jonów
obojnaczych (H3N+-CH(R)-COO-) i tworzyć kryształy jonowe. Tłumaczy to polarną i krystaliczną strukturę aa, z
czego wynikają wysokie temperatury topnienia (dalsze ogrzewanie prowadzi do rozkładu).
MoŜliwe formy jonowe aa bez bocznych grup hydrolizujących przedstawione są poniŜej:
R-CH(N(+)H3)-COOH ↔K1↔ R-CH(N(+)H3)-COO- ↔K2↔ R-CH(NH2)-COO(I) pH < pI
(II) pI
(III) pH > pI
Krzywa miareczkowania takiego aa składa się z dwóch sigmoidalnych części, rozdzielonych punktem
izoelektrycznym:
pH = pK1 + log [II]/[I] dla pH < pI
pK2 + log [III]/[II] dla pH < pI
Przez punkt izoelektryczny (pI) rozumiemy wartość pH, w której aa występuje niemal w całości w postaci jonu
obojnaczego, nie wędruje w polu elektrycznym i cechuje się minimalną moŜliwą rozpuszczalnością w wodzie. pI
to innymi słowy wartość pH w punkcie pomiędzy wartościami pK po obydwu stronach form izojonowych (jonu
obojnaczego) – stąd dla aa z R niepolarnym pI = ½ x (pK1 + pK2).
- 9-
JeŜeli chodzi o aa z rodnikiem polarnym i jonizującym, sytuacja przedstawia się odmiennie dla kwasów
oraz zasad. W przypadku kwasu najpierw tracony jest proton z własnej reszty karboksylowej, następnie z grupy
bocznej, a na samym końcu z własnej grupy aminowej; wobec tego pI oblicza się podobnie jak dla aa z R
niepolarnym, czyli: pI = ½ x (pK1 + pK2). Natomiast w przypadku zasady najpierw tracony jest proton z reszty
karboksylowej, następnie z grupy bocznej, a ostatecznie z własnej grupy aminowej; wyraŜenie opisujące pI
przyjmuje zatem postać: pI = ½ x (pK2 + pK3).
f)
właściwości chemiczne – reakcje aa
Aa posiadają kilka grup funkcyjnych – α-aminową, α-karboksylową oraz reaktywne grupy w obrębie R
(niektóre aa) – dzięki czemu mogą ulegać wielu rozmaitym przemianom.
• Reakcje grupy karboksylowej:
dysocjacja i tworzenie soli (aa + zasada):
H2N-CH(R)-COOH →OH-→ H2N-CH(R)-COOH2N-CH(R)-COOH + NaOH → H2N-CH(R)-COONa (sól sodowa aa)
tworzenie estrów (aa + alkohol):
H2N-CH(R)-COOH + R1-OH → H2N-CH(R)-CO-O-R1
tworzenie amidów
tworzenie bezwodników kwasowych
dekarboksylacja (pod wpływem ogrzewania lub enzymatycznie):
H2N-CH(R)-COOH →∆T, -CO2→ R-CH2-NH2
• Reakcje grupy aminowej:
dysocjacja i tworzenie soli:
H2N-CH(R)-COOH →H+→ H3N+-CH(R)-COOH
H2N-CH(R)-COOH + HCl → Cl-H3N+-CH(R)-COOH = HCl.H2N-CH(R)-COOH (chlorowodorek aa)
estryfikacja, acylacja, N-formylacja
dezaminacja (gł. enzymatyczna):
H2N-CH(R)-COOH →→ R-CO-COOH (ketokwas)
• Grupa hydroksylowa (Ser, Thr, Tyr) – estryfikacja
• Grupa sulfhydrylowa (Cys):
utlenianie
do cystyny: 2 Cys-SH →-2H→ Cys-S-S-Cys
do kwasu cysteinowego (przez silne utleniacze, np. kwas nadmrówkowy):
Cys →HCOOOH→ HO2S-CH2-CH(NH2)-COOH
alkalizacja
• JeŜeli grupa aminowa znajduje się w dalekim połoŜeniu w stosunku do grupy karboksylowej (tj. przy
C4-C6), wówczas w wyniku ogrzewania następuje wewnętrzna cyklizacja i powstają cykliczne amidy –
laktamy. Np. kwas 6-aminoheksanowy tworzy kaprolaktam, będący surowcem do produkcji
poliamidów.
• Jak wcześniej wspomniano, aa mają postać bezbarwnych ciał stałych. MoŜna jej jednak wybarwić
poprzez reakcję z ninhydryną. Jest to reakcja charakterystyczna aa, pozwalająca na ich identyfikację. Jej
produktami są aldehydy poch. od aa oraz złoŜony barwnik, którego anion posiada intensywnie
purpurową barwę.
•
Reakcja powstawania i charakterystyka wiązania peptydowego – patrz punkt I-2-a.
-10-
g) techniki rozdziału
Skład mieszaniny aa, np. pochodzącej z hydrolizy peptydu, moŜna określić za pomocą chromatografii lub
elektroforezy.
• Istotą chromatografii jest rozdział składników między fazą stacjonarną a ruchomą, spowodowany ich
silniejszym wiązaniem się z jedną z tych faz. Istnieje kilka rodzajów chromatografii.
• Chromatografia bibułowa jest najprostsza do przeprowadzenia, gdyŜ nie wymaga specjalnego sprzętu.
Kroplę roztworu zawierającą aa nanosi się na pasek bibuły (stąd nazwa), który następnie umieszcza się
w szczelnym naczyniu, tak iŜ koniec paska styka się z rozpuszczalnikiem. Ten stopniowo wędruje
wzdłuŜ paska, „wciągany” przez higroskopijną strukturę bibuły. Po przepływie rozpuszczalnika do
końca pasek suszy się oraz identyfikuje (wybarwia) aa przez dodanie roztworu ninhydryny – powstają
w ten sposób purpurowe plamy. Pozycja plamy danego aa, uwarunkowana jego ruchliwością
chromatograficzną, zaleŜy od jego względnej polarności – aa z R niepolarnymi i długimi wędrują na
pasku dalej niŜ aa z R krótszymi lub polarnymi. Dla kaŜdego aa moŜna wyznaczyć jego względną
ruchliwość (Rf), definiowaną jako stosunek odległości przebytej przez dany aa do odległości przebytej
przez czoło rozpuszczalnika.
• Chromatografia cienkowarstwowa (ang. thin-layer chromatography = TLC) dzieli się na podziałową
(partition TLC = PTLC) oraz adsorpcyjną (adsorption TLC = ATLC).
W PTLC wykorzystuje się rozdział składników mieszaniny pomiędzy fazę stacjonarną oraz ciekłą –
ruchomą, które dodatkowo róŜnią się polarnością.
W typowej PTLC faza stacjonarna jest bardziej polarna, zaś rozpuszczalnik zawiera zarówno
składniki polarne, jak i mało polarne. Wraz z przesuwem rozwijacza nad nośnikiem zmienia
się skład rozpuszczalnika, gdyŜ jego bardziej polarne składniki wiąŜą się z polarnymi grupami
hydroksylowymi celulozy – wskutek tego przesuwające się czoło rozpuszczalnika staje się
stopniowo coraz mniej polarne. W typowej PTLC słabiej polarne składniki mieszaniny
wędrują więc dalej od polarnych podobnej wielkości.
W PTLC w fazie odwróconej polarność faz oraz szybkość wędrówki składników próby są
odwrotne niŜ powyŜej – faza stacjonarna jest mniej polarna, a faza ruchoma utrzymuje swoją
polarność. Dlatego polarne składniki mieszaniny wędrują z czołem rozpuszczalnika, a mniej
polarne pozostają z tyłu.
W ATLC wykorzystuje się adsorpcję składników próby na praŜonym Ŝelu krzemionkowym. Faza
ruchoma eluuje (wymywa) zaadsorbowane składniki, współzawodniczące o miejsce wiązania na Ŝelu –
składniki słabiej związane wymywane są w pierwszej kolejności.
• Klasyczna chromatografia kolumnowa przeprowadzana jest w kolumnie szklanej, wypełnionej
ściśliwym złoŜem, w warunkach wykluczających stosowanie wysokich ciśnień; ogranicza to
maksymalną szybkość przepływu rozpuszczalnika, a tym samym szybkość całego procesu
chromatografii. Udoskonaleniem tej metody jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high
performance liquid chromatography = HPLC), prowadzona w kolumnach ze stali nierdzewnej,
wypełnionych mniejszymi i bardziej jednorodnymi cząsteczkami nieściśliwego wymiennika jonowego,
sita molekularnego lub złoŜa stosowanego w chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Bywa
równieŜ określana jako wysokociśnieniowa, gdyŜ wartości uŜywanych ciśnień osiągają wartości 5 – 10
tys. psi. Do jej zalet naleŜy znaczne skrócenie czasu rozdziału, co ogranicza dyfuzję boczną i zapewnia
lepszy rozdział składników próby. Rozdział aa metodą HPLC uwzględnia ich reakcję z odczynnikiem
umoŜliwiających ich identyfikację i ocenę ilościową. Reakcję tą przeprowadza się albo przed (precolumn) albo po (post-column) właściwej chromatografii. Przy barwieniu post-column uŜywa się
znanej juŜ ninhydryny, która tworzy barwne związki indygowe (pochłaniające promieniowanie z
zakresu światła widzialnego). Z kolei przy barwieniu pre-column uŜywa się odczynnika określanego
skrótem AQC, który wykazuje zdolność fluorescencji – aa identyfikuje się więc przez oświetlenie
lampą UV.
• Elektroforeza wysokonapięciowa (ang. high-voltage electrophoresis = HVE) słuŜy do rozdzielania
mieszanin amfolitów, czyli cząsteczek, których wypadkowy ładunek zaleŜy od pH otoczenia.
Zaliczamy tu m. in. aa, polipeptydy, nukleotydy, fosfosacharydy i inne. Próbki nanosi się na nośnik
zwilŜony buforem o odpowiednim pH i następnie umieszcza w polu elektrycznym. Wówczas kationy
wędrują do katody, a aniony do anody, przy czym szybkość wędrówki składników zaleŜy od ich
ładunku elektrycznego (wprost proporcjonalnie) oraz od masy cząsteczkowej (odwrotnie
proporcjonalnie). Po zakończeniu rozdziału produkty uwidacznia (wybarwia) się odpowiednim
odczynnikiem.
Rozdział aa prowadzi się na bibule lub cienkowarstwowej płytce pokrytej sproszkowaną celulozą, a
wybarwia roztworem ninhydryny.
Rozdział polipeptydów i białek prowadzi się na usieciowanym Ŝelu poliakrylamidowym (PAG).
-11-
Do rozdziału oligomerów nukleotydowych uŜywa się agarozy i PAG, do wybarwiania produktów słuŜy
zaś bromek etydyny (identyfikacja w świetle UV).
2.
Peptydy
a)
synteza i właściwości wiązania peptydowego
Tworzenie wiązania peptydowego jest najistotniejszą reakcją aa z biologicznego punktu widzenia. Polega
ono na kondensacji dwóch aa, a dokładniej na reakcji grupy karboksylowej jednego aa z grupa aminową
drugiego aa, czemu towarzyszy eliminacja cząsteczki wody:
...-COOH + H2N-... →-H2O→ ...-CO-NH-...
Stała równowagi powyŜszej reakcji jest przesunięta na korzyść hydrolizy wiązania peptydowego. Jego
powstanie musi być zatem poprzedzone aktywacją grupy karboksylowej – laboratoryjnie osiąga się to przez
przekształcenie aa w chlorek kwasowy, zaś w organizmach Ŝywych aa ulega kondensacji z ATP, tworząc
aktywny aminoacyloadenylan (patrz punkt VIII-4-b).
Wiązanie peptydowe moŜe występować w formie ketonowej (-CO-NH-), bądź enolowej (-CO(-)=N(+)H-),
które wzajemnie w siebie przechodzą (zjawisko to określane jest jako tautomeria keto-enolowa). Stabilizacja
rezonansowa wiązania peptydowego nadaje mu charakter częściowo (ok. 40%) wiązania podwójnego. Ma to
daleko idące konsekwencje – wiąŜe się bowiem ze skróceniem długości i usztywnieniem wiązania oraz
zablokowaniem wokół niego rotacji przyległych atomów. Sprawia to, iŜ wszystkie 4 atomy tworzące wiązanie
(C, O, N, H) znajdują się w jednej płaszczyźnie (tzn. są koplanarne) i pozbawione są moŜliwości wzajemnego
ruchu. To z kolei umoŜliwia występowanie izomerii geometrycznej względem atomu tlenu: cis (Z) i trans (E),
przy czym fizjologicznie wyraźnie dominuje ta druga. Rotacja moŜe odbywać się jedynie wokół wiązań Cα-C
oraz N-Cα. Charakter tej rotacji opisują ilościowo tzw. kąty torsyjne: φ (Cα-C) i ψ (N-Cα). Mają one określone
wartości dla uporządkowanych struktur II-rzędowych (por. dalej).
Wiązanie peptydowe nie posiada ładunku w Ŝadnym istotnym fizjologicznie pH. Pomimo to peptydy są w
fizjologicznym pH obdarzone ładunkiem elektrycznym dzięki ładunkom ich grup końcowych (karboksylowej i
aminowej) oraz polarnych grup R. Wartość tego ładunku zaleŜy od wartości pK i otoczenia grup dysocjujących
oraz od pH otoczenia. Podobnie jak kaŜdemu aa moŜna przyporządkować pI, tak kaŜdemu peptydowi odpowiada
punkt izojonowy – wartość pH, przy której liczba protonów związanych z grupami zasadowymi jest równa
liczbie protonów odszczepionych przez grupy kwasowe (wyrównanie liczby ładunków). Własność ta dotyczy
czystych peptydów, a wartość jest dla danego związku stała i charakterystyczna.
Wiązanie peptydowe nie absorbuje promieniowania z zakresu widzialnego, toteŜ nie nadaje zawierającym
je związkom barwy. Pochłania natomiast promieniowanie UV z zakresu λ = 220-230 nm.
Obecność wiązania peptydowego, począwszy od trójpeptydów, moŜna wykazać za pomocą reakcji
biuretowej. Nazwa ta pochodzi od biuretu (H2N-CO-NH-CO-NH2) – najprostszego związku dającego pozytywny
wynik wspomnianej reakcji. Przeprowadza się ją dodając do próby zasadowego roztworu siarczanu miedzi
(CuSO4) – wynik pozytywny objawia się intensywnie fioletowym zabarwieniem.
b) nazewnictwo, podział i funkcje peptydów
W kaŜdym peptydzie wyróŜniamy dwa końce – aminowy (N) oraz karboksylowy (C), zaleŜnie od rodzaju
występującej na nim wolnej grupy funkcyjnej. Jeśli chodzi o nazewnictwo, obowiązuje zasada podawania
kolejności aa od N-końca do C-końca. Peptydy traktuje się jako acyloaminokwasy, więc końcówkę nazwy aa,
którego grupa karboksylowa jest podstawiona, zmienia się na „-ylo”. Jedynie aa znajdujący się na C-końcu – z
wolną grupą karboksylową – zachowuje niezmienioną nazwę. Np. Ile-Cys-Gly to izoleucylo-cysteinylo-glicyna.
Wiele naturalnych peptydów zawiera zmodyfikowane aa lub nietypowe wiązania.
Ze względu na ilość reszt aa wchodzących w skład peptydu, wyróŜniamy: oligopeptydy (3-10; 3 –
trójpeptydy, 4 – tetrapeptydy itd.), polipeptydy (10-100) oraz białka (>100). Zgodnie z innym kryterium (masy)
peptydy o masie <10 kDa określane są jako polipeptydy, zaś o masach większych – jako białka.
Peptydy pełnią rozmaite funkcje biologiczne:
• hormony, np. TRH, ADH, OT
• neuroprzekaźniki i neuromodulatory, np. enkefaliny, endorfiny, PS, neurotensyna, somatostatyna
• toksyny, np. mikrocystyny i nodularyny syntetyzowane przez cyjanobakterie
• antybiotyki, np. walinomycyna, gramicydyna A i S, bleomycyna
• antyoksydanty, np. GSH
-12-
c)
przykłady peptydów aktywnych biologicznie
Nie tylko wielkocząsteczkowe białka o skomplikowanej i wielorzędowej strukturze, ale proste
oligopetydy, złoŜone ze stosunkowo niewielkiej liczby aa, mogą pełnić w organizmie waŜne i niezastąpione
funkcje. Omówione zostaną wg liczby reszt aa.
•
Istotnymi biologicznie dwupeptydami są: karnozyna, homokarnozyna i anseryna.
Karnozyna, czyli Nα-(β-alanylo)histydyna, w znacznych ilościach występuje w mięśniach
szkieletowych wyŜszych kręgowców i człowieka. Wzmaga aktywność ATP-azy miozynowej oraz
chelatuje jony Cu2+ i pobudza pobieranie związków miedzi.
Homokarnozyna, czyli Nα-(4-aminobutyrylo)histydyna, jest dwupeptydem ośrodkowego układu
nerwowego, występującym w tkance mózgowej, którego funkcja nie jest znana.
Anseryna, czyli π-metylokarnozyna lub Nα-(3-aminopropionylo)-π-metylohistydyna, występuje w
mięśniach szkieletowych wyŜszych kręgowców, które odznaczają się szybką czynnością skurczową, np.
mięśnie kończyn królika lub mięśnie piersiowe ptaków. Brak anseryny w mięśniach człowieka. U
niŜszych kręgowców, np. u ryb kostnoszkieletowych występuje ona w znacznych ilościach, w
porównaniu ze śladową ilością karnozyny.
•
Aktywnym trójpeptydem jest tyreoliberyna (TRH) – produkowana przez podwzgórze stanowi czynnik
uwalniający tyreotropinę z przedniego płata przysadki. Jej pełna nazwa to:
piroglutamylohistydyloprolinoamid. Składa się z reszt aminokwasowych Glu, His i Pro, przy czym Nkońcowy kwas glutaminowy ulega wewnętrznej cyklizacji o kwasu piroglutaminowego, zaś C-końcowa
grupa karboksylowa proliny występuje jako amid kwasowy.
•
Innym aktywnym trójpeptydem, pełniącym rolę biologicznego układu redox, jest glutation, czyli γglutamylocysteinyloglicyna. Zawiera on reszty Glu, Cys i Gly, przy czym Glu łączy się z Cys
wiązaniem nie-α-peptydowym – wiązanie peptydowe tworzy nie grupa karboksylowa przy
asymetrycznym C1, lecz przy C3. Glutation występuje w komórkach w stosunkowo duŜych ilościach –
rzędu 5 mM. Obecny jest w postaci dwóch form – utlenionej i zredukowanej, przy czym tej drugiej jest
zazwyczaj około 500 razy więcej. Glutation pełni rolę buforującą stanowiąc bufor hydrosulfidowy.
Pełni równieŜ role odtruwającą, poniewaŜ jest przeciwutleniaczem reagującym z nadtlenkiem wodoru i
nadtlenkami organicznymi, unieszkodliwiając te uboczne i toksyczne produkty metabolizmu.
-13-
•
Do aktywnych pięciopeptydów zaliczamy enkefalinę metioninową i leucynową. Pierwsza ma postać:
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, druga zaś: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu – róŜnią się zatem jedynie C-końcowym
aminokwasem, uwzględnionym w nazwie. Wraz z endorfinami (α, β, γ) – grupą polipeptydów o 20-30
resztach aminokwasowych – stanowią one naturalne peptydy opioidowe, przeciwbólowe, o działaniu
podobnym do morfiny, lecz silniejszym 18-20 razy.
•
Aktywnym ośmiopeptydem jest angiotensyna II (hipertensyna), powstająca z osoczowego
angiotensynogenu pod wpływem reniny wydzielanej w nerkach, a następnie pod wpływem działania
enzymu konwertującego. Skutkiem działania reniny na angiotensynogen jest powstanie
dziesięciopepetydu – angiotensyny I, z której pod wpływem wspomnianego enzymu powstaje
angiotensyna II. Ma ona strukturę: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe. Angiotensyna zwęŜa naczynia
krwionośne i jest najsilniejszym czynnikiem podwyŜszającym ciśnienie krwi. Pobudza korę nadnerczy
do syntezy aldosteronu, który zwiększa resorpcję zwrotną jonu Na+ w nerkach, przeciwdziałając ich
utracie z moczem.
•
Bradykinina to dziewięciopeptyd rozszerzający naczynia krwionośne i obniŜający ciśnienie krwi, działa
zatem antagonistycznie do angiotensyny II. Odpowiedzialna jest równieŜ za uczucie bólu towarzyszące
zranieniu skory. Ma postać: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Bradykinina stanowi typowa
kininę powstającą ze specjalnych białek, kininogenów, naleŜących do α2-globulin osocza pod wpływem
swoistych enzymów proteolitycznych, zwanych kalikreinami.
•
Dzięwięciopeptydami wykazującymi aktywność klasycznych hormonów są wazopresyna i oksytocyna,
produkowane w podwzgórzu, a magazynowane w tylnym płacie przysadki. Mają prawie identyczną
sekwencje aminokwasową, róŜnią się jedynie dwoma aminokwasami, dlatego hormony te wywołują
pewne wspólne efekty biologiczne. Wazopresyna czyli hormon antydiuretyczny (ADH) zwiększa
wchłanianie zwrotne wody w dystalnych kanalikach nerkowych. Niedobór ADH prowadzi do
moczówki prostej. Oksytocyna stymuluje skurcze mięśni gładkich macicy (przez co rozpoczyna akcję
porodową) i gruczołu sutkowego.
•
Niektóre peptydy wykazują aktywność biologiczną antybiotyków. Antybiotyki peptydowe mają bardzo
charakterystyczną cykliczna strukturę i mogą zawierać D-aminokwasy.
-14-
•
Penicylina jest produkowana przez pleśń Penicillium, gdzie powstaje z Val i Cys, które tworzą 4członowy pierścień β-laktamowy i 5-członowy pierścień tiazolidynowy. Do pierwszego z nich
przyłączana jest wiązaniem peptydowym zmienna grupa kwasowa (R), która moŜe być róŜna i przez to
wyróŜniamy róŜne rodzaje penicylin. Penicylina poprzez reaktywny pierścień β-laktamowy zawierający
wiązanie peptydowe nieodwracalnie hamuje transpeptydazę glikopeptydową – kluczowy enzym w
syntezie ścian komórkowych bakterii. W praktyce najczęściej uŜywa się penicyliny G.
Symbol
F
G
K
V
X
Nazwa penicyliny
pentylopenicylina
benzylopenicylina
heptylopenicylina
fenoksymetylopenicylna
hydroksybenzylopenicylina
Wzór R
-CH2-CH=CH-CH2-CH3
-CH2-C6H5
-(CH2)6-CH3
-CH2-O-C6H5
-CH2-C6H4-OH
•
Aktynomycyna D pochodzi ze szczepu Streptomyces. W swej strukturze zawiera grupę barwnikową
(kwas fenoksazonodikarboksyowy), która połączona jest wiązaniami peptydowymi z dwoma
pięciopeptydami. Końcowe grupy karboksylowe obu pięciopeptydów tworzą makrocykliczne
pierścienie laktonowe. W pięciopeptydach występuje D-Val. Aktynomycyna D jest specyficznym
inhibitorem syntezy RNA, czyli transkrypcji, zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i
eukariotycznych, dlatego często jest wykorzystywana w badaniach biochemicznych. Aktynomycyna D
wiąŜe się specyficznie z 2-niciowym DNA, uniemoŜliwiając jego uŜycie jako matrycy w syntezie RNA.
ObniŜenie stęŜenia mRNA prowadzi do hamowania syntezy białka. Pierścień fenoksazonowy
aktynomycyny interkaluje, czyli wślizguje się pomiędzy pary zasad CG w 2-niciowym DNA, natomiast
cykliczne polipeptydy wystają jeden ponad, a drugi pod pierścieniem fenoksazonowym Symetria
aktynomycyny D dokładnie odpowiada symetrii specyficznej sekwencji zasad CG. Ponadto
aktynomycyna D ma działanie cytostatyczne, czyli hamuje podział komórek, w tym komórek szybko
dzielących się, dlatego znalazła zastosowanie w leczeniu niektórych nowotworów.
•
Walinomycyna ma strukturę cykliczną, utworzoną z aminokwasów i hydroksykwasów połączonych na
przemian wiązaniami estrowymi i peptydowymi. Składa się z trzykrotnie powtórzonego elementu, w
skład którego wchodzą reszty L-mleczanu (Lac), L-waliny, D-hydroksyizowalerianu (Hiv) i D-waliny.
Walinomycyna jest jonoforowym antybiotykiem nośnikowym, pod wpływem którego błony
biologiczne stają się przepuszczalne dla jonu K+. Organizmy znajdujące się pod wpływem
-15-
antybiotyków jonoforowych pozbawione są moŜliwości kontroli nad wymianą składników z
otoczeniem. Walinomycyna koordynacyjnie wiąŜe jon K+ z 6 atomami tlenu reszt walin centralnej
przestrzeni cząsteczki i jako nośnik przenosi je na drugą stronę błony.
•
Gramicydyna S jest cyklicznym dziesięciopeptydem, w strukturze którego występują 2 reszty Dfenyloalaniny.
•
Gramicydyna A jest równieŜ polipepetydowym antybiotykiem jonoforowym, zbudowanym z 15
naprzemiennie występujących reszt L- i D-aminokwasowych, który na N-końcu posiada grupę
formylową. Przyjmuje strukturę β-helisy. Poprzez N-formylowe końce dwa takie polipeptydy łączą się,
tworząc dimeryczny, funkcjonalny kanał jonowy dla kationów jednowartościowych, np. Na+, lecz nie
dla dwuwartościowych. Kanał ten spontanicznie otwiera się i zamyka, przepuszczając w ciągu sekundy
ponad 107 kationów. Por tego kanału wyścielony jest polarnymi grupami karboksylowymi peptydu, a
hydrofobowe łańcuchy boczne ustawione są na obwodzie kanału. UłoŜenie to umoŜliwiają zestawione
naprzemiennie reszty L i D-aminokwasowe.
3.
Białka
a)
klasyfikacja
•
•
Ze względu na kształt cząsteczki i rozpuszczalność w wodzie białka dzieli się na:
globularne – o współczynnikach osiowych ≤ 3-4, a więc w przybliŜeniu kuliste, dobrze rozp. w wodzie,
fibrylarne – o współczynnikach osiowych > 10 (kształt wydłuŜony), nierozpuszczalne w wodzie.
Ze względu na stan skupienia dzieli się białka na: stałe (kolagen, elastyna), półpłynne
(cytoplazmatyczne) oraz płynne (białka osocza).
Ze względu na budowę cząsteczki – obecność dodatkowych składników – na:
białka proste (proteiny) – zbudowane wyłącznie z aa i nie posiadające dodatkowych elementów, m. in.:
albuminy, globuliny, histony, protaminy, skleroproteiny,
białka złoŜone (proteidy) – zawierające dodatkowe składniki niebiałkowe, np. cząsteczki
węglowodanów (glikoproteiny), lipidów (lipoproteiny), resztę kwasu fosforowego (fosfoproteiny), atom
metalu (metaloproteiny), cząsteczkę barwnika (chromoproteiny) lub związane z kwasem nukleinowym
(nukleoproteiny).
Ze względu na pełnione w organizmie funkcje:
enzymatyczne – np. dehydrogenaza mleczanowa (LDH), transaminaza asparaginianowa (AspAT),
cyklooksygenaza (COX),
hormonalne – np. hormony przedniego płata przysadki (GH, PRL, ACTH, TSH, FSH, LH), hormony
trzustki (insulina, glukagon), parathormon (PTH),
strukturalne – np. kolagen, elastyna, keratyna,
transportowe – np. transferryna, hemoglobina (HGB), ceruloplazmina (CER), transkobalamina (TC),
zapasowe – np. mioglobina, ferrytyna,
odpornościowe – np. immunoglobuliny, białka układu dopełniacza (C), białka ostrej fazy,
kurczliwe lub pośrednio biorące udział w ruchu – np. aktyna, miozyna, tropomiozyna, troponina,
toksyny – np. tęŜcowa (tetanospazmina i tetanolizyna), botulinowa, toksyna cholery.
Białka pokarmowe dzieli się ze względu na przydatność dla organizmu na: pełnowartościowe –
zawierające aa egzogenne oraz niepełnowartościowe – złoŜone z aa endogennych.
•
•
•
-16-
b) identyfikacja
Obecność białka w środowisku moŜna wykazać za pomocą kilku reakcji:
Reakcja ksantoproteinowa (gr. ksantos – Ŝółty, proteina – białko) polega na działaniu na próbę
stęŜonym kwasem azotowym (HNO3). JeŜeli w próbie tej znajduje się białko zawierające aa
aromatyczne, to ulegną one reakcji nitrowania, dając produkty dysocjujące do Ŝółto-pomarańczowego
anionu, np.:
Tyr + HNO3 →∆T, -H2O→ 3-nitrozotyrozyna
• Reakcja biuretowa bierze swoją nazwę od biuretu (dwumocznika: H2N-CO-NH-CO-NH2) –
najprostszego związku dającego jej pozytywny wynik. Pozwala ona na wykrycie obecności wiązania
peptydowego, począwszy od trójpeptydów wzwyŜ. Przeprowadza się ją dodając do próby zasadowego
roztworu siarczanu miedzi (CuSO4). JeŜeli w próbie znajduje się związek zawierający dwa sąsiadujące
wiązania peptydowe, to utworzy on z jonami miedzi (II) połączenie kompleksowe o intensywnie
fioletowym zabarwieniu. NaleŜy jednak zaznaczyć, iŜ pozytywne miano nie potwierdza obecności w
próbie związków aminokwasowych.
• Reakcja cystynowa pozwala na wykrycie białek zawierających wiązania dwusiaczkowe (S-S).
Przeprowadza się ją w środowisku zasadowym, z dodatkiem rozpuszczalnej soli ołowiu, np. octanu.
Pod wpływem wysokiego pH następuje rozpad wspomnianych wiązań z uwolnieniem anionu
wodorosiarczkowego:
Cys-S-S-Cys + H2O + OH- → 2 CH3COCOOH + 2 NH3 ↑ + HS- + S ↓,
który łączy się z kationem ołowiu, prowadząc do strącenia czarnego osadu siarczku ołowiu:
Pb(CH3COO)2 + HS- → CH3COOH + CH3COO- + PbS ↓.
•
c)
poziomy organizacji i fałdowanie
Białka naleŜą do najbardziej złoŜonych związków chemicznych występujących w przyrodzie. Ich budowa
wykazuje pewne poziomy organizacji, stąd dla precyzyjnego jej opisu wprowadzono pojęcie struktury I, II, III i
IV-rzędowej. Metody laboratoryjne określania kolejnych struktur nieznanych białek opisane zostaną dalej.
• Przez strukturę I-rzędową rozumiemy liczbę, budowę i kolejność (sekwencję) połączonych ze sobą
reszt aa tworzących dane białko, wraz ze wskazaniem miejsc występowania wiązań dwusiarczkowych
(S-S). Struktura I-rzędowa opisuje więc konfigurację peptydu. Przez konfigurację rozumiemy
powiązania geometryczne między danym zbiorem atomów, których zmiana wiąŜe się z zerwaniem i
ponownym uformowaniem wiązań kowalencyjnych.
• Struktura II-rzędowa określa sposób skręcenia łańcucha polipeptydowego, czyli jego konformację.
Konformacja to trójwymiarowa architektura cząsteczki, inaczej przestrzenne powiązania między
atomami; moŜe ona ulec zmianie przez reorganizację stabilizujących ją wiązań niekowalencyjnych
(wiązania kowalencyjne zostają zachowane – por. wyŜej). Cząsteczka białka o określonej konfiguracji
(strukturze I-rz.), wobec moŜliwości swobodnej rotacji wokół duŜej części (ok. 2/3) wiązań głównego
łańcucha polipeptydowego, moŜe posiadać nieproporcjonalnie duŜą liczbę moŜliwych konformacji,
choć zwykle tylko niektóre z nich umoŜliwiają cząsteczce pełnienie funkcji biologicznych. Liczba ta
ograniczona jest częściowo podwójnym charakterem wiązania peptydowego, jak równieŜ rodzajem i
kształtem grup bocznych (R) aa. Kąty rotacji φ i ψ muszą więc przyjmować takie kombinacje wartości,
aby wykluczyć przestrzenne konflikty między poszczególnymi atomami cząsteczki, a ich znajomość
pozwala na jednoznaczne określenie konformacji wszystkich atomów gł. łańcucha polipeptydowego.
Dozwolone wartości obejmują konformacje regularne – α-helisę, β-kartkę, zwrot β, superhelisę
kolagenu oraz nieregularne – pętle i zwoje.
Ogólnie rzecz biorąc, kaŜda helisa (zwój) tworzona jest przez szkielet polipeptydowy skręcający się
równomiernie wokół kaŜdego atomu Cα. Istnieją róŜne typy helis, róŜniące się między sobą rozmiarami
i kierunkiem skrętu. Budowę helisy opisuje się więc przez podanie: liczby reszt aa przypadających na
jeden skręt (n) oraz skoku śruby (p) lub odległości między sąsiednimi skrętami. Helisy polipeptydowe
zabudowane z aa chiralnych są równieŜ chiralne, tzn. prawo- bądź lewoskrętne, przy czym w
naturalnych białkach występują niemal wyłącznie te pierwsze. Taki kierunek skrętu zdeterminowany
jest przez fakt budowy cząsteczki z enancjomerów L: w wyniku przyciągania się atomów wiązania
peptydowego lŜejsza grupa N-H zbliŜa się w stronę cięŜszej grupy C-O właśnie w prawo.
α-helisa cechuje się korzystnymi wartościami kątów rotacji oraz układem stabilizujących wiązań
wodorowych. Zawiera zazwyczaj 4 – 50 (śr. ok. 12) reszt aa, posiada parametry: n=3,6, p=0,54 nm.
RównowaŜne atomy z sąsiednich reszt łańcucha głównego oddalone są o 0,15 nm (mierzone wzdłuŜ
osi). Grupy R skierowane są na zewnątrz helisy, co minimalizuje wzajemne interakcje przestrzenne. We
wnętrzu helisy praktycznie brak wolnej przestrzeni. Dzięki maksymalnej liczbie wiązań wodorowych
jest to konformacja o najniŜszej energii i tym samym największej stabilności, dlatego formuje się ona
-17-
•
spontanicznie. Wiązania wodorowe występują między atomem N wiązania peptydowego oraz atomem
O wchodzącym w skład czwartego kolejnego wiązania peptydowego tego samego łańcucha (wiązania
wewnątrzłańcuchowe); mają one optymalną odległość 0,28 nm. Dodatkową funkcję pełnią wiązania
van der Waalsa (por. dalej), zwłaszcza działające poprzecznie do osi helisy, pomiędzy ciasno
upakowanymi atomami jej rdzenia. Jedynie peptydowy atom N proliny nie moŜe uformować wiązania
wodorowego, dlatego aa ten pasuje jedynie do 1. obrotu helisy – w innym miejscu wytwarza on zgięcie.
α-helisy występują zwykle na powierzchni cząsteczek białek, chociaŜ mogą być równieŜ częściowo lub
całkowicie schowane w ich wnętrzu. Szczególny przypadek stanowią helisy amfipatyczne, w których aa
polarne i niepolarne zmieniają się ze sobą co 3 – 4 reszty – w ten sposób mogą one kontaktować się ze
środowiskiem polarnym z jednej strony, a z niepolarnym z drugiej. Helisy amfipatyczne występują m.
in. w: lipoproteinach osocza, hormonach, toksynach, antybiotykach, glikoproteinach wirusa HIV oraz w
kinazie białkowej regulowanej kalmoduliną.
Struktura β nazywana jest inaczej β-kartką, β-harmonijką lub pofałdowanym arkuszem. Nazwy te
odnoszą się do jej kształtu, obserwowanego wzdłuŜ krawędzi – Cα i związane z nimi R występują
naprzemiennie nieco powyŜej i poniŜej płaszczyzny głównego łańcucha polipeptydowegom który jest
niemal w pełni rozciągnięty. β-kartka posiada powtarzające się co do wartości kąty φ i ψ oraz jest
stabilizowana maksymalną ilością wiązań wodorowych. Te jednak, w przeciwieństwie do α-helisy,
mają charakter międzyłańcuchowy – występują między atomami N i O wiązań peptydowych
sąsiadujących pasm łańcuchów peptydowych; w ich tworzenie zaangaŜowane są odcinki o długości 5 –
10 aa z róŜnych regionów struktury I-rz.
Struktury β mogą być równoległe lub antyrównoległe (przeciwrównoległe, przeciwbieŜne); w
pierwszym przypadku sąsiednie łańcuchy peptydowe biegną w tym samym kierunku, w drugim zaś – w
przeciwnym. Z wyjątkiem pasm granicznych tworzą się wszystkie moŜliwe wiązania wodorowe. W
strukturze antyrównoległej pary wiązań wodorowych występują na przemian raz blisko, a raz daleko od
siebie, a zorientowane są mniej więcej prostopadle do szkieletu polipeptydowego. Z kolei w strukturze
równoległej wiązania wodorowe są rozmieszczone równomiernie, ale leŜą względem siebie ukośnie i w
zmiennych kierunkach. Powszechne są regiony połączenia struktur równoległych i antyrównoległych,
wiele łańcuchów moŜe teŜ występować w obrębie jednej kartki (chociaŜ struktury równoległe złoŜone z
< 5 łańcuchów są nieco mniej stabilne i przez to rzadko spotykane). Niemal wszystkie pasma
harmonijki β są zwinięte prawoskrętnie, tworząc centralny rdzeń wielu białek globularnych.
Zwrot β (zagięcie β, β-skręt) to układ umoŜliwiający zmianę kierunku przebiegu struktury β, często
łączący końce dwóch przyległych pasm antyrównoległych. Zwrot β umoŜliwiający zmianę kierunku
łańcucha o 180o składa się z 4 aa, z czego pierwszy tworzy wiązania wodorowe z czwartym. Ponadto
często zawiera glicynę – z powodu niewielkiego rozmiaru oraz prolinę – gdyŜ ok. 6 % jej wiązań
peptydowych posiada konfigurację cis. Jest to struktura regularna, często obecna na powierzchni białek.
W typowym białku globularnym jedynie ok. połowa aa wchodzi w skład struktur α i β, podczas gdy
reszta występuje w postaci struktur nieregularnych, tj. pętli i zwojów. Szczególnie dotyczy to obu
końców (N i C) oraz reszt R lizyny. Obszary pętli warunkują głównie właściwości powierzchni
cząsteczek białek. Bezładna struktura wiąŜe się z giętkością i łatwością dopasowania, przy czym wiele
obszarów bezładnych ulega organizacji pod wpływem specyficznych ligandów; z tego powodu regiony
nieregularne często występują w miejscach interakcji cząsteczek białek z innymi cząsteczkami
(ligandami), np. w centrach katalitycznych enzymów, czy na powierzchni białek odpornościowych,
gdzie kształtują obszary oddziaływania przeciwciała z antygenem. Pętle o kształcie spinki do włosów
spinają sąsiadujące antyrównoległe struktury β.
Struktury II-rz. mogą tworzyć motywy naddrugorządowe, np. klucz grecki pojedynczy i podwójny,
motyw βαβ czy β-spinkę (antyrównoległe pasma β zespolone krótką pętlą).
Struktura III-rz. określa przestrzenne powiązania między elementami struktury II-rz. (helisami,
kartkami, innymi), jak równieŜ wzajemne oddziaływania między domenami, sposoby fałdowania oraz
oddziaływania stabilizujące takie ułoŜenie.
Struktura III-rz. stabilizowana jest przez róŜnorodne rodzaje wiązań niekowalencyjnych:
wiązania wodorowe – wytwarzane przez polarne R aa
oddziaływania hydrofobowe – występują pomiędzy niepolarnymi R aa
oddziaływania elektrostatyczne („mostki solne”) – tworzą się między przeciwnie naładowanymi
grupami, np. końcami N i C peptydów bądź R polarnymi jonizującymi (np. Lys i Asp)
siły van der Waalsa – są bardzo słabe i działają jedynie na niewielkie odległości, równe sumie
promieni van der Waalsa atomów pomiędzy którymi występują
Białka mogą być dodatkowo stabilizowane kowalencyjnymi wiązaniami dwusiarczkowymi (S-S);
rozwiązanie takie występuje w niektórych enzymach (np. rybonukleaza), hormonach (np. insulina) czy
białkach strukturalnych (keratyna).
-18-
Struktury II-rz. i motywy naddrugorzędowe, zwłaszcza w duŜych białkach, mogą być zorganizowane w
połączone ze sobą fragmenty, zwane domenami. Domena to lokalna, zwarta, globularna, potencjalnie
niezaleŜne jednostka fałdowania białka, związana z nim jednak wiązaniami kowalencyjnymi. Domena
reprezentuje zwarty genetycznie segment, np. domeny w Ig, dehydrogenazach czy globinach; ponadto
interesujące jest, iŜ sekwencje aa charakterystyczne dla danej domeny moŜna spotkać w innych,
podobnych domenach tego samego białka lub w innych białkach. Domeny często nadają białkom w
których występują zdolność pełnienia specyficznych funkcji, np. wiązania swoistych ligandów
(nukleotydów, polisacharydów). Przestrzeń między domenami wyznacza często centrum aktywne
białka, a powierzchnia kontaktu między nimi jest miejscem przenoszenia mechanizmów
allosterycznych.
Zaburzenia struktury II/III-rz. białek stanowią istotę chorób prionowych (TSE) – zmiany w konformacji
białek powodują zastąpienie α-helisy przez β-kartkę oraz wystąpienie oporności na proteolizę
enzymatyczną.
• Struktura IV-rz. określona jest w przypadku białek oligomerycznych, tj. złoŜonych z ≥ 2 łańcuchów
polipeptydowych – zwanych protomerami lub podjednostkami – połączonych siłami
niekowalencyjnymi. Opisuje ona sposób ułoŜenia w przestrzeni kilku wzajemnie ze sobą
oddziaływujących łańcuchów. Cechuje się ponadto największą złoŜonością, a zarazem jest najsłabiej
poznana.
Ze względu na liczbę podjednostek wyróŜniamy odpowiednio di-, tri-, tetramery itd. Homooligomery
składają się z kilku identycznych podjednostek, podczas gdy heterooligomery – z róŜnych; róŜne
protomery białek heterooligomerycznych pełnią zazwyczaj specyficzne funkcje, np. katalityczne,
regulacyjne czy rozpoznające ligandy. Właściwości chemiczno-biologiczne białek podjednostkowych
zaleŜą od przestrzennej orientacji ich podjednostek.
• W odpowiednich warunkach moŜna pozbawić białko struktur wyŜszych rzędów.
Denaturacja polega na zniszczeniu wiązań niekowalencyjnych białka, a tym samym na trwałej utracie
jego struktury II, III i IV-rz. oraz aktywności biologicznej. Do denaturacji dochodzi pod wpływem tzw.
czynników denaturujących, do których zaliczamy: wysoką temperaturę, silnie polarne (kwaśne lub
zasadowe) środowisko oraz określone substancje: alkohol, formalina, rozpuszczalne sole metali
cięŜkich (głównie ołowiu, rtęci i srebra), SDS.
W przeciwieństwie do denaturacji, koagulacja (wysolenie) polega na odwracalnej utracie postaci białka
pod wpływem działania soli metali lekkich, np. NaCl, NH4Cl. Sole te, dzięki właściwościom
higroskopijnym, wiąŜą i pozbawiają białko pewnej ilości wody, wskutek czego naturalny półpłynny zol
białkowy zmienia postać na półstały Ŝel. Dodanie do skoagulowanego białka wody powoduje
przywrócenie mu pierwotnej konsystencji, co nazywa się peptyzacją.
• Natywne białka nie mają postaci prostych łańcuchów, lecz są w skomplikowany sposób zwinięte lub –
inaczej mówiąc – sfałdowane. Fałdowanie białek nie odbywa się na drodze prób i błędów, o czym
świadczy chociaŜby paradoks Levinthala – czas przypadkowego poszukiwania odpowiedniej struktury
sfałdowania nawet w przypadku niewielkiego peptydu byłby teoretycznie dłuŜszy niŜ szacowany wiek
wszechświata. Oczywiste jest zatem, iŜ fałdowanie białek to nieprzypadkowy i wysoce zorganizowany
proces.
Proces fałdowania składa się z kilku faz: formowania krótkich fragmentów struktury i ich wzrostu →
uformowania domen (w białkach wielodomenowych połączonych w tzw. stopioną globulę) → zmian
konformacyjnych nadających strukturę III-rz. → osiągnięcia natywnej struktury (na tym kończy się
fałdowanie białek monomerycznych) → ew. łączenia podjednostek i formowania oligomerów.
Łańcuchy polipeptydowe wielu zdenaturowanych białek spontanicznie (bez zewnętrznej interwencji,
„same z siebie”) zwijają się powtórnie w warunkach in vitro, łącznie z przywróceniem aktywności
biologicznej, choć trwa to o wiele dłuŜej niŜ w warunkach in vivo; zjawisko to określa się mianem
renaturacji.
In vivo procesy fałdowania przebiegają o wiele szybciej i są wyraźnie ukierunkowane, m. in. dzięki
obecności specyficznych enzymów:
izomeraza dwusiarczkowa białek (ang. protein disulphide isomerase – PDI) ułatwia przetasowanie
wiązań dwusiarczkowych (S-S) przez zwiększenie szybkości wzajemnej wymiany mostków S-S,
izomeraza peptydylo-prolinowa cis-trans (ang. peptidil-proline isomerase – PPI) katalizuje
izomeryzację wiązań peptydowych X-Pro z formy trans do cis (przekształceniu ulega ok. 10 %
wiązań),
chaperony (białka opiekuńcze, m. in. tzw. białka szoku cieplnego – ang. heat shock protein = Hsp)
przyspieszają proces fałdowania przez zapewnienie białku ochronnego środowiska oraz preferencje
przemian powstrzymujących niewłaściwe interakcje między powierzchniami komplementarnymi i
ułatwiających właściwe interakcje.
-19-
d) rozdział i określanie struktury białek
•
•
•
•
•
Aby móc badać strukturę białek, naleŜy je wpierw wyizolować w stanie czystym, tzn. pozbawić
zanieczyszczeń i oddzielić od innych białek. Do najczęściej stosowanych technik oczyszczania i izolacji
białek naleŜą:
Chromatografia jonowymienna i HVE – stosowane są do aa i polipeptydów; podstawą rozdziału jest
ładunek elektryczny.
Filtracja Ŝelowa z uŜyciem wysokich stęŜeń (1-4M) kwasu mrówkowego lub octowego – stosowana do
wielkocząsteczkowych hydrofobowych peptydów; wykorzystuje odmienne zatrzymywanie i
wymywanie peptydów z porów sita molekularnego (Sephadex).
HPLC w odwróconym układzie faz (niepolarny nośnik + polarny rozpuszczalnik) – stosowana j.w.,
czasem w połączeniu z poprzednio omówiona metodą – do oczyszczania złoŜonych mieszanin
peptydów, otrzymywanych przez częściowe trawienie białek.
HVE na sitach molekularnych (sączenie molekularne) – technicznie przeprowadza się na skrobii,
agarozie lub Ŝelu poliakrylamidowym (PAG; usieciowany polimer akrylamidu). Stosuje się do
polipeptydów i polinukleotydów. Próbkę w buforze nanosi się na płytkę lub do rurki, rozdziela
elektroforetycznie i ostatecznie identyfikuje – peptydy błękitem brylantowym Coomassie lub solami
srebra, zaś polinukleotydy bromkiem etydyny. Czasem wykorzystuje się odmianę tej metody w
warunkach denaturujących (mocznik, SDS) – łańcuch peptydowy ulega wówczas rozprostowaniu,
dodatkowo wiąŜąc na powierzchni ładunek ujemny proporcjonalnie do swojej wielkości (właściwie do
ilości wiązań peptydowych), więc rozdział elektroforetyczny opiera się tu pośrednio na masie
cząsteczkowej. Metodę PAGE-SDS stosuje się więc do określania masy cząsteczkowe białek przez
porównanie ich ruchliwości elektroforetycznej z ruchliwościami wzorców o znanych masach.
Po uzyskaniu czystego białka moŜna przystąpić do stopniowego określania jego struktury. Wiele białek
składa się z ≥ 2 łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami niekowalencyjnymi lub przez
mostki dwusiarczkowe, które muszą być rozbite przed sekwencjonowaniem. W tym celu roztwór
badanego białka traktuje się czynnikami denaturującymi (mocznik, chlorowodorek guanidyny), które
rozbijają wiązania wodorowe i niektóre niekowalencyjne oraz czynnikami redukującymi lub
utleniającymi, które pozbawiają peptydy mostków dwusiarczkowych – czynniki utleniające, np. kwas
nadmrówkowy (HCOOOH), utleniają reszty cystyny do kwasu cysteinowego (Cys-SO3-), natomiast
czynniki redukujące, np. 2-merkaptoetanol, redukują je do cysteiny (Cys-SH).
Polipeptydy wielkocząsteczkowe rozbija się, czasami kilkuetapowo, na mniejsze fragmenty o długości
20-60 aa. Do tego celu uŜywa się następujących odczynników (w nawiasach podano rodzaj rozbijanego
wiązania): bromocyjan – CNBr (Met-X), trypsyna (Lys-X, Arg-X), o-jodobenzen (Trp-X),
hydroksyloamina (Asn-Gly), proteaza V8 Staphylococcus aureus (Glu-aa hydrofobowy), łagodna
hydroliza kwaśna (Asp-Pro).
Przed rozpoczęciem sekwencjonowania białka określa się jego skład aminokwasowy poprzez poddanie
go kwaśnej hydrolizie (6M HCl, 11oC, 1-4 doby), a następnie rozdzielenie i identyfikację wolnych aa
metodą HPLC, chromatografii jonowymiennej bądź elektroforetyczną. Wadą takiego postępowania jest
zniszczenie struktury wielu aa przez agresywne środowisko – całkowicie niszczone są Trp i Cys,
częściowo – Met, Tyr, Ser, Thr, ponadto zachodzi deamidacja Glu i Asn, natomiast wiązania Val-Val,
Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val wykazują oporność na ten rodzaj hydrolizy. Aby tego uniknąć, wykonuje się
kilka zabiegów:
Cys utlenia się do kwasu cysteinowego – opornego na działanie kwaśnego środowiska,
obecność Trp oznacza się po hydrolizie zasadowej (która za to niszczy Ser, Thr, Arg i Cys),
określa się tempo spadku poziomów Ser i Thr, po czym dane te ekstrapoluje się do czasu 0,
obecność aa rozgałęzionych oznacza się po 96 h hydrolizy,
obecność aa kwaśnych oraz ich amidów określa się łącznie jako Glx (Glu + Gln) i Asx (Asp + Asn).
Po określeniu procentowego udziału poszczególnych aa w budowie badanego białka, moŜna przystąpić
do jego sekwencjonowania, czyli określenia struktury I-rz. Istnieje tu kilka metod:
Najstarsze metody sekwencjnowania opierają się na przeprowadzeniu N-końcowego aa peptydu w
określoną pochodną, hydrolizę peptydu oraz identyfikację powstałej pochodnej aa. Taka jest m. in. idea
metody Sangera – uŜywa się w niej odczynnika Sangera – DNFB (2,4-dinitro-1-fluorobenzenu), który
reaguje wyłącznie z N-końcowymi resztami aa, po czym prowadzi się hydrolizę i identyfikację.
Bardziej zaawansowana metoda Edmana wnosi automatyczne usuwanie i identyfikację N-końcowych
reszt aa peptydów w postaci pochodnych. Wykorzystuje się tu odczynnik Edmana –
fenyloizotiocyjanian, który reagując z końcem aminowym peptydu daje kwas fenylotiohydantoinowy,
który w środowisku kwaśnym i obecności niehydroksylowych rozpuszczalników (np. nitrometanu)
rozpada się na fenylotiohydantoinową pochodną aa oraz peptyd skrócony o jeden N-końcowy aa. W
przeciwieństwie do metody Sangera, po usunięciu N-końcowego aa peptyd pozostaje niezmieniony.
-20-
•
•
Pochodne aa identyfikuje się metodą HPLC, po czym opisany cykl powtarza się 30 – 80 x w jednym
ciągu operacyjnym.
Oznaczenie struktury I-rz. wszystkich peptydów otrzymanych ze wstępnej hydrolizy próbki pozostawia
do wyjaśnienia jedynie kolejność ich ułoŜenia. Dlatego naleŜy otrzymać i zsekwencjonować dodatkowe
peptydy o nakładających się resztach N i C-końcowych (techniki rozrywające polipeptyd w innych
miejscach).
W celu oznaczenia połoŜenia wiązań dwusiarczkowych rozdziela się zarówno peptydy pochodzące z
hydrolizy próbki pierwotnej, jak i zmodyfikowane metodami utleniania / redukcji – za pomocą
chromatografii dwuwymiarowej lub chromatografii i elektroforezy.
Metoda Maxima i Gilberta prezentuje inne podejście do problemu – opiera się na szybkim
sekwencjonowaniu DNA genu kodującego dane białko i określeniu sekwencji aa na podstawie tabeli
kodu genetycznego. Jej wadą jest brak ujawniania miejsc wiązań dwusiarczkowych oraz obecności
posttranslacyjnych modyfikacji aa (hydroksylacja, metylacja, fosforylacja, estryfikacja, izoprenylacja).
Stosowana jest w identyfikacji labilnych pre- lub prepropeptydów istotnych w katalizie lub w badaniu
kierowania peptydów do określonych organelli komórkowych.
Alternatywnym sposobem sekwencjonowania krótkich (do ok. 25 aa) peptydów jest szybkie
bombardowanie atomowe (FAB) ze spektroskopią masową (MS) w dwóch połączonych
spektrometrach. Szybkie bombardowanie atomami gazów szlachetnych (Ar lub Xe) daje w efekcie
kationy peptydów. W pierwszym spektrometrze oddzielane są zanieczyszczenia, po czym jony
peptydów zderzają się w komorze z atomami He, ulegając fragmentacji do wielu jonów o
zmniejszających się rozmiarach, których masy cząsteczkowe oznaczane są w drugim spektrometrze –
porównanie jonów z rosnącymi masami pozwala na identyfikację wszystkich reszt aa i ich kolejności.
Metoda FAB-MS umoŜliwia identyfikację aa zmodyfikowanych posttranslacyjnie oraz – w
przeciwieństwie do metody Edmana – umoŜliwia sekwencjonowanie peptydów z zablokowanym (np.
zacylowanym) końcem aminowym.
Trójwymiarową strukturę białek moŜna badać metodami krystalografii rentgenowskiej oraz MRS.
Krystalografia rentgenowska ujawnia statyczny obraz białka krystalicznego. Wymaga duŜych,
doskonale uporządkowanych kryształów białka, zawierających szereg powtarzających się regularnie
identycznych cząsteczek, silnie załamujących promienie X. Obraz powstały w wyniku załamania
wiązki promieni na krysztale białka pozwala na odtworzenie struktury pojedynczej cząsteczki.
Kryształy białek hoduje się techniką wiszącej kropli, po czym eksponuje na monochromatyczne (o
jednej, stałej i określonej długości fali) promieniowanie X i obraza w celu uzyskania wszystkich
moŜliwych odwzorowań dyfrakcyjnych. Promienie X są wówczas rozpraszane i tworzą obraz zaleŜny
od gęstości elektronowej w róŜnych częściach białka. Maksima dyfrakcji są analizowane komputerowo,
aby na tej podstawie skonstruować mapy gęstości elektronowej (amplitudy i fazy). Reprezentują one
serię równoległych przekrojów przez białko, co z kolei pozwala na konstrukcję trójwymiarowych map
gęstości elektronowej i dalej – model fizyczny lub przybliŜone dopasowanie struktury I-rz. Dokładne
wyznaczenie połoŜeń atomów moŜliwe jest jedynie po zsekwencjonowaniu badanego białka.
Spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego (ang. magnetic resonance spectroscopy = MRS)
jest techniką dostarczającą informacji o strukturze białka w roztworze. Parametrami bezpośrednio
mierzonymi jest otoczenie chemiczne jąder atomowych wykazujących moment magnetyczny albo spin
(głównie 1H), co dostarcza informacji o odległości atomów w cząsteczce – przesunięciach
chemicznych. Dwuwymiarowa MRS analizuje skomplikowane widma otrzymywane z białek
zmieniających się w czasie, dlatego jest wykorzystywana do badania tworzenia struktur przejściowych
w procesie zwijania łańcuchów białkowych.
Do metod badania struktury IV-rz. białek i oznaczania ich mas cząsteczkowych zaliczamy m. in.:
Ultrawirowanie analityczne – pomiar szybkości sedymentacji białka przy wirowaniu z przyspieszeniem
kątowym 10 tys. x większym niŜ przyspieszenie ziemskie.
Wirowanie w gradiencie gęstości (zwykle 5 – 20 % roztworu zbuforowanej sacharozy) – porównanie
poziomu białka w próbówce w odniesieniu do poziomów białek o znanych masach cząsteczkowych
przy wirowaniu w powyŜszych warunkach.
Filtracja Ŝelowa – masę cząsteczkową nieznanego białka oblicza się z porównania jego objętości
elucyjnej z analogicznymi objętościami białek wzorcowych.
PAGE – rozdział białek w Ŝelach o zmiennej porowatości i wykrywanie błękitem brylantowym lub
solami srebra. PAGE-SDS stosowane jest do określania rozmiarów podjednostek oligomerów.
Mikrofotografia elektronowa – obrazowanie kompleksów makromolekularnych – wirusów,
kompleksów enzymatycznych czy oligomerów.
-21-
e)
związek budowy i funkcji białek fibrylarnych i globularnych
•
Białka fibrylarne cechują się m. in. wydłuŜonym kształtem i brakiem rozpuszczalności w wodzie.
Pełnią one funkcje białek strukturalnych w skórze, tkance łącznej oraz róŜnego rodzaju włóknach
(włosy, jedwab, wełna). Często zawierają atypowe sekwencje aa lub zmodyfikowane aa, co przekłada
się na strukturę II i III-rz. i konsekwentnie dalej na właściwości mechaniczne. Przykładami białek
fibrylarnych są: kolagen (patrz punkt VII-9-b), elastyna (VII-8-a), miozyna (VII-7-a), keratyna,
fibroina.
Keratyna nie jest pojedynczym białkiem, lecz całą rodziną, wśród której moŜna wyróŜnić tzw. keratyny
twarde i miękkie. Ogólnie cechują się one wysoką odpornością na czynniki fizyczne, chemiczne i
działanie proteaz oraz wysoką zawartością aa zawierających siarkę – Cys (17%) i Met
(0,5%).Wykazano istnienie ok. 10 izoform keratyn twardych, obecnych w rozmaitych wytworach
naskórka zwierząt – paznokciach, piórach, rogach, wełnie i innych. W ludzkich komórkach
nabłonkowych zidentyfikowano ok. 20 izoform cytokeratyn (40-70 kDa), naleŜących do keratyn
miękkich. Cytokeratyny stanowią największą i najbardziej zróŜnicowaną grupę filamentów pośrednich,
wchodzącą w skład cytoszkieletu komórkowego. Podjednostki keratyn zbudowane są według
wspólnego planu – wyróŜniamy w nich α-helisową domenę centralną oraz globularne domeny N i Ckońcowe. Ta pierwsza posiada wysoce konserwatywny charakter i składa się z 310-315 reszt aa, zaś
domeny terminalne liczą od 15 do 30 reszt. Podjednostki keratyn, asocjując w struktury wyŜszego
rzędu, tworzą kolejno: dimery → protofilamenty → protofibryle → filamenty pośrednie. W
przeciwieństwie do cytokeratyn, keratyny twarde są strukturami dwufazowymi, w których włókna
keratyny są zatopione w bezpostaciowej macierzy zbudowanej z białek o duŜej zawartości siarki.
Enzymy proteolityczne zdolne do hydrolizy keratyny to występujące u kręgowców kaspazy degradujące
cytokeratyny (udział w procesie apoptozy) lub syntetyzowane przez mikroorganizmy keratynazy.
Fibroina stanowi główne białko jedwabiu. 85% jej składu stanowi Gly, występująca na zmianę z Ser lub
Ala. Łańcuchy polipeptydowe formują szereg rozciągniętych antyrównoległych pasm β, tak iŜ grupy
boczne (R) Gly wyłaniają się z jednej powierzchni, zaś Ser lub Ala – z drugiej. W ten sposób układ
stabilizowany jest nie przez wiązania wodorowe, lecz przez oddziaływania hydrofobowe. Wtrącone co
pewien odcinek aa z duŜym R (Val, Tyr) zaburzają regularną strukturę β i zwiększają giętkość całości
konstrukcji.
•
Jedną z grup globularnych białek złoŜonych są chromoproteiny, reprezentowane w ludzkim ustroju gł.
przez białka hemowe – nazwane tak od dołączonego do łańcucha peptydowego barwnika – hemu. Rola
białek hemowych polega na transporcie i magazynowaniu tlenu oraz transporcie elektronów. Ich
zdolność wiązania tlenu uwarunkowana jest obecnością jonu Fe2+, zlokalizowanego w centrum grupy
hemowej, stanowiącej grupę prostetyczną hemoglobiny i mioglobiny. Grupa hemowa występuje
równieŜ w wielu enzymach – cytochromach, katalazie (CT), syntazie tlenku azotu (NOS), 2,3dioksygenazie tryptofanowej i innych.
Hem jest cyklicznym tetrapirolem – składa się z 4 grup pirolowych połączonych 4 mostkami
metinowymi między atomami Cα (układ porfiny), zaś przy atomach Cβ obecne są charakterystyczne
podstawniki. Układ wielu sprzęŜonych wiązań podwójnych nadaje cząsteczce płaski kształt (pierścienie
pirolowe, atomy C mostków metinowych i jon Fe2+ leŜą praktycznie w jednej płaszczyźnie) oraz
warunkuje pochłanianie światła w niskim zakresie światła widzialnego, dzięki czemu ma ona – a przez
to równieŜ HGB i krew – barwę czerwoną. Przy atomach Cβ występują grupy: metylowe (M – w
pozycjach 1, 3, 5, 8), winylowe (V – 2 i 4) oraz propionowe (P – 6 i 7). Te ostatnie, stanowiąc jedyne
polarne łańcuchy boczne hemu, są zwrócone w stronę powierzchni hemoprotein. Jak wcześniej
wspomniano, jon Ŝelaza zajmuje centralne miejsce w cząsteczce hemu, wiąŜąc się dwoma wiązaniami
kowalencyjnymi oraz dwoma koordynacyjnymi z czterema atomami N tetrapirolu. Pozostałe (5. i 6.)
wiązania koordynacyjne jonu Ŝelaza leŜą prostopadle do płaszczyzny porfiny – odpowiednio nad i pod
układem tetrapirolu.
Funkcją mioglobiny (MGB – skrót nieformalny) jest magazynowanie tlenu w mięśniach czerwonych.
Jej cząsteczka złoŜona jest z pojedynczego łańcucha polipeptydowego (masa ok. 17 kDa), złoŜonego ze
153 reszt aa. Zewnętrzna część cząsteczki jest polarna, zaś wewnętrzna – niepolarna, co ma związek z
rozpuszczalnością w wodzie. Wyjątkowo we wnętrzu cząsteczki znajdują się dwa aa polarne – His –
wiąŜące grupę hemową do części polipeptydowej. Cząsteczka mioglobiny ma kształt w przybliŜeniu
kulisty, pomimo nieregularnej i niesymetrycznej budowy. Poszczególne α-helisy, struktury β i pętle
określa się za pomocą liter i cyfr. AŜ ok. 75 % łańcucha występuje w formie 8 prawoskrętnych α-helis,
o długościach 7 – 20 reszt aa, oznaczonych literami od A do H, począwszy od N-końca. Fragmenty
międzyhelikalne oznacza się literami dwóch odcinków helikalnych przez nie połączonych. Pojedyncze
-22-
reszty aa oznacza się podając literę oznaczającą helisę oraz liczbę – pozycję aa w danej helisie,
począwszy od N-końca.
Aa zajmujące odległe miejsca w strukturze I-rz. mogą w wyniku skomplikowanego fałdowania
znaleźć się blisko siebie w strukturze III-rz., np. His F8 i His E7. Informacja zawarta w strukturze
I-rz. apomioglobiny jest odpowiedzialna za prawidłowe i swoiste upakowanie białka w obecności
hemu. Grupa hemowa znajduje się w zagłębieniu między helisami E i F, jon Ŝelaza wiąŜe się 5.
wiązaniem koordynacyjnym z pierścieniem imidazolowym His F8 (tzw. His proksymalna). Po
przeciwnej stronie płaszczyzny hemu (w stosunku do His F8) znajduje się His E7 (tzw. His
dystalna), która nie zajmuje jednak 6. pozycji koordynacyjnej Fe2+. W odtlenowanej MGB jon Fe2+
jest lekko (0,03 nm) wysunięty poza płaszczyznę hemu w kierunku His F8, natomiast w MGB
utlenowanej – gdy cząsteczka O2 zajmuje 6. pozycję koordynacyjną – wysunięcie to jest 3 x
mniejsze, wynosząc 0,01 nm. Związaniu cząsteczki tlenu towarzyszy więc ruch jonu Ŝelaza i His
F8 w stronę płaszczyzny porfiryny, co daje zmiany konformacyjne cząsteczki białka.
W utlenowanej MGB wiązanie Fe2+ – O jest prostopadłe do płaszczyzny porfiryny, natomiast 2.
atom tlenu przyłączony jest pod pewnym kątem („skośnie”). Z kolei tlenek węgla (CO) preferuje
przyłączanie się w całości prostopadle do tej płaszczyzny – taka orientacja jest jednak moŜliwa
jedynie w wyizolowanym hemie, bowiem fizjologicznie w MGB His dystalna stanowi przestrzenną
zawadę dla wiązania CO pod tym kątem. Zatem otoczenie hemu w MGB zmniejsza powinowactwo
CO do Ŝelaza hemowego, które w przypadku czystego hemu jest aŜ 25 tys. razy większe niŜ
powinowactwo O2 do tego Ŝelaza. Dzięki opisanemu mechanizmowi cząsteczka CO zmuszona jest
do wiązania się w mniej korzystnej konfiguracji, co obniŜa względne powinowactwo do ok. 200.
MGB jest białkiem magazynującym, a nie transportującym tlen. Ilość O2 związanego przez białko
(nasycenie, saturacja) zaleŜy od stęŜenia (ciśnienia) tego gazu – pO2. Nie jest to jednak zaleŜność
liniowa, lecz obrazuje ją krzywa dysocjacji tlenowej. Dla MGB krzywa ta ma kształt hiperboli, co
oznacza, iŜ oddaje ona tlen dopiero przy znacznym spadku pO2, co ma miejsce przy duŜym
deficycie tlenowym w warunkach wysokiej aktywności fizycznej. MGB nie mogłaby pełnić funkcji
transportu tlenu z płuc do tkanek, gdyŜ przy granicznych w tych warunkach wartościach pO2
oddaje ona jedynie znikomą część zmagazynowanego O2.
Hemoglobina (HGB) spełnia funkcję transportu gazów oddechowych – O2 z płuc do tkanek oraz CO2 i
H+ w kierunku przeciwnym.
HGB jest tetramerem złoŜonym z pary dwóch typów łańcuchów polipepydowych, oznaczanych α,
β, γ, δ, S itd. Łańcuchy te stanowią podjednostki HGB – posiada ona zatem strukturę IV-rz., dzięki
czemu zyskuje nowe właściwości, których nie prezentuje MGB. Łańcuch α składa się ze 141 reszt
aa, a β – ze 146, oba są kodowane przez odmienne geny. Znanych jest wiele typów HGB, jednak
do najwaŜniejszych naleŜą: HbA (α2β2; podstawowa fizjologiczna HGB dorosłych), HbA2 (α2δ2;
fizjologiczna HGB dorosłych, stanowi ok. 2,5 %), HbF (α2γ2; płodowa), HbS (α2S2; występuje w
sierpowatych erytocytach).
MGB i podjednostki β HbA wykazują praktycznie identyczną strukturę II i III-rz., podobna jest
równieŜ lokalizacja grup hemowej i odcinków helikalnych, choć HbA posiada ich tylko 7.
Hem kaŜdej podjednostki HGB przyłącza 1 cząsteczkę O2, więc cała HGB wiąŜe łącznie 4
cząsteczki tlenu. Co więcej, przyłączenie O2 do jednego hemu ułatwia wiązanie kolejnych O2 przez
pozostałe grupy hemowe – określa się to jako kooperatywne wiązanie O2 z HGB. Zjawisko to
pozwala na związanie maksymalnej ilości tlenu w płucach oraz uwalnianie moŜliwie największej
ilości tlenu w tkankach. Zjawisko kooperatywności powoduje, Ŝe krzywa dysocjacji tlenowej HGB
ma kształt sigmoidalny (wygięty jak litera S). Wniosek jest taki, iŜ połączenie łańcuchów
polipeptydowych w tetramer pozwala na zwiększenie wydajności transportu tlenu.
RóŜne typy HGB cechują się odmiennym powinowactwem do O2. Jego ilościową miarą jest
wskaźnik P50, tj. wartość pO2, przy której HGB jest wysycona tlenem w 50 %. P50 dla HbA wynosi
26 mmHg, a dla HbF 20 mmHg – oznacza to, iŜ HbF silniej wiąŜe O2 (przy danej pręŜności jest
wysycony w większym stopniu) – właściwość ta pozwala na przekazywanie tlenu z HbA na HbF w
obrębie łoŜyska. Po porodzie odsetek HbF szybko maleje, gdyŜ jego obecność nie jest juŜ
uzasadniona – płuca pracują, a wysokie powinowactwo HbF do tlenu utrudnia jego oddawanie w
tkankach. Na jego miejsce syntetyzowana jest HbA. Nagły rozpad duŜych ilości HbF wiąŜe się z
powstaniem duŜych ilości bilirubiny (por. punkt VI-5-b/c), co jest przyczyną Ŝółtaczki
noworodków.
Przyłączeniu O2 towarzyszy rozerwanie wiązań poprzecznych (niekowalencyjnych –
elektrostatycznych) między końcami C wszystkich podjednostek HGB, co zmienia jej strukturę II,
III i IV-rz. Jedna para podjednostek α+β wykonuje obrót o ok. 15o w stosunku do drugiej pary, w
wyniku czego podjednostki zbliŜają się do siebie i wzrasta powinowactwo do tlenu. Struktura IVrz. HGB częściowo utlenowanej określana jest jako stan napręŜony (T), zaś HGB całkowicie
-23-
utlenowanej – jako stan rozluźniony (R). Podczas utlenowania HGB atomy Fe, leŜące 0,06 nm
poza płaszczyzną porfiryny w HGB pozbawionej tlenu, wsuwają się bliŜej tej płaszczyzny,
pociągając za sobą His F8 i sąsiadujące z nią reszty aa. Prawdopodobieństwo przejścia T→R
wzrasta wraz z przyłączaniem olejnych cząsteczek O2 do HGB, gdyŜ wiązanie O2 osłabia i rozbija
wiązania poprzeczne utrzymujące HGB w stanie T. Równowaga T↔R znajduje się pod wpływem
takich czynników jak: H+, CO2, Cl-, BPG, które zwiększają ilość związanego O2 wymaganego do
przejścia T→R.
Po oddaniu O2 HGB wiąŜe CO2, transportując go do płuc – w ten sposób przenoszonych jest ok.
15% całkowitego CO2 transportowanego przez krew. CO2 wchodzi w reakcję z N-końcami
łańcuchów HGB, dając karbaminiany:
HGB-NH3+ + CO2 ↔ HGB-NH-COO- + 2 H+.
Powstające w tej reakcji protony odpowiedzialne są za efekt Bohra. Zmiana ładunków N-końców
HGB umoŜliwia tworzenie wiązań poprzecznych pomiędzy podjednoskami tak jak w formie
nieutlenowanej. W płucach utlenowaniu HGB towarzyszy odłączenie i wydalenie CO2. CO2
docierający do krwi przekształcany jest przez anhydrazę węglanową (CA) do H2CO3, który
samorzutnie dysocjuje do H+ + HCO3-. Protony wiąŜą się z HGB (Hb . 2 H+), zaś aniony
wodorowęglanowe stanowią główną formę transportu CO2 przez krew. Przez efekt Bohra określa
się zmniejszenie powinowactwa tlenu do HGB wraz ze spadkiem pH – dzięki temu w tkankach
następuje bardziej efektywne oddawanie O2, a krzywa dysocjacji tlenowej HGB przesuwa się
przez to w prawo. Zjawisko odwrotne, tj. zwiększenie oddawania CO2 pod wpływem wiązania O2
nosi nazwę efektu Haldena. Efekt Bohra jest charakterystyczny dla tetramerycznej HGB, zaleŜy
bowiem od interakcji pomiędzy grupami hemowymi, czyli kooperatywności wiązania O2 – nie
wykazuje go zatem MGB. Dzięki zdolności wymiany protonów z otoczeniem, HGB pełni funkcję
układu buforowego krwi.
Protony odpowiedzialne za efekt Bohra powstają w wyniku rozerwania wiązań poprzecznych
podczas utlenowania formy T, pochodzą głównie z atomów N pierścieni imidazolowych Ckońcowych reszt His łańcuchów β (HC3; His 146). Z kolei odłączenie O2 i związane z tym
tworzenie wiązań poprzecznych wymaga przyłączenia H+ do w/w miejsc. Obecność protonów w
tkankach ułatwia więc tworzenie wiązań poprzecznych poprzez protonację C-końcowych reszt His
łańcuchów β, a odtwarzanie tych wiązań sprzyja przejściu R→T, czyli oddawaniu O2.
2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) powstaje w tkankach w wyniku niedoboru O2, jako modyfikacja
podstawowego szlaku glikolizy. BPG wiąŜe się z HGB w stosunku stechiometrycznym 1:1, w
miejscu pomiędzy podjednostkami – w centrum cząsteczki. Rozmiar tej wnęki – odległość
pomiędzy helisami H łańcuchów β – odpowiada BPG jedynie w formie T. BPG tworzy wiązania
poprzeczne w obrębie łańcuchów β (z N-końcem – ValNA1, Lys EF6 i His H21), przez co
stabilizuje i preferuje formę T, zwiększa zatem oddawanie O2 przez HGB w tkankach. BPG o wiele
słabiej działa w przypadku HbF, gdyŜ posiada ona w pozycji H21 Ser zamiast His, w związku z
czym nie tworzy wiązań poprzecznych. Adaptacja organizmu do duŜych wysokości polega m. in.
na zwiększeniu syntezy BPG, co zmniejsza P50, a zwiększa uwalnianie tlenu do tkanek.
Stany patologiczne związane z HGB:
Hemoglobinopatie – są to zaburzenia funkcji biologicznej HGB, będące następstwem mutacji
genów kodujących jej łańcuchy polipeptydowe (α i β). Znanych jest kilkaset hemoglobinopatii,
jednak ogromna większość występuje rzadko i ma łagodny przebieg, tak Ŝe większe znaczenie
posiada zaledwie kilka z nich.
HbM: His F8 → Tyr Mutacja taka powoduje stabilizację Ŝelaza hemowego w formie Fe3+,
gdyŜ tworzy ono trwałe połączenie z anionem fenolanowym Tyr. Powoduje to
methemoglobinemię – podobnie jak sulfonamidy lub stany obniŜenia aktywności
reduktazy methemoglobiny – i związany z tym spadek zdolności HGB do wiązania i
transportu O2. Przy wariantach HbM dotyczących łańcuchów α wystepuje preferencja
formy T, obniŜenie powinowactwa do tlenu i zniesienie efektu Bohra; natomiast przy
wariantach dotyczących łańcuchów β przejście R↔T nie zostaje zakłócone, podobnie jak
efekt Bohra.
HbS: Glu A2(6)β → Val Mutacja powoduje powstanie na powierzchni HGB „lepkich
miejsc”, komplementarnych do odpowiednich miejsc na powierzchni nieutlenowanej
HGB (zarówno A, jak i S). Komplementarność oddziałujących powierzchni powoduje
polimeryzację nieutlenowanej HbS – powstają w ten sposób helikalne włókna HGB, które
wytrącają się i zniekształcają erytrocyty, które przyjmują kształt sierpowaty, posiadają
obniŜoną oporność hemolityczną oraz większą tendencję do agregacji i zlepiania. Objawy
anemii sierpowatokrwinkowej pogłębiają się przy obniŜeniu pO2 – polimeryzuje przecieŜ
forma T, czyli nieutlenowana. Barierę i zatrzymanie polimeryzacji powoduje przyłączenie
-24-
prawidłowej HbA zarówno w formie R i T, gdyŜ pomimo istnienia miejsc
komplementarnych, nie posiada ona lepkich końców.
Talasemie – są to choroby, których istotą jest zmniejszona synteza łańcuchów HGB (α lub β), co
jest przyczyną anemii.
HGB glikowana (HbA1c) – jest to HGB poddana procesowi glikacji. Glikacja jest procesem
nieenzymatycznej glikozylacji białek – w tym przypadku HGB – zachodzącym w warunkach
podwyŜszonego poziomu glukozy w środowisku, np. cukrzycy. Anomeryczna grupa hydroksylowa
glukozy reaguje z grupą aminową Lys oraz aa N-końcowych. HbA i HbA1c moŜna rozdzielić
stosując chromatografię jonowymienną lub elektroforezę. HbA1c stanowi fizjologicznie < 5 %
HGB i jest proporcjonalne do średniego stęŜenia glukozy we krwi w okresie 1,5 – 3 miesięcy
poprzedzających badanie (długofalowa kontrola terapii cukrzycy).
Mioglobinuria jest stanem wydalania z moczem MGB pochodzącej z rozległego uszkodzenia
mięśni szkieletowych (w mniejszym stopniu serca), przez co mocz ma barwę ciemnoczerwną. Stan
taki moŜe prowadzić do ostrej niewydolności nerek (ONN).
-25-
ROZDZIAŁ II – STRUKTURA I FUNKCJE ENZYMÓW
1.
Ogóle właściwości enzymów
a)
klasyfikacja i nazewnictwo
Podstawą klasyfikacji enzymów jest typ i mechanizm katalizowanej przez nie reakcji. KaŜdy enzym
posiada swój kod o postaci: EC xx.xx.xx.xx, gdzie litery x oznaczają cyfry arabskie. Symbol EC zaznacza, Ŝe
dalsza część kodu to numer w międzynarodowym katalogu enzymów (ang. Enzyme Commission, fr. Enzyme
Catalogue). Sam numer składa się z 4 członów:
pierwszy określa główną klasę, charakteryzującą typ katalizowanej reakcji; system zawiera 6 klas
enzymów i katalizowanych przez nie reakcji:
1 – oksydoreduktazy – katalizują reakcje utleniania i redukcji (redox; patrz punkt III-3)
2 – transferazy – katalizują reakcje przenoszenia grup funkcyjnych
3 – hydrolazy – katalizują reakcje rozpadu pod wpływem wody (hydrolizy)
4 – liazy – katalizują reakcje rozpadu bez udziału cząsteczek wody
5 – izomerazy – katalizują reakcje zmian połoŜenia grup chemicznych z zachowaniem szkieletu
6 – ligazy – katalizują reakcje tworzenia wiązań kowalnecyjnych
drugi określa podklasę, charakteryzującą zazwyczaj rodzaj wiązania lub grupy, której dotyczy reakcja
trzeci określa podpodklasę, która moŜe zawierać: dokładniejszą specyfikację wiązania, grupę związków
do której naleŜy substrat, nazwę donora lub akceptora
czwarty wskazuje na określony enzym przez podanie nazwy substratu reakcji.
Nazwa enzymu jest dwuczęściowa – część pierwsza, zakończona przyrostkiem ”-aza”, określa typ
katalizowanej reakcji, druga – substrat(y) reakcji.
b) centrum katalityczne
Enzymy posiadają zdolność przyłączania substratów i miejscowego zwiększania ich stęŜenia, przez co
przyspieszają przebieg katalizowanej reakcji. Zazwyczaj cząsteczka białka enzymatycznego jest wielokrotnie
większa (nawet o kilka rzędów wielkości) od cząsteczki substratu, co sugeruje istnienie ograniczonego obszaru –
centrum katalitycznego – bezpośrednio wiąŜącego substrat.
Model miejsca katalitycznego wg Fishera przedstawia je jako sztywną konstrukcję, a interakcję z
substratem – jako przestrzenne ułoŜenie dopasowanych do siebie geometrycznie (niczym klucz do zamka)
cząsteczek. Koncepcja ta wyjaśnia specyficzność połączeń E-S, nie tłumaczy jednak dynamicznych zmian
towarzyszących procesom katalitycznym.
W przeciwieństwie do w/w, model indukowanego dopasowania, zaproponowany przez Koshlanda,
zakłada iŜ bliskość substratu indukuje zmiany konformacyjne w cząsteczce enzymu, tak Ŝe moŜe nastąpić
połączenie pasujących do siebie powierzchni. Z chemicznego punktu widzenia polega to na przyjęciu
odpowiedniej konformacji przez grupy funkcyjne cząsteczki enzymu, co umoŜliwia interakcję z cząsteczką
substratu i właściwą katalizę. Reszty aa znajdujące się w miejscu katalitycznym mogą być od siebie znacznie
oddalone w strukturze I-rzędowej, lecz przestrzennie zbliŜone w strukturze III-rzędowej.
Miejsca aktywne (katalityczne) enzymów złoŜonych z pojedynczej podjednostki są często zlokalizowane
w bruzdach cząsteczki enzymu, natomiast w oligomerach znajdują się zazwyczaj przy powierzchniach między
podjednostkami. Wykazano, iŜ w skład miejsca katalitycznego wchodzi wiele reszt aa, a główną rolę w katalizie
odgrywają pewne określone reszty – w szczególności aa z boczną grupą sulfhydrylową (Cys) lub hydroksylową
(Ser, Thr, Tyr) oraz kwaśne (Asp, Glu) i zasadowe (Lys, His, Arg), poniewaŜ ich łańcuchy boczne stanowią
czynniki nukleofilowe – katalizatory kwaśne lub zasadowe bądź akceptory grupy ulegającej przeniesieniu.
Wszystkie formy enzymu, katalizujące określoną reakcję (lub typ reakcji), posiadają jednakowy i uniwersalny
mechanizm, występujący w całej przyrodzie. Związany jest z tym fakt, iŜ reszty aa istotne w procesie
katalitycznym, jak równieŜ ich najbliŜsze otoczenie w cząsteczce enzymu, wykazują wysoką konserwatywność,
zachowaną i utrwaloną w procesie ewolucji. PoniewaŜ jednak dany motyw struktury III-rz. moŜe być utworzony
przez róŜne kombinacje struktur I-rz., toteŜ ta pierwsza wykazuje zdecydowanie większą konserwatywność.
c)
koenzymy i witaminy będące ich prekursorami
Wiele enzymów do przeprowadzenia reakcji wymaga, poza substratem, obecności dodatkowej substancji
niebiałkowej, określanej jako koenzym. Wówczas samą białkową część enzymu nazywamy apoenzymem, a
połączenie apoenzym z koenzymem – holoenzymem. Koenzymy zwiększają moŜliwości katalityczne enzymów
-26-
poza te wynikające z obecności grup funkcyjnych reszt aa. Koenzymy ściśle związane z enzymami określa się
mianem grup prostetycznych. Obecności koenzymów wymagają generalnie enzymy katalizujące reakcje redox,
przenoszenia grup, izomeryzacji i tworzenia wiązań kowalencyjnych (klasy EC 1, 2, 5 i 6), nie potrzebują ich
natomiast enzymy lityczne – hydrolazy i liazy (EC 3 i 4). Często koenzym bywa rozpatrywany jako kolejny
substrat reakcji – po pierwsze poniewaŜ zmienia się wraz z podstawowym substratem, po drugie – gdyŜ często to
właśnie jego przemiany są fizjologicznie istotne. Prekursorami wielu koenzymów są witaminy, gł. z grupy B
(por. niŜej). W zaleŜności od przenoszonej grupy, koenzymy dzieli się na:
przenoszące protony: NAD(P)+, FMN, FAD, CoQ, kwas liponowy,
przenoszące inne grupy: fosforany sacharydów, CoA, DPT, PLP, koenzymy folianowe, biotyna,
koenzymy kobalaminowe, kwas liponowy.
W tabeli poniŜej przedstawiono najwaŜniejsze koenzymy i grupy prostetyczne, witaminy będące ich
prekursorami oraz przykłady zawierających je enzymów.
Lp.
grupa
1.
nukleotydy
adeninowe
2.
3.
nukleotydy
flawinowe
4.
skrót(y)
NAD+,
NADH
koenzym
pełna nazwa
dinukleotyd
nikotynamidoadeninowy
NADP+,
NADPH
fosforan dinukleotydu
nikotynamidoadeninowego
FMN
mononukleotyd flawinowy
FAD
dinukleotyd
flawinoadeninowy
kwas liponowy
(lipoinowy)
witaminy
PP
B2
(ryboflawina)
5.
-
-
-
6.
-
CoA1
koenzym A
7.
-
koenzym Q, ubichinon
8.
cytochromy
CoQ
b, c, c1,
a, a3
kwas
pantotenowy
-
cytochrom
-
przykład enzymu
odnośniki
dehydrogenaza
mleczanowa
dehydrogenaza
glukozo-6fosforanow
dehydrogenaza
NADH
oksydaza αaminokwasów
oksydaza αketokwasów
syntetaza kwasów
tłuszczowych
-2
III-9 i 10,
V-5 i 6
III-5
-3
III-3, III-5
III-3
III-10
karboksylaza
IV-4-b
pirogronianowa
dekarboksylaza
10.
DPT
difosfotiamina
B1 (tiamina)
III-10
pirogronianowa
B6
transaminaza
11.
PLP
fosforan pirydoksalu
VI-2-a
(pirydoksal)
alaninowa
hydroksymetyloTHF,
12.
tetrahydrofolian
kwas foliowy
transferaza
VI-4-h
FH4
serynowa
mutaza
B12
13.
kobalamina
metylomalonyloIV-4-b
(kobalamina)
CoA
1
– CoA = {P} + ryboza + adenina + 2 {P} + kwas pantotenowy + merkaptoetanoloamina
kwas pantotenowy = kwas pantoinowy + β-alanina
2
– CoQ pełni funkcję przenośnika elektronów między metaloflawoproteinami a cytochromami w łańcuchu
oddechowym
3
– cytochromy są przenośnikami elektronów w łańcuchu oddechowym
9.
-
-
biotyna
H
d) swoistość działania enzymów
•
•
W przeciwieństwie do katalizatorów nieorganicznych czy prostych katalizatorów organicznych,
enzymy charakteryzuje wysoka swoistość substratowa i aktywność katalityczna, będące wynikiem
wykształcenia miejsc katalitycznych dostosowanych do szybkiej i selektywnej katalizy indywidualnych
reakcji.
Jedną z najwaŜniejszych cech enzymów jest ich zdolność do swoistej katalizy tylko jednej reakcji (ew.
jednego typu reakcji), dzięki czemu szybkość procesów metabolicznych moŜe być regulowana przez
modyfikacją aktywności odpowiednich enzymów (por. punkt II-4).
-27-
•
•
•
e)
Enzymy są stereoswoistymi katalizatorami; większość substratów tworzy z nimi ≥ 3 wiązania, przez co
cząsteczki symetryczne pod względem budowy chemicznej mogą nabywać cech asymetrii (por. punkt
V-1-d – kwasy tłuszczowe w pozycjach 1 i 3 glicerolu).
Enzymy wykazują absolutną swoistość optyczną dla przynajmniej jednej cząsteczki substratu – głównie
dla form D węglowodanów i form L aa. Wyjątkiem są epimerazy – racemazy.
Enzymy (poza pewnymi wyjątkami) wykazują równieŜ swoistość wobec określonego koenzymu, nawet
jeśli przenoszenie danej grupy moŜe się odbywać z udziałem innego (por. wyŜej).
aktywność enzymów, jednostki aktywności
Z powodu zazwyczaj bardzo małej ilości enzymów w materiale biologicznym często określa się nie ilość
samego białka enzymatycznego, lecz jego aktywność katalityczną. Zakłada się przy tym, Ŝe w warunkach
badania szybkość reakcji katalizowanej przez enzym zaleŜy proporcjonalnie od ilości tego enzymu. Wobec tego
ilość enzymu w próbce moŜna określić na podstawie tempa ubytku substratów lub pojawiania się produktów w
środowisku reakcji. Wyniki podaje się odpowiednich jednostkach:
• IU – międzynarodowa jednostka aktywności enzymu, oznaczająca taką jego ilość, która przemienia
1 µmol reagentu w ciągu 1 min.
• Katal (kat) – jednostka SI aktywności enzymów i innych katalizatorów, oznacza ilość konwertującą
1 mol reagentu w czasie 1 s. Związek między katalem a IU przestawia się następująco: 1 kat = 60 mln
U). Katal jest zatem jednostką względnie duŜą, dlatego w praktyce uŜywa się µkat i nkat.
• Liczba obrotów enzymu – ilość cząsteczek substratu, które mogą zostać przekształcone przez enzym w
produkt w ciągu 1 sekundy. Zwykle wynosi ona od kilku tysięcy do kilku milionów.
• Aktywność specyficzna – jest to wyraŜenie aktywności enzymu, jaką posiada jednostkowa masa białka
enzymatycznego, np. 1 U/mg oznacza, Ŝe 1 mg białka posiada aktywność 1 IU.
• Aktywność całkowita – jest to wyraŜenie aktywności enzymu, jaką posiada jednostkowa masa lub
objętość materiału biologicznego, z którego ten enzym jest izolowany, np. 1 U/ml oznacza, Ŝe 1 ml
płynu ustrojowego posiada daną aktywność enzymatyczną o wartości 1 IU.
Wyjątkowo w przypadku pewnych enzymów oznacza się ich bezwzględną ilość metodami
immunochemicznymi (por. punkt II-5-c – CK-MB mass).
f)
kompartmentacja komórkowa enzymów
Enzymy, ich substraty i koenzymy nie występują zazwyczaj jednorodnie w obrębie komórki, lecz w jej
określonych przestrzeniach, zwanych kompartmentami. Rozmieszczenie to moŜna badać metodami
histochemicznymi. Kompartmetacja komórki umoŜliwia wzajemną izolację jej przedziałów i zachodzenie w nich
przeciwstawnych procesów biochemicznych, np. syntezy i degradacji tej samej grupy związków.
Rozmieszczanie w komórce przykładowych, kluczowych dla jej funkcjonowania, enzymów:
• cytoplazma: aldolaza, izomeraza fosfoheksozowa, dehydrogenza mleczanowa, aminotransferaza
alaninowa, dehydrogenaza sorbitolowa,
• mitochondria: enzymy cyklu Krebsa, oksydazy, dehydrogenaza glutaminianowa, aminotransferaza
asparaginianowa,
• ER: esterazy, reduktazy, acetylazy, GGTP,
• rybosomy: enzymy syntezy białek, ceruloplazmina, cholinesteraza,
• lizosomy: proteazy, fosfatazy, kolagenazy
g) izoenzymy
Izoenzymy (izozymy) są to fizycznie odmienne formy tej samej aktywności katalitycznej, innymi słowy –
białka o odmiennej strukturze, lecz katalizujące przebieg tej samej reakcji. Poszczególne izoenzymy pojedynczej
aktywności mogą występować w róŜnych kompartmentach subkomórkowych lub nawet w odmiennych typach
komórek (tkankach – stąd teŜ często pochodzą ich nazwy), róŜniąc się dodatkowo powinowactwem do
substratów (por. punkt IV-4-a – aldolaza A i B).
Izoenzymy są produktami ekspresji blisko spokrewnionych genów. Enzymy oligomeryczne z róŜnymi
protomerami mogą występować w kilku postaciach, ponadto jedna tkanka moŜe produkować jeden rodzaj
protomeru, druga zaś inny. Jeśli protomery mogą łączyć się w róŜny sposób, aby utworzyć aktywny enzym,
tworzą się wówczas tzw. izoenzymy rzekome danej aktywności. Określa się je jako rzekome, gdyŜ są to
produkty asocjacji mniejszej liczby rodzajów protomerów. Np. dla LDH z 2 produktów translacji (posiadających
odmienne mRNA) powstaje 5 izoenzymów rzekomych (patrz punkt II-5-b). Izoenzymy prawdziwe róŜnią się
natomiast tym, Ŝe kaŜdy z nich jest produktem translacji innego mRNA.
-28-
Znane są izoenzymy szeregu dehydrogenaz, oksydaz, transaminaz, fosfataz i proteaz. Rozdział i
identyfikacja izoenzymów określonych aktywności ma istotne znaczenie diagnostyczne (por. punkt II-5).
h) izolacja enzymów
Enzymy mogą być otrzymywane przez oczyszczanie z komórek Ŝywych organizmów, w których
naturalnie występują, bądź metodami rekombinacji DNA – z komórek, gdzie fizjologicznie ich brak. Ze względu
na szybki wzrost uŜywa się do tych celów komórek droŜdŜy i bakterii. Ponadto techniki ukierunkowanej
mutagenezy pozwalają na manipulację składem aa rekombinowanego enzymu, np. w celu określenia roli
strukturalno – funkcjonalnej pewnych jego regionów (czy nawet pojedynczych reszt aa).
Do technik oczyszczania enzymów z materiału biologicznego zaliczamy: strącanie solami o róŜnych
stęŜeniach ((NH4)2SO4, Na2SO4) lub rozpuszczalnikami (aceton, etanol), róŜnicową denaturację cieplną,
denaturację spowodowaną zmianami pH, wirowanie róŜnicowe, elektroforezę, filtrację Ŝelową, chromatografię
jonowymienną (jonity: A – DEAE/C, K – CMC), sączenie na sitach molekularnych oraz chromatografię
powinowactwa (z uŜyciem substratów, pochodnych koenzymów lub barwników organicznych, ligandów
hydrofobowych). Homogenność białka (tu – enzymu) potwierdza się techniką PAGE ± SDS lub elektroforezą
dwuwymiarową.
Technologii rekombinacji DNA składa się z kilku etapów: sklonowanie genu kodującego enzym →
zsekwencjonowanie genu → wprowadzenie do wektorów plazmidowych lub fagowych → umieszczenie w
docelowym genomie. Ostatecznie gen enzymu powinien znaleźć się pod kontrolą silnego promotora, najlepiej z
moŜliwością jego kontroli przez specyficznie chemicznie induktor – wówczas podanie tego ostatniego do
poŜywki wzrostowej spowoduje produkcje enzymu w ilościach wielokrotnie większych niŜ naturalnie.
Technologia ta moŜe być stosowana do otrzymywania zmodyfikowanych – tzw. fuzyjnych – białek. W tym celu
do oryginalnego genu dołącza się taką sekwencję, aby powstały białkowy produkt był odpowiednim ligandem
dla specyficznego nośnika w chromatografii powinowactwa, po czym po rozdzieleniu usuwa się dodany
fragment (tzw. domenę fuzyjną).
2.
Mechanizmy działania enzymów
a)
typy reakcji enzymatycznych przy dwóch substratach
Choć rozwaŜania dotyczące reakcji enzymatycznych najprościej jest przedstawić i zrozumieć w sytuacji
pojedynczy substrat : pojedynczy produkt, to w rzeczywistości większość reakcji obejmuje dwa lub więcej
substratów i produktów. Ich liczbę określa się terminami: uni-, bi-, ter-, quad- itd., zaś rodzaj reakcji ze względu
na liczbę reagentów – przez podanie terminów określających ilość substratów i produktów. Bardzo często
spotykane są reakcje typu BiBi, tzn. posiadające 2 S i 2 P. Mogą one zachodzić na kilka sposobów:
• reakcje ciągłe – wszystkie substraty muszą połączyć się z enzymem, aby uwolniony został produkt;
inaczej określa się je jako reakcje pojedynczego zastąpienia, gdyŜ grupa ulegająca przeniesieniu
przechodzi bezpośrednio z donora (substratu) na akceptor (produkt)
reakcje przypadkowego przyłączenia – nie ma znaczenia, w jakiej kolejności substraty połączą się z
enzymem; w ten sposób funkcjonują pewne dehydrogenazy i kinazy
E + S1/2 → E-S1/2 + S2/1 → E-S1-S2 → E-P1-P2 → E-P1/2 + P2/1 → E + P 1/2
reakcje uporządkowanego (sekwencyjnego) przyłączenia – tylko jeden z substratów moŜe połączyć się
z enzymem, drugi natomiast łączy się z powstałym kompleksem; przyłączenie pierwszego substratu
indukuje w cząsteczce enzymu zmiany konformacyjne, umoŜliwiające przyłączenie drugiego substraty
dzięki adekwatnemu ustawieniu grup aktywnych; jako przykład moŜna podać wiele oksydoreduktaz
zaleŜnych od NAD(P)+
E + S1 → E-S1 + S2 → E-S1-S2 → E-P1-P2 → E-P1 + P2 → E + P1
• reakcje typu „ping-pong” – jeden lub więcej produktów uwalnia się od enzymu, zanim jeszcze zostaną
przyłączone wszystkie substraty; są to inaczej reakcje podwójnego zastąpienia, poniewaŜ przenoszona
grupa ulega wpierw przeniesieniu na enzym (często na koenzym), następnie odłącza się pierwszy
produkt, wtedy dopiero przyłącza się drugi substrat i po dołączeniu doń przenoszonej grupy powstaje i
uwalniany jest drugi produkt; taki mechanizm występuje m. in. w transaminazach i chymotrypsynie
E + S1 → E-S1 → E*-P1 → E* + P1 → E* + S2 → E*-S2 → E-P2 → E + P2
b) mechanizm działania chymotrypsyny
Chymotrypsyna (CT) jest dobrym przykładem enzymu do opisania ogólnych cech katalizy
enzymatycznej, poniewaŜ cechuje się stosunkowo prostą budową, a takŜe nie wymaga obecności koenzymu,
grupy prostetycznej ani atomu metalu.
-29-
Chymotrypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których część karboksylowa pochodzi od aa
aromatycznego (Phe, Tyr, Trp) bądź posiadającego duŜy niepolarny łańcuch boczny (Met). Ponadto katalizuje
hydrolizę niektórych estrów, co nie ma wprawdzie znaczenia biologicznego, lecz pozwala na prowadzenie nad
nią badań. UŜywanym w eksperymentach substratem jest octan p-nitrofenylu (PNPA), hydrolizowany przez CT
do kwasu octowego i p-nitrofenolu – ten drugi w zasadowym pH dysocjuje do anionu p-nitrofenolanowego,
którego poziom moŜe być oznaczany kolorymetrycznie.
Uwalnianie anionu p-nitrofenolanowego jest dwufazowe – najpierw ma miejsce faza szybka, a następnie
powolna, co jest konsekwencją mechanizmu katalizy. W pierwszym etapie CT łączy się z PNPA w kompleks, z
którego jako pierwszy odłącza się anion PNP-, zaś reszta octanowa pozostaje związana z enzymem. Oba te etapy
zachodzą stosunkowo szybko, natomiast hydroliza kompleksu CT-Ac przebiega o wiele wolniej. Szybka faza
uwalniania PNP- odpowiada więc przekształceniu całej dostępnej CT w kompleks CT-Ac z równoczesnym
maksymalnym uwolnieniem PNP-, natomiast faza wolna zaleŜy od powolnego rozpadu kompleksu CT-Ac –
regeneracji wolnej CT, która odzyskuje zdolność reagowania z PNPA. Szybkość reakcji w pierwszej fazie jest
uwarunkowana i proporcjonalna do liczby moli CT w momencie rozpoczęcia reakcji.
Główną rolę w omawianej katalizie odgrywa reszta Ser 195 – z nią właśnie połączona jest grupa
acetylowa w kompleksie CT-Ac. ChociaŜ CT zawiera aŜ 28 reszt Ser, to jedynie ta w pozycji 195 cechuje się tak
wysoką reaktywnością i szczególną funkcją. Świadczy o tym m. in. wynik reakcji z
diizopropylofluorofosforanem (DIPP) – reszt Ser 195 zostaje wówczas zablokowana, co pozbawia całą
cząsteczkę CT aktywności enzymatycznej. Ze względu na szczególną rolę właśnie reszty Ser w katalizie, CT
zaliczana jest do grupy proteaz serynowych.
W reakcji o której mowa szczególne znaczenie mają 3 reszty aa, znajdujące się we wzajemnej bliskości w
sensie przestrzennym, choć zajmują odległe pozycje w strukturze I-rz. Są to: Asp 102, His 57 i wspomniana
Ser 195. Znajdują się one w otoczeniu niepolarnego wnętrza cząsteczki CT. Podczas reakcji Ser 195 ulega
acetylacji: zbliŜenie Ac- do grupy hydroksylowej Ser 195 powoduje przeniesienie protonu z Ser 195, poprzez
His 57 na Asp 102 – przejście to zwiększa aktywność atomu tlenu grupy hydroksylowej Ser, co konsekwentnie
zwiększa szybkość reakcji. Z kolei podczas rozpadu CT-Ac protony przekazywane są w przeciwnym kierunku,
co pozwala na uwolnienie Ac- i odtworzenie pierwotnej postaci Ser 195. Podobna sekwencja zdarzeń zachodzi
podczas hydrolizy peptydów, stanowiących fizjologiczny substrat CT – patrz poniŜszy rysunek.
Chymomypsyna, podobnie jak wiele innych enzymów, syntetyzowana jest w postaci nieaktywnego
prekursora (proenzymu, zymogenu). Przekształcenie do formy aktywnej następuje przez kilkustopniową
proteolizę, w trakcie której powstaje miejsce katalityczne oraz układ przekazywania protonu (por. punkt VI-1-a).
-30-
c)
mechanizm działania fruktozo-2,6-bisfosfatazy
W przypadku fruktozo-2,6-bisfosfatazy (grupa fosfohydrolaz) występuje nieco bardziej skomplikowany
układ. Miejsce katalityczne obejmuje tu 7 reszt aa – triada katalityczna składa się z: His 258, His 392 i Glu 327,
natomiast zasadowe (dodatnio naładowane) reszty Arg 257, Arg 307, Arg 352 i Lys 356 stabilizują ujemnie
naładowany substrat. Etapy katalizy:
• Poczwórny ujemny ładunek związanego substratu stabilizowany jest przez oddziaływania
elektrostatyczne z czterem dodatnio naładowanymi w/w resztami aa. Reszta Glu 327 stabilizuje dodatni
ładunek reszty His 392.
• Nukleofilowa reszta His 392 atakuje wiązanie C2-{P} – reszta fosforanowa zostaje przeniesiona na
His 258, fosforylując enzym oraz powstaje fruktozo-6-fosforan.
• Cząsteczka H2O, z pomocą Glu 327, przeprowadza nukleofilowy atak, rozbijając wiązanie pomiędzy
resztą fosforanową a enzymem, w wyniku czego uwalnia się fosforan nieorganiczny (Pi), oddziałujący
elektrostatycznie z Arg 257 i Arg 307, a ostatecznie uwalniany.
d) mechanizm działania transaminaz
Transaminazy (aminotransferazy = AT) to enzymy katalizujące przeniesienie grup α-aminowych aa na
grupy α-ketonowe α-ketokwasów (pirogronowego, szczawiooctowego lub α-ketoglutarowego). Reakcja
katalizowana przez AT ma charakter ping-pong, podobnie jak wiele innych reakcji przebiegających z udziałem
enzymu zawierającego koenzym (w tym konkretnym przypadku jest to PLP). Dokładny mechanizm – patrz
punkt VI-2-a.
e)
kataliza kwasowo – zasadowa (k-z)
Gdy substrat zwiąŜe się z miejscem katalitycznym, naładowane lub zdolne do naładowania grupy
funkcyjne łańcuchów bocznych aa znajdujących się blisko substratu mogą brać udział w katalizie, działając jako
katalizatory kwasowo – zasadowe. RozróŜnia się katalizę k-z swoistą i ogólną; róŜnią się one m. in. kolejnością
przebiegu szybkiego i powolnego etapu reakcji:
• Swoista kataliza enzymatyczna k-z cechuje się zaleŜnością szybkości reakcji od stęŜenia H+, a brakiem
zaleŜności od stęŜenia innych kwasów lub zasad w roztworze. JeŜeli przy stałym stęŜeniu buforu
szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą pH, to jest to reakcja swoiście katalizowana przez kwas
(pH < 7) lub zasadę (pH > 7). Równanie opisujące szybkość reakcji swoistej katalizy k-z zawiera
wyłącznie wartości stęŜenia substratu oraz – odpowiednio – [H+] lub [OH-].
• Ogólna kataliza enzymatyczna k-z cechuje się zaleŜnością szybkości reakcji od stęŜeń wszystkich
kwasów i zasad w roztworze. JeŜeli przy stałym pH szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą
stęŜenia buforu, to jest to ogólna kataliza kwasowa (pH < 7) lub zasadowa (pH > 7).
f)
enzymy wymagające atomów metali
Wiele (ok. 25 %) enzymów zawiera związany atom metalu, niezbędny do ich aktywności. WyróŜniamy
dwa rodzaje połączeń enzymu z metalem:
• metaloenzymy – zawierają określoną liczbę funkcyjnych atomów metalu, nie usuwanych w procesie
oczyszczania,
• enzymy aktywowane przez metale – słabiej wiąŜą atomy metalu.
Jednak bez względu na powinowactwo metalu i enzymu, atomy metali pełnią podobne funkcje. W
katalizie enzymatycznej funkcjonują trójskładnikowe kompleksy miejsce katalityczne – metal – substrat, które
mogą być połączone w róŜnoraki sposób:
• liniowo
z mostkiem przez substrat (E-S-M) – w wyniku wyparcia cząsteczki wody ze strefy koordynacyjnej
metalu przez substrat moŜe dojść do połączenia z enzymem; w przenoszeniu reszty fosforanowej metal
pełni rolę aktywatora atomu fosforu (tego rodzaju połączenia tworzy m. in. większość kinaz)
z mostkiem przez enzym (M-E-S) – metal odgrywa rolę strukturalną: utrzymuje aktywną konformację
(np. syntetaza Glu) lub tworzy mostek z substratem (np. kinaza pirogronianowa – tu teŜ dodatkowo
aktywuje jeden z substratów)
z mostkiem przez metal (E-M-S) – np. transfosfatazy pirogronianu i PEP, inne enzymy działające na
PEP, karboksylazy
• cyklicznie przez metal (-E-M-S-)
Enzymy aktywowane przez metale tworzą kompleksy wszystkich czterech w/w typów, natomiast
metaloenzymy – wszystkie z wyjątkiem E-S-M, gdyŜ juŜ wyjściowo obecny jest silnie zespolony kompleks
-31-
enzymu z metalem, który nie moŜe być rozdzielony przez substrat. Dany enzym moŜe tworzyć róŜne typy
kompleksów, w zaleŜności od substratu. W wielu białkach resztą aa wiąŜącą metal jest His, np.
karboksypeptydaza A, fosfataza zasadowa (ALP), kinaza białkowa C (PKC), rubredoksyna, hemoproteiny.
Metale mogą pełnić bardzo róŜnorodne funkcje w katalizie oraz brać udział we wszystkich
mechanizmach zwiększania szybkości reakcji, tj.: ogólnej katalizie kwasowo – zasadowej, katalizie
kowalencyjnej, zbliŜeniu reagujących cząstek oraz indukcji zmian strukturalnym w obrębie enzymu lub
substratu. Do najczęściej związanych z katalizą metali naleŜą: Ŝelazo, magnez, kobalt (w postaci kobalaminy)
oraz mangan. Zwłaszcza Ŝelazo i mangan mogą występować na róŜnych stopniach utlenienia i brać udział w
katalizie reakcji redox; zazwyczaj występują wówczas w specyficznych grupach prostetycznych, jak np. hem
(patrz punkt I-3-e) czy centra Ŝelazo-siarkowe (patrz punkt III-5). Odnośnie róŜnorodnej funkcji atomów metali
w katalizie – mogą one:
uczestniczyć w tworzeniu pary elektronowej wiązania σ,
gromadzić i zbliŜać substraty, słuŜyć jako trójwymiarowa matryca do ustawiania grup zasadowych
enzymu lub substratów w określonej pozycji,
aktywować grupy elektro- lub nukleofilowe (ogólna kataliza k-z), same funkcjonować jako nukleofile,
maskować grupy nukleofilowe i przez to kierować reakcję na właściwy tor,
indukować zmiany konformacyjne w obrębie enzymu lub substratu.
3.
Kinetyka reakcji enzymatycznych
Wiele informacji dotyczących kinetyki reakcji katalizowanych przez enzymy jest prawdziwych i
wywodzi się z zasad kinetyki reakcji nieenzymatycznych, dlatego najpierw przypomniane i omówione zostaną
ogólne reguły kinetyki chemicznej, a następnie pewne wyjątkowe i charakterystyczne dla przemian z udziałem
enzymów.
a)
ogólne zasady kinetyki reakcji chemicznych
Reakcje chemiczne moŜemy ogólnie podzielić na nieodwracalne i odwracalne. Do pierwszej grupy
zaliczymy te, podczas których w środowisku powstają wyłącznie produkty. Przyjmuje się, Ŝe tego typu reakcje
zachodzą do końca. Jako przykład podać moŜna reakcje zobojętniania oraz te, w wyniku których wytrąca się
nierozpuszczalny osad, wydziela się gaz lub powstaje słaby elektrolit. Reakcje odwracalne to takie, podczas
których gromadzące się w środowisku produkty reagują ze sobą i odtwarzają substraty. W środowisku reakcji
oprócz produktów występują nieprzereagowane substraty. Reakcje tego typu nie zachodzą do końca. Jako
przykład podać moŜna dysocjację słabych elektrolitów lub hydrolizę soli.
Większość obserwowanych w przyrodzie reakcji naleŜy do grupy odwracalnych. Oznacza to, iŜ mówimy
w ich przypadku o występowaniu pewnego stanu równowagi. Ogólnie pod pojęciem równowagi rozumiemy
ustalony stan jakiegoś zjawiska. WyróŜniamy równowagę statyczną i dynamiczną. Pierwsza występuje w
sytuacji, gdy Ŝadne procesy w środowisku nie zachodzą, a stęŜenia reagentów nie zmieniają się w czasie.
Równowaga dynamiczna to stan, w którym przemiany chemiczne co prawda zachodzą, jednak tyle samo
substratów przechodzi w produkty co produktów w substraty. W stanie równowagi dynamicznej szybkość danej
reakcji oraz reakcji do niej odwrotnej są sobie równe, a stęŜenia reagentów ustalają się na stały poziomie.
Procesy biologiczne występują w stanie równowagi dynamicznej – wciąŜ istnieje konkurencja przemiany danej i
do niej odwrotnej, miedzy którymi ustala się dynamiczna równowaga.
Jak wspomniano, reakcje odwracalne mogą teoretycznie przebiegać w dwie strony. O tym zaś, w którą
stronę reakcja rzeczywiście przebiega, decyduje wartość wielości zwanej energią swobodną (G) danej reakcji.
Innymi słowy energia swobodna określa samorzutność przebiegu oraz stan równowagi reakcji. Energia
swobodna jest funkcja stanu, co oznacza, iŜ nie zaleŜy ona od sposobu, w jaki przemiana zachodzi, lecz jedynie
od początkowego i końcowego stanu układu. Oznacza to tym samym, iŜ nie zaleŜy ona od ilości i jakości
występujących w przebiegu reakcji stanów pośrednich, co będzie miało istotne znaczenie przy katalizie
enzymatycznej.
Energia swobodna powiązana jest z innymi funkcjami stanu charakteryzującymi reakcję chemiczną, tj. z
entalpią i entropią.
• Entalpią reakcji (H) nazywamy jej efekt cieplny, zachodzący pod stałym ciśnieniem. Na podstawie I
zasady termodynamiki wyraŜa się ona następująco: ∆H=∆U+p∆V, gdzie ∆U oznacza zmianę energii
wewnętrznej, p∆V zaś pracę objętościową (zmiana ilości gazu o 1 mol jest równoznaczna z
wykonaniem pracy ok. 2,6 kJ). Pojęcie entalpii tłumaczy zachodzenie procesów ezgoergicznych.
• Z kolei entropia (S) jest miarą rozkładu energii w układzie. Wszystkie układy dąŜą do zapewnienia
moŜliwie największej róŜnorodności sposobów podziału energii między drobiny oraz poszczególne
rodzaje form jej gromadzenia. Pojęcie entropii tłumaczy zachodzenie procesów endoergicznych,
zachodzenie reakcji w układach izolowanych oraz samorzutne mieszanie się gazów.
-32-
Zmiany funkcji stanu w wyniku przebiegu reakcji chemicznej łączy ze sobą równanie GibbsaHelmholtza: ∆G=∆H-T∆S. Układy biologiczne dąŜą do zmniejszenia energii wewnętrznej (∆H<0) oraz wzrostu
wewnętrznego nieuporządkowania (∆S>0), co w efekcie daje ∆G<0 – stan taki oznacza reakcję samorzutną.
Przez analogię ∆G=0 oznacza ustalenie się stanu równowagi w układzie, zaś 4G>0 – zachodzenie reakcji
wymuszonej.
Wartości i znaki funkcji stanu opisują samorzutność reakcji, nie mówią jednak nic o szybkości jej
przebiegu. Miarą szybkości reakcji jest szybkość pojawiania się produktów i jednoczesnego ubytku substratów
w środowisku: v=dc/dt. Szybkość zaleŜy od początkowego stęŜenia substratu: v~c0. Po wprowadzeniu
współczynnika proporcjonalności: v=kc0 (współczynnik k nazywamy stałą szybkości reakcji). Z porównania
powyŜszych zaleŜności wynika, iŜ szybkość reakcji maleje wykładniczo – jest największa na początku i
stopniowo, zrównując się z szybkością reakcji odwrotnej, co ma miejsce w chwili osiągnięcia stanu równowagi.
Dla większej ilości reagentów wyraŜenia opisujące szybkość reakcji powiększają się o iloczyn odpowiednich
stęŜeń:
A↔B
v = k[A]
A+A↔B
v = k[A][A]=k[A]2
aA↔B
v = k[A]a
Ogólnie dla modelowej reakcji odwracalnej: aA + bB ↔ cC + dD wyraŜenia opisujące szybkości reakcji
przyjmują postać: v1=k1[A]a[B]b i v2=k2[C]c[D]d. PoniewaŜ w stanie równowagi szybkość reakcji danej i
przeciwnej jest równa (v1=v2), zatem: k1/k2 = [C]c[D]d/[A]a[B]b = const. Wynik tego przekształcenia interpretuje
prawo działania mas Guldberga-Waagego: w stanie równowagi chemicznej iloczyn stęŜeń (ciśnień) reagentów w
wykładnikach potęgowych ich współczynników stechiometrycznych jest wielkością stałą dla danej reakcji i w
określonej temperaturze i nazywaną stałą równowagi reakcji (stęŜeniową – Kc lub ciśnieniową – Kp, przy czym
w praktyce częściej posługujemy się tą pierwszą). Pomiędzy stałymi równowagi tej samej reakcji zachodzi
zaleŜność: Kp=Kc(RT)∆n, gdzie: R – stała gazowa, T – temperatura bezwzględna, ∆n – przyrost liczby moli
produktów gazowych w czasie reakcji. Stała równowagi jest wielkością chemiczną charakteryzującą ilościowo
stan równowagi dynamicznej reakcji odwracalnej. Jej wielkość nie zaleŜy od stęŜeń reagentów, a jedynie od
temperatury, zmieniając się w sposób zaleŜny od efektu energetycznego reakcji.
Energia swobodna reakcji związana jest z jej stałą równowagi zaleŜnością: ∆G = -RTlnKc. JeŜeli więc
reakcja jest samorzutna, czyli ∆G<0, to Kc >1 – równowaga przesunięta jest w stronę produktów. Analogicznie
dla ∆G=0 Kc=1, zaś dla ∆G>0 Kc<1, czyli równowaga przesunięta jest w stronę substratów (reakcja przebiega
odwrotnie). PowyŜsze równanie jest uniwersalne; w przypadku układów redox pozwala ono na wyprowadzenie
równania Nernsta.
b) kinetyka katalizy enzymatycznej; czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej
Udział enzymów w reakcji chemicznej dostarcza jej alternatywnych stanów pośrednich. Inaczej mówiąc
enzymy obniŜają barierę energetyczną reakcji. Nie wpływają one jednak na energię swobodną, która zaleŜy
przecieŜ tylko od stanu początkowego i końcowego. Enzymy, ani teŜ inne katalizatory, nie są w stanie wpłynąć
na kierunek ani zmienić stałej równowagi reakcji. Widać to wyraźnie po rozpisaniu równań na stałe równowagi:
bez enzymu: A + B ↔ C + D, Kc1=[C][D]/[A][B],
z enzymem: A + B + Enz ↔ ... ↔ C + D + Enz, Kc2=[C][D][Enz]/[A][B][Enz]=[C][D]/[A][B]=Kc1.
Szybkość reakcji katalizowanej enzymatycznie zaleŜna jest od wielu czynników. NaleŜą do nich:
temperatura, odczyn środowiska (pH), stęŜenie enzymu, stęŜenie substratu oraz brak lub obecność inhibitorów.
• Wraz ze wzrostem temperatury wzrasta szybkość reakcji katalizowanej enzymatycznie, ale tylko w
ściśle ograniczonym zakresie temperatury. Szybkość reakcji początkowo się zwiększa, wraz ze
wzrostem temperatury, z powodu zwiększania energii kinetycznych reagujących cząsteczek.
Ostatecznie energia kinetyczna enzymu przekracza jednak barierę energetyczną słabych wiązań
wodorowych i hydrofobowych, które utrzymują jego strukturę II- i III-rzędową. W tej temperaturze
denaturacji dominuje towarzysząca strąceniu białka utrata aktywności katalitycznej enzymu. Zakres
temperatury, w którym enzym utrzymuje stabilną katalitycznie kompetentną konformację zaleŜy
zazwyczaj od temperatury komórek, w których występuje i umiarkowanie ją przekracza. Enzymy
organizmu ludzkiego, którego temperatura wynosi ok. 37oC, zachowują zazwyczaj stabilność do
temperatury 45-55oC.
• Gdy aktywność enzymu zmierzy się w kilku wartościach pH, obserwuje się, Ŝe optymalna aktywność
mieści się na ogół między wartościami pH 5-9, niemniej kilka enzymów, np. pepsyna, jest aktywnych
przy wartościach pH wyraźnie wykraczających poza ten zakres. Kształt krzywych wyraŜających
zaleŜność aktywności od pH określają czynniki takie jak: denaturacja enzymu przy małych i duŜych
-33-
•
c)
wartościach pH oraz zmiany ładunku enzymu i / lub substratów. W przypadku enzymu odczyn moŜe
wpływać na jego aktywność przez zmianę struktury lub przez zmianę ładunku reszty aa, biorącej udział
w przyłączeniu substratu lub w katalizie. Aby to zilustrować naleŜy wziąć od uwagę ujemnie
naładowany enzym E- reagujący z dodatnio naładowanym substratem SH+: E- + SH+ → ESH. Przy
niskim pH enzym dąŜy do przyłączenia protonu i traci swój ładunek ujemny: E- + H+ → EH. Przy
wysokim pH substrat jonizuje i traci swój ładunek dodatni: SH+ → S + H+. PoniewaŜ jedynymi
formami, które mogą wchodzić w interakcje są SH+ i E-, krańcowe wartości pH będą zmniejszały
skutecznie stęŜenie E- i SH+, zmniejszając w ten sposób szybkość reakcji.
Szybkość początkowa jest proporcjonalna do stęŜenia enzymu. Szybkość początkowa reakcji jest to
szybkość mierzona przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu, pozwalającej na zachodzenie
reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji katalizowanej przez enzym jest zawsze proporcjonalna
do stęŜenia enzymu. NaleŜy jednak podkreślić, iŜ stwierdzenie to odnosi się tylko do szybkości
początkowej.
wpływ stęŜenia substratu na szybkość reakcji
JeŜeli zwiększa się stęŜenie substratu ([S]), a wszystkie inne warunki pozostają niezmienione, to
mierzona szybkość początkowa v zwiększa się do wartości maksymalnej vm i nie przekracza jej. Szybkość
reakcji zwiększa się wraz ze zwiększaniem stęŜenia substratu aŜ do momentu, gdy enzym jest nasycony
substratem. Mierzona szybkość początkowa osiągnie wartość maksymalną i nie ma na nią wpływu dalsze
zwiększanie substratu, poniewaŜ substrat występuje w duŜym nadmiarze molowym w stosunku do enzymu.
StęŜenie substratu, które powoduje osiągnięcie połowy szybkości maksymalnej, zwane jest stałą
Michaelisa (Km). MoŜna ją oznaczyć doświadczalnie przez graficzne przedstawienie zaleŜności V od [S]
(rysunek poniŜej). Km ma wymiar stęŜenia molowego.
PowyŜsza krzywa jest wykresem tzw. równania Michaelisa-Menten, które ma postać:
Opisuje ono zachowanie się wielu enzymów przy zmieniającym się stęŜeniu substratu. Na jego podstawie
zaleŜność początkowej szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od [S] i od Km moŜna przedstawić
następująco:
• gdy [S] « Km – dodanie [S] do Km w mianowniku zmienia bardzo niewiele jego wartość, tak Ŝe
wyraŜenie [S] moŜna w mianowniku pominąć; poniewaŜ vm i Km są stałe, moŜna ich stosunek zastąpić
nową stała K:
Innymi słowy, jeŜeli stęŜenie substratu jest znacznie mniejsze od tego, które jest wymagane do uzyskania
połowy szybkości maksymalnej, to szybkość początkowa zaleŜy od stęŜenia substratu.
-34-
•
gdy [S] = Km:
Oznacza to, iŜ jeŜeli stęŜenie substratu jest równe wartości Km, to szybkość początkowa równa się
połowie szybkości maksymalnej. Wskazuje to takŜe jak oznaczyć Km, a mianowicie trzeba określić
doświadczalnie stęŜenie substratu, przy którym początkowa szybkość stanowi połowę wartości maksymalnej.
• gdy [S] » Km – dodanie Km do [S] w mianowniku zmienia jego wartość bardzo niewiele, tak Ŝe
wyraŜenie Km moŜna w mianowniku pominąć:
Oznacza to, Ŝe jeŜeli stęŜenie substratu znacznie przewyŜsza wartość Km, to szybkość początkowa jest
szybkością maksymalną.
Bezpośredni pomiar liczbowej wartości vm i obliczenie Km często wymaga trudnych do uzyskania w
praktyce wysokich stęŜeń substratu, aby w laboratorium osiągnąć warunki nasycenia. Aby ominąć tę przeszkodę,
stosuje się liniową formę równania Michaelisa-Menten, która pozwala łatwo ekstrapolować vm i Km z szybkości
reakcji mierzonych przy mniejszych niŜ nasycające stęŜeniach substratu. Równanie M-M przekształcić moŜna
następująco:
Jest to równanie prostej y=ax+b, gdzie y=1/v, zaś x=1/[S]. JeŜeli y lub 1/v jest wykreślony jako funkcja x lub
1/[S], to b=1/vm na osi y, a kąt nachylenia a=Km/vm. Ujemny odcinek na osi x moŜna określić przez przyjęcie
y=0. Wtedy: x=-b/a=-1/Km.
Wykres taki nazywamy wykresem podwójnych odwrotności lub wykresem Lineweavera-Burka. Z jego pomocą
moŜna określić Km wykorzystując albo nachylenie krzywej i odcinek na osi y albo odcinek na ujemnej części osi
x. Technika podwójnych odwrotności wymaga stosunkowo niewielu punktów dla określenia Km i jest metodą
najczęściej uŜywaną do wyznaczania Km.
Innym podejściem do doświadczalnego wyznaczenia Km i vm jest podejście Eadie i Hofstee. Równanie
M-M moŜe być przekształcone w następujący sposób:
Aby wyznaczyć Km i vm, wykreśla się v/[S] (oś y) wobec v (oś x). Miejsce przecięcia osi y wyznacza wówczas
vm/Km, a miejsce przecięcia osi x – vm. Nachylenie wynosi –1/Km.
-35-
d) zjawisko kooperatywności
Pewne enzymy i inne białka przyłączające ligandy, takie jak hemoglobina, nie działają zgodnie z
klasyczną kinetyką nasycenia M-M. JeŜeli prędkość wykreśli się względem stęŜenia substratu, to krzywa
nasycenia ma kształt sigmoidalny (jak rozciągnięta litera S) – rysunek niŜej.
Ogólnie wskazuje to na kooperatywne przyłączenie substratu do licznych miejsc. Przyłączenie w jednym
miejscu wpływa na przyłączenie w innych miejscach. W przypadku sigmoidalnej kinetyki nasycenia enzymu
substratem omówione powyŜej metody graficznej oceny stęŜenia substratu, które powoduje osiągnięcie połowy
szybkości maksymalnej, są bezuŜyteczne z powodu braku linii prostych. Aby ocenić taką kinetykę nasycenia,
moŜna wykorzystać graficzne przedstawienie równania Hilla – wyprowadzonego pierwotnie, aby opisać
kooperatywne przyłączenie O2 do Hb. W formie linii prostej ma ono postać następującą:
,
gdzie k jest stała złoŜoną. Z równania wynika, Ŝe gdy [S] « k, to szybkość reakcji zwiększa się jak n-ta potęga
[S].
Na kolejnym rysunku przedstawiono wykres Hilla danych kinetycznych dla enzymu z kinetyką wiązania
kooperatywnego. Wykres v / (vm – v) względem log [S] daje linię prostą o nachyleniu n, gdzie n jest parametrem
empirycznym, którego wartość zaleŜy od liczby miejsc wiąŜących substrat oraz liczby i typu interakcji między
nimi. Gdy n=1, miejsca wiązania działają niezaleŜnie jedno od drugiego. JeŜeli n>1, to miejsca są kooperatywne
i przy większej wartości n kooperatywność jest silniejsza, a wówczas kinetyki nasycenia są bardziej
sigmoidalne. JeŜeli n<1, wówczas miejsca wykazują negatywna kooperatywność. W połowie szybkości
maksymalnej: v=vm/2, więc: v / (vm – v) = 1, czyli: log v / (vm-v) = 0. Aby zatem wyznaczyć S50 (stęŜenie
substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej) naleŜy wykreślić linię
prostopadłą do osi x z punktu, w którym log v / (vm – v) = 0.
e)
inhibicja odwracalna i nieodwracalna
Do czynników modyfikujących szybkość zachodzenia reakcji enzymatycznej naleŜy równieŜ obecność
inhibitora. Inhibitory dzielimy ze względu na to, czy hamowanie ustępuje czy nie w wyniku zwiększenia
stęŜenia substratu, na kompetycyjne i niekompetycyjne. Podział ten jest o tyle utrudniony, o ile wiele
inhibitorów nie wykazuje idealnych właściwości czysto nie- lub kompetycyjnych. Innym sposobem
klasyfikowania inhibitorów jest podział według ich miejsca działania. Niektóre z nich wiąŜą się z enzymem w
-36-
tym samym miejscu co substrat (miejsca katalityczne), inne zaś łączą się z dla od miejsca katalitycznego
(miejsca allosteryczne).
Klasyczne hamowanie kompetencyjne zachodzi w miejscu wiązania substratu (katalitycznym).
Chemiczna struktura inhibitora, analogu substratu (I), ogólnie przypomina budowę substratu. Łączy się on zatem
odwracalnie z enzymem, tworząc kompleks enzym-inhibitor (EI), a nie kompleks ES. Gdy jest obecny zarówno
substrat, jak i ten typ inhibitora, wówczas współzawodniczą one ze sobą o te same miejsca wiązania w enzymie.
Klasycznym przypadkiem hamowania kompetycyjnego jest para malonian (I) i bursztynian (S) w stosunku do
dehydrogenazy busztynianowej. Enzym ten katalizuje tworzenie fumaranu przez usunięcie po jednym atomie
wodoru z kaŜdego atomu α-węgla bursztynianu. Malonian moŜe łączyć się z dehydrogenazą, tworząc kompleks
EI. Nie moŜe on ulec odwodornieniu, gdyŜ nie ma Ŝadnego sposobu, aby usunąć nawet jeden atom wodoru z
pojedynczego atomu węgla α bez utworzenia pięciowartościowego atomu węgla. Jedyną reakcją, której moŜe
podlegać kompleks EI jest powtórny rozpad na wolny enzym i inhibitor. Dla reakcji rozpadu określić moŜna
równowagi Ki=[E][I]/[EI]. Inhibitory kompetycyjne nie zmieniają szybkości reakcji enzymatycznej, wpływają
natomiast na stałą Km. Wykresy L-B dla tej samej reakcji bez inhibitora oraz z inhibitorem kompetycyjnym będą
przecinały oś y w tym samym miejscu, róŜny natomiast będzie odcinek po ujemnej stronie osi x. To ostatnie ma
wartość: 1/x=Km(1+[I]/Ki), gdzie Ki jest obliczoną wcześniej stałą szybkości hamowanej reakcji.
W hamowaniu niekompetycyjnym nie występuje konkurencja między S a I. Inhibitor zazwyczaj nie
wykazuje Ŝadnego albo małe podobieństwo wobec substratu i moŜna przyjąć, Ŝe wiąŜe się z inna domeną
enzymu. Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszają szybkość maksymalną, osiągalną przy danej ilości
enzymu, ale zazwyczaj nie wpływają na Km. PoniewaŜ I i S mogą się łączyć w róŜnych miejscach, jest moŜliwe
tworzenie zarówno kompleksów EI, jak i EIS. PoniewaŜ EIS moŜe się rozpaść, tworząc produkt z mniejszą
szybkością niŜ ES, reakcja moŜe być spowolniona, ale nie zatrzymana. Wykresy L-B dla tej samej reakcji bez
inhibitora oraz z inhibitorem niekompetycyjnym będą miały taki sam odcinek po ujemnej stronie osi x,
natomiast będą przecinały oś y w róŜnych miejscach – zaleŜnie od powinowactwa S względem E oraz EI.
Aktywność enzymatyczną całkowicie blokują działające na enzymy „trucizny”, np. jodoacetamid, jony
metali cięŜkich (Ag+, Hg2+), czynniki utleniające itd. Te inhibitory zazwyczaj powodują chemiczną modyfikację
aminokwasów w enzymie, co odgrywa istotną rolę w katalizie. Proces ten nie jest łatwo odwracalny ani poprzez
usunięcie pozostałości wolnego inhibitora, ani przez wzrost stęŜenia substratu. Inhibitory takie często nie
wykazują strukturalnego podobieństwa do substratu. Niemniej, kiedy miejsce ataku chemicznego znajduje się w
obrębie miejsca katalitycznego, obecność substratu lub produktu często wywiera ochronny wpływ przez
blokowanie lub spowalnianie dostępu inhibitora do odpowiedniego aminokwasu.
-37-
4.
Regulacja aktywności enzymów
Aktywność katalityczna enzymu zaleŜy od dwóch czynników, tj. od ilości tego enzymu oraz od jego
sprawności katalitycznej.
a)
Ilość enzymu determinowana jest równowagą pomiędzy jego syntezą a rozkładem. Oba te procesy
zachodzą róŜnymi drogami oraz podlegają odmiennej i niezaleŜnej regulacji (por. dalej). Modyfikacja
syntezy i/lub degradacji jest powolną metodą regulacji, ze względu na złoŜoność i wieloetapowość
procesu syntezy białka.
•
Synteza enzymu jest reakcją na obecność swoistych drobnocząsteczkowych induktorów – na ogół, choć
nie zawsze, są to substraty enzymów podlegających indukcji, mogą to być równieŜ związki
przypominające budową substrat – tzw. induktory gratisowe. Enzymy podlegające tej formie kontroli
określa się jako indukowalne, zaś te posiadające stałą i niezmienną aktywność – jako konstytucyjne.
Jeden enzym (aktywność katalityczna) moŜe posiadać zarówno izoenzymy indukowalne, jak i
konstytutywne. Do grupy enzymów indukowalnych naleŜą m. in.: 2,3-dioksygenaza tryptofanowa,
dehydrataza treoninowa, transaminaza tyrozyna : α-ketoglutaran, β-D-fruktofuranozydaza, enzymy
cyklu mocznikowego, reduktaza HMG-CoA, cytochrom P450 (CYP), syntaza tlenku azotu – izoenzym i
(iNOS).
Synteza enzymów moŜe być hamowana – ulegać represji – przez obecność w środowisku reakcji jej
produktu. Zarówno indukcja, jak i represja, przebiega przy udziale elementów cis, tj. specyficznych
sekwencji DNA obecnych po stronie 5’ genu kodującego dany enzym oraz białek regulujących, tj.
czynników trans. Ponadto określone metabolity mogą stanowić korepresory lub koinduktory, które
przez wiązanie a czynnikami trans mogą modulować ich oddziaływanie z elementami cis. DuŜe
wewnątrzkomórkowe stęŜenie niektórych metabolitów (np. aa, zasady azotowe) blokuje syntezę
elementów biorących udział w ich własnej biosyntezie. Po obniŜeniu tego stęŜenia enzym powraca do
pierwotnej aktywności – ulega odblokowaniu, czyli derepresji. PowyŜszy mechanizm odnosi się do
represji na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego za pomocą produktu (por. operon tryptofanowy u bakterii).
Innym modelem regulacji jest represja za pomocą katabolitu, polegająca na represji syntezy enzymów
katalizujących reakcje kataboliczne pod wpływem związków pośrednich, powstających w tych
reakcjach (por. operon galaktozowy u bakterii).
Degradacja enzymów, podobnie jak synteza, jest swoiście regulowana – wraŜliwość białek
enzymatycznych na proteolizę zaleŜy m. in. od obecności substratów, koenzymów lub jonów metali.
Np. synteza arginazy nasila się po spoŜyciu posiłku, a degradacja maleje w trakcie głodzenia
(wypadkowo ilość enzymu rośnie w obu przypadkach, choć są to inne mechanizmy regulacji). Podobnie
jest w przypadku 2,3-dioksygenazy (pirolazy) tryptofanowej – kortykosteroidy zwiększają jej syntezę,
zaś Trp spowalnia jej degradację przez obniŜenie wraŜliwości na proteolizę.
•
•
b) Aktywność katalityczna enzymu moŜe być regulowana w róŜny sposób – poprzez odwracalne wiązanie
ligandów (regulacje allosteryczne) lub zmianę wiązań kowalencyjnych (modyfikacje kowalencyjne).
Jest to o wiele szybszy sposób regulacji w porównaniu z wpływem na syntezę / rozkład enzymu.
•
•
Aktywność enzymów regulacyjnych, tj. kluczowych dla danego szlaku metabolicznego, jest
modulowana za pomocą małocząsteczkowych efektorów allosterycznych, na ogół niepodobnych ani do
substratów ani koenzymów danego enzymu. Hamowanie aktywności enzymu szlaku biosyntezy przez
końcowy produkt tego szlaku to tzw. hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne, a ten produkt – to ujemny
efektor allosteryczny lub inhibitor zwrotny. WiąŜe się on zwykle z miejscem allostercznym enzymu,
które nie pokrywa się z miejscem katalitycznym. Kinetyka hamowania przez sprzęŜenie zwrotne moŜe
mieć charakter kompetycyjny, niekompetycyjny, częściowo kompetycyjny lub inny. Mechanizm ten
występuje najczęściej jako regulacja szlaków biosyntezy, a inhibitorem zwrotnym jest ostatni związek
drobnocząsteczkowy szlaku, stanowiący substrat do syntezy związków wielkocząsteczkowych (np. aa i
synteza białek, nukleotydy i synteza kwasów nukleinowych). Zazwyczaj regulacja przez sprzęŜenie
zwrotne dotyczy etapu kontrolującego (limitującego), charakterystycznego wyłącznie dla danego szlaku
biosyntezy.
W przypadku szlaków rozgałęzionych – czyli gdy początkowe reagenty słuŜą do syntezy kilku
związków ostatecznych – enzymy tego szlaku znajdują się pod złoŜonym wpływem zarówno
metabolitów pośrednich, jak i ostatecznych, zaś same mechanizm regulacji potrafią być bardzo
skomplikowane. Hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne moŜe mieć w szlakach rozgałęzionych
charakter:
-38-
kumulatywny – gdy hamujący wpływ ≥ 2 produktów końcowych jest sumą skutków wywoływanych
przez kaŜdy z tych produktów niezaleŜnie,
zgodny czyli wielowartościowy – jeśli całkowite zahamowanie aktywności enzymu występuje tylko
wtedy, gdy jednocześnie ≥ 2 produkty końcowe występują w nadmiarze,
kooperatywny – gdy pojedynczy produkt końcowy hamuje enzym regulujący, zaś efekt inhibicji przez
≥ 2 nadmiarowe produkty przewyŜsza sumę efektów niezaleŜnego działania kaŜdego z nich.
• Brak podobieństwa w budowie substratów i regulatorów allosterycznych sugeruje, iŜ substancje te
wiąŜą się z róŜnymi miejscami enzymu – odpowiednio z katalitycznymi i allosterycznymi. Z tego
powodu enzymy takie określamy jako enzymy allosteryczne. O niezaleŜności miejsc wiązania świadczy
m. in. fakt, iŜ utrata wraŜliwości na efektory allosteryczne nie musi być jednoznaczna z utratą
aktywności katalitycznej. Ponadto efektory allosteryczne potrafią chronić miejsce katalityczne przed
denaturacją skuteczniej od samych substratów, co trudno byłoby wyjaśnić, gdyby przyjąć ich wspólne
miejsce wiązania. W pewnych enzymach miejsca katalityczne i allosteryczne zlokalizowane są na
róŜnych podjednostkach białka oligomerycznego. Enzymy katalizujące tę samą reakcję (lub typ reakcji)
potrafią posiadać róŜne efektory allosteryczne w róŜnych komórkach.
• Enzymy allosteryczne dzieli się na grupy – tzw. serię K i V. Te pierwsze cechują się kompetycyjną
kinetyką nasycenia substratem – wzrasta KM, a Vm pozostaje bez zmian. W przypadku drugiej grupy
efektor allosteryczny zmniejsza Vm, nie wpływając na KM. Zmiany obydwu parametrów wynikają
prawdopodobnie ze zmian konformacyjnych w miejscu katalitycznym – dla serii K moŜe to
spowodować osłabienie wiązania z substratem, dla V – zmianę przestrzennej orientacji lub ładunków
reszt aa centrum katalitycznego.
• Aktywność enzymów podlega nadrzędnej regulacji hormonalnej i nerwowej (tzw. przekaźników I
rzędu), które to bodźce mogą pobudzać syntezę lub uwolnienie gotowych juŜ efektorów allosterycznych
(tzw. przekaźników II rzędu).
•
Regulacja aktywności enzymów przez kowalencyjne modyfikacje ich cząsteczek moŜe mieć charakter
odwracalny lub nie – w pierwszym przypadku mówimy o odwracalnej fosforylacji, w drugim zaś – o
swoistej ograniczonej proteolizie (jest to metoda nieodwracalna, gdyŜ nie ma moŜliwości ponownej
resyntezy raz zhydrolizowanych wiązań peptydowych).
Wiele białek syntetyzowanych jest w formie nieaktywnych prekursorów – probiałek; w przypadku
enzymów są to proenzymy (inaczej zymogeny). Nadanie im właściwej postaci, w której mogą
wykazywać swą aktywność, odbywa się drogą swoistej hydrolizy pewnych wiązań peptydowych
(proteolizy). W procesie tym łańcuch polipeptydowy moŜe tracić swą ciągłość – produkty proteolizy
mogą zostać na stałe rozdzielone, bądź utrzymywane w całości dzięki istnieniu wiązań
dwusiarczkowych. RównieŜ nie wszystkie reszty aa obecne w probiałku muszą znaleźć się w jego
formie ostatecznej – niektóre z powstałych peptydów mogą ulec odrzuceniu jako nieaktywne
biologicznie. Mogą one mieć jednak duŜą wartość diagnostyczną, gdyŜ ich poziom koreluje z ilością
synetyzowanego endogennie probiałka – np. oznaczanie peptydu C w cukrzycy czy NT-proBNP w
niewydolności krąŜenia. Podstawową konsekwencją swoistej proteolizy jest uzyskanie przez białko
nowej konformacji, co w przypadku enzymów oznacza odsłonięcie miejsca katalitycznego. Synteza
probiałek ma istotne znaczenie fizjologiczne – w takiej formie syntetyzowane są białka
wykorzystywane przez organizm jedynie czasowo – w razie potrzeby; wówczas jednak są one
potrzebne natychmiast, wobec czego synteza de novo z aa trwałaby zbyt długo – do tego czasu albo
minęłoby zapotrzebowanie na dane białko, albo doszłoby do uszkodzenia komórek i synteza okazałaby
się spóźniona. Ponadto pewne reakcje zachodzące z udziałem białek wymagają precyzyjnej koordynacji
czasowej. Inną przyczyną syntezy proenzymów jest ochrona syntetyzującej je tkanki przed
samostrawieniem (np. przedwczesna aktywacja zymogenów hydrolaz trzustkowych jest elementem
patogenezy ostrego zapalenia tego narządu). Do białek syntetyzowanych w formie prekursorów zalicza
się: insulinę, pepsynę i proteazy trzustkowe – trypsynę, chymotrypsynę, elastazę, karboksypeptydazę
(patrz punkt VI-1-a), kolagen (patrz punkt VII-8-b) oraz niektóre czynniki krzepnięcia krwi (patrz punkt
VII-4-e).
Cząsteczki białek mogą podlegać róŜnorodnym modyfikacjom kowalencyjnym – czy to w celu zmiany
ich struktury (glikozylacja, hydroksylacja, acylacja), czy teŜ regulacji ich aktywności (metylacja, ADPrybozylacja, fosforylacja). Najczęściej spotykanym mechanizmem jest tu odwracalna fosforylacja.
Reakcje fosforylacji białek katalizowane są przez enzymy – kinazy białek (białkowe), które przenoszą
grupę γ-fosforanową z ATP na reszty aa zawierające grupy hydroksylowe, tj. Ser, Thr lub Tyr; bardzo
rzadko w przyrodzie modyfikacji tej podlegają reszty His, Lys, Arg czy Asp. Zasadniczo reakcje
dotyczą reszt aa odległych o miejsca katalitycznego, stąd miejsca fosforylacji mogą być uznawane za
pewną formę miejsc allosterycznych. Reszta fosforanowa moŜe zostać odłączona w wyniku hydrolizy,
katalizowanej przez fosfatazy białek. Typowa komórka ludzka posiada tysiące białek podlegających
-39-
regulacji przez odwracalną fosforylację oraz kilkaset odpowiednich kinaz i fosfataz – świadczy to o
prostocie i uŜyteczności tego mechanizmu, stąd teŜ jest on najczęściej spotykanym. Reszty fosforanowe
są bardzo skutecznymi modyfikatorami struktury III-rzędowej i funkcji białek, m. in. dzięki obecności
ładunku elektrycznego (-2 w fizjologicznym pH) oraz tworzeniu wiązań jonowych w resztami Arg.
Fosforylacja moŜe zmieniać sprawność katalityczną, powinowactwo do substratu, lokalizację
wewnątrzkomórkową lub wraŜliwość na efektory allosteryczne. Jedne białka wykazują większą
aktywność w formie ufosforylowanej, podczas gdy inne w zdefosforylowanej.
Nie wszystkie białka podlegają odwracalnej fosforylacji; podobnie w białkach fosforylowanych nie
ulegają tej reakcji wszystkie dostępne grupy hydroksylowe. Ogólnie białka mogą być fosforylowane w
róŜnych miejscach i przez róŜne kinazy (por. regulacja syntazy glikogenowej – punkt IV-5-c), z kolei
poszczególne kinazy i fosfatazy modyfikują zazwyczaj więcej niŜ jedno białko, same podlegając
regulacji przez przekaźniki II rzędu lub równieŜ odwracalną fosforylację. W ten sposób mogą powstać
regulacyjne kaskady kinaz / fosfataz, w których jedne enzymy uaktywniają lub pozbawiają aktywności
kolejne, podczas gdy ostatni modyfikuje aktywność właściwego białka o aktywności enzymatycznej
(por. regulacja reduktazy HMG-CoA – punkt V-8-a; jeszcze lepiej jest to widoczne na przykładzie
kinaz aktywowanych mitogenami – MAPK). Pewne kinazy, same modyfikowane przez odwracalną
fosforylację, posiadają zdolność fosforylacji własnych miejsc allosterycznych (tzw. autofosforylacji) i
zmiany swojej aktywności (np. kinaza tyrozynowa receptora insulinowego – patrz punkt IV-8-b).
W opisany wyŜej sposób powstają złoŜone systemy przekaźników I i II rzędu, kinaz i fosfataz, miejsc
fosforylacji i modyfikacji allosterycznych oraz ostatecznie efektów fosforylacji odpowiednich białek,
umoŜliwiające szybką i precyzyjną regulację czynności komórek, a przez to adekwatną odpowiedź
ustroju na działanie czynników zewnętrznych. Odwracalne fosforylacje regulują przepływ metabolitów
w organizmie, kierując substraty w kierunku szlaków syntezy związków aktualnie najbardziej
potrzebnych oraz synchronizując anabolim i katabolizm określonych grup substancji.
Uproszczona klasyfikacja kinaz białkowych:
rodzina kinaz serynowo-treoninowych
kinaza białkowa A (PKA) – zaleŜna od cAMP
kinaza białkowa G (PKG) – zaleŜna od cGMP
kinaza białkowa C (PKC) – zaleŜna od Ca2+ i DAG
kinaza białkowa CaM – zaleŜna od Ca2+/kalmoduliny
kinazy zaleŜne od cyklin (CDK)
kinazy aktywowane mitogenami (MAPK)
inne: kinaza białkowa B (PKB, Akt1), kinaza zal. od AMP (AMPK), kinazy syntazy
glikogenowej (GSK)
rodzina kinaz tyrozynowych
receptorowe kinazy Tyr, stanowiące integralną część receptorów katalitycznych, np.
receptora insulinowego czy dla czynników wzrostowych (PDGF, EGF, IGF-1)
cytoplazmatyczne kinazy Tyr (Abl, src)
kinazy mieszane – tzw. o podwójnej specyficzności
5.
Znaczenie diagnostyczne pomiarów aktywności enzymów
Diagnostyka enzymatyczna ma praktyczne zastosowanie w chorobach wątroby, serca, trzustki, mięśni,
krwi, kości oraz w schorzeniach nowotworowych. KaŜda tkanka jest wyposaŜona w swoisty dla siebie zestaw
enzymów – w przypadku uszkodzenia lub zaburzenia funkcji danego narządu enzymy w nim występujące
uwalniane są do krwiobiegu. Stopień zwiększenia aktywności enzymatycznych i czas ich utrzymania się w
surowicy zaleŜy od: nasilenia procesów patologicznych, rozległości uszkodzeń tkankowych oraz szybkości
katabolizmu i eliminacji enzymów z osocza. Na tej podstawie często moŜliwe jest określenie pochodzenia i
stopnia zaawansowania patologii. Dokładniejsze określenie rodzaju uszkodzonego narządu jest moŜliwe na
podstawie obrazu izoenzymów w surowicy; istotnymi diagnostycznie enzymami występującymi w postaci
izoenzymów są m. in.: CK, ALP oraz LDH.
a)
Ze względu na podstawową lokalizację enzymu oraz wydzielanie go do płynów ustrojowych, wyróŜnia
się 3 grupy enzymów:
•
Enzymy wskaźnikowe (indykatorowe) to takie, które po zsyntezowaniu pozostają w obrębie komórki.
Przenikają w bardzo niewielkich ilościach do krwi, co jest wyrazem powolnego, fizjologicznego
obumierania produkujących je komórek. Przez analogię – ich obecność we krwi w stęŜeniach
przekraczających normę świadczy o nasilonym obumieraniu lub nagłym uszkodzeniu tych komórek.
Niestety większość enzymów indykatorowych jest niespecyficzna tkankowo, dlatego lokalizacja
-40-
•
•
•
uszkodzenia opiera się na poszukiwaniu enzymu, którego poziom najbardziej przekroczył normę. Do
enzymów wskaźnikowych naleŜą m.in.: aminotransferaza asparaginowa (AspAT), aminotransferaza
alaninowa (AlAT), dehydrogenaza mleczanowa (LDH) oraz kinaza kreatynowa (CK).
Enzymy ekskrecyjne syntetyzowane są w komórkach, a następnie wydzielane do przewodów
wyprowadzających (Ŝółć, trzustka, prostata). Enzymy te, podobnie jak wcześniej omówione
wskaźnikowe, nie występują fizjologicznie we krwi w znacznych stęŜeniach. Gdy jednak taki fakt
nastąpi, świadczy o utrudnieniu w odpływie wydzieliny, najprawdopodobniej spowodowanym
niedroŜnością odpowiedniego przewodu wyprowadzającego. NiedroŜność moŜe być z kolei
spowodowana blokadą wewnątrz przewodu (np. przez kamień lub guz), uciskiem na przewód z
zewnątrz bądź znacznym poszerzeniem ścian przewodu (np. w wyniku stanu zapalnego). Do enzymów
ekskrecyjnych naleŜą m.in.: fosfataza alkaliczna (ALP), γ-glutamylotranspeptydaza (GGTP) i 5’nukleotydaza (5’-NT), określane wspólnie jako markery cholestazy (zastoju Ŝółci), gdyŜ znaczny
wzrost ich aktywności we krwi towarzyszy niedroŜności dróg Ŝółciowych.
Enzymy sekrecyjne po zsyntetyzowaniu wydzielane są do krwi, więc występują w niej fizjologicznie w
znaczących ilościach. Stanem patologicznym jest natomiast obniŜenie ich aktywności w surowicy,
mogące świadczyć o niewydolności produkującego je narządu. Niektóre z enzymów sekrecyjnych są
specyficzne tkankowo, zatem obniŜenie ich poziomu świadczy o uszkodzeniu jednego konkretnego
narządu. Np. pseudocholinosteraza (butyrylocholinoesteraza = BChE) jest swoista dla hepatocytów,
stąd jej niski poziom sugeruje uszkodzenie miąŜszu wątroby.
Enzymy sekrecyjne, występujące we krwi w większych stęŜeniach niŜ w tkankach i pełniące w niej
funkcje fizjologiczne, określa się jako funkcjonalne enzymy osocza. Enzymy ekskrecyjne i
wskaźnikowe, występujące we krwi w o wiele mniejszych stęŜeniach niŜ w tkankach i nie pełniące w
niej Ŝadnej istotnej roli (poza diagnostyczną), określa się jako niefunkcjonalne enzymy osocza.
b) enzymy najczęściej oznaczane w praktyce klinicznej
Ogólnie w materiale biologicznym pobranym z ludzkiego organizmu istnieje moŜliwość oznaczenia
aktywności kilkudziesięciu enzymów. Większość z nich oznacza się jednak rzadko i przy specjalnych
potrzebach, zaś w rutynowej diagnostyce uŜywa się ok. 10 z nich. Są to:
AST, AspAT – aminotransferaza asparaginianowa,
ALT, AlAT – aminotransferaza alaninowa,
LDH – dehydrogenaza mleczanowa,
HBD – dehydrogenaza hydroksymaślanowa,
CK – kinaza kreatynowa,
GGTP – γ-glutamylotranspeptydaza,
ALP – fosfataza alkaliczna,
ACP – fosfataza kwaśna,
AMS – α-amylaza,
LP – lipaza trzustkowa
ChE – esteraza cholinowa, cholinoesteraza
•
dehydrogenaza mleczanowa (LDH)
LDH jest enzymem przekształcającym pirogronian w mleczan lub odwrotnie (patrz punkt IV-4-a).
Aktywność ta nie jest przypisana pojedynczej cząsteczce – LDH posiada 5 izoenzymów, numerowanych kolejno
od 1 do 5. Są to jednak tzw. izoenzymy rzekome, bowiem syntetyzowane są tylko dwa odmienne (róŜnią się one
strukturą IV-rzędową) łańcuchy polipeptydowe – sercowy (H) oraz mięśniowy (M). Z nich następnie formowane
jest aktywne białko tetrameryczne, w którym oba rodzaje podjednostek mogą występować w dowolnym
składzie. PoniewaŜ istnieje 5 moŜliwych kombinacji (HHHH, HHHM, HHMM, HMMM, MMMM), stąd
wyróŜnia się 5 izoenzymów rzekomych. Warto zwrócić uwagę, iŜ LDH wykazuje aktywność jedynie w postaci
tetramerycznej, a pojedyncze podjednostki nie są zdolne do katalizy. Izoenzymy LDH róŜnią się lokalizacją
tkankową:
LDH1 – serce, nerki, mózg, erytrocyty,
LDH2 – mózg, nerki, serce, erytrocyty
LDH3 – trzustka, płuca, mm. szkieletowe,
LDH4 – trzustka, nerki, mm. szkieletowe,
LDH5 – wątroba, mm., skóra
Dwa pierwsze – LDH1 i LDH2 – odpowiadają łącznie za ok. 50% aktywności w surowicy. Izoezymy LDH róŜnią
się równieŜ okresem półtrwania – dla LDH1 wynosi on ok. 100 h, podczas gdy dla LDH5 – tylko ok. 10 h.
Znaczenie diagnostyczne:
-41-
DuŜy wzrost aktywności w surowicy z przewagą izoenzymów 1 i 2 moŜe świadczyć o zawale mięśnia
sercowego. Ze względu na długie T1/2 tych izoenzymów, zalicza się je do późnych markerów zawału.
PowyŜszy wynik moŜe równieŜ wystąpić w przypadku anemii megaloblastycznej, w przebiegu ostrych
białaczek lub towarzyszyć cięŜkim uszkodzeniom nerek.
DuŜy wzrost aktywności, jednak w przewagą LDH5, moŜe występować w chorobach wątroby i/lub mm.
szkieletowych.
Umiarkowany wzrost aktywności jest symptomem nieswoistym – moŜe być obecny przy zawale serca,
WZW lub procesach nowotworowych.
Równoległy wzrost aktywności izoenzomów 1 i 2 oraz narastaniem aktywności 5 przemawiają za
zawałem serca oraz dodatkowym rozwoju zastoju w krąŜeniu wątrobowym (tym samym rozwoju
niewydolności krąŜenia) i jest złym objawem prognostycznym.
•
kinaza kreatynowa (CK), kinaza fosfokreatynowa (CPK)
Jest to enzym katalizujący przeniesienie reszty fosforanowej z ATP na kreatynę, dając ADP i
fosfokreatynę oraz reakcję odwrotną (patrz punkt VI-3). CK bierze więc udział w procesach energetycznych –
regeneracji ATP z ADP poprzez wykorzystanie innego związku wysokoenergetycznego, jakim jest
fosfokreatyna, bowiem wiązanie pomiędzy kreatyną a resztą {P} naleŜy do wysokoenergetycznych. Aktywność
CK, podobnie jest obecność kreatyny, są największe w tkance mięśniowej, w tym równieŜ w mięśniu sercowym.
CK nie jest jednorodną cząsteczką – posiada 3 izoenzymy: BB – występujący w mózgu, płucach i jelitach oraz
MM i MB – występujące w mm. szkieletowych (gł. MM) i sercu (gł. MB). Fizjologicznie u dorosłych występuje
przede wszystkim CK-MM, stanowiący niemal 100% ogólnej aktywności; u dzieci obecna jest niewielka ilość
CK-MB.
Aktywność CK w surowicy wzrasta po duŜych wysiłkach fizycznych – stąd często podwyŜszony poziom
u sportowców – oraz w szeregu stanów patologicznych:
znaczny (> 5x) wzrost moŜe towarzyszyć stanom takim jak: zawał lub zapalenie mięśnia sercowego,
wstrząs lub niewydolność krąŜenia oraz dystrofia mm. szkieletowych,
umiarkowany (< 5x) wzrost moŜe świadczyć o: uszkodzeniach mięśni (równieŜ w wyniku iniekcji lub
operacji), rozległych uszkodzeniach tkanki nerwowej, chorobie nowotworowej lub alkoholizmie.
Największe znaczenie pomiarom aktywności CK przypisuje się w diagnostyce zawału serca.
PodwyŜszenie całkowitej aktywności CK pojawia się w ciągu I doby od incydentu ostrego niedokrwienia serca,
a izoenzym CK-MB stanowi jeden z tzw. wczesnych markerów niedokrwienia. JuŜ po 6h trwania zawału
wartość CK-MB wzrasta 10x, po czym wraca do normy ok. 3 dobach; utrzymywanie się podwyŜszonej
aktywności powyŜej 72 h stanowi zły czynnik rokowniczy.
•
aminotrasferazy, transaminazy:
asparaginanowa (AspAT) = Serum Glutamat-Oxalazetat Transaminase (SGOT)
alaninowa (AlAT) = Serum Glutamat-Pyruvat Transaminase (SGPT)
Aminotransferazy katalizują reakcje przeniesienia grupy aminowej – w tym przypadku pomiędzy αaminokwasami a α-ketokwasmi (patrz punkt VI-2-a). NaleŜą do enzymów wskaźnikowych (indykatorowych).
Pod względem lokalizacji komórkowej AspAT jest enzymem mitochondrialnym, zaś AlAT – cytozolowym. Ma
to istotne znaczenie diagnostyczne, bowiem przy nieznacznym uszkodzeniu komórek do surowicy przenikają
głównie enzymy cytoplazmatyczne, natomiast przy postępującej destrukcji dołączają do nich równieŜ enzymy
mitochondrialne. Transaminazy występują głównie (AlAT wyłącznie) w wątrobie, a pomiar ich aktywności
słuŜy do oceny stopnia uszkodzenia (stan zapalny, marskość) tego narządu. AspAT obecny jest równieŜ w
mięśniu sercowym, dlatego jego poziom rośnie wskutek niedokrwienia lub niewydolności serca. RóŜne moŜliwe
przyczyny wzrostu aktywności transaminaz osocza przedstawia poniŜsza tabela.
AspAT
AlAT
zawał serca1, WZW2, toksyczne
WZW, choroby miąŜszu wątroby,
duŜy wzrost aktywności
uszkodzenie wątroby, cięŜka
cięŜka niewydolność krąŜenia
niewydolność krąŜenia, hemoliza
choroby mm. szkieletowych,
choroby mm. szkieletowych,
wzrost umiarkowany, nieswoisty cholestaza, niewydolność krąŜenia
marskość wątroby, Ŝółtaczka
bez zawału, nowotwory wątroby
zastoinowa
1
W zawale serca wzrost aktywności transanimaz powyŜej 250U świadczy o istnieniu dodatkowych czynników
zwiększających jej poziom np. uszkodzeniu wątroby wywołanego niedotlenieniem.
2
W WZW aktywność transaminaz zaczyna wzrastać na 7-14 dni przed wystąpieniem Ŝółtaczki, zaś szczyt
przypada w okresie Ŝółtaczkowym.
-42-
•
γ-glutamylotranspeptydaza (GGTP)
GGTP katalizuje tworzenie wiązania peptydowego przez kwas glutaminowy, jednak nie z udziałem jego
grupy α, lecz γ-karboksylowej – w ten sposób uczestniczy w syntezie glutationu (patrz punkty: I-2-c, VII-6-a).
GGTP występuje na ER hepatocytów, w błonie kanalików nerkowych, obecna jest w trzustce i gruczole
krokowym – stanowi nieswoisty enzym wskaźnikowy. Ponadto stanowi enzym ekskrecyjny Ŝółci; w przypadku
niedroŜności dróg Ŝółciowych GGTP przenika w zwiększonych ilościach do krwi, dlatego stanowi jeden z tzw.
markerów cholestazy. Osoczowa aktywność GGTP wzrasta w bardzo wielu stanach patologicznych, do których
zaliczamy: zastoinowe choroby wątroby, ch. dróg Ŝółciowych, ch. nowotworowe wątroby i trzustki oraz stany
zapalne trzustki. Enzym ten indukowany jest przez estrogeny, barbiturany (leki uspokajająco-nasenne) oraz
alkohol. Jego poziom podwyŜsza się w przewlekłym alkoholizmie, zaś wraca do normy po 2 – 5 tyg.
abstynencji, stąd GGTP słuŜy do monitorowania terapii odwykowej uzaleŜnienia od alkoholu.
•
dehydrogenaza glutaminianowa (GLD)
GLD katalizuje reakcję deaminacji kwasu glutaminowego (patrz punkt VI-2-b). Jest enzymem swoistym
dla hepatocytów – oznaczenie aktywności w surowicy, wraz z transaminazami, pomaga w diagnostyce
róŜnicowej chorób wątroby. Wysoki wzrost aktywności moŜe towarzyszyć śpiączce wątrobowej, chorobom
miąŜszowym wątroby (np. przewlekłemu stanowi zapalnemu) lub Ŝółtaczce zastoinowej. Umiarkowany wzrost
świadczy często o nowotworze wątroby – pierwotnym bądź przerzucie.
•
fosfataza zasadowa = alkaliczna (ALP)
ALP posiada kilka izoenzymów: kostny (B), wątrobowy (L), jelitowy (J) i łoŜyskowy (P). U dorosłych
dominuje ALP-L, stanowiący ok. 50 % ogólnej aktywności ALP w surowicy, u dzieci znaczny udział ma ALP-B
(ze względu na szybki wzrost i aktywność metaboliczną kości), zaś u cięŜarnych ok. 48 % aktywności ALP
przypada na izoenzym P – z jego powodu w III trymestrze ciąŜy wzrasta całkowita aktywność ALP. Jest
enzymem wskaźnikowym chorób narządów, od których biorą nazwy izoenzymy, a takŜe nerek i śledziony. Jest
równieŜ enzymem ekskrecyjnym Ŝółci i – podobnie jak GGTP – stanowi marker cholestazy.
Aktywność ALP wzrasta w dwojakiego rodzaju patologiach. Pierwsze z nich to zaburzenia funkcji
wątroby – wówczas wzrost pochodzi od izoenzymu L, a dodatkowo rośnie GGTP; mogą to być: WZW, ostre lub
przewlekłe uszkodzenie toksyczne bądź przerzuty nowotworowe. Druga grupa obejmuje choroby kości,
zwłaszcza przebiegające z zahamowaniem ich wzrostu – wówczas wzrost ALP pochodzi od izoenzymu B, zaś
aktywność GGTP nie odbiega od normy. Zaliczmy tu: krzywicę, chorobę Pageta, przerzuty nowotworowe do
kości oraz demineralizację tkanki kostnej w przebiegu nadczynności przytarczyc.
•
fosfataza kwaśna (ACP)
ACP naleŜy do enzymów indykatorowych takich narządów jak: wątroba, nerki, śledziona, trzustka, jelita,
kości, erytrocyty i trombocyty; ponadto jest enzymem ekskrecyjnym, obecnym w wydzielinie gruczołu
krokowego. U dorosłych męŜczyzn ok. 30 % aktywności APC stanowi właśnie izoenzym sterczowy. U dzieci w
okresie pokwitania, ze względu na szybki wzrost, aktywność ACP jest kilkukrotnie (2 – 5 x) większa niŜ u
dorosłych. Podstawową rolę diagnostyczną ACP pełni w diagnostyce schorzeń prostaty – przerostu, zapalenia
czy nowotwory; w tym ostatnim przypadku obserwuje się wzrost całkowitej aktywności ACP, jak równieŜ
izoenzymu sterczowego – PAP. Aktywność ACP moŜe równieŜ przekraczać normę w takich stanach jak:
choroby kości (osteoporoza, ch. Pageta, przerzuty nowotworowe, nadczynność przytarczyc), nowotwory sutka
lub jelit oraz nadmierny rozpad elementów krwi: hemoliza, anemia megaloblastyczna czy trombopatie.
•
α-amylaza (AMS), diastaza
AMS katalizuje hydrolizę wiązań 1,4-glikozydowych w polisacharydach (patrz punkt IV-2). Jest
enzymem ekskrecyjnym, wydzielanym do śliny (izoenzym S), soku trzustkowego (izoenzym P) oraz jelitowego.
Pomiary aktywności osoczowej AMS wykorzystywane są gł. w diagnostyce zaburzeń przewodu pokarmowego,
a zwłaszcza chorób trzustki. Znaczny wzrost aktywności AMS obserwuje się w przebiegu ostrego zapalenia
trzustki (OZT) bądź zaostrzenia przewlekłego stanu zapalnego tego narządu (PZT). Ponadto wysoki poziom
AMS stwierdza się w makroamylazemii oraz cięŜkiej niewydolności nerek. α-amylaza jest białkiem
małocząsteczkowym, dlatego jako jedyny z enzymów fizjologicznie ulega przesączaniu kłębuszkowemu,
utrzymując się w moczu dłuŜej niŜ we krwi, co poszerza moŜliwości diagnostyczne. Nieswoisty wzrost
aktywności AMS towarzyszy wielu patologiom przewodu pokarmowego, m. in.: urazom jamy brzusznej,
-43-
marskości wątroby, ostremu zapaleniu pęcherzyka Ŝółciowego, perforacji wrzodu trawiennego, zapaleniu
otrzewnej, a takŜe chorobom ślinianek (np. nagminnemu zapaleniu przyusznic – tzw. śwince).
•
lipaza trzustkowa (LP)
LP katalizuje hydrolizę tłuszczów pokarmowych – odszczepia kwasy tłuszczowe z cząsteczek
trójacylogliceroli (TAG) (patrz punkt V-2). Jest to enzym ekskrecyjny, podobnie jak AMS występujący w soku
trzustkowym, lecz w odróŜnieniu od niej tylko w nim. LP stanowi zatem bardziej swoisty marker OZT niŜ AMS.
Aktywność LP w surowicy wzrasta w przebiegu stanów zapalnych i nowotworów trzustki, cholestazy
pozawątrobowej z zajęciem trzustki, chorobach z objawami „ostrego brzucha” (np. ostra niedroŜność jelit),
niewydolności nerek (rzadko) oraz w wyniku farmakoterapii hepatyną (lek obniŜający krzepliwość krwi) lub
lekami p/bólowymi (analgetykami).
•
esteraza cholinowa, cholinoesteraza (ChE)
Cholinoesteraza syntetyzowana jest w wątrobie, po czym uwalniana do łoŜyska naczyniowego (enzym
sekrecyjny). Występuje w dwóch formach: pierwszą jest swoista ChE – acetylocholinoesteraza (AChE), obecna
na błonach postsynapycznych synaps cholinergicznych, zakończeniu neuronów cholinergicznych oraz na
powierzchni erytrocytów, gdzie hydrolizuje rozkład acetylocholiny (ACh) uwalnianej z neuronów
cholinergicznych. Drugą jest nieswoista ChE – psuchocholinoestreraza, butyrylocholinoesteraza (BChE),
występująca w mózgu, wątrobie, skórze, mięśniówce gładkiej przewodu pokarmowego oraz w surowicy, gdzie
katalizuje rozkład wielu substancji, m. in. kilku leków – w tym suksametonium (sukcynylocholiny).
Pomiar aktywności ChE w osoczu słuŜy ocenie zdolności wątroby do syntezy tego enzymu. Aktywność
ChE zmniejsza się w chorobach miąŜszu wątroby (np. zapaleniu) oraz w zatruciu związkami
fosforoorganicznymi (pestycydy, gazy bojowe), które blokują zdolność katalityczną enzymu. Znane są
przypadki wrodzonego niedoboru aktywności ChE – dotknięta tym zaburzeniem osoba zazwyczaj nie ma o nim
pojęcia, gdyŜ brak enzymu nie jest na co dzień uciąŜliwy, jednak istnieje wówczas ryzyko cięŜkiego zatrucia
pewną grupą leków zwiotczających – gł. wspomnianą sukcynylocholiną. Przy normalnej aktywności ChE
działanie zwiotczające tego leku utrzymuje się przez czas rzędu minut, podczas gdy przy braku ChE efekt moŜe
utrzymywać się przez wiele tygodni.
Wzrost aktywności ChE występuje w zespole nerczycowym, nadczynności tarczycy (hipertyreozie) oraz
w okresach rekonwalescencji po uszkodzeniach wątroby.
•
lipaza lipoproteinowa (LPL)
LPL katalizuje hydrolizę TAG do kwasów tłuszczowych i glicerolu. Jest to enzym sekrecyjny, którego
pomiary są przydatne w róŜnicowaniu zaburzeń gospodarki lipidowej (lipoproteinowej).
•
enolaza
Enolaza naleŜy do enzymów szlaku glikolizy – katalizuje dehydratację 3-{P}-glicerynianu do {P}enolopirogronianu (PEP) (patrz punkt IV-4-a). Występuje w postaci trzech izoenzymów: α jest pospolity –
występuje we wątrobie, nerkach i płucach, β – w mm. szkieletowcyh, zaś γ – w neuronach (ang. neuron-specyfic
enolase = NSE). Ten ostatni ma szczególne znaczenie w diagnostyce onkologicznej, stanowi bowiem marker
raka drobnokomórkowego płuc oraz neuroblastoma.
c)
panele enzymatyczne
Jak widać na powyŜszych przykładach, enzymy i narządy ludzkiego ciała nie są do siebie swoiście
dopasowane – kaŜdy z organów posiada cały zestaw enzymatyczny, zaś poszczególne enzymy produkowane są
przez róŜnorodne tkanki. Aby zatem móc lepiej ocenić stan pojedynczego narządu, oznacza się aktywność nie
jednego, lecz kilku enzymów wytwarzanych i uwalnianych przez ten narząd. Odnosi się to zwłaszcza do wątroby
i mięśni (szkieletowych oraz sercowego). Powstają w ten sposób zestawienia, określane jako narządowe panele
lub profile enzymatyczne. Proporcje zmian aktywności enzymów są niezwykle pomocnymi informacjami
diagnostycznymi, przyjmują bowiem określone wartości w szeregu patologii.
-44-
•
panel enzymów wątrobowych
ostre zapalenie
przewlekle zapalenie
cholestaza
marskość
nowotwór
•
AST
↑↑↑
↑↑
↑
↑↑↑
↑
ALT
↑↑↑
↑↑
↑
↑
↑
GGTP
↑↑
↑↑↑
↑↑↑↑
↑↑
↑↑↑↑
ALP
↑↑
↑
↑↑↑↑
↑
↑
ChE
0
↓
0
↑↑
↓/0
panel enzymów mięśni szkieletowych
dystrofia Duchenne'a (DMD)
miopatia
neurogenne zapalenie mięśni
•
GLD
↑↑
↑
↑↑
0
↑↑
CK-MM
↑↑↑
↑
0
LDH5
↑↑↑
↑↑↑
↑↑↑
ALT, AST
↑
↑↑
↑
panel enzymów sercowych*
wczesny okres zawału
późny okres zawału
niewydolność krąŜenia (bez zawału)
CK
↑↑
↑
0
AST
↑
↑
↑
ALT
↑
↑
↑
LDH1
0
↑↑
↑
* – Przedstawiony panel jest juŜ przestarzały – obecnie w diagnostyce zawału mięśnia sercowego oznacza się we
krwi poziomy markerów wczesnych: sercowej troponiny I (cTpI; patrz punkt VII-7), CK-MB metodą „mass”
(pomiar stęŜenia enzymu, a nie jego aktywności) oraz mioglobiny (nie zawsze). Natomiast w niewydolności
krąŜenia oznacza się we krwi stęŜenie N-końcowego fragmentu prekursora mózgowego peptydu
natriuretycznego (NT-proBNP).
d) Pomiary aktywności enzymów są równieŜ wykorzystywane jako narzędzie diagnostyczne w onkologii:
enzym
ALP-B
ALP-P
nowotwór
nowotwory kości pierwotne i przerzuty do kości
pierwotny nowotwór wątroby, przerzuty do wątroby, ucisk
guza na przewody Ŝółciowe
rak jajnika
ACP1
zaaw. rak prostaty z przerzutami (tkanki miękkie, kości)
5'-NT
przerzuty do wątroby
ALP-L
uwagi
↑ Ca2+ i Pro-OH w moczu
mała specyficzność diagnostyczna
powtórny wzrost po terapii –
wznowa
pojawia się wcześniej niŜ ↑ ALP i
inne objawy kliniczne
pierwotne nowotwory wątroby lub przewodu
pokarmowego, rak jajnika
AMS, LP
rak trzustki
AMS2
surowiczy rak jajnika
PSA3
rak prostaty
czułość diagnostyczna 99%
1
– izoenzym sterczowy
2
– izoenzym śliniankowy
3
– PSA = prostate-specyfic antigene (proteaza serynowa produkowana wyłącznie przez nabłonek kanalików
nasiennych)
GGTP
-45-
ROZDZIAŁ III – TRANSPORT PRZEZ BŁONY
I UTLENIANIA BIOLOGICZNE
1.
Budowa i funkcje błon biologicznych
a) skład błon
Składnikami błon biologicznych są: lipidy, białka i węglowodany.
Wśród lipidów błonowych wyróŜniamy:
fosfolipidy – związki tłuszczowe zawierające dołączoną resztę fosforanową; dzielą się one dalej na:
fosfoglicerydy, złoŜone z glicerolu, do którego dołączone są (do C1 i C2) dwie reszty kwasów
tłuszczowych długości 16 – 18 atomów C oraz reszta fosforanowa (do C3), a do niej – alkohol;
alkohole występujące w fosfolipidach to: etanoloamina, cholina, seryna (Ser), glicerol i inozytol
(patrz równieŜ punkt V-1-e)
sfingomieliny, złoŜone z ceramidu, reszty fosforanowej i choliny; sam ceramid składa się ze
sfingozyny i reszty KT
• glikosfingolipidy – lipidy zawierające sfingozynę oraz fragment węglowodanowy; wyróŜniamy 3 ich
podgrupy:
cerebrozydy – sfingozyna, z dołączoną resztą KT, łączy się ponadto z cząsteczką heksozy
(monosacharyd C6)
globozydy – j. w., ale zamiast czystej reszty cukrowej występuje cząsteczka aminocukru (patrz
punkt IV-7-a)
gangliozydy – jak cerebrozydy, z tym Ŝe nie z pojedynczą cząsteczką cukru, a z całym łańcuchem
heksoz, wśród których moŜe występować kwas sialowy (SA; por. punkt IV-1-c)
• sterole, przy czym gł. cholesterol
Zjawisko poprzecznej asymetrii lipidowej błon polega na róŜnicy składu lipidów warstwy zewnętrznej i
wewnętrznej błony. W warstwie zewnętrznej występuje cholesterol oraz fosfolipidy zawierające cholinę –
sfingomielina (Sph) i fosfatydylocholina (PC), natomiast w wewnętrznej – fosfolipidy posiadające grupę
aminową – fosfatydyloseryna (PS) oraz fosfatydyloetanoloamina (PE).
Dojrzałość płuc wcześniaków ocenia się na podstawie stosunku stęŜenia lecytyny do sfingomieliny w
płynie owodniowym.
•
Białka błon komórkowych mogą być rozmaicie zlokalizowane i pełnić róŜnorakie funkcje. Problem
odpychania się wiązań peptydowych – o charakterze hydrofilowym – oraz dwuwarstwy lipidowej
(hydrofobowej) rozwiązywany jest przez zwinięcie łańcucha w strukturę α (α-helisę; por. punkt I-3-c). Białka
błonowe mogą pełnić m. in. funkcje: strukturalne, transportujące, enzymatyczne, receptorowe i antygenowe.
Białka mogą być połączone z błoną na dwa sposoby. Białka peryferyjne są związane z błoną w sposób
nietrwały; często łączą się z białkami integralnymi. Te ostatnie są bowiem trwale związane z błonami, gdyŜ
przechodzą przez dwuwarstwę lipidową (stąd określenie: przezbłonowe). Białka integralne klasyfikuje się ze
względu na ilość razy i sposób przekraczania błony:
• jednokrotnie przechodzące przez błonę, z N-końcem na zewnątrz, np. receptor LDL (por. punkt V-3-b)
• jednokrotnie przechodzące przez błonę, z C-końcem na zewnątrz, np. receptor asjaloglikoproteinowy
(por. punkt IV-7-b)
• wielokrotnie przechodzące przez błonę, np. błonowy przenośnik glukozy (GLUT; por. punkt IV-3-a)
Niektóre białka enzymatyczne zlokalizowane są wyłącznie w niektórych błonach, stanowiąc ich markery.
Markerami błony plazmatycznej są: 5’NT, AC i Na+/K+-ATPaza, ER – glukozo-6-fosfataza, wewnętrznej błony
mitochondrialnej – syntaza ATP, aparatu Golgiego (odpowiednio: cis, środkowego, trans i TGN) – transferazy:
GlcNAc I, Golgi mannozydaza II, Gal i SA.
Związki węglowodanowe są jedynym składnikiem błony, którego skład zaleŜy nie od samej komórki,
lecz od jej otoczenia. Cukry związane są głównie z białkami błonowymi, tworząc N- lub O-glikoproteiny.
-46-
b) funkcje błon
Dzięki istnieniu błon komórkowych moŜliwe jest oddzielenie od siebie poszczególnych komórek
organizmu (ich indywidualizacja), a tym samym stworzenie bariery pomiędzy wnętrzem a zewnętrzem kaŜdej z
nich. To ostatnie pozwala m. in. na utrzymywanie róŜnic stęŜeń substancji we wnętrzu i na zewnątrz komórek,
co wiąŜe się z ich pobudliwością i regulacją aktywności. Błony istniejące w obrębie komórki wydzielają w niej
sektory, w których mogą zachodzić wzajemnie przeciwstawne procesy biochemiczne (kompartmentacja – por.
punkt II-1-f). Obłonione organella komórkowe mogą sprawniej regulować transport substancji przezeń
zuŜywanych lub produkowanych. Błony nie słuŜą jednak wyłącznie celom podziału środowiska na mniejsze
części – umoŜliwiają one wymianę substancji między komórkami (złącza szczelinowe) oraz percepcję sygnałów
docierających do komórki (receptory)
2.
Transport przez błony biologiczne – klasy białek transportujących
Transport przez błony biologiczne moŜna generalnie podzielić na bierny i aktywny. Kryterium tego
podziału stanowi kierunek transportu oraz niezbędność energii chemicznej. Transport bierny nie wymaga
nakładu energii i zachodzi zgodnie z gradientem stęŜeń substancji, natomiast transport aktywny nie moŜe
odbywać się bez dostarczania energii i transportuje związki chemiczne w kierunku przeciwnym do ich gradientu
po obu stronach błony. Transport bierny – dyfuzja przez błony – moŜe odbywać się na dwa sposoby: jako
dyfuzja prosta lub ułatwiona.
Dyfuzja prosta moŜe z kolei polegać albo na bezpośrednim przenikaniu substancji przez błonę albo na
przechodzeniu przez specyficzne białka błonowe – kanały. Zdolność do bezpośredniego przenikania przez błony
posiadają cząsteczki obojętne chemicznie – woda, obojętne gazy oddechowe oraz związki lipofilne – steroidy.
MoŜliwości takiej pozbawione są cząstki naładowane – jony – które ze względu na swój ładunek nie mogą
przeniknąć w dowolnym miejscu przez hydrofobową błonę, a jedynie przejść przez specyficzne kanały. Z uwagi
na fakt, Ŝe kanały słuŜą głównie do transportu jonów, uŜywa się pojęcia: kanały jonowe.
a)
kanały jonowe
Zgodnie z ideą transportu biernego, kanały umoŜliwiają jonom przepływ w kierunku zgodnym z ich
gradientem (tzn. z tej strony błony, gdzie odpowiednich jonów jest więcej, na stronę, gdzie jest ich mniej).
Prędkość przepływu jest relatywnie wysoka – zbliŜona do dyfuzji i osiąga nawet 106-107 jonów na sekundę (są
to wartości 103 x większe niŜ w przypadku innych białek transportowych – wymienników i pomp – por. dalej).
Pomimo tego kanały cechuje zazwyczaj wysoka wybiórczość – zazwyczaj przepuszczają one tylko jeden
określony rodzaj jonu, toteŜ często klasyfikuje się je na podstawie rodzaju transportowanych jonów (istnieją tu
wyjątki, np. kanały kationowe).
Kanały potrafią do pewnego stopnia kontrolować swoją pracę – mianowicie mają moŜliwość
występowania w róŜnych stanach konformacyjnych: otwartym, zamkniętym i gotowości. Wyjściowo kanał
znajduje się w stanie gotowości do otwarcia (nie przepuszcza jonów). Pod wpływem pewnych czynników moŜe
on przejść w stan otwarty – wówczas jony mogą przez niego swobodnie przepływać. Po pewnym czasie,
indywidualnym dla danego typu kanału, stan otwarty spontanicznie przechodzi w stan zamknięty. Ten ostatni
róŜni się od stanu gotowości brakiem wraŜliwości na bodźce otwierające. Ostatecznie kanał przechodzi ze stanu
zamkniętego w stan gotowości, zamykając cykl pracy. Wspomniane czynniki pobudzające kanały do otwarcia są
podstawą ich klasyfikacji na: bramkowane napięciem (potencjałem) na błonie, bramkowane ligandem oraz
bramkowane napręŜeniem mechanicznym.
Kanały zbudowane są z kilku przezbłonowych podjednostek białkowych, z których kaŜda moŜe posiadać
kilka przezbłonowych domen. Kanały bramkowane ligandem mogą funkcjonować jako receptory
neuroprzekaźników – wówczas receptory takie określa się jako jonotropowe. Przykładem tego ostatniego jest
receptor acetylocholinowy typu N. Ma on budowę pentameru, złoŜonego z czterech rodzajów podjednostek
transbłonowych, występujących w stosunku stechiometrycznym α2βγδ. KaŜda podjednostka składa się z kilku
segmentów; szczególne znaczenie mają segmenty m2 podjednostek, budujące właściwą część kanału. Ligand –
ACh – przyłączany jest jednocześnie do miejsc złączy α-γ i α-δ (do otwarcia kanału potrzebne jest związanie
dwóch cząsteczek ACh). Indukuje to zmiany konformacyjne, których efektem jest otwarcie kanału dla jonów
Na+ i Ca2+. Natychmiastowy napływ kationów do wnętrza komórki powoduje jej szybką depolaryzację – tzw.
szybki pobudzający potencjał postsynaptyczny (fEPSP). Fizjologicznie powoduje to: skurcz mm. szkieletowych,
pobudzenie neuronu zazwojowego (przekaźnictwo zwojowe) oraz uwalnianie amin katecholowych z rdzenia
nadnerczy.
W odróŜnieniu od w/w, kanały Na+ i K+ błony są bramkowane napięciem na błonie, czyli róŜnicą
potencjałów elektrycznych po obu jej stronach. W stanie wyjściowym błona komórkowa jest spolaryzowana
(posiada tzw. potencjał spoczynkowy), a kanały są wówczas zamknięte. Odpowiedniego stopnia depolaryzacja
-47-
błony, np. pod wpływem impulsu nerwowego, powoduje otwarcie tych kanałów i przepływ jonów zgodnie z
kierunkiem wyznaczonym przez gradient. Zjawisko to jest podstawą powstawania potencjału czynnościowego w
komórkach pobudliwych (tj. nerwowych, mięśniowych i gruczołowych).
Kanał Na+ jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym o masie 260 kDa; jego końce N i C znajdują się
w środku komórki, a pętle wystają z obu stron błony. Składa się z 4 powtarzających się podjednostek, z których
kaŜda złoŜona jest z 6 α-helikalnych przezbłonowych domen. Por kanału zlokalizowany jest między helisami 5 i
6, ma szerokość 5 – 8 nm i od strony światła zawiera kwasowe (naładowane ujemnie) reszty aa.
Kanał K+ jest teramerem zbudowanym analogicznie jak kanał Na+. Podjednostki kanału tworzą por w
kształcie stoŜka, biegnącego przez środek i zwęŜającego się od strony wewnętrznej; por i jego ujście wypełnione
są cząsteczkami wody. W najwęŜszym (0,3 nm) punkcie kanału jon K+ ma moŜliwość przeciśnięcia się tylko pod
warunkiem pozbycia się otoczki hydratacyjnej; odcinek ten, utworzony przez 5 reszt aa (Thr-Val-Gly-Tyr-Gly),
pełni rolę filtra selektywności kanału, preferując właśnie K+, tak iŜ przepuszczalność dla Na+ (który ma przecieŜ
mniejszą średnicą) jest 100 x mniejsza. Okazuje się, Ŝe względnie niewielkie rozmiary jonu Na + uniemoŜliwiają
mu swobodne interakcje z obecnymi we filtrze atomami tlenu, które są tak ułoŜone przestrzennie, Ŝe uwalniają
jon K+ z otoczki wodnej, ale nie mogą zrobić tego samego z Na+. Jon Na+ pozostaje więc uwodniony i – jako
zbyt szeroki – nie przechodzi przez kanał. Jon K+, po przejściu przez filtr selektywności, wchodzi w drugie
miejsce wiązania, cechujące się nieco większym powinowactwem. Jednak energia wiązania tego miejsca
unieruchamia jon, zamykając go w pułapce. Dopiero, gdy kolejny jon K+ zostanie związany z pierwszym
miejscem, następuje ich elektrostatyczne odpychanie i pierwszy z jonów zostaje uwolniony na drugą stronę
błony. Inaktywacja kanału K+ zachodzi przez zamknięcie jego poru (obrazuje to tzw. model kuli na łańcuchu).
Niektóre drobnoustroje posiadają zdolność syntezy jonoforów – substancji bezpośrednio przenoszących
jony przez błonę lub tworzących w niej kanały jonowe. Związki takie, wbudowując się w obręb błon i
zaburzając ich wybiórczość transportową, mogą prowadzić do śmierci komórek. Z tego powodu stosowane są
jako antybiotyki – np. walinomycyna czy gramicydyna A i S (patrz punkt I-2-c).
b) przenośniki transbłonowe – translokazy
Drugim rodzajem transportu biernego jest dyfuzja ułatwiona. Podobnie jak wcześniej opisana dyfuzja
prosta, tak teŜ dyfuzja ułatwiona zachodzi z udziałem specyficznych transbłonowych białek transportowych – tu
określanych jako przenośniki (translokazy; biorą one udział równieŜ w transporcie aktywnym). Przenośniki słuŜą
generalnie do transportu związków większych niŜ jony pojedynczych atomów – np. reszt fosforanowych,
kwasów karboksylowych, aminokwasów, węglowodanów, kwasów tłuszczowych i nukleotydów. Wnika z tego,
iŜ pełnią one rolę m. in. w transporcie cząsteczek podstawowych składników pokarmowych.
Mechanizm dyfuzji ułatwionej wykazuje pewne podobieństwa z interakcją enzymu i substratu:
istnieje swoiste miejsce wiązania przenoszonej cząsteczki,
przy pewnym stęŜeniu substratu białko transportowe ulega wysyceniu (vmax),
istnieje określona stała wiązania (KM),
transport moŜe ulec zahamowaniu przez inhibitory kompetycyjne.
Między tymi procesami występują równieŜ pewne róŜnice – np. dyfuzja ułatwiona odbywa się bez
interakcji kowalencyjnej białka transportującego z przenoszoną cząstką. Translokazy występują w dwóch
podstawowych stanach konformacyjnych – gotowości do związania oraz uwalniania przeniesionego związku, a
cykl ich pracy polega na ciągłym przeskakiwaniu między nimi – przypomina to nieco mechanizm reakcji pingpong. Szybkość transportu przez przenośnik zaleŜy od gradientu stęŜenia przenoszonej substancji po obu
stronach błony. Aktywność transporterów moŜe podlegać regulacjom hormonalnym, np. przenośnik glukozy
GLUT-4 ulega przeniesieniu do błony, gdzie moŜe pełnić swą funkcję, pod wpływem insuliny (patrz punkt IV8-b).
Ze względu na ilość cząsteczek transportowanych przez przenośnik w jednym cyklu wyróŜniamy 2
rodzaje transportu z udziałem przenośnika: unitransport – gdy na raz przenoszona jest tylko jedna cząstka oraz
kotransport – gdy przenoszone są na raz dwie. JeŜeli obie cząstki przenoszone na zasadzie kotransportu
docelowo znajdują się po jednej stronie błony, to określa się to jako symport, jeŜeli zaś po stronach przeciwnych,
to jest to antyport. Przykładem symportu jest przenoszenie glukozy lub aa jednocześnie z kationem Na+ (por.
punkty IV-3-a i VI-1-a), natomiast antyportu – pompa Na+/K+ (por. dalej).
Szczególną obfitość rodzajów przenośników zawiera błona mitochondrialna. Wszystkie translokazy
mitochondrialne są podobnie zbudowane, tj. z ustawionych szeregowo trzech powtórzeń tandemowych modułu
100 reszt aa; kaŜde z powtórzeń posiada prawdopodobnie 2 elementy transbłonowe. Opis przenośników zawiera
poniŜsza tabela.
-48-
1.
2.
fosforanowy
pirogronianowy
rodzaj
kotransportu
antyport
symport
3.
anionów dwukarboksylowych
antyport
4.
5.
anionów trójkarboksylowych
α-ketoglutaranowy
antyport
antyport
H2PO4 / OH
pirogronian- / H+
jabłczan2- lub bursztynian2lub fumaran2- / HPO42jabłczan2- / cytrynian3- + H+
jabłczan2- / ketoglutaran2-
6.
nukleotydów adeninowych
antyport
ADP3- / ATP4- *
Lp.
nazwa przenośnika
wymieniane związki
-
uwagi i odnośniki
-
blokowany przez
atraktylozyd
7.
glutaminowo – asparaginianowy
antyport
glutaminian2- / asparaginian28.
karnitynowo – acylokarnitynowy
patrz punkt V-5-b
9.
ornitynowy
patrz punkt VI-2-d
10.
aa obojętnych
11.
glutaminowy
*
– Przenośnik ten współdziała z przenośnikiem fosforanowym w elektroobojętnym transporcie substratów do
fosforylacji oksydacyjnej. Tłumaczy to, dlaczego synteza 1 cząsteczki ATP wymaga transportu 4 H+ – poniewaŜ
1 z nich zuŜywany jest na symport z fosforanem nieorganicznym, a 3 – na właściwą fosforylację oksydacyjną, tj.
do pracy syntazy ATP (por. dalej).
c)
pompy jonowe
Transport aktywny róŜni się od biernego przede wszystkim tym, Ŝe aby zachodzić wymaga nakładu
energii swobodnej (na tę formę transportu zuŜywanych jest 30 – 40 % energii produkowanej przez komórkę).
Jako proces niekorzystny energetycznie wymaga sprzęŜenia z innym, bardziej korzystnym procesem (procesy
endoergiczne zachodzą wyłącznie wtedy, jeśli są sprzęŜone z procesami egzoergicznymi) – tym ostatnim moŜe
być hydroliza ATP, ruch elektronów lub światło (u roślin).
Transport aktywny wykazuje pewne podobieństwa z dyfuzją ułatwioną:
oba przebiegają z udziałem białek transportowych, występujących w dwóch stanach konformacyjnych
(w przypadku transportu aktywnego nie są to translokazy, lecz pompy – por. dalej),
wykazują swoistość względem jonów, aa i węglowodanów,
wykazują cechy reakcji enzymatycznej, choć bez interakcji kowalencyjnych (por. wyŜej).
Główne róŜnice pomiędzy nimi polegają na tym, Ŝe transport aktywny jest jednokierunkowy (a dyfuzja
ułatwiona – dwukierunkowa) oraz Ŝe zachodzi on zawsze przeciwnie do kierunku wyznaczonego przez gradient
stęŜeń (właśnie do jego przełamania wymagana jest energia).
Jak wspomniano, białkami aktywnie transportującymi cząsteczki przez błonę są pompy. WyróŜnia się
dwa rodzaje pomp wykorzystujących ATP – ATP-azy typu P oraz białka ABC – pompy posiadające kasetę
wiąŜącą ATP (ang. ATP binding cassette = ABC). Te pierwsze ulegają fosforylacji w miejscu specyficznej
reszty Asp i mogą podlegać zmianom konformacyjnym; cykl ich pracy przedstawia się następująco:
pompa w wyjściowym stanie konformacyjnym wiąŜe cząsteczki: ATP oraz substancji przenoszonej –
np. jonu,
ATP ulega rozszczepieniu, a jego grupa γ-fosforanowa – przeniesieniu na specyficzną resztę Asp,
powyŜsza fosforylacja przesuwa równowagę w kierunku drugiego stanu konformacyjnego, co
powoduje wyeksponowanie miejsca wiązania po drugiej stronie błony, pozwalając przenoszonej cząstce
na odłączenie się,
niŜsze powinowactwo pompy do jonu w drugim stanie konformacyjnym powoduje ich dysocjację,
wraz z uwolnieniem jonu uwalniana jest równieŜ grupa fosforanowa,
zdefosforylowana pompa powraca do pierwotnego stanu konformacyjnego.
Do pomp typu ATPazy typu P naleŜą m. in.:
Na+/K+-ATPaza – integralne białko błonowe obecne w większości komórek organizmu, zwłaszcza w
komórkach pobudliwych. Wymaga do pracy obecności fosfolipidów. Posiada miejsca wiąŜące dla
wszystkich trzech składników, tj. ATP, Na+ i K+. Hydroliza ATP (i praca pompy) zachodzi tylko w
sytuacji, gdy obydwa jony są związane. Podczas jednego cyklu pracy 3 jony Na+ transportowane są na
zewnątrz komórki, a 2 jony K+ do jej wnętrza. Pompa sodowo-potasowa jest elektrogenna, tzn. ma
pewien (ok. 10 %) wkład w utrzymywanie błony w stanie spolaryzowanym (utrzymywanie potencjału
spoczynkowego). Pracę Na+/K+-ATPazy hamują inhibitory – glikozydy nasercowe: ouabaina
(strofantyna – glikozyd skrętnika) oraz digoksyna i digitoksyna (glikozydy naparstnicy), stosowane
jako leki zwiększające kurczliwość mięśnia sercowego, wskazane gł. w stanach jego niewydolności.
-49-
Ca2+-ATPaza – występuje gł. w retikulum sarkoplazmatycznym miocytów. Jej praca polega na
transporcie jonów wapniowych do wnętrza ER, co pozwala na rozkurcz mięśnia. Pod względem
budowy stanowi ona pojedynczy polipeptyd. Posiada 3 domeny cytoplazmayczne pełniące odmienne
funkcje: wiązanie ATP (domena N), przyjmowanie grupy fosforanowej (domena P) oraz regulacja
domeny N (domena A). W czasie pracy następuje zbliŜenie domen N i P.
H+/K+-ATPaza – pompa protonowa obecna w komórkach okładzinowych Ŝołądka. Poprzez transport
protonów do jego światła utrzymuje silnie kwaśny odczyn, pozwalając na aktywację enzymów i
niszcząc bakterie. Jej funkcja jest regulowana przez ACh (receptor M1) i histaminę (receptor H2).
H+-ATPaza – syntaza ATP ma zdolność do hydrolizy ATP i transportu protonów (por. punkt III-6 –
fosforylacja oksydacyjna).
I- – pompa jodkowa – występuje w tarczycy, gdzie transportuje aniony jodu do komórek nabłonka
pęcherzyków tarczycowych, umoŜliwiając ich przenoszenie na aa i syntezę hormonów tarczycy (patrz
punkt VI-3).
Do pomp posiadających kasetę wiąŜącą ATP naleŜą m. in. białko oporności wielolekowej (ang.
multidrug resistance = MDR) oraz przezbłonowe białko regulacyjne zwłóknienia torbielowatego tj.
mukowiscydozy (ang. cystic fibrosis transmembrane regulator = CFTR). KaŜde z nich składa się z 4 domen –
dwóch kaset wiąŜących ATP (ABC) oraz dwóch domen łączących z błoną.
d) wymienniki
Oprócz opisanych białek transportowych wyróŜnia się jeszcze tzw. wymienniki, czyli białka
transportujące II rzędu. Ich wyjątkowość polega na sprzęganiu transportu wbrew gradientowi stęŜeń jednej
substancji z transportem zgodnym z gradientem innej substancji. Przykładem jest wymiennik Na+/Ca2+,
wykorzystujący gradient jonów Na+ do odkomórkowego transportu jonów Ca2+ (w stosunku stechiometrycznym
3 Na+ : 1 Ca2+). Cechuje się on imponującą wydajnością, moŜe bowiem transportować z prędkością do
2000 jonów/s, podczas gdy Ca2+-ATPaza – jedynie 30 jonów/s. Niezbędny do pracy przenośnika gradient jonów
Na+ utrzymywany jest przez Na+/K+-ATPazę.
3.
Oksydoreduktazy, ich kofaktory i grupy prostetyczne
a)
klasyfikacja oksydoreduktaz
Oksydoreduktazy (EC 1) to enzymy katalizujące reakcje typu redox. WyróŜnia się wśród nich 4 klasy:
oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy.
•
Oksydazy katalizują oderwanie od substratu atomów wodoru i przeniesienie ich na atom tlenu:
AH2 + ½ O2 → A + H2O
AH2 + ½ O2 → A + H2O2
Przykładem oksydazy jest oksydaza cytochromowa. Oksydazy są metaloflawoproteinami, gdyŜ
wymagają do katalizy atomów metali (Fe, Cu) oraz grup prostetycznych w postaci nukleotydów
flawinowych.
•
Dehydrogenazy, w przeciwieństwie do oksydaz, nie mogą uŜywać tlenu jako akceptora atomów
wodoru, przenoszą je natomiast z jednego substratu na drugi:
AH2 + B → A + BH2
Przykładem dehydrogenaz są cytochromy: b, c1, c i a; zawierają one atom Fe, a ich funkcją jest
transport elektronów pomiędzy flawoproteinami a oksydazą cytochromową. Niektóre z dehydrogenaz
posiadają flawinowe grupy prostetyczne, inne zaś wymagają obecności koenzymów
nikotynamidowych.
•
Peroksydazy – rozkładają nadtlenki, przez co chronią ustrój przed skutkami stresu oksydacyjnego (por.
punkt III-7 – ochrona przed RFT).
Klasyczne peroksydazy utleniają pewien substrat, w celu uzyskania atomów wodoru do redukcji atomu
tlenu w cząsteczce nadtlenku wodoru:
H2O2 + AH2 → A + 2 H2O.
Tak działa np. peroksydaza glutationowa.
Katalaza (CT) – zawiera 4 grupy hemowe; katalizuje reakcję dysproporcjonowania nadtlenku wodoru i
nie wymaga dodatkowych substratów:
2 H2O2 → 2 H2O + O2
-50-
•
Oksygenazy – katalizują bezpośrednie przeniesienie i przyłączenie tlenu do cząsteczki substratu;
uczestniczą w reakcjach syntezy lub degradacji metabolitów.
Dioksygenazy przyłączają oba atomy tlenu do cząsteczki substratu:
A + O2 → AO2.
Przykładem jest dioksygenaza homogentyzynowa (enzym biorący udział w szlaku katabolizmu aa Tyr –
patrz punkt VI-3).
Monooksygenazy przyłączają jeden z atomów tlenu do cząsteczki substratu, tworząc grupę
hydroksylową (stąd inna nazwa – hydroksylazy), zaś drugi atom tlenu znajduje się ostatecznie w
cząsteczce wody:
AH + O2 + Z-H2 → AOH + H2O + Z.
Do monooksygenaz naleŜy m. in. cytochrom b5 (patrz punkt VII-4-b – ochrona erytrocytów przed RFT,
redukcja methemoglobiny) oraz cytochrom P450 (CYP) (patrz punkt III-8 – utlenianie mikrosomalne).
b) kofaktory i grupy prostetyczne przenoszące protony i elektrony
•
Do nukleotydów flawinowych naleŜą FMN i FAD. Ich prekursorem jest ryboflawina (witamina B2),
składająca się z flawiny, zawierającej pierścień izoalloksazynowy oraz z D-rybitolu.
FMN – mononukleotyd flawinowy – powstaje z ryboflawiny przez jej fosforylację z udziałem kinazy
ryboflawinowej (flawokinazy):
ryboflawina + ATP →flawokinaza→ FMN + ADP
FMN moŜe przyłączać 2 atomy wodoru (2 H+ + 2 e-), przechodząc z formy utlenionej (FMN) przez
pośrednią – semichinonową (FMNH*) w zredukowaną (FMNH2). Miejscem wiązania atomów wodoru
jest fragment izoalloksazynowy:
FMN jest silniejszym czynnikiem utleniającym niŜ NAD+ (por. dalej). Pełni on funkcję grupy
prostetycznej m. in. w oksydazie α-aminokwasów.
FAD – dinukleotyd flawinoadeninowy – składa się z FMN oraz AMP. W sposób analogiczny do FMN
ma zdolność przyłączania 2 atomów wodoru, czemu towarzyszy redukcja do FADH2. W tej
zredukowanej formie FAD moŜe funkcjonować jako substrat fosforylacji oksydacyjnej (por. dalej).
Stanowi on grupę prostetyczną np. dehydrogenazy aldehydowej.
-51-
•
Koenzymami nikotynamidowmi są NAD+ oraz NADP+. Ich prekursorem jest witamina PP (niacyna,
kwas nikotynowy i jego amid kwasowy).
NAD+ – dinukleotyd nikotynamidoadeninowy – składa się z nukleotydu niacynowego (nikotynamid +
ryboza + {P}) oraz AMP. MoŜe on związać jeden proton i dwa elektrony (H+ + 2 e-; jest to wynikiem
zgromadzenia na atomie azotu ładunku dodatniego – por. rys.), przechodząc z formy utlenionej (NAD+)
w zredukowaną (NADH). JeŜeli dostarczane są 2 protony, to wiązaniu ulega tylko jeden z nich, a
pozostaje w środowisku reakcji, dlatego teŜ formę zredukowaną zapisuje się: NADH + H+. Miejscem
wiązania protonu i elektronów jest pierścień nikotynamidowy:
Forma zredukowana (NADH + H+) moŜe stanowić substrat fosforylacji oksydacyjnej. NAD+ jest
koenzymem enzymów biorących udział w oksydacyjnych szlakach metabolicznych (katabolicznych).
NADP+ – fosforan NAD+ – róŜni się od NAD+ obecnością reszty {P}, połączonej z C2’ rybozy
nukleotydu adeninowego. Przyłączanie protonu i dwóch elektronów zachodzi identycznie jak w
przypadku NAD+. RóŜnica polega na tym, Ŝe NADPH + H+ nigdy nie stanowi bezpośredniego substratu
fosforylacji oksydacyjnej. Pełni on natomiast rolę koenzymu enzymów uczestniczących w syntezach
redukcyjnych, np. dehydrogenaz PPP czy enzymów steroidogenezy (szlaki anaboliczne).
•
Koenzym Q, ubichinon, (CoQ, UQ, Q) – składa się z pierścienia p-benzochinonu, do którego wolnych
atomów węgla przełączone zostały grupy boczne – jedna metylowa, dwie zmetylowane hydroksylowe
(metoksy-) oraz jeden boczny łańcuch poliizoprenowy. Ten ostatni składa się ze zmiennej (6-10) liczby
reszt izoprenowych (-CH2-CH=C(CH3)-CH2-), wskutek czego przedstawicieli rodziny CoQ opisuje się
podając właśnie ilość tych reszt. Znane są cząsteczki Q6 – Q10, przy czym w ludzkich mitochondriach
dominuje ta ostatnia.
-52-
Dzięki obecności pierścienia benzochinonowego cząsteczka CoQ moŜe przyłączać i transportować 2 H+
i 2 e-. Redukcja formy utlenionej – ubichinonu do formy zredukowanej – ubichinolu zachodzi
dwustopniowo: wpierw przyłącza się jedna para H+ + e-, w wyniku czego powstaje rodnikowa forma
semichinonowa („pół-chinonowa”), a następnie druga para H+ + e-, dając zredukowany ubichinol. Ten z
kolei moŜe oddać protony i elektrony, powracając do formy utlenionej. Fizjologicznie CoQ podlega
ciągłym cyklicznym przemianom: Q → QH* → QH2 → Q itd. Ze względu na znaczną mobilność,
koenzym Q pełni funkcję przenośnika elektronów między nieruchomymi – bo wbudowanymi w
wewnętrzną błonę mitochondrialną – kompleksami łańcucha oddechowego. Ubichinon zbiera
równowaŜniki redukujące z kompleksów I i II, po czym przekazuje je na kompleks III (por. dalej).
•
Centra Ŝelazo-siarkowe (Fe:S) – są to ugrupowania atomów Fe i S, mające zdolność odwracalnego
wiązania elektronów, stanowiące grupy protetyczne pewnych białek – z tego powodu równieŜ
określanych jako Ŝelazo-siarkowe. PoniewaŜ atomy Ŝelaza wchodzące w skład centrów nie są
składnikami cząsteczek hemu, ale biorą udział w katalizie, określa się jako Ŝelaza niehemowe. Centra
związane są z białkami poprzez wiązania tworzące się między atomami Fe niehemowego, a atomami
siarki reszt Cys lub azotu reszt His (por rys.). Atomy siarki występujące między atomami Ŝelaza w
obrębie centrów wykazują wraŜliwość na działanie niskich wartości pH. Znanych jest kilka rodzajów
centrów Fe:S, róŜniących się ilością i składem atomów, przy czym najistotniejszymi są Fe2S2 i Fe4S4.
Struktura centrów Fe:S cechuje się regularnością i symetrią (por. rysunki). Ich zdolność do wiązania i
oddawania elektronów wynika z moŜliwości występowania atomów Ŝelaza na róŜnych stopniach
utlenienia – II i III. Podczas wiązania e- atom Ŝelaza ulega redukcji do Fe2+, zaś podczas oddawania eŜelazo utlenia się do Fe3+. Fizjologicznie centra te stanowią jednoelektronowe pomosty, transportujące
elektrony z flawoprotein na koenzym Q oraz z koenzymu Q na cytochrom c1.
4.
Transport atomów wodoru przez błonę mitochondrialną
Mitochondria są organellami komórkowymi, których główną funkcją jest produkcja energii. Energia ta
gromadzona jest w wysokoenergetycznych wiązaniach ATP. Proces syntezy ATP nazywa się fosforylacją
oksydacyjną; fosforylacja wykorzystuje energię róŜnicy stęŜeń (gradientu) protonów po obu stronach
wewnętrznej błony mitochondrialnej. Gradient ten wytarzany jest z kolei przez układ białek błonowych, zwany
łańcuchem oddechowym, który wymaga obecności zredukowanego substratu, od którego mógłby odebrać atomy
wodoru i wykorzystać ich energię, aby ostatecznie przekazać je na tlen. Substratami łańcucha oddechowego są
głównie zredukowane formy nukleotydów – NADH oraz FADH2; inne związki wykorzystywane są w ten
sposób, Ŝe ulegają utlenieniu, przekazując swoje atomy wodoru na NAD+ lub FAD, które są przez to
redukowane. Źródła przenośników redukujących dzieli się na wewnątrz- i pozamitochondrialne.
-53-
•
Źródłem pochodzącym z samych mitochondriów jest NADPH, który moŜe przekazać atomy wodoru na
NAD+ dzięki aktywności transhydrogenazy:
NADPH + H+ + NAD+ →transhydrogenaza→ NADP+ + NADH + H+.
• Przenośniki pozamitochondrialne, aby móc zostać wykorzystane do pozyskania energii, muszą wpierw
znaleźć się wewnątrz mitochondriów. Nie mogą jednak swobodnie pokonać bariery w postaci
podwójnej błony mitochondrialnej, dlatego teŜ są przez nią przenoszone za pośrednictwem par
substratów sprzęŜonych odpowiednimi dehydrogenazami. Istnieją dwa takie układy transportujące:
Układ glicerolo-3-fosforanowy – utworzony jest przez glicerolo-3-{P} (forma zredukowana) oraz {P}dihydroksyaceton (forma utleniona). Występuje on w mózgu, brunatnej tkance tłuszczowej, białej
tkance mięśniowej oraz w wątrobie. Transport z jego udziałem obarczony jest stratami energii, gdyŜ
zredukowana forma NADH, z której moŜe powstać maks. 2,5 cząsteczki ATP (patrz punkt III-8),
wymieniana jest na zredukowaną formę FADH2, z której moŜe powstać jedynie 1,5 cząsteczki ATP.
Układ szczawiooctan – jabłczan – asparaginian jest bezstratnym sposobem transporty. Jest to układ
uniwersalny, powszechnie występujący w organizmie:
OA – szczawiooctan, M – jabłczan, Asp – asparaginian, Glu – glutaminian, αKG – α-ketoglutaran
MDH – dehydrogenaza jabłczanowa, AT – aminotransferaza (transaminaza)
1 – przenośnik α-ketoglutaranowy, 2 – przenośnik glutaminianowo – asparaginianowy
5.
Łańcuch oddechowy
Łańcuch oddechowy jest to złoŜony układ wielu białek, zlokalizowany na wewnętrznej błonie
mitochondrialnej, którego funkcją jest utlenianie równowaŜników redukujących. Substratami łańcucha są
zredukowane formy nukleotydów nikotynamidowych (NADH) i flawinoadeninowych (FADH2). Praca łańcucha
polega na odebraniu im protonów i elektronów (ich utlenieniu), a następnie na kontrolowanym przepływie tych
cząstek (H+ + e-) przez kolejne ogniwa łańcucha o wzrastającym potencjale redox. Przepływowi temu
towarzyszy stopniowe uwalnianie energii tych cząstek. Wielkość uwolnionej energii jest proporcjonalna do
róŜnicy potencjałów oksydoredukcyjnych układów wymieniających między sobą elektrony (∆G = -n.F.∆V; G –
energia swobodna, n – liczba elektronów, F – stała Faradaya – 96500 C/mol, V – potencjał redox). Przenoszenie
elektronów pomiędzy ogniwami katalizowane jest przez odpowiednie dehydrogenazy. Wyjątkiem jest ostatnia
reakcja, polegająca na przeniesieniu protonów na tlen i utworzeniu w ten sposób cząsteczki wody, katalizowana
-54-
przez oksydazę. Powstająca energia zuŜywana jest przez pompy protonowe samego łańcucha do transportu
protonów (H+) z macierzy (matrix) mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej. W ten sposób po obu
stronach wewnętrznej błony mitochondrialnej tworzy się róŜnica stęŜeń protonów – innymi słowy powstaje
przezbłonowy gradient stęŜenia protonów, a dodatkowo – poniewaŜ od [H+] zaleŜne jest pH – gradient pH.
Powstała róŜnica stęŜeń wykorzystywana jest do syntezy związku wysokoenergetycznego – ATP – w procesie
oksydacyjnej fosforylacji.
Jak wspomniano, w skład łańcucha oddechowego wchodzi bardzo wiele cząsteczek białkowych. Nie są
one jednak ani bezładnie rozrzucone ani mobilne, lecz zorganizowane w 4 nieruchome kompleksy, przechodzące
przez całą błonę wewnętrzną, oznaczone kolejnymi numerami rzymskimi (I – IV). KaŜdy kompleks przedstawia
układ redox, posiadający określony potencjał utleniający; jak wyŜej zaznaczono, elektrony przechodzą kolejno
przez kompleksy o wzrastających potencjałach. Kompleksy I, III i IV wykazują aktywność pomp protonowych,
transportując jony H+ na zewnątrz błony wewnętrznej. PoniewaŜ kompleksy nie mają moŜliwości ruchu, istnieją
dodatkowe ruchome przenośniki – koenzym Q oraz cytochrom c.
Kompleks I określany jest jako dehydrogenaza NADH bądź oksydoreduktaza NADH : ubichinon.
Zawiera on grupę prostetyczną – FMN oraz centra Fe:S – zarówno Fe2S2, jak i Fe4S4. Kompleks ten katalizuje
wpierw przeniesienie 2 H+ i 2 e- z NADH + H+ na FMN – powstaje w ten sposób NAD+ i FMNH2. Następnie
protony i elektrony są rozdzielane – te pierwsze wędrują do matrix, a te drugie podlegają transportowi przez
centra Fe:S. Ostatecznie elektrony zostają przekazane na ubichinon, który dobiera sobie 2 protony z matrix,
dając zredukowany ubichinol (Q → QH2). Układ NAD+ / NADH posiada potencjał -0,32 V, zaś układ ubichinon
/ ubichinol – +0,10 V. Energia uwolniona w wyniku przejścia substratów między tymi układami słuŜy do
transportu 4 protonów z macierzy do przestrzeni międzybłonowej.
Kompleks II nosi nazwę oksydoreduktazy bursztynian : ubichinon lub inaczej dehydrogenazy
bursztynianowej (SDH). Zawiera FAD oraz centra Fe:S. SDH stanowi jeden z enzymów cyklu Krebsa (por.
punkt II-9), jednocześnie dostarczający równowaŜników redukujących do łańcucha oddechowego. SDH
katalizuje reakcję odwodornienia bursztynianu i przeniesienia 2 H+ + 2 e- na FAD; daje to w efekcie malonian
oraz FADH2. Następnie protony i elektrony są rozdzielane – protony tradycyjnie wędrują do matrix, a elektrony
transportowane są przez centra Fe:S. Elektrony, a za nimi protony, przyłączają się do ubichinonu, redukując go.
Układ bursztynian / fumaran posiada potencjał +0,03 V. Wyjątkowo jednak przepływowi substratów przez
kompleks II nie towarzyszy przezbłonowy transport protonów. Kompleks II jako jedyny nie jest związany z
aktywnością pompy protonowej, w związku z czym nie występuje tu przyrost (zysk) energetyczny.
Kompleks III to z kolei oksydoreduktaza ubichinon : cytochrom c. Zawiera on centrum Fe2S2, cytochrom
b w tzw. formie niskiej (bL) i wysokiej (bH) oraz cytochrom c1. Cząsteczki CoQ – zarówno te zredukowane w
kompleksach I i II, jak i posiadające protony przyłączone bezpośrednio z matrix (por. dalej) – oddają swoje
protony do przestrzeni międzybłonowej, przez co powracają do formy ubichinonowej (Q). Elektrony natomiast
wędrują dwiema drogami – jedna część przekazywana jest kolejno: na centrum Fe:S, na cytochrom c1, a
ostatecznie na cytochrom c, druga część natomiast łączy się z cytochromem bL, który w wyniku tego
przekształca się w bH. Ten ostatni przekazuje elektrony znów na cząsteczką ubichinonu, która dobiera sobie
bezpośrednio 2 protony z matrix, powiększając w ten sposób pulę QH2. Cytochrom c, podobnie jak CoQ,
stanowi rozpuszczalny transporter, odbierający elektrony z kompleksu III i oddający go kompleksowi IV. Układ
cytochrom c utleniony / zredukowany posiada potencjał +0,22 V. Energia uwolniona z substratów
przechodzących przez kompleks III wystarcza do transportu 4 protonów na zewnątrz błony.
Kompleks IV to oksydoreduktaza cytochrom c : tlen lub krócej – oksydaza cytochromowa. Posiada on
cytochromy a i a3 (z których kaŜdy zawiera Ŝelazo hemowe) oraz 2 atomy miedzi – CuA i CuB. Elektrony oddane
kompleksowi IV przez cytochrom c1 wiązane są wpierw przez atomy CuA (dzięki moŜliwości przejścia Cu2+ ↔
Cu+), następnie przekazywane na hem a, dalej – na atomu CuB i hem a3, aby ostatecznie posłuŜyć do redukcji
cząsteczki tlenu (½ O2 → ½ O2-). Ta ostatnia przyciąga 2 protony z matrix, dając w reakcji końcowy produkt
łańcucha oddechowego – cząsteczkę wody. Układ tlen / woda ma potencjał redox równy + 0,82 V. Energia z
transportu substratów przez ostatni kompleks przekłada się na przeniesienie dwóch protonów przez wewnętrzną
błonę mitochondrialną.
Podsumowując – substraty, redukując kolejne układy o coraz to wyŜszym potencjale, tracą stopniowo
energię, zuŜywaną na wytworzenie gradientu protonowego. RóŜnica potencjału pomiędzy skrajnymi ogniwami
łańcucha – NAD+ / NADH oraz O2 / H2O – wynosi: ∆V = +0,82 – (-0,32) = 1,14 V, co przekłada się na energię:
∆G = - 2 mol . 1,14 V . 96500 C/mol ≈ - 220 kJ. Znak ujemny przed wynikiem oznacza, iŜ jest to energia oddana
przez substraty.
Warto zwrócić uwagę na róŜnicę drogi, jaką pokonują protony i elektrony z NADH, a jaką z FADH2:
substraty z tego pierwszego źródła przechodzą przez kompleksy I, III i IV, co daje w sumie 4 + 4 + 2 = 10
protonów przeniesionych na zewnątrz błony, natomiast z drugiego – pokonują kompleksy II, III i IV, ale
poniewaŜ II nie pompuje protonów, transportowi ulega tylko 4 + 2 = 6 z nich. Płynie stąd wniosek, iŜ utlenianie
NADH jest bardziej opłacalne niŜ utlenianie FADH2 (por. następny punkt).
-55-
6.
Fosforylacja oksydacyjna
Fosforylacja oksydacyjna to sprzęŜony z oddychaniem proces wytwarzania związku
bogatoenergetycznego (ATP), zachodzący w mitochondrium. UmoŜliwia on organizmom tlenowym (aerobom)
pozyskanie znacznie większej części dostępnej energii swobodnej substratów oddechowych w porównaniu z
organizmami beztlenowymi (anaerobami).
Źródłem energii do syntezy ATP jest wytworzony przez łańcuch oddechowy przezbłonowy gradient
stęŜenia protonów i pH. Ta róŜnica potencjału elektrochemicznego wykorzystywana jest przez „jednostki
fosforylujące”, pokrywające wewnętrzną powierzchnię błony mitochondrialnej. Taka pojedyncza jednostka
składa się z wielu podjednostek białkowych, które moŜna podzielić na dwa kompleksy – F0 i F1.
Hydrofobowy kompleks F0 przechodzi przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Składa się z 6
podjednostek, w obrębie których wyróŜnia się 4 róŜne łańcuchy polipeptydowe. Najmniejsza z
podjednostek tworzy transbłonowy kanał jonowy, przeznaczony dla protonów.
Oba kompleksy połączone są za pośrednictwem trzonka (szyjki), równieŜ złoŜonego z szeregu
podjednostek. NaleŜą do nich m. in.: inhibitor F1 regulujący przepływ protonów i syntezę ATP, OSCP –
białko warunkujące wraŜliwość na oligomycynę oraz podjednostka Fc2 (F6).
Hydrofilowy kompleks F1 (czynnik sprzęgający 1) ma w przybliŜeniu kształt kuli o średnicy 8,5 nm i
znajduje się po wewnętrznej stronie błony. Składa się z 5 rodzajów podjednostek, występujących w
relacji stechiometrycznej α3β3γδε (czyli łącznie 9 o wspólnej masie: 3 x 56 + 5 x 53 + 34 + 14 + 6 =
378 kD). Kompleks F1 wykazuje aktywność syntazy ATP transportującej H+, której praca
uwarunkowana jest przechodzeniem protonów przez kanał w kompleksie F0 oraz przez sam kompleks
F1. Substratami do syntezy ATP są ADP i Pi.
Historycznie rzecz biorąc, powstało kilka teorii wyjaśniających proces syntezy ATP. Jedne z nich zostały
juŜ odrzucone jako nieprawdziwe, inne wciąŜ funkcjonują i stanowią współczesne podejście do istoty
fosforylacji.
Teoria sprzęŜenia chemicznego zakładała bezpośrednie sprzęŜenie chemiczne na wszystkich etapach
procesu syntezy ATP, tak jak to ma miejsce w reakcjach generujących ATP w szlaku glikolizy (por.
punkt IV-4-a). Teoria ta została odrzucona, poniewaŜ nie udało się wyizolować bogatoenergetycznych
pośredników łączących procesy utleniania i fosforylacji.
Teoria chemiosmotyczna (Mitchell) zakłada, Ŝe energia z procesów utleniania przenośników w
łańcuchu oddechowym wykorzystywana jest przez pompy protonowe związane z kompleksami I, III i
IV do transportu protonów na zewnątrz sprzęgającej (tzn. wewnętrznej) błony mitochondrialnej. Ta
ostatnia jest zasadniczo nieprzepuszczalna dla jonów, a zwłaszcza dla protonów, które gromadząc się
po jej zewnętrznej stronie, wytwarzają przezbłonową róŜnicę potencjału elektrochemicznego (∆µH+), na
który składa się potencjał chemiczny (∆pH) i potencjał elektryczny (∆E). Termodynamicznie
uwarunkowany, swobodny przepływ protonów w tym układzie skierowany jest od matrix do przestrzeni
międzybłonowej. Syntaza ATP, zawierając kanał jony, umoŜliwia ten przepływ, a dodatkowo pochłania
część jego energii, magazynując ją w odpowiednich wiązaniach ATP.
Teoria ta, choć dobrze tłumaczy działanie syntazy ATP, nie wyjaśnia do końca wszystkich aspektów
tego procesu. Wykazano bowiem, Ŝe to nie sama reakcja syntezy ATP wymaga dostarczenia
zewnętrznej energii, a raczej etap uwalniania tego związku z centrum katalitycznego enzymu.
Przypuszczano, iŜ wymaga to zajścia zmian konformacyjnych w obrębie kompleksu F1, do czego
miałby być niezbędny gradient protonowy.
Hipoteza konformacyjna (Boyer) definitywnie dowodzi, iŜ rolą gradientu protonowego nie jest udział w
syntezie ATP, lecz odłączeniu produktu od syntazy oraz Ŝe 3 miejsca wiąŜące substraty w tym enzymie
wzajemnie na siebie oddziałują. Wiązanie ADP + Pi do jednego miejsca pobudza usunięcie ATP z
drugiego, czyli syntaza ATP wykazuje kooperatywność katalityczną. 3 podjednostki katalityczne β są
wprawdzie identyczne, ale w kaŜdym momencie funkcjonalnie nierównowaŜne: jedno miejsce
katalityczne występuje w formie otwartej O i ma znikome powinowactwo do substratów, drugie (L)
wiąŜe substraty luźno i nie wykazuje aktywności katalitycznej, trzecie (T) wiąŜe substraty silnie i jest
aktywne. W sytuacji T ↔ ATP, L ↔ ADP + Pi dostarczenie energii pobudza kaskadę przejść: T → O,
L → T, O → L. Protony przepływają przez kanał w syntazie ATP jedynie wówczas, gdy konformacje
L, O i T wzajemnie w siebie przechodzą. Te przejścia konformacyjne są powiązane
najprawdopodobniej przez zmiany w oddziaływaniach między podjednostkami syntazy.
Jak wiadomo, substratami do syntezy ATP są ADP i Pi. Aby reakcja syntezy mogła się dokonać, oba one
muszą znaleźć się w bezpośrednim sąsiedztwie syntazy (tj. w matrix), dokąd muszą być przetransportowane
przez odpowiednie przenośniki (por. punkt III-2-b). Do samego procesu syntezy ATP potrzebny jest przepływ
przez kompleks F0F1 trzech protonów, jednak aby dostarczyć do matrix cząsteczkę fosforanu nieorganicznego,
zuŜywany jest jeszcze czwarty – niezbędny do symportu z Pi. PoniewaŜ utlenianie NADH w łańcuchu
oddechowym jest równowaŜne z transportem 4 + 4 + 2 = 10 protonów, zatem jedna cząsteczka NADH niesie ze
-56-
sobą tyle energii, ile potrzeba do syntezy 10 : 4 = 2,5 cząsteczki ATP. Przez analogię – utlenianie FADH2
przenosi przez błonę 4 + 2 = 6 protonów, więc niesie energię odpowiadającą 6 : 4 = 1,5 cząsteczki ATP. JeŜeli
natomiast zsyntetyzowana cząsteczka ATP zostaje zuŜyta w obrębie matrix, to nie ma potrzeby symportu Pi
(gdyŜ jest on juŜ dostępny z hydrolizy ATP), zatem do syntezy 1 ATP potrzeba jedynie energii przepływu 3
protonów. W tej sytuacji utlenianie cząsteczki substratu oddechowego przez dehydrogenazy zaleŜne od NAD+ i
łańcuch oddechowy dostarcza 3 cząsteczek ATP, zaś przez dehydrogenazy zaleŜne od FAD – 2 cząsteczek ATP:
S-H2 + NAD+ → S + NADH + H+
NADH + H+ + 3 ADP + 3 Pi → NAD+ + 3 ATP
S-H2 + FAD → S + FADH2
FADH2 + 2 ADP + 2 Pi → FAD + 2 ATP
Pod pojęciem trucizn oddechowych rozumie się związki chemiczne, które po dostaniu się do organizmu
zaburzają procesy oddychania komórkowego – tj. hamują łańcuch oddechowy, obniŜają gradient protonów lub
hamują oksydacyjną fosforylację.
• inhibitory łańcucha oddechowego
Barbiturany (amobarbital, amytol), piericydyna A i rotenon zaburzają przekazywanie elektronów z
centrum Fe:S kompleksu I na CoQ.
Dimerkaprol (BAL), antymycyna A i myksotiazol zaburzają transport z cytochromu c1 na c.
Siakowodór (H2S), tlenek węgla (CO), cyjanki (CN-) i azydki (N3-) hamują aktywność oksydazy
cytochromowej, m. in. przez wiązanie się z atomami Ŝelaza hemowego.
Karboksyna i TTFA (czynnik chelatujące Fe) zaburzają przekazywanie równowaŜników z SDH na
CoQ.
Malonian jest kompetycyjnym inhibitorem SDH.
• Związki rozprzęgające – są to substancje amfipatyczne, zwiększające przepuszczalność wewnętrznej
błony mitochondrialnej dla protonów, przez co zmniejszają błonowy potencjał elektrochemiczny i
wywołują spięcie syntazy ATP. W ich obecności procesy fizjologicznie związane (sprzęŜone) – łańcuch
oddechowy i fosforylacja oksydacyjna – przebiegają niezaleŜnie od siebie (łańcuch pompuje protony, a
fosforylacja nie zachodzi) – tzn. są rozprzeŜone, stąd nazwa. Do związków takich zalicz się m. in.: 2,4dinitrofenol (DNP), dinitrokrezol, pentachlorofenol, m-chlorokarbonylocyjanidofenylohydrazon
(CCCP) oraz karboksycyjanek-p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP).
• inhibitory fosforylacji oksydacjnej
Oligomycyna, wiąŜąc się z podjednostką OSCP, całkowicie blokuje kompleks F0 – protony nie
przepływają przez kanał i fosforylacj nie zachodzi.
Związki takie jak: atraktylozyd, karboksyatraktylozyd czy kwas bongkrekowy hamowanie przenośnik
antyportowy ADP / ATP.
7.
Reaktywne formy tlenu (RFT, ang. ROS)
Wolne rodniki (oksydanty) to atomy, jony lub cząsteczki zdolne do samodzielnego Ŝycia, posiadające na
ostatnim orbitalu niesparowany elektron. Powstają one w wyniku działania róŜnych czynników na materię: w
reakcjach homolitycznego rozpadu wiązań, wyrwania atomu wodoru, wyrwania elektronu, addycji lub oksydacji.
Rodniki odznaczają się ogromną reaktywnością. W reakcjach przebiegających z ich udziałem wyróŜnia się 3
etapy:
inicjacji – działanie czynników: absorpcja, jonizacja (działanie promieniowaniem jonizującym),
sonifikacja (działanie ultradźwiękami), reakcja red-ox,
prolongacji – nie zmienia się nominalna ilość rodników, a jedynie właściwość ta przechodzi na
rozmaite cząsteczki – nosicieli,
terminacji – kiedy w wyniku reakcji powstanie trwały produkt.
Rodniki powstają w Ŝywych komórkach, jak równieŜ przenikają do nich ze środowiska zewnętrznego. Do
zjawisk odpowiedzialnych za generację RFT zaliczamy m. in.:
nieszczelność łańcucha oddechowego (1 – 4 %)
działanie NADPH-oksydazy: 2 O2 + NADPH → 2 O2-* + NADP+ + H+
działanie oksydazy ksantynowej (patrz punkt VI-4-d)
toksyczne działanie wolnego Ŝelaza:
Fe3+ + O2-* → Fe2+ + O2
(reakcja Habera – Weissa)
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + HO*
(reakcja Fentona)
O2-* + H2O2 →Fe→ O2 + OH- + HO*
-57-
toksyczne działanie wolnej miedzi:
Cu2+ + O2-* → Cu+ + O2
Cu+ + H2O2 → Cu2+ + OH- + HO*
O2-* + H2O2 →Cu→ O2 + OH- + HO*
Do zewnątrzkomórkowych źródeł wolnych rodników zaliczamy: spodki spoŜywcze, leki i chemikalia,
zanieczyszczenia powietrza, ksenobiotyki domowe, tlen pod zwiększonym ciśnieniem, stres psychiczny,
naraŜenie na promieniowanie.
RFT są w małych stęŜeniach produkowane i wykorzystywane przez sam organizm w określonych celach.
Fizjologicznie biorą one udział w: transporcie O2 przez HGB, aktywacji cytochromu P450, syntezie eikozanoidów
oraz niszczeniu czynników zakaźnych – bakterii, wirusów i grzybów. Jednak znaczne zwiększenie ich poziomu
jest dla organizmu bardzo szkodliwe – stan taki określa się jako stres oksydacyjny.
Przyczyną toksycznego działania RFT w organizmie jest głównie rodnik hydroksylowy HO*. Przenosi on
własny elektron na roŜne molekuły i odszczepia od nich protony, przez co zapoczątkowuje kaskadę uszkodzeń.
Peroksydacja lipidów – markerem tego procesu jest stęŜenie aldehydu dimalonowego (OHC-CH2CHO). Cholesterol wchodzący w skład błon komórkowych (membranowy), jak równieŜ stanowiący
składnik frakcji LDL lipoprotein, ulega utlenianiu do 7-oksocholesterolu; utlenianiu ulega równieŜ
apolipoproteina B, stanowiąca białkowy składnik cząsteczek LDL (patrz punkt V-3-a i b). Na poziomie
błonowym obserwuje się: modyfikację aktywności enzymów błonowych, utlenianie grup
sulfhydrylowych (SH) białek błonowych i następowe zmiany ich konformacji, wzrost
przepuszczalności błon i konsekwentne rozprzęgnięcie transportu przez nie, modyfikację stanu
skupienia (płynności) oraz polaryzacji błon. Z kolei peroksydacja LDL powoduje zaburzenie ich
rozpoznawania przez komórki wątrobowe, wobec czego zmiatane są przez makrofagi, które w wyniku
przeładowania lipidami osiadają w ścianie naczyń jako tzw. komórki piankowe; jest to istota
powstawania blaszki miaŜdŜycowej.
Uszkodzenia białek dotyczą gł. reszt bocznych aa. Uszkodzenie struktury białka moŜe być wynikiem
jego fragmentacji bądź tworzenia wiązań krzyŜowych między aa, co moŜe wpływać na aktywność
enzymatyczną, podatność proteolityczną oraz właściwości antygenowe. Najczęstsze uszkodzenia to:
oksydacyjna modyfikacja Cys i Met – utlenianie atomu siarki,
utlenianie metali w metaloproteinach,
modyfikacje sacharydów w glikoproteinach,
tworzenie wiązań krzyŜowych – gł. H-H, H-W, H-Y, Y-Y,
fragmentacja białka: oksydacyjna modyfikacja Pro i hydroliza reszty Pro z powstaniem Nglutamylopeptydu bądź powstanie endonadtlenku His.
Uszkodzenia DNA mogą dotyczyć modyfikacji zasad azotowych, przemiany reszt cukrowej,
rozerwania wiązania glikozydowego lub fosfodiestrowego, powstania dimerów tymidynowych itp.
puryny: atak na wiązanie C7-C8 → rozerwanie pierścienia imidazolowego → powstanie poch.
pirymidyny,
U → 5-hydroksy-U, 5,6-dihydroksy-U, 5-hydroksymetylo-U,
C → 5-hydroksy-C, 5,6-dihydroksy-C,
T → 5,6-dihydro-T, glikol T, 5-hydroksy-6-hydro-T.
• Mechanizmy obronne komórek przed stresem oksydacyjnym:
enzymatyczne:
dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) – dysproporcjonowanie O2-*:
2 O2-* + 2 H+ → H2O2 + O2
katalazy (CT) – rozkład nadtlenku wodoru:
H2O2 → H2O + ½ O2
peroksydazy, np. glutationowa – rozkład H2O2 z wykorzystaniem zredukowanego substratu:
H2O2 + S-H2 → 2 H2O + A
nieenzymatyczne:
białka:
obronne, np. albumina
kontrolujące obieg metali – Fe (ferrytyna, transferryna), Cu (cerulplazmina)
witaminy:
wit. C – kwas askorbinowy – antyoksydant fazy wodnej:
askorbinian →-2H→ dehydroaskorbinian
wit. E – tokoferol – antyoksydant fazy lipidowej
W reakcji zmiatania rodnika lipidowego sam przekształca się w formę rodnikową, po
czym na granicy fazy lipofilnej i hydrofilnej redukowany jest przez askorbinian.
karotenoidy: wit. A (retinol), α-, β-, γ-karoteny – antyoksydanty fazy lipidowej
-58-
związki niskocząsteczkowe:
glutation (γ-glutamylocysteinyloglicyna) – we współpracy z peroksydazą glutationową:
H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GSSG
bilirubina związana z albuminą (osocze)
kwas moczowy (śródbłonek, hepatocyty)
melaniny – eumelanina i feomelanina (skóra)
kreatynina, karnozyna, kwas α-lipoinowy (tiooktanowy), flawonoidy roślinne
8.
Utlenianie mikrosomalne
Monooksygenazy systemów mikrosomalnych występują razem z cytochromami P450 i b5. NADH i
NADPH dostarczają równowaŜników redukujących do redukcji tych cytochromów, które z kolei są utlenianie
przez substraty w cyklu hydroksylacyjnym. Takie mikrosomalne układy hydroksylacyjne występują w:
wątrobie, gdzie biorą udział w:
przemianie poch. wit. D (hydroksylacja w pozycji 25),
syntezie kwasów Ŝółciowych (patrz punkt V-9)
detoksykacji ksenobiotyków, m. in. benzopirenu, aminopiryny, aniliny, morfiny, benzofelaminy,
w nerkach, gdzie biorą udział w przemianie pochodnych wit. D (hydroksylacja w pozycjach 1α lub 24)
(patrz punkt V-10 oraz VII-2-b)
w korze nadnerczy, gonadach i łoŜysku) gdzie biorą udział w steroidogenezie (hydroksylacja w
pozycjach 11β, 17α i 21α) (patrz punkt V-11).
Schemat mikrosomalnej hydroksylacji:
A-H + P450-Fe3+ → H-A-P450-Fe3+
H-A-P450-Fe3+ + e- → H-A-P450-Fe2+
H-A-P450-Fe2+ + O2 → H-A-P450-Fe2+-O2
H-A-P450-Fe2+-O2 + e- → H-A-P450-Fe2+-O2-*
H-A-P450-Fe2+-O2-* + 2 H+ → P450-Fe3+ + A-OH + H2O
Reakcje reduktazy NADPH – cytochrom P450 (dostarczanie 2 H+ i 2 e-):
NADPH + H+ + FAD → NADP+ + FADH2
FADH2 + 2 Fe2S23+ → FAD + 2 Fe2S22+ + 2 H+ + 2 e9.
Cykl Krebsa = cykl kwasu cytrynowego = cykl kwasów trójkarboksylowych (TCA)
Cyklem Krebsa nazywamy ciąg reakcji zachodzących w matrix mitochondrialnej, polegający na
katabolizmie reszt acetylowych (kwasu octowego) z uwolnieniem równowaŜników wodorowych. Rola cyklu jest
dwojaka. Po pierwsze dostarcza on substratów dla łańcucha oddechowego w postaci atomów wodoru
przenoszonych na FAD i NAD+, ponadto dostarcza energii poprzez fosforylację substratową. Po drugie stanowi
węzłowy punkt metabolizmu, gdyŜ kończą się na nim lub od niego zaczynają liczne szlaki metaboliczne: jest to
punkt końcowy katabolizmu podstawowych składników pokarmowych (węglowodanów, lipidów i białek), jak
równieŜ punkt wyjścia dla: glukoneogenezy, syntezy KT, transaminacji i dezaminacji.
Enzymy cyklu zlokalizowane są w macierzy mitochondrialnej albo w formie wolnej albo przyłączone do
wewnętrznej powierzchni wewnętrznej błony mitochondrialnej – ułatwia to przenoszenie równowaŜników
redukujących na odpowiednie enzymy łańcucha oddechowego, umiejscowionego przecieŜ równieŜ w
wewnętrznej błonie mitochondrialnej.
a)
reakcje cyklu
kondensacja:
CH3CO-CoA (AcCoA) + HOOC-CO-CH2-COOH (szczawiooctan) + H2O →syntaza cytrynianowa→
→ HOOC-CH2-C(OH)(COOH)-CH2-COOH (cytrynian) + CoA
izomeryzacja – reakcję tą hamuje fluorocytrynian:
cytrynian →akonitaza (hydrataza akonitanowa), -H2O→
HOOC-CH2-C(COOH)=CH-COOH (cis-akonitan) →akonitaza, Fe2+, +H2O→
→ HOOC-CH2-CH(COOH)-CH(OH)-COOH (izocytrynian)
-59-
dehydrogenacja ((*): NAD+ – mitochondrium; NADP+ – mitochondrium / cytozol):
izocytrynian + NAD+ →dehydrogenaza izocytrynianowa (*)→
→ HOOC-CH2-CH(COOH)-CO-COOH (szczawiobursztynian) + NADH + H+
dekarboksylacja:
szczawiobursztynian →dehydrogenaza izocytrynianowa, -CO2→
→ HOOC-CH2-CH2-CO-COOH (α-ketoglutaran)
oksydacyjna dekarboksylacja (patrz punkt III-10) – reakcję tę hamuje arsenin i Hg2+:
α-ketoglutaran + NAD+ + CoA →kompleks oksydazy α-KG, -CO2→
→ HOOC-CH2-CH2-CO~CoA (sukcynylo-CoA) + NADH + H+
oksydacyjna fosforylacja:
sukcynylo-CoA + GDP + Pi →syntetaza sukcynylo-CoA = tiokinaza bursztynianowa (tworząca GDP/ADP)→
→ HOOC-CH2-CH2-COOH (bursztynian) + GTP + CoA
GTP + ADP → GDP + ATP
dehydrogenacja – katalizuje jedyny enzym błonowy szlaku; reakcja hamowana przez malonian:
bursztynian →dehydrogenaza bursztynianowa→ HOOC-CH=CH-COOH (cis) (fumaran)
hydratacja:
fumaran + H2O →fumaraza (hydrataza fumaranowa)→ HOOC-CH(OH)-CH2-COOH (L-jabłczan)
dehydrogenacja:
L-jabłczan + NAD+ →dehydrogenaza jabłczanowa→
HOOC-CO-CH2-COOH (szczawiooctan) + NADH + H+
b) bilans energetyczny cyklu
dehydrogenaza izocytrynianowa
dehydrogenaza α-ketoglutaranowa
syntetaza sukcynylo-CoA
dehydrogenaza bursztynianowa
dehydrogenaza jabłczanowa
c)
powiązania z innymi szlakami – amfiboliczność cyklu
NAD
NAD
substrat.
FAD
NAD
3
3
1
2
3
12 moli ATP
węglowodany:
glukoneogeneza (patrz punkt IV-4-b):
szczawiooctan + GTP/ITP →karboksykinaza {P}-enolopirogronianowa (PEPCK)→
→ {P}-enolopirogronian (PEP) + CO2 + GDP/IDP
PEP →→ glukoza
konwersja do szczawiooctanu:
pirogronian + CO2 + H2O + ATP →karboksylaza pirogronianowa, biotyna (wit. H)→
→ szczawiooctan + ADP + Pi
lipidy (patrz punkt V-6-a):
AcCoA (matrix) → cytynian →liaza ATP-cytrynian→ AcCoA (cytozol) →→ synteza KT
aminokwasy – punkty wejścia szkieletów węglowych aa do cyklu Krebsa – patrz punkt VI-3
d) regulacja cyklu
ogólna: kontrola oddechowa (łańcuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna) ↔ podaŜ utlenianych
kofaktorów dehydrogenaz ↔ dostępność ADP ↔ szybkość zuŜywania ATP ↔ wysiłek organizmu
-60-
wewnętrzna:
dehydrogenaza α-ketoglutaranowa – czynniki regulacji jak PDH (patrz punkt III-10)
syntaza cytrynianowa ← hamowanie przez ATP i długołańcuchowe KT
dehydrogenaza izocytrynianowa ← hamowanie przez ATP i NADH
dehydrogenaza bursztynianowa ← hamowanie przez szczawiooctan ↔ dehydrogenaza
jabłczanowa ↔ stosunek [NADH]/[NAD+]
10. Kompleks oksydazy α-ketokwasów
W skład kompleksu oksydazy α-ketokwasów wchodzą po 6 łańcuchów kaŜdego z trzech składowych
enzymów: swoistej dehydrogenazy (pirogronianowa, α-ketoglutaranowa), transferazy dihydrolipoamidowej oraz
dehydrogenazy dihydrolipoamidowej, jak równieŜ 5 kofaktorów: DPT, kwas liponowy, CoA, FAD oraz NAD+.
Kompleks stanowi regularny przestrzenny układ, poszczególne składowe są doń stale przyłączone i mają
ograniczone moŜliwości ruchu. Zasada działania zostanie dokładnie omówiona na przykładzie kompleksu PDH.
Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDH) katalizuje oksydacyjną dekarboksylację pirogronianu
do AcCoA, przez co stanowi pomost m. in. pomiędzy szlakiem glikolizy, a cyklem Krebsa i syntezą KT. Na
jeden cykl pracy kompleksu składa się 5 reakcji.
• W pierwszej pirogronian ulega połączeniu z koenzymem – difosforanem tiaminy (TDP; poch. wit. B1) i
dekarboksylacji:
CH3COCOOH →PDH→ CH3-C(OH)-[TDP] (hydroksyetyl) + CO2
•
W następnej hydroksyetyl ulega przeniesieniu z TDP na kolejny kofaktor kompleksu – lipoamid
(połączenie kwasu liponowego z resztą Lys):
hydroksyetyl →acetylotransferaza dihydrolipoamidowa→ acetylolipoamid
•
W trzeciej reakcji reszta acetylowa ulega przeniesieniu z lipoamidu na CoA, w wyniku czego powstaje
produkt – AcCoA:
Ac-lipoamid + CoA → dihydrolipoamid + AcCoA
•
PoniewaŜ produktem 3. reakcji jest lipoamid w formie zredukowanej, toteŜ w 4. następuje jego
regeneracja z udziałem FAD:
dihydrolipoamid + FAD →dehydrogenaza dihydrolipoamidowa→ lipoamid + FADH2
•
Powstały FADH2 przekazuje atomy wodoru na NAD+, co stanowi wyjątkowe i niespotykane nigdzie
indziej przejście:
FADH2 + NAD+ → FAD + NADH + H+
Zredukowana forma NADH + H+ stanowi substrat łańcucha oddechowego. Kompleks PDH wraca do
stanu wyjściowego i moŜe rozpocząć kolejny cykl pracy.
Regulacja pracy kompleksu opiera się na:
• allosterycznym hamowaniu przez produkty końcowe (AcCoA i NADH)
• modyfikacjach kowalencyjnych w postaci odwracalnej fosforylacji (aktywność wykazuje forma
zdefosforylowana):
kinaza kompleksu PDH hamowana jest przez Ca2+, pirogronian (substrat) i dwuchlorooctan, zaś
aktywowana przez wysokie wartości stosunków: [AcCoA]/[CoA], [NADH]/[NAD+] oraz
[ATP]/[ADP],
fosfataza aktywowana jest przez: Ca2+, Mg2+ oraz insulinę.
W analogiczny sposób funkcjonuje kompleks dehydrogenazy α-ketoglutaranowej, stanowiący jeden z
enzymów cyklu Krebsa. Rolę substratu pełni tu α-ketoglutaran, a produktu – sukcynylo-CoA. (por. punkt III-9-a)
-61-
ROZDZIAŁ IV – WĘGLOWODANY
1.
Budowa chemiczna, właściwości i funkcje cukrów prostych i złoŜonych
• klasyfikacja węglowodanów
monosacharydy
triozy (C3), tetrozy (C4), pentozy (C5), heksozy (C6), heptozy (C7)
aldozy (polihydroksyaldehydy) / ketozy (polihydroksyketony)
oligosacharydy: disacharydy, trisacharydy itd.
polisacharydy
homoglikany / heteroglikany
pentozany / heksozany
a)
monosacharydy
• Stereoizomeria monosachrydów:
Izomery konfiguracyjne D i L (enancjomery) – przynaleŜność zaleŜy od tego, po której stronie
wystepuje grupa hydroksylowa przy ostatnim asymetrycznym atomie węgla. Skręcalność optyczna
roztworów w prawo (+) bądź w lewo (-) jest niezaleŜna od izomerii D – L. Równomolową mieszaninę
obu izomerów nazywamy recematem (mieszaniną racemiczną, DL-mieszaniną); w wyniku znoszenia
się izomerii optycznej obu izomerów nie wykazuje ona aktywności optycznej.
Piranozowe i furanozowe formy pierścieniowe – poprzez działanie grupy karbonylowej na reszty
hydroksylowe, połoŜone przy dalszych atomach węgla, powstają pięcio- i sześcioczłonowe cykliczne
formy monosacharydów. Przez podobieństwo ich budowy furanu lub piranu nazywamy je odpowiednio
furanozami i piranozami.
Powstanie form cyklicznych, tj. hemiacetali i hemiketali powoduje wystąpienie dodatkowego
asymetrycznego atomu węgla. Mówimy przez to o anomerach α i β: anomer α występuje, gdy grupa
karboksylowa przy atomie węgla hemi znajduje się po przeciwnej stronie niŜ reszta przy ostatnim
atomie węgla tworzącym pierścień, gdy zaś obie grupy znajdują się po tej samej stronie – jest to anomer
β. W roztworze ustala się stan równowagi pomiędzy obiema formami, co nosi nazwę mutarotacji.
Epimerami nazywamy cząsteczki róŜniące się konfiguracją grup hydroksylowych przy atomach C2-C4.
•
Szereg D-aldoz:
aldehyd D-glicerynowy
D-treoza
D-liksoza
D-taloza
D-Gal
•
D-erytroza
D-arabinoza
D-ryboza
D-Man
D-Glc
D-altroza
D-alloza
D-ksyloza
D-idoza
D-guloza
Szereg D-ketoz:
dihydroksyaceton
D-erytruloza
D-ksyluloza
D-tagatoza
D-sorboza
D-fruktoza
D-rybuloza
D-psikoza
D-sedoheptuloza
• Pochodne monosacharydów:
estry
fosforany, np. PGAL, G-6-{P}
siarczany (składowe GAG)
deoksycukry = alditole, np. deoksyryboza, fukoza, rybitol
aminocukry, np. GlcNH2, GalNH2, ManNH2
kwasy (→ laktony)
aldonowe
aldarowe
alduronowe, np. GlcUA, IdUA, GulUA
-62-
glikozydy (brak mutarotacji)
O-glikozydy (acetale)
N-glikozydy
S-glikozydy
b) disacharydy
•
•
posiadają właściwości redukujące, jeŜeli w budowie wiązania O-glikozydowego nie biorą udziału
jednocześnie oba aromatyczne atomy węgla
przedstawiciele:
maltoza: α-D-Glc 1→4 α-D-Glc
sacharoza: β-D-Fru 2→1 α-D-Glc
laktoza: β-D-Gal 1→4 β-D-Glc
trehaloza: α-D-Glc 1→1 α-D-Glu
c)
polisacharydy
• homoglikany
skrobia – glukazon, najwaŜniejsze źródło węglowodanów w pokarmie
amylaza (15 – 20 %): α-D-Glc 1→4
amylopektyna (80 – 85 %): α-D-Glc 1→4 i 1→6 (raz na 24 – 30 reszt)
glikogen – „zwierzęca skrobia”, polisacharyd zapasowy zwierząt
α-D-Glc 1→4 i 1→6 (raz na 12 – 14 reszt → bardziej rozgałęziony niŜ skrobia)
inulina – fruktazon, złoŜony z ok. 30 reszt Fru 1→2; uŜywana do badań klirensu nerkowego
dekstryny – półprodukty hydrolizy skrobii
błonnik (celuloza) (β-D-Glc 1→4) – masowy składnik poŜywienia, nie ulegający trawieniu
chityna (β-D-GluNAc 1→4) – składnik pancerzy bezkręgowców
• heteroglikany
GAG (glikozoaminoglikany, mukopolisacharydy, śluzowielocukry)
[GluNAc lub GalNAc + GlcUA lub IdUA]n
kwas sialowy (SA) = kwas neuraminowy (NA) + X; np. N-Ac-Neu (NeuAc, NANA)
NA (C9) = ManNH2 (C6) + Pyr (C3)
glikany proteoglikanów: (GAGn + proteina)m + HA
glikany glikoprotein
glikany glikolipidów
2.
Trawienie węglowodanów i jego zaburzenia
•
Amylaza ślinowa (optimum 6,6-6,8, wymaga Cl-) – rozkłada skrobię i glikogen do maltozy i innych
oligosacharydów przez hydrolizę wiązań 1→4. Ulega unieczynnieniu w pH < 4, dlatego jest
nieaktywna w kwaśnej treści Ŝołądka.
α-amylaza trzustkowa (optimum 7,1) – rozkłada skrobię i glikogen do maltozy, maltotriozy, dekstryn
granicznych nierozgałęzionych oligosacharydów i niewielkiej ilości wolnej glukozy.
Sok jelitowy – zawiera swoiste oligo- i disacharydazy:
maltaza – α-glukozydaza (optimum 5,8-6,2) – odszczepia pojedyncze reszty cukrowe od sacharydów z
wiązaniem α(1,4), rozpoczynając od końca nieredukującego
kompleks sacharaza – izomaltaza (optimum 5-7) – po rozdzieleniu enzymy stają się aktywne,
hydrolizując sacharozę i wiązania α(1,6) dekstryn
laktaza – β-glikozydaza (optimum 5,4-8,0) – odszczepia galaktozę od laktozy, atakuje celobiozę i inne
β-glikany, druga domena katalityczna rozszczepia glikozyloceramidy
trehalaza – katalizuje hydrolizę trehalozy
•
•
• Zaburzenia trawienia:
Niedobór laktazy jest przyczyną nietolerancji laktozy, sprowadzającej się do nietolerancji mleka.
WyróŜnia się niedobór dziedziczny (pierwotny – spowodowany mutacją genu) oraz wtórny –
towarzyszący chorobom jelit, zabiegom operacyjnym na jamie brzusznej itp. Obecność w świetle jelita
nie rozłoŜonej laktozy – substancji czynnej osmotycznie – powoduje biegunki osmotyczne. Z kolei jej
bakteryjna fermentacja dostarcza duŜej ilość produktów gazowych, draŜniących jelito i przez to
wywołujących wzdęcia i bóle brzucha.
Niedobór aktywności sacharazy i izomaltazy wywołuje podobne zjawiska.
-63-
Disacharyduria to zaburzenie trawienia niektórych disacharydów, które w tej sytuacji wchłaniane są w
formie nie rozłoŜonej i w zwiększonej ilości wydalane są z moczem (np. 300 mg/d).
Wadliwe wchłanianie monosacharydów – dotyczy Gal i Glc (defekt SGLT-1) lub Fru i sorbitolu
3.
Wchłanianie i transport węglowodanów
a)
transport aktywny i bierny, białka transportujące
•
•
W świetle jelita aktywne są skupiska disacharydaz połączone z rąbkiem szczoteczkowym komórek
nabłonkowych. Produkty trawienia węglowodanów wchłaniane są z jelita czczego do krąŜenia
wrotnego w postaci monosacharydów, w tym głównie pentoz i heksoz. Proces wchłaniania odbywa się
przez dyfuzję prostą oraz transport aktywny. Ten ostatni jest bardziej wybiórczy i wymaga określonej
budowy transportowanej cząsteczki: konfiguracji grupy hydroksylowej przy C2 jak w glukozie,
pierścienia piranozowego oraz obecności przy C5 grupy metylowej lub jej pochodnej.
Transport glukozy i galaktozy odbywa się przez przenośniki zaleŜna lub nie od Na+. Przenośniki
kotransportowe (SGLT-1) przenoszą jednocześnie cząsteczkę glukozy i kation Na+, przez co
współdziałają z Na+/K+-ATPazą; transport ten moŜna więc zahamować ouabainą (inhibitor pompy Na+)
lub florazyną (inhibitor reabsorpcji nerkowej). Na komórce nabłonkowej występują ponadto
przenośniki niezaleŜne od Na+ – GLUT. Fruktoza wchłania się względnie wolno, biernie, przez
przenośnik GLUT-5.
•
Charakterystyka transporterów glukozy:
przenośnik
GLUT-1
GLUT-2
GLUT-3
GLUT-4
GLUT-5
SGLT-1
lokalizacja
mózg, nerki, jelito grube, łoŜysko, erytrocyty
wątroba, komórki β wysp, jelito cienkie, nerki
mózg, nerki, łoŜysko
serce, mięśnie, tkanka tłuszczowa
jelito cienkie
jelito cienkie, nerka
b) zróŜnicowanie tkankowe transportu
-64-
rola
pobieranie glukozy
szybkie pobieranie / uwalnianie glukozy
pobieranie glukozy
pobieranie glukozy zal. od insuliny
wchłanianie glukozy
aktywny transport zal. od Na+
c)
rola insuliny (patrz równieŜ punkt IV-8-b)
•
mechanizm wydzielania insuliny:
Glc → ↑ ATP → zamknięcie kanałów K+ zal. od ATP → depolaryzacja błony → otwarcie kanałów
Ca2+ zal. od potencjału → napływa Ca2+ do komórki → egzocytoza pęcherzyków zawierających
insulinę
działanie insuliny:
mobilizacja i przeniesienie na powierzchnię błony przenośnika GLUT-4 (mięśnie, tkanka tłuszczowa)
modyfikacja ekspresji genów enzymów (wątroba)
wpływ na regulację insulinową:
związki endogenne: egzocytozę insuliny zwiększają aa i WKT, zaś zmniejszają aminy katecholowe
doustne leki p/cukrzycowe:
poch. sulfonylomocznika (np. tolbutamid) oraz glinidy (np. repaglinid) przyłączają się w pobliŜu
kanałów K+ zal. od ATP i blokują go, przez co zwiększają egzocytozę insuliny
glitazony (np. troglitazon) bezpośrednio modyfikują transkrypcję białek, w tym enzymatycznych,
podlegających kontroli insuliny
•
•
d) rola fosforylacji monosacharydów
Fosforylacja monosacharydów pełni istotną rolę w ich transporcie. Heksokinaza ma duŜe powinowactwo
do heksoz (1 / KM = 20 1/mM), dlatego funkcjonuje jako transporter cukrów do tkanek; cechuje się małą
swoistością. Glukokinaza z kolei ma duŜą swoistość i małe powinowactwo (1 / KM = 0,1 1/mM), stąd bierze
udział w regulacji stęŜenia glukozy do krwi; występuje w wątrobie i trzustce. Dzięki takiemu układowi po
posiłku glukoza transportowana jest do wątroby i zuŜywających ją tkanek, natomiast w stanie między posiłkami
wątroba oddaje glukozę do krwi, a tkanki obwodowe stale ją zuŜywają.
4.
Metabolizm glukozy
a)
glikoliza (szlak Embdena – Meyerhoffa – Parnasa = EMP)
•
lokalizacja komórkowa: cytozol; miejsca aktywne glikolitycznie skupione są w kompleksy mające
postać małych organelli komórkowych – glikolizosomów; enzymy szlaku zaadsorbowane są na błonach
ER
•
znaczenie glikolizy:
podstawowa droga katabolizmu glukozy do AcCoA
główny szlak metabolizmu pokarmowej fruktozy i galaktozy
moŜe zachodzić w warunkach beztlenowych, przez co dostarcza energii tkance mięśniowej nawet w
stanie niedotlenienia
stanowi jedyne źródło energii dla komórek pozbawionych moŜliwości oddychania tlenowego –
pozbawionych mitochondriów (np. erytrocyty)
•
przebieg glikolizy:
ogólne równanie: Glc + 2 ADP + 2 Pi → 2 L-mleczan + 2 H2O + 2 ATP
fosforylacja:
Glc + ATP →heksokinaza, Mg2+→ Glc-6-{P} + ADP
Reakcja ta traktowana jest za fizjologicznie nieodwracalną dzięki uwalnianiu energii w postaci ciepła. Ma
miejsce allosteryczne hamowanie przez produkt.
Rodzaje heksokinazy:
glukokinaza – wątrobowa
galaktokinaza – wątrobowa
fruktkinaza – nie tylko wątrobowa
mózgowa – oddziałuje z błoną mitochondrialaną
izomeryzacja aldoketozowa:
α-D-Glc-6-{P} ↔izomeraza fosfoheksozowa↔ α-D-Fru-6-{P}
-65-
fosforylacja:
D-Fru-6-{P} + ATP →fosfofruktokinaza-1 (PFK-1) → D-Fru-1,6-bis-{P} + ADP
Reakcja jest fizjologicznie nieodwracalna, ma ponadto duŜe znaczenie w regulacji glikolizy.
rozszczepienie:
D-Fru-1,6-bis-{P} ↔aldolaza↔ D-aldehyd 3-{P}-glicerynowy (PGAL) + {P}-dihydroksyaceton
Aldolaza występuje w mózgu, wątrobie i mięśniach. Składa się z 4 podjednostek. Izoenzym A, obecny w
większości tkanek, słabo przeprowadza reakcję Fru-1-{P} → PGAL + {P}-dihydroksyaceton, zaś izoenzym B,
występujący w wątrobie i nerce, przeprowadza obie reakcje z podobnym powinowactwem. Przy niedoborze
aldolazy występuje wrodzona nietolerancja Fru. Z kolei wzrost tej aktywności obserwuje się przy zawale serca,
w zapaleniu wątroby, przy dystrofiach.
izomeryzacja:
D-aldehyd 3-{P}-glicerynowy ↔izomeraza fosfotriozowa↔ {P}-dihydroksyaceton
utlenianie i fosforylacja:
D-aldehyd 3-{P}-glicerynowy + NAD+ + Pi ↔dehydrogenza PGAL↔ 1,3-bis-{P}-glicerynian + NADH + H+
Dehydrogenaza PGAL jest tetramerem, a kaŜda podjednostka posiada 4 grupy SH, z czego jedna wchodzi w
skład centrum katalitycznego. Ten etap szlaku blokowany jest przez jodooctan.
fosforylacja substratowa
1,3-bis-{P}-glicerynian + ADP ↔kinaza fosfoglicerynianowa, Mg2+↔ 3-{P}-glicerynian + ATP
W tej reakcji arsenian rozprzęga procesy utleniania i fosforylacji – nie powstaje ATP.
izomeryzacja – katalizowana przez mutazę fosfoglicerynianową
3-{P}-glicerynian ↔ 2,3-bis-{P}-glicerynian ↔ 2-{P}-glicerynian
dehydratacja
2-{P}-glicerynian ↔enolaza, Mg2+/Mn2+↔ {P}-enolopirogronian (PEP) + H2O
Reakcję tą hamuje obecność fluorków, dlatego dodaje się je do krwi pobieranej w celu oznaczenia poziomu
glukozy.
fosforylacja substratowa
PEP + ADP →kinaza pirogronianowa, Mg2+→ enolopirogronian + ATP
enolopirogronian →spontaniczna izomeryzacja→ pirogronian (w formie ketonowej)
Reakcję tą uwaŜa się za fizjologicznie nieodwracalną. Jest ona hamowana przez alaninę. Kinaza pirogronianowa
występuje w kilku formach: R (erytrocyty), L (wątroba), M1 i M2 (mózg i mięśnie).
redukcja (w warunkach beztlenowych)
pirogronian + NADH + H+ ↔dehydrogenza mleczanowa (LDH)↔ L-mleczan + NAD+
LDH posiada 5 izoenzymów, których oznaczenie stosowano przy diagnostyce zawału serca (H4) oraz funkcji
wątroby.
•
bilans energetyczny:
dehydrogenaza PGAL
kinaza {P}-glicerynianowa
kinaza pirogronianowa
fosforylacja heksoz:
LDH
warunki tlenowe: 8 ATP
warunki beztlenowe: 2 ATP
•
utlenianie 2 NADH
fosforylacja substratowa
fosforylacja substratowa
heksokinaza
PFK-1
– 2 NADH
3x2=6
1x2=2
1x2=2
–1
–1
–3x2=–6
regulacja:
heksokinaza ←(-) Glc-6-{P} (produkt reakcji)
PFK-1 ←
← (+) Fru-6-{P}, Fru-2,6-bis-{P}
← (-) ↓ pH (prewencja kwasicy), ATP (znosi to AMP), cytrynian (← cykl Krebsa)
← Fru-1,6-bis-{P} (produkt) (← (-) cAMP)
-66-
kinaza pirogronianowa ←
← (+)Fru-1,6-bis-{P}
← (-) alanina, cAMP (← (+) glukagon)
• dalsze moŜliwe losy pirogronianu:
→transaminaza→ alanina →→ cykl Glu-Ala
→LDH→ mleczan → cykl Cori
→karboksylaza pirogronianowa→ szczawiooctan, jabłczan →→ cykl Krebsa
→dehydrogenza pirogronianowa→ AcCoA → cykl Krebsa / synteza kwasów tłuszczowych
→dekarboksylaza pirogronianowa→ aldehyd octowy → dehydrogenaza alkoholowa → etanol (bakterie)
•
W erytrocytach zachodzi alternatywny szlak glikolizy, róŜniący się ominięciem reakcji kinazy
fosfoglicerynianowej, zaś wytworzona z 1,3-bis-{P}-glicerynianu energia ulega rozproszeniu. Pozwala
to na przebieg glikolizy nawet w warunkach minimalnego zapotrzebowania na ATP (występuje
minimalny zysk energetyczny w postaci 1 ATP). Ponadto syntetyzowany jest 2,3-bis-{P}-glicerynian
(BPG) – allosteryczny regulator, przesuwający w prawo krzywą wysycenia hemoglobiny, co w efekcie
ułatwia oddawanie tlenu do tkanek.
1,3-bis-{P}-glicerynian →mutaza bisfosfoglicerynianowa→ 2,3-bis-{P}-glicerynian (BPG)
BPG →fosfataza 2,3-bis-{P}-glicerynianowa→ 3-{P}-glicerynian + Pi
b) glukoneogeneza
•
Przez glukoneogenezę rozumiemy wszystkie mechanizmy i szlaki metaboliczne odpowiedzialne za
przekształcanie związków niewęglowodanowych w glukozę lub glikogen.
•
lokalizacja
Pełen zestaw enzymów niezbędnych do glukoneogenezy zawierają wątroba i nerki. Enzymy
zlokalizowane są w matriks mitochondrialnej (karboksylaza pirogronianowa), w cytozolu
(karboksykinaza PEP i Fru-1,6-bisfosfataza) oraz na błonach ER (Glc-6-fosfataza).
•
Znaczenie – zaspokajanie zapotrzebowania organizmu na glukozę przy niedostatecznej podaŜy
węglowodanów w diecie. Pomimo, iŜ energetyczne potrzeby organizmu mogą być zaspokajane przez
inne związki, dla niektórych przemian metabolicznych niezbędna jest glukoza (energia dla układu
nerwowego, erytrocytów, mięśni pracujących w deficycie tlenowych, pokarm dla płodu, glicerol dla
tkanki tłuszczowej, galaktoza do syntezy mleka). Ponadto za pośrednictwem tego szlaku usuwane są z
krąŜenia produkty metabolizmu innych tkanek (mleczan, glicerol, proponian).
•
przebieg
Glukoneogeneza obejmuje reakcje glikolizy, cyklu Krebsa oraz niektóre reakcje specjalne. Przebieg
glikolizy nie moŜe zostać w prosty sposób odwrócony, dlatego w dodatkowych reakcjach omijane są jej
bariery termodynamiczne.
pirogronian → PEP
translokacja pirogronianu do mitochondrium
karboksylacja:
pirogronian + CO2 + ATP →karboksylaza pirogronianowa, biotyna (wit. H), Mg2+→
→ szczawiooctan + ADP + Pi
przeniesienie do cytozolu: wejście w cykl Krebsa → przekształcenie w jabłczan →
translokacja → powrót do szczawiooctanu
dekarboksylacja:
szczawiooctan + GTP →karboksykinaza PEP (PEPCK) → PEP + GDP + CO2
Fru-1,6-bis-{P} → Fru-6-{P}
Reakcja katalizowana jest przez swoistą Fru-1,6-bisfosfatazę. Jej obecność warunkuje, czy dana tkanka
zdolna jest do syntezy glikogenu z fosfokinaz; zdolność tą posiadają: wątroba, nerki i mięsień.
Glc-6-{P} → Glc
Reakcja katalizowana jest przez swoistą Glc-6-fosfatazę, obecną w wątrobie i nerce, co pozwala tym
narządom na oddawanie glukozy do krwi.
Glc-6-{P} → glikogen
Reakcja ma odmienny przebieg i związana jest z utworzeniem UDP-Glc przez syntazę glikogenową.
-67-
•
bilans energetyczny:
karboksylaza pirogronianowa
PEPCK
kinaza {P}-glicerynianowa
dehydrogenaza PGAL
•
2 ATP
2 ATP
2 ATP
+ 6 ATP
6 ATP
2 NADH
włączenie glikogenu:
glicerol + ATP →kinaza glicerolowa (wątroba, nerka)→ glicerolo-3-{P} + ADP
glicerolo-3-{P} + NAD+ →dehydrogenaza glicerolo-3-{P}→ {P}-dihydroksyaceton + NADH + H+
•
metabolizm propionianu:
propionian + CoA + ATP →syntetaza acylo-CoA, Mg2+→ propionylo-CoA + AMP + PPi
propionylo-CoA + CO2 + H2O + ATP →karboksylaza propionylo-CoA, wit. H→
→ D-metylomalonylo-CoA + ADP + Pi
D-metylomalonylo-CoA →racemaza metylomalonylo-CoA→ L-metylomalonylo-CoA
L-metylomalonylo-CoA →mutaza metylomalonylo-CoA, wit. B12→ sukcynylo-CoA
sukcynylo-CoA →→ cykl Krebsa
•
regulacja glikolizy i glukoneogenezy
indukcja i represja syntezy enzymów
enzymy gliko- i lipolizy
enzymy glukoneogenezy
obfitość glukozy
+
-
insulina
+
-
glukagon, GKS
+
kowalencyjna modyfikacja przez odwracalną fosforylację
glukagon, A → AC → cAMP → kinaza białkowa zal. od cAMP → fosforylacja i inaktywacja kinazy Pyr
modyfikacje allosteryczne
karboksylaza Pyr
fosfofruktokinaza-1 (PFK-1)
-68-
c)
szlak pentozofosforanowy
(szlak Warburga – Dickensa – Horeckera = WDH; ang. pentose phosphate pathway = PPP)
•
lokalizacja
Enzymy szlaku stanowią składnik cytozolu. Cykl przeprowadzany jest gł. przez wątrobę, nadnarcze,
tarczycę i gruczoł piersiowy. W erytrocytach przetwarzane jest w ten sposób do 10 % glukozy, a
powstałe równowaŜniki redukujące zuŜywane są do regeneracji GSH, zabezpieczającego przed
skutkami stresu oksydacyjnego i hemolizą.
•
znaczenie
PPP jest alternatywną drogą metabolizmu glukozy. Dostarcza NADPH do syntez redukcyjnych, np.
biosyntezy KT i steroidogenezy, oraz rybozy do syntezy nukleotydów i koenzymów.
•
porównanie z glikolizą
akceptor H
CO2
ATP
rybozo-{P}
•
glikoliza
NAD+
produkt
-
PPP
NADP+
obecny
produkt
przebieg
ogólne równanie: 3 Glc-6-{P} + 6 NADP+ → 2 Glc-6-{P} + 3 PGAL + 3 CO2 + 6 NADPH + 6 H+
etap oksydacyjny → wytwarzanie NADPH
Glc-6-{P} + NADP+ →dehydrogenaza Glc-6-{P}, Mg2+/Ca2+→ 6-{P}-glukonolakton + NADPH + H+
6-{P}-glukonolakton + H2O →hydrolaza glukonolaktonowa, Mg2+/Mn2+/Ca2+→ 6-{P}-glukonian
6-{P}-glukonian + NADP+ →dehydrogenaza 6-{P}-glukonianowa→ 3-keto-6-{P}-glukonian + NADPH + H+
3-keto-6-{P}-glukonian → rybulozo-5-{P} + CO2
etap nieoksydacyjny → wytwarzanie prekursorów rybozy
d) niektóre zaburzenie przemian glukozy
•
Kwasica mleczanowa – występuje m. in. przy zatruciu As i Hg, niedoborze wit. B1, w dziedzicznym
niedoborze dehydrogenazy Pyr, cukrzycy typu II.
-69-
•
•
•
•
•
•
•
Anemia hemolityczna – jest m. in. objawem dziedzicznego niedoboru aldolazy A i kinazy Pyr w
erytrocytach.
Deficyt aktywności PFK w mięśniach → mała wydolność wysiłkowa.
Glukozuria = obecność glukozy w moczu w następstwie przekroczenia progu nerkowego dl tego
związaku.
Niedobór Fru-1,6-bisfosfatazy → zablokowanie glukoneogenezy → nagromadzenie mleczanu →
kwasica mleczanowa i hipoglikemia.
Hipoglikemia – moŜe być efektem upośledzenia utleniania KT, przedawkowania leków
p/cukrzycowych (insulina lub leki doustne), występować w ciąŜy i u noworodków.
Fawizm – choroba spowodowana niedoborem aktywności dehydrogenazy Glc-6-{P}, co powoduje
zahamowanie PPP → deficyt GSH w erytrocytach → ↓ oporność hemolityczna → napadowa hemoliza
po spoŜyciu związków utleniających (kwas acetylosalicylowy, sulfonamidy, primarchina, ziarna bobu
(łac. vicia fava – stąd nazwa)).
Dziedziczna samoistna pentozuria – niedobór aktywności enzymu redukującego ksylulozę w ksilitol →
obecność w moczu znacznych ilości ksylulozy.
5.
Metabolizm glikogenu
a)
synteza glikogenu = glikogenogeneza (gł. mięśnie i wątroba)
Glc →heksokinaza / glukokinaza→ Glc-6-{P}
Glc-6-{P} ↔fosfoglukomutaza, Mg2+↔ Glc-1,6-bis-{P} ↔fosfoglukomutaza, Mg2+↔ Glc-1-{P}
Glc-1-{P} + UTP →pirofosforylaza UDP-Glc→ UDP + PPi
PPi + H2O →nieorganiczna pirofosfataza→ 2 {P}
UDP-Glc + (C6)n →syntaza glikogenowa→ UDP + (C6)n+1
•
•
•
Ostatnia reakcja moŜe jedynie dołączać glukozę do juŜ istniejącego łańcucha, dlatego do
zapoczątkowania syntezy potrzebny jest primer – białko glikogenina – posiadające przyłączone do Tyr
4 reszty glukozowe.
Enzym rozgałęziający posiada aktywność amylo-[1→4]→[1→6]-transglukozydazy: gdy łańcuch staje
się zbyt długi, enzym ten odcina jego część, tworząc zeń boczne odgałęzienie.
Wraz ze zwiększaniem liczby nieredukujących reszt końcowych zwiększa się w cząsetczce glikogenu
całkowita liczba miejsc zdolnych do reakcji, umoŜliwiając przyspieszenie zarówno glikogenogenezy,
jak i glikogenolizy.
b) fosforoliza glikogenu = glikogenoliza
•
Glikogenoliza nie jest prostym odwróceniem glikogenogenezy, lecz stanowi zupełnie inny szlak
przemian.
(C6)n + {P} →fosforylaza→ (C6)n-1 + Glc-1-{P}
• Enzym odgałęziający posiada podwójną aktywność:
α[1→4]→α[1→4]-transferazy glukonowej: przenosi trójsacharydową jednostkę z bocznej gałęzi na
łańcuch prosty i odsłania wiązanie α[1→6],
amylo-[1→6]-glukozydazy: odcina resztę glukozy odgałęzionej, w wyniku czego w procesie rozkładu
glikogenu powstaje niewielka ilość wolnej glukozy.
Glc-1-{P} ↔fosfoglukomutaza, Mg2+↔ Glc-6-{P}
Glc-6-{P} + H2O →Glc-6-fosfataza→ Glc + {P}
•
Glukozo-6-fosfataza występuje jedynie w wątrobie i w nerce, umoŜliwiając tym narządom eksport
wolnej glukozy z komórek do krwi.
-70-
c)
integracja regulacji glikogenogenezy i glikogenolizy
•
Regulacja metabolizmu glikogenu jest efektywna dzięki równowadze między aktywnościami syntazy
glikogenowej i fosforylazy.
Fosforylaza glikogenu występuje w formie (a) ufosforylowanej oraz w formie (b) zdefosforylowanej.
Fosforylaza mięśniowa jest dimerem, zawiera PLP; forma (a) jest zawsze aktywna, zaś forma (b)
jedynie w obecności AMP, powstającego podczas wysiłku. Aktywacji skurczu mięśnia i glikogenolizy
zapoczątkowywana jest przez to samo białko wiąŜące Ca2+, zapewniając synchronizację tych procesów.
Fosforylaza wątrobowa jest tetramerem, forma (a) jest aktywna, zas forma (b) – nieaktywna.
Kinaza fosforylazy składa się z 4 rodzajów podjednostek w stosunku stechiometrycznym (αβγδ)4:
podjednostki α i β posiadają reszty Ser, które mogą być odwracalnie fosforylowane przez kinazę
białkową zal. od cAMP,
podjednostka γ zawiera miejsce katalityczne,
podjednostka δ wiąŜe 4 Ca2+, jest identyczna z kalmoduliną i podobna do podjednostki C troponiny
(TpC)
Syntaza glikogenowa składa się z 4 podjednostek, z których kaŜda zawiera 7 reszt Ser odpowiadających
7 miejscom odwracalnej fosforylacji, w czym bierze udział co najmniej 6 kinaz białkowych: 2 zal. od
Ca2+/kalmoduliny, kinaza fosforylazy, kinaza białkowa zal. od cAMP oraz kinaza-3, 4 i 5 syntazy
glikogenowej (GSK).
Zarówno kinaza fosforylazy, jak i syntaza glikogenowa, mogą być odwracalnie fosforylowane w więcej
niŜ jednym miejscu przez odrębne kinazy. Te wtórne fosforylacje modyfikują wraŜliwość pierwotnych
miejsc do odwracalną fosforylację. Taka wielopunktowa regulacja pozwala insulinie przez wzrost Glc6-{P} wywierać skutki przeciwne do cAMP.
•
•
•
•
d) glikogenozy – choroby spichrzania glikogenu
numer
I
II
nazwa
ch. von Gierkego
ch. Pompego
III
IV
V
VI
VII
VIII
ch. Forbesa / Cori / dekstrynoza graniczna
ch. Andersena / amylopektynoza
syndrom McArdle’a
ch. Hersa
ch. Tauri
-71-
enzym z deficytem aktywności
Glc-6-fosfataza
lizosomalna α[1→4] i α[1→6]
glukozydaza (kwaśna maltaza)
enzym odgałęziający
enzym rozgałęziający
fosforylaza mięśniowa
fosforylaza wątrobowa
PFK w mięśniach i erytrocytach
kinaza fosforylazy w wątrobie
6.
Inne szlaki metabolizmu monosacharydów
a)
szlak kwasu uronowego – alternatywny szlak utleniania glukozy, nie prowadzący do powstania ATP
(u człowieka synteza askorbinianu nie zachodzi z powodu braku odp. aktywności enzymatycznej)
-72-
b) metabolizm fruktozy
• ↑ podaŜ fruktozy →
→ ↑ synteza i estryfikacja KT, ↑ wydzielanie VLDL → hipertriacyloglicerolemia, chipercholesterolemia
LDL → działanie aterogenne
→ ↓ ATP → ↑ katabolizm purynowy → ↑ synteza kwasu moczowego → hiperurykemia → urykozuria
• zaburzenia przemiany fruktozy:
↓ aktywność fruktokinazy → samoistna fruktozuria
↓ aktywność aldolazy B → dziedziczna nietolerancja fruktozy
↓ aktywność Fru-1,6-bisfosfatazy → hipoglikemia
cukrzyca → hiperglikemia → szlak sorbitolowy → zaćma cukrzycowa, neuropatia
c)
metabolizm galaktozy
•
•
↑ podaŜ galaktozy →reduktaza aldozowa→ ↑ galaktitol → zaćma
przyczyny galaktozemii: ↓ aktywność galaktokinazy, 4-epimerazy lub urydylilotransferazy (→ zab.
metabolizmu {P} w wątrobie → zab. funcki wątroby i mózgu)
-73-
7.
Metabolizm heteroglikanów
a)
aminocukry – heksozoaminy
•
Prekursorem do syntezy wszystkich aminocukrów jest glukoza. Aminocukry są składnikami
glikoprotein, GAG i glikosfingolipidów – gangliozydów. Najpowszechniej spotykanymi
przedstawicielami są: glukozoamina (GlcNH2), galaktozoamina (GalNH2), mannozoamina (ManNH2)
oraz kwasu sialowe (SA) – gł. kwas neuraminowy (Neu). Aminocukry występują w formie Nacetylowej (N-Ac-X), a donorem występującej w tych połączeniach grupy N-acetylowej jest AcCoA.
b) glikoproteiny
•
•
•
•
•
Glikoproteiny (GP) to białka posiadające łańcuchy oligosacharydowe przyłączone kowalencyjnie do
rdzenia polipeptydowego.
Mogą one pełnić następujące funkcje: strukturalne (kolagen), „poślizgowe” (mucyny), transportujące
(transferryna, ceruloplazmina), immunologiczne (immunoglobuliny), hormonalne (TSH, hCG),
enzymatyczne (fosfataza alkaliczna), rola w interakcjach międzykomórkowych.
Rola i znaczenie łańcuchów oligosacharydowych GP:
modulacja właściwości fizykochemicznych, np. duŜe łańcuchy cukrowe w N-GP zwiększają ich
rozpuszczalność w wodzie,
ochrona przed rozkładem (proteolizą) lub umoŜliwienie obróbki proteolitycznej,
nadawanie aktywności biologicznej,
określenie docelowego miejsca transportu w obrębie komórki, np. sygnał Man-6-{P} powoduje
skierowanie białek do lizosomów,
determinacja okresu półtrwania białka (T1/2) w krwiobiegu – na powierzchni hepatocytów obecne są
receptory dla asialo-GP (z odsłoniętą resztą Gal), które są usuwane z krąŜenia
udział w procesach wzrostu i róŜnicowania (w tym równieŜ lokalizacja przerzutów nowotworowych)
Składnikami oligosacharydowych fragmentów GP są: Glc, GlcNH2, Gal, GalNAc, Man, Fuc, Xyl,
NeuAc.
Wbudowanie sacharydów do GP poprzedzone jest aktywacją prekursorów:
Glc-1-{P} + UTP ↔pirofosforylaza UDP-Glc↔ UDP-Glc + PPi
UDP-Glc ↔epimeraza UDP-Glc↔ UDP-Gal
UDP-Gal + białko →galaktozylotransferaza→ białko-Gal + UDP
UDP →nukleotydodifosfataza→ UMP + Pi
antyport z/do GERL: UDP-Gal / UMP
-74-
• Klasyfikacja GP:
O-GP:
mucyny: GalNAc-Ser/Thr
proteoglikany: Gal-Gal-Xyl-Ser
kolageny: Gal-Hyl
N-GP (GlcNAc-Asp/Glu):
kompleksowe (+ Fuc, + SA)
wysokomannozowe
hybrydowe
zakotwiczone przez GPI
• Mucyny występują w wydzielinach śluzowych. Dzieli się je na sekrecyjne i leukocytarne. Obecność
NeuAc oraz grup siarczanowych nadaje im ładunek ujemny i związaną z tym lepkość, z kolei
rozbudowana struktura powoduje elastyczność. Budowę ich moŜna schematycznie przedstawić w
postaci: N-C-PTS-C-N, gdzie PTS oznacza sekwencje tandemowe. Mucyny spełniają funkcje ochronne
w stosunku do komórek, są odpowiedzialne za zachodzące między nimi oddziaływania oraz
maskowanie ich antygenów powierzchniowych.
• Proces O-glikozylacji:
bierze w niej udział zespół glikozylotransferaz glikoproteinowych związanych z błonami, działających
w określanej kolejności, wykazujących swoistość katalityczną względem określonego typu wiązania
odpowiednie enzymy znajdują się w aparacie Golgiego
substratem do reakcji jest bezpośrednio odpowiedni sacharyd
proces zachodzi posttranslacyjnie i dotyczy reszt Ser i Thr
nie występuje {P}-{P}-dolichol ani glikozydazy (por. dalej)
• Proces N-glikozylacji:
Istotny jest w nim długołańcuchowy (C100) alkohol – dolichol, ulegający wpierw fosforylacji:
dolichol + ATP →kinaza dolicholowa→ dolicholo-{P} + ADP
Następnie z pochodnych nukleotydowych i dolicholowych dołączane są doń monosacharydy (w liczbie
po 7 z obydwu rodzajów pochodnych) aŜ do wytworzenia struktury:
dolichol-{P}-{P}-GlcNAc2Man3Man6Glc3.
W kolejnym etapie następuje kotranslacyjne (równoległe z translacją mRNA na białko) przeniesienie
powstałego wcześniej oligosacharydu z dolicholu na białko, katalizowane przez transferazę
oligosacharydowo – białkową (proces hamowany jest przez tunikamycynę). Oligosacharyd przyłączony
zostaje do specyficznej sekwencji Ans-X-Ser/Thr, gdzie X = Pro, Asp lub Glu.
Następnie podstawowa sekwencja reszt sacharydowych w przyłączonej do białka strukturze ulega
dalszym modyfikacjom przez enzymy: α-glukozydazę I i II, mannozydazę α1, α2 oraz I i II aparatu
Golgiego, transferazę GlcNac-{P} I i II, fukozotransferazę, galaktozotransferazę i sialotransferazę.
JeŜeli zachodzi wyłącznie odcinanie istniejących podjednostek sacharydowych, wówczas powstają NGP wysokomannozowe, jeŜeli zaś dodatkowo dołączane są podjednostki – syntetyzowane są N-GP
kompleksowe i hybrydowe.
• Glipiacja
Istotą glipiacji jest wyposaŜenie białka w tzw. kotwicę GPI (glikozylofosfatydyloinozytolową) o
budowie: białko-etanoloamina-{P}-Man3-GlcNH2-fosfatydyloinozytol, za pomocą której moŜe ono
utrzymywać łączność z błoną komórkową. Zyskuje przez to większą ruchomość w błonie oraz
moŜliwość pełnienia roli w procesie przekazywania sygnałów. Glipiacja zachodzi posttranslacyjnie.
Dołączenie kotwicy GPI wiąŜe się z odcięciem z C-końca białka grupy hydrofobowej oraz reakcją z
grupą karboksylową. Rozkładu GPI dokonuje fosfolipaza C (PLC). Do białek wyposaŜonych w kotwicę
GPI zaliczamy m. in.: acetylocholinoesterazę (AChE) oraz izoenzym jelitowy i łoŜyskowy fosfatazy
zasadowej (ALP). Defekt kotwicy GPI w obrębie krwinek czerwonych jest przyczyną nocnej
napadowej hemoglobinurii.
c)
proteoglikany
•
Proteoglikany to grupa białek złoŜonych, zawierających kowalencyjnie przyłączone GAG
(glikozoaminoglikany), które same z kolei mogą być niekowalencyjnie przyłączone do HA.
• Przykłady proteoglikanów: syndekan, β-glikan, serglikan, prelekan, agrekan, wesikan, dekorin,
biglikan, fibromodulina.
• Mechanizm syntezy proteoglikanów:
przyłączenie GAG do rdzenia białkowego, zsyntetyzowanego w RER,
wydłuŜenie łańcucha katalizowane przez odpowiednie glikozylotransferazy – substratami są
nukleotydowe pochodne sacharydów,
-75-
zakończenie wydłuŜania łańcucha odbywa się przez siarczanowanie reszt cukrowych bądź przerośniecie
łańcucha poza strefę glikozylacji,
ostateczne modyfikacje polegają na siarczanowaniu przez sulfotransferazy (donorem {S} jest PAPS –
fosfoadenylylosiarczan) oraz epimeryzacji (GlcUA → IdUA)
• Występowanie GAG w organizmie:
kwas hialuronowy (HA) – płyn stawowy, ciało szkliste oka, tkanka łączna luźna
siarczan chondroityny A i B (CS) – chrząstki, kości, rogówka
siarczan keratanu 1 (KS1) – rogówka
siarczan keratanu 2 (KS2) – tkanka łączna luźna
heparyna (H) – ziarnistości mastocytów, wątroba, płuca, serce
siarczan heparanu (HS) – fibroblasty skóry, ściana aorty
siarczan dermatanu (DS) – występuje powszechnie
• Funkcje GAG w organizmie:
składniki strukturalne macierzy pozakomórkowej (ECM),
oddziaływanie z białkami macierzy,
wiązanie kationów,
kształtowanie napięcia tkanek,
ułatwianie migracji komórek (HA),
spręŜystość chrząstki (HA, CS),
przejrzystość rogówki (KS1, DS),
funkcja antykoagulacyjna (H) – gł. egzogenna,
receptory interakcji międzykomórkowych (HS),
selektywność filtracji kłębuszkowej (HS),
składniki pęcherzyków (HS)
d) Mukopolisacharydozy (MPS) – są to wrodzone zaburzenia metaboliczne związane z defektami hydrolaz
lizosomalnych katabolizujących GAG (endo- i egzoglikozydaz, sulfataz itd.). Spowodowane są
mutacjami genów kodujących enzymy uczestniczące w rozkładzie określonych GAG. Niedobór
hydrolaz powoduje spichrzanie ich substratów w róŜnych tkankach, m. in.: wątroba, śledzona, kości,
skóra, OUN. Skutkuje to powiększeniem narządów, zaburzeniami wzrostu, zniekształceniami twarzy
oraz upośledzeniem umysłowym. Najczęściej występujące mukopolisacharydozy to zespoły: Hurler –
Scheiego, Huntera, Sanfilippo A – D, Morquio A – B, Monteaux – Lamy, Sly’ego.
8.
Regulacja przemiany węglowodanów
a)
zróŜnicowanie tkankowe przemiany węglowodanowej i integracyjna rola wątroby
•
Poszczególne narządy organizmu róŜnią się zarówno sposobem pobierania cukrów (ich przenośnikami),
jak i zestawem enzymów biorących udział w ich metabolizmie oraz wraŜliwością na bodźce
metaboliczne i hormonalne, regulujące przemianę węglowodanową.
Dla mózgu jedynym źródłem energii jest glukoza, a jej niedostatek, np. w wyniku zatrzymania akcji
serca, powoduje zmiany w obrębie kory mózgowej juŜ po kilku minutach.
W komórkach mięśniowych (miocytach) zachodzi glikoliza, mogąca dostarczać energii nawet pod
nieobecność tlenu i zaciągać dług tlenowy. Powstały mleczan wydalany jest do krwi, wchodząc
następnie w cykl Corich. Część mleczanu, jak równieŜ glukoza pobierana z krwi, przekształcane są w
glikogen, który moŜe ulegać fosforolizie. Nie występuje moŜliwość oddawania glukozy do krwi.
Produktem przemian (po transaminacji szczawiooctanu) moŜe być alanina, usuwana do krwi i zasilająca
cykl glukozowo – alaninowy.
Tkanka tłuszczowa (adipocyty) pobiera glukozę z krwi i przekształca ją w 3-{P}-glicerynian i dalej w
glicerol, wykorzystywany do syntezy TAG. Po lipolizie glicerol usuwany jest do krwi, po czym
wątroba regeneruje go w szlaku glukoneogenezy.
W krwinkach czerwonych (erytrocytach) nie występują mitochondria, dlatego glukoza jest jedynym
źródłem energii. Ma tu miejsce modyfikacja glikolizy z powstaniem BPG, allosterycznego modyfikaora
uwalniającego tlen z oksyhemoglobiny. Ok. 10 % glukozy zuŜywana jest w oksydacyjnym etapie PPP
w celu regeneracji zredukowanej formy glutationu (GSH).
Nerka pod względem zestawu enzymów podobna jest do wątroby. Ma moŜliwość przeprowadzenia
glukoneogenezy, glikogenolizy łącznie z oddawaniem glukoz do krwi oraz fosforylację i dalsze
przemiany frukozy.
W gruczole sutkowym w okresie laktacji następuje przekształcanie glukozy w galaktozę oraz synteza
laktozy z obu powyŜszych monosacharydów.
•
•
•
•
•
•
-76-
•
•
Tkanki przeprowadzające syntezy redukcyjne zuŜywają duŜo glukozy na pierwszy, a tkanki
intensywnie dzielące się – na drugi etap PPP.
Wątroba pełni nadrzędną rolę, koordynując metabolizm węglowodanów w całym organizmie. Dochodzi
tu do regeneracji glukozy z produktów przemiany innych tkanek, tj.: mięśni, erytrocytów, czy tkanki
tłuszczowej, a więc: mleczanu, glicerolu, alaniny i propionianu. Zachodzi PPP. StęŜenie glukozy we
krwi w okresie między posiłkami regulowane jest dzięki glikogenogenezie i glikogenolizie z
moŜliwością oddawania glukozy do krwi. Przeprowadzana jest izomeryzacja fruktozy do glukozy.
Działa szlak kwasu uronowego, dostarczając tego substratu do syntezy proteoglikanów. Z
glukuronianem sprzęgane są steroidy, bilirubina, leki i ich metabolity (np. kwas acetylosalicylowy), co
ułatwia ich wydalenie z moczem (funkcja detoksykacyjna). Granulocyty łącznotkankowego zrębu
wątroby produkują GAG heparynę, będącą naturalnym antykoagulantem. Wątroba jest zatem miejscem
zbierającym wszystkie szlaki metabolizmu węglowodanów.
b) kontrola stęŜenie glukozy we krwi i hormonalna regulacja metabolizmu węglowodanów
•
Glukoza w organizmie jest produktem i substratem wielu reakcji. Pojawia się w wyniku spoŜywania
pokarmów oraz przekształceni dwojakiego rodzaju związków – recyclingowych (mleczan i alanina)
oraz nierecyclingowych (aa, propionian i glicerol). ZuŜywana jest przez róŜne tkanki do róŜnych celów.
• Regulacja stęŜenie glukozy odbywa się juŜ na etapie jej wchłaniania. Powszechna w komórkach
heksokinaza jest allosterycznie modyfikowana przez glukozo-6-{P}, ma więc miejsce pewna
autoregulacja. W wątrobie i trzustce obecna jest niewraŜliwa na glukozo-6-{P} glukokinaza oraz
dwukierunkowy transporter GLUT-2.
• W komórkach B (β) trzustki napływ glukozy powoduje zwiększenie stęŜenia ATP, które blokuje kanały
K+. W podobny sposób działają doustne leki p/cukrzycowe – poch. sulfonylomocznika (m. in.
tolbutamid i gliburyd). Powoduje to dalej depolaryzację i otwarcie napięciowo-zaleŜnych kanałów Ca2+,
co powoduje egzocytozę do krwi pęcherzyków zawierających insulinę. Dodatnio na jej wydzielanie
wpływają KT i aa, ujemnie zaś aminy katecholowe. Insulina dociera do swojego receptora o
stechiometrii α2β2. Podjednostka α bezpośrednio wiąŜe insulinę dzięki obecności domeny bogatej w
Cys. Podjednostka β ulokowana jest transbłonowo – jej część zewnętrzna łączy się z podjednostką α
przez mostek dwusiarczkowy, część cytozolowa zaś wykazuje aktywność kinazy tyrozynowej i
właściwości autofosforylujące. Przyłączenie insuliny do receptora indukuje w nim zmiany
konformacyjne. Receptory grupują się i internalizują w pęcherzyki klatrynowe, skąd mogą być
recyclingowane do cytoplazmy. Fosforylacja własnych i obcych reszt tyrozynowych stanowi podstawę
wewnątrzkomórkowego przekaźnictwa sygnału. Substrat IRS2 daje IRS2-Y-P i aktywuje kinazę PI3.
Ta zaś pośrednio powoduje szereg efektów:
translokację do błony transporterów GLUT-4 oraz receptorów własnych i IGF-2,
zmianę aktywności genów: PEPCK, IGFBP, glukagonu, hekso- i glukokinazy oraz kinazy
pirogroninowej,
zmianę aktywności enzymów przemiany: cAMP, glukozy, glikogenu (podwójnie), lipidów i cząsteczek
sygnałowych.
Z kolei IRS → IRS-Y-P a Shc → Shc-Y-P wpływają na mobilizację wzrostu komórek i syntezy DNA.
Insulina wpływa na rozwój organizmu, a jej brak powoduje leprechaunizmu (krasnoludkowatości). W
ten sposób dochodzi do zmniejszenia poziomu glukozy we krwi (efekt hipoglikemizujący).
• Spadek poziomu glukozy w osoczu powoduje z kolei uwalnianie glukagonu przez komórki A (α) wysp
trzustkowych, który indukuje fosforylazę wątrobową, powodują glikogenolizę i uwalnianie glukozy do
krwi. W przeciwieństwie do glukagonu, aminy katechlowe wpływają zarówno na fosforlazę mięśniową,
jak i wątrobową, przez co umoŜliwiają mięśniom efektywniejszą pracę. Pomaga to równieŜ w
wytęŜonej pracy umysłowej, gdyŜ układ nerwowy jest wówczas lepie zaopatrzony w glukozę.
Uwalniany przy skurczu mięśnia wapń dodatkowo i podwójnie mobilizuje glikogenolizę.
• Efekt hiperglikemizujący wywierają równieŜ glikokortykoidy przez mobilizację glukoneogenezy i
przysparzanie dla niej substratów, a takŜe hormony przedniego płata przysadki (GH, ACTH),
demobilizujące przenośnik GLUT-4.
-77-
ROZDIZAŁ V – LIPIDY
1.
Budowa chemiczna, podział i rola tłuszczów prostych i złoŜonych
a) funkcje tłuszczów:
materiał energetyczny
tkanka tłuszczowa jest izolatorem termicznym oraz mechanicznie ochrania delikatne narządy przed
uszkodzeniem
izolacja elektryczna wokół aksonów mielinowych
składniki błon biologicznych
rozpuszczalniki witamin lipofilnych (A, D, E, K, F) oraz EFA
prekursory hormonów (steroidy), cząsteczek aktywnych biologicznie i międzykomórkowych
przekaźników informacji (eikozanoidy)
b) podział lipidów:
proste (KT + alkohol)
tłuszcze właściwe (KT + glicerol) ... oleje płynne
woski (KT + długołańcuchowy alkohol alifatyczny)
złoŜone (KT + alkohol + X)
fosfolipidy (KT + alkohol + {P} + zasada azotowa)
glicerofosfolipidy
sfingofosfolipidy
glikolipidy = glikosfingolipidy (KT + glicerol + sacharyd)
inne
sulfolipidy
aminolipidy
prekursory i poch. lipidów: KT, glicerol, steroidy, alkohole, aldehydy tłuszczowe, ciała ketonowe,
węglowodory, witaminy lipofilne, hormony
lipidy obojętne = glicerydy oraz cholesterol wolny i jego estry
c) kwasy tłuszczowe (KT, ang. fatty acids – FA)
KT dzielimy ogólnie na nasycone i nienasycone; są one nierozgałęzione i posiadają zazwyczaj parzystą
liczbę atomów węgla
kwasy nasycone w niŜszych temperaturach przyjmują formę zygzaka, zaś w wyŜszych dochodzi do
rotacji wokół wiązań podwójnych – dlatego błony biologiczne stają się cieńsze ze wzrostem
temperatury
w kwasach nienasyconych wiązania podwójne dodawane są między istniejącym wiązaniem podwójnym
a karboksylowym atomem węgla, dlatego wyodrębnić moŜna rodziny ω9, ω6 i ω3; naturalne kwasy
nienasycone występują zazwyczaj w konfiguracji cis (kształt litery L o rozwarciu 120o)
n
3
2
1
CH3 ... CH2 CH2 COOH
ω
β
α
oznaczenie połoŜenia wiązania podwójnego: 18:1,9; ∆9 18:1; ω9 C18:1; n-9, 18:1
kwasy o konfiguracji trans występują w margarynie, wytwarzanej przez utwardzanie tłuszczów
roślinnych oraz w tłuszczach przeŜuwaczy
w wielonienasyconych KT zwiększa się ilość moŜliwych konfiguracji, np. C20:4 – forma słupa lub
litery U
temperatura topnienia KT wzrasta wraz z długością łańcucha, zaś maleje ze wzrostem nienasycenia
cząsteczki; regulacja Tt i związanego z tym składu KT zachodzi zaleŜnie od funkcji – lipidy zapasowe
są nasycone, składniki błon juŜ bardziej płynne, najbardziej zaś lipidy tkanek naraŜonych na chłód
d)
triglicerydy (TG) = triacyloglicerole (TAG)
TAG są główną formą zapasową KT
przyłączone do glicerolu KT zazwyczaj róŜnią się od siebie
z trójwymiarowego punktu widzenia atomy C1 i C3 glicerolu róŜnią się między sobą i są odmiennie
rozpoznawane przez enzymy
w syntezie i hydrolizie TAG biorą udział monoacyloglicerole (MAG) i diacyloglicerole (DAG)
-78-
e) fosfolipidy
głównym związkiem pośrednim syntezy TAG i fosfoglicerydów jest kwas fosfatydowy (KF: glicerol +
KT1 + KT2 + {P}); w pozycji sn-1 znajduje się zazwyczaj rodnik nasycony, zaś w sn-2 – rodnik
nienasycony
fosfoglicerydy występujące w organizmie ludzkim:
fosfatydyloglicerol (KF + glicerol)
bisfosfatydyloglicerol = kardiolipina (KF + glicerol + KF) – syntetyzowany w mitochondriach z
fosfatydyloglicerolu, składnik wewnętrznej błony mitochondrialnej, odpowiedzialny w duŜym stopniu
za jej nieprzepuszczalność dla jonów
fosfatydyloetanoloamina = kefalina (KF + etanoloamina)
fosfatydylocholina = lecytyna (KF + cholina) – istotny składnik błon biologicznych, pełniący rolę w
przewodnictwie nerwowym; ponadto stanowi zapas grup metylowych oraz źródło rodników acylowych
do estryfikacji cholesterolu; dipalmitoilolecytyna jest składnikiem surfaktantu płucnego, którego
niedobór manifestuje się zespołem błon szklistych
fosfatydyloseryna (KF + Ser), fosfatydylotreonina (KF + Thr)
fosfatydyloinozytol (PI) (KF + mio-inozytol) + 2{P} → fosfatydyloinozytolo-4,5-bis{P} (PIP2) – rola
w wewnątrzkomórkowym szlaku przekazywania sygnałów
lizofosfolipidy (np. lizolecytyna) zawierają tylko jeden acyl, drugie miejsce pozostaje wolne
plazmalogeny stanowią 10% fosfolipdów mózgu i mięśni, posiadają przy C1 wiązanie eterowe oraz
nienasycony alkohol (np. kwas plazmenowy + etanoloamina → plazmalogen etanoloaminowy =
plazmenyloetanoloamina)
sfingomieliny (ceramid + {P} + cholina; ceramid = sfingozyna + KT połączone wiązaniem amidowym)
f)
glikolipidy
tworzą one sacharydy powierzchni komórki (glikokaliks)
glikosfingolipidy = ceramid + fragment cukrowy
cerebrozydy
glukozyloceramid – tkanki pozanerwowe
galaktozylocerebrozyd – w mózgu i tkance nerwowej
sulfogalaktozylocerebrozyd (sulfatyd) – składnik mieliny
globozydy = ceramid + aminocukier
gangliozydy są pochodnymi glukozyloceramidu zawierającymi kwas sialowy (SA; gł. N-Acneuraminowy = NANA); występują gł. w tkance nerwowej, pełniąc m. in. funkcje receptorowe
GM3: Cer-Glc-Gal-NeuAc
GM1: Cer-Glc-Gal(-NeuAc)-GalNAc-Gal – receptor toksyny cholery w jelicie cienkim
g) steroidy
budowa steroidów opiera się na szkielecie węglowym cyklopentanoperhydrofenantrenu:
pierścienie cykloheksanowe występują w formie krzesłowej
wzajemne ułoŜenie pierścieni: A-B – cis/trans; B-C – trans; C-D – trans (w wyj. glikozydów
nasercowych)
h) poliprenoidy składają się z jednostek izoprenowych (-CH=C(-CH3)-CH=CH-)
np.: koenzym Q (ubichonon), dolichol, witaminy A, E, K, β-karoten, kamfora, kauczuk
2.
Trawienie i wchłanianie lipidów
•
Lipaza językowa (optimum 4 – 4,5) wytwarzana jest przez gruczoły Ebnera na grzbiecie języka (u
człowieka enzym ten nie jest aŜ tak istotny)
W Ŝołądku panują odpowiednie warunki do hydrolizy lipidów – temperatura powoduje ich upłynnienie,
ruchy perystaltyczne wspomagają proces tworzenia emulsji tłuszczowych, lipaza Ŝołądkowa (optimum
4 – 4,5) wraz ze ślinowa trawią TAG do 1,2-DAG i KT. Optymalne pH dla lipaz wynosi 3 – 6. Chętniej
odszczepiane są KT krótsze i nienasycone, dlatego lipidy mleka są najlepszym substratem. KT krótko- i
•
-79-
•
•
•
•
•
•
•
średniołańcuchowe wchłaniane są przez ścianę Ŝołądka do Ŝ. wrotnej, zaś KT długołańcuchowe
rozpuszczają się w kroplach tłuszczowych i wędrują do dwunastnicy.
Wątroba produkuje Ŝółć, która zagęszczana jest w pęcherzyku Ŝółciowym. Składa się z wody (86-97%)
i rozpuszczonych w niej składników stałych: kwasów Ŝółciowych (37%), mucyny i barwników (21%),
soli nieorganicznych (33%), KT (7%) i cholesterolu (2%). śółć powoduje emulgację lipidów i pokrycie
nimi cząstek pokarmu, zobojętnienie treści Ŝołądkowej, wydalanie cholesterolu, kwasów Ŝółciowych i
barwników Ŝółciowych, a takŜe leków, toksyn i metali cięŜkich (Cu, Zn, Hg).
Wraz z Ŝółcią do dwunastnicy wydalany jest sok trzustkowy zawierający lipazę trzustkową
(optimum 8); trypsyna usuwa N-końcowy pentapeptyd (enterostatynę) z prolipazy, dając aktywną
lipazę, hamowaną początkowo przez sole kwasów Ŝółciowych. Kolipaza łączy się z lipazą i fazą
graniczną TAG pokrytych przez sole – po zakotwiczeniu lipazy kolipaza znosi efekt inhibicji soli.
Lipaza odłącza KT z pozycji sn-1 i sn-2, a gł. produktami końcowymi trawienia są 2-MAG, które tylko
w 20% są izomeryzowane i rozkładane.
Esteraza cholesterolowa aktywowana solami kwasów Ŝółciowych rozkłada estry cholesterolu, który
wchłaniany jest w formie wolnej.
Trzustkowa fosfolipaza A2 (PLA2) aktywowana trypsyną i Ca2+ przekształca glicerofosfolipidy w
lizofosfolipidy – detergenty wspomagające emulgację i trawienie tłuszczów.
W jelicie fosfataza (optimum 8,6) odszczepia {P} z glicerofosforanów, zaś zespół fosfolipaz (A1, A2, B,
C, D) rozkłada glicerolofosfolipidy na poszczególne składowe.
KT, 2-MAG i niewielkie ilości 1-MAG dyfundują z fazy olejowej zawiesiny tłuszczowej do miceli
mieszanych i liposomów, które z kolei osiągają rąbek szczoteczkowy śluzówki i ulegają wchłonięciu do
enterocytów. W ścianie jelita 1-MAG ulegają dalszej hydrolizie. 2-MAG wchodzą w szlak
monoacyloglicerolowy i są przekształcane do TAG (resynteza) przy udziale syntetazy acylo-CoA. TAG
zawierające KT o łańcuchach krótkiej i średniej długości mogą być wchłaniane bezpośrednio i
rozkładane w nabłonku. Produkty rozkładu lipidów przekształcane są do acylo-CoA i wykorzystywane
jako substraty do resyntezy TAG. Glicerol z jelita wędruje do krąŜenia wrotnego, zaś pochodzący z
enterocytów ulega przekształceniu do glicerolo-3-{P} i wbudowaniu w TAG. Powstałe w jelicie TAG
stanowią składnik chylomikronów limfy i wędrują przewodem piersiowym do lewego kąta Ŝylnego,
gdzie osiągają łoŜysko Ŝylne. KT krótszy niŜ C10 przechodzą jako FFA do Ŝ. wrotnej, gdyŜ nie zajmuje
się nimi syntaza acylo-CoA.
Poza witaminą D fitosterole nie wchłaniają się ze światła jelita.
•
zaburzenia wchłaniania:
zwłóknienie torbielowate trzustki (mukowiscydoza) → niewydolność egzogenna → stolce tłuszczowe
niedobór kolipazy → niedobór aktywnej lipazy trzustkowej → stolce tłuszczowe (steatorrhoea)
przetoka limfatyczno – moczowa → chyluria (wydalanie: „mlecznego moczu”) → karmienie KT < C12
niepr. połączenie naczyń limfatycznych jamy brzusznej z jamą opłucnową → chylothorax → karmienie
KT < C12
kamica Ŝółciowa
Tworzenie kamieni Ŝółciowych spowodowane jest niedostateczną rozpuszczalnością cholesterolu w
Ŝółci. Rozpuszczalność ta zaleŜy od stosunku stęŜeń cholesterolu, fosfatydylocholiny i soli kwasów
Ŝółciowych (prawidłowo: 5% : 15% : 80%) oraz od zawartości wody. U chorych z kamica ma miejsce
spadek aktywności 7α-hydroksylazy i w efekcie zmniejszenie puli kwasów Ŝółciowych w krąŜeniu
jelitowo – wątrobowym oraz wzrost syntezy cholesterolu przez hepatocyty, co z kolei powoduje
przesycenie Ŝółci cholesterolem. Sprzyjający czynnik, np. infekcja bakteryjna, inicjuje powstanie jąder
krystalizacji, które nie wydalone wzrastają do znacznych rozmiarów. Powstałe kamienie usuwa się
operacyjnie (wraz z pęcherzykiem) lub rozbija ultradźwiękami. Litogenność Ŝółci zmniejsza kwas
chenodeoksycholowy przez hamowanie syntezy cholesterolu na etapie HMG-CoA, natomiast
zwiększają niektóre leki, np. fibraty.
-80-
3.
Transport lipidów w chłonce i w osoczu
a)
budowa lipoprotein
•
skład lipidów osocza:
TAG
1,6
45
mM
% KT
fosfolipidy
3,1
35
ch. całk.
5,2
15
ch. wolny
1,4
-
WKT
0,4
5
•
Problem transportu niepolarnych lipidów (TAG i estrów cholesterolu) w polarnym środowisku osocza
rozwiązany został przez ich związanie z lipidami amfipatycznymi (fosfolipidami i cholesterolem) oraz z
białkami. W ten sposób powstają lipoproteiny (Lp). Lp składa się z lipidowego rdzenia (TAG i estry
cholesterolu), warstwy powierzchownej (fosfolipidy i wolny chlesterol) oraz z apolipoproteiny (apoLp)
o zróŜnicowanej mobilności. ApoLp spełniają róŜne funkcje:
mogą stanowić część struktury Lp, np. apoB,
mogą stanowić kofaktory enzymów, np. A I dla LCAT, C II dla LPL,
mogą być ligandami dla receptorów Lp, np. B100 + E ↔ rec. LDL, A I ↔ HDL.
• Podziału lipoprotein dokonuje się za względu na ich gęstość oraz umiejscowienie elekktroforetyczne:
klasa
chylomikrony
VLDL
IDL
LDL
HDL
VHDL
FFA
połoŜenie
0 (bezruch)
pre-β
gł. składnik
β
α
cholesterol
fosfolipidy
Φ
ρ
% białek
% lipidów
↑
↑
↑
↓
↓
↓
↓
↓
↓
↑
↑
↑
TAG
gł. apoLp
B48
B100
B100
A
albumina
Φ – średnica; ρ – gęstość
b) transport lipidów w lipoproteinach osocza
•
•
•
•
•
•
•
Lipoliza TAG i działanie lipazy Lp (LPL) są źródłem WKT, które łączą się z albuminami osocza. Ich
ilość waha się w szerokich granicach: w stanie poabsorpcyjnym wynosi 0,5 mM, w głodzeniu 0,8 mM,
a w cukrzycy nawet 2 mM. WKT są najbardziej aktywną metabolicznie frakcją lipidów osocza. Ulegają
one utlenianiu lub estryfikacji – stan odŜywienia ma niewielki wpływ na frakcję WKT pobieranych
przez tkanki, wpływa natomiast na proporcję kwasów utlenianych do estryfikowanych.
W pobliŜu błony kompleks albumin z KT dysocjuje i te ostatnie wiązane są przez błonowe białko
wiąŜące KT. Następnie zachodzi kotransport z Na+ oraz wiązanie przez wewnątrzkomórkowe białko
wiąŜące KT.
TAG eksportowane są przez jelito i wątrobę – jedyne narządy, skąd lipidy wędrują jako Lp. Na RER
produkowana jest apoB, która w SER ulega połączeniu z lipidem, a w aparacie Golgiego glikozylacji,
po czym Lp usuwana jest z komórki na zasadzie odwróconej pinocytozy.
W jelicie TAG pakowane są w chylomikrony, które – ze względu na rozmiary – nie mogą przejść przez
środbłonek naczyniowy, wobec czego usuwane są do przestrzeni między enterocytami, a stamtąd do
układu limfatycznego jelita. Wraz z chłonką dostają się do przewodu piersiowego, aby w lewym kącie
Ŝylnym dostać się do układu krwionośnego.
Wątroba wysyła TAG w postaci VLDL, które przechodzą przez przestrzeń okołozatokową (Dissego) do
zatok wątrobowych, a stąd przez okienka śródbłonka do krwi.
Gdy chylomikrony i VLDL znajdą się juŜ w układzie krąŜenia, przenoszone są na nie apoLp z HDL –
apoC i apoE.
TAG chylomikronów i VLDL hydrolizowane są przez LPL zlokalizowaną w ścianach włośniczek,
zakotwiczoną przez siarczan heparanu. LPL występuje w sercu, tkance tłuszczowej, śledzionie, płucach,
rdzeniu nerki, aorcie, przeponie, gruczole sutkowym i wątrobie noworodka. Ilość LPL zwiększa się po
podaniu heparyny. Kofaktorami hydrolizy są fosfolipidy i apoC II.
-81-
•
•
•
•
Niewielka ilość KT wraca do krwiobiegu, aby związać się z albuminą, większość zaś wnika do tkanek.
KM tkanki tłuszczowej = 10 x KM serca, dlatego podczas głodzenia zachodzi redystrybucja pobierania
KT z tkanki tłuszczowej na korzyść serca. Podobna sytuacja ma miejsce w gruczole sutkowym podczas
laktacji.
LPL pozbawia chylomikrony 90% TAG i apoC, która wraca do HDL, ale nie apoE, która towarzyszy
chylomikronom resztkowym (remnantom chylomikronów). Podobnie VLDL przechodzi w remnenty
VLDL, czyli IDL. Oba typy remnantów wychwytywane są przez hepatocyty w procesie endocytozy z
udziałem receptorów (receptor B100 + E, LRP = receptor α2-makroglobuliny). Lipaza wątrobowa działa
jako ligand Lp oraz uczestniczy w hydrolizie jej TAG oraz fosfolipidów. IDL nie wychwycone przez
wątrobę ulegają przekształceniu w LDL (przenoszące gł. cholesterol).
LDL ulegają degradacji w wątrobie (70%) oraz w tkankach pozawątrobowych (30%) – wychwytywane
są przez receptor LDL (B100 + E). W apoB48 brakuje C-domeny apoB100, czyli właściwego ligandu dla
receptora, z powodu procesu redagowania mRNA w jelicie (transkrypcji do apoLp ulega tylko 48%
genu – por. punkt VIII-3-d).
Receptor LDL jest białkiem transbłonowym o masie 115 kD, posiadającym 5 domen:
1: N-koniec – wiąŜe się z sekwencją 7 x 40 (↑ Cys) → ujemnie naładowane boczne łańcuchy oddziałują
z dodatnio naładowaną apoB100; po endocytozie protonacja Gln i Asn w kwaśnych endosomach uwalnia
LDL od receptora
2: homologiczna do części EGF, zawiera 2 łańcuchy oligosacharydowe (N)
3: duŜo reszt Ser/Thr z przyłączonymi sacharydami (O) – te i zw. z glikoforyną funkcjonują jako
podpórki – odstają od błony, dzięki czemu domena 1. jest dostępna dla LDL
4: transbłonowa
5: cytozolowa, kontaktuje oddziaływanie receptora z dołkami opłaszczonymi → reguluje endocytozę
•
HDL syntetyzowane są w wątrobie i w jelicie w połączeniu z apoA I, po czym w osoczu dołączane są
apoC i apoE (HDL stanowi ich skład). Nowo wytworzona HDL ma kształt dyskoidalny, zawiera
dwuwarstwę fosfolipidową, wolny cholesterol, apoA I i LCAT (acylotransferaza lecytyna : cholesterol).
LCAT przenosi acyle z fosfolipidów (lecytyna) na cholesterol, dając estry cholesterolu i lizolecytynę; te
pierwsze wnikają do wnętrza, zaś lizolecytyna łączy się z albuminą osocza. W ten sposób HDL3 staje
się pseudomicelarne i przekształca w HDL2, które znów ulega lipazie wątrobowej i powraca jako HDL3,
dodatkowo oddzielana jest wolna apoA I, która tworzy pre-β-HDL lub jest rozkładana w nerce.
Aktywność lipazy wątrobowej zwiększają androgeny, a zmniejszają estrogeny, dlatego kobiety
posiadają więcej HDL2.
c)
zaburzenia transportu lipoproteinowego
•
•
hipolipoproteinemie
abetalipoproteinemia → kropelki lipidów gromadzą się w ścianie jelita i wątrobie
rodzinna hipobetlipoproteinemia → ↓ LDL → długowieczność
rodzinny niedobór α-lipoproteiny → ch. wyspy Tanger / ch. rybiego oka, niedobory apoA I
hiperlipoproteinemie
rodzinny brak LPL (I) – powolne oczyszczanie osocza
rodzinna hipercholestrolemia (II) → wysoka aterogenność (szybsza miaŜdŜyca)
ch. Walmana – spichrzanie cholesterolu
rodzinna hiperbetalipoproteinemia (III) – defekt apoE, Ŝółtaki, aterogenność
rodzinna hipertriacyloglicerolemia (IV) → aterogenność, NIDDM, otyłość
rodzinna hiperlipoproteinemia (V) → ↑ TAG i cholesterol
rodzinna hiperalfalipoproteinemia → ↑ HDL → długowieczność
niedobór LPL → zwyrodnienie tłuszczowe ścian naczyń
rodzinny niedobór LCAT → HDL rulonowe, obecna Lp X
rodzinny nadmiar Lp α → ↓ fibrynoliza, aterogenność
•
apoE występuje w trzech izoformach (E2, E3, E4) – pacjenci homozygotyczni względem genu E4
wykazują kilkakrotne zwiększenie zachorowalności na ch. Alzheimera, gdyŜ apoE4 łatwiej wiąŜe się do
β-amyloidu płytek zwyrodnieniowych układu nerwowego.
-82-
d) rola wątroby w metabolizmie lipidów (patrz równieŜ punkt VII-5-b)
produkcja Ŝółci ułatwiającej trawienie i wchłanianie lipidów z jelita
aktywne układy enzymatyczne syntetyzujące i utleniające KT, syntetyzujące TAG i fosfolipidy
przekształcanie KT w ciała ketonowe (ketogeneza)
integracja metabolizmu Lp osocza
Wzrost syntezy TAG i wydzielanie VLDL występuje w stanie sytości, przy karmieniu węglowodanami
(zwł. fruktozą), przy wysokim poziomie WKT, przy spoŜywaniu etanolu oraz przy wzroście stosunku
insulina : glukagon.
Mechanizm zmian patomorfologicznych wątroby:
marskość ← włóknienie ← stłuszczenie (nagromadzenie lipidów gł. TAG) ←
← typ I: ← ↑ WKT ← mobilizacja z adipocytów, hydroliza TAG przez LPL, ↓ insulina (← głodzenie)
← typ II: metaboliczny blok syntezy Lp
← blok syntezy apoLp
← puromycyna, etionina (→ ↓ ATP), CCl4, CHCl3, P, Pb, As
← ↓ synteza VLDL ← ↓ synteza białka ← głodzenie
← blok łączenia apoLp z lipidami ← stres oksydacyjny ← CCl4
← niewydolność wydzielnicza
← stres oksydacyjny ← CCl4
← zab. glikozylacji ← kwas orotowy
← ↓ fosfolipidy ← ↓ EFA, ↑ cholesterol, ↓ cholina (cz. lipotropowy) ← ↓ Met (donor grupy metylowej)
Metabolizm etanolu:
I: etanol + NAD+ →dehydrogenaza alkoholowa→ aldehyd octowy + NADH
aldehyd octowy →dehydrogenaza aldehydowa→ kwas octowy → AcCoA
NADH → ↓ utlenianie i ↑ estryfikacja KT → stłuszczenie wątroby
→ ↑ lipogeneza, ↑ biosynteza cholesterolu
→ hiperlaktocydemia → ↓ wydalanie moczanów
→ hamowanie dehydrogeazy jabłczanowej → hamowanie cyklu Krebsa (TCA)
II: etanol + NADPH + O2 →MEOS→ aldehyd octowy + NADP+ + 2 H2O
→ adaptacja do alkoholizmu
→ konkurencja z lekami (np. barbiturany)
III: katalaza (niewielki udział)
-83-
4.
Tkanka tłuszczowa – rola w metabolizmie lipidów
a)
metabolizm adipocytów
•
Tkanka tłuszczowa jest głównym magazynem TAG w organizmie, których ilość jest wypadkową
szybkości lipogenezy i β-oksydacji.
Jednym z substratów do syntezy TAG jest gligerolo-3-{P}, który moŜe powstawać dzięki kinazie
glicerolowej. Ta jednak wykazuje niewielką aktywność, wobec czego źródłem jest glukoza,
przekształcana w procesie glikolizy w {P}-hydroksyaceton, redukowany następnie przez
dehydrogenazę glicerolo-3-{P} do glicerolo-3-{P}. Glukoza moŜe równieŜ: zasilać TCA (→ CO2), PPP
(→ NADPH), być przekształcona w AcCoA i dalej w acylo-CoA.
Do adipocytów docierają TAG z Lp. Po rozkładzie przez LPL glicerol wraca do osocza i jest
metabolizowany przez kinazę glicerolową w wątrobie lub nerkach, zaś KT tworzą pulę WKT2 o
krótkim T1/2.
TAG adipocytów ulegają lipolizie przez lipazę wraŜliwą na hormony ((+): ACTH, TSH, ADH, A/NA,
glukagon, (-): insulina, PGE1, kwas nikotynowy) do glicerolu, usuwanego do osocza oraz do KT
tworzących pulę WKT1. Obie pule WKT dostarczają substratu do syntezy acylo-CoA.
Gdy estryfikacja nie równowaŜy lipolizy, WKT gromadzą się i przenikają do osocza, łącząc się z
albuminami.
•
•
•
•
-84-
b) regulacja
•
•
•
c)
Procesy zachodzące w tkance tłuszczowej podlegają ścisłe regulacji hormonalnej.
Insulina mobilizuje przenośnik GLUT-4 na powierzchnię komórki, wzmaga aktywność dehydrogenazy
pirogronianowej, karboksylazy AcCoA (ACC) i acylotransferazy glicerolo-3-{P} oraz hamuje
aktywność lipazy wraŜliwej na hormony, przez co wzmaga metabolizm i usuwa glukozę w osocza oraz
hamuje uwalnianie WKT do krwi.
Lipolizę pobudzają: A/NA, glukagon, ACTH, α/β-MSH, TSH, GH, ADH, KS, T3/4, metyloksantyny.
Brunatna tkanka tłuszczowa uczestniczy w termogenezie. Występuje u zwierząt hibernujących i
noworodków ludzkich. Jej brązowy kolor pochodzi od nagromadzenia cytochromów w mitochondriach.
Zawiera dodatkowo białko termogeninę (hamowaną przez puryny). Pod wpływem pobudzenia układu
współczulnego wydzielana NA zwiększa poziom cAMP, przez co lipaza hormonozaleŜna staje się
aktywna i hydrolizuje TAG do WKT. Te odblokowują termogeninę oraz dostarczają acylo-CoA,
przenoszonego następnie do wnętrza mitochondriów, utlenianego w szlaku β-oksydacji i
dostarczającego równowaŜników redukujących, które z kolei wykorzystywane są przez łańcuch
oddechowy do tworzenia gradientu pH. Normalnie słuŜy on do pracy syntazy ATP, jednak termogenina
wykorzystuje gradient do „jałowych cykli”, podczas których energia nie jest gromadzona w
wysokoenergetycznych wiązaniach, lecz rozpraszana, podnosząc temperaturę tkanki, a przez to całego
organizmu.
-85-
5.
Utlenianie kwasów tłuszczowych
a)
lokalizacja komórkowa i tkankowa
Utlenianie KT zachodzi w matrix mitochondrialnej. Proces ten zachodzi gł. w wątrobie, chociaŜ
większość tkanek organizmu jest w tanie przeprowadzić pełny szlak oksydacji KT.
b) aktywacja i transport KT do mitochondrium
Utlenianie KT poprzedzone jest ich aktywacją, polegającą na przekształceniu w bezpośredni substrat
dla β-oksydacji. Jest to jedyna reakcja szlaku wymagająca ATP.
KT + ATP + CoA →syntetaza acylo-CoA (tiokinaza)→ acylo-CoA + AMP + PPi
PPi + H2O →pirofosfataza nieorganiczna→ 2 {P}
Dzięki obecności pirofosfatazy nieorganicznej liczba traconych wysokoenergetycznych wiązań fosforowych
wzrasta do 2 i z tego powodu reakcja zachodzi do końca. Syntetazy acylo-CoA występują na ER, w
peroksysomach, na zewnętrznej błonie mitochondrialnej i w jej matrix.
Karnityna syntetyzowana jest z Lys i Met w wątrobie i w nerkach, zaś największa jej ilość występuje w
mięśniach. NiŜsze KT mogą być aktywowane i utleniane bez jej udziału, w przeciwieństwie do wyŜszych.
c)
β-oksydacja nasyconych KT
Proces ten zachodzi w matrix mitochondrialnej przy udziale kompleksu enzymatycznego oksydazy KT,
umiejscowionego w pobliŜu łańcucha oddechowego. ZaleŜnie od długości KT jest on utleniany przez
swoiste dla siebie enzymy
• przebieg:
dehydrogenacja – powstaje ∆2-trans-enoilo-CoA
R-CH2-CH2-CO~SCoA + FAD →dehydrogenaza acylo-CoA→ R-CH=CH-CO~SCoA + FADH2
hydratacja – powstaje L(+)-3-hydroksyacylo-CoA
R-CH=CH-CO~SCoA + H2O →hydrataza ∆2-enoilo-CoA→ R-CH(OH)-CH2-CO~SCoA
dehydrogenacja – powstaje 3-ketoacylo-CoA
R-CH(OH)-CH2-CO~SCoA + NAD+ →dehydrogenaza L(+)-3-hydroksyacylo-CoA→
→ R-CO-CH2-CO~SCoA + NADH + H+
rozcięcie – powstaje acylo-CoA skrócony o C2 i AcCoA
R-CO-CH2-CO~SCoA + CoA-SH →tiolaza 3-ketoacylo-CoA (acetylotransferaza acetoacetylo-CoA) →
→ R-CO~SCoA + CH3-CO~S-CoA
• bilans energetyczny:
aktywacja:
- 2 ATP
FADH2
+ 2 ATP x (n-1)
NADH + H+
+ 3 ATP x (n-1)
AcCoA
+ 12 ATP x n
Dla kwasu o C2n atomach węgla zysk energetyczny wynosi 12 n + 5 (n – 1) = 17 n – 7 ATP
np. dla kwasu palmitynowego (C16) mamy 128 ATP.
-86-
•
KT o nieparzystej liczbie atomów węgla są utleniane w podobny sposób, aŜ powstanie z nich
trójwęglowa reszta propionylo-CoA. Ten ulega przekształceniu do sukcynylo-CoA, który
metabolizowany jest w cyklu Krebsa (patrz punkt IV-4-b). Reszta propionylowa jest jedynym
glukogennym fragmentem nieparzystych KT.
•
W peroksysomach zachodzi zmodyfikowana β-oksydacja, gdyŜ obok AcCoA powstaje H2O2 na etapie
dehydrogenazy z flawoproteiną, który następnie rozkładany jest przez katalazę. Sytuacja ta nie jest
związana z fosforylacją i produkcją ATP, lecz ułatwia działanie na KT o bardzo długich łańcuchach
(≥ C20). Peroksysomy nie utleniają acylo-CoA krótszych niŜ C8.
•
α-oksydacja zachodzi w mózgu i polega na stopniowym usuwaniu po jednym atomie węgla, począwszy
od C1. Reakcja ta nie wymaga CoA, nie powstają teŜ w niej wiązania makroergiczne.
•
ω-oksydacja zachodzi w ER przy udziale CYP. Końcowa reszta metylowa KT (CH3-) utleniana jest
kolejno do pochodnej alkoholowej (-CH2OH), a następnie karboksylowej (-COOH). Powstały kwas
dwukarboksylowy ulega oksydacji do kwasu adypinowego (C6) lub korkowego (C8), które są wydalane
z moczem.
d) oksydacja nienasyconych KT
•
•
ZaleŜnie od połoŜenia wiązania nienasyconego odpowiednie acylo-CoA degradowane są w szlaku βoksydacji do momentu powstania ∆3-cis-acylo-CoA lub ∆4-cis-acylo-CoA.
W pierwszym przypadku pochodna ∆3 ulega izomeryzacji przez izomerazę ∆3-cis/trans→∆2-transenoilo-CoA do ∆2-trans-enoilo-CoA, po czym ulega dalszemu utlenianiu.
KaŜdy ∆4-cis-acylo-CoA – zarówno powstający z utleniania pochodnej ∆3, jak i wchodzący do szlaku
bocznie, jest poddawany dehydrogenazie acylo-CoA i tak powstaje ∆2-trans-∆4-cis-dienoilo-CoA. Ten
ulega działaniu NADPH-zaleŜnej reduktazy ∆2-trans-∆4-cis-dienoilo-CoA, w wyniku czego powstaje
∆3-trans-enoilo-CoA, na który działa znów izomeraza ∆3-cis/trans→∆2-trans-enoilo-CoA, dając ∆2trans-enoilo-CoA, który utleniany jest następnie w klasycznym szlaku β-oksydacji.
e)
ketogeneza
•
Powstawanie ciał ketonowych u człowieka ma miejsce w wątrobie w warunkach znacznego nasilenia βoksydacji. Powoduje to odwrócenie reakcji katalizowanej przez tiolazę, czyli kondensację 2 AcCoA → acetoacetylo-CoA. Do niego przyłącza się jeszcze jedna cząsteczka AcCoA, i w reakcji katalizowanej przez syntazę
HMG-CoA (mit) powstaje 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo-CoA (HMG-CoA). Następnie liaza HMG-CoA (mit)
odłącza AcCoA, pozostawiając acetooctan, który pozostaje w równowadze z D(-)-β-hydroksymaślanem dzięki
obecności dehydrogenazy D(-)-hydroksymaślanowej (mit); stan tej równowagi zaleŜy od stosunku
[NAD+]/[NADH]. Acetooctan ulega równieŜ spontanicznej dekarboksylacji do acetonu. Wymienione trzy
związki, określane łącznie jako ciała ketonowe, transportowane są z krwią, gdzie ich stęŜenie nie powinno
przekraczać 0,2 mM. Z osoczem wędrują one do płuc, gdzie lotny aceton jest wydychany (zapach acetonu z ust
jest jednym z objawów cukrzycy), a takŜe do nerek, gdzie kilka % usuwanych jest z moczem. Ketonemia
(nadmiar ciał ketonowych w osoczu) spowodowany jest raczej zwiększonym ich wytwarzaniem w wątrobie, niŜ
zmniejszoną utylizacją przez tkanki pozawątrobowe. Dla tkanek pozawątrobowych ciała ketonowe stanowią
bowiem substraty oddechowe – β-hydroksymaślan przekształcany jest do acetooctanu, który z kolei dzięki
transferazie CoA sukcynylo-CoA : acetooctan łączy się z AcCoA. Powstały acetoacetylo-CoA ulega działaniu
tiolazy, dając 2 cząsteczki AcCoA, które utleniane są w cyklu Krebsa.
Regulacja ketogenezy opiera się na trzech zasadniczych przemianach:
po pierwsze: ketogeneza występuje przy zwiększonym utlenianiu KT, pochodzącym z lipolizy TAG w
adipocytach, regulują ją zatem czynniki mobilizujące WKT,
po drugie: WKT oprócz utleniania mogą być estryfikowane, przy czym decydującą rolę odgrywa CPT I
– zmniejsza ona swoją aktywność w stanie sytości pod wpływem malonylo-CoA. Wówczas
pochłaniane przez hepatocyty WKT są estryfikowane i eksportowane jako VLDL. W okresie głodzenia
jest odwrotnie:↑ WKT → ↑ acylo-CoA → ↓ ACC → ↓ malonylo-CoA → ↑ CPT I.
po trzecie: proporcja AcCoA ulegającego ketogenezie i oksydacji jest tak regulowana, aby całkowita
powstała energia nie wahała się zbytnio w czasie. Ketogeneza pozwala wątrobie utleniać zwiększające
się ilości KT w układzie ściśle skojarzonych oksydacyjnych fosforylacji bez zwiększania całkowitego
wydatku energetycznego.
-87-
f)
zaburzenia oksydacji KT
niedobór karnityny
← wcześniaki, hemodializa, acyduria spowodowana kwasami organicznymi
→ napady hipoglikemii, hiperlipidemia i osłabienie mięśni (objawy podobne do zespołu Reye’a)
niedobór CPT I – dotyczy wątroby; → hipoglikemia
niedobór CPT II – dotyczy gł. mięśni; → osłabienie, martwica, mioglobinuria
hamowanie CPT
← hipoglikemizujący efekt leków p/cukrzycowych – poch. sulfonylomocznika (tolbutamid, gliburyd)
ostre ciąŜowe stłuszczenie wątroby
← deficyt dehydrogenazy długołańcuchowych β-hydroksyacylo-CoA
niedobór liazy HMG-CoA → zab. ketogenezy i degradacji leucyny
jamajska choroba wymiotna – hipoglicyna hamuje oksydację
acyduria dwukarboksylowa ← brak dehydrogenazy dla KT o łańcuchach średniej długości
ch. Refsuma ← nagromadzenie kwasu fitanowego z fitolu
zespół Zellwegera (mózgowo – wątrobowo – nerkowy)
← brak peroksysmów w tkankach
→ gromadzenie w mózgu wielonienasyconych długołańcuchowych KT (C26-C38)
→ upośledzenie syntezy kwasów Ŝółciowych i lipidów eterowych (plazmalogenów)
ketoza (ketonemia i następowa ketonuria) → moŜe spowodować kwasicę ketonową, co ma miejsce np.
w cukrzycy
6.
Lipogeneza – synteza kwasów tłuszczowych
a)
lokalizacja i transport substratów
•
Enzymy biosyntezy KT zlokalizowane są w cytozolu, zaś układ elongacji łańcucha na ER hepatocytów.
Lipogeneza zachodzi w wątrobie, nerce, mózgu, płucach, gruczole sutkowym i adipocytach.
AcCoA powstały z węglowodanów wskutek wewnątrzmitochondrialnego utleniania pirogronianu nie
moŜe swobodnie przechodzić do cytozolu, by dać się przekształcić w KT. AcCoA kondensuje więc ze
szczawiooctanem w cytrynian, który ulega antyportowi z jabłczanem i OH- do przestrzeni
pozamitochondrialnej; tu dzięki ATP, CoA i liazie ATP : cytrynianowej ulega przekształceniu w
AcCoA, który moŜe ulegać karboksylacji przez ACC do malonylo-CoA i budować KT. Pozostały
szczawiooctan moŜe przejść w jabłczan dzięki NADH-zaleŜnej dehydrogenazie jabłczanowej, po czym
następuje generacja NADPH przez „enzym jabłczanowy”. Jabłczan moŜe równieŜ wniknąć do
mitochondrium.
•
b) przebieg lipogenezy
•
Pierwszym etapem lipogenezy jest karboksylacja AcCoA katalizowana przez kompleks enzymatyczny,
złoŜony m. in. z biotyny (wit. H) i jej karboksylazy, białka nośnikowego karboksybiotyny,
transkarboksylazy oraz allosterycznego miejsca regulatorowego. Donorem CO2 jest HCO3-.
AcCoA + HCO3- + ATP →ACC→ malonylo-CoA + ADP + Pi
•
U człowieka kompleks syntazy KT jest homodimerem i tylko w takiej formie wykazuje aktywność.
KaŜdy monomer jest pojedynczym polipeptydem, kodowany przez jeden gen, co zapewnia duŜą
wydajność i brak interferencji. Monomery łączą się mostkiem dwusiarczkowym obecnym między 4’{P}-panteteiną białka przenoszącego acyl (ACP), a cysteiną syntazy 3-ketoacylowej (połoŜenie 69).
Kompleks wykazuje 7 aktywności enzymatycznych: transacylaza acetylowa, transacylaza malonylowa,
syntaza 3-ketoacylowa, reduktaza 3-ketoacylowa, hydrataza, reduktaza enoilowa oraz tioesteraza.
Kolejność reakcji:
połączenie AcCoA z Cys-HS przez transacylazę acetylową
połączenie malonylo-CoA z grupą SH 4’-{P}-panteteiny przez transacylazę malonylową; wytworzenie
acetylo(acylo)-malonylo-enzymu
atak grupy acylowej na grupę metylenową reszty malonylowej katalizowany przez syntazę 3ketoacylową oraz uwolnienie CO2, dzięki czemu reakcja zachodzi do końca; powstanie 3-ketoacyloenzymu = acetoacetylo-enzymu
redukcja grupy 3-ketoacylowej przez reduktazę 3-ketoacylową
-88-
dehydratacja grupy 3-hydroksyacylowej przez hydratazę
redukcja wiązania nienasyconego przez reduktazę enoilową; utworzenie nasyconego acylo-S-enzymu
połączenie malonylo-CoA z grupą HS 4’-{P}-panteteiny i wyparcie reszty acylowej na miejsce
połączenia z Cys-HS
sześciokrotne powtórzenie procesu → wytworzenie rodnika palmitylowego (C16)
hydroliza do czystego enzymu i palmitynianu przez tioesterazę = deacylazę (w gruczole sutkowym
enzym ten występuje w kilku formach, odpowiednio dla C8, C10 i C12)
•
Sumaryczna reakcja:
CH3-CO~SCoA + 7 HOOC-CH2-CO~SCoA + 14 (NADPH + H+) →
→ CH3-(CH2)14-COOH + 7 CO2 + 6 H2O + 8 CoA-SH + 14 NADP+
•
Inicjatory reakcji:
standardowy: AcCoA
w gruczole sutkowym i wątrobie: butyrylo-CoA
dla nieparzystych KT: propionylo-CoA
•
Źródła NADPH:
PPP – wątroba, adipocyty, gruczoł sutkowy,
„enzym jabłczanowy” = dekarboksylująca dehydrogenaza jabłczanowa
pozamitochondrialna dehydrogenaza cytrynianowa
•
Otrzymanie KT dłuŜszych niŜ C16 moŜliwe jest dzięki mikrosomalnemu układowi elongazy KT. Do
reakcji wchodzi nasycony lub nienasycony KT ≥ C10, który aktywowany jest do acylo-CoA. Ten łączy
się z malonylo-CoA dzięki syntetazie 3-ketoacylo-CoA. Powstały produkt ulega swoistej reduktazie,
hydratazie oraz reduktazie 2,3-enoiloacylo-CoA. Ostatecznie powstaje łańcuch wydłuŜony o C2. W
mózgu elongacja ulega przyspieszeniu podczas mielinizacji, aby dostarczyć KT C22 i C24 dla
sfingolipidów. Głodzenie i cukrzyca hamują elongację. Istnieje równieŜ mniej wydajny
mitochondrialny układ elongazy wykorzystujący AcCoA.
•
Anaboliczną fazę cyklu Ŝywieniowego stanowi m. in. przekształcanie w tłuszcz nadmiaru glukozy,
pirogronianu, mleczanu i AcCoA. Głównym czynnikiem regulującym aktywność lipogenezy jest stan
odŜywienia organizmu – proces ulega zwolnieniu przy głodówce, diecie tłuszczowej i niedoborze
insuliny (np. w przebiegu cukrzycy). Lipogeneza zaleŜy równieŜ odwrotnie proporcjonalnie od stęŜenia
WKT w osoczu. Fruktoza wzmaga lipogenezę przez ominięcie regulacji glikolizy na poziomie PFK-1;
dostarcza przez to zarówno substratu do syntezy KT, jak i glicerolu do ich estryfikacji.
•
Regulacja lipogenezy występuje w formie krótkoterminowej – jako modyfikacje kowalencyjne i
allosteryczne oraz w formie długoterminowej kontroli adapatacyjnej – przez modyfikację ekspresji
genów.
-89-
c)
synteza nienasyconych KT
•
MoŜliwe jest wstawianie wiązań podwójnych do KT w pozycjach ∆4,5,6,9, lecz nie dalej (zdolność tą
posiadają rośliny, co związane jest z syntezą EFA).
Jednonienasycone KT otrzymywane są z odpowiednich acyli nasyconych przez mikrosomalny układ
∆9-desaturazy (wątroba i inne narządy) złoŜony z cytochromu b5, reduktazy NADPH – cytochrom b5
oraz desaturazy z Ŝelazem niehemowym wraŜliwym na CN-.
•
palmitoilo-CoA + O2 + NADH + H+ →∆9-desaturaza→ palmitooleilo-CoA + 2 H2O + NAD+
steareilo-CoA + O2 + NADH + H+ →∆9-desaturaza→ oleilo-CoA + 2 H2O + NAD+
•
Dodatkowe wiązania podwójne wprowadzane są między istniejące juŜ wiązanie nienasycone (∆9) oraz
atom C1 przez układ ∆5-desaturazy i elongazy. W ten sposób moŜna otrzymać kwas arachidonowy z αlinolenowego, dzięki czemu nie jest on niezbędny w poŜywieniu. Aktywność tego układu zmniejszają:
A, glukagon i deficyt insuliny.
α-linolenoilo-CoA →∆5-desaturaza→ γ-linolenoilo-CoA →elongaza→
→ dihomo-γ-linolenoilo-CoA →∆5-desaturaza→ arachidonoilo-CoA
•
Egzogenne kwasy tłuszczowe (EFA, wit. F) potrzebne są do tworzenia eikozanoidów oraz stanowią
strukturalne lipidy komórki – kwas arachidonowy stanowi do 10 % KT fosfolipidów, zaś DHA
występuje w jądrze, spermie, korze mózgowej i siatkówce, gdzie zwiększa płynność lipidów
wspomagającą działanie rodopsyny (w przypadku niedoboru rozwija się retinitis pigmentosa).
Generalnie deficyt EFA powoduje zmiany skórne i zaburzenia transportu lipidów. Zaburzenia
metabolizmu EFA występują przy zwłóknieniu torbielowatym trzustki (mukowiscydoza),
acrodermatitis enteropathica, zespole wątrobowo – nerkowym, chorobie Crohna, marskości wątroby,
zespole Reye’a, zespole Zellwegera oraz alkoholizmie.
d) metabolizm eikozanoidów (patrz równieŜ punkt VII-1-b)
PG – odkryte w nasieniu (stąd nazwa), hormony miejscowe (autakoidy) biorące udział m. in. w rozwoju
stanu zapalnego
PGI – produkowana przez śródbłonek, hamuje skurcz naczyń i agregację trombocytów
TX – produkowane przez trombocyty, nasilają skurcz naczyń i agregację trombocytów
LT – zw. z leukocytami, silne rozszerzenie naczyń i skurcz oskrzeli
-90-
7.
Synteza trójglicerydów
a)
lokalizacja tkankowa i komórkowa
Kinaza glicerolowa występuje w wątrobie, nerkach, jelicie, brunatnej tkance tłuszczowej i gruczole
sutkowym, niewielką zaś aktywność wykazuje w mięśniach i Ŝółtej tkance tłuszczowej (tam za to działa
dehydrogenaza glicerolo-3-{P}). Większość enzymów syntezy TAG występuje w ER, chociaŜ
acylotransferaza glicerolo-3-{P} związana jest z mitochondriami, a fosfohydrolaza fosfatydowa – z
cytozolem (przy czym jej forma aktywna związana jest z błonami).
b) przebieg syntezy
-91-
8.
Cholesterol
a)
biosynteza cholesterolu
Wszystkie tkanki złoŜone z komórek eukariotycznych posiadają zdolność syntezy cholesterolu. Ok. połowa
puli cholesterolu w ludzkim organizmie pochodzi z poŜywienia (gł. jajka, mięso, wątroba, mózg), reszta jest
syntetyzowana de novo – 10 % w wątrobie oraz w 10 % w jelitach. Proces biosyntezy cholesterolu ma
miejsce w ER i w cytozolu.
Regulacja syntezy cholesterolu zachodzi na etapie HMG-CoA. T3/4 wpływają na szlak jak insulina, zaś KS
jak glukagon.
-92-
b) trawienie i wchłanianie cholesterolu
pokarm → cholesterol + jego estry →hydroliza estrów→ cholesterol → wchłanianie (Ŝółć) →
→ estryfikacja 80 – 90 % → chlomikrony →LPL→ remnanty chylomikronów →
→ wątroba (hydroliza remnantów chylomikronów, IDL i LDL) →
→ VLDL →LPL→ IDL → LDL → tkanki pozawątrobowe
c)
równowaga cholesterolu i endocytoza LDL
pula cholesterolu:
(+):
← pobieranie w Lp przez receptor LDL lub oczyszczający (zmiatający)
← pobieranie do błony
← biosynteza
← hydroliza estrów cholesterolu
(-):
← usuwanie gradientu stęŜeń do HDL3
← estryfikacja przez ACAT (acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol)
← synteza kwasów Ŝółciowych i hormonów sterydowych
d) wydalanie cholesterolu
•
•
•
Z poŜywieniem dostarczane jest ok. 0,4 g cholesterolu dziennie.
Wraz z Ŝółcią do jelita wydala się dziennie ok. 0,6 g cholesterolu oraz 0,4 g kwasów Ŝółciowych, z
czego 98 % ulega zwrotnemu wchłonięciu w jelicie krętym do krąŜenia jelitowo – wątrobowego.
W wyniku działania flory bakteryjnej jelita w cholesterolu powstaje koprostanol.
e)
miaŜdŜyca
Istotą miaŜdŜycy jest odkładanie cholesterolu z lipoprotein zawierających apoLp B100 w postaci wolnej i
zestryfikowanej w tkance łącznej ścian tętnic. Do czynników ryzyka zaliczamy: nadciśnienie tętnicze, nadmierne
spoŜycie soli, kawy i alkoholu, obfite posiłki, dietę wysokotłuszczową, picie miękkiej wody, nadwagę, palenie
tytoniu (nikotyna, CO, stres oksydacyjny), płeć męską, otyłość zwłaszcza brzuszną (↓ HDL), brak ruchu, stres.
Wzrost zachorowalności występuje przy określonych hipolipoproteinemiach, w cukrzycy, nerczycy lipidowej,
niedoczynności tarczycy i uogólnionej hiperlipidemii. Prognoza choroby zaleŜy od stosunku [cholesterol HDL] :
[cholesterol LDL]. Terapia niefarmakologiczna obejmuje m. in. zmianę diety polegającą na zastąpieniu
nasyconych KT (masło, tłuszcz wołowy, olej kokosowy) przez jedno- (oliwa z oliwek) i wielonienasycone (olej
słonecznikowy, sojowy, kukurydziany, bawełniany) oraz wykluczenie fruktozy i zawierające ją sacharozy
(działanie hiperlipemizujące). Nasycone KT nasilają tworzenie oraz spowalniają katabolizm mniejszych
cząsteczek VLDL z większą ilością cholesterolu. Natomiast nienasycone KT nasilają katabolizm i wydalanie
cholesterolu oraz LDL poprzez oddziaływanie z ich receptorami (zjawisko regulacji w górę). W terapii
farmakologicznej stosuje się: Ŝywice jonowymienne (cholestyramina, cholestipol), fibraty (klofibrat,
gemfibrozil), leki hamujące lipolizę (kwas nikotynowy), antyoksydanty (probukol). W wyjątkowych
-93-
przypadkach decyduje się na zabieg chirurgiczny, polegający na wyłączeniu jelita krętego z konsekwentnym
zaburzeniem krąŜenia jelitowo – wątrobowym kwasów Ŝółciowych.
9.
Kwasy Ŝółciowe
Synteza kwasów Ŝółciowych zachodzi w wątrobie. Prekursorem jest cholesterol, hydroksylowany przez
7α-hydroksylazę (ER); reakcja wymaga O2, NADPH, witaminy C i CYP. Jest to etap regulujący całą syntezę –
nasila go sam cholesterol, hamuje zaś produkt (kwasy Ŝółciowe – poprzez receptor FXR) oraz niedobór
witaminy C. 7α-hydroksylaza regulowana jest wspólnie z reduktazą HMG-CoA, obie teŜ ulegają modyfikacjom
kowalencyjnym, przy czym hydroksylaza wykazuje aktywność w formie ufosfrylowanej.
Powstały 7α-hydroksycholesterol podlega następnie kilku etapom przemian z udziałem O2, NADPH,
CoA i ewentualnie 12α-hydroksylazy – wysycane jest wiązanie ∆5,6, łańcuch boczny skracany jest o C3
(propionylo-CoA), reszta karboksylowa wiązana z CoA, zaś C12 hydroksylowany. Powstaje w ten sposób
choloilo-CoA oraz chenodeoksycholoilo-CoA, które łączone z glicyną i tauryną w proporcji 1:3 dają pierwotne
kwasy Ŝółciowe, wydalane z Ŝółcią do światła jelita. UmoŜliwiają tam trawienie i wchłanianie, tworzenie emulsji
tłuszczowych i rozbijanie tłuszczu na micele, pokrywanie tłuszczem innych cząstek pokarmowych i lepszy
dostęp enzymów. Dzięki działalności flory bakteryjnej jelita pierwotne kwasy ulegają dekoniugacji i 7αdehydroksylacji, dając odpowiednio kwas deoksycholowy i litocholowy – wtórne kwasy Ŝółciowe. W jelicie
krętym ogromna większość kwasów Ŝółciowych ulega wchłonięciu do krąŜenia jelitowo – wątrobowego, z
wyjątkiem nierozpuszczalnego kwasu litocholowego. Reszta wydalana jest z kałem, stanowiąc główną drogę
wydalania cholesterolu z organizmu.
-94-
10. Kalcyferole (patrz równieŜ punkt VII-2-b)
Witamina D jest prohormonem sterydowym, jej przedstawicielem jest ergosterol, występujący w
roślinach i droŜdŜach oraz 7-dehydrocholesterol, obecny u zwierząt – róŜnią się one między sobą nasyceniem i
metylacją łańcucha bocznego. KaŜdy z nich ulega u odpowiednich gatunków reakcji fotolitycznej,
przebiegającej z rozbiciem wiązana C9-C10 w pierścieniu B, dając ergokalcyferol (D2) lub cholekalcyferol (D3).
Witaminy te po spoŜyciu w pokarmach (gł. olej rybi, Ŝółtka jaj, wątroba) wchłaniane są przez jelita do krwi,
gdzie wiąŜe je białko nośnikowe. Wychwytywane przez wątrobę ulegają 25-hydroksylazie (ER), a powstała 25OH-D3 jest formą zapasową gromadzoną w hepatocytach, adipocytach i miocytach, podlega krąŜeniu jelitowo –
wątrobowemu. W kanalikach nerkowych, kościach i łoŜysku 25-OH-D3 ulega 1-hydroksylazie (mitochondria),
dając 1α,25-(OH)2-D3 (synteza regulowana przez PTH i [{P}] w osoczu). Szlak alternatywny prowadzi przez 24hydroksylazę (mitochondria), obecna w kanalikach nerkowych, chrząstce, kościach, jelicie i łoŜysku. Aktywna
witamina D reguluje ekspresję odpowiednich genów, przez co uczestniczy w regulacji gospodarki wapniowo –
fosforanowej i kształtowaniu kości, procesach róŜnicowania oraz zjawiskach immunologicznych.
-95-
11. Hormony sterydowe
•
•
•
•
•
•
•
Hormony o budowie sterydowej syntetyzowane są przez korę nadnerczy oraz przez gonady.
Kora nadnerczy (cortex glandulae adrenalis) syntetyzuje kortykosteroidy. W obrębie kory wyróŜniamy
3 warstwy, wydzielające odmienne rodzaje hormonów. Warstwa kłębuszkowata produkuje
mineralokortykosteroidy (C21), których głównym przedstawicielem jest aldosteron. Warstwa
pasmowata produkuje glukokortykosteroidy (C21): kortyzol = hydrokortyzon, kortyzon i kortykosteron.
Warstwa siateczkowata produkuje androgeny (C19): DHEA i androstendion.
Substratem do syntezy hormonów steroidowych jest cholesterol. W tkankach docelowych
steroidogenezy podlega on działaniu enzymu odgałęziającemu z grupy cytochromu P450 (CYP SCC –
ang. side-chain cleavage enzyme), który pozbawia cholesterol atomów C22-C27; produktem tej reakcji
jest ∆5-pregnenolon, właściwy macierzysty związek wszystkich naturalnych sterydów. W wyniku
działania nań enzymów: dehydrogenazy 3-β-hydroksysteroidowej, 21-α-hydroksylazy, 11-βhydroksylazy, 17-α-hydroksylazy, 17,20-liazy oraz syntazy aldosteronowej powstają wymienione
wyŜej grupy hormonów kory nadnercza.
Główne działanie mineralokortykoidów polega na wzroście resorpcji zwrotnej wody, Na+ i Cl- w
kanaliku dalszym, przez co regulowana jest objętość płynów krąŜących w łoŜysku naczyniowym oraz
ich ciśnienie osmotyczne. Działanie glukokortykoidów polega na rozległym wpływie na metabolizm
(↑ glikemia – stąd nazwa, nasilenie katabolizmu lipidowego i azotowego), gospodarkę wodno –
elektrolitową (choć nie w takim stopniu jak aldosteron), syntezę składników tkanki łącznej oraz na
modyfikacji układu immunologicznego – m. in. hamowaniu tkanki limfoidalnej i działaniu
przeciwzapalnym przez hamowanie izoenzymu 2 syntazy PGH2 (PGHS-2).
Gonada męska (jądro; testis) produkuje androgeny (C19), gł. testosteron. Jego synteza moŜliwa jest
dzięki obecności dodatkowego enzymu – dehydrogenazy 17-β-hydroksysteroidowej, która pozwala
przeprowadzić DHEA w androstandiol oraz androstendion w testosteron. Ten podlega obwodowej
redukcji przez 5α-reduktazę do dihydrotestosteronu (DHT), wykazującego większą aktywność i
odpowiedzialnego za większość efektów działania androgenów. Androgeny są niezbędne do
wykształcenia męskich cech płciowych; ponadto działają anabolicznie m. in. na układ ruchu,
zwiększając masę mięśni szkieletowych i aktywność osteoblastów, pobudzają do wydzielania gruczoły
łojowe (objawy trądziku) oraz stymulują przerost gruczołu krokowego.
Androgeny metabolizowane są do 17-ketosteroidów (17-KS), wydalanych następnie z moczem. U
kobiet całość wydalanych 17-KS pochodzi z nadnerczy, zaś u męŜczyzn 2/3 ma pochodzenie
nadnerczowe, a 1/3 gonadalne. 17-KS uŜywane są jako marker diagnostyczny. Zwiększenie ich
poziomu występuje fizjologicznie w ciąŜy, a takŜe towarzyszy takim patologiom jak: rak kory
nadnerczy, guz wirylizujący nadnerczy lub jajników, zespół Cushinga, zespół nadnerczowo – płciowy
(wrodzony przerost nadnerczy), nowotwory jądra produkujące androgeny. Z kolei spadek poziomu 17KS towarzyszy pierwotnej i wtórnej niedoczynności kory nadnerczy (o róŜnej etiologii) oraz obniŜeniu
czynności hormonalnej jąder, np. przy hipogonadyzmie.
Gonada Ŝeńska (jajnik) wytwarza progestageny (C21), gł. progesteron oraz estrogeny (C18): estradiol,
estron i estriol. Do syntezy progesteronu wystarczy aktywność enzymu odgałęziającego i
dehydrogenazy 3-β-hydroksysteroidowej. Natomiast powstawanie estrogenów wymaga obecności
dehydrogenazy 17-β-hydroksysteroidowej (jak w jądrze), desmolazy, katalizującej C19-demetylację oraz
aromatazy, nadającej pierścieniowi A szkieletu steroidowego charakter aromatyczny. Estrogeny są
niezbędne do dojrzewania płciowego dziewcząt i płodności kobiet; ponadto przeciwdziałają miaŜdŜycy
(hamowanie lipazy wątrobowej → ↑ HDL2) oraz osteoporozie (hamowanie osteoklastów).
Progestageny, wydzielane gł. przez ciałko Ŝółte, ułatwiają zagnieŜdŜenie trofoblastu i umoŜliwiają
utrzymanie ciąŜy; poza tym pobudzają rozwój gruczołów sutkowych oraz przyspieszają metabolizm –
związany jest z tym niewielki skok temperatury ciała towarzyszący owulacji (wykorzystanie w
naturalnej antykoncepcji – metodzie termicznej i nowszych, objawowo – termicznych).
-96-
-97-
ROZDZIAŁ VI – PRZEMIANA AZOTOWA
1.
Trawienie białek w przewodzie pokarmowym
a)
enzymy i ich specyficzność
•
Trawienie białek rozpoczyna się w Ŝołądku, gdzie kontakt z HCl wytwarzanym przez komórki
okładzinowe powoduje ich denaturację, tj. utratę struktury IV i III-rzędowej przez zniszczenie wiązań
wodorowych, wyprostowanie polipeptydów i wzrost podatności na działanie proteaz.
Główną funkcją Ŝołądka jest trawienie białek. Komórki główne wytwarzają zymogen, który pod
wpływem aktywacji proteolitycznej przez H+ ulega przekształceniu w pepsynę (A – dno, B –
odźwiernik; optimum 1 – 2). Pepsyna rozkłada dalsze cząsteczki zymogenu na zasadzie autokatalizy.
Pepsyna jest endopeptydazą atakującą wiązania peptydowe utworzone przez aa aromatyczne lub
dwukarboksylowe, dzieląc zdenaturowane białko na duŜe polipeptydy.
Rennina (chymozyna; optimum 4) występuje w Ŝołądku niemowląt, gdzie w obecności Ca2+
przekształca kazeinęw parakazeinę, będącą substratem dla pepsyny, zapobiegając szybkiemu
przedostaniu się mleka z Ŝołądka do jelit.
Treść Ŝołądkowa przechodzi do dwunastnicy, gdzie jest neutralizowana przez zasadową Ŝółć i
zasadowy sok trzustkowy (optimum 7,5 – 8).
Sok trzustkowy zawiera liczne enzymy proteolityczne. Do endopeptydaz zaliczamy: trypsynę,
chymotrypsynę i elastazę – wszystkie wydzielane początkowo jako zymogeny. Śluzówka jelita
wydziela enteropeptydazę (enterokinazę), rozbijającą wiązania peptydowe Lys, przez co rozprostowuje
i uaktywnia trypsynę (optimum 7,9; działa na aa zasadowe). Aktywna trypsyna przeprowadza
autokatalizę oraz przekształca chymotrypsynogen w chymotrypsynę (optimum 8,0; działa na
pozbawione ładunku), proelastazę w elastazę (działa na małe aa) oraz prokarboksypeptydazę w
karboksypeptydazę (egzopeptydaza odłączająca pojedyncze C-końcowe aa od polipeptydów).
Schemat aktywacji proteolitycznej chymotrypsyny:
pro-CT:
1
245
↓
π-CT:
1
15 16
245
↓
α-CT:
1 A 13 16
B
146 149 C 245
Sok jelitowy zawiera aminopeptydazę (ezgopeptydaza odcinająca N-końcowe aa poli- i oligopeptydów)
oraz dwupeptydazy o róŜnej swoistości.
Naturalne izomery L-aa transportowane są aktywnie przez rąbek szczoteczkowy przy udziale PLP przez
liczne przenośniki podobne do SGLT-1. WyróŜniamy następujące przenośniki:
zaleŜne od Na+: dla aa obojętnych, Phe i Met oraz Pro i Hyp,
niezaleŜne: dla aa lipofilnych i obojętnych (Leu, Phe) oraz zasadowych (Lys).
(transport aa w kanalikach nerkowych – patrz punkt VII-6-a)
Flora bakteryjna jelita powoduje przekształcanie niewchłoniętych aa:
dekarboksylaza bakteryjna wytwarza ptomainy (R-CH2-NH2): Lys → kadaweryna, Arg → agametyna,
Tyr → tyramina, Orn → putrescyna, His → histamina,
Trp → indol, metyloindol (skatol)
aa siarkowe przekształcane są w tiole (metylomerkaptan, etylomerkaptan), z których powstaje
siarkowodór: CH3SH + 2 H → CH4 + H2S
powstały z deaminacji amoniak dostaje się do krąŜenia wrotnego, skąd eliminuje go wątroba; w
schorzeniach tego narządu moŜne rozwinąć się hiperamonemia, prowadząca do amoniakowej śpiączki
wątrobowej i encefalopatii wątrobowej
antybiotyki (np. neomycyna) hamują wzrost flory fizjologicznej
•
•
•
•
•
•
•
•
• zaburzenia trawienia i wchłaniania białek:
wchłanianie nie strawionych białek moŜe wywołać reakcje immunologiczne,
sprue rodzinna (nie tropikalna) powstaje gdy polipeptydy powstałe z glutenu uszkadzają śluzówkę jelita
oraz powodują powstawanie przeciwciał p/glutenowych; jej odpowiednikiem u dzieci jej celiakia
(choroba trzewna),
złe wchłanianie produktów trawienia białek wywołuje obrzęki i osteoporozę,
-98-
defekt przenośnika jelitowego dla aa obojętnych wywołuje chorobę Hartnupów (uogólniona
aminoacyduria, objawy przypominające pelagrę),
kwashiorkor występuje gdy dziecko odstawione od piersi matki przechodzi na dietę niskobiałkową,
wyniszczenie (kacheksja, marazmus) to niedobór energetycznego poŜywienia oraz swoistych aa
b) transport azotu pomiędzy tkankami
Główną rolę w utrzymaniu stęŜenie krąŜących w osoczu aa odgrywają mięśnie i wątroba – miocyty są
źródłem ponad połowy puli wolnych aa, zaś hepatocyty przeprowadzają glukoneogenezę i cykl mocznikowy,
niezbędny do wydalania nie magazynowanego azotu. W stanie poresorpcyjnym aa uwalniane są z mięśni –
dotyczy to gł. Ala i Gln. Ta ostatnia wędruje do jelit i nerek, gdzie stanowi źródło amoniaku i powraca do krwi
jako Ala lub Ser (tylko z nerek). Ala – ostateczny transporter azotu – wychwytywana jest przez wątrobę, gdzie
stanowi główny aa glukogenny, poniewaŜ hamuje glikolizę na etapie kinazy pirogronianowej oraz stanowi
doskonały substrat dla glukoneogenezy, wysycający ten proces dopiero w stęŜeniu 20 – 30 x większym od
fizjologicznego. Część aa ulega w wątrobie cyklowi mocznikowemu. Po bogatobiałkowym posiłku transport
zachodzi w odwrotnym kierunku, tj. z tkanek trzewnych do mięśni. Aa o rozgałęzionym łańcuchu – gł. Val –
stanowią na czczo źródło energii dla OUN, w stanie resorpcyjnym zaś wychwytywane są przez mięśnie po
uprzednim oszczędzeniu przez wątrobę.
2.
Ogólna przemiana aminokwasów i metabolizm grupy aminowej
W przeciwieństwie do innych składników pokarmowych, jak cukry i tłuszcze, aa nie są w organizmie
gromadzone w postaci zapasowej, lecz usuwane w przypadku nadmiaru. Pierwszym etapem tych przemian jest
zazwyczaj transaminacja, tj. wymiana grupy aminowej z α-ketokwasem, dają nowy ketokwas i nowy aa. Glu
jako jedyny nie wymienia azotu z innym związkiem, lecz odłącza go w procesie oksydacyjnej dezaminacji. Tak
powstały NH3 jest transportowany, aby ostatecznie ulec połączeniu z CO2 w cyklu mocznikowym, dając
mocznik – gł. metabolit azotowy u człowieka.
a)
transaminacja
•
Aa pokarmowe oraz własne traktowane są identycznie, tj. rozbijane na grupę aminową i szkielet
węglowy.
Typowa transaminacja polega na przemianie 2 α-aa i 2 α-ketokwasów.
Czasami do reakcji wchodzą grupy karbonylowe i nie-α-aminowe, np. grupa δ-aminowa Orn.
Transaminacji nie ulegają: Lys, Thr, Pro i Hyp.
W większości tkanek obecne są: transaminaza Ala – Pyr (AlAT, GPT, SGPT) oraz Glu – szczawiooctan
(GluAT, GOT, SGOT).
KaŜda transaminacja jest swoista dla jednej pary substratów.
Dzięki temu Ŝe Ala moŜe wejść do reakcji katabolizowanej przez GluAT, cały azot aminowy
pochodzący z aa podlegających transaminacji moŜe być zgromadzony w Glu.
W miejscu katalitycznym transaminaz występuje PLP (fosforan pirydoksalu) – pochodna wit. B6
wchodząca w skład enzymów metabolizujących aa.
•
•
•
•
•
•
•
-99-
•
Aa przyłącza się do PLP przez połączenie typu zasady Schiffa.:
• Mechanizm transaminacji (przykład reakcji ping – pong):
w sytuacji wyjściowej PLP połączony jest z apoenzymem przez zasadę Schiffa pomiędzy grupą εaminową Lys a grupą aldehydową pirydoksalu,
przyłączenie α-aa1 powoduje wyparcie grupy ε-aminowej Lys, połączenie PLP z apoenzymem przez
wiązanie jonowe z udziałem grupy fosforanowej PLP oraz utworzenie nowej zasady Schiffa –
aldoiminy.
odłączenie H+ od C2 α-aa1 powoduje przegrupowanie do ketoiminy i dearomatyzację PLP,
przyłączenie H2O i H+ powoduje rozpad do α-ketokwasu1 i fosforanu pirydoksaminy, połączonego
nadal jonowo z apoenzymem,
następnie zachodzi reakcja odwrotna – przyłącza się α-ketokwas2 i usuwane są H2O i H+ z utworzeniem
ketoiminy,
przyłączenie H+ powoduje przegrupowanie wiązań i powstanie aldoiminy,
odłączenie α-aa2 daje powrót do stanu wyjściowego, tj. PLP połączony przez zasadę Schiffa z grupą εaminową Lys apoenzymu,
niedobór wit. B6 wystepuje przy wielowitaminowym deficycie grupy B, podczas laktacji, u alkoholików
oraz przy leczeniu gruźlicy izoniazydem (INH):
izonikotynian hydrazyny (izoniazyd) + pirydoksal → hydrazon pirydoksalu (→ mocz) + H2O
•
Aa mogą być równieŜ przekształcane przez oksydazę aa, obecną w wątrobie i nerkach:
b) dezaminacja
Centralną pozycję w metabolizmie azotu zajmuje dehydrogenaza Glu – enzym rozpowszechniony w
wielu tkankach i wykorzystujący NAD(P)+. Katalizuje on odwracalne przejście Glu ↔ α-ketoglutaran + NH3. W
wątrobie aktywność tą nasila ADP, zmniejszają zaś: ATP, GTP oraz NADH.
c)
transport
Stale wytwarzany w tkankach amoniak jest toksyczny dla organizmu, dlatego teŜ musi być na bieŜąco
usuwany. Funkcję tę pełni wątroba, syntetyzując Glu, Gln i mocznik.
Syntetaza glutaminowa katalizuje reakcję:
Glu + NH4+ + ATP → Gln + H2O + ADP + Pi
Jest to enzym mitochondrialny, występujący w znacznych ilościach w tkance nerwowej, gdzie głównym
mechanizmem detoksykacyjnym jest synteza Gln. W stanach nadmiaru NH3 zachodzi karboksylacja
ketokwasów na potrzeby sprzęgania i unieczynniania NH3.
Uwalnianie azotu amidowego Gln katalizuje glutaminaza: Gln + H2O → Glu + NH4+.
Współdziałanie obu powyŜszych enzymów warunkuje równowagę pomiędzy jonem amonowym a Gln.
100
- -
d) eliminacja
U człowieka 80 – 95 % azotu wydalane jest przez nerki w postaci mocznika, powstałego w cyklu
mocznikowym, zachodzącym gł. w wątrobie. Cykl ten ma zatem kluczowe znaczenie w detoksykacji
organizmu.
Po przetransportowaniu CO2 i NH4+ do matrix mitochondrialnej reagują one z 2 ATP, co katalizuje
syntetaza karbamoilofosforanowa I (mitichondrialna).
Reszta karbamoilowa ulega przeniesieniu na Orn, która dostaje się do mitochondrium dzięki
translokazie ornitynowej. Produktem reakcji jest Pi oraz Cyt, eksportowana do cytozolu. Reakcję
katalizuje transkarbamoilaza ornitynowa.
W cytozolu cytulina reaguje z ATP dając cytrulilo-AMP, który wraz z Asp tworzy argininobursztynian.
Reakcję katalizuje syntetaza argininobursztynianowa.
Argininobursztynian ulega trans-eliminacji katalizowanej przez argininobursztynazę, w wyniku czego
powstaje Arg i fumaran.
Arginaza występuje w wątrobie, tkance nerwowej, mózgu, gr. sutkowym, jądrze, skórze; aktywność ta
hamowana jest przez Orn i Lys. Katalizuje ona rozczepienie grupy guanidynowej Arg, dając Orn i
mocznik, usuwany do krwi.
Regulacja cyklu:
Głodzenie nasila syntezę enzymów, aby moŜliwe było wydalanie większej ilości mocznika z
powodu zwiększonego katabolizmu białkowego.
Kluczowe znaczenie ma pierwsza reakcja cyklu – syntetaza karbamoilfosforanowa I wykazuje
aktywność wyłącznie w obecności allosterycznego modyfikatora (N-Ac-Glu) zwiększaącego
powinowactwo do ATP. Poziom N-Ac-Glu jest wypadkową reakcji syntezy i degradacji:
Glu + AcCoA →syntaza N-Ac-Glu→ N-Ac-Glu →hydrolaza N-Ac-Glu→ Glu + octan
101
- -
Zaburzenia cyklu – ogólnie wywołują wymioty, unikanie pokarmów bogatobiałkowych, przerywaną
ataksję, nerwowość, letarg i opóźniony rozwój umysłowy.
hiperamonemia typ I – defekt syntetazy karbamoilofosforanowej I
hiperamonemia typ II – defekt transkarbamoilazy Orn → ↑ Glu
cytrulinemia – defekt syntetazy argininobursztynianowej, ↑ Cyt
acyduria argininobursztynianowa – defekt argininobursztynazy, → łamliwe włosy skupione w
kępki
w cytrulinemii i acydurii argininobursztynianowej podaje się Arg i benzoesan
hiperargininemia – defekt arginazy → ↑ Arg, podobieństwo do lizynocystynurii
3.
Metabolizm poszczególnych aminokwasów
Ze względu na moŜliwość biosyntezy de novo wszystkie aa dzielimy na endogenne i egzogenne. Te
pierwsze mogą być zsyntetyzowane przez organizm człowieka, drugie zaś nie – z powodu braku odpowiednich
enzymów – i muszą być dostarczane wraz z pokarmem. Do aa endogennych zaliczamy: Glu, Gln, Ala, Asp, Ans,
Ser, Gly, Pro, Cys, Tyr, Hyp i Hyl, pozostałe zaś – do egzogennch. MoŜliwość syntezy niektórych aa (ich
endogenny charakter) zaleŜy w pewnych przypadkach od odpowiedniej podaŜy innych, np. Tyr moŜe być
syntetyzowana pod warunkiem obecności odpowiedniej ilości Phe. Charakter aa zmienia się równieŜ z wiekiem,
np. Arg jest egzogenna dla dzieci, z powodu ich szybkiego wzrostu, natomiast u dorosłych całkowicie wystarczą
zasoby produkowane w cyklu mocznikowym.
Ze względu na to, czy produkty katabolizmu szkieletu węglowego danego aa zasilają szlaki syntezy
węglowodanów czy lipidów, dzielimy aa na glukogenne i ketogenne. Do aa czysto glukogennych naleŜą: Gly,
Ala, Val, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Glu, Arg, His, Pro i Hyp, do czysto ketogennych – jedynie Leu, zaś do
jednocześnie gluko- i ketogennych: Ile, Lys, Phe, Tyr oraz Trp.
a)
Kwas asparaginowy (asparaginian, Asp, D) jest aa endogennym. Syntetyzowany jest ze szczawiooctanu
w reakcji transaminacji:
szczawiooctan + Ala →AT→ Asp + Pyr.
Jego katabolizm polega na przebiegu tej samej reakcji w przeciwną stronę.
b) Asparaginaza (amid kwasu asparaginowego, Asn, N) jest równieŜ endogenna. Powstaje z Asp w reakcji
katalizowanej przez syntetazę Asn:
Asp + Glu + ATP →syntetaza Asn→ Asn + Glu + AMP + PPi (→ 2 Pi)
Jej rozkład przez asparaginazę daje z powrotem Asp:
Asn + H2O →asparaginaza→ Asp + NH4+
c)
Kwas glutaminowy (glutaminian, Glu, E) jest endogenny – powstaje z α-ketoglutaranu w reakcji
katalizowanej przez dehydrogenazę Glu:
α-ketoglutaran + NH4+ + NAD(P)H + H+ →dehydrogenaza Glu→ Glu + H2O + NAD(P)+
Katabolizowany jest z powrotem do α-KG w reakcji transaminacji:
Glu + Pyr →AT→ α-ketoglutaran + Ala
Glu jest substratem do syntezy γ-aminomaślanu (GABA), pełniącego funkcje hamującego
neurotransmitera w UN:
Glu ↔dekarboksylaza Glu, PLP↔ GABA
GABA ulega degradacji przez przekształcenie do składników cyklu Krebsa:
GABA → semialdehyd bursztynowy → α-KG lub bursztynian
d) Glutamina (amid kwasu glutaminowego, Gln, Q) jest endogenna – syntetyzowana z Glu przy udziale
aktywności syntetazy Gln:
Glu + NH4+ + ATP →syntetaza Gln→ Gln + ADP + Pi
Rozkładana jest do Glu przy udziale glutaminazy:
Gln + H2O →glutaminaza→ Glu + NH4+
e)
Alanina (Ala, A) jest zarówno syntetyzowana, jak i katabolizowana przez transaminację z / do
pirogronianu:
Pyr + Glu ↔AT↔ Ala + α-KG
f) Glicyna (Gly, G) jest aa endogennym. MoŜe być syntetyzowana na kilka sposobów:
z glioksalanu przez transaminację (w wątrobie):
glioksalan + α-aa ↔AT↔ Gly + α-ketokwas (1)
102
- -
z choliny:
cholina ↔ aldehyd betainowy ↔ betaina ↔ dimetyloglicyna ↔ sarkozyna ↔ Gly (2)
z Ser:
Ser + THF ↔hydroksymetylotransferaza Ser↔ Gly + metyleno-THF (3)
Powstająca z Gly cholina uŜywana jest do syntezy:
acetylocholiny (ACh) – neurotransmitera:
cholina + AcCoA →acetylotransferaza cholinowa→ ACh
ACh →esteraza cholinowa (AChE)→ cholina + octan
fosfolipidów – składników błon biologicznych:
cholina → cholino-{P} →CDP-cholina
CDP-cholina + DAG → fosfatydylocholina = lecytyna
Degradacja Gly zachodzi albo przez zachodzenie reakcji (1) i (3) w drugą stronę albo przez rozkład z
udziałem syntazy Gly:
Gly + NAD+ + THF →syntaza glicynowa, PLP→ CO2 + NH4+ + NADH + H+ + metyleno-THF
g) Seryna (Ser, S) jest endogenna. MoŜe powstawać albo z Gly w wyŜej podany sposób (tą drogą zachodzi
równieŜ jej degrdacja), jak równieŜ z 3-{P}-glicerynianu w ciągu przemian:
3-{P}-glicerynian + NAD+ → {P}-hydroksypirogronian + NADH + H+
{P}-hydroksypirogronian + α-aa →AT→ {P}-seryna + α-ketokwas
{P}-seryna + H2O → seryna + Pi
h) Prolina (Pro, P) jest aa endogennym. Zarówno jej synteza, jak i rozkład, zachodzą przez przekształcenia
z / do Glu:
Glu + NADH + H+ ↔dehydrogenaza↔ γ-semialdehyd Glu + NAD+
γ-semialdehyd Glu ↔ dehydroprolina + H2O
dehydroprolina + NADH + H+ ↔dehydrogenaza Pro↔ Pro + NAD+
i)
Hydroksyprolina (Hyp) jest endogenna, choć nie jest kodowana przez Ŝaden kodon mRNA. Powstaje z
Pro w wyniku nieodwracalnej hydroksylacji zachodzącej na mikrosomach (ER) w skórze, wątrobie,
płucach, sercu, mięsniach i ziarninujących ranach:
Pro →hydroksylaza Pro, Fe2+, O2, wit. C, α-KG→ Hyp
MoŜe być degradowana do Pyr i glioksalanu, głównie jednak wydalana jest z moczem w formie
niezmienionej. PoniewaŜ występuje wyłącznie w proteinach łącznotkankowych – kolagenie i elastynie
– jej poziom uznawany jest za diagnostyczny wskaźnik szybkości degradacji tkanki łącznej (gł. kości).
Wzrasta on w takich patologiach jak: choroba Pageta, pierwotna i wtórna nadczynność przytarczyc /
tarczycy / kory nadnerczy, przerzuty nowotworowe do kości oraz w osteoporozie.
j)
Arginina (Arg, R) jest generalnie endogenna, choć zaleŜy to od wieku (patrz wyŜej). Jest elementem
cyklu mocznikowego (patrz punkt VI-2-d) – syntetyzowana przy udziale argininobursztynazy, zaś
degradowana przez arginazę do Orn. Arg bierze udział w syntezie dwóch istotnych związków:
kreatyna – przenośnik energii gł. w mięśniach:
Arg + Gly →transamidynaza Arg-Gly (nerka)→ glikocyjamina = guanidynooctan
guanidynooctan + ATP + SAM →metylotransferaza guanidynooctanowa (wątroba)→
→ fosforan kreatyny (PCr, mięśnie, mózg, krew) + ADP + SA-homocysteina
fosfokreatyna + ADP ↔kinaza (fosfo)kreatynowa = CK / CPK↔ kreatyna + {P} + ATP
kreatyna →nieenzymatyczna cyklizacja w mięśniach→
→ kreatynina (→ wydalanie z moczem) + H2O
PoniewaŜ powstawanie kreatyniny jest reakcją nieenzymatyczną, jej poziom jest proporcjonalny do
masy mięśniowej organizmu (wykorzystywane w sporcie). Szybkość usuwania kreatyniny z krwiobiegu
przez nerki (tzw. klirens endogennej kreatyniny) przyjmuje się za równy szybkości filtracji
kłębuszkowej (GFR) – parametr słuŜący do oceny sprawności pracy nerek (np. w oparciu o niego
określa się stopień zaawansowania przewlekłej niewydolności nerek). GFR moŜna równieŜ obliczyć
pośrednio na podstawie stęŜenia kreatyniny we krwi (wzór Cockcroft’a – Gault’a).
Z kolei poziom CPK jest wskaźnikiem diagnostycznym uszkodzenia tkanek, gł. mięśni. Wzrasta przy
kontuzjach, nadmiernym wysiłku fizycznym, w chorobach mięśni, w tym serca, OUN, wylewach,
napadach epileptycznych, niedoczynności tarczycy, radioterapii, farmakoterapii statynami. Spadek CPK
moŜe oznaczać RZS lub alkoholową chorobę wątroby. Izoenzym sercowy (CK-MB) uŜywany jest w
diagnostyce zawału mięśnia sercowego. (por. II-5-b i c)
103
- -
tlenek azotu (NO):
Arg + O2 → syntaza tlenku azotu (NOS)→ Cyt + NO
NOS wymaga kofaktorów: NADPH, FAD, FMN, THB (tetrahydrobiopteryny) oraz hemu. Występuje w
trzech formach – dwóch konstystucyjnych (śródbłonkowa – eNOS, neuronalna – nNOS) oraz jednej
indukowalnej (makrofagowa – iNOS). NO produkowany przez śródbłonek w odpowiedzi na
pobudzenie PS+ (→ ACh → PIP2 →IP3 + DAG → ↑ Ca2+ → Ca2+/kalmodulina → NOS → NO)
dyfunduje do leŜącej głębiej mięśniówki gładkiej naczyń, gdzie pobudza GC do produkcji cGMP, który
stymuluje defosforylację łańcuchów lekkich miozyny, wykazując działanie rozszerzające naczynia oraz
hamujące agregację trombocytów. Działanie tego układu moŜna nasilić podając egzogenny donator NO
(np. nitroglicerynę) lub zahamować PDE rozkładającą cGMP (np. sildenafil). NO jest usuwany przez
wiązanie z hemoproteinami oraz interakcje ze związkami tlenu:
NO + ½ O2 → NO2
NO + HO2* → ONOOH (peroksyazotyn) → NO2 + OH*
k) Ornityna (Orn) nie jest kodowana przez mRNA, a jedynie powstaje z Arg jako jeden z produktów cyklu
mocznikowego. MoŜe albo włączyć się w następny obrót cyklu (kondensacja z karbamoilofosforanem)
albo zostać rozłoŜona przez transaminację:
Orn + α-KG →δ-aminotransferaza Orn→ γ-semialdehyd Glu + Glu
Dalsze przemiany γ-semialdehydu Glu prowadzą do Glu lub Pro (patrz Pro). Orn moŜe podlegać
równieŜ dekarboksylacji do putrescyny, która stanowi substrat do syntezy biogennych amin
alifatycznych – poliamin:
Poliaminy (spermidyna i spermina) to zasadowe substancje związane z proliferacją i wzrostem
komórkowym (przez wiązanie z kwasami nukleinowymi powodują ich stabilizację i stymulują
biosyntezę). Ponadto obniŜają RR i temperaturę ciała.
l)
Cysteina (Cys, C) naleŜy do aa endogennych. Syntetyzowana jest w przez fuzję dwóch innych aa – Met
i Ser, a dokładniej (patrz równieŜ Met):
Met →→→ homocysteina
homocysteina + Ser → cystationina → Cys
MoŜe równieŜ powstawać przez rozkład wiązań dwusiarczkowych cystyny:
Cys-S-S-Cys + NADH + H+ →reduktaza cystynowa→ 2 Cys-SH + NAD+
Jej katabolizm jest odbywa się równieŜ na dwa sposoby, prowadzące do wspólnego końca:
I: Cys →dioksygenaza→ cysteinosulfinian →AT→ β-sulfinylo-Pyr →desulfinaza→ Pyr
II: Cys →AT→ tiolo-Pyr →siarkotransferaza→ Pyr
Oprócz wyjątkowej funkcji w kształtowaniu struktury białek, Cys stanowi jeden z substratów do
syntezy glutationu (GSH):
Cys + Glu + ATP →syntetaza γ-Glu-Cys→ γ-glutamylocysteina + ADP
γ-Glu-Cys + Gly + ATP →syntetaza GSH→ ADP + γ-glutamylocysteinyloglicyna (GSH)
104
- -
m) Fenyloalanina (Phe, F) jest dla człowieka egzogenna (organizm nie potrafi samodzielnie jej
wytworzyć). Praktycznie jedyną reakcją (poza wbudowywania do białek) Phe jest hydroksylacja do Tyr
zachodząca w hepatocytach:
Phe →hydroksylaza Phe→ Tyr
Niedobór tego enzymu jest przyczyną hiperfenyloalaninemii typu I, czyli klasycznej fenyloketonurii
(PKU). Wobec braku enzymu Phe jest katabolizowana przez transaminację do nie fizjologicznych
metabolitów, jak fenylopirogronian (fenyloketon), felylooctan i fenyloetyloamina; ten pierwszy moŜna
wykrywać w moczu i stanowi wówczas wskaźnik diagnostyczny PKU.
n) Tyrozyna (Tyr, Y) jest aa endogennym, który powstaje w wyniku hydroksylacji Phe – o ile nie
występuje niedobór tej ostatniej lub blok metaboliczny hydroksylacji (PKU). Katabolizm Tyr obejmuje
szereg reakcji:
Tyr + α-KG →AT, PLP→ {P}-hydroksyfenylo-Pyr + Glu
{P}-hydroksyfenylo-Pyr + ½ O2 →dioksygenaza, Cu2+, wit. C→ homogentyzynian + CO2
homogentyzynian + ½ O2 →dioksygenaza, Fe2+→ maleiloacetooctan
maleiloacetooctan →izomeraza cis-trans, GSH→ fumaryloacetooctan
fumaryloacetooctan + H2O →fumaryloacetoacetaza→ fumaran + acetooctan (AcAc)
Następnie fumaran wchodzi do cyklu Krebsa, zaś acetooctan zasila pule ciał ketonowych (patrz punkt
V-5-e). Niedobór dioksygenazy homogentyzynianu powoduje alkaptonurię. Główne objawy choroby
związane są ze wzmoŜoną konwersją Tyr do melaniny i jej odkładaniem w tkankach i obejmują:
ochranozę (wzmoŜoną pigmentację tkanki łącznej), zapalenie stawów oraz ciemnienie moczu na
powietrzu.
Ponadto Tyr moŜe ulegać:
dezaminacji do tyraminy,
sprzęganiu z jodem do mono- (MIT) i dwujodotyrozony (DIT), z których następnie powstają hormony
tarczycy – trójjodoyronina (T3) oraz tyroksyna (T4),
hydroksylacji przez hydroksylazę Tyr do dihydroksyfenyloalaniny (DOPA):
Tyr →3-monooksygenaza (hydroksylaza) Tyr, Cu2+→ DOPA
DOPA pełni niezwykle istotną rolę metaboliczną, stanowi bowiem związek wyjściowy dla dwóch
waŜnych szlaków, tj.:
syntezy amin katecholowych (neurony, rdzeń nadnerczy), stanowiących neurotransmitery i hormony:
DOPA →dekarboksylaza DOPA, PLP→ dopamina (D)
dopamina →β-oksydaza dopaminowa, Cu2+, wit. C→ noradrenalina (NA)
noradrenalina →N-metylotransferaza fenyloetanoloaminowa→ adrenalina (A)
Katecholaminy są katabolizowane przez oksydazę monoaminową (monoaminooksydazę = MAO) oraz
katecholoksymetylotransferazę (COMT) odpowiednio: D do kwasu homowalinowego (HVA), NA do
normetanefryny i kwasu wanilinomigdałowego (VMA), zaś A do metanefryny i VMA. Zarówno wolne
aminy katecholowe, jak i ich metabolity, stanowią wskaźnik diagnostyczny ogólnoustrojowej produkcji.
Markery te ulegają zwiększeniu w guzie chromochłonnym rdzenia nadnerczy (phaeochromocytoma).
syntezy barwników skóry i wytworów naskórkowych – melanin (melanogeneza):
DOPA →oksydaza katechlowa→ dopachinon
dopachinon →→→ trichochromy, feomelaniny (czerwone), melaniny mieszane, melanochrom
melanochrom i inne →→→ eumelaniny (ciemnobrązowe)
eumelaniny / feomelaniny + białka macierzy melanosomalnej → melanoproteiny
Zaburzenia enzymów szlaku melanogenezy prowadzą do hipopigmentacji bądź albinizmu.
o) Lizyna (Lys, K) jest dla człowieka aa egzogennym. Ulega ona katabolizmowi bez transaminacji do CO2
i H2O. Lys stanowi substrat do syntezy karnityny – przenośnika długołańcuchowych KT przez błonę
mitochondrialną (patrz punkt IV-5-b):
Lys → N6-trimetylo-Lys → N6-trimetylo-3-hydroksy-Lys → karnityna
MoŜe równieŜ ulegać mikrosomalnej hydroksylacji do Hyl.
p) Hydroksylizyna (Hyl, Lys-OH) jest endogenna, choć nie kodowana przez mRNA – powstaje z Lys pod
wpływem swoistej hydroksylazy na zasadzie analogicznej do syntezy Hyp z Pro:
Lys →hydroksylaza Lys, Fe2+, O2, wit. C, α-KG→ Hyl
105
- -
q) Histydyna (His, H) jest aa egzogennym. Ulega degradacji w następującym ciągu reakcji:
His →histydaza→ urokanian
urokanian →urokanaza→ 4-imidazolo-5-propionian
4-imidazolo-5-propionian →imidazolopropionaza→ N-formimino-Glu (FIGLU)
FIGLU + THF →formiminotransferaza Glu→ Glu + formimino-THF
His jest ponadto prekursorem aminy biogennej – histaminy:
His → dekarboksylaza aa aromatycznych / dekarboksylaza His → histamina
Dekarboksylaza His hamowana jest przez aa α-metylowe. Histamina bierze udział w rozwoju alergii i
stanu zapalnego. Katabolizowana jest przez imidazolo-N-metylotransferazę, monooksygenazę (MAO) i
dioksyganazę (DAO) do N-metyloimidazolooctanu. Histamina moŜe być wydzielana przez pewne guzy
przewodu pokarmowego (np. rakowiaka).
r)
Treonina (Thr, T) jest aa egzogennym. Katabolizm przebiega nastepująco:
Thr →aldolaza Th, PLP→ aldehyd octowy + Gly
aldehyd octowy →dehydrogenaza aldehydowa→ octan →syntaza AcCoA→ AcCoA
s)
Metionina (Met, M) równieŜ jest egzogenna. Ulega następującym reakcjom katabolicznym:
Met →aktywacja, - CH3, - S, - NH3→ α-ketomaślan
α-ketomaślan →oksydacyjna karboksylacja→ α-KG
α-KG → - CO2 → propionylo-CoA
propionylo-CoA → + CO2 → metylomalonylo-CoA
metylomalonylo-CoA →wit. B12→ sukcynylo-CoA
Dzięki niepowtarzalnej budowie (grupa metylowa połączona z resztą cząsteczki przez atom siarki) Met
bierze udział w przenoszeniu grup metylowych na inne związki:
Met + ATP →adenozylotransferaza Met→ S-adenozylo-Met (SAM)
SAM + X →transmetylaza→ SA-homocysteina + X-CH3
SA-homocysteina →adenozylotransferaza→ homocysteina
Ponadto dekarboksylowana SAM bierze udział w syntezie poliamin (patrz Orn), zaś homocysteina – w
syntezie Cys (patrz Cys).
t)
Tryptofan (Trp, W) zaliczany jest do aa egzogennych. Ulega on katabolizmowi w skomplikowanym
szlaku kinureninowo – antranilanowym z udziałem PLP do CO2 i H2O. Trp jest prekursorem związków
aktywnych biologicznie: serotoniny oraz melatoniny:
Trp →hydroksylaza Trp→ 5-hydroksy-Trp (5-HTP)
5-HTP →dekarboksylaza 5-HTP / aa aromatycznych→ 5-hydroksytryptamina (5-HT, serotonina)
5-HT →transmetylaza hydroksyindolowa (HIOMT)→ 5-metoksytryptamina
5-HT →MAO→ 5-hydroksyindolooctan (HIAA)
5-HT →N-Ac-transferaza 5-HT→ N-Ac-5-HT
N-Ac-5-HT →HIOMT→ N-Ac-5-metoksytryptamina = melatonina
Serotonina bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, m. in. w regulacji motoryki przewodu
pokarmowego oraz agregacji trombocytów (patrz punkt VI-4-d). Serotonina i jej metabolity (HIAA),
podobnie jak histamina, mogą być wydzielane przez guzy neuroendokrynne przewodu pokarmowego
(np. rakowiaka). Oznaczenie poziomu HIAA w moczu odzwierciedla ogólnoustrojową produkcję
serotoniny.
106
- -
u) Walina (Val, V), leucyna (Leu, L) oraz izoleucyna (Ile, I) są określane wspólnie jako aa o
rozgałęzionym łańcuchu bocznym. Cała grupa jest egzogenna. Ulegają one rozkładowi w wątrobie,
nerkach, mięśniach, sercu oraz tkance tłuszczowej.
Zaburzenie aktywności dehydrogenazy ketokwasów poch. z aa rozgałęzionych jest przyczyną choroby
syropu klonowego (nazwa wzięła się od charakterystycznego zapachu moczu osób na nią cierpiących).
Nieprzestrzeganie diety prowadzi do upośledzenia fizycznego i umysłowego.
• Punkty wejścia metabolitów aa do cyklu Krebsa:
← szczawiooctan ← Asp ← Asn
← cytrynian ←
AcCoA ← Ile, Leu, Trp
← Pyr ← Ala, Cys, Gly, Hyp, Ser, Thr
← AcAcCoA ← Leu, Lys, Phe, Trp, Thr
← α-ketoglutaran ← Glu ← Arg, His, Gln, Pro
← sukcynylo-CoA ← Ile, Met, Val
← fumaran ← Phe, Tyr
4.
Przemiana nukleotydów
a)
trawienie kwasów nukleinowych w przewodzie pokarmowym
sok trzustkowy – rybonukleaza, dezoksyrybonukleaza → trawienie kwasów nukleinowych do
nukleotydów
sok jelitowy – polinuklotydazy, nukleozydazy (→ rozkład nukleotydów do zasad N i pentozo-{P})
107
- -
b) budowa nukleotydów (patrz punkt VIII-1-a)
A = 6-aminopuryna
G = 2-amino-6-oksypuryna
H = 6-oksypuryna
X = 2,6-dioksypuryna
O = kwas 2,4-diokso-1,2,3,6-tetrahydro-4-pirymidynowy
U = 2,4-dioksypirymidyna
C = 2-oksy-4-aminopirymidyna
T = 2,4-dioksy-5-metylo-pirymidyna
c)
biosynteza nukleotydów purynowych
•
Szlak ten jest o tyle istotny, o ile pobrane z pokarmem zasady azotowe nie są wcale lub prawie wcale
wbudowywane do endogennych kwasów nukleinowych.
Głównym narządem syntezy puryn jest wątroba. Zdolności tej pozbawiony jest mózg, erytocyty i
leukocyty wielojądrzaste.
synteza de novo – z amfibolicznych związków pośrednich (kreski z prawej strony oznaczają
występowanie aktywności enzymatycznych w kompleksach; N – ogólny symbol nukleotydu)
•
•
108
- -
109
- -
• reakcje rezerwowe (ang. „salvage”)
fosforylacja puryn:
A + PRPP →{P}-rybozylotransferaza adeninowa→ AMP + PPi
H + PRPP →{P}-rybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa (HGPRT-aza)→ IMP + PPi
G + PRPP →HGPRT-aza→ GMP + PPi
fosforylacja nukleozydów purynowych:
N-R + ATP →kinaza→ NMP + ADP
•
regulacja syntezy puryn
•
biosynteza dezoksyrybonukleodytów (redukcja rybonukleotydów)
d) degradacja puryn – zachodzi gł. w wątrobie i prowadzi do powstania kwasu moczowego
110
- -
U człowieka ostatecznym produktem katabolizmu purynowego jest kwas moczowy. Większość innych
ssaków potrafi natomiast utleniać mocznik do alantoiny, nazwanej tak od jednej z błon płodowych – omoczni
(łac. allantois) – w której ulega gromadzeniu. Kwas moczowy pełni rolę antyoksydantu, co stanowi przewagę
nad alantoiną, jest jednak od niej kilkukrotnie gorzej rozpuszczalny w wodzie. Z tego powodu przy nadmiernym
stęŜeniu we krwi (hiperurykemii) ulega wytrąceniu, uszkadzając nerki (kamica moczanowa, niewydolność) i
stawy (guzki dnawe – dna moczanowa). Przyczynami hiperurykemii mogą być: wysoka podaŜ puryn i/lub
fruktozy w diecie, głodzenie, jednoczesny rozpad duŜej ilości komórek – np. rozległe urazy, oparzenia, zespół
rozpadu guza (TLS) towarzyszący nowotworom układu krwiotwórczego. Postępowanie lecznicze obejmuje:
odpowiednią dietę,
zmniejszenie syntezy kwasu moczowego – inhibitory oksydazy ksantynowej (allopurinol),
zwiększenie rozpuszczalności moczanów w moczu przez podniesienie jego pH – np. inhibitory
anhydrazy węglanowej (acetazolamid),
podanie enzymu rozkładającego kwas moczowy do alantoiny – rekombinowana urykaza (rasburikaza)
e)
odzysk puryn – cykl nukleotydów purynowych
f)
synteza nukleotydów pirymidynowych
111
- -
•
synteza de novo
• szlaki rezerwowe
fosforylacja pirymidyn, np. OA + PRPP →rybozylotransferaza orotanowa→ OMP + PPi
fosforylacja rybonukleotydów:
U-R + ATP →kinaza urydynowo-cytydynowa→ UMP + ADP
C-R + ATP →kinaza urydynowo-cytydynowa→ CMP + ADP
C-dR + ATP →kinaza deoksycytydynowa→ dCMP + ADP
T-dR + ATP →kinaza tymidynowa→ dTMP + ADP
•
regulacja syntezy pirymidyn
112
- -
g) degradacja pirymidyn → produkty rozpuszczalne w wodzie
h) kwas foliowy; zaburzenia przemiany nukleotydów
• rola kwasu foliowego w metabolizmie nukleotydów
kwas foliowy = pterydyna + PABA + Glu
W jelicie kwas foliowy ulega reduktazie folianowej zaleŜnej od NADPH, dając DHF (reakcję hamuje
trimetoprim) oraz THF (hamuje metotreksat (MTX)).
Rolą THF jest udział w przenoszeniu reszta jednowęglowych (C1):
Niedobór kwasu foliowego i/lub wit. B12 uniemoŜliwia syntezę nukleotydów purynowych i TMP, a
przez to niedokrwistość megaloblastyczną.
• Synteza puryn blokowana jest przez analogi Glu:
azaseryna → blok włączania N3
diazanorleucyna → blok włączania N9
azatiopryna → 6-merkaptopuryna (6MP) → bezpośredni blok powstawania AMP i XMP
kwas mykofenolowy (MPA) → bezpośredni blok powstawania XMP
• Analogi pirymidyn kompetycyjnie hamują enzymy biorące udział w ich biosyntezie ({P}rybozylotransferaza orotanowa, np. 5-fluorouracyl (5FU), allopurinol.
113
- -
•
•
Wydalanie i reabsorpcja moczanów są kompetycyjnie hamowane przez wysokie dawki ASA.
Klasyfikacja chorób przebiegających z hiperurykemią:
prawidłowe wydalanie moczanów, defekt pracy nerek
nadmierna produkcja i wydalanie moczanów
niedobór enzymatyczny (sPRPP, HGPRT, glukozo-6-fosfataza)
wtórna patologia (nowotwór, łuszczyca)
nieznana etiologia
• Przyczyną dny moczanowej jest enzymatyczne upośledzenie katabolizmu puryn (↑ vm, ↓ KM lub brak
regulacji syntazy PRPP, niedobór HGPRT-azy). Hiperurykemia prowadzi do krystalizacji moczanów w
stawach w postaci guzków dnawych, przeciwko którym skierowana zostaje odpowiedź zapalna.
Rozwija się przewlekłe dnawe zapalenie stawów dające artretyzm.
• W zespole Lescha – Nyhana występuje deficyt aktywności HGPRT-azy, co powoduje ↑ PRPP →
↑ puryn → hiperurykemia, kamica moczanowa, poraŜenie móŜdŜkowe, samookaleczenia.
• Choroba von Gierkego polega na niedoborze glukozo-6-fosfatazy, co powoduje ↑ PRPP, hiperurykemię
i kwasicę mleczanową.
• Niedobór aktywności oksydazy ksantynowej moŜe być spowodowany mutacją kodującego genu lub
silnym uszkodzeniem wątroby. Objawia się hiperurykemią, ksantynurią i kamicą ksantynową.
• niedobór transaminazy → kwasica β-aminoizomaślanowa
• niedobór ornitynotranskarbamoilazy → lekka kwasica orotowa, nietolerancja białek, encefalopatia
wątrobowa
• orotoacudyria:
typ II – defekt dekarboksylazy orotydylanowej → anemia megaloblastyczna
typ I – j. w. + defekt {P}-rybozylotransferazy orotanowej → j. w. + niedobór immunologiczny
• niedobór deaminazy adenozynowej (1) lub fosforylazy nukleotydu purynowego (2) → nagromadzenie
nie rozłoŜonego dATP i gGTP → allosteryczne zahamowanie reduktazy rybonukleotydowej →
pozbawienie komórek dCTP → niedobór immunologiczny: (1) → limfocyty T i B, (2) → tylko
limfocyty T
5.
Metabolizm porfiryn
•
struktura porfiny – 4 pierścienie pirolowe (I – IV) połączone mostkami metinowymi (α – δ)
(por. punkt I-3-e)
•
•
podstawniki: A = octan, M = metyl, P = propionian, V = winyl
gł. hemoproteiny: mioglobina, hemoglobina, cytochrom c, cytochrom P450 (CYP), katalaza (CT), 2,3dioksygenaza Trp, syntaza tlenku azotu (NOS)
114
- -
a)
synteza hemu – 85 % zachodzi w komórkach erytroidalnych szpiku, zaś prawie cała reszta w wątrobie
• regulacja syntezy hemu zachodzi na etapie syntazy ALA i polega gł. na modulacji ekspresji genów
← (-) hem + aporepresor
← (+) leki metabolizowane przez CYP (barbiturany, gryzeofulwina)
← (-) podawanie glukozy lub hematyny
115
- -
b) rozkład hemu – część porfirynowa katabolizowana jest przez komórki układu siateczkowo –
śródbłonkowego (RES) wątroby, śledziony i szpiku
c)
zaburzenia metabolizmu porfiryn
Porfirie to wrodzone (dziedziczone gł. AD) lub nabyte choroby związane z wadliwą syntezą hemu.
ZaleŜnie od enzymu, którego dotyczy defekt, wyróŜnia się 5 typów choroby. Nagromadzenie ALA i PBG w
tkankach i płynach ustrojowych powoduje toksyczne działanie na nerwy brzuszne, stąd bóle brzucha. Wychwyt
ALA przez mózg i jego hamujący wpływ na aktywność ATP-azy powoduje upośledzenie neurotransmisji i przez
to – zaburzenia neuropsychiczne. Zwiększony poziom porfirynogenów w skórze i tkankach, połączony z ich
samorzutnym utlenianiem się do porfiryn pod wpływem światła, znacznie nasila stres oksydacyjny; wolne
rodniki uszkadzają organella komórkowe, m. in. lizosomy, które uwalniają enzymy, niszczące skórę i
powodujące jej bliznowacenie (stąd nadwraŜliwość na światło). Leczenie polega na unikaniu leków i alkoholu,
podawaniu glukozy, hematyny (hamują syntezę hemu) i β-karotenu (antyoksydant) oraz aplikowaniu na skórę
filtrów hamujących promienie światła widzialnego u UV.
116
- -
hiperbilirubinemia → dyfuzja do tkanek → Ŝółtaczka
↑ produkcja ← np. hemoliza
hiperbilirubinemia retencyjna = miąŜszowa
↑ bilirubina nie sprzęŜona = pośrednia
→ Ŝółtaczka jąder podstawnych (kernicterus)
↓ usuwanie ← np. uszkodzenie wątroby, niedobór
enzymu, mechaniczna blokada odpływu
hiperbilirubinemia zwrotna = zastoinowa
↑ bilirubina sprzęŜona = bezpośrednia
→ ↑ bilirubina w moczu (choluria)
hiperbilirubinemia z dominacją bilirubiny nie sprzęŜonej
anemia hemolityczna
fizjologiczna Ŝółtaczka noworodków ← hemoliza HbF i niewydolność enzymatyczna wątroby w
zakresie dostatecznie szybkiego usuwania bilirubiny pośredniej; Ŝółtaczka jąder podstawnych
mózgu powoduje upośledzenie umysłowe; leczenie obejmuje podawanie fenobarbitalu (nasila
proces sprzęgania) oraz fototerapię (stymuluje rozkład bilirubiny w skórze)
zespół Criglera – Najjara
typ I – wrodzona Ŝółtaczka niehemolityczna ← defekt UDP-glukuronylotransferazy
typ II – podobny defekt o łagodniejszym przebiegu
zespół Gilberta ← defekt wychwytu i sprzęgania bilirubiny
hiperbilirubinemia toksyczna ← uszkodzenie wątroby: CCl4, CHCl3, arsfenamina (Salwarsan),
acetaminofen (Paracetamol), WZW, marskość, zatrucie grzybami (muchomory – amanototoksyny)
hiperbilirubinemia z dominacją bilirubiny sprzęŜonej
niedroŜność przewodów Ŝółciowych, ucisk przez guz trzustki → cholestaza → Ŝółtaczka
cholestatyczna
zespół Dubina – Johnsona, przewlekła Ŝółtaczka samoistna – defekt przenośnika sprzęŜonej
bilirubiny do kanalików Ŝółciowych
zespół Rotora – defekt transportu anionów organicznych przez hepatocyty
typ Ŝółtaczki
fizjologia
hemolityczna
mechaniczna
typ Ŝółtaczki
fizjologia
hemolityczna
wątrobowa
mechaniczna
bilirubina sprzęŜona w moczu
w normie
+
bilirubina w surowicy
+
↑ pośrednia
↑
↑ bezpośrednia
bilirubina w moczu
–
–
+/–
+
117
- -
urobilinogen w moczu
niewiele
↑
-
urobilinogen w moczu
+
↑
↓/+
–
urobilinogen w kale
+
↑
↓
–
ROZDZIAŁ VII – BIOCHEMIA FUNKCJONALNA TKANEK
1.
Endogenne regulatory procesów metabolicznych
a)
regulacja metabolizmu przez hormony, mechanizmy regulacji, receptory, przekaźniki wtórne
•
receptory
Działanie hormonu na komórkę rozpoczyna się od połączenia z wysoko swoistym receptorem. Są to
struktury zapewniające wychwyt hormonów juŜ w bardzo niewielkich stęŜeniach, 106 – 109 x mniejszych niŜ
cząsteczki o podobnej budowie. Oprócz swoistości receptory charakteryzują się duŜym powinowactwem, szybką
odwracalnością oraz wysycalnością.
W strukturze receptora wyróŜniamy dwie domeny czynnościowe – rozpoznającą (przyłącza hormon) oraz
sygnalizacyjną (przekłada informację na czynność wewnątrzkomórkową – tzw. sprzęŜenie receptorowo –
efektorowe). Receptory składają się z kilku części, np. nAChR – z 5, insulinowy – 4, kaskadowy cAMP – 7,
steroidowy – 4.
JeŜeli chodzi o umiejscowienie, to hormony białkowe, polipeptydowe i katecholaminy łączą się z
receptorami błonowymi, modulującymi aktywność enzymów, zaś hormony sterydowe, tarczycowe i retinolowe
stanowią ligandy dla receptorów śródkomórkowych (cytozolowych lub jądrowych), które modyfikują ekspresję
genów. Receptory sieroce są spokrewnione z rodziną receptorów typu steroidowo – tarczycowego, ale nie
posiadają znanego ligandu. Przykładowo receptor glikokortykoidowy ma budowę: C koniec – domena wiąŜąca
hormon – domena wiąŜąca DNA (ściślej sekwencję odpowiedzi hormonalnej – HRE) – 2 regiony aktywujące
transkrypcje genu – 2 regiony translokacji z cytoplazmy do jądra – region wiąŜący Hsp (białko szoku cieplnego,
chaperon) w nieobecności ligandu – N koniec.
•
hormony
Hormony są cząsteczkami chemicznymi, które po związaniu ze swoistymi receptorami modulują
czynności Ŝyciowe komórki. Hormony są substancjami endogennymi, co odróŜnia je od wielu ksenobiotyków,
które równieŜ mogą wywoływać efekty biologiczne.
Hormony klasyfikować moŜna ze względu na róŜne kryteria. Pod względem struktury chemicznej
mówimy o pochodnych aminokwasów, polipeptydach i steroidach. Mogą to być cząsteczki rozpuszczalne w
wodzie (hydrofilne) lub w tłuszczach (lipofilne). Receptory dla hormonów mogą być zlokalizowane na
powierzchni komórki bądź w jej wnętrzu. Wreszcie odnośnie II przekaźnika – moŜe nim być kompleks hormonu
z receptorem, cAMP, cGMP, PIP2, Ca2+ lub kaskada kinazowa. PowyŜsze cechy układają się w pewne wzory, co
pozwala na klasyfikacją hormonów na dwie główne grupy.
Pierwsza grupa hormonów obejmuje steroidy, jodotyroniny, kalcytriol i retinoidy. Są to związki lipofilne,
dlatego do transportu w osoczu wymagają białek nośnikowych, co przedłuŜa ich okres półtrwania do rzędu
godzin lub dni. Jednocześnie lipofilność pozwala im na przenikanie przez błony wszystkich komórek, jednak
wywierają efekty biologiczne wyłącznie tam, gdzie znajduje się swoisty dla nich receptor. Połączenie hormonu
pierwszej grupy z receptorem śródkomórkowym daje II przekaźnik. Taki kompleks ulega aktywacji (np. przez
odłączenie Hsp90 w receptorze glikokortykoidowym), po czym moŜe migrować do jądra i wiązać się z
chromatyną, aktywując lub dezaktywując określone geny. Modyfikacja moŜe zachodzić na róŜnych etapach
szlaku informacyjnego: transkrypcji, translacji, stęŜenia swoistych białek (nie więcej niŜ 1%). WyróŜnić moŜna
dwa miejsca regulujące gen i połoŜone przed nim, na które moŜe wpłynąć hormon: nieswoisty element
promotorowy określający miejsce wiązania polimerazy RNA II oraz swoista sekwencja odpowiedzi hormonalnej
(HRE) składająca się z kilku fragmentów i odpowiedzialna za modulację częstości inicjacji transkrypcji (HRE
wiąŜe się z kompleksem silniej niŜ inne fragmenty DNA – por. punkt VIII-3-b). Geny kontrolowane przez kilka
hormonów mają odpowiednią liczbę HRE. Zmienna ilość HRE i fragmentów DNA współtworzy jednostki
odpowiedzi hormonalnej (HRU) – ich analiza pozwala na całościową ocenę wpływu hormonu na komórkę.
Aktywność genów moŜe być modulowana przez hormony peptydowe równieŜ za pośrednictwem cAMP oraz
CREB.
118
- -
grupa hormonów
hormony płciowe: androgeny, estrogeny, progestyny
hormony kory nadnerczy: gliko- i mineralokortykoidy
hormony tarczycy: trójjodotyronina i tyroksyna
kalcytriol (aktywna witamina D3)
kwas retinolowy (poch. witaminy A)
swoisty HRE
ARE, ERE, PRE
GRE, MRE
TRE
VDRE
RARE
Druga grupa hormonów składa się z polipeptydów, białek i katecholamin. Są to cząsteczki hydrofilne, nie
transportowane w połączeniach z białkami nośnikowymi, dlatego ich okres półtrwania jest rzędu minut. Po
związaniu z receptorem błonowym uwalniany jest II przekaźnik – w zaleŜności od niego wyróŜniamy 4
podgrupy:
podgrupa
II A
II przekaźnik
cAMP
II B
II C
cGMP
Ca2+ / PIP2
II D
kaskada kinaz
przykłady hormonów i receptorów
(+) ACTH, CT, FSH, hCG, ADH, CRH, LPH, LH, MSH, PTH, TSH,
glukagon, katecholaminy (receptor β)
ANF, NO
receptory M (ACh), CCK, PDGF, OT, TRH, ADH, PS, angiotensyna II,
gastryna, gonadoliberyna, katecholzminy (receptory α1)
FGF, IGF-I/II, EGF, NGF, PDGF, EPO, GH, CS, PRL, insulina
Hormony grupy II A wpływają na cyklazę adenylanową (AC), aktywując ją (HS+) lub dezaktywując (Hi-).
Aktywna cyklaza katalizuje przejście ATP w cykliczny AMP (cAMP). Ten sam hormon moŜe jednak róŜnie
zmieniać poziom cAMP w róŜnych tkankach, np. adrenalina działa głównie na mięśnie, a glukagon głównie na
wątrobę. JeŜeli tkanka reaguje na kilka hormonów tej samej podgrupy, to musi posiadać dla kaŜdego z nich
niepowtarzalny receptor, regulujący na właściwy sobie sposób aktywność cyklazy. Równoczesne działanie
hormonów na komórkę nie jest jednak addytywne.
Cyklaza adenylanowa nie występuje samodzielnie, lecz jako fragment większego kompleksu – receptor
dla hormonów tej podgrupy składa się ponadto z części wiąŜącej hormon oraz białka G. Bezpośredni receptor
składa się z 7 hydrofobowych transbłonowych domen; poprzez zmiany konformacji pod wpływem hormonu ma
on zdolność indukcji białka G. Samo zaś białko G (białko wiąŜące GTP – GTPBP) jest heterotrimerem o
budowie αβγ. Istnieje wiele odmian GTPBP – wyróŜniona dotychczas 16 odmian podjednostki α, 6 β, 12 γ oraz
8 odmian cyklaz. Podjednostki β i γ są ściśle ze sobą związane i zakotwiczone w błonie dzięki posttranslacyjnej
poliprenylacji resztami farnezylu oraz mirystylacji. Podjednostka α jest mobilna i w zaleŜności od jej
występowania w wersji αS lub αi mówimy o białkach G pobudzających (GS) oraz hamujących (Gi). Indukcja
przez bezpośredni receptor katalizuje reakcję: GDP-αβγ + GTP → GTP-α + βγ + GDP, zaś powrót do stanu
wyjściowego moŜliwy jest dzięki GTP-azowej aktywności podjednostki αS. Toksyna cholery jest
nieodwracalnym aktywatorem cyklazy przez zniesienie aktywności GTP-azy, podobnie toksyna krztuśca przez
zniesienie aktywności podjednostki αi. Podjednostka α związana z GTP aktywuje odpowiedni efektor – moŜe
nim być nie tylko cyklaza adenylanowa, lecz równieŜ kanały potasowe, wapniowe lub fosfolipaza C (PLC).
Dzięki temu kompleksy białek biorą udział w regulacji metabolizmu, skurczu mięśnia, akcji serca i ciśnienia
tętniczego, aktywności nerwowej oraz w percepcji wzrokowej i węchowej.
cAMP wywiera odpowiednie efekty fizjologiczne poprzez połączenie z heterotetrameryczną cząsteczką
kinazy zaleŜnej od cAMP. Składa się ona z dwóch podjednostek regulatorowych (R) i dwóch katalitycznych (C):
4 cAMP + R2C2 → R2(cAMP)4 + 2 C. Uwolniona i przez to zaktywowana podjednostka katalityczna katalizuje
przeniesienie reszty γ-fosforanowej z ATP na serynę lub treoninę odpowiedniego białka, zazwyczaj w sekwencji
RRXS lub KRXXS. Powstanie fosfoprotein wywołuje efekty biologiczne, jako Ŝe fosforylacja dotyczy
najczęściej cząsteczek enzymów. Dochodzą do tego wtórne fosforylacje oraz wpływ cAMP na geny poprzez
białko CREB. Przerwanie działania odbywa się głównie przez hydrolizę cAMP do 5’-AMP przez
fosfodiesterazy (PDE). Podlegają one regulacji przez inne hormony, kompleks Ca2+-kalmodulina oraz
ksenobiotyki (np. metyloksantyny). RównieŜ fosfoproteiny ulegają rozkładowi przez fosfatazy, które z kolei
mogą znów być regulowane przez odwracalną fosforylację oraz interakcje z białkami.
Hormony grupy II B działają podobnie na cyklazę guanylanową, katalizującą przejście GTP w cGMP.
Ten ostatni pełni funkcję II przekaźnika dla atriopeptyn (np. ANF), wywołując natriurezę, diurezę,
wazodylatację oraz spadek produkcji aldosteronu. Podobnie działają: tlenek azotu (NO), nitroprusydek sodu,
nitrogliceryna, azotyn sodu (NaNO2), azydek sodu (NaN3) – dzięki fosforylacji łańcuchów lekkich miozyny
miocyty ulegają relaksacji, a naczynia – rozszerzeniu. Efekt ten wzmagają inhibitory PDE, np. cytrynian
sildenafilu (preparat Viagra).
119
- -
Jon wapniowy (Ca2+) jest istotnym regulatorem wewnątrzkomórkowym, biorącym udział w skurczu
mięśnia, hemostazie, przekaźnictwie synaptycznym oraz modyfikacji aktywności enzymów. Pomimo znacznego
gradientu stęŜenia – ok. 5 – 10 tys. x (Ca2+ w ECF ≈ 2,5 mM a w ICF ≈ 0,1 – 10 µM) – transport przez błonę jest
ograniczony. Stan taki moŜne być zmieniony przez działanie hormonów podgrupy II C, mobilizujących
wymiennik Na+/Ca2+ (duŜa pojemność a małe powinowactwo). Ponadto występują: wymiennik Ca2+/H+ (duŜe
powinowactwo a mała pojemność) oraz mechanizm mobilizacji wapnia z mitochondriów i ER. Wiele swoistych
efektów Ca2+ wywiera przez zaleŜne od siebie białko regulatorowe – kalmodulinę. Po wysyceniu w nim czterech
miejsc wiąŜących Ca2+ zmiany konformacyjne prowadzą do uformowania α-helisy, co pozwala na modyfikację
aktywności enzymów. Często kalmodulina stanowi fragment większego kompleksu białkowego, w których pełni
wówczas funkcje regulatorowe. Połączenie Ca2+-kalmodulina jest w stanie modyfikować aktywność
następujących enzymów: cyklaza adenylanowa, cyklaza guanylanowa, PDE, Ca2+-zaleŜna kinaza białkowa,
kinaza białkowa zaleŜna od Ca2+ i fosfolipidów, kinaza miozyny, kinaza fosforylazy, kinaza NAD+, fosfataza
fosfoproteinowa 2B, fosfolipaza A2, kinaza pirogronianowa, dehydrogenaza pirogronianowa, karboksylaza
pirogronianowa, Ca2+/Mg2+-ATP-aza, dehydrogenaza glicerolo-3-{P}, syntaza glikogenowa.
Szlak polifosfoinozytolowy polega na aktywacji fosfolipazy C (PLC) oraz otwarciu kanałów wapniowych
przez kompleks receptora z hormonem za pośrednictwem białka G. PLC katalizuje rozpad błonowego
fosfatydyloinozytolodwufosforanu (PIP2) do inozytolotrójfosforanu (IP3) oraz diacyloglicerolu (DAG). Ten
pierwszy indukuje uwalnianie wapnia z ER i mitochondriów. Wzrost cytozolowego poziomu wapnia powoduje
jego łączenie z kalmoduliną oraz konsekwentną aktywację kinaz kalmoduliny – swoistej i wieloczynnościowej.
IP3 moŜe ulec przekształceniu w nieaktywny IP2 lub w potencjalnie aktywny IP4. 1,2-DAG wraz z Ca2+ aktywuje
kinazę białkową C (PKC). Kinazy kalmoduliny oraz PKC fosforylują odpowiednie białka. Powstałe
fosfoproteiny oraz inne skutki działania Ca2+ wywołują reakcje biologiczne.
Hormony grupy II D działają przez kaskadę kinaz białkowych. Do tej grupy naleŜą regulatory procesów
wzrostu i róŜnicowania oraz reakcji zapalnych. Hormon bezpośrednio lub pośrednio (tj. odpowiednio przez
receptor bądź proteiny Tyk-2 czy JAK-1/2) aktywuje kinazy tyrozynowe, które dalej katalizują lawinę
fosforylacji.
b) eikozanoidy – budowa, powstawanie i funkcje metaboliczne
Eikozanoidy są pochodnymi kwasu arachidonowego oraz innych 20-węglowych kwasów tłuszczowych z
wiązaniami podwójnymi poprzedzielanymi grupami metylenowymi. Związki te pełnią funkcje lokalnie
działających hormonów, oddziaływujących na komórki docelowe za pośrednictwem receptorów związanych z
białkami G. Cząsteczka kwasu arachidonowego pochodzi zazwyczaj z pozycji sn-2 fosfolipidów błonowych,
skąd odszczepiana jest przez fosfolipazę A2 (PLA2); proces ten nasila adrenalina, angiotensyna II, bradykinina,
trombina oraz Ca2+. Następnie od arachidonianu rozpoczyna się szlak cyklooksygenazy (PG, PGI, TX) oraz
lipoksygenazy (LT, LX). WyróŜniamy 3 grupy (I, II, III) eikozanoidów powstających z kwasów tłuszczowych
zawartych w diecie: linolowego, arachidonowego oraz α-linolenowego. Eikozanoidy charakteryzuje się podając,
do której z 5 rodzin naleŜą, dodając literę, oznaczającą ilość i rodzaj podstawników oraz liczbę, oznaczającą
całkowita ilość wiązań podwójnych oraz serię.
Biosynteza prostanoidów jest katalizowana przez syntazę prostaglandyny H (PGHS, izoenzym 1 i 2),
posiadającą aktywność cyklooksygenazy (COX) i peroksydazy: arachidonian + 2 O2 → PGG2 → PGH2.
Powstały endoperoksyd moŜe ulec przekształceniu do: PGD2 (izomeraza), PGE2 (izomeraza) i dalej PGF2α
(reduktaza), PGI2 (syntaza prostacyklinowa) i dalej 6-keto-PGF1α, TXA2 (syntaza tromboksanowa) i dalej TXB2
oraz do malonylodwualdehydu i hydroksyheptadekatrienoanu (HHT). Podobne przekształcenia zachodzą w
grupach I i III.
Cyklooksygenaza wykazuje zdolność katalizowania samozagłady – gdy zaprzestaje syntezy prostanoidów
rozkłada samą siebie. Ze względu na udział prostanoidów w rozwoju stanu zapalnego wiele leków p/zapalnych
uderza właśnie w układ PGHS. Substancje p/zapalne moŜna podzielić na sterydowe i niesterydowe.
120
- -
Fizjologicznie kortykosteriody całkowicie hamują transkrycję PGHS-2. Kwas acetylosalicylowy acyluje i
inaktywuje PGHS. Wiele niesteroidowych leków p/zapalnych (NLPZ, ang. NSAID) kompetycynie hamuje
cyklooksygenazę, np. ibuprofen czy indometacyna. Raz powstałe prostanoidy ulegają degradacji przez
dehydrogenazę 15-hydroksyprostaglandynową; wpływ ten jest hamowany przez sulfasalazynę i indometacynę.
Szlak lipoksygenazy prowadzi do powstania leukotrienów (LT) i lipoksyn (LX). LT to sprzęŜone trieny
wytworzone w leukocytach, mastocytach i trombocytach. Występują tam 5-, 12- oraz 15-lipoksygenaza, które
przekształcają arachidonian w hydroksyperoksyeikozatetraenoany (HPETE), te zaś z kolei pod wpływem
peroksydazy dają hydroksyeikozatetraenoany (HETE). Przez dehydratację 5-HPETE powstaje LTA4, który
hydrolaza epoksydu LTA4 przekształca w LTB4, zaś S-transferaza glutationowa w LTC4. Następnie GGTP
przekształca LTC4 w LTD4, zaś dwupeptydaza Cys-Gly – LTD4 w LTE4. LX są sprzęŜonymi tetraenami
powstającymi w leukocytach pod wpływem więcej niŜ jednej lipoksygenazy, natomiast ich dalsze
przekształcanie w LXA4-E4 zachodzi podobnie jak LT.
Prostaglandyny (PG) i prostacykliny (PGI) biorą udział w rozwoju stanu zapalnego, regulacji szerokości
naczyń krwionośnych ((-): PGA, PGE, PGI, (+): PGF), PGI2-3 produkowane w śródbłonku zapobiegają agregacji
trombocytów, zawarte w nasieniu pobudzają mięśniówkę macicy, wydzielane przez płód indukują poród;
stosowane są w antykoncepcji, aborcji, chorobie wrzodowej Ŝołądka, stanie zapalnym, nadciśnieniu, astmie
oskrzelowej i nieŜycie nosa. Tromboksany (TX) produkowane przez płytki autokrynnie indukują ich agregację i
zwęŜają naczynia (TXA2). Leukotrieny (LT) produkowane są w leukocytach; wchodzą w skład substancji wolno
działającej anafilaksji (SRS-A) – LTC4-E4 wywołują silny skurcz oskrzeli. LTB4-E4 rozszerzają naczynia
krwionośne i zwiększają ich przepuszczalność oraz indukują chemotaksję i aktywację leukocytów, przez co
przyczyniają się do rozwoju odpowiedzi immunologicznej.
2.
Gospodarka wapniowo – fosforanowa w organizmie i jej regulacja
a)
rola wapnia oraz białek wiąŜących wapń
Wapń jest dla organizmu pierwiastkiem niezbędnym, pełniącym wiele bardzo rozmaitych funkcji.
Nieorganiczne sole wapnia (fosforany i węglany) stanowią jeden z głównych składników strukturalnych kości i
zębów. Wapń jest pierwiastkiem bardzo nierównomiernie rozmieszczonym w organizmie, a wzrost jego stęŜenia
w komórce powoduje liczne zmiany metaboliczne, m. in. przez łączenie z kalmoduliną, aktywację kinaz i
fosforylację odpowiednich białek, w tym wielu enzymów. Z kalmoduliną analogiczna jest podjednostka C
troponiny (TpC), a napływ Ca2+ do miocytu powoduje jego skurcz. W przypadku mięśni szkieletowych jest to
wapń organelli komórkowych (głównie retikulum sarkoplazmatycznego), zaś skurcz mięśni gładkich i mięśnia
sercowego zaleŜny jest równieŜ od zasobów pozakomórkowych. Brak kontroli nad rozkładem wapnia w
przestrzeniach wodnych organizmu prowadzi do stęŜenia pośmiertnego. Wiele leków naczyniowych i
nasercowych wywołuje swój efekt poprzez wpływ na czynność kanałów wapniowych. Depolaryzacja błony
kolbki aksonu powoduje otwarcie napięciowo–zaleŜnych kanałów wapniowych, wapń indukuje łączenie się
pęcherzyków zawierających neurotransmiter z błoną presynaptyczną, warunkuje zatem przekaźnictwo
synaptyczne. Wapń bierze równieŜ udział w hemostazie przez łączenie się z resztami Gla (γkarboksyglutaminianowymi) występującymi na osoczowych czynnikach krzepnięcia: II, VII, IX i X; efekt
biologiczny jest efektem interakcji białek, fosfolipidów i Ca2+. Ponadto wapń zwiększa szczelność naczyń i błon
komórkowych.
Ciało ludzkie zawiera ok. 1 kg wapnia, stanowiącego 4 % jego suchej masy. Z tej ilości aŜ 99 % tworzy
hydroksyapatyt kości, z czego tylko 1 % moŜe ulegać wymianie z pulą wapnia płynu pozakomórkowego; proces
ten podlega ścisłej regulacji hormonalnej. W osoczu wapń występuje w kompleksach z cytrynianami,
fosforanami i innymi anionami nieorganicznymi (6 %), w połączeniu z białkami (CBP, 47 %) oraz jako wolny i
zjonizowany (47 %). Ta ostatnia forma jest aktywna i ze względu na to wymaga najbardziej precyzyjnej
regulacji. Fizjologicznie łączny poziom wapnia we krwi wynosi 2,25 – 2,75 mM (9 – 11 mg%) – mówimy
wówczas o izokalcemii. Białka wiąŜące wapń z grupy albumin i globulin są po pierwsze niezbędne do
wchłaniania tego pierwiastka z przewodu pokarmowego (w pokarmie powinno kaŜdego dnia znaleźć się 0,8 –
1,2 mg), a po drugie zapobiegają przekroczeniu iloczynu rozpuszczalności i powstawaniu ektopowych
121
- -
kalcyfikacji. Hipoproteinemia wiąŜe się zatem z hipokalcemią. Podobnie obniŜenie pH powoduje przejście
wapnia z CBP do formy jonowej, zaś wzrost pH działa odwrotnie (wyjaśnia do drętwotę w zespole
hiperwentylacyjnym).
b) regulacja przemiany wapniowej
Wchłanianie wapnia obejmuje: wychwyt przez rąbek szczoteczkowy i błonę mikrokosmków, aktywny
transport przez błonę enterocytów oraz równieŜ aktywne wydalanie do płynu pozakomórkowego.
•
parathormon (PTH)
Niedoczynność przytarczyc moŜe być pierwotna (np. autoimmunologiczna), wtórna (jatrogenna) lub
rzekoma (defekt efektora). W kaŜdym przypadku powoduje obniŜenie stosunku Ca / {P}, moŜe powodować
tęŜyczkę, poraŜenie mięśni oddechowych, skurcz głośni, zmiany skórne, zaćmę oraz kalcyfikację jąder
podkorowych mózgu.
Nadczynność przytarczyc moŜe być pierwotna – w wyniku przerostu lub nowotworu. Stan taki, podobnie
jak wydzielanie peptydu podobnego do PTH (PTHRP), powoduje wzrost stosunku Ca / {P}, rozległą resorpcję
kości, kamicę nerkową, wapnicę i / lub niewydolność nerek, zapalenia dróg moczowych. Niewydolność nerek
powoduje spadek produkcji kalcytriolu i wtórną nadczynność przytaczyc – błędne koło chorobowe prowadzi do
osteodystrofii nerkowej.
•
Kalcytonina (CT) (32 aa) produkowana jest głównie przez komórki pęcherzykowe (parafolikularne,
komórki C) tarczycy. Przy N końcu obecna jest 7-aa pętla, połączona wiązaniem dwusiarczkowym.
Hiperkalcemia mobilizuje produkcję CT, to zaś zwiększa aktywność nerkowej 24-hydroksylazy;
powoduje to spadek poziomu kalcytiolu i konsekwentne obniŜenie [Ca2+] w ECF.
122
- -
•
kalcytriol – 1,25(OH)2-D3
Krzywica u dzieci a osteomalacja u dorosłych występuje wskutek spadku zarówno Ca2+ jak i {P}. Typ I
spowodowany jest deficytem aktywności 1α-hydroksylazy, zaś typ II – defektem motywu palca cynkowego w
receptorze i tym samym jego niewraŜliwości na ligand (por. punkt VIII-1-j).
c)
rola fosforanu nieorganicznego, regulacja przemiany fosforanowej, powiązania z gospodarką wapniową
ChociaŜ chemicznie czysty fosfor jest pierwiastkiem silnie szkodliwym, to w formie ortofosforanu
występuje w wielu związkach chemicznych ciała ludzkiego, nie wykazując działań toksycznych. Fosfor stanowi
2,5 % suchej masy ciała; dzienne zapotrzebowanie wynosi 800 – 1200 mg. Większość tego pierwiastka
zdeponowana jest w tkance kostnej w postaci hydroksyapatytu. Reszta fosforanowa przyłączona jest równieŜ do
wielu związków: kofaktorów (DPT, FMN, FAD, NAD+, NADP+, CoA, PLP), przenośników energii (ADP, ATP,
PCr), II przekaźników hormonalnych (cAMP, cGMP), kwasu fosfatydowego ({P} + glicerol + 2 FA)
wchodzącego w skład fosfolipidów błon plazmatycznych oraz nukleotydów i przez to DNA i RNA. O
wykorzystaniu fosforanu w procesach magazynowania energii decyduje szybki potencjał przenoszenia grupy,
czyli tzw. bogatoenergetyczne wiązania fosforanowe. Odwracalne dołączanie fosforanu do białek, katalizowane
przez kinazy i fosfatazy, umoŜliwia regulacje procesów metabolicznych oraz ich integracje na poziomie
komórki. Odłączenie pirofosforanu (PPi) w trakcie przemian chemicznych oraz jego rozkład do 2 {P} przez
nieorganiczną fosfatazę umoŜliwia zachodzenie wielu reakcji do końca.
Fosforan występuje w kościach i w osoczu (izofosfatemia 1 – 1,5 mM / 3 – 4,5 mg%) w połączeniu z
Ca2+ – ten fakt oraz wspólna regulacja hormonalna przyczyniły się do rozpatrywania ich wspólnie, dlatego mówi
się o gospodarce wapniowo – fosforanowej. Obecność we krwi anionów fosforanowych o róŜnym stopniu
uprotonowania pozwala na ich funkcjonowanie jako układu buforującego osocza. Ilość fosforanu zaleŜy od
przypływu z pokarmem i mobilizacji przez osteoklasty oraz od wydalania z moczem i deponowania jako
123
- -
hydroksyapatytu. Hiperfosfatemia mobilizuje PTH, który pobudza osteolizę i klirens {P}, wypadkowo
zmniejszając [{P}] w ECF. Kalcytriol z kolei obniŜa klirens {P}. Hipofosfatemia oddziałuje na kości równie
niekorzystnie jak hipokalcemia.
3.
Gospodarka Ŝelazem w organizmie – wchłanianie, regulacja, zaburzenia przemiany
śelazo dostarczane jest z pokarmem w ilości 10 – 15 mg dziennie, jednak z powodu małej wydajności
wchłaniania do krwiobiegu dostaje się tylko 1 mg. Wchłanianie Fe2+ zachodzi przez komórki krypt jelita czczego
przy udziale białka apoferrytyny. Następnie Ŝelazo łączy się z przenoszącym je białkiem – transferryną (β1globulina), która przenosi Fe3+ do szpiku i innych narządów. Transferryna po związaniu się z receptorem ulega
internalizacji na zasadzie endocytozy sterowanej receptorem. W lizosomach następuje oddzielenie Fe3+, po czym
kompleks apotransferrytyny z receptorem wędruje do błony, gdzie równieŜ ulega rozpadowi. Transferryna
występuje we krwi w stęŜeniu ok. 300 mg% i jest w stanie związać ok. 3 mg Fe / l osocza (tzw. całkowita
zdolność wiązania Ŝelaza = TIBC). Fizjologicznie wysycenie ferrytyny wynosi ok. 1/3, a zatem 3 – 4 mg w
całym organizmie.
W obrębie komórki Ŝelazo ulega wbudowaniu w hem, by następnie wejść w skład hemoprotein, do
których naleŜą: hemoglobina (2,5 g Fe), mioglobina, cytochromy (CYP, cyt. c), katalaza, dioksygenaza
tryptofanowa, syntaza tlenku azotu (NOS) i inne (łącznie 300 mg). KaŜdego dnia 1 % erytrocytów ulega
rozkładowi, uwalniając przez to 25 mg Ŝelaza, które ulega związaniu przez transferrynę.
Ferrytyna jest białkiem magazynującym Ŝelazo. Składa się z apoferrytyny (24 podjednostki x 18,5 kD =
444 kD) otaczającej 3 – 4 tys. atomów Ŝelaza występujących w postaci micelarnej. Częściowa degradacja
ferrytyny prowadzi do powstania hemosyderyny. W białkach magazynujących zgromadzone jest łącznie ok. 1 g
Ŝelaza.
KaŜdego dnia w wyniku złuszczania komórek nabłonka jelitowego zawierających Ŝelazo i wydalania ich
z kałem organizm traci ok. 1 mg Ŝelaza.
Ilość Ŝelaza w komórce wpływa na syntezę wiąŜących je białek oraz ich receptorów. Wzrost poziomu Fe
wzmaga translację mRNA ferrytyny oraz degradację mRNA receptora transferrynowo – ferrytynowego (TfR). Z
kolei spadek stęŜenia Fe nasila translację mRNA TfR, zaś unieczynnia mRNA apoferrytyny (por. punkt VIII-4e).
Zagadnienie przemian Ŝelaza jest istotne u kobiet z powodu comiesięcznych jego strat. Podobnie u
cięŜarnych dzienne zapotrzebowanie wzrasta do 25 mg. Do niedoboru dochodzić moŜe w wyniku
nieprawidłowego odŜywiania. Deficyt Ŝelaza moŜe powodować anemię (niedokrwistość), a erytrocyty są
wówczas hipochromiczne (niedobarwliwe). Nadmiar Ŝelaza w organizmie określa się jako hemochromatoza.
MoŜe być ona pierwotna (o podłoŜu genetycznym – mutacja 6p21.3) lub wtórna (w wyniku częstych transfuzji
lub gotowania w Ŝelaznych naczyniach). Przyczyną nadmiernego poziomu Ŝelaza (> 15 g w organizmie) jest
utrata regulacji wchłaniania tego pierwiastka. W nadmiernych ilościach Ŝelazo przyczynia się do nasilenia stresu
oksydacyjnego, który uszkadza wiele tkanek, gł. wątroby, trzustki, skóry i miokardium. Gromadzenie się w
skórze melaniny i Ŝelaza nadaje jej barwę szaro-ziemistą. Dodatkowo rozwija się marskość wątroby, cukrzyca,
kardiomiopatie, artropatie oraz bezpłodność. Leczenie polega na powtarzalnych upustach krwi oraz podawaniu
środków chelatujących (np. desferioksamina).
Haptoglobina (HAP) jest białkiem osocza związanym z transportem pozakrwinkowej hemoglobiny. HAP
występuje w surowicy w ilości 0,4 – 1,7 g / l, która pozwala związać 400 – 1800 mg HGB. Codziennie 10 %
katabolizowanej HGB przedostaje się do krąŜenia, skąd mogłaby być usuwana z moczem (65 kD), powodując
straty Ŝelaza i wytrącanie w świetle kanalików. HAP występuje w 3 formach polimorficznych (Hp 1-1, 2-1, 2-2),
z których kaŜda ma masę > 90 kD. Powstały kompleks HAP-HGB (155 kD) nie ulega przesączaniu, jest za to
wychwytywany i rozkładany przez hepatocyty, po czym Ŝelazo moŜe być wykorzystane ponownie. HAP jest
ponadto białkiem ostrej fazy. Hemopeksyna (β1-globulina) wiąŜe wolny hem; wpierw albumina tworzy z
methemem methemalbuminę, aby następnie przekazać go hemopeksynie.
4.
Biochemia krwi
a)
białka osocza i ich rola
Osocze krwi zawiera fizjologicznie 70 – 80 g/l białek. Są to zarówno białka proste (głównie albuminy),
jak i złoŜone (lipo-, gliko-, chromo- i metaloproteiny). Ze względu na budowę i ruchliwość elektroforetyczną
wyróŜniamy: albuminy (ok. 55%), globuliny α1, α2, β i γ (ok. 38%) oraz fibrynogen (7%). NajwaŜniejsze α1
globuliny to: kwaśna glikoproteina (α-seromukoid, orozomukoid), HAP, HDL1 i transkortyna, α2: CER, HDL2,
protrombina i α2-makroglobulina, β: LDL, transferyna i plazminogen. Stosunek ilości albumin do globulin
nazywamy wskaźnikiem białkowym osocza; wynosi on średnio 1,2 w elektroforezie oraz 1,7 przy wysalaniu;
124
- -
wzrasta w krwotokach, a maleje w stanie zapalnym, chorobach nerek i wątroby oraz deficycie białka w
poŜywieniu. Funkcje białek są bardzo istotne, jak i róŜnorodne:
• utrzymywanie ciśnienia onkotycznego (3,5 kPa / 25 mmHg), za co w 75 – 80 % odpowiedzialne są
albuminy,
• rola buforująca dzięki charakterowi amfoterycznemu,
• stabilizacja składników morfotycznych dzięki powierzchniowemu ładunkowi elektrycznemu (dlatego
wskaźnik białkowy osocza jest skorelowany z odczynem opadania krwinek – OB),
• hemostaza, m. in. obecność ok. 20 czynników krzepnięcia,
• funkcje odpornościowe – γ-globuliny (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD), układ dopełniacza (C1-9), białka
ostrej fazy (CRP, HAP, CER, AAT, kwaśna α1-glikoproteina = orozomukoid = seromukoid,
plazminogen, fibrynogen)
• aktywność enzymatyczna (np. ChE połączona przez GPI z RBC), diagnostyczne enzymy komórkowe
(AlAT, AspAT, GGTP, LDH, CPK),
• aktywność hormonalna (np. EPO),
• modyfikacja aktywności innych białek, np. antyproteazy: α1-antytrypsyna (AAT) – inhibitor proteaz
serynowych, antychymotrypsyna, α2-makroglobulina – inhibitor panproteinazowy,
• transport:
nieswoisty: albuminy (bilirubina, FFA, hormony, Ca2+, Cu2+, Zn2+, sulfonamidy, penicylina G,
dikumarol, kwas acetylosalicylowy), lipoproteiny (FA, TG, cholesterol i jego estry),
swoisty: Fe (transferyna, ferrytyna, hemosyderyna), hem (hemopeksyna), HGB (HAP), Cu2+ (CER),
Ca2+ (CBP), witamina B12 (TC), T3/4 (TBP, TBPA), glikokortykoidy (transkortyna), retinoidy (RBP),
hormony płciowe (TBP), cholekalcyferol (VDBP).
b) struktura i funkcja erytrocytów
Główną funkcją erytrocytów jest transport O2, CO2 i H+ oraz ich wymiana z tkankami. Krwinka czerwona
zbudowana jest z błony komórkowej otaczającej roztwór hemoglobiny, stanowiącej 95% wszystkich białek.
Błona jest dwuwarstwowa, złoŜona w połowie z białek i w połowie z lipidów. Głównymi proteinami są:
spektryna α2β2, ankiryna, białko wymiany jonów (prąŜka 3.), białko prąŜka 4.1, aktyna, G6PDH, tropomiozyna,
glikoforyny A, B i C, adducyna. Do lipidów błony zewnętrznej naleŜą fosfolipidy cholinowe (PC, Sph), zaś na
błonie wewnętrznej występują fosfolipidy zawierające aminokwasy (PE, PS). Ponadto na błonie występują
determinanty antygenowe w postaci układów grupowych krwi; najistotniejszy (główny) układ ABO zaleŜy od
genów: H (Fuc-transferaza), A (NAc-Gal-transferaza) oraz B (Gal-transferaza). Błona zawiera układy
transportowe o duŜym powinowactwie do glukozy – przenośnik GLUT-1 (permeaza glukozowa). Erytrocyt nie
zawiera natomiast mitochondriów (nie funkcjonuje cykl Krebsa ani łańcuch oddechowy), lizosomów, aparatów
Golgiego ani jądra (brak syntezy kwasów nukleinowych, białek, FA i glikogenu).
Głównym czynnikiem stymulującym tworzenie erytrocytów jest erytropoetyna (EPO), wytwarzana przez
nefrony w odpowiedzi na spadek pO2. EPO po dostaniu się do szpiku pobudza kinazy za pośrednictwem
receptora, co powoduje proliferację komórek macierzystych.
Głównym źródłem energii jest glukoza osocza. W wyniku glikolizy beztlenowej powstaje mleczan i ATP,
zuŜywany m. in. na utrzymanie dwuwklęsłego kształtu krwinki oraz równowagi wodno-elektrolitowej.
Jednocześnie obecna jest modyfikacja glikolizy, gdyŜ kosztem wytwarzania tylko jednej cząsteczki ATP z jednej
cząsteczki glukozy powstaje 2,3-BPG – allosteryczny modyfikator dysocjacji oksyhemoglobiny, umoŜliwiający
sprawniejsze oddawanie tlenu w tkankach. Alternatywnie 5 – 10 % wchłoniętej glukozy zuŜywa PPP, w wyniku
czego powstaje NADPH, zuŜywany przez reduktazę glutationową do regeneracji glutationu (GSH). GSH jest
jednym z nieenzymatycznych mechanizmów obrony przed stresem oksydacyjnym. Reaktywne formy tlenu
(RFT; ROS) (O2-*, H2O2, ROO*, OH*) powstają w wyniku autooksydacji hemoglobiny (ok. 3 % dziennie),
nieszczelności łańcucha oddechowego (do 4 %), działania enzymów: reduktazy CYP, oksydazy ksantynowej,
oksydazy α-aminokwasów, oksydazy NADPH, mieloperoksydazy czy reakcji Fentona czy Habera – Weissa
(szkodliwość metali – Fe i Cu). Istotnym enzymem PPP jest błonowa G6PDH, zaś jej niedobór znany jest jako
fawizm; wówczas spoŜycie produktów zawierających silne utleniacze (bób, primarchina, sulfonamidy, naftalen)
wywołuje napady hemolizy i konsekwentną anemię. Stres oksydacyjny moŜe prowadzić do peroksydacji lipidów
błonowych i hemolizy oraz do utleniania grup sulfhydrylowych hemoglobiny i powstawania ciałek Heinza.
Powstanie methemoglobiny jest niwelowane przez jej reduktazę sprzęŜoną z utlenianiem cytochromu b5, który z
kolei jest regenerowany przez utlenianie NADH z udziałem reduktazy cytochromu b5 (reduktazy
methemoglobiny). Methemoglobinemia moŜe być wrodzona (niedobór aktywności reduktazy) lub nabyta
(spoŜycie duŜej ilości sulfonamidów lub aniliny). Leczenie polega na podawaniu środków redukujących (kwas
askorbinowy, błękit metylenowy). Erytrocyty zawierają liczne enzymy metabolizmu nukleotydowego:
deaminazę adenozynową, nukleotydazę pirymidynową i kinazę adenylanową.
125
- -
Stare i uszkodzone erytrocyty wychwytywane są przez makrofagowo – histiocytarny układ siateczkowo –
śródbłonkowy (RES niektórych narządów miąŜszowych, głównie wątroby i sledziony. Hemoglobina rozkładana
jest do globiny i hemu. Łańcuchy globinowe ulegają dalszemu rozkładowi do aminokwasów, które mogą być
powtórnie wykorzystane. Hem z kolei pozbawiany jest Ŝelaza i utleniany do bilirubiny, która z Ŝółcią dostaje się
do światła jelita i wchodzi w skład mas kałowych.
c)
budowa i metabolizm leukocytów na przykładzie neutrofili
Główną funkcją neutrofili jest udział w odpowiedzi immunologicznej. Odznaczają się one aktywnym
metabolizmem i zawierają wiele unikatowych białek.
Pozyskiwanie energii zachodzi na drodze glikolizy tlenowej oraz umiarkowanej fosforylacji oksydacyjnej
z powodu relatywnie niewielkiej liczby mitochondriów. Działa równieŜ PPP, dostarczając NADPH m. in. do
funkcjonowania NADPH-oksydazy.
Neutrofile są ruchliwymi komórkami Ŝernymi, biorącymi główny udział w ostrym odczynie zapalnym.
Przedostanie się mikroorganizmów do tkanek powoduje reakcję makrofagów, które, gdy nie są w stanie
samodzielnie ich zwalczyć, wydzielają czynniki chemotaktyczne dla neutrofili, powodując ich aktywację i
imigrację. Podobnie działa np. składnik C5a dopełniacza oraz egzogenne peptydy bakteryjne (N-formino-MetLeu-Phe). Przyciągane w dane miejsce neutrofile muszą opuścić światło naczynia (diapedeza), poniewaŜ jednak
normalnie nie są do tego zdolne, musi zajść ciąg przemian chemicznych. Mastocyty (komórki tuczne) uwalniają
histaminę, która rozszerza naczynia i zwiększa ich przepuszczalność. Białka osocza dostarczają aktywnych
fragmentów dopełniacza (C3a, C4a, C5a), wazodylatacyjnej bradykininy i produktów rozpadu fibryny (FDP).
Same neutrofile wydzielają róŜne eikozanoidy, w tym wazodylatacyjne PG i TX oraz PAF (czynnik aktywujący
płytki). Z kolei zaktywowane płytki uwalniają serotoninę. Wszystkie przedstawione procesy wywołują
przekrwienie danej części ciała, powodując podniesienie temperatury (łac. calor), obrzęk (oedema),
zaczerwienienie (rubor) i draŜnienie zakończeń nerwowych (ból – dolor); są to cztery objawy stanu zapalnego,
znane juŜ w staroŜytności. Przyciągnięte neutrofile ulegają marginalizacji, toczeniu po śródbłonku, ich własne
integryny asocjują z ligandami glikoproteinowymi śródbłonka (kolagen, fibronektyna, laminina, ICAM-1), aŜ
wreszcie przenikają przez ścianę naczynia i zwalczają zakaŜenie.
Aktywacja neutrofili zachodzi pod wpływem pobudzenia przez bakterie, czynniki chemotaktyczne oraz
kompleksy antygen-przeciwciało. Powoduje to poprzez szlak polifosfoinozytolowy wzrost poziomu
wewnątrzkomórkowego Ca2+ i następnie asocjacja mikrotubul (egzocytoza zawartości ziarnistości) oraz
pobudzenie układu aktyna – miozyna (ruchliwość pozwala na odszukanie źródła zakaŜenia). Kontakt ze źródłem
czynnika aktywującego powoduje jego fagocytozę, dlatego neutrofile nazywamy mikrofagami (w odróŜnieniu
od makrofagów – fagocytujących agranulocytów). Zabijanie bakterii poprzedzone jest eksplozją tlenową, tj.
szybkim zuŜyciem tlenu celem wytworzenia ROS. Aktywacja pobudza dwa peptydy cytozolowe do
przeniesienia się na błonę, gdzie w połączeniu z cytochromem b558 tworzą NADPH-oksydazę. Ta katalizuje z
kolei reakcję powstawania anionorodników ponadtlenkowych (2 O2 + NADPH → 2 O2-* + NADP+), które
wydalane są do fagolizosomów, gdzie spontanicznie dają nadtlenek wodoru (2 O2-* + 2 H+ → H2O2 + O2), ten z
kolei daje rodnik hydroksylowy (2 H2O2 → 2 OH*). Dodatkowo mieloperoksydaza wytwarza kwasy
podhalogenowe (H2O2 + H+ + X- → HOX + H2O, gdzie X = Cl, Br, I, SCN), dysocjujące na aniony
podhalogenowe (OX-). Ogólnie powstające w fagolizosomach warunki (↑ pH, O2-*, H2O2, OH*, OX-) w
połączeniu z proteazami prowadzą do unieszkodliwienia drobnoustrojów. Mutacje genów kodujących składniki
NADPH-oksydazy dają przewlekłą chorobę ziarniczą.
Neutrofile uśmiercane w walce z zakaŜeniem tworzą ropę, która ze względu na zawartość
mieloperoksydazy moŜe przybierać barwę zieloną. Powstawanie ropy w obrębie narządu moŜe prowadzić do
nacieku, ropnia lub sepsy – uogólnionego zakaŜenia organizmu.
Oprócz ataku ROS przez neutrofile, organizm posiada równieŜ mechanizmy odporności nieswoistej.
Lizozym niszczy ścianę komórkową bakterii przez hydrolizę wiązań peptydoglikanu – między kwasem N-Acmuraminowym a D-Glc-N-Ac. Defenzyny to tlenoniezaleŜne 30-aa zasadowe peptydy antybiotykowe, równieŜ
uszkadzające ścianę komórkową. Laktoferryna wiąŜe Ŝelazo, przez co moŜe hamować wzrost niektórych
bakterii. Proteazy (elastaza, kolagenaza, Ŝelatynaza, katepsyna G, aktywator plazminogenu = PA) zabijają
zarówno komórki obce, jak i własne, dlatego organizm musi bronić się przez aktywność antyproteazową. Do
antyproteaz naleŜą: α1-antytrypsyna = α1-antyproteaza, α1-antychymotrypsyna, α2-makroglobulina, wydzielniczy
inhibitor leukoproteaz, inhibitor-1 aktywatora plazminogenu (PAI-1), tkankowy inhibitor metaloproteaz.
Destrukcyjne skutki palenia tytoniu opierają się m. in. na utlenianiu grup sulfhydrylowych i w konsekwencji
obniŜaniu aktywności antyproteaz, co daje przewagę proteazom.
126
- -
d) budowa i metabolizm trombocytów
Tromocyty, zwane równieŜ płytkami krwi, są obłonionymi fragmentami cytoplazmy megakariocytów
szpikowych. Nie posiadają jądra, a jedynie centralne zagęszczenie cytoplazmy zwane granulomerem, oddzielne
od błony bardziej przejrzystym hialomerem. W trombocytach występuje system kanalikowy otwarty i
zamknięty, słuŜące odpowiednio do transportu oraz wydzielania. Ziarnistości płytek dzielimy na α, gęste i
lizosomalne. Fizjologicznie trombocyty krąŜą swobodnie w osoczu.
Trombocyty pod wpływem określonych czynników (kolagen śródbłonka, trombina osocza, TXA2 i ADP
innych płytek, PAF wydzielany przez neutrofile) ulegają aktywacji. Aktywne płytki wykazują adhezję do
uszkodzonej ściany naczyniowej, uwalniają zawartość swych ziarnistości oraz agregują w zespoły. Adhezja
trombocytów do kolagenu naczynia krwionośnego zachodzi przez receptorowy kompleks glikoproteinowy
GP Ia-IIa (integryna α2β1). Wiązanie do warstwy podśródbłonkowej ułatwia czynnik von Willebranda (vWF),
stanowiący ligand dla GP Ib-V-IX. Trombina działając na swój receptor pobudza szlak polifosfoinozytolowy,
prowadząc przez DAG do fosforylacji plekstryny i w konsekwencji uwolnienia zawartości ziarnistości.
Uwalniany z ziaren gęstych ADP pobudza agregację innych płytek. Kontakt z kolagenem pobudza PLA2 do
odszczepiania z fosfolipidów błonowych arachidonianu, stanowiącego substrat dla COX produkującej TXA2 –
działa on synergistycznie z trombiną, pobudzając PLC-β. Równocześnie uwolnienie IP3 powoduje napływ Ca2+ z
RER. Ca2+ współdziała z kalmoduliną i kinazą lekkich łańcuchów miozyny – fosforylacja tych ostatnich
prowadzi do współpracy z aktyną, przesunięcia i zmiany kształtu trombocytów, powodują ich rozpłaszczenie na
uszkodzonej powierzchni.
Na aktywnych trombocytach dochodzi do ekspresji na zewnętrznej powierzchni błony kompleksu GP IIbIIIa (integryna αIIbβ3), umoŜliwiającego łączenie z fibrynogenem i agregację oraz fosfolipidów występujących
spoczynkowo po cytozolowej stronie błony (PS, PI), a niezbędnych do aktywacji czynników krzepnięcia X i II.
Synergistycznie z substancjami pobudzającymi agregację działa adrenalina (poprzez receptor α2),
serotonina (5-HT2A) i wazopresyna (V1).
Komórki śródbłonka naczyń produkują PGI2, która, działając na trombocyty poprzez swój receptor,
pobudza AC do produkcji cAMP, co obniŜa poziom Ca2+, a przez to aktywność PLA2 i produkcję TXA2.
Śródbłonek rozkłada ponadto ADP i produkuje NO, siarczan heparanu, trombomodulinę i tkankowy aktywator
plaminogenu (tPA). Wszystkie te mechanizmy mają na celu działanie antykoagulacyjne.
e)
hemostaza osoczowa
Hemostaza jest procesem zatrzymywania krwawienia, następującym po uszkodzeniu ściany naczynia
krwionośnego. W zjawisku tym obserwujemy współdziałanie ściany naczyniowej, trombocytów i osoczowych
czynników krzepnięcia. Reakcja naczyniowa (hemostaza naczyniowa) polega wpierw na obkurczeniu naczynia
w miejscu uszkodzenia, a następnie na obkurczeniu naczyń w odcinku proksymalnym oraz zwolnieniu akcji
serca. Hemostaza płytkowa obejmuje równieŜ obkurczenie naczynia oraz agregację i adhezję płytek do miejsca
uszkodzenia, prowadzące do wytworzenia czopu płytkowego. Hemostaza osoczowa polega na powstaniu sieci
fibryny gromadzącej czop płytkowy (skrzep biały) i/lub erytrocyty (skrzep czerwony).
WyróŜnia się 13 czynników krzepnięcia, które dzielimy na: zymogeny proteaz serynowych (II, IX, X, XI,
XII, VII), kofaktory (III, V, VIII), włóknik = fibrynogen (I) i transglutaminazy (XIII). Dodatkowo w hemostazie
biorą udział: Ca2+ (IV), białko C, białko S, trombomodulina, kalikreina, wysokocząsteczkowy kininogen oraz
płytkowe czynniki krzepnięcia w postaci fosfolipidów błonowych.
127
- -
Powstanie sieci fibrynowej moŜe zostać zapoczątkowane na dwa sposoby. Uszkodzenie naczynia
odsłaniające włókna kolagenowe, tworzące tzw. aktywną powierzchnię, lecz nie połączone z uszkodzeniem
okolicznych tkanek, aktywuje tzw. szlak wewnątrzpochodny. Z kolei uszkodzenie tkanek i kontakt z nimi krwi
włącza szlak zewnątrzpochodny. W pewnym momencie oba szlaki zbiegają się, aby utworzyć wspólną drogę
końcową.
Szlak wewnątrzpochodny rozpoczyna się ekspozycją ujemnie naładowanych fragmentów kolagenu.
Wówczas kalikreina aktywuje czynnik XII (czynnik kontaktu, czynnik Hagemana) do XIIa. Ten ostatni
wykazuje aktywność proteazy serynowej – działa na prekalikreinę, uwalniając kolejne cząsteczki kalikreiny,
odszczepia bradykininę z wielkocząsteczkowego kininogenu oraz aktywuje czynnik XI (prekursor lub czynnik
poprzedzający tromboplastynę osoczową = PTA, czynnik przeciwhemofilowy C) do XIa. Ten jest równieŜ
proteazą serynową i w obecności Ca2+ aktywuje czynnik IX (czynnik Christmasa, składnik tromboplstyny
osoczowej = PCT, czynnik przeciwhemofilowy B) do IXa – zawiera on Gla i równieŜ jest proteazą serynową.
Niewielkie ilości trombiny aktywują czynnik VIII (czynnik przeciwhemofilowy A, globulina
antyhemofilowa = AHG) do VIIIa, który jest kofaktorem słuŜącym jako receptor dla czynników IXa i X na
powierzchni trombocytu.
Na zewnętrznej powierzchni błony aktywowanych płytek powstaje kompleks aktywny złoŜony z
czynników VIIIa, IXa, Ca2+ oraz X (czynnik Stewarta – Prowera). Wówczas IXa rozkłada wiązanie Arg-Ile w
cząsteczce X, tworząc dwułańcuchową proteazę serynową Xa (czynna troboplastyna osoczowa; zawiera Gla).
Szlak zewnątrzpochodny uaktywniany jest przez ekspresję czynnika III (czynnik tkankowy = TF,
nieczynna tromboplastyna tkankowa) na komórkach naczynia. Niewielka ilość trombiny lub Xa przekształca VII
(prokonwertyna, akcelerator konwersji protrombiny = SPCA, kotromboplastyna) do VIIa (konwertyna, proteaza
serynowa; zawiera Gla), który w obecności Ca2+ i kofaktora III katalizuje aktywację X do Xa. Dodatkowo
kompleks VIIa-III aktywuje IX do IXa, zatem szlak zewnątrzpochodny moŜe aktywować wewnątrzpochodny.
Xa stanowi punkt zbiegnięcia się obu szlaków krzepnięcia. Ulega on inhibicji przez inhibitor szlaku
czynnika tkankowego (TFPI), będący głównym fizjologicznym inhibitorem krzepnięcia. Niewielka ilość
trombiny katalizuje przejście czynnika V (proakceleryna, czynnik chwiejny, akcelerator globuliny) do Va = VI
(akceleryna).
Na powierzchni aktywowanych płytek wytwarza się kolejny kompleks, gdzie Xa w obecności Ca2+ i
kofaktora Va hydrolizuje 2 wiązania w obrębie czynnika II (protrombina; zawiera Gla), dając IIa (trombina,
proteaza serynowa). IIa działa na wiele pozostałych czynników: I, VII, VIII, XI, XIII. Dodatkowo przez
tworzenie kompleksu z trombomoduliną nabiera zdolności aktywacji białka C, które wówczas po połączeniu z
białkiem S tworzy kofaktor ACP, rozkładający Va i IIa-Va, ograniczając krzepliwość. Aktywacja II hamowana
jest przez naturalne inhibitory – antytrombinę III, α2-makroglobulinę, kofaktor heparyny III i α1-antytrypsynę =
α1-antyproteazę. Efekt inhibicji moŜna nasilić kwaśnymi proteoglikanami (heparyna, siarczan heparanu) lub
znieść zasadowymi polipeptydami (protamina).
Fibrynogen (czynnik I) składa się z 3 par łańcuchów – (AαBβγ)2. Bβ i γ zawierają łańcuchy sacharydowe
przyłączone przez Asn. Regiony N utrzymywane są blisko siebie, podczas gdy C leŜą po przeciwnych stronach.
Do α i β przyłączone są fibrynopeptydy A i B (FPA i FPB), zawierające Asp, Glu i O-siarczan Tyr, które
zwiększają rozpuszczalność i zapobiegają niepoŜądanej agregacji.
IIa w obecności Ca2+ hydrolizuje 4 wiązania Arg-Gly pomiędzy α i A oraz β i B. Powoduje to odsłonięcie
miejsc wiąŜących monomerów fibryny (αβγ)2, które spontanicznie agregują w fibrynę labilną (czynnik Ia),
zatrzymującą elementy morfotyczne krwi i prowadzącą do powstania skrzepu. IIa przekształca równieŜ XIII
(czynnik stabilizujący fibrynę = FSF, fibrynoligaza) do XIIIa (tiolowo-zaleŜna transglutamylaza). Czynnik ten
łączy kowalencyjnie cząsteczki fibryny przez utworzenie wiązań peptydowych między grupą amidową Gln a εaminową Lys z eliminacją NH4+. Powstaje w ten sposób ostateczna fibryna stabilna (czynnik Ib).
Powstały pełnowartościowy skrzep ulega retrakcji, czyli obkurczeniu połączonemu z wyciskaniem
surowicy. Ostatecznie zaś musi zostać rozpuszczony, za co odpowiedzialna jest plazmina (fibrynolizyna,
proteaza serynowa), dając produkty degradacji fibryny i fibrynogenu (odpowiednio – fdp i FDP). Plazmina
powstaje z osoczowego plazminogenu pod wpływem działania róŜnych fibrynolizynokinaz, dezaktywowana zaś
jest przez α2-antyplazminę. Fibrynolizynokinazy rozszczepiają wiązanie Arg-Val plazminogenu. Do tej grupy
związków naleŜą: streptokinaza (SK) produkowana przez paciorkowce (łac. Streptococci), tkankowy aktywator
plazminogenu (tPA), hamowany przez inhibitor aktywatora plazminogenu oraz urokinaza, powstająca z
prourokinazy przez działanie kalikreiny (z tego powodu podejrzewa się, iŜ szlak wewnątrzpochodny bierze
udział bardziej w procesie fibrynolizy niŜ hemostazy).
W skład produktów degradacji fibryny stabilnej wchodzą D-dimery (DD) – wspomniane wyŜej
połączenia Gln z Lys, które z powodu obecności wiązań kowalencyjnych tworzonych przez XIIIa wykazują
oporność na trawienie przez plazminę. Poziom D-dimerów koreluje z aktywnością fibrynolizy, zaleŜną od
obecności skrzepów, dlatego jest istotnym parametrem diagnostycznym, pomocnym w ocenie takich patologii
jak: zakrzepica ŜŜ. głębokich, zatorowość płucna czy zespół rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego
(DIC).
128
- -
5.
Biochemia wątroby
a)
rola tkanki wątrobowej
Wątroba pełni w organizmie wiele istotnych funkcji, bez których niemoŜliwe byłoby Ŝycie. Przyjmuje
ona rozgałęzienia Ŝ. wrotnej, prowadzącej krew z jelit i śledziony – stanowi przez to filtr dla związków
potencjalnie niebezpiecznych, które rozpoznaje, wiąŜe i wydala róŜnymi drogami. Buforuje ponadto stęŜenia
składników odŜywczych krwi, magazynując ich nadmiar bezpośrednio po posiłku, a uwalniając je stopniowo w
miarę potrzeby; w przypadku deficytu przekształca substancje średnio istotne na te najwaŜniejsze. Wątroba
degraduje jednocześnie własne cząsteczki organizmu, krąŜące we krwi zbyt długi czas. Z drugiej strony
syntetyzuje wiele związków czynnych biologicznie, w tym funkcjonalne enzymy osocza oraz białka osocza
(poza γ-globulinami). Większość znanych szlaków metabolicznych zachodzi w wątrobie, z czego wyłącznie w
tym narządzie. Wątroba spełnia zatem funkcję integrującą biologiczne przemiany głównych składników
chemicznych organizmu. Dochodzi tu równieŜ do produkcji Ŝółci, pełniącej zarówno funkcje trawienne, jak i
wydalnicze. Ponadto wątroba stanowi magazyn pewnej ilości krwi, skład Ŝelaza oraz zapas witamin
rozpuszczalnych w tłuszczach. Szybki metabolizm podnosi temperaturę wątroby o ok. 2o, jest więc narządem
termogenezy.
b) przemiana węglowodanowa, lipidowa i azotowa w wątrobie
Wątroba posiada bardzo bogaty zestaw enzymów, niespotykany w Ŝadnym innym narządzie, co
umoŜliwia funkcjonowanie w niej większości szlaków metabolicznych. Jak juŜ wspomniano, jest miejscem
integracji gospodarki węglowodanowej, lipidowej i azotowej.
Dostarczenie duŜej ilości składników odŜywczych po spoŜyciu pokarmu powoduje ich napływ do
wątroby, gdzie ulegają pierwszym przekształceniom. Nadmiar glukozy zostaje zmagazynowany jako glikogen
(glikogenogeneza), aby w czasie między posiłkami być stopniowi uwalniany (glikogenoliza), utrzymując poziom
glukozy w osoczu na niemal niezmienionym poziomie. Glukoza i glikogen mogą być ponadto regenerowane z
produktów metabolizmu tkanek pozawątrobowych – tj. z pirogronianu, mleczanu, alaniny, glicerolu i
propionianu (glukoneogeneza). Tkanka wątrobowa jest miejscem izomeryzacji do glukozy innych cukrów
prostych – fruktozy i galaktozy. Zachodzi równieŜ szlak pentozofosforanowy (PPP), dostarczając
równowaŜników redukujących do procesów detoksykacji oraz syntez redukcyjnych (lipogeneza,
steroidogeneza). Funkcjonuje tu szlak kwasu uronowego, produkujący glukuronian, zuŜywany w II fazie
detoksykacji oraz do syntezy proteoglikanów. Do tych ostatnich naleŜy siarczan heparanu – naturalny
antykoagulant wydzielany przez granulocyty łącznotkankowego zrębu wątroby do krwi.
Równie donośna jest rola wątroby w przemianie lipidów. Produkuje ona apolipoproteiny, będące
nośnikami dla hydrofobowych tłuszczy. Jednocześnie zaś posiada receptory dla lipoprotein, wychwytując lipidy
i włączając je w reakcje. Zachodzi tu równieŜ synteza kwasów tłuszczowych (lipogeneza), jak i ich utlenianie w
szlaku β-oksydacji. Napływające z adipocytów trójglicerydy są rozkładane, dają kwasy tłuszczowe oraz glicerol,
które mogą posłuŜyć jako źródła energii lub zostać przebudowane w inne cząsteczki. Syntetyzowane są równieŜ
fosfolipidy – istotne składniki błon biologicznych, pełniące zarówno funkcje strukturalne, jak i biorące udział w
hemostazie, apoptozie, syntezie eikozanoidów i transdukcji sygnałów hormonalnych. Nadmierne nasilenie βoksydacji prowadzi do powstania ciał ketonowych (ketogeneza), które mogą być wykorzystane jako substrat
energetyczny przez tkanki pozawątrobowe lub wydalane z wydychanym powietrzem (aceton w cukrzycy).
Tkanka wątroby to równieŜ miejsce zbierania cholesterolu z reszty organizmu oraz syntezy go de novo.
Cholesterol moŜe zostać przekształcony w kwasu Ŝółciowe i wydalony do światła jelita lub wysłany przez krew
do tkanek przekształcających go w hormony sterydowe (kora nadnerczy i gonady). Wątroba jest wreszcie
miejscem 25-hydroksylacji prowitaminy D3 – etapu powstawania kalcytriolu, będącego regulatorem gospodarki
wapniowo – fosforanowej.
Podobnie przedstawia się integracja przemiany azotowej. Do wątroby trafiają aminokwasy pochodzenia
pokarmowego oraz glikoproteiny krwi pozbawione reszt kwasu sialowego (asialoglikoproteiny), które narząd ten
wychwytuje za pomocą receptora i hydrolizuje do aa. Dodatkowo zachodzi tu synteza aa endogennych z ich
związków prekursorowych. Aa wątroby zuŜywane są przez nią do syntezy białek osocza (z wyjątkiem γ-globulin
produkowanych przez plazmocyty) oraz enzymów funkcjonalnych osocza. W przeciwieństwie do cukrów i
tłuszczy nadmiar aa nie moŜe być nie moŜe być zmagazynowany, lecz podlega transaminacji i dezaminacji.
Powstałe szkielety węglowe mogą być utleniane bądź przekształcane w inne związki, zaś amoniak, łącznie z
pulą powstającą w wyniku dezaminacji jelitowej, przenoszony jest na CO2; następnie jako mocznik przenoszony
jest z krwią do nerek, gdzie podlega filtracji kłębuszkowej i usuwany jest z moczem. Wątroba unieszkodliwia
równieŜ produkty dezaminacji i dekarboksylacji jelitowej – indol, skatol i ptomainy (kadaweryna, putrescyna,
agametyna). W wątrobie dochodzi ponadto do syntezy i rozkładu zasad azotowych. Pirymidyny rozkładane są do
produktów rozpuszczalnych w wodzie (CO2, NH3, octan, β-hydroksymaślan), puryny zaś do nierozpuszczalnego
129
- -
kwasu moczowego, który podobnie jak mocznik ulega wydaleniu z moczem. Wraz ze śledzioną wątroba stanowi
miejsce rozpadu hemoglobiny i hemu, a powstała bilirubina sprzęgana jest z glukoronianem i poprzez Ŝółć trafia
do mas kałowych. Narząd ten jest równieŜ miejscem ostatniej reakcji w szlaku syntezy kreatyny – mięśniowego
przenośnika energii.
c)
wątroba jako gruczoł zewnątrzwydzielniczy
Wątroba jest miejscem produkcji Ŝółci, która przechodząc kolejnymi przewodami zbiera się w
pęcherzyku Ŝółciowym, aby opuścić go podczas trawienia. Skurcze pęcherzyka powodują wtłaczanie Ŝółci do
dwunastnicy, zaraz zaś przed nią dochodzi do zmieszania z sokiem trzustkowym. śółć wątrobowa jest lekko
zasadowa (pH 7,1 – 7,3) i składa się z wody (97%) i rozpuszczonych w niej składników stałych: kwasów
Ŝółciowych (37%), soli nieorganicznych (33%), mucyn i barwników Ŝółciowych (21%), kwasów tłuszczowych
(7%) oraz cholesterolu (2%). W pęcherzyku Ŝółć ulega 4 – 5 x zagęszczeniu, tak iŜ woda stanowi 86%, a pH
moŜe wahać się w dość szerokich granicach (6,9 – 7,7). Sole kwasów Ŝółciowych przez zmniejszanie napięcia
powierzchniowego ułatwiają jelitową emulgację tłuszczy i rozpuszczanie kwasów tłuszczowych, przez co
wspomagają trawienie i wchłanianie zarówno samych lipidów, jak i rozpuszczalnych w nich witamin. Pośrednio
wpływa to na trawienie wszystkich składników pokarmowych. Ponadto lekko zasadowa Ŝółć neutralizuje
kwaśną treść pokarmową, przygotowując ją do trawienia enzymami jelitowymi. Przez Ŝółć organizm pozbywa
się równieŜ cholesterolu, kwasów Ŝółciowych, metabolitów leków i toksyn oraz metali cięŜkich (Cu, Zn, Hg).
d) procesy biotransformacji i detoksykacji
Ksenobiotykami nazywamy wszelkie substancje obce dla organizmu – leki, kosmetyki, środki czystości i
zanieczyszczenia środowiska . Po dostaniu się do organizmu bardzo rzadko opuszczają go w formie
niezmienionej – najczęściej ulegają róŜnorodnym przemianom, nierzadko z udziałem wielu enzymów.
Przemiany te moŜne podzielić na reakcje I i II fazy. W fazie I zachodzi najczęściej hydroksylacja przez
monooksygenazy, ale równieŜ: dezaminacja, dehalogenacja, desulfuracja, peroksydacja, redukcja czy hydroliza.
W fazie II dochodzi do sprzęgania produktów fazy I ze związkami endogennymi: glukuronianem, siarczanem,
octanem, glutationem (GSH), aa lub resztą metylową. Celem obu faz jest zwiększenie polarności i
rozpuszczalności w wodzie, a przez to zapobieganie akumulacji w lipidach i umoŜliwienie wydalenia.
Najczęściej efekt ten zostaje osiągnięty, czasem jednak reakcje te prowadzą do powstania produktu bardziej
toksycznego niŜ pierwotny.
Główną reakcją I fazy jest hydroksylacja przez monooksygenazy, tj. enzymy grupy cytochromu P450
(CYP, zawierającej ogółem 35 – 60 enzymów): RH + O2 + cyt-H2 → R-OH + H2O + cyt. Poza ksenobiotykami
substrat mogą stanowić lipofilne steroidy, eikozanoidy, kwasy tłuszczowe i retinoidy. Jest to najbardziej
uniwersalny ze znanych biokatalizatorów (przetwarza ok. 50% leków). Stanowi oksydazę o mieszanej funkcji,
gdyŜ jeden atom tlenu wchodzi w skład cząsteczki wody, a drugi do grupy hydroksylowej produktu. W
reakcjach uczestniczy NADPH oraz reduktaza NADPH : CYP; przeniesienie elektronu indukuje redukcyjną
aktywację tlenu cząsteczkowego, donorem elektronów zaś moŜe być mikrosomalny cytochrom b5. W skład
układu CYP wchodzi główny fosfolipid ER – fosfatydylocholina; układ zawiera równieŜ hem. Występuje
głównie w jelicie cienkim, w wątrobie (gdzie stanowi do 20% frakcji mikrosomalnej), w nadnerczach (równieŜ
w mitochondriach, gdzie posiada adrenodoksynę i reduktazę adrenodoksynową), w mózgu i w płucach. Synteza
układu wzmaga się pod wpływem określonych związków, np. fenobarbitalu, głównie przez oddziaływanie na
wzrost transkrypcji mRNA. Ma to znaczenie w zjawisku interakcji leków, np. dikumarol-fenobarbital-CYP2C9,
etanol-rozpuszczalniki-CYP2E1. Niektóre (CYP1A1) biorą udział w metabolizmie wielopierścieniowych
węglowodorów aromatycznych (PAH), dlatego nazywa się je hydroksylazą węglowodorów aromatycznych
(AHH); moŜe ona przekształcać prokarcynogeny, np. dymu tytoniowego. Zjawisko polimorfizmu genów
cytochromów jest przyczyną osobniczego zróŜnicowania reakcji organizmu na daną substancję.
Reakcje II fazy przekształcają substrat w formę, w jakiej jest on wydalany z organizmu (z moczem, Ŝółcią
lub inną drogą). NaleŜą tu następujące procesy sprzęgania:
typ reakcji
endogenny donor grupy
enzym(y)
glukuronidacja
UDPGlcUA
transferaza glukuronylowa
sulfatacja
3’-{P}-adenozno-5’-{P}siarczan = PAPS
transferaza siarczanowa
sprzęganie z GSH
(→ merkapturan –
zaw. grupę Ac-Cys)
GSH, AcCoA
S-transferaza glutationowa,
GGTP, dipeptydaza CysGly, transacetylaza
130
- -
przykłady ksenobiotyków
2-acetyloaminofluoren,
anilina, benzoesan,
meprobenat, fenol, steroidy
alkohole, aminy
aromatyczne, fenole
elektrofilowe ksenobiotyki,
np. pewne karcynogeny
acetylacja
metylacja
AcCoA
S-adenozylo-Met (SAM)
transacetylaza
transmetylaza
Efekty działania ksenobiotyków:
• cytotoksyczny – w wyniku połączenia się reaktywnych metabolitów z witalnymi makrocząsteczkami,
• immunologiczny – w wyniku połączenia haptenu z białkami komórkowymi moŜe powstać antygen,
przeciwko któremu skierowana zostanie odpowiedź immunologiczna (nadwraŜliwość, alergia),
• karcynogeneza chemiczna – efekt mutagenny w wyniku połączenia karcynogenów z DNA.
6.
Biochemia nerek
a)
funkcje i regulacja
Nerki pełnią wiele funkcji niezbędnych do Ŝycia organizmu: usuwają końcowe metabolity i toksyny,
utrzymują równowagę wodno – mineralną i kwasowo – zasadową oraz stanowią organ wydzielniczy.
Najistotniejszą rolą nerek jest oczyszczanie ustroju ze szkodliwych produktów metabolizmu, m. in.
gospodarki azotowej, a takŜe K+ i H2O. W ciałku nerkowym dochodzi do filtracji osocza – po zatrzymaniu
elementów morfotycznych i makrocząsteczkowych (> 60-70 kDa) woda i rozpuszczone w niej związki
przechodzą do kanalika nerkowego, tworząc mocz pierwotny. PoniewaŜ ten ostatni posiada bardzo duŜą objętość
(ok. 200 l/dobę) i zawiera wiele cennych składników, toteŜ w kanaliku bliŜszym (proksymalnym) dochodzi do
resorpcji wody, jonów, glukozy, aa, witamin i polipeptydów. Tu równieŜ wydalane są do kanalików: kreatynina,
leki i substancje diagnostyczne (np. kwas para-aminohipurowy = PAH). Pętle nefronu dzięki zróŜnicowanej
przepuszczalności i pompom jonowym wytwarza gradient osmotyczny w tkance śródmiąŜszowej (tzw.
wzmacniacz przeciwprądowy). W obrębie kanalika dalszego (dystalnego) aktywnie wchłaniany jest Na+
(zaleŜnie od aldosteronu) – zachodzi jego wymiana z K+, H+ i NH4+ oraz bierny transport Cl-. Wreszcie w
cewkach zbiorczych komórki główne wymieniają Na+ na K+ (zaleŜnie od aldosteronu i ADH), zaś komórki
wstawkowe – K+ na H+. Dzięki wytworzonemu przez pętle i naczynia proste gradientowi osmolalnemu dochodzi
tu równieŜ do ostatecznego zagęszczania moczu, tak iŜ staje się on hipertoniczny względem krwi i w takiej
formie jest wydalany. Wymiana wodno – elektrolitowa zachodząca między pętlami a naczyniami prostymi
określana jest jako wymiennik przeciwprądowy.
Nerka jest równieŜ narządem wydzielniczym. Sama tkanka śródmiąŜszowa jest źródłem związków
regulujących ciśnienie krwi – PGA2 i PGE2. Na biegunie naczyniowym kłębuszka znajduje się aparat
przykłębuszkowy, złoŜony z trzech elementów. Komórki mioidalne są zmodyfikowaną mięśniówką tętniczki doi odprowadzającej; pełnią one funkcje pressoreceptorów i wydzielają reninę, która przez angiotensynę II i
aldosteron podnosi ciśnienie krwi (układ RAA). Plamka gęsta składa się z komórek fragmentu ściany kanalika
dystalnego, przylegającego do bieguna naczyniowego; jest to osmochemoreceptor czuły na zmiany poziomu Na+
i mający moŜliwość wpływu na czynność komórek mioidalnych. Wreszcie mezangium pozakłębuszkowe
występuje między powyŜszymi elementami i w razie spadku pO2 wydziela nerkowy czynnik erytropoetyczny
(renal erythropoetic factor = REF), przekształcający prekursorową globulinę osocza w erytropoetynę, regulującą
proces tworzenia krwinek czerwonych w szpiku kostnym.
Pod względem biochemicznym nerka jest narządem o duŜej aktywności metabolicznej – zuŜywa 20x
więcej energii niŜ przeciętna tkanka. Posiada zestaw enzymatyczny zbliŜony do wątrobowego. Pobiera z krwi
mleczan, FFA i glicerol – część z nich zaspokaja jej własne potrzeby energetyczne, reszta zaś wchodzi w szlak
glukoneogenezy. Powstała glukoza, wraz z ilością odzyskaną z moczu przez przenośnik SGLT-1, powraca do
krwi dzięki obecności dwukierunkowego transportera GLUT-2. Resorpcja aa z moczu zachodzi poprzez cykl γglutamylowy z udziałem glutationu:
GGT (γ-glutamylotransferaza = γ-glutamylotranspreptydaza = GGTP) oprócz błony komórek kanalików
nerkowych występuje na ER hepatocytów. Nerka jest miejscem produkcji NH4+ z mocznika i glutaminy, przez
co moŜe kompensować kwasicę bez mobilizacji istotnych dla organizmu zasad. Zachodzi tu równieŜ reakcja
wymiany: Arg + Gly → Orn + glikocyjamina = guanidynooctan, której produktem jest półprodukt do syntezy
131
- -
kreatyny – mięśniowego przenośnika energii. W wyniku nieenzymatycznej reakcji cyklizacji kreatyny powstaje
kreatynina, wydzielana do moczu w kanaliku bliŜszym; pomiar jej stęŜenia jest wskaźnikiem filtracji
kłębuszkowej. Podobnie wydzielany jest hipuran – produkt sprzęgania Gly z benzoesanem, pochodzącym z
konserwantów pokarmowych lub z metabolizmu ksenobiotyków aromatycznych. Mitochondria komórek
kanalika proksymalnego zawierają 1α- oraz 24-hydroksylazę, przeprowadzając ostatni etap syntezy kalcytriolu.
b) skład i właściwości moczu w normie i w patologii
Dorosły człowiek produkuje fizjologicznie w ciągu doby ok. 1500 ml moczu (600 – 3000 ml; < 500 ml to
oliguria (skąpomocz), < 100 ml to anuria (bezmocz), > 2500 ml to poliuria (wielomocz)). Barwa zaleŜy od
urochromu i zazwyczaj jest słomkowoŜółta (czerwona ← krew, HGB, leki, moczony; brązowa ← bilirubina;
brązowienie na powietrzu ← alkoptoniuria). Swoisty zapach moŜe ulec zmianie w gnilny (← zapalenie),
fermentujących jabłek (← ciała ketonowe) lub draŜniący (← fenyloketonuria). Gęstość waha się prawidłowo w
granicach 1,018 – 1,022, choć moŜe wynosić 1,002 – 1,035. pH jest lekko kwaśne (ok. 6), lecz zaleŜy wyraźnie
od diety (bogatobiałkowa → do 4,6, jarzynowo – mleczna → do 8).
Mocz jest wodnym roztworem wielu związków organicznych i mineralnych – znajdujemy w nim
(stęŜenie molowe / stęŜenie objętościowe): mocznik (410 / 24,6), kwas moczowy (5 / 0,85), kreatyninę (11,9 /
1,35), hipuran, glukuroniany, mleczan, octan, szczawian, witaminy, hormony i ich metabolity (aldosteron,
katecholaminy, kortyzol, metanefryna, kwas wanilinomigdałowy = VMA, 11,17-hydroksykortykosteroidy, 17ketosteroidy), enzymy (m. in. AspAT i AlAT), barwniki i ich metabolity (kwas δ-aminolewulinowy = ALA,
porfobilinogen = PBG, urobilinogen) oraz jony Na+ (148 / 3,4), K+ (100 / 3,9), Ca2+ (4 / 0,16), Mg2+ (11 / 0,27),
NH4+, Cl- (150 / 5,3), {P} (37 / 3,5), SO42- (25 / 1,2).
Fizjologicznie mocz nie zawiera białek (co najwyŜej wydalanych jest 50 – 100 mg / dobę). Proteinuria
(albuminuria) moŜe świadczyć o uszkodzeniu układu filtrującego. Podobnie glukozy nie powinno być więcej niŜ
0,1 – 1 mM / 1,8 – 18 mg%. Glikozuria moŜe być następstwem hiperglikemii, występującej w cukrzycy, ciąŜy,
pod wpływem stresu, w zaburzeniach hormonalnych (akromegalia, choroba Cushinga). Prawidłowo nie
pojawiają się w moczu ciała ketonowe, a ketonuria bywa następstwem głodzenia, cukrzycy, wymiotów lub
wysiłku fizycznego. Podobnie nie powinna występować bilirubina, a bilirubinuria świadczy o Ŝółtaczce za- lub
wątrobowej albo nowotworach. Urobilinogen występuje fizjologicznie w niewielkiej ilości, a moŜe wzrastać
przy niedroŜności dróg Ŝółciowych i antybiotykoterapii hamującej florę jelitową. Uszkodzenie miąŜszu moŜe
dawać hematurię (krwiomocz). Obecność kwasów Ŝółciowych to choluria, cystyny – cystynuria, ksantyny –
ksantynuria. Przy mukopolisacharydozach pojawiają się siarczany dermatanu i heparanu, a przy mukolipidozach
– fragmenty glikoprotein.
7.
Biochemia mięśni
a)
budowa i charakterystyka białek mięśni
Aktyna G jest białkiem globularnym stanowiącym ¼ wszystkich białek mięśnia. W fizjologicznej sile
jonowej i obecności Mg2+ dochodzi do kowalencyjnej polimeryzacji, w wyniku czego powstaje fibrylarna aktyna
F. Tropomiozyna jest heterodimerem αβ o budowie fibrylarnej, przyłącza się do aktyny F w rowku między
łańcuchami. Troponina jest heterotrimerem: podjednostka T łączy elementy filamentu w całość, I – hamuje
interakcję aktyny F i miozyny, zaś C jest analogiem kalmoduliny wiąŜącym 4 Ca2+.
Miozyny stanowią rodzinę kilkunastu białek. Miozyna I jest monomerem łączącym mikrofilamenty z
błonami. Mięśniowa miozyna II stanowi ponad ½ masy białek mięśnia. Jest heksamerem, składa się w dwóch
skręconych helis, z których kaŜda zakończona jest globularną główką. Posiada 2 łańcuchy cięŜkie H i 4 lekkie L
(po dwa podstawowe i dwa regulatorowe). Rozkład trypsyną ujawnia meromiozyny: lekka LMM stanowi
fragment skręconych α-helis trzonu, nie wiąŜe aktyny F i nie jest ATP-azą; cięŜka HMM posiada część
globularną S1 i nitkowatą S2, które moŜna rozdzielić papainą. HMM-S1 wiąŜe łańcuchy lekkie L oraz aktynę (w
nieobecności ATP), jest ATP-azą, a aktywność ta wzrasta 100-200x po związaniu z aktyną F. HMM-S2 posiada
strukturę podobną do LMM.
Inne białka filamentu to:
tytyna – sięga od linii Z do M i pełni rolę w rozkurczu mięśnia,
nebulina – rozciąga się od linii Z wzdłuŜ nitek aktyny, regulując ich tworzenie i długość,
α-aktynina – stabilizuje aktynę, zakotwiczając ją w liniach Z,
desmina – układ się wzdłuŜ aktyny i łączy się z plazmalemmą,
dystrofina – równieŜ połączona z plazmalemmą, jej defekt jest przyczyną dystrofi mięśni,
kalcyneuryna – wykazuje aktywność fosfatazy regulowanej przez kalmodulinę,
białko C wiąŜące miozynę ułoŜone jest poprzecznie w prąŜkach A, integruje ono strukturę
sarkomeru przez wiązanie tytyny i miozyny.
132
- -
b) mechanizm skurczu mięśnia
Główki miozyny S1 hydrolizują ATP, nie pozwalając jednocześnie produktom na odłączenie się;
kompleks miozyna-ADP-{P} jest w stanie wysokoenergetycznym. Pobudzenie miocytu zwiększa
powinowactwo aktyny do miozyny, główki odnajdują i wiąŜą się z odpowiednimi miejscami na aktynie.
Oddzielenie ADP i {P} indukuje zmiany konformacyjne główek względem trzonu i przesunięcie nitek
względem siebie. Do kompleksu w stanie niskoenergetycznym przyłącza się ATP, zmniejszając powinowactwo
aktyny do miozyny i powodując rozpad kompleksu.
Regulacja skurczu odbywa się z udziałem Ca2+. Mechanizm oparty na aktynie występuje w mięśniu
szkieletowym i sercowym, zaś oparty na miozynie – w mięśniu gładkim. Inhibitorem skurczu jest troponina
związana z tropomiozyną. TpI zapobiega łączeniu aktyny z miozyną przez przesunięcie tropomiozyny na
miejsce wiązania główek miozynowych, wobec czego mięsień pozostaje w rozkurczu. Spoczynkowe
sarkoplazmatyczne [Ca2+] wynosi 10-100 nM i jest utrzymywane przez Ca2+-ATP-azę pompującą wapń do ER,
gdzie przejściowo łączy się z kalsekwestryną. Sarkomery i ER stykają się z pobudliwymi błonami w postaci w
postaci ścian kanalików porzecznych (T). Powstanie potencjału czynnościowego na sarkolemmie powoduje
aktywację powolnych napięciowo-zaleŜnych kanałów wapniowych (DHPR = receptor dihydropirydynowy), a
przez to ATP-Ca2+-zaleŜnych kanałów uwalniających Ca2+ z ER (RYR1 = receptor rianodynowy 1; 2 – w sercu,
3 – w UN). Gwałtowny wzrost sarkoplazmatycznego [Ca2+] do 10 µM powoduje łączenie Ca2+ z TpC, wpływ na
TpT i TpI i usunięcie tropomiozyny z dotychczasowych miejsc. Podczas rozkurczu ↓ [Ca2+], wapń uchodzi z
TpC, tropomiozyna wraca na pierwotne miejsce i w obecności ATP kompleks aktyna-miozyna ulega rozpadowi.
Brak ATP powoduje utrzymanie wysokiego [Ca2+] oraz utrudnia dysocjację aktyny i miozyny – w konsekwencji
mięsień pozostaje w skurczu, co moŜe prowadzić do stęŜenia.
Złośliwa hipertermia spowodowana jest mutacją podjednostki α RYR1 z następowym utrzymującym się
wysokim [Ca2+]. Obserwuje się nadwraŜliwość na anestetyki (halotan) i/lub leki zwiotczające (sukcynylocholina
= suksametonium). Leczenie obejmuje m. in. dantralen (poch. hydantoniny).
W mięśniu sercowym miocyty tworzą syncytium. Obecny jest własny automatyzm dzięki powolnej
spoczynkowej depolaryzacji komórek P przedsionków. Obserwuje się silniejszy rozwój kanalików T, zaś słabszy
ER, co uzaleŜnia skurcz od zewnątrzkomórkowych zasobów wapnia. Wymiana Ca2+ pomiędzy kardiomiocytem
a płynem pozakomórkowym zachodzi przez kanały wapniowe L i T (układ CIRC), wymiennik 3Na+/Ca2+ oraz
Ca2+-ATP-azę, Miocyty sercowe posiadają receptory błonowe dla hormonów i wykazują wraŜliwość na cAMP,
czym tłumaczy się dodatnie inotropowe działanie agonistów β-adrenergicznych.
W mięśniu gładkim nie dostrzegamy uporządkowania odpowiedzialnego za poprzeczne prąŜkowanie.
Brak równieŜ układu troponiny. Istotny jest wapń zewnątrzkomórkowy, a pompy Ca2+ działają wolno. Lekkie
łańcuchy miozyny zbudowane są inaczej, ponadto występuje miozynowy mechanizm regulacji skurczu. Miozyna
nie wykazuje aktywności ATP-azy oraz to lekki łańcuch p zapobiega łączeniu się aktyny F z miozyną; oba te
efekty znoszone są przez fosforylację łańcucha lekkiego p. Wzrost [Ca2+] powoduje łączenie się go z
kalmoduliną, następnie wiązanie z kinazą miozynową i fosforylację przez nią łańcucha lekkiego p, ostatecznie
dochodzi do interakcji aktyny z miozyną. Powrót do stanu wyjściowego zapewnia fosfataza. Sam skurcz jest
długi i powolny, z małym zuŜyciem ATP; moŜe być zapoczątkowany zarówno przez stymulację nerwową, jak i
hormonalną. cAMP aktywuje odpowiednią kinazę, która fosforyluje kinazę łańcucha lekkiego – wówczas u tej
spada powinowactwo do kompleksu Ca2+-kalmodulina; w ten sposób pod wpływem β-adrenergicznym dochodzi
do zahamowania skurczu. W mięśniu gładkim występuje kaldesmon, który wiąŜąc się z aktyną i tropomiozyną
zapobiega skurczowi. Wzrost [Ca2+] i wiązanie z kalmoduliną poprzedza wiązanie z kaldesmonem i
umoŜliwienie skurczu; podobnie działa fosforylacja.
Źródła energii dla skurczu mięśnia (ATP):
• glikogen – fosforylaza aktywowana przez Ca2+, A i AMP;
• glukoza i TAG z osocza
• kreatyna (Cr) – fosforylowana przez kinazę (CK)
• ADP
133
- -
8.
Biochemia tkanki łącznej
a)
składniki tkanki łącznej, ich budowa i funkcja
KaŜda tkanka organizmu składa się z komórek, pomiędzy którymi występuje zmienna ilość substancji
międzykomórkowej. Ta ostatnia ma największy udział w strukturze tkanki łącznej. Substancja
międzykomórkowa składa się z włókien oraz istoty (substancji) podstawowej. Włókna dzielimy na kolagenowe,
siateczkowe (zbudowane z kolagenu III) oraz spręŜyste (złoŜone z elastyny oraz mikrofibryli, zbudowanych z
fibryliny). W skład istoty podstawowej wchodzą mukopolisacharydy (glikozoaminoglikany = GAG: kwas
hialuronowy (HA), siarczan chondroityny A i C (CSA+C), siarczan dermatanu (DS), siarczan keratanu (KS) oraz
siarczan heparanu (HS)), jak równieŜ białka niekolagenowe: fibronektyna, laminina i inne.
Elastyna odpowiada za spręŜystość tkanek. Występuje w znacznych ilościach w płucach, duŜych
tętnicach i niektórych więzadłach spręŜystych, mniej zaś jej zawiera skóra i małŜowina uszna. Syntetyzowana
jest jako monomeryczna proelastyna, której określone Pro ulegają hydroksylacji do Hyp. W przeciwieństwie do
kolagenu nie występują peptydy ekstensyjne, łańcuchy cukrowe, Hyl, powtarzalne sekwencje ani mnogość
odmian. Po wydaleniu z komórki niektóre Lys ulegają oksydacyjnej dezaminacji do aldehydów, po czym
kondensacja takich trzech z niezmienioną Lys daje desmozynę; zapewnia one nierozpuszczalność, stabilność,
spręŜystość i długi okres półtrwania. Mutacje genu elastyny (7q11-23) prowadzą do zespołu Williamsa, który
objawia się zwęŜeniem aorty, zaburzeniami tkanki łącznej i OUN, gromadzeniem się elastyny (twardzina) lub jej
niedoborem (rozedma płuc, nadmierna rozciągliwość i starzenie się skóry).
Fibrylina to glikoproteina, która po opuszczeniu komórki ulega wbudowaniu do mikrofibryl,
stanowiących rusztowanie dla odkładanej elastyny. Mutacje genu fibryliny (chromosom 15) prowadzą do
zespołu Marfana. Jej występowanie we włóknach soczewki, w okostnej i we włóknach spręŜystych duŜych tętnic
tłumaczy objawy zespołu: ektopię (przesunięcie) soczewki, wysoki wzrost, arachnodaktylię i anomalie sercowo
– naczyniowe, np. tętniak aorty wstępującej.
Fibronektyna to główna glikoproteina substancji pozakomórkowej, występująca równieŜ w osoczu. Jest
homodimerem, zawiera 3 typy motywów tworzące ≥ 7 czynnościowych fragmentów cząsteczki – ich rolą jest
wiązanie heparyny, fibrynogenu, kolagenu, DNA i powierzchni komórek. Poprzez sekwencję RDG łączy się z
receptorową integryną przezbłonową, a ta z kolei łączy się poprzez adhezyny (talina, winkulina, α-aktynina,
białko czapeczkowe) z aktyną cytozolową. Fibronektyna bierze udział w adhezji i migracji komórek.
Laminina to heterotrimer o budowie AB1 B2, tworzący cząsteczkę o kształcie krzyŜa. WiąŜe ona kolagen
IV, heparynę oraz integryny powierzchniowe komórek, odpowiada za spójność nabłonka z błoną podstawną.
WiąŜe się z entaktyną pełniącą podobne funkcje. Ujemne ładunki na powierzchni cząsteczki lamininy
wytwarzane przez siarczan heparanu i kwaśne glikoproteiny spełniają istotne funkcje w błonie filtracyjnej
kłębuszków nerkowych, odpychając ujemnie naładowane białka osocza i zapobiegając ich przechodzeniu do
moczu pierwotnego.
b) synteza kolagenu – reakcje i regulacja procesu
Kolagen stanowi główny składnik większości tkanek łącznych oraz jest najbardziej rozpowszechnionym
białkiem zwierzęcym (stanowi 25% wszystkich białek ssaków). U człowieka występuje 19 typów kolagenu,
zbudowanych z 30 róŜnych łańcuchów polipeptydowych. WyróŜniamy typy tworzące włókna (I, II, III, V, XI),
tworzące sieci (IV, VIII, X), FACIT (IX, XII, XIV, XVI, XIX), koralikowe (VI), kotwiczące (VII),
przezbłonowe (XIII, XVII) i inne (XV, XVIII). Niektóre odmiany cechują się dobrą rozciągliwością (ścięgna,
skóra), twardością (kości, zęby) lub przejrzystością (rogówka).
Produktem translacji mRNA jest preprokolagen, który dzięki sekwencji sygnałowej wędruje do ER. Tam
peptyd sygnalny jest odszczepiany, dając prokolagen, który podlega hydroksylacji i glikozylacji. Na obu
końcach prokolagenu występują peptydy ekstensyjne, zawierające reszty Cys, tworzące wewnątrz- (N+C) oraz
134
- -
międzyłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe, ułatwiające tworzenie superhelisy. Łańcuch polipeptydowy α jest
lewoskrętną helisą (n ≈ 3), zaś 3 łańcuchy α skręcone są w prawoskrętną superhelisę. Co 3 aa stanowi Gly, gdyŜ
jest ona na tyle mała, aby zmieścić się w ograniczonej przestrzeni w środkowej części rdzenia superhelisy.
Struktura wygląda zatem jak (Gly-X-Y)n, gdzie 3n ≈ 1000. Helisa podlega hydroksylacji Pro i Lys oraz
glikozylacji powstałego Hyl.
Pro —— hydroksylaza Pro, askorbinian, α-ketoglutaran —→ Hyp
Lys —— hydroksylaza Lys, askorbinian, α-ketoglutaran —→ Hyl —— O-glikozylacja —→ + Gal, + Gal-Glc
Pro i Hyp, obie występujące w ilości ok. po 100, zapewniają cząsteczce odpowiednią sztywność, a
poprzez wzajemne odpychanie wymuszają postać wydłuŜonej lewoskrętnej helisy. Aparat Golgiego pomaga w
wydaleniu takiej formy prokolagenu poza komórkę, gdzie aminoproteinaza i karboksypeptydaza prokolagenowa
usuwają peptydy ekstensyjne. UmoŜliwia to spontaniczną agregację nowo powstałych cząsteczek kolagenu do
włókien kolagenowych – typy włókniste układają się superhelisami bok do boku przy przesunięciu ¼, co
tłumaczy prąŜkowanie włókien tkanki łącznej. Ostatnim etapem jest stabilizacja włókien przez tworzenie wiązań
poprzecznych z udziałem oksydazy lizynowej; utlenia ona grupy ε-aminowe Lys i Hyl, a powstałe reszty
aldehydowe ulegają kondensacji aldolowej między sobą lub tworzą zasadę Schiffa z nieutlenionymi grupami εaminowymi. Po niewielkich przekształceniach struktura ulega wzmocnieniu i nabiera ostatecznego kształtu.
Choroby:
• Zespół Ehlersa – Danlosa charakteryzuje się nadmierną rozciągliwością skóry i zwiększoną
ruchomością stawów. WyróŜniono 11 typów, z czego w IV obserwuje się samoistne pękanie ścian jelit i
naczyń, w VI – pęknięcia gałki ocznej, w VII C – miękką skórę i nadmierną ruchomość stawów.
• Zespół Alporta związany jest z defektem kolagenu VI budującego błony podstawne. Objawia się
krwiomoczem i niewydolnością nerek.
• Epidermoliza pęcherzykowa to defekt włókien kotwiczących, zbudowanych z kolagenu VII, co
powoduje pękanie skóry i urazowe tworzenie pęcherzy.
• Szkorbut polega na deficycie witaminy C, co upośledza strukturę kolagenu. Pojawia się krwawienie z
dziąseł, wybroczyny podskórne i upośledzone gojenie ran.
c)
biochemia kości
W skład tkanki kostnej wchodzą substancje organiczne i mineralne. 95% tych pierwszych stanowi
kolagen I, reszta to kolagen V oraz białka niekolagenowe: osocza, proteoglikany CD-PG I – III, osteonektyna,
osteokalcyna, osteopontyna, sialoproteina kostna, BMP. Składniki nieorganiczne to głównie hydroksyapatyt
Ca10(PO4)6(OH)2, a takŜe Na+, Mg2+, K+, Cl-, F-, węglany i cytryniany.
Osteoklasty odpowiadają za trawienie tkanki kostnej. Na błonie apikalnej występuje rąbek
szczoteczkowy, gdzie ATP-aza pompuje protony do przestrzeni resorpcyjnej, obniŜając pH do ok. 4. Ułatwia to
rozpuszczanie hydroksyapatytu i demineralizację, zaś kwaśne proteazy lizosomalne rozkładają białka kostne.
Aktywatorami osteoklastów są: PTH, 1,25(OH)2D3, IL-1, IL-6, TNF, TGF-α, zaś inhibitorami: kalcytonina,
estrogeny (przez IL-6), TGF-β, IFN-α, PGE2.
Osteoblasty wytwarzają białka, czynniki wzrostu i cytokiny; kontrolują mineralizację przez migrację Ca +
{P} przez ich błony zawierające fosfatazę alkaliczną, która pozyskuje {P} z fosforanów organicznych.
Aktywacja zachodzi pod wpływem: PTH, 1,25(OH)2D3, T3/4, hGH, IGF-I, PGE2, TGF-β, estrogenów, zaś
hamowanie przez glikokortykoidy.
Choroby:
• karłowatość – genetyczna (achondroplazja), hormonalna (przysadkowa – GH, tarczycowa – T3/4),
• krzywica i osteomalacja – hipowitaminoza D3,
• choroba zwyrodnieniowa stawów – mutacje kolagenu I i II,
• osteoporoza – zmniejszenie gęstości kości ułatwia ich złamania; związek z estrogenami (niedobór po
menopauzie), IL-6, IL-6
• osteopetroza = marmurowatość kości – defekt procesu resorpcji powoduje wzrost gęstości kości;
przyczyną jest mutacja genu anhydrazy węglanowej II (CA-II, 8q22); występuje równieŜ kwasica
nerkowa i zwapnienia mózgowia
• przedwczesne zarastanie szwów czaszkowych:
zespół Pfeiffera – mutacja FGFR-1
zespół Jacksona – Weissa – mutacja FGFR-2
zespół Crouzona – mutacja FGFR-2
• achondroplazja / dysplazja tanatoferyczna – mutacja FGFR-3
135
- -
•
Wrodzona łamliwość kości (łac. osteogenesis imperfecta; inna nazwa – zespół błękitnych białkówek)
spowodowana jest mutacjami w obrębie genu kolagenu I, np. zamianą Gly na większy aa. Obecność
jednego nieprawidłowego łańcucha prowadzi do proteolizy całej cząsteczki, co znane jest jako
samobójstwo prokolagenu. Najgroźniejsza jest wrodzona zaawansowana postać u noworodków, które
mogą wówczas rodzić się z wieloma złamaniami i umierać. Dodatkowo twardówki oczu są
patologicznie cienkie i przejrzyste, tak iŜ prześwitują przezeń Ŝyły naczyniówki, nadając barwę lekko
niebieską, stąd inne określenie – zespół błękitnych białkówek.
9.
Biochemia zmysłu wzroku
a)
rola i przemiany karotenoidów w organizmie człowieka
W jarzynach występuje β-karoten (prowitamina A) – Ŝółty barwnik złoŜony z dwóch cząsteczek retinalu i
wykazujący 1/6 jego aktywności. W jelicie ulega on dioksygenazie β-karotenowej i przy współudziale kwasów
Ŝółciowych oraz tlenu cząsteczkowego daje 2 cząsteczki retinalu (witamina A1). Retinal w reakcji katalizowanej
przez NADPH-zaleŜną reduktazę retinalową daje odwracalnie retinol (witamina A), zaś utleniony przechodzi
nieodwracalnie w kwas retinolowy. Estry retinolu rozpuszczalne w tłuszczach pokarmowych ulegają emulgacji
w kroplach Ŝółci, hydrolizie w świetle jelita oraz wchłonięciu przez nabłonek. Retinol jest estryfikowany i
wbudowywany do chylomikronów, których remnanty wychwytywane są przez hepatocyty. Następnie retinol
magazynowany jest w lipocytach pod postacią lipoglikoprotein lub transportowany przez RBP (retinol binding
protein) do tkanek pozawątrobowych, gdzie wiąŜe go CRBP. Retinol wolny, występujący we krwi po
przekroczeniu pojemności białek transportowych, jest toksyczny i teratogenny. Kwas retinolowy transportowany
jest przez albuminy.
Retinol i kwas retinolowy ulegają wiązaniu przez białka jądrowe, działając niczym hormony sterydowe
na regulację ekspresji genów. Kwas retinolowy reguluje syntezę surfaktantu fosfolipidowego pęcherzyków
płucnych, wpływa na układ reprodukcyjny, nasila procesy wzrostu i róŜnicowania komórek przez wspomaganie
syntezy glikoprotein (fosforan retinoilowy jest błonowym przenośnikiem oligosacharydów). 5,6-epoksyretinolan
pełni funkcje antyoksydacyjne.
11-cis-retinal jest istotnym składnikiem rodopsyny, pełniącej funkcje barwnika wzrokowego. Cząsteczka
retinolu połączona jest przez zasadę Schiffa z Lys296 opsyny.
b) reakcje zachodzące w procesie fotorecepcji
Do funkcjonowania rodopsyny wymagana jest duŜa płynność błony, co zapewnia obecność kwasu
dekozaheksaenowego (DHA) w fosfolipidach siatkówki. Absorpcja kwantu światła przez rodopsynę powoduje
izomeryzację 11-cis–retinalu do formy all-trans, co z kolei destabilizuje połączenie typu zasady Schiffa.
Rodopsyna przechodzi przez kilka stadiów, rozpadając się na zaktywowaną opsynę i all-trans retinal. Ten ostatni
ulega izomerazie retinalowej, przechodząc z powrotem w formę 11-cis, która moŜe łączyć się z opsyną w
rodopsynę. Zanim jednak do tego dojdzie zaktywowana opsyna oddziałuje z białkiem GT trasnsducyną,
powodując wymianę w nim GDP na GTP. Powoduje to oddzielenie podjednostki α od zakotwiczonego w błonie
kompleksu βγ. Łączy się ona z podjednostką γ PDE cGMP, odsłaniając aktywny katalitycznie kompleks αβ.
Aktywność PDE prowadzi do znacznego spadku [cGMP] w komórce światłoczułej i zamknięcie cGMPzaleŜnych kanałów kationowych (dla Na+ i Ca2+). Przy niezakłóconej pracy innych mechanizmów wymiany
jonów prowadzi to do zwiększenia ujemnego ładunku wnętrza komórki, czyli jej hiperpolaryzacji, która po
przekroczeniu odpowiedniego progu wzbudza potencjał czynnościowy. Informacja o odebraniu bodźca wędruje
przez kolejne warstwy siatkówki do nerwu wzrokowego, po czym drogą wzrokową do korowego ośrodka
wzroku. 10 x spadek poziomu wewnątrzkomórkowego Ca2+ aktywuje GC do produkcji cGMP, co otwiera kanały
kationowe i niweluje hiperpolaryzację. Podjednostka α trasnducyny rozkłada GTP i ustaje aktywność GTPazy.
Kinaza rodopsynowa fosforyluje, a arestyna wiąŜe barwnik wzrokowy. W ten sposób układ zdolny jest do
odebrania następnego bodźca.
136
- -
ROZDZIAŁ VIII – KWASY NUKLEINOWE
I BIOSYNTEZA BIAŁEK
1.
Budowa i właściwości kwasów nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny
a)
elementy składowe kwasów nukleinowych – zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy
Cząsteczki nazywane kwasami nukleinowymi biorą swoją nazwę od głównego miejsca występowania w
komórce – jądra (łac. nucleus). WyróŜnia się dwa rodzaje kwasów nukleinowych – kwas rybonukleinowy (ang.
ribonucleic acid – RNA) oraz dezoksyrybonukleinowy (ang. desoxiribonucleic acid – DNA). W budowie
obydwu z nich dostrzec moŜna tak podobieństwa, jak i róŜnice. RóŜnią się one ponadto funkcją i lokalizacją
komórkową: DNA występuje w jądrze i stanowi magazyn informacji genetycznej, zaś RNA obecny jest w jądrze
i w cytoplazmie, a jego podstawową rolą jest udział w biosyntezie białek. Wszystkie kwasy nukleinowe są
polimerami mniejszych cząsteczek, zwanych nukleotydami. Nukleotyd składa się z nukleozydu, do którego
przyłączona jest reszta fosforanowa (PO43-). Nukleozyd z kolei stanowi połączenie zasady azotowej oraz cukru
pięciowęglowego (pentozy).
•
zasady azotowe
Zasady azotowe wchodzące w skład kwasów nukleinowych to pochodne puryny (zasady purynowe) lub
pirymidyny (zasady pirymidynowe). Zasady purynowe to adenina (A; 6-aminopuryna) i guanina (G; 2-amino-6hydrokypuryna), zaś pirymidynowe – cytozyna (C; 2-hydroksy-4-aminopirymidyna), uracyl (U; 2,4dihydroksypirymidyna) i tymina (T; 5-metylouracyl). Metabolizm tych związków opisany jest w punkcie V-4.
Adenina, guanina i cytozyna występują w obu rodzajach kwasów nukleinowych, natomiast tymina tylko w
DNA, a uracyl – tylko w RNA. Ponadto w kwasach nukleinowych zwierząt, roślin i drobnoustrojów występują
w niewielkich ilościach pochodne powyŜszych zasad, np.: hipoksantyna (H; 6-hydroksypuryna), N6metyloadenina, N6,6-dimetyloadenina, N1-metyloguanina, 5-metylocytozyna czy 5-hydroksymetylocytozyna.
Zasady azotowe mogą występować w dwóch formach tautomerycznych – puryny w ketonowej i enolowej, zaś
pirymidyny w aminowej i iminowej. W kwasach nukleinowych dominują te pierwsze – ketonowa w purynach, a
aminowa w pirymidynach – co ma istotne znaczenie w tworzeniu wiązań wodorowych (por. dalej). Obecność
układu wiązań nienasyconych powoduje, Ŝe omawiane związki silnie pochłaniają promieniowanie z zakresu
ultrafioletu (UV), z maksimum absorpcji w okolicach λ ≈ 260 nm. Ma to dwojakiego rodzaju konsekwencje – z
jednej strony czyni promienie UV wyjątkowo silnym czynnikiem mutagennym (zastosowanie w lampach
bakteriobójczych), z drugiej zaś umoŜliwia ich wykorzystanie do identyfikacji kwasów nukleinowych
(zawierająca je próbka świeci w świetle UV na pomarańczowo).
•
pentozy, nukleozydy
Drugim składnikiem nukleozydu jest cukier C5 – pentoza. Nazwy kwasów nukleinowych wzięły się
właśnie od wchodzących w ich skład cukrów – kwas rybonukleinowy zawiera D-rybozę, zaś
dezoksyrybonukleinowy – 2-dezoksy-D-rybozę. Obie pentozy występują w kwasach nukleinowych w postaciach
pierścieniowych (β-furanozowych). Atomy węgla wchodzące w skład pierścienia pentozy numeruje się, dodając
znaczek ‘ (prim), dla odróŜnienia od numeracji atomów zasad azotowych. Nukleozydy są N-glikozydami pentoz
zasad azotowych, przy czym wiązanie glikozydowe łączy atom C1’ pierścienia cukrowego z atomem N1 zasady
pirymidynowej lub N9 zasady purynowej. Ze względu na połoŜenie zasady i pentozy względem tego wiązania
wyróŜnia się konfiguracje syn i anty nukleozydów, przy czym fizjologicznie dominuje ta druga. Nazwy
nukleozydów tworzone są od występujących w nich zasad. W nukleozydach purynowych końcówkę zasady –ina
zamienia się na –ozyna: nukleozyd adeniny (9-N-β-D-rybofuranozyloadenina) to adenozyna, a guaniny (9-N-βD-rybofuranozyloguanina) – guanozyna. Nazwy nukleozydów pirymidyn tworzy się w inny sposób: nukleozyd
uracylu (1-N-β-D-rybofuranozylouracyl) to urydyna, cytozyny (1-N-β-D-rybofuranozylocytozyna) – cytydyna,
zaś tyminy (1-N-2’-dezoksy-β-D-rybofuranozylotymina) – tymidyna (występuje tylko w DNA i zawsze zawiera
dezoksyrybozę). Inne niŜ tymidyna nukleozydy zawierające dezoksyrybozę przybierają dodatkowo przedrostek
dezoksy-: dezoksyadenozyna (9-N-2’-dezoksy-β-D-rybofuranozyloadenina), dezoksyguanozyna (9-N-2’dezoksy-β-D-rybofuranozyloguanina) oraz dezoksycytydyna (1-N-2’-dezoksy-β-D-rybofuranozylocytozyna).
Nukleozydy zawierające rybozę określa się jak rybozydy, a dezoksyrybozę – dezoksyrybozydy. Jednoliterowe
skróty nazw zasad (A, G, C, T, U) stosuje się równieŜ jako skróty nazw ich nukleozydów, czyli np. G oznacza
zarówno guaninę, jak i guanozynę, zaleŜnie od kontekstu. Wyjątkowo w kwasach nukleinowych mogą
137
- -
występować nukleozydy zawierające inne niŜ wyŜej opisane rodzaje wiązań – np. w pseudourydynie (5rybozylouracyl, ψ-urydyna lub po prostu ψ) ryboza związana jest z atomem C5, a nie C1 uracylu; związek ten
występuje w pewnych rodzajach RNA (tRNA, por. dalej).
•
nukleotydy
Nukleotydy są estrami fosforowymi (dokładnie – ortofosforowymi (V)) nukleozydów. Reszta
fosforanowa związana jest z jedną z grup hydroksylowych pentozy: w rybozydach – przy C2’, C3’ lub C5’, a
dezoksyrybozydach – przy C3’ lub C5’. Nazwy nukleotydów tworzy się od nazw ich nukleozydów, dodając
numer atomu węgla, z którym związana jest zestryfikowana grupa hydroksylowa – i tak kwas 5’-adenylowy to
adenozyno-5’-fosforan (ang. adenosine 5’-monophosphate – 5’-AMP), kwas 5’-guanylowy – guanozyno-5’monofosforan (GMP), kwas 5’-urydylowy – urydyno-5’-monofosforan (UMP), kwas 5’-cytydylowy – cytydyno5’-monofosforan (CMP); określa się je łącznie mianem rybotydów. Przez analogię dezoksyrybotydy to: kwas
tymidylowy – tymidyno-5’-monofosforan (TMP), kwas dezoksyadenylowy (dAMP), dezoksyguanylowy
(gGMP) oraz dezoksycytydylowy (dCMP). W niewielkich ilościach występują w kwasach nukleinowych
nietypowe nukleotydy, jak np. kwas 5’-inozynowy – inozyno-5’-monofosforan (IMP), w którym zasadą jest
hipoksantyna. Wszystkie nukleozydy mogą być równieŜ fosforylowane przy C3’, a rybozydy – takŜe przy C2’.
Istnieją teŜ cykliczne nukleotydy, w których reszta fosforanowa estryfikuje dwie kolejne grupy hydroksylowe (tj.
przy C2’ i C3’ lub C3’ i C5’); aby zaznaczyć ich cykliczny charakter, dodaje się do skrótu literę c, np. cykliczny
3’,5’-guanozynomonofosforan to 3’,5’-cGMP. Monofosforany nukleozydów mogą być dalej fosforylowane –
powstają wówczas dwu- (ADP, GDP, CDP, TDP, UDP) i trójfosforany nukleozydów (ATP, GDP, CDP, TTP,
UTP). Substratami do biosyntezy kwasów nukleinowych są właśnie te ostatnie (por. dalej). Ponadto
trójfosforany nukleozydów uŜywane są jako cząsteczki aktywujące inne związki, pozwalając im na pełnienie
funkcji substratów w wielu reakcjach – por. UDP i synteza glikogenu (patrz punkt III-5-a), metabolizm
galaktozy (III-6-c) czy aminocukrów (III-7-a), CTP i synteza fosfolipidów, ATP i synteza białek (VIII-4-b).
•
polinukleotydy
Kwasy nukleinowe – zarówno DNA, jak i RNA – są polinukleotydami, tj. liniowymi polimerami
odpowiednich nukleotydów, połączonych ze sobą wiązaniami fosfodwuestrowymi (reszta fosforanowa łączy
atom C3’ jednej pentozy z C5’ kolejnej). W ten sposób powstaje polarna nić, w której wyróŜnić moŜna koniec 5’
oraz 3’; na 5’-końcu obecna jest zazwyczaj wolna grupa hydroksylowa (rzadko ufosforylowana), a na 3’-końcu –
ufosforylowana (rzadko wolna). Sekwencję nukleotydów w cząsteczce kwasu nukleinowego, czyli jego strukturę
I-rzędową, podaje się zawsze w kolejności 5’→3’, chyba Ŝe zaznaczone jest inaczej.
W odpowiednich warunkach reszty fosforanowe dysocjują, co nadaje polinukleotydom ładunek
elektryczny. To z kolei umoŜliwia im wędrówkę w stałym polu elektrostatycznym, a przez to – rozdział metodą
elektroforezy (patrz punkt I-1-g).
b) budowa przestrzenna i właściwości DNA
Badacze J. D. Watson i F. C. K. Crick wykazali, Ŝe DNA posiada strukturę II-rzędową w postaci
podwójnej prawoskrętnej helisy. Dwie nici polinukleotydowe występują jako wzajemnie splecione helisy,
oplatające linią śrubową wspólną oś długą.
• W zaleŜności od warunków środowiska, dwupasmowe DNA moŜe występować w co najmniej 6
formach: A, B, C, D, E i Z, przy czym w warunkach fizjologicznych (niskie stęŜenia soli, wysoki
poziom uwodnienia) dominuje forma B.
W formie B szerokość helisy (odległość między atomami C1 danej zasady i zasady komplementarnej)
wynosi ok. 1,1 nm, skok p = 3,4 nm, ilość par zasad na skok n = 10, zatem odległość między
sąsiadującymi zasadami wynosi 3,4 : 10 = 0,34 nm, a ich wzajemne skręcenie: 360o : 10 = 36o.
Płaszczyzny pierścieni sąsiadujących ze sobą zasad są równoległe i występują między nimi tzw.
oddziaływania warstwowe. Pomiędzy warstwy te mogą wnikać róŜne inne cząsteczki, zaburzając
funkcjonowanie DNA, co pozwoliło na ich zastosowanie jako środki dezynfekcyjne (barwniki
akrydynowe, np. etakrydyna – Riwanol) lub leki cytostatyczne (p/nowotworowe). Obie helisy
rozdzielone są przez 2 róŜnej wielkości rowki – większy i mniejszy – stanowiące miejsca interakcji z
białkami, które mogą dzięki temu rozpoznawać i wiązać się ze swoistymi sekwencjami
nukleotydowymi bez potrzeby rozdzielania par zasad komplementarnych (por. punkt VIII-1-j).
Forma Z powstaje w warunkach zmniejszonego uwodnienia (hydratacji). Cechuje się rozsunięciem obu
nici i obecnością wolnej przestrzeni wewnątrz cząsteczki.
W formie E zaasdy nie występują w układzie osiowym, lecz niejako rozsuniętym.
138
- -
•
•
•
PoniewaŜ oba łańcuchy są prawoskrętne i polarne, muszą być przeciwbieŜne, tzn. sekwencje atomów i
grup układają się w kaŜdym z nich w kierunku przeciwnym. Pasmo biegnące w kierunku 5’→3’ określa
się jako kodujące, poniewaŜ koduje przekazywaną informację genetyczną (przekłada się na sekwencję
aa w kodowanym białku), drugie natomiast (3’→5’) – jako matrycowe, gdyŜ stanowi matrycę do
syntezy mRNA.
Grupy cukrowe i fosforanowe stanowią zewnętrzny szkielet, wijący się helikalnie, natomiast zasady
schowane są we wnętrzu cząsteczki, co chroni informację genetyczną i umoŜliwia oddziaływania
między zasadami. KaŜda zasada jednego łańcucha jest bowiem połączona kilkoma wiązaniami
wodorowymi z naprzeciw leŜącą zasadą drugiego łańcucha. PoniewaŜ odległość między nićmi jest
stała, a wymiary zasad purynowych i pirymidynowych – róŜne, toteŜ wnioskować moŜna, Ŝe wiązania
tworzą się między zasadą purynową jednego łańcucha a pirymidynową drugiego. Jednak skład pary
puryna – pirymidyna tworzącej wiązania nie jest dowolny, ograniczają go bowiem moŜliwości rotacji
wokół wiązań fosfodwuestrowych, preferencja konfiguracji anty wiązania N-glikozydowego oraz
dominacja określonych form tautomerycznych zasad azotowych (keto » enolo, amino » imino). Analiza
tych ograniczeń uzasadnia obserwację, Ŝe wiązania wodorowe tworzą się tylko między parami A i T
oraz G i C – z tego powodu zasady kaŜdej z par określa się jako komplementarne (uzupełniające się). W
parze A-T jedno wiązanie powstaje między atomem N1 A a atomem wodoru przy N5 T, drugie zaś
między grupą aminową przy C6 A a grupą ketonową przy C4 T; obecne są więc dwa wiązania,
wzajemnie do siebie równoległe. Natomiast w parze G-C tworzą się 3 wiązania: jedno między atomem
wodoru przy N1 G a atomem N5 C, drugie między grupą ketonową przy C6 G a grupą aminową przy
C4 C oraz trzecie między grupą aminową przy C2 G a grupą ketonową przy C6 C. Obecność
dodatkowego wiązania wodorowego powoduje, ze siły utrzymujące parę G≡C są mocniejsze niŜ w
przypadku A=T. Następstwem komplementarności jest równa ilość uzupełniających się zasad w
cząsteczce DNA (A = T, a G = C), przez co w konsekwencji ilość puryn (A + G) jest taka sama jak
ilość pirymidyn (C + T). Natomiast stosunek A+T : G+C jest zmienny gatunkowo. Długość odcinka
DNA lub sparowanego RNA wyraŜa się podając ilość wchodzących w jego skład par zasad (ang. base
pairs – bp). Cały genom ludzki składa się z ok. 3 Gbp.
Denaturacja (topnienie) DNA polega na rozpleceniu podwójnej helisy i zmianie płaszczyzn
wzajemnego połoŜenia zasad przy zachowaniu struktury I-rzędowej (sekwencji nukleotydów). Do
zmian w środowisku powodujących denaturację zaliczamy wysoką temperaturę i obniŜenie stęŜenia
soli. PoniewaŜ róŜnie regiony DNA cechują się zróŜnicowaną wraŜliwością na czynniki denaturujące,
przez temperaturę topnienia (Tm) DNA rozumie się średnią temperatur rozpoczęcia i zakończenia
rozplatywania DNA. ZaleŜy ona od składu zasad DNA (ilość wiązań komplementarnych i
oddziaływania warstwowe decydują o tym, Ŝe regiony DNA o duŜej zawartości par G≡C są bardziej
odporne na denaturację niŜ bogate w pary A=T), stęŜenia soli w roztworze oraz od obecności innych
substancji, np. formamid destabilizuje wiązania wodorowe i ułatwia denaturację. Denaturacji
towarzyszy spadek lepkości roztworu oraz tzw. efekt hiperchromiczny, polegający na zwiększeniu
absorpcji promieniowania UV przez zasady azotowe. Po powrocie do fizjologicznej temperatury i siły
jonowej następuje powrót do postaci natywej – renaturacja, czyli ponowne połączenie (reasocjacja)
rozdzielonych pasm komplementarnych lub tworzenie hybryd z cDNA lub mRNA, co wykorzystuje się
w analityce odpowiednio w metodach Southern- i Northern-blotting. Denaturację cieplną wykorzystuje
się równieŜ w technice PCR.
W niektórych niŜszych organizmach (bakterie, wirusy) DNA ma formę kolistą, co niweluje wolne końce
5’ i 3’. Taka cząsteczka moŜe występować w postaci rozluźnionej albo silnie skręconej (gdy zajdzie skręcenie
wokół własnej osi bądź skręcenie linijnej cząsteczki o zakotwiczonych końcach). Proces dodatkowego skręcania
wymaga dostarczenia energii w ilości proporcjonalnej do stopnia skręcenia. Oznacza to, Ŝe cząsteczka
zawierająca dodatkowe skręty posiada zmagazynowaną w ten sposób energię, przez co łatwiej poddaje się
reakcjom endoergicznym (np. rozdzielaniu pasm niezbędnemu do replikacji i transkrypcji) i dzięki temu jest
preferowaną postacią w układach biologicznych. Zmiany stopnia skręcenia, tj. topologiczne zmiany DNA,
katalizowane są przez enzymy topoizomerazy – ich przykładem jest bakteryjna gyraza DNA, czerpiąca energię z
ATP w celu wprowadzania dodatkowych skrętów. Zablokowanie aktywności topoizomeraz uniemoŜliwia
podziały komórkowe, stąd zastosowanie ich inhibitorów jako chemioterapeutyki (chinolony) i cytostatyki
(kamptotecyna i jej pochodne).
139
- -
c)
budowa, właściwości i klasyfikacja RNA
W przeciwieństwie do DNA, kwas rybonukleinowy składa się z pojedynczego łańcucha
polinukleotydowego; istnieje tu tylko jeden wyjątek w postaci sekwencji palindromowych, zawierających ciągi
komplementarnych zasad o odwróconej polarności, które mogą ulegać parowaniu. Konsekwencją jednonicowej
budowy RNA jest nierówna ilość A i U oraz G i C (równość moŜe zdarzyć się przypadkowo). Ponadto w RNA
tymina (T) zastąpiona jest przez uracyl (U), a pentozą jest ryboza – obecność grupy hydroksylowej przy atomie
C2’ cukru warunkuje wraŜliwość RNA na hydrolizę zasadową, w wyniku której powstają cykliczne 2’,3’dwuestry nukleozydów. RNA powstaje w wyniku transkrypcji DNA – jest więc komplementarny do
matrycowego pasma źródłowego DNA i moŜe z nim hybrydyzować (Northern-blotting). W komórce istnieje 5
klas RNA (mRNA, tRNA, rRNA, hnRNA i snRNA), róŜniących się wielkością, stabilnością i szczegółową rolą,
ale ogólną funkcją wszystkich z nich jest udział w biosyntezie białek.
Informacja z DNA przepisywana jest w procesie transkrypcji na informacyjny RNA (ang. messager RNA
– mRNA). W komórce moŜe więc występować tyle rodzajów mRNA, ile genów posiada jej materiał genetyczny,
a więc u człowieka aŜ 30 tys. mRNA posiada stałą sedymentacji w granicach 18 – 30S i stanowi niewielką część
(5%) ogólnej puli RNA komórki. U Eucariota DNA jest wpierw przepisywane na heterogenny jądrowy RNA
(ang. heterogenous nuclear RNA – hnRNA), który następnie przechodzi proces składania, dając ostatecznie
dojrzałe mRNA. W składaniu RNA uczestniczy pomocniczo małocząsteczkowy jądrowy RNA (snRNA; ok. 10
rodzajów cząsteczek). Informacja z gotowego mRNA jest następnie przepisywana na sekwencję aa w
kodowanym białku w procesie translacji. To tego ostatniego niezbędne są dwa kolejne rodzaje RNA, tj.
rybosomalny (rRNA) oraz transportujący (tRNA). Istnieją tylko 4 rodzaje rRNA, jednak stanowią one aŜ 80%
komórkowego RNA. Wraz z odpowiednimi białkami współtworzą podjednostki rybosomalne (większą i
mniejszą), które złoŜone w całość dają kompletny rybosom. tRNA pełni funkcję pośredniczącą pomiędzy
sekwencją nukleotydów a sekwencją aa – ma budowę niejako dwubiegunową i moŜe przyłączać oba te
elementy. Istnieje ok. 50 rodzajów tRNA, ta klasa ma jednak znikomy udział ilościowy w RNA komórki.
Pewne rodzaje RNA (rRNA, snRNA) wykazują wewnętrzną aktywność katalityczną (działają jak
enzymy), dlatego określa się je mianem rybozymów („rybonukleinowych enzymów”). Stanowi to fenomen
biochemiczny, poniewaŜ aktywność katalityczna jest cechą przypisywaną wyłącznie cząsteczkom białek.
snRNA pełni funkcje rybozymu w reakcjach endorybonukleolizy i transestryfikacji w procesie składania mRNA
(por. punkt VIII-3-c), zaś rRNA – w reakcji hydrolizy estru aminoacylowego w elongacji translacji (por. punkt
VIII-4-d).
d) budowa chromatyny
W organizmach eukariotycznych niemal całość materiału genetycznego (DNA) znajduje się na terenie
jądra komórkowego, gdzie występuje w formie związanej z białkami jako chromatyna. Są to głównie białka
zasadowe – histony, resztę stanowią kwaśne i większe białka niehistonowe. W skład chromatyny wchodzi
równieŜ niewielka ilość RNA.
Histony to mała grupa blisko spokrewnionych ze sobą białek. Oznacza się je symbolami: H1, H2A, H2B,
H3 i H4. 2/3 cząsteczki począwszy od C końca zawiera zwykły skład aa, natomiast w 1/3 N-końcowej części
dominują aa zasadowe – w H2A i H2B jest to głównie Lys, a w H3 i H4 – Arg. Histon H1 jest najsłabiej
związany z chromatyną i daje się z niej łatwo usunąć roztworem soli, co pozwala na rozpuszczenie chromatyny.
Pozostałe rodzaje histonów wchodzą w skład rdzenia nukleosomów: H3 i H4 agregują w tetramer (H3/H4)2, a
H2A i H2B łączą się w dimer H2A/H2B, który moŜe polimeryzować do form (H2A/H2B)n – fizjologicznie n=2,
czyli powstaje drugi tetramer. Oba tetramery asocjują, tworząc oktamer histonowy, który spontanicznie łączy się
z DNA, w wyniku czego powstaje nukleosom. Tworzenie struktury nukleosomu uwarunkowane jest obecnością
H3 i H4, zaś H2A i H2B stabilizują pierwotną cząsteczkę i wiąŜą 2 dodatkowe półskoki spirali DNA. Nić
polinukleotydowa owinięta jest wokół oktameru 1,75 x, co odpowiada odcinkowi 146 bp, natomiast
poszczególne nukleosomy oddzielone są od siebie odcinkami o długości ok. 30 bp. Dalsze upakowanie materiału
genetycznego zaleŜy od interakcji histonów H1 z przyległymi nukleosomami. Większość komórkowego DNA
występuje właśnie w postaci nukleosomów, a cały genom ludzki zawiera ich ok. 17 mln. Preferencja
nukleosomów do pewnych regionów na szczególnych cząsteczkach DNA określana jest jako fazowanie.
Histony nukleosomów mogą podlegać 5 rodzajom modyfikacji kowalencyjnych, których znaczenie nie
zostało do końca poznane; są to:
• acetylacja – w przypadku H3 i H4 jest to mechanizm regulacji transkrypcji genów,
• fosforylacja – dodanie reszty {P} do H1 towarzyszy kondensacji chromosomów w czasie cyklu
replikacyjnego,
• ADP-rybozylacja – związana jest z naprawą DNA,
• kowalencyjne związanie z ubikwityną – tylko w przypadku H2A,
• metylacja.
140
- -
Nukleoplazmina jest pentamerem kwaśnego białka, które nie wiąŜe się ani z DNA ani z chromatyną, lecz
ma zdolność odwracalnego oddziaływania z oktamerem histonowym, dzięki czemu zasadowe (kationowe)
histony nie przylegają nieswoiście do kwaśnych (anionowych) powierzchni takich jak DNA. Białko to utrzymuje
w jądrze komórkowym środowisko jonowe powodujące swoiste oddziaływania DNA z histonami i tworzenie
struktur nukleosomów. Po utworzeniu nukleosomów nukleoplazmina uwalnia się od histonów.
Strukturami wyŜszego rzędu od nukleosomów są nici chromatydowe 10 nm oraz 25-30 nm. Nić 10 nm
(stopień upakowania 1-10 x) składa się z nukleosomów ułoŜonych w taki sposób, Ŝe ich brzegi stykają się, a ich
płaskie powierzchnie leŜą równolegle do długiej osi nici. Nić 10 nm jest dodatkowo skręcona, tworząc nić 30 nm
(upakowanie 40-60 x), zawierającą 6 – 7 nukleosomów na 1 skok. Zwoje tej spirali są dosyć płaskie, a płaskie
powierzchnie nukleosomów kolejnych skrętów są niemal równoległe. Nić 30 nm jest prawdopodobnie
stabilizowana przez histony H1.
Nici chromatyny mogą ulegać dalszemu zwinięciu w pętle (domeny), zakotwiczone w strukturze
szkieletowej (macierzy podporowej) jądra. Jedna domena obejmuje odcinek DNA o długości 30 – 100 kbp. W
ich obrębie określone sekwencje DNA mogą posiadać nieprzypadkowe ułoŜenie.
e)
chromatyna aktywna i nieaktywna
Pomimo faktu, iŜ kaŜda komórka ludzkiego ustroju zawiera te same cząsteczki DNA, to poszczególne
komórki wykazują bardzo zróŜnicowaną ekspresję genów. Jest to wynikiem róŜnic w aktywności
poszczególnych sekwencji DNA, okazuje się bowiem, Ŝe chromatyna zawiera fragmenty transkrypcyjnie
aktywne oraz nieaktywne.
Chromatyna aktywna – euchromatyna – występuje w postaci rozluźnionej, tzn. ma zmienioną lub
całkowicie zniesioną strukturę nukleosomalną. Zawiera duŜe (ok. 100 kbp) regiony wraŜliwe na trawienie
nukleazą (np. DNAazą I), w obrębie których istnieją krótkie (100-300 bp) odcinki o wybitnie zwiększonej
(nawet 20x) wraŜliwości, często połoŜone bezpośrednio przed aktywnym genem. W powstawaniu miejsc
nadwraŜliwych biorą udział białka uczestniczące w transkrypcji oraz zaangaŜowane w utrzymywanie dostępu do
pasma matrycowego.
Chromatyna nieaktywna – heterochromatyna – jest natomiast gęsto upakowana. Dzieli się ona na dwa
rodzaje. Heterochromatyna konstytutywna jest zawsze nieaktywna (upakowana), występuje w regionach w
pobliŜu centromeru i w telomerach. Natomiast heterochromatyna fakultatywna moŜe być przejściowo aktywna i
ulegać transkrypcji, przez resztę czasu będąc skondensowaną i nieaktywną. Jej przykładem jest drugi
chromosom X u kobiet, który kondensuje w tzw. ciałko Barra, ale ulega dekondensacji w okresie gametogenezy
i jest aktywny we wczesnej embriogenezie.
Chromatyna wykazuje największy stopień upakowania w stadium metafazy – wówczas występuje w
postaci chromosomów (u człowieka w licznie 2n = 46). Pętle chromosomów metafazowych posiadają
współczynnik upakowania ok. 8000x. KaŜdy chromosom składa się z dwóch identycznych (siostrzanych)
połówek, zwanych chromatydami – kaŜda z nich stanowi pojedynczą cząsteczkę dwupasmowego DNA.
Chromatydy połączone są w centromerze – nazwanym tak, gdyŜ połoŜony jest mniej więcej w połowie długości
chromosomów. Centromer ma długość ok. 130 bp i zawiera region bogaty w pary A=T, a wraz z licznymi
białkami tworzy kompleks zwany kinetochorą, do którego przyłącza się wrzeciono kariokinetyczne. Na końcach
kaŜdego chromosomu obecne są telomery, złoŜone z wielokrotnie powtórzonej pojedynczej sekwencji bogatej w
T i G (u człowieka: 5’-TTAGGG-3’). Telomery ulegają skracaniu wraz z kaŜdym podziałem komórki, co
warunkuje ich Ŝywotność. W niektórych komórkach istnieje odtwarzający je enzym – telomeraza; obecność
telomerazy w komórkach nowotworowych warunkuje ich nieśmiertelność.
f)
sekwencje powtarzające; mutacje dynamiczne; konwersja genu
DuŜa część ludzkiego (i innych ssaków) genomu występuje w nadmiarze – większość posiadanego przez
nas DNA nie niesie informacji i nie ulega ekspresji. Całość DNA moŜna zatem podzielić na sekwencje
unikatowe (nie powtarzające się, złoŜone z pojedynczych kopii genów kodujących białka) oraz sekwencje
powtarzające (2 – 10 mln kopii w kaŜdej komórce), stanowiące 20 – 30 % genomu. Te ostatnie dzielą się na
sekwencje umiarkowanie oraz często powtarzające.
• Sekwencje często powtarzające składają się z odcinków długości 5 – 500 bp, powtarzanych
wielokrotnie w postaci tandemu. Są one zgrupowane w centromerach i telomerach, występują w liczbie
1 – 10 mln kopii, są nieaktywne transkrypyjnie i mogą pełnić funkcje strukturalne.
• Sekwencje umiarkowanie powtarzające występują w mniejszej liczbie (< 1 mln kopii) i nie są
zgrupowane, lecz rozproszone wśród sekwencji unikatowych. Mogą ulegać transkrypcji przez
polimerazę RNA II i posiadać czapeczki metylacyjne. Dzielą się na długie (LINEs – 6-7 kbp, 20-50 tys.
kopii) oraz krótkie (SINEs 70-300 bp, ≥ 100 tys. kopii). Prawdopodobnie są one retropozonami, tj.
sekwencjami powstałymi wskutek transpozycji oraz utworzonymi za pośrednictwem RNA i odwrotnej
141
- -
transkryptazy. Przykładem SINE jest rodzina sekwencji Alu, występująca w liczbie ½ mln kopii, a
której przedstawiciele wykazują zdolność poruszania się w obrębie genomu.
Sekwencje powtarzające istnieją w formie rozproszonej lub zgrupowanych tandemów sekwencji
mikrosatelitarnych – długości 2-5 bp, ok. 50 powtórzeń, najczęściej AC na jednym paśmie i TG na drugim,
zlokalizowane w ok. 50 – 100 tys. miejsc w genomie. Heterozygotyczność pod względem liczby kopii
poszczególnych sekwencji mikrosatelitarnych, czyli inaczej mówiąc – istnienie róŜnej ilości powtórzeń na
dwóch chromosomach homologicznych, jest cechą dziedziczną. Mnogość i łatwość wykrywania tych sekwencji
metodą PCR czyli z nich uŜyteczne narządzie diagnostyczne – większość genów towarzyszy bowiem co
najmniej jednemu markerowi satelitarnemu, przez co moŜna oznaczyć ich połoŜenie (mapy sprzęŜeń), a ponadto
moŜna badać polimorfizm mikrosatelitarny u duŜej liczby spokrewnionych osób. Mutacje dynamiczne, głównie
zwiększenie liczby powtórzeń sekwencji trójnukleotydowych, czyli niestabilność sekwencji mikrosatelitarnych,
jest przyczyną wielu chorób, m. in. zespołu łamliwego chromosomu X (powtórzenia CGG), choroby
Huntingtona (CAG), dystrofii miotonicznej (CTG), atrofii mięśniowej rdzeniowo – opuszkowej (CAG) czy
choroby Kennedy’ego (CAG).
Konwersja genu to ujednolicenie sekwencji składowych rodzin powtarzającego DNA w wyniku
przypadkowego utrwalenia jednego z ich wariantów. Sytuacja taka ma miejsce, gdy podobne sekwencje na
chromosomach homologicznych nieprzypadkowo wytwarzają między sobą sparowane struktury dwupasmowe i
eliminują wszystkie sekwencje niesparowane.
g) rekombinacja (crossing-over); wymiana chromatyd siostrzanych
Materiał genetyczny moŜe ulegać rearanŜacji, m. in. drogą rekombinacji chromosomalnej, czyli równej i
wzajemnej wymiany fragmentów chromosomów homologicznych (ang. crossing-over – dosłownie:
przechodzenie na drugą stronę). Zjawisko to zachodzi w stadium pachytenu profazy I mejozy. JeŜeli osobnik jest
heterozygotą względem genu połoŜonego w odcinku podlegającym rekombinacji, wówczas mogą pojawić się
zauwaŜalne i dziedziczne róŜnice w sprzęŜeni genów. Z kolei przy niedokładnym ułoŜeniu chromosomów moŜe
dochodzić do nierównej wymiany materiału – tzw. nierównego crossing-over. Oddziałuje to na tandemową
organizację powtarzających sekwencji DNA i moŜe zmienić liczbę kopii rodziny takich sekwencji.
Wymiana chromatyd siostrzanych to proces rekombinacji, zachodzący między identycznymi
chromatydami w tetraploidalnych komórkach, które zakończyły fazę S cyklu komórkowego. Są one identyczne,
poniewaŜ są produktami semikonserwatywnej replikacji wspólnej macierzystej cząsteczki DNA. Wymiana
chromatyd siostrzanych nie niesie ze sobą Ŝadnych konsekwencji genetycznych tak długo, jak nie dochodzi do
nierównego crossing-over.
h) gen i jego ekspresja; genom
Gen jest podstawową jednostką informacji genetycznej. Dokładna definicja genu ulegała wielokrotnej
modyfikacji. Pierwotnie, zanim poznano budowę i rolę DNA, przez gen rozumiano czynnik determinujący
występowanie u organizmu określonej cechy. Później, gdy odkryto Ŝe DNA niesie informacje o strukturze
białek, genem nazywano odcinek DNA kodujący strukturę pojedynczego białka. PoniewaŜ jednak wykazano
istnienie białek złoŜonych z kilku podjednostek, kodowanych przez odmienne geny, toteŜ współcześnie przez
gen rozumie się fragment DNA kodujący jeden łańcuch polipeptydowy.
Ekspresja (dosłownie: wyraŜanie) genu to proces tłumaczenia zawartej w nim (w postaci sekwencji
nukleotydów) informacji na strukturę I-rzędową nowo biosyntetyzanego białka (czyli sekwencji występujących
w tym białku aa). Ekspresja genu jest bardzo złoŜona pod względem biochemicznym, moŜna ją podzielić na 2
etapy. W pierwszym, zwanym transkrypcją, sekwencja dezoksyrybotydów DNA przepisywana jest na sekwencję
rybotydów RNA – zazwyczaj mRNA. Innymi słowy na matrycy w postaci jednego z pasm DNA (z tego właśnie
powodu określanego jako matrycowe) syntetyzowana jest nowa cząsteczka RNA. Produkt transkrypcji (RNA)
stanowi jednocześnie substrat dla drugiego etapu – translacji, w którym z kolei sekwencja rybotydów RNA
przekładana jest na sekwencję aa w powstającym białku. Przez analogię do powyŜszego – na matrycy RNA
(równieŜ nazywanego matrycowym – stąd mRNA) biosyntetyzowane jest nowe białko. Cząsteczki mRNA
stanowią zatem w tym łańcuchu pośrednie ogniwo. Ekspresja genów podlega złoŜonej regulacji.
Genomem nazywamy całość materiału genetycznego, jaki posiada kaŜda komórka organizmu. U niŜszych
organizmów genom stanowi pojedyncza, zamknięta cząsteczka DNA, u wyŜszych natomiast DNA podzielone
jest na duŜe odcinki, z których kaŜda ulega upakowaniu w jeden chromosom. MoŜna więc powiedzieć, Ŝe genom
to inaczej pojedynczy (haploidalny) zestaw chromosomów (przykładowo u człowieka liczący n = 23
chromosomy). Genom ludzki zawiera ok. 30 tys. genów, tzn. znajduje się w nim informacja o budowie takiej
liczby łańcuchów polipeptydowych. Genom to jednak więcej niŜ zbiór wszystkich genów, występuje w nim
bowiem jeszcze duŜa ilość tzw. materiału międzygenowego – nie ulegającego tłumaczeniu na strukturę białek,
lecz pełniącemu funkcje strukturalne i regulacyjne.
142
- -
i)
transpozony; geny przekształcone
W komórkach eukariotycznych istnieją małe elementy DNA – tzw. „skaczące DNA” – zdolne do
transpozycji, czyli zmiany swojego połoŜenia w obrębie genomu bez zaburzania funkcji sąsiednich sekwencji
DNA. Dowodem na ich istnienie jest obecność genów przekształconych, tj. złoŜonych z sekwencji DNA
identycznych lub bardzo podobnych do mRNA kodującego produkt odpowiedniego genu. W genach tych
nietranskrybowany region 5’-końcowy, fragment kodujący pozbawiony intronu oraz 3’-końcowa sekwencja
poliadenylowa ułoŜone są w sposób ciągły. Jedynym wyjaśnieniem tego zjawiska jest wsteczna transkrypcja
mRNA do DNA na zasadzie transpozycji. Znane są geny przekształcone m. in. dla cząsteczek immunoglobulin,
α-globuliny i innych. Pseudogeny to geny przekształcone, które w przebiegu ewolucji zostały tak zmienione, Ŝe
zawierają kodony nonsensowne (por. punkt VIII-4-d – termiacja translacji), uniemoŜliwiające ich ekspresję.
j)
motywy funkcjonalne białek wiąŜących się z DNA
Wiele białek, m. in. regulatorów transkrypcji, musi wiązać się do określonych sekwencji DNA z wysokim
powinowactwem, wykazując jednocześnie niewielkie do innych. UmoŜliwiają im to trzy unikatowe motywy
funkcjonalne: helisa-skręt-helisa, palec cynkowy i zamek leucynowy. W bezpośredni kontakt z DNA wchodzą
jedynie niewielkie regiony tych białek, zawierające powyŜsze motywy, pozostałe części cząsteczek odpowiadają
za dimeryzację i stabilizację. Białka te wiąŜą się kooperatywnie do kilku miejsc w obrębie DNA, a kontakt
białko-DNA utrzymywany jest dzięki wiązaniom niekowalencyjnym – wodorowym i van der Waalsa.
Motyw helisa-skręt-helisa (ang. helix-turn-helix) występuje u ssaków w białkach homeobox (por. geny
homeotyczne) i pou, jak równieŜ u organizmów prymitywnych, np. w represorze Cro bakteriofaga λ. Monomer
białka Cro składa się z trzech przeciwrównoległych płaszczyzn β (1 – 3) oraz trzech α-helis (1 – 3). Elementem
bezpośrednio rozpoznającym i wiąŜącym się do powierzchni DNA jest helisa α3. Średnia szerokość α-helisy
wynosi 120 nm, co odpowiada mniej więcej szerokości większego rowka DNA w formie B. Motyw helisa-skręthelisa powstaje w ten sposób, Ŝe helisy α2 i α3 są utrzymywane pod kątem 90o przez skręt 4 aa. Dwa monomery
białka Cro asocjują przez zwinięcie antyrówoległych płaszczyzn β3 w dimer o podwójnej osi symetrii. Reszta
cząsteczki odpowiada głównie za jej stabilizację. Domena rozpoznająca DNA kaŜdego monomeru oddziałuje z
nim na odcinku 5 bp. Cały odcinek DNA przyłączający białko zawiera sekwencje palindromowe i ma długość
340 nm – odpowiada to długości jednego kompletnego zwoju podwójnej helisy DNA, przez co umoŜliwia
dopasowanie kolejnych półskrętów w rowku większym na tej samej powierzchni.
Motyw palca cynkowego (ang. zinc finger) występuje u ssaków m. in. w rodzinie receptorów steroidowo
– tarczycowych oraz w białku Sp1. Palce cynkowe stanowią serię powtórzonych domen (2 – 9 x), z których
kaŜda osadza się na atomie cynku w postaci tetraedralnej konformacji. Atom ten związany jest przez 2 kolejne
reszty Cys, następnie obecna jest sekwencja 12 – 13 aa, po czym znów występują 2 reszty Cys (np. w THIIIA)
lub 2 reszty His (np. w rodzinie receptorów steroidowo – tarczycowych) – atom cynku jest więc umocowany do
białka czterema wiązaniami. Białka zawierające taki motyw wiąŜą się do jednej płaszczyzny helisy DNA, a
kolejne palce ułoŜone są naprzemiennie w obrębie duŜego skrętu w duŜym rowku, oddziałując na odcinku 5 bp.
Mutacja pojedynczego aa w jednym z dwóch palców cynkowych receptora dla 1,25(OH)2D3 powoduje krzywicę
typu II.
Motyw zamka leucynowego (ang. leucine zipper) występuje w wielu ssaczych białkach regulatorowych –
C/EBP, Fos, Jun/Ap1, c-myc, n-myc, l-myc. Występuje w postaci 30-aa sekwencji α-helikalnej, w której reszty
Leu powtarzają się w stałej odległości 7 aa, przez co znajdują się po jednej stronie helisy w ułoŜeniu liniowym.
Organizacja taka obejmuje 8 helikalnych skrętów i 4 powtarzające się reszty Leu. Prawdopodobnie struktura ta
pozwala na połączenie monomerów białkowych w homo- (np. Jun*Jun) lub heterodimery (Jun*Fos), podobnie
jak zamek błyskawiczny. Zamek leucynowy, w przeciwieństwie do dwóch poprzednich motywów, bierze więc
udział w interakcjach typu białko-białko, które wzmacniają oddziaływania poszczególnych pojedynczych domen
z docelowymi sekwencjami DNA. Tak struktura wydaje się niezbędna do utrzymania domen wiąŜących DNA
kaŜdego monomeru w odpowiedniej konformacji, umoŜliwiającej właściwe wiązanie.
2.
Replikacja i naprawa DNA; cykl komórkowy i jego regulacja
Replikacja (duplikacja, kopiowanie) DNA jest procesem syntezy nowej cząsteczki DNA, identycznej z
juŜ istniejącą. W jej wyniku ilość materiału genetycznego komórki ulega podwojeniu. Do replikacji dochodzi w
fazie S interfazy, czyli okresu poprzedzającego podział komórki (por. dalej). Skopiowanie materiału
genetycznego jest bowiem niezbędne, jeŜeli kaŜda z dwóch komórek potomnych ma zawierać identyczny i
kompletny genom.
Replikacja zachodzi wg modelu semikonserwatynego (dosłownie: pół-konserwatywnego; autorzy:
Messelson i Stahl). Substratem jest macierzysta cząsteczka dwupasmowego DNA (ang. double-stranded DNA –
dsDNA), a kaŜde jej pasmo słuŜy do syntezy nowego. W rezultacie powstają dwie identyczne cząsteczki DNA, z
143
- -
których kaŜda zawiera jedną nić macierzystą („starą”) oraz jedną nowo zsyntetyzowaną („nową”) – stąd nazwa
modelu.
Replikacja jest procesem złoŜonym, przebiegającym w trzech etapach – inicjacji (rozpoczęcia), elongacji
(wydłuŜania) oraz terminacji (zakończenia). Bierze w nim udział szereg enzymów: polimerazy, helikazy,
topoizomerazy, białka SSB, primaza i ligaza, z czego najwaŜniejsza jest polimeraza DNA, wykazująca liczne
aktywności katalityczne. ChociaŜ replikowana jest cząsteczka dwuniciowa, to pojedyncza polimeraza DNA
kopiuje jednocześnie tylko jedno pasmo, wymaga zatem do pracy DNA jednoniciowego (ang. single-stranded
DNA – ssDNA).
a)
inicjacja
Inicjacja replikacji rozpoczyna się odnalezieniem w obrębie DNA miejsca, od którego ma się ona zacząć,
określanego jako ori (od ang. origin – początek). Organizmy prokariotyczne posiadają tylko jedną, kolistą
cząsteczkę DNA i w związku z tym jeden punkt początku replikacji. U bakterii E. coli jest to ori C, natomiast u
bakteriofaga λ – ori λ. U ssaków natomiast istnieje wiele miejsc rozpoczęcia replikacji, zgrupowanych po ok.
100. Proces przebiega w obu kierunkach wzdłuŜ chromosomu i oba pasma replikowane są jednocześnie. W
wyniku tego powstają tzw. bańki replikacyjne. Zgrupowania przyległych miejsc rozpoczynają replikację w
sposób zsynchronizowany, co przemawia za obecnością mechanizmów regulacji czasowo – przestrzennej – być
moŜe funkcjonalne domeny chromatyny replikują się jako pełne jednostki.
Bakteryjny ori C ma długość 145 bp i zawiera kilka charakterystycznych konserwatywnych sekwencji. Po
pierwsze zawiera 4 sekwencje powtarzalne o odwrotnej orientacji (←→←→), długości 9 nukleotydów i
składzie: 5’-TTATNCANA-3’, gdzie N oznacza dowolny nukleotyd, po drugie – 3 sekwencje powtarzalne o
jednakowej orientacji (→→→), długości 13 nukleotydów i składzie: 5’-GATCTNTTNTTTT-3’. DuŜa
zawartość par A=T w tych odcinkach ułatwia rozdzielenie pasm (por. dalej). Do sekwencji typu powtarzalnego
wprost (ang. direct repeats) asocjują swoiste białka wiąŜące: u E. coli 4 cząsteczki białka dna A przyłączają się
do 4 sekwencji 9-nukleotydowych, zaś u faga λ 4 cząsteczki białka O łączą się z analogicznymi odpowiednimi
sekwencjami w obrębie ori λ. Do białek tych dołączają się kolejne, tak iŜ powstaje kompleks DNA długości 150
– 200 bp oraz multimerów białkowych w liczbie ok. 40. Do takiego kompleksu, określanego na tym etapie jako
zamknięty, dołączają się bakteryjne czynniki HU, FIS i IHC. Dla porównania: u droŜdŜy obecne są
autonomiczne sekwencje replikujące (ARS), zawierające odcinki zwane elementami początku replikacji (ORE) o
długości 11 bp, zlokalizowane w regionie przyległym do sekwencji bogatej w pary A=T o długości 80 bp – ten
ostatni to tzw. rozplatający element DNA (DUE); do ORE przyłączają się białka analogiczne do dna A, tworząc
kompleks początku replikacji (ORC). NiezaleŜnie od organizmu (wirus – fag, bakteria – E. coli, grzyb –
droŜdŜe) powyŜsze zabiegi mają na celu rozdzielenie pasm podwójnej helisy DNA, bowiem tylko pojedyncza
nić stanowi substrat replikacji.
Następnym etapem jest rozdzielnie na krótkim odcinku struktury podwójnej helisy z wyodrębnieniem
pojedynczego pasma (ssDNA). Dzięki interakcjom między samymi białkami oraz między białkami i DNA, ten
ostatni owija się wokół kompleksu białkowego, aŜ komplementarne wiązania stabilizujące zaczynają pękać,
począwszy od sekwencji 13-nukleotydowej. Miejscowa denaturacja DNA umoŜliwia powstanie kompleksu
otwartego, oczka i widełek replikacyjnych. Do kompleksu otwartego przyłącza się helikaza DNA – u E. coli jest
to białko dna B, transportowane przez białko dna C. Heksamer proteinowy (dna B)6 . (dna C)6 wprowadzony
zostaje do widełek replikacyjnych, po czym ulega rozpadowi – białko dna C odchodzi, zabierając ze sobą
niepotrzebne juŜ białko dna A. Aby nie doszło do przedwczesnej renaturacji DNA do formy dwupasmowej, do
kaŜdej z nici przyłącza się stabilizujące ją białko wiąŜące jednopasmowy DNA (ang. single-staranded DNA
binding protein – SSB). PoniewaŜ obie nici są nie tylko wzajemnie połączone, ale i skręcone w przestrzeni,
zatem dsDNA musi ulec rozkręceniu – potrzebne jest do tego wykształcenie struktury obrotowych widełek,
katalizowane przez topoizomerazy DNA (np. bakteryjna gyraza DNA – nazwa od łac. gyrus – zwój, zakręt).
Enzymy te wprowadzają tymczasowe przerwy w jednym pasmie, umoŜliwiając obrót widełek i likwidację
napręŜeń, po czym przerwy są spajane. W nacinanym miejscu tworzy się wiązanie wysokoenergetyczne między
enzymem a resztą 5’-fosforanową wolnego końca DNA, dzięki czemu reakcja spajania nie wymaga nakładu
energii (w przeciwieństwie do spajania DNA przez ligazy). Topoizomerazy mają równieŜ zdolność rozkręcania
struktur wyŜszego rzędu kolistych cząsteczek DNA, np. skręconych wokół własnego środka (tzw. superzwinięt
DNA). W medycynie stosuje się inhibitory topoizomeraz – por. punkt VIII-1-b.
U E. coli zakaŜonej fagiem λ białko P faga wiąŜe białka dna B, po czym kompleks P/dna B oddziałuje z
białkiem O i wiąŜe się do ori λ. Następnie 3 białka szoku cieplnego (dna K, dna J i Grp E) zabierają dna B z
kompleksu P/dna B/O i aktywują je, co pozwala na rozplecenie DNA. W ten sposób w zakaŜonej komórce
bakteryjnej replikacji ulega materiał genetyczny faga, a nie bakterii.
144
- -
b) elongacja
Przygotowane w powyŜszy sposób oczko replikacyjne jest gotowe do elongacji, polegającej na właściwej
biosyntezie pasm komplementarnych. Ze względu na fakt, Ŝe polimeraza DNA ma zdolność jedynie przyłączania
nukleotydów do juŜ istniejącego pasma, a nie rozpoczynania synezy de novo, enzym primaza (u E. coli – białko
dna G) syntetyzuje krótkie (10 – 200 nukleotydów) starterowe sekwencje komplementarnego RNA – primery –
posiadające wolną grupę 3’.
Polimeraza DNA syntetyzuje nowe siostrzane pasmo, komplementarne do macierzystego, uŜywając jako
substratów trójfosforanów odpowiednich dezoksyrybotydów (dNTP). Reakcja przebiega w ten sposób, Ŝe
nukleofilowa grupa 3’OH primera atakuje grupę α-fosforanową pierwszego NTP z odszczepieniem
pirofosforanu (PPi). Następnie grupa 3’OH ostatnio przyłączonego monofosforanu dezoksyrybotydu (dNMP)
atakuje następny dNTP, odszczepiając PPi itd. Wybór odpowiedniego dNTP, tj. tego, którego grupa αfosforanowa zostanie zaatakowana, zaleŜy od odpowiedniego parowania z siostrzanym pasmem DNA, zgodnie z
zasadami komplementarności. W ten sposób stale rosnące pasmo stale ulega wydłuŜeniu.
Replikacja obydwu rozdzielonych pasm zachodzi jednocześnie, choć asymetrycznie, bowiem nici są
antyrównoległe (przeciwbieŜne), a polimeraza DNA katalizuje wydłuŜanie nici jedynie w kierunku 5’→3’.
Wobec tego jedno z pasm (tzw. wiodące, prowadzące, liderowe) replikowane jest normalnie w sposób ciągły w
kierunku 5’→3’, drugie zaś (tzw. opóźnione, wsteczne) – równieŜ w stronę 5’→3’, lecz skokowo („po
kawałku”), tak Ŝe za kaŜdym razem dobudowywany jest komplementarny odcinek o długości 1 – 5 tys.
nukleotydów, zwany fragmentem Okazaki. Helikaza, działając na nici opóźnionej, rozwija dsDNA w stronę
5’→3’, a towarzysząca jej primaza syntetyzuje primery na paśmie opóźnionym; taki ruchliwy kompleks primazy
i helikazy nosi nazwę primosomu. Po ukończeniu syntezy fragmentu Okazaki polimeraza odłącza się, a primaza
wstawia nowy primer, po czym ta sama cząsteczka polimerazy syntetyzuje kolejny fragment Okazaki itd.
Synteza przebiega wówczas w kierunku tylnego końca poprzedzającego primera RNA, a nie w kierunku
niezreplikowanej części cząsteczki. Określa się to połowiczną nieciągłą biosyntezą DNA. Gdy powstanie
odpowiednia ilość fragmentów Okazaki, kompleks replikacyjny usuwa primery RNA, uzupełnia powstałe po
nich ubytki odpowiednimi dezoksyrybotydami oraz łączy ze sobą nowo zsyntetyzowane fragmenty – to ostatnie
katalizują ligazy DNA. Podczas gdy w jądrach ssaków większość primerów jest usuwana, w mitochondriach
małe odcinki RNA pozostają jako integralna część zamkniętych kolistych struktur DNA.
U Eucariota chromosomy nie jest koliste, lecz liniowe, w związku z czym posiada wolne końce –
telomery. PoniewaŜ polimeraza funkcjonuje tylko w jednym kierunku, sekwencja związana z primerem
najbliŜszym telomerowi nie ulega replikacji – jest to tzw. problem replikacji końca. W efekcie kaŜdemu
podziałowi komórki towarzyszy pewne skrócenie chromosomu, co jest przyczyną starzenia się komórki i
ogranicza jej Ŝywotność. Ma to swoje pozytywne aspekty, gdyŜ zmniejsza ryzyko rozwoju procesu
nowotworowego, polegającego na ciągłych i niekontrolowanych podziałach komórek (proliferacji). Komórki
intensywnie dzielące się (embrionalne i komórki pnia) posiadają natomiast telomerazę, enzym
rybonukleoproteinowy (RNP) dobudowujący brakujące końce nici opóźnionej. Jej integralna cząsteczka RNA
zawiera sekwencję bogatą w C, która funkcjonuje jako matryca dla nici wiodącej, do której dobudowywane są
sekwencje telomerowe. Następnie primaza syntetyzuje primer na nici opóźnionej, polimeraza DNA odtwarza
odpowiedni fragment, po czym primer jest wycinany. W efekcie powstaje nowy ubytek, jednak w obrębie
telomeru, a nie obszaru strukturalnego (zawierającego geny). Aktywność telomerazy zmniejsza się wraz z
wiekiem. W większości komórek somatycznych jest ona zablokowana, reaktywuje się natomiast w komórkach
nowotworowych (85 – 95 % nowotworów ludzkich), które mogą cechować się nawet jej podwyŜszoną
aktywnością, co ma znaczenie diagnostyczne.
Zarówno w organizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych występuje kilka typów polimeraz,
pełniących trojakiego rodzaju funkcje. Po pierwsze – wydłuŜają pasmo, czego miarą jest szybkość wstawiania
komplementarnych nukleotydów [nukleotydy/s]. Po drugie – reprodukują sekwencję, co odpowiada liczbie
nukleotydów dodanych do nici przed odejściem polimerazy od matrycy [Mb/cykl]. Po trzecie – identyfikują i
korygują błędy (tylko u Procariota – por. dalej). U E. coli największe znaczenie i najwyŜsze parametry replikacji
posiada dekameryczna (10 podjednostek, > 1 MDa) polimeraza DNA III (replikaza; białko dna E). Jej
holoenzym wiąŜe się z DNA jako część wielobiałkowego kompleksu, w skład którego wchodzą róŜne czynniki
pomocnicze: β, γ, δ, δ’ i τ. Dwie identyczne podjednostki otaczają matrycę, pozwalając polimerazie na stabilny
ruch. Polimeraza DNA II zajmuje się głównie identyfikacją i naprawą błędów replikacji, a polimeraza DNA I
uzupełnia przestrzenie między fragmentami Okazaki. W organizmach eukariotycznych polimeraza DNA α
(odpowiednik I) wypełnia przerwy i syntetyzuje pasmo opóźnione, δ (odpowiednik III) – reprodukuje oraz
syntetyzuje pasmo prowadzące (wiodące), zaś polimerazy β, ε i γ (odpowiadają II) identyfikują błędy (ε),
naprawiają DNA (β i ε) oraz syntetyzują mitDNA (γ). W komórkach ssaków polimeraza działa ok. 10 x wolniej
(wstawia kilkaset nukleotydów/s) niŜ u Procariota (kilkanaście tysięcy nukleotydów/s), co moŜe wynikać z
nawinięcia DNA na histony, czyli obecności nukleosomów. Jednak obecność wielu miejsc inicjacji powoduje, Ŝe
ogólna sprawność procesu jest wyŜsza u Eucariota.
145
- -
c)
terminacja
W kolistym genomie E. coli miejsce terminacji połoŜone jest naprzeciwko ori C i ma długość ok. 600 bp.
Występują tam 4 sekwencje terminalne ter, do których przyłączają się białka ter A – D. JeŜeli polimerazy
przesuwają się w oczku replikacyjnym zgodnie z kierunkiem ruchu wskazówek zegara, to przechodzą przez
punkty A i D, a zatrzymują się w B i C, jeŜeli zaś przeciwnie do ruchu wskazówek, to odwrotnie. Dzięki temu
zatrzymanie polimeraz odbywa się w odpowiednim miejscu. Rozplecione pasma schodzą się, a dwie potomne
cząsteczki DNA – rozdzielają. U Eukariota następuje odtwarzanie struktury chromatyny: nowo zreplikowany
DNA jest szybko organizowany w nukleosomy, a oktamery histonów rozmieszczają się na kaŜdy ramieniu
widełek replikacyjnych.
d) regulacja replikacji i cykl komórkowy
Replikacja zachodzi w fazie S (tzw. okres syntezy) cyklu komórkowego. Znacznie wzrasta wówczas ilość
polimerazy DNA oraz enzymów syntetyzujących substraty replikacji, tj. trójfosforany nukleotydów. Faza
syntezy (S) oddzielona jest od fazy podziału (M) przez okresy przerw (ang. gap) – G1 i G2. Komórka nie
dopuszcza do biosyntezy DNA poza okresem, kiedy przygotowuje się do podziału. Przejście komórki z jednej
fazy do drugiej uwarunkowane jest obecnością odpowiednich białek, zwanych cyklinami – nazywanych tak,
poniewaŜ ich poziom koreluje z fazami cyklu i podlega cyklicznym zmianom. Cykliny aktywują z kolei kolejną
grupę białek – kinazy zaleŜne od cyklin (ang. cyclin-dependent kinases – CDK), które z kolei fosforulują
substraty odpowiedzialne za przebieg cyklu. Główne cykliny to A, B, D1-3 i E (istnieją równieŜ F, K, H, L i T,
ale mają mniejsze znaczenie); CDK oznacza się numerami 1 – 11.
• Poziom cykliny D wzrasta pod koniec fazy G1, przez co komórka przekracza punkt startowy (droŜdŜe)
lub restrykcyjny (ssaki), wkraczając nieodwracalnie w fazę S. Cykliny D aktywują CDK 4 i 6,
występując z nimi we wspólnym kompleksie, który wykazuje aktywność kinazy Ser/Thr. Jednym z jego
substratów jest białko Rb (nazwa pochodzi od pewnego nowotworu siatkówki – retinoblastoma), które
wiąŜe i inaktywuje czynnik transkrypcyjny E2F, niezbędny do przejścia G1→S. Fosforylacja Rb przez
CDK4/6 uwalnia czynnik E2F od Rb, umoŜliwiając progresję cyklu.
• Cyklina E i CDK 2 tworzą kompleks w późnej fazie G1. Cyklina E ulega degradacji, zaś uwolniona
CDK 2 wiąŜe się z cykliną A. Taka sekwencja zdarzeń jest krytyczna dla rozpoczęca syntezy DNA w
fazie S.
• Cyklina B i CDK 1 regulują przejście fazowe G2→M, czyli wejście komórki w fazę podziału.
Wydzielanie cyklin w nieodpowiedniej ilości lub czasie moŜe zaburzać cykl komórkowy. Przykładowo
onkogen bcl, związany z chłoniakiem typu B, koduje cyklinę D1.
e)
naprawa DNA
Źródłami uszkodzeń materiału genetycznego są błędy procesu replikacji oraz działanie czynników
zewnętrznych – fizycznych i chemicznych.
Warunkiem poprawności i dokładności replikacji DNA jest swoiste parowanie nukleotydów, zaleŜne od
obecności preferowanych postaci tautomerycznych zasad azotowych. Faworyzowanie odpowiednich zasad
zapewnione jest przez system dwukrotnego monitorowania ich parowania – pierwszy raz w trakcie włączania
trifosforanów dezksyrybotydów oraz drugi raz przy ponownej kontroli (i ewentualnie naprawie). Dzięki temu
pomyłki spowodowane błędnie wstawioną zasadą zdarzają się nie częściej niŜ 1 : 108–10.
U organizmów prokariotycznych, jak E. coli, elementem monitorującym jest aktywność egzonukleazy
3’→5’, jaką wykazuje sama polimeraza DNA II. U ssaków funkcje te zostały przejęte przez inne systemy
enzymatyczne. Mechanizmy naprawy DNA są skuteczne w przypadku uszkodzenia tylko jednego pasma
dsDNA.
Umowna klasyfikacja uszkodzeń DNA:
• zamiana 1. zasady: depuryncja, deaminacja C→U lub A→H, alkilacja zasady, insercja lub delecja
nukleotydu, inkorporacja (włączenie) analogu zasady,
• zamiana 2. zasad: dimery tymidynowe (indukowane UV), wiązania poprzeczna dwufunkcyjnym
czynnikiem alkilującym,
• pęknięcie łańcucha: pod wpływem promieniowania jonizującego, rozpad wiązań fosfodwuestrowych
pod wpływem radioaktywności,
• wiązania poprzeczne: między zasadami tego samego pasma lub pasm przeciwległych, między DNA a
białkami (np. histonami).
146
- -
WyróŜnia się 4 mechanizmy naprawy DNA: przez naprawę niesparowanych zasad, przez wycięcie
zasady, przez wycięcie nukleotydu oraz naprawę pęknięć dwupasmowych.
• Naprawa niesparowanych zasad (ang. mismatch repair – MMR) – koryguje błędy replikacji, powstałe
np. w wyniku poślizgu lub zacięcia polimerazy, w postaci nadmiarowego wstawienia pojedynczej
zasady lub obecności pętli z kilku (2-5) niesparowanych nukleotydów. Nowo zsyntetyzowany odcinek
DNA jest przeszukiwany od kątem błędów; punkt orientacyjny stanowi zmetylowana adenina w
sekwencji GATC. JeŜeli znaleziona zostanie niesparowana zasada lub mała pętla nukleotydowa,
wówczas endonukleaza GATC przecina w odpowiednim miejscu pasmo zawierające mutację, następnie
egzonukleaza trawi pasmo i usuwa zmutowaną sekwencję, a ostatecznie ubytek wypełniany jest
komplementarymi zasadami dzięki aktywnościom polimerazy, SSB i ligazy. U E. coli do rozpoznania i
przecięcia potrzeba 3 białek (Mut S, C i H), u ssaków zaś aŜ 6. Zaburzenie tego mechanizmu ma udział
w patogenezie dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego (HNPCC). Zaburzenia dotyczą tu
genów hMSH2 (na chromosomie 6, odpowiednik bakteryjnego Mut S) oraz hMLH1 (odpowiednik Mut
L); w ich wyniku powstają dysfunkcje enzymów naprawczych, co powoduje wydłuŜenie sekwencji
mikrosatelitarnych, co z kolei zaburza funkcje białek krytycznych dla nadzoru cyklu komórkowego w
nabłonku jelita grubego.
• Naprawa przez wycięcie zasady odwraca m. in. skutki depurynacji. Wiązanie N-glikozydowe, łączące
reszty cukrowe i zasad azotowych, jest wraŜliwe na działanie temperatury (termolabilne). W komórkach
dochodzi więc stale do jego rozbijania i pozbawiania nukleotydów zasad purynowych, co jest
jednoznaczne z utratą niesionej przez nie informacji. Depurynacja w temperaturze 37oC zachodzi w
tempie 5 – 10 tys. w kaŜdej komórce w ciągu doby. Miejsca depurynacji są rozpoznawane przez
swoiste N-glikozylazy, co jednocześnie stanowi sygnał dla endonukleazy apurynowej lub
apirymidynowej, które usuwają resztę cukrową pozbawioną zasady. Następnie naprawcza polimeraza
DNA β uzupełnia nukleotyd, a ligaza łączy go z sąsiednimi. W podobny sposób przebiega naprawa
deaminacji, alkilacji lub substytucji zasad przez ich analogi.
• Naprawa przez wycięcie nukleotydu uŜywana jest do usuwania i zastępowania większych (długości ok.
30 nukleotydów) regionów DNA, bierze w niej równieŜ udział większa liczba białek. Takie
uszkodzenia mogą powstawać w wyniku: działania promieni UV (→ dimery cyklobutanowe między
dwoma pirymidynami), dymu tytoniowego (→ addukcja beznzo[a]pirenu do guaniny), promieniowania
jonizującego i leków cytostatycznych (→ modyfikacje zasad, pękanie pasm, sieciowanie DNA-DNA
lub DNA-białka). W opisywanym mechanizmie hydrolizie ulegają dwa wiązania fosfodwuestrowe w
uszkodzonym paśmie, co katalizuje egzonukleaza złoŜona z wielu podjednostek (u E. coli – 3, u
człowieka – 17). Usunięty odcinek jest uzupełniany (u człowieka przez polimerazę δ/ε) oraz łączony
przez ligazę DNA. Zaburzenie tego typu naprawy związane jest z patogenezą typów A i C choroby
xeroderma pigmentosum (XP).
• Naprawa pęknięć dwupasmowych, poza funkcjonowaniem jako mechanizm naprawy DNA, jest częścią
fizjologicznego procesu rearanŜacji genów immunoglobulin. W niehomologicznym łączeniu złamań
dwupasmowych bierze udział białko Ku, które wiąŜe się do wolnych końców DNA i wykazuje latentną
aktywność helikazy zaleŜnej od ATP. Następnie aktywacji ulega zaleŜna od DNA kinaza białkowa
(DNA-PK), która wiąŜe wolne końce i zbliŜa je do siebie. W powstałym kompleksie kinaza ulega
aktywacji, fosforylując białko Ku i inną cząsteczkę DNA-PK, połoŜoną na przeciwległym paśmie w
pozycji trans. Kinaza dysocjuje wówczas z kompleksu, a aktywacji ulega helikaza białka Ku, która
rozplata oba końce. Rozpleciona i zbliŜone końce ulegają parowaniu, a dodatkowe ogony nukleotydowe
– usunięciu przez egzonukleazę. Przerwy między nukleotydami są ostatecznie scalane przez ligazę
DNA.
• Zaburzenia mechanizmów naprawy są ponadto przyczyną chorób: ataxia teleangiectasia (AT),
cechującą się zwiększoną wraŜliwością na promieniowanie X oraz anemia Fanconiego, gdzie defekt
dotyczy naprawy uszkodzeń wywołanych wiązaniami poprzecznymi w DNA.
3.
Synteza RNA (transkrypcja) i jego modyfikacje
Transkrypcja (dosłownie: przepisywanie) jest procesem, w którym informacja zawarta w DNA
przenoszona jest na RNA (najczęściej mRNA). Innymi słowy na podstawie budowy DNA, a dokładniej
sekwencji nukleotydów w jego paśmie matrycowym, syntetyzowana jest nowo cząsteczka RNA. Ta ostatnia jest
więc komplementarna do pasma matrycowego swojego genu, a dokładnie identyczna z jego pasmem kodującym
(oczywiście T zamienione są na U). W dwupasmowym DNA pasmo matrycowe jednego genu nie musi być tym
samym dla drugiego w helisie DNA – kaŜde z dwóch pasm dsDNA pełni rolę pasma matrycowego dla jednych,
a kodującego dla drugich genów. Transkrypcja jest procesem polarnym: informacja z pasma matrycowego
czytana jest w kierunku 3’→5’, zaś nowo powstająca cząsteczka RNA syntetyzowana jest w kierunku 5’→3’;
ma to istotne konsekwencja m. in. w sprzęŜeniu transkrypcji z translacją u Procariota (por. dalej).
147
- -
Istnieją pewne podobieństwa pomiędzy replikacją a transkrypcją. Oba procesy podzielone są na 3 etapy
(inicjacja, elongacja, terminacja), w obu biorą udział duŜe białkowe kompleksy inicjacyjne, w obu wreszcie
kolejne nukleotydy nowo syntetyzowanego kwasu nukleinowego wstawiane są na zasadzie komplementarności z
nukleotydami juŜ istniejącej nici. Jednak, w przeciwieństwie do replikacji, w transkrypcji substratem są
trifosforany rybotydów (NTP), zamiast T wstawiany jest U, nie występują primery, a produkt nie jest
sprawdzany pod kątem poprawności wstawionych zasad. Ponadto w procesie replikacji kopiowany jest cały
komórkowy DNA, transkrypcji natomiast podlega tylko pewna niewielka jego część. Fragment DNA
podlegający transkrypcji to tzw. jednostka transkrypcyjna. Jest ona poprzedzona przez obszar zwany
promotorem, za nią zaś obecny jest terminator. Promotor i terminator wyznaczają miejsca początku (inicjacji) i
końca (terminacji) transkrypcji, czyli wyznaczają granice jednostki transkrypcyjnej. Pierwszy nukleotyd
jednostki transkrypcyjnej oznaczany jest +1 (jest to puryna – G lub rzadziej A), a dalsze – kolejnymi liczbami
naturalnymi; nukleotydy promotora oznaczane są kolejnymi liczbami ujemnymi (w kierunku 3’→5’).
a)
transkrypcja u Procariota
Inicjacja transkrypcji polega na odnalezieniu przez polimerazę RNA (RNAP) promotora genu na paśmie
matrycowym i związaniu się z nim. Niezwykle waŜny jest wybór odpowiedniego promotora – genom E. coli
(4 Mbp) zawiera ich bowiem ok. 2 tys., zaś ludzki (3 Gbp) – ok. 100 tys. RNAP przeszukuje więc genom z
prędkością ok. 1 kbp/s w poszukiwaniu miejsca, do którego wykazuje wysokie powinowactwo.
•
budowa promotora
Promotory bakteryjne mają długość ok. 40 bp (4 zwoje podwójnej helisy), tak iŜ mogą być w danym
momencie całkowicie pokryte przez pojedynczą cząsteczkę RNAP (kompleks RNAP pokrywa 30 – 75 bp
zaleŜnie od konformacji). Promotor zawiera 2 konserwatywne sekwencje: w pozycji -35 bp znajduje się 8nukleotydowa sekwencja 5’-TGTTGACA-3’, z którą wiąŜe się RNAP, tworząc kompleks zamknięty, zaś w
pozycji -10 bp występuje 6-nukleotydowa sekwencja 5’-TATAAT-3’ (tzw. ramka TATA – ang. TATA box;
inaczej ramka Pribnowa). Ta ostatnia, ze względu na zawartość samych wiązań podwójnych, łatwo ulega
denaturacji, pozwalając na dysocjację pasma kodującego i matrycowego i jego odczyt tego przez RNAP
(kompleks otwarty). Inne bakterie posiadają inaczej zbudowane promotory, ale zazwyczaj zawierają one równieŜ
2 charakterystyczne sekwencje (ramki).
•
budowa polimerazy RNA
U E. coli DNA-zaleŜna polimeraza RNA (RNAP) składa się z tetramerycznego rdzenia, do którego
odwracalnie przyłącza się podjednostka σ; razem tworzą one holoenzym. Rdzeń polimerazy składa się z 2
podjednostek identycznych (α; 36,5 kDa; funkcja: montaŜ rdzenia) oraz z 2 podobnych, choć nieidentycznych: β
(151 kDa; wiąŜe rybotydy) i β’ (155 kDa; wiąŜe DNA); zawiera równieŜ 2 atomy cynku. Czynnik białkowy σ
odpowiada za rozpoznanie promotora i związanie z nim rdzenia RNAP, po czym przestaje być potrzebny i
odłącza się od rdzenia, mogąc przyłączyć się do innego. Dzięki temu transkrypcja moŜe zachodzić z taką samą
szybkością nawet gdy czynników σ jest mniej niŜ rdzeni. Czynniki σ działają ponadto jako białka regulatorowe
transkrypcji – pojawiają się w komórce w odpowiedzi na szkodliwe czynniki zewnętrzne (np. bakteriofagi,
wstrząs cieplny; sporulacja), przyłączają się do odpowiednich rdzeni i modyfikują swoistość rozpoznawania
promotorów przez RNAP, przez co stymulują ekspresję określonych genów i w konsekwencji uruchamiają
mechanizmy obronne. RóŜne bakterie posiadają róŜne swoiste gatunkowo czynniki σ, np. u E. coli jest to σ70.
•
inicjacja
Podjednostka σ rozpoznaje w promotorze sekwencję -35 bp, co umoŜliwia związanie z nim RNAP i
utworzenie kompleksu zamkniętego; czynnik σ ulega wówczas odłączeniu. Gdy polimeraza rozpoznaje
sekwencję -10 bp, zmienia swoją konformację i zaczyna przesuwać się po nici. Dostęp do nukleotydów pasma
matrycowego wymaga rozdzielenia pasm i rozkręcenia podwójnej helisy. Topnienie DNA następuje na stałym
odcinku ok. 17 bp na cząsteczkę polimerazy i nie zaleŜy od sekwencji DNA, co sugeruje, Ŝe RNAP wykazuje
aktywność rozwijającą. Zaraz za polimerazą postępuje topoizomeraza, zapobiegająca tworzeniu kompleksów
helisy wyŜszego stopnia. Udostępnienie pasma pozwala na utworzenie kompleksu otwartego i bąbla
transkrypcyjnego. Etap ten jest krytyczny dla powodzenia całego procesu – albo dochodzi do inicjacji poronnej
(zsyntetyzowanych jest tylko kilka nukleotydów, które odrywają się od kompleksu) albo RNAP osiąga punkt +1
i niemal z pewnością ukończy transkrypcję genu.
148
- -
•
elongacja
Elongacja transkrypcji jest bardzo podobna do elongacji replikacji. Gdy RNAP dojdzie do miejsca +1,
wstawia pierwszy (5’-końcowy) rybotyd, przy czym substratem jest jego trójfosforan (NTP), wiąŜący się do
podjednostki β. W wyniku odłączenia pirofosforanu (PPi) pozostaje NMP. Następnie RNAP przemieszcza się
(ulega translokacji) do kolejnej zasady na matrycy, wiąŜe i wstawia kolejny rybotyd, który tworzy z poprzednim
wiązanie 3’,5’-fosfodwuestrowe, czemu towarzyszu uwolnienie PPi. Cykl ten powtarza się wielokrotnie, zaleŜnie
od długości jednostki transkrypcyjnej. Elongacja biegnie antyrównolegle – pasmo matrycowe czytane jest w
kierunku 3’→5’, a nowe RNA wydłuŜa się w stronę 5’→3’. Nowo syntetyzowany RNA związany jest z
podjednostką β RNAP. W tym samym czasie jedno pasmo matrycowe genu moŜe być przepisywane przez
więcej niŜ jedną cząsteczkę RNAP, jednak jest to proces tak zsynchonizowany, Ŝe w danej chwili przepisywaniu
ulegają odmienne sekwencje DNA. Bakteryjny RNA jest policistronowy, gdyŜ kilka pobliskich genów moŜe
znajdować się pod kontrolą wspólnego promotora i ulegać jednoczesnej transkrypcji. U Eucariota natomiast
kaŜdy gen posiada własny promotor i ulega niezaleŜnej ekspresji, stąd RNA jest monocistronowy.
•
terminacja
Terminacja transkrypcji moŜe być dwojakiego rodzaju: tzw. ρ-zaleŜna lub ρ-niezaleŜna.
Terminacja ρ-zaleŜna wyznaczona jest przez odpowiednią sekwencję na paśmie matrycowym, którą
rozpoznaje i z którą wiąŜe się heksameryczne (3 dimery) białko terminacji – czynnik ρ. Wykazuje on aktywność
RNA-DNA helikazy zaleŜnej od ATP, dzięki czemu rozrywa kompleks DNA i RNA. Rdzeń polimerazy odłącza
się od DNA, czekając na pojawienie się kolejnego czynnika σ, aby znów rozpoznać promotor i zainicjować
transkrypcję.
Terminacja ρ-niezaleŜna, zwana równieŜ spontaniczną, wyznaczana jest przez sekwencję terminatora. Ma
on długość ok. 40 bp i zawiera sekwencję palindromową (przerwana odwrócona sekwencja powtórzona –
orientacja: →...←), po której występuje wiele reszt A. Gdy polimeraza przejdzie przez sekwencję
palindromową, powstały odcinek RNA wykazuje komplementarność z samym sobą, dochodzi więc do
parowania zasad, w wyniku czego powstaje struktura II-rz. o kształcie szpilki lub spinki do włosów (są to
synonimy). Struktura ta oddziałuje z kompleksem transkrypcyjnym, tak Ŝe RNAP zatrzymuje się i odłącza. Za
sekwencją palindromową reszty A matrycy ulegają przepisaniu na U w RNA – dzięki temu kompleks DNARNA jest za strukturą szpilki utrzymywany przez słabe pary A=U, łatwo więc ulega destabilizacji i transkrypt
odłącza się od matrycy. W czasie terminacji ρ-niezaleŜnej struktura szpilki pojawia się zawsze, natomiast w
czasie ρ-zaleŜnej zazwyczaj nie, choć moŜe wystąpić dodatkowo.
b) róŜnice w transkrypcji u Eucariota
•
promotory eukarotyczne
Generalnie promotory eukariotyczne są bardziej złoŜone. Przed jednostką transkrypcyjną występują 2 lub
3 typy sekwencji sygnalnych – jedna określa miejsce przyłączenia polimerazy, druga – podstawową częstość
transkrypcji, zaś trzecia determinuje dodatkową częstość transkrypcji, stanowiącą główny mechanizm
regulacyjny.
Większość genów ssaków zawiera mniej więcej w pozycji -15 bp sekwencję TATA (gł. TATAAT, choć
układ A i T moŜe się róŜnić) – jest to tzw. ramka Haggesa. Przyłącza się do niej odpowiednie białko
wiąŜące (ang. TATA binding protein – TBP), do którego z kolei przyłączają się białkowe czynniki
asocjujące (ang. TBP associated facors – TAF). Powstanie kompleksu TBP i TAF (dawniej określanego
jako TFIID – por. dalej) jest pierwszym etapem tworzenia kompleksu transkrypcyjnego na promotorze.
Pewne geny nie posiadają sekwencji TATA – wówczas polimeraza kieruje się sekwencją inicjacyjną
(Inr), obejmującą punkt startu (-3 – +5) i o budowie: Py2A*NT/APy2, gdzie A* to nukleoyd +1, a Py –
pirymidyna. Promotory mogą zawierać zarówno sekwencję TATA, jak i Inr – są wówczas silniejsze od
zawierających tylko jedną z nich.
Sekwencje połoŜone jeszcze wcześniej przed promotorem (ok. -80 bp) określają podstawową częstość
transkrypcji danego genu. Są to tzw. kasety GC oraz CAAT, wiąŜące odpowiednio białka: Sp1 oraz
CTF, C/EBP, NF1, NFY i inne. Są to elementy cis mogące funkcjonować w połoŜeniu o odwróconej
polarności (→ lub ←), choć lepszy efekt wywierają gdy są zorientowane zgodnym z genem (→).
Istnieje równieŜ 3. klasa sekwencji sygnalnych, regulujących inicjację transkrypcji genów
eukariotycznych – są to tzw. wzmacniacze (ang. enhancers) lub wyciszacze (silencers). Mogą one
występować po obu stronach punktu +1, funkcjonują niezaleŜnie od polarności i nawet będąc w duŜej
(rzędu setek – tysięcy bp) odległości od jednostek transkrypcyjnych. Mogą wiązać jedno lub więcej
białek, które z kolei mogą się wiązać z jednym lub większą liczbą takich elementów. Elementy
149
- -
odpowiedzi hormonalnej (HRE; patrz punkt VII-1-a) działają albo jako takie właśnie sekwencje albo są
z nimi sprzęŜone. Inne czynniki wpływające na ekspresję genów (wstrząs cieplny, metale – Zn, Cd,
dioksyny) działają przez swoiste elementy regulatorowe. Podobnie swoista tkankowo ekspresja genów
zachodzi przez swoiste sekwencja DNA.
•
polimerazy eukariotyczne
W przeciwieństwie do Procariota, komórki ssaków zawierają kilka DNA-zaleŜnych polimeraz RNA: I
(A), II (B) i III (C). Wszystkie mają podobną masę (500 – 600 kDa) i zbudowane są podobnie jak bakteryjna
RNAP (2 duŜe podjednostki + kilka mniejszych). RóŜnią się natomiast rodzajem przepisywanych genów oraz
wraŜliwością na α-amanitynę. Polimeraza I, II i III przepisuje odpowiednio geny klasy I (rRNA), II (mRNA lub
hnRNA) i III (tRNA i 5S rRNA). α-amanityna jest toksyną grzyba Amanita phalloides, działającą jako swoisty
inhibitor eurakriotycznej nukleoplazmatycznej DNA-zaleŜnej polimerazy RNA II, blokującym jej translokację.
Polimeraza I jest niewraŜliwa na α-amanitynę, II – bardzo wraŜliwa (wraŜliwa na małe stęŜenia), a III – słabo
wraŜliwa (wraŜliwa na duŜe stęŜenia).
•
kompleks transkrypcyjny; regulacja transkrypcji
U Eucariota kompleks transkrypcyjny złoŜony jest z ok. 50 białek. Polimerazy nie rozpoznają same
promotorów, lecz są nań nakierowywane przez inne białka. Dla genów klasy II funkcje prokariotycznego
czynnika σ przejmują inne białka, tak iŜ podstawowa transkrypcja, oprócz polimerazy RNA II, wymaga
obecności czynników A, B, D, E, F, H i J. Określa się je symbolami TFIIX – czynnik transkrypcyjny (ang.
transcription factor) X dla genu klasy II, gdzie X to jedna z powyŜszych liter. Spośród nich jedynie TFIID (czyli
TBP i 8 – 10 TAF, por. wyŜej) ma zdolność wiązania się ze swoistymi sekwencjami DNA – tu z sekwencją
TATA. TBP wiąŜe się z TATA w rowku mniejszym DNA (inaczej niŜ większość czynników transkrypcyjnych –
por. punkt VIII-1-j) powodując zgięcie lub złamanie helisy o kat 100o, co ułatwia integrację TAF i innych
składników kompleksu inicjacyjnego, a prawdopodobnie równieŜ czynników wiąŜących się z sekwencjami cis.
TBP jest takŜe składnikiem kompleksów inicjacyjnych transkrypcji genów klas I i III, choć ich promotory nie
zawierają sekwencji TATA – nie wiadomo zatem gdzie dokładnie przyłącza się TBP. Związanie TBP z
promotorem genu oznacza go jako gotowy do transkrypcji – jest to jedyny etap całkowicie zaleŜny od interakcji
typu białko-DNA. Następnie do kompleksu TBP-promotor dołącza się TFIIB – powstały trójskładnikowy
kompleks dokładniej umieszcza się na promotorze i wiąŜe do niego kompleks polimerazy II i TFIIF (podobny do
σ – niezbędny do połączenia polimerazy z promotorem). Dołączenie TFIIA stabilizuje kompleks TBP z
promotorem oraz umoŜliwia mu odpowiedź na aktywatory. Dodanie do kompleksu polimeraza II – TFIIF
czynników TFIIE i H finalizuje formowanie kompleksu preinicjacyjnego (ang. preinitiation complex – PIC).
KaŜde z opisanych zdarzeń powiększa rozmiar kompleksu, który ostatecznie pokrywa obszar ok. 60 bp (30 bp
po kaŜdej stronie punktu +1) i jest gotowy do rozpoczęcia podstawowej transkrypcji. W genach zawierających
zamiast sekwencji TATA sekwencję Inr niezbędne są te same składniki.
Eukariotyczna polimeraza RNA II składa się z 14 podjednostek, z czego 2 największe (ok. 200 kDa) są
homologiczne do bakteryjnych β i β’. Na C-końcu największej podjednostki obecne są 7-aa powtórzenia (TyrSer-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) – tzw. powtarzająca domena końca karboksylowego (ang. carboxyl termical repeat
domain – CTD), u ssaków w licznie 52. CTD stanowią substrat dla wielu kinaz, w tym THIIF oraz miejsca
wiązania białek mediatorowych Srb (supresory polimerazy RNA B), ponadto biorą udział w obróbce RNA i
poliadenylacji 3’-końca. TFIIE zwiększa aktywność kinazową TFIIH. Fosforylacja reszt Ser i Thr w obrębie
CDT aktywuje polimerazę II; polimeraza nie moŜe funkcjonować bez sprawnych CDT.
TFIID (nie sam TBP) podtrzymuje zarówno transkrypcję podstawową (jak TBP), jak i nasiloną
działaniem innych czynników – aktywatorów. Te ostatnie przyłączają się do odpowiednich sekwencji: CAAT
(C/EBP, NF-Y), GC (Sp1, MyoD, NF1), oktamer Ig (Oct-1, 2, 4, 6), AP1 (Jun, Fos, ATF), SRF (← surowica),
HSF (← szok cieplny). TAF są niezbędne w tym drugim przypadku, tj. do aktywności aktywatorów, dlatego
określa się je jako koaktywatory. Istnieją więc 3 klasy czynników transkrypcyjnych, biorących udział w regulacji
genów klasy II: podstawowe (TBP i czynniki TFIIX), koaktywatory (TAF) oraz powyŜsze aktywatory.
Kolejność organizacji PIC wyjaśniają 2 modele: stopniowego montowania PIC (składniki kompleksu
przyłączają się kolejno, a aktywatory stymulują formowanie lub funkcje PIC) oraz hipoteza rekrutacji
(koaktywatory i aktywatory doprowadzają wcześniej preformowany PIC do promotora). Hormony i inne
cząsteczki sygnałowe modulują ekspresję genów przez wpływ na gromadzenie i aktywność aktywatorów i
koaktywatorów oraz następowe formowanie się PIC na promotorze danego genu.
•
Terminacja transkrypcji u Eucariota jest słabo poznana, jednak przypuszczalnie sygnały terminacji
znajdują się z znacznej odległości za (np. 1 – 2 kbp w stronę 3’) jednostkami transkrypcyjnymi.
150
- -
c)
geny podzielone; snRNA; składanie mRNA
U Procariota pierwotne transkrypty genów klasy II stanowią gotowe matryce do translacji, nawet jeszcze
przed ukończeniem transkrypcji. Transkrypcja i translacja są ze sobą sprzęŜone, co jest związane m. in. z
brakiem jądra komórkowego. Prokariotyczne mRNA nie ulega więc praktycznie Ŝadnym modyfikacjom od
chwili powstania do chwili podjęcia funkcji matrycy dla syntezy białek. rRNA i tRNA są przepisywane w
formach dłuŜszych niŜ ostateczna, a liczne jednostki transkrypcji tRNA zawierają więcej niŜ jedną cząsteczkę –
wymagają one więc przekształcenia do form dojrzałych.
U Eucariota natomiast transkrypcja i translacja są rozdzielone przestrzennie (jądro / cytoplazma) i w
konsekwencji czasowo. Pomiędzy czasem syntezy a rozpoczęcia pełnienia funkcji wszystkie typy
eukariotycznego RNA przechodzą szereg przekształceń (ang. processing). Jest to konsekwencją występowania
większości genów eukariotycznych w formie genów podzielonych – oznacza to, Ŝe sekwencje kodujące aa w
produktach białkowych (tzw. eksony) są w nich porozdzielane długimi sekwencjami niekodującymi (tzw.
intronami – sekwencjami wtrąconymi), tj. niosącymi informacje odrzucane w procesie obróbki RNA. Introny
mogą być nawet dłuŜsze od eksonów; ciągłość pojedynczego gen jest zazwyczaj przerwana przez co najmniej 1
intron, a czasami moŜe ich być nawet 50. Dokładna znaczenie intronów nie jest poznane, jednak przypuszczalnie
ich obecność przyspiesza reanarŜacje genetyczne przez rekombinację, co przekłada się na przyspieszenie
ewolucji funkcji biologicznych. Eukariotyczne transkrypty pierwotne mają postać hnRNA, zawierającego
odcinki komplementarne do intronów, natomiast transkrypty ostateczne (mRNA), bezpośrednio podlegające
translacji, są ich pozbawione. Produkty transkrypcji ulegają więc jeszcze przed opuszczeniem jądra
komórkowego obróbce nukleolitycznej, określanej jako składanie (ang. splicing) RNA, a polegającej na
usunięciu intronów i spojeniu eksonów. W wyniku składania duŜa część (½ – ¾) syntetyzowanego w jądrze
RNA nie opuszcza tego organellum i nie dostaje się do cytoplazmy, lecz ulega wycięciu i strawieniu. Ogólnie
istnieją 4 mechanizmy reakcji składania RNA, ale u Eucariota występuje głównie jeden. Sekwencje intronów,
choć generalnie bardzo heterogenne, zawierają konserwatywne sekwencje w miejscach spojenia z eksonami oraz
w miejscach rozgałęzienia, zlokalizowanego 20 – 30 nukleotydów od miejsca spojenia 3’ (granicy intron /
ekson).
W procesie składania RNA bierze udział małocząsteczkowe jądrowe RNA (snRNA). Ta klasa RNA
występuje głównie w połączeniach z białkami jako kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP), zlokalizowane
zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie. Jego funkcją jest wspomaganie przekształceń mRNA oraz regulacja
ekspresji genów. snRNA U1-2 i 4-6 biorą udział w procesie składania RNA, U4 i 6 – dodatkowo w obróbce
ogona poli(A), a U7 – w tworzeniu prawidłowego końca 3’ histonowego mRNA (brak ogona poliadenylowego).
Składanie RNA zachodzi w strukturze zwanej spliceosomem. Składa się ona z pierwotnego transkryptu, 5
rodzajów snRNA (U1, 2, 5, 4/6) oraz ponad 50 białek – całość tworzy kompleks zwany małym kompleksem
nukleoproteinowym (snRNP, snURP), który ustawia hnRNA w taki sposób, aby mogło zajść spajanie eksonów.
Cząsteczki snRNA i białek pomagają w tworzeniu półproduktów i pełnią funkcje katalityczne (rybozymy).
Wpierw U1 wiąŜe się z 5’-końcem granicy ekson / intron (dawca, strona lewa) i nacina to miejsce.
Następnie U2 wiąŜe się do miejsca rozgałęzienia, zlokalizowanego nieco przed końcem 3’ tego intronu i
zawierającego sekwencję: PyNPyPyPuAPy (Py to pirymidyny, a Pu – puryny), eksponując występującą w tej
sekwencji nukleofilową resztę A. Jest ona zwykle połoŜona 28 – 37 nukleotydów w górę od 3’ końca danego
intronu. Dalej przyłącza się kompleks U5/4/6, po czym następuje zaleŜne od ATP rozplecenie i dysocjacja U4/6
– U4 uwalnia się, a U6 wchodzi w interakcję z U2 i U1, zbliŜając je do siebie. Reaktywna reszta adenylylowa,
zbliŜając się do 5’-końca, przeprowadza nań nukleofilowy atak, w wyniku czego tworzy się pętla (struktura
lassa), zawierająca wyjątkowe wiązanie 5’,2’-fosfodwuestrowe; reakcję tą wzmacnia U5. Następnie dochodzi do
drugiego nacięcia, tym razem na 3’-końcu granicy intron / ekson (biorca lub strona prawa). W tej drugiej reakcji
transestryfikacji grupa 3’OH poprzedniego eksonu atakuje resztę 5’{P} na granicy ekson / intron. Struktura lassa
zostaje wówczas odrzucona i ulega rozkładowi. Wolne końce najbliŜszych eksonów utrzymywane są przez
kompleks U2/6, a ostatecznie ulegają ligacji (spojeniu), dając ciągłe pasmo.
W genach zawierających liczne introny powyŜszy ciąg reakcji ulega powtórzeniu, przy czym introny nie
muszą być wycinane kolejno w kierunku 5’→3’.
W procesie składania pierwotnego transkryptu genu podzielonego mogą powstawać róŜne cząsteczki
mRNA. Zjawisko o określa się jak alternatywne składanie (alternatywny splicing) i jest związane ze swoistością
tkankową i rozwojową ekspresji genów. ZłoŜoność procesu składania sprzyja zaburzeniom hierarchicznego
porządku relacji ekson – intron i powstawaniu róŜnych form mRNA z tego samego transkryptu. Dochodzą do
tego alternatywne punkty donorowe (5’) i akceptorowe (3’), moŜliwości selektywnego wyboru eksonów, miejsca
terminacji, przecinania i poliadenylacji, powiększające heterogenność mRNA.
Tkankowo-swoista regulacja ekspresji genów moŜe być osiągnięta przez sekwencje kontrolne w
promotorach albo przez uŜyciu alternatywnych promotorów. Przykładowo geny glukokinazy (GK) w wątrobie i
w komórkach β trzustki róŜnią się składem produktów i lokalizacją promotorów: promotor genu GK komórek β i
151
- -
ekson 1B są połoŜone ok. 30 kbp w górę (przed) od promotora wątrobowego i eksonu 1L. KaŜdy z promotorów
ma odmienną strukturę i podlega odmiennej regulacji. Pozostałe eksony (2 – 10) w obu genach są identyczne.
Zaburzenia składania RNA są przyczyną co najmniej jednej postaci β-talasemii – choroby, w której gen
β-globiny jest silnie wytłumiony i podlega zbyt małej ekspresji.
d) modyfikacje potranskrypcyjne mRNA; redagowanie RNA
Wiele typów RNA ulega modyfikacjom potranskrypcyjnym. W przypadku mRNA jest to dodawanie
czapeczki metylacyjnej na koniec 5’ i ogona poli(A) na 3’ oraz wtórne metylacje zasad.
Na 5’-końcu nowo syntetyzowanego mRNA obowiązkowo tworzona jest czapeczka (ang. cap)
metylacyjna w postaci 7-metylo-GTP połączonego przez 3 reszty {P} ze zmetylowanym nukleotydem
purynowym. Proces ten zachodzi w obrębie jądra przed transportem do cytozolu. Czapeczka pełni potrójną
funkcję: chroni przed atakiem 5’-egzonukleaz, umoŜliwia wytworzenie kompleksu RNP w procesie składania
hnRNA oraz bierze udział w rozpoznawaniu transkryptu przez układ translacji (por. punkt VIII-4-d i e). Być
moŜe ma równieŜ udział w transporcie RNA.
Dodawanie ogona poliadenylowego do 3’-końca jest fakultatywne (nieobowiązkowe) i moŜe zachodzić
albo w jądrze albo w cytoplazmie. Gdy polimeraza RNA II przekroczy region kodujący koniec 3’, endonukleaza
RNA przecina pierwotny transkrypt w miejscu ok. 15-20 nukleotydów w kierunku 3’ od sekwencji AAUAAA,
która wydaje się być sygnałem dla przecięcia transkryptów eukariotycznych. Następnie na tak powstały 3’koniec działa polimeraza poli(A), dodając krótki ogon, który następnie moŜe być wydłuŜany do nawet 200 – 250
reszt A. Funkcja ogona obejmuje m. in. ochronę przed atakiem 3’-egzonukleaz, co nie ma wpływu na transport
do cytoplazmy. W cytoplazmie długość ogona moŜe być skracana lub wydłuŜana, co nie ma jednak wpływu na
stabilność mRNA.
Wtórne metylacje zasad, głównie grupy 2’-OH lub atomu azotu N6 adeniny, zachodzą w cytoplazmie.
Informacja niesiona przez DNA moŜe być zmieniona na poziomie mRNA w procesie jego korekty – tzw.
redagowania (ang. editing) – wówczas kodująca sekwencja mRNA róŜni się od odpowiadającej sekwencji DNA.
Przykładem jest synteza apoB – w wątrobie gen podlega transkrypcji i translacji do białka apoB100 (nazwa z
powodu masy ok. 100 kDa), natomiast w jelicie deaminaza C katalizuje konwersję C→U, co zmienia kodon
CAA (Glu) na UAA (sygnał terminacji translacji – stop). W wyniku tego powstaje o wiele krótsze białko apoB48
(48 kDa). Podobnie zachodzi zamiana Gln → Arg w receptorze Glu.
e)
transkrypcja genów tRNA i rRNA
DNA-zaleŜna polimeraza RNA III przepisuje geny klasy III, tj. tRNA i 5S rRNA. Rozpoznaje ona
promotor wewnątrz genu podlegającego transkrypcji, a nie przed nim. U Eucariota obecne są 2 oddzielne
wewnętrzne bloki sekwencji (A i B), funkcjonujące jako promotor wewnątrzgenowy. Sekwencje te w dojrzałej
cząsteczce tRNA znajdują się w obszarach konserwatywnych – pętli DHU i TψC. Punkt startu transkrypcji
znajduje się 10 – 16 bp przed blokiem A, zaś optymalna dla funkcji promotora odległość A-B wynosi 30 – 40
bp. Dla genu 5S rRNA istnieje swoisty białkowy czynnik transkrypcyjny, umoŜliwiający dopasowanie miejsca
katalitycznego polimerazy III do miejsca startu transkrypcji na DNA.
Zarówno u Procariota jak i Eucariota cząsteczki tRNA transkrybowane są jako duŜe cząsteczki
prekursorowe, które następnie poddawane są obróbce nukleolitycznej. Ponadto tRNA musi być precyzyjnie
złoŜone z powodu obecności pojedynczego intronu w pobliŜu fragmentu docelowo tworzącego ramię
antykodonowe. Nukleazy przekształcające prekursory tRNA kierują się prawdopodobnie jego strukturą III-rz., a
nie I-rz., dlatego przekształcane są jedynie cząsteczki zdolne do odpowiedniego sfałdowania.
Modyfikacje potranskrypcyjne tRNA obejmują modyfikacje (alkilację) nukleotydów oraz dołączenie
końcówki CCA do 3’-końca przez transferazę nukleotydylową.
Rybosomalny RNA (rRNA) stanowi niebiałkowy składnik rybosomów, odpowiedzialny za formowanie
ich struktury, wiązanie mRNA oraz udział w translacji. Znane są 4 rodzaje rRNA: 5S, 5,8S, 18S oraz 28S, z
czego wszystkie poza 5S powstają w wyniku obróbki pojedynczej duŜej cząsteczki prekursorowej 45 S. Geny
rRNA zlokalizowane są w jąderku, w liczbie setek kopii w kaŜdym z nich – tak duŜa liczba jest niezbędna do
syntezy RNA dla ok. 10 mln rybosomów, potrzebnych do pojedynczego podziału komórkowego. O ile bowiem
na pojedynczej cząsteczce mRNA moŜe postać 100 tys. cząsteczek kodowanego białka, to rRNA jest produktem
końcowym.
Pierwotny transkrypt 45S jest silnie zmetylowany – zawiera 65 grup metylowych na rybozach oraz 5 na
zasadach (dla prekursora 28S); metylacji ulegają tylko te jego fragmenty, które mogą stać się stabilnym rRNA.
Następnie, wciąŜ w obrębie jąderka, ulega on hydrolizie (nukleolizie) w serii reakcji katalizowanych przez endoi egzonukleazy, w wyniku czego degradowana jest niemal połowa transkryptu. Rybonukleazy specyficzne dla
rRNA odcinają z 5’-końca prekursora 45S fragment, dając prekursor 32S; następnie w jego obrębie rozcinany
152
- -
jest odcinek łączący materiał dla 18S oraz 5,8S, po czym eliminowane są jego pozostałości. Ostatecznie
rozdzielane są sekwencje 5,8S oraz 28S. W czasie przekształcania rRNA zachodzi dalsza metylacja, 28S oraz
5,8S łączą się na terenie jąderka z białkami rybosomalnymi, tworząc duŜą (60S) podjednostkę rybosomalną, zaś
18S, po połączeniu z białkami, wchodzą w skład podjednostki małej (40S).
Rybosom ssaków (4,3 MDa, 80S) składa się z dwóch podjednostek. Większa z nich (2,8 MDa, 60S)
zawiera cząsteczki rRNA: 5 S, 5,8 S i 28 S, a takŜe ok. 50 łańcuchów polipeptydowych, zaś mniejsza (1,4 MDa,
40S) – rRNA 18 S i ok. 30 łańcuchów białkowych.
Rybosom bakteryjny jest mniejszy od eukariotycznego (70S), ale równieŜ składa się z podjednostki
mniejszej (30S) i większej (50S). RóŜni się równieŜ pod względem regulacji (por. punkt VIII-4-e ).
4.
Translacja – biosynteza białek
Translacja jest procesem syntezy białka w oparciu o informacje zawarte w mRNA. Podczas translacji
sekwencja nukleotydów w mRNA tłumaczona jest na sekwencję aa w syntetyzowanym białku; sposób w jaki
odbywa się to tłumaczenie określa się kodem genetycznym. PoniewaŜ w procesie tym matryca i aa nie mają ze
sobą bezpośredniego kontaktu, musi istnieć cząsteczka pośrednicząca, kontaktująca się z jednej strony z
nukleotydami, a z drugiej z aa – cząsteczką tą jest tRNA.
a)
kod genetyczny
mRNA zawiera 4 rodzaje nukleotydów (A, U, G, C). Za pomocą pojedynczego nukleotydu moŜna więc
zakodować informację o 4 cząsteczkach, za pomocą dwu (dublet) – o 42 = 16, trzech (tryplet) – 43 = 64 itd.
PoniewaŜ kodowanych jest 20 aa białkowych, toteŜ informacja o kaŜdym z nich musi być zapisana przez 3
nukleotydy. Tryplet nukleotydowy kodujący pojedynczy aa określa się jako kodon. System przełoŜenia kodonu
na aa określany jest kodem genetycznym; posiada on kilka istotnych cech:
• jednoznaczność, determinacja – oznacza, Ŝe dany kodon koduje tylko jeden określony aa; cecha ta jest
konsekwencją przyłączania pojedynczej cząsteczki aa do tRNA (por. dalej)
• nadmiarowość, degradacja, niejednoznaczność – oznacza, Ŝe powyŜsza reguła jednoznaczności nie
działa w drugą stronę, tzn. róŜne kodony mogą kodować ten sam aa, np. Ser jest kodowana przez aŜ 6
róŜnych kodonów; główną przyczyną degradacji kodu jest niewielkie znaczenie ostatniego (3.)
nukleotydu w determinacji kodowanego aa (por. dalej)
• brak nakładania się – skrajne nukleotydy sąsiadujących kodonów stykają się ze sobą, lecz nigdy nie
pokrywają; innymi słowy ostatni nukleotyd kodonu poprzedniego nie moŜe być jednocześnie
pierwszym nukleotydem kodonu następnego; zasada ta jest złamana jedynie u pewnych wirusów
• bezprzecinkowość – pomiędzy kodonami nie występują przerwy, inaczej mówiąc: kaŜdy nukleotyd
wchodzi w skład jakiegoś kodonu, nie wystepują fragmenty niekodujące
• trójkowość – poniewaŜ jeden aa kodowany jest przez 3 nukleotydy
• kolinearność – kodujące nukleotydy są ułoŜone liniowo, a cząsteczka mRNA nie zawiera rozgałęzień
• pośredni charakter – kodujące nukleotydy nigdy nie kontaktują się z odpowiadającymi im aa
• uniwersalność – wszystkie Ŝywe komórki tłumaczą kodony w ten sam sposób; zasada ta nie jest ścisła,
gdyŜ istnieją pewne róŜnice między kodem cytoplazmatycznym a mitochondrialnym, nawet tej samej
komórki, jak równieŜ między kodami poszczególnych gatunków – por. tabela:
kodon
AUA, AUU
cytoplazma
Ile
mitochondrium
ssaki
Met
droŜdŜe
*
bakterie
Ile
* – Neurospora spp. i Aspergillus spp.
UGA
stop
AGA, AGG
Arg
stop
Trp
Arg
Tabela kodu genetycznego (1, 2, 3 – kolejne zasady kodonu):
1.
2.
3.
U
U
C
A
G
U
Phe
Phe
Leu
Leu
C
Ser
Ser
Ser
Ser
C
A
Tyr
Tyr
stop
stop
G
Cys
Cys
stop
Trp
U
Leu
Leu
Leu
Leu
C
Pro
Pro
Pro
Pro
A
A
His
His
Gln
Gln
G
Arg
Arg
Arg
Arg
* – kodon startowy (por. dalej)
153
- -
U
Ile
Ile
Ile
Met*
C
Thr
Thr
Thr
Thr
G
A
Asn
Asn
Lys
Lys
G
Ser
Ser
Arg
Arg
U
Val
Val
Val
Val
C
Ala
Ala
Ala
Ala
A
Asp
Asp
Glu
Glu
G
Gly
Gly
Gly
Gly
b) budowa tRNA i aktywacja aa
RNA transportujący (tRNA) wyróŜnia się wśród wszystkich RNA najmniejszą cząsteczką – ok. 75
nukleotydów. Podobnie jak mRNA ulega on obróbce na terenie jądra. tRNA pełni funkcje adaptacyjne –
odczytuje informację zawartą w sekwencji nukleotydów mRNA i tłumaczy ją na sekwencję aa syntetyzowanego
białka. Zdolność ta jest konsekwencją niejako dwubiegunowej budowy tRNA – z jednej strony posiada on
sekwencję komplementarną do kodonu mRNA (antykodon), z drugiej zaś wiąŜe odpowiedni aa. PoniewaŜ do
pojedynczego tRNA moŜe przyłączyć się tylko jeden określony aa, toteŜ w komórce musi istnieć co najmniej
jeden rodzaj tRNA dla kaŜdego aa, czyli łącznie dla wszystkich aa – co najmniej 20 rodzajów tRNA. Struktura Irzędowa tRNA warunkuje fałdowanie cząsteczki – wewnętrzna komplementarność zasad umoŜliwia im
parowanie i tworzenie II-rzędowej struktury liścia koniczyny, w obrębie której moŜna wskazać 4 główne
ramiona. KaŜde z ramion posiada szypułę z kilku sparowanych zasad oraz zakończone jest pętlą. Przyciąganie
się skrajnych ramion powoduje zgięcie całej cząsteczki, tak iŜ przestrzennie przypomina ona odwróconą literę L
(struktura III-rz.).
Ramię akceptorowe (szypuła 7 bp) zakończone jest sekwencją CCA, do której końcowego nukleotydu
przyłącza się swoją grupą karboksylową swoista reszta aa.
Ramię DHU (szypuła 3-4 bp) zawiera zmodyfikowany nukleozyd – dihydrourydynę (stąd nazwa). Jest
istotne dla właściwego rozpoznania danego rodzaju tRNA przez odpowiednią syntetazę aa-tRNA, gdyŜ
zawiera sekwencję rozpoznawalną przez tą ostatnią.
Ramię antykodonowe (szypuła 5 bp) zawiera sekwencję 7 nukleotydów: 3’-N-Pu*XYZPyPy-5’ (N –
dowolny nukleotyd, Pu* – zmodyfikowana puryna, Py – pirymidyna), z których 3 środkowe (XYZ)
stanowią antykodon, tj. sekwencję komplementarną do kodonu na mRNA. Odpowiada ona za swoistość
mRNA. Kodon i antykodon są antyrównoległe pod względem komplementarności. Degeneracja kodu
genetycznego związana jest gł. z ostatnim nukleotydem kodonu, co sugeruje jego mniej precyzyjne
połączenie z komplementarnym nukleotydem antykodonu. Wyjaśnia to tzw. hipoteza tolerancji,
zgodnie z którą w tym miejscu kodon i antykodon są w stanie rozchwiania, tak iŜ kilka kodonów
kodujących ten sam aa moŜe się wiązać z tym samym antykodonem, nawet pomimo braku między nimi
komplementarności. Translacja kodonu jest więc mało wraŜliwa na zmiany w pozycji 3.
Ramię TψC (szypuła 5 bp) zawiera tyminę, niespotykaną normalnie w RNA oraz pseudourydynę,
róŜniącą się od urydyny wiązaniem N-glikozydowym pomiędzy atomem C5, a nie C1, uracylu. Bierze
ono udział w wiązaniu aa-tRNA do powierzchni rybosomu.
Ramię dodatkowe jest najbardziej heterogennym fragmentem całej cząsteczki, a jego długość stanowi
kryterium klasyfikacji tRNA na dwie kwasy: klasa 1 (75% tRNA) zawiera krótką (3-5 bp) pętlę
dodatkową, zaś klasa 2 – długą pętlę (13-21 bp) oraz strukturę pętla – szypuła.
Reakcje przenoszenia aa na odpowiedni tRNA katalizowane są przez 20 róŜnych enzymów, zwanych
wspólnie syntetazami aminoacylo-tRNA (aa-tRNA). Reakcja rozpoznawania i dołączania aa jest dwuetapowa:
wpierw powstaje aktywny kompleks pośredni aminoacylo-tRNA-enzym, który następnie rozpoznaje swoisty
tRNA i przenosi resztę aa na jego grupę 3’OH:
aa + ATP + enzym → enzym-AMP-aa + PPi
enzym-AMP-aa + tRNA → enzym + AMP + aa-tRNA
Powstałe wiązanie estrowe utrzymuje się aŜ do czasu wprowadzenia reszty aa w sekwencję syntetyzowanego na
rybosomie polipeptydu.
c)
budowa i funkcje rybosomów (patrz równieŜ punkt VIII-3-e)
Organellum komórkowym, w którym odbywa się translacja, jest rybosom. Spotykają się tu róŜne
cząsteczki, aby ostatecznie dać produkt w postaci nowo zsyntetyzowanego białka. Pojedyncza cząsteczka
mRNA moŜe być jednocześnie uŜywana przez wiele rybosomów – zespoły takie określa się jako polirybosomy
(polisomy). Poszczególne rybosomy wiąŜą się do mRNA w odległościach nie mniejszych niŜ 80 nukleotydów.
Wielkość polisomów, tj. liczba rybsomów związanych z mRNA, zaleŜy bezpośrednio od długości tego
ostatniego. Polisomy przyłączone do błon tworzą szorstką siateczkę śródplazmatyczną (ang. rough
endoplasmatic reticulum – RER), słuŜącą do syntezy integralnych białek błonowych oraz białek eksportowanych
poza komórkę lub magazynowanych jako zymogeny w aparacie Golgiego, czekając na eksport. Rybsomy wolne,
tj. obecne w cytoplazmie i niezwiązane z błonami, uŜywane są do syntezy własnych białek cytoplazmatycznych
komórki.
154
- -
d) etapy translacji
Proces translacji składa się z inicjacji, elongacji i terminacji. Informacja genetyczna odczytywana jest w
kierunku 5’→3’, a polipeptyd syntetyzowany od N do C-końca. Polarność procesu translacji umoŜliwia
organizmom prokariotycznym na rozpoczęcie translacji jeszcze przed ukończeniem transkrypcji – do powstałego
fragmentu 5’ mRNA szybko przyłączają się rybosomy i rozpoczynają syntezę polipeptydu.
•
inicjacja i regulacja translacji
Inicjacja translacji obejmuje złoŜenie aparatu translacyjnego, w skład którego wchodzą: mRNA, tRNA,
rRNA i białka rybosomalne oraz czynniki inicjujące. Podczas translacji zuŜywane są: ATP, GTP i aa.
U Procariota istnieją 3 czynniki inicjujące (ang. initiation factors – IF): IF1, IF2 i IF3. W pierwszym
etapie inicjacji czynniki te przyłączają się do mniejszej podjednostki rybosomu (30S), przy czym IF2 związany
jest z GTP. Czynniki 1 i 3 uniemoŜliwiają przyłączenie podjednostki większej (50S), zaś 2 (+ GTP) odpowiada
za przyłączenie formylo-Met-tRNA. Następnie IF3 i Mg2+ ułatwiają przyłączenie mRNA. Do kodonu startowego
(AUG, GUG, UUG – wszystkie 3 kodują formylometioninę) przyłącza się formylo-Met-tRNA, po czym czynnik
IF3 oddysocjowuje, co pozwala na przyłączenie się podjednostki większej i powstanie kompletnego rysobomu
(70S). Tak przygotowany aparat jest gotowy do elongacji.
U Eucariota natomiast występuje co najmniej 10 eukariotycznych czynników inicjacji (ang. eucariotic IF
– eIF), złoŜonych z licznych podjednostek. Proces inicjacji składa się tu z 4 faz.
W pierwszej fazie rybosom (80S) dysocjuje na dwie podjednostki (40S i 60S). Do mniejszej (40S)
wiąŜą się eIF3 i eIF1A, co sprzyja dysocjacji oraz zapobiega reasocjacji. Podobny efekt wywiera
związanie eIF3A z większą (60S).
W drugiej fazie tworzy się kompleks preinicjacyjny (PIC). eIF2 wiąŜe GTP – powstały kompleks
startowy inicjacji wiąŜe Met-tRNA Si, który z kolei łączy się z kodonem startowym AUG (kodującym
Met). Symbol Si (start inicjacji) oznacza startowy tRNA dla Met, który róŜni się od tRNA dla Met
wprowadzanej do polipeptydu podczas elongacji. Potrójny kompleks łączy się z podjednostką mniejszą
(40S), tworząc PIC 43S, stabilizowany przez eIF3 i eIF1A.
eIF2 bierze udział w regulacji syntezy białka – jego podjednostka α jest fosforylowana (reszta Ser51)
przez róŜne kinazy białkowe (HRC, PKP, GCN2) aktywowane pod wpływem stresu komórki, kiedy
przeciwwskazany jest wydatek energetyczny na biosyntezę białek. Do czynników stresowych komórki
naleŜą: brak aa lub glukozy, infekcja wirusowa, brak surowicy, hiperosmolalność, szok cieplny).
Ufosforylowana podjednostka α wiąŜe β, nie pozwalając na wymianę GTP / GDP i utworzenie PIC.
W fazie trzeciej powstaje właściwy kompleks inicjacyjny. Czapeczka metylacyjna na końcu 5’ mRNA
ułatwia jego wiązanie do PIC 43S. Do niej bezpośrednio przyłącza się kompleks eIF4F, złoŜony z
eIF4E (miejsce wiązania), 4G i 4A. Następnie eIF4A i 4B redukują strukturę II-rzędową kompleksu na
5’ końcu mRNA dzięki swojej aktywności ATPazy i helikazy zaleŜnej od ATP. Kompleks przeszukuje
mRNA w poszukiwaniu kodonu inicjacyjnego – AUG (dokładniej: sekwencja Kozaka o składzie
GCCA/GCC-AUG-G). eIF3 wiąŜe się do eIF4G i łączy cały kompleks z podjednostką 40S w
kompletny kompleks inicjacyjny 48S.
Ostatecznie w czwartej fazie eIF5 hydrolizuje GTP związaną eIF2, co uwalnia czynniki inicjacyjne
związane z kompleksem inicjacyjnym (podlegają one recyrkulacji) i prowadzi do spontanicznej
asocjacji podjednostek rybosomalnych 40S i 60S w 80S. Met-tRNA znajduje się w miejscu P rybosomu
i jest gotowy do rozpoczęcie cyklu elongacji.
Szczególne znaczenie w regulacji inicjacji (i całości transkrypcji) ma kompleks eIF4F, a właściwie jego
dwa składniki – 4E i 4G.
eIF4E rozpoznaje i wiąŜe się z czapeczką metylacyjną, co ogranicza tempo translacji. Proces ten jest
podwójnie regulowany. Po pierwsze grupa białek wiąŜących ten czynnik 4E-BP1 (PHAS1), BP2 i BP3
uniemoŜliwia mu połączenie się z 4G i utworzenie kompleksu 4F (regulacja negatywna). Po drugie liczne
mitogeny (insulina, IGF-1, PGDF, IL-2, angiotensyna II) aktywują kinazy zwiększające aktywność eIF4E
(regulacja pozytywna): z jednej strony aktywują komponentę szlaku MAPK, która fosforyluje sam 4E (Ser209
lub Thr210), tak iŜ ma większe powinowactwo do czapeczki 5’, a z drugiej aktywują serynową kinazę białkową
aktywną w szlaku mTOR, która fosforyluje 4E-BP w 5 unikatowych miejscach, przez odłącza się ono od 4E i
nie przyłącza ponownie aŜ do całkowitej defosforylacji.
eIF4G wiąŜe się natomiast do eIF3, który łączy kompleks do 40S oraz do 4A i 4B, czyli kompleksu
ATPaza – ATP-zaleŜna helikaza, uniemoŜliwiając rozplecenie mRNA (regulacja negatywna).
155
- -
•
elongacja
U Procariota występują 3 czynniki elonacyjne: EF-Tu, EF-Ts oraz EF-G. Na początku elongacji
pojawiają się one kolejno, przy czym pierwszy związany jest z GTP i wiąŜe aa-tRNA, a funkcją drugiego jest
regeneracja pierwszego. W kompleksie translacyjnym wyróŜnia się miejsce P (peptydowe), w którym
początkowo obecny jest formylo-Met-tRNA oraz A (akceptrowe), do którego przyłącza się na zasadzie
komplementarności odpowiedni aa-tRNA. Następnie EF-Tu związany z GDP zostaje wyparty z kompleksu przez
EF-Ts, tak Ŝe moŜe wymienić GDP na GTP i powrócić. Aktywność peptydylotransferazy przenosi 1. aa –
formylo-Met na 2., wytwarzając między nimi wiązanie peptydowe. Powstały dwupeptyd związany jest z tRNA
w miejscu A, zaś wolny tRNA z miejsca P usuwa się z kompleksu. Translokaza (EF-G) przesuwa wówczas
tRNA z przyłączonym dwupeptydem w miejsce P, a do miejsca A wchodzi następny odpowiedni aa-tRNA. Cykl
ten powtarza się tyle razy, ile kodonów zawiera mRNA.
U Eucariota elongacja przebiega analogicznie jak u Procariota, z tym Ŝe katalizowana jest przez
eukarotyczne czynniki elongacji (eEF) – eEF1α, eEF1βγ oraz eEF2. Rybosom eukariotyczny równieŜ posiada
miejsce P, zajęte początkowo przez Met-tRNA Si oraz A, początkowo wolne. eEF1α, tworząc kompleks z GTP,
umoŜliwia wejście odpowiedniego aa-tRNA w wolne miejsce A. Jednocześnie od GTP odłącza się fosforan,
pozostawiając eEF1α-GDP, który odłącza się, ale wraca po wymianie GDP na GTP. Gdy w miejscach A i P
rybosomu znajdują się aa-tRNA, tworzone jest wiązanie peptydowe: grupa α-aminowa nowego aa-tRNA
przeprowadza nukleofilowy atak na estryfikowaną grupę α-karboksylową peptydylo-tRNA. Reakcja ta
katalizowana jest przez komponent białkowy podjednostki 60S – peptydylotransferazę albo przez składnik RNA
(być moŜe 23S – rybozym). Rosnący łańcuch peptydowy zostaje przeniesiony na tRNA w miejscu A. W miejscu
P znajduje się wówczas cząsteczka tRNA pozbawiona reszty aa, która szybko stamtąd oddysocjowuje. eEF2 i
GTP odpowiadają za translokację nowo utworzonego peptydylo-tRNA z miejsca A do zwolnionego P, co wiąŜe
się z hydrolizą GTP → GDP + {P}. Jednocześnie miejsce A zostaje zwolnione i moŜe się z nim związać kolejny
aa-tRNA. Translokacji towarzyszy przesunięcie rybosomu względem mRNA o 3 nukleotydy, tak iŜ w miejscu A
znajduje się kolejny kodon. Elongacja prowadzona jest z prędkością 6 aa/s u Eucariota i 3 x szybciej u
Procariota.
Bilans energetyczny jednego cyklu elongacji:
związanie reszty aa z tRNA: ATP → AMP = 2 ATP → 2 ADP
wejście aa-tRNA w miejsce A:
GTP → GDP
translokacja:
GTP → GDP
Zatem synteza jednego wiązania peptydowego zuŜywa łącznie 4 wiązania wysokoenergetyczne.
•
terminacja
Terminacja translacji zachodzi, gdy w miejscu A znajdzie się jeden z kodonów nonsensownych (stop:
UAG – amber, UGA – opal lub UAA – orche). Dla takich kodonów nie istnieją Ŝadne swoiste tRNA, sygnał ten
jest natomiast rozpoznawany przez czynniki uwalniające (ang. releasing factors – RF). U bakterii są to: RF1 (dla
UAA lub UAG), RF2 (dla UAA lub UGA) oraz RF3, aktywujący oba poprzednie, u Eucariota zaś –
eukariotyczne czynniki uwalniające (ang. eucariotic RF – eRF). Wchodzą one w miejsce A i, wraz z GTP i
peptydylotransferazą, przenoszą na peptydylo-tRNA w miejscu P cząsteczkę wody, przez co powodują hydrolizę
wiązania pomiędzy peptydem a tRNA, które ulegają uwolnieniu. Ostatecznie czynniki uwalniające i translokaza
powodują rozpad kompleksu na elementy składowe – podjednostki rybosomalne, mRNA i tRNA, które mogą
ponownie wchodzić do cyklu.
e)
regulacja i inhibitory translacji
Układ translacyjny gospodarza wykorzystywany jest przez wirusy do syntezy własnych białek. Czasem
wirusowe mRNA ulega bardziej wydajnej translacji niŜ gospodarza (np. mengovirus), a czasem powstaje w
nadmiernych ilościach, konkurując z mRNA gospodarza o dostęp do aparatu translacyjnego (np. HSV1,
reowirusy). Niektóre wreszcie hamują syntezę białek komórkowych przez blokadę połączenia mRNA i 40S.
Pikornawirusy (piko-RNA-wirusy – czyli bardzo małe wirusy RNA; np. wirus polio) zaburzają funkcje
kompleksu 4F, a ich mRNA nie posiada czapeczki 5’, lecz miejsce IRES (ang. initial ribosomal entry site),
wymagające 4G zamiast 4E. Proteaza wirusowa atakuje 4G i 4E, dlatego nie powstaje kompleks 4F i 40S nie
łączy się z komórkowymi mRNA (z czapeczką). 4G łączy się za to z miejscem IRES wirusowego mRNA,
którego translacja jest w tej sytuacji promowana. Ponadto wirusy te pobudzają defosforylację BP1, dodatkowo
zmniejszając translację komórkowego mRNA.
Egzotoksyna maczugowca błonicy (Corynebacterium diphtheriae) katalizuje ADP-rybozylację eEF2,
wykorzystując jako donor NAD+, przez co blokuje translację.
156
- -
Rycyna (toksyna nasion rącznika) inaktywuje eukariotyczny 28S rRNA albo przez rozcięcie wiązania Nglikozylowego albo przez odłączenie reszty A.
RóŜnica między rybosomami bakteryjnymi (70S) a eukariotycznymi (80S) umoŜliwiła opracowanie i
syntezę kilku klas antybiotyków bakteriostatycznych, hamujących syntezę białek bakteryjnych i
uniemoŜliwiających ich rozwój. Hamowanie podjednostki mniejszej (30S) to zasada działania aminoglikozydów
i tetracyklin, zaś większej (50S) – makrolidów i ketolidów, linkozamidów, streptogramin, oksazolidynonów i
chloramfenikolu. Związkami blokującymi podjednostki rybosomalne, które pozbawione są znaczenia
klinicznego, są puromycyna i cykloheksamid. Puromycyna jest analogiem Tyr-tRNA – powoduje przedwczesne
uwolnienie syntetyzowanego peptydu, hamując translację zarówno na rybosomach prokariotycznych, jak i
eukariotycznych. Cykloheksamid natomiast blokuje syntezę białek tylko u Eucariota przez hamowanie
aktywności peptydylotransferazy w podjednostce 60S.
Translacja moŜe być mechanizmem obronnym organizmu. Przykładowo obecność Ŝelaza uwalnia białko
cytozolowe, które wiąŜe się z sekwencją nie tłumaczącą blisko końca 5’ mRNA ferrytyny, stymulując jego
translację. Konsekwentny wzrost ferrytyny wiąŜe jony Ŝelaza, nie dopuszczając do osiągnięcie przezeń poziomu
toksycznego (por. punkty III-7 – RFT oraz VII-3 – gospodarka Ŝelazem).
f)
potranslacyjne modyfikacje białek
Wiele białek powstałych w wyniku translacji odpowiednich mRNA stanowi dopiero nieaktywne
cząsteczki prekursorowe, wymagające do aktywacji obróbki potranslacyjnej. Modyfikacje potranslacyjne moŜna
podzielić na strukturalne i regulacyjne, w zaleŜności od zmienianych właściwości białek. Do pierwszej grupy
naleŜą m. in.: glikozylacja (patrz punkt IV-7-b), hydroksylacja (por. VII-8-b) i acylacja, do drugiej zaś – obróbka
proteolityczna i fosforylacja (por. II-4-b), acetylacja, metylacja i ADP-rybozylacja (por. punkt VIII-1-d). Do
białek mogą być równieŜ dołączane atomy metali (por. II-2-f) czy grupy barwnikowe (por. I-3-e).
5.
Mitochondrialne DNA (mtDNA)
Niemal cały materiał genetyczny komórki znajduje się na terenie jej jądra. Istnieją jednak organella
posiadające własny DNA – są to mitochondria, zawierające mtDNA, a u roślin równieŜ chloroplasty (chlDNA).
Obecność własnego materiału pozwala im na niezaleŜne podziały, dlatego określa się je mianem organelli
autonomicznych. Teoria endosymbiozy głosi, Ŝe powstały one w wyniku wniknięcia probakterii do komórek
prokariotycznych. Cząsteczki mtRNA w róŜnych mitochondriach tej samej komórki, a nawet w tym samym
mitochondrium, mogą się od siebie róŜnić, co określa się jako heteroplazmia. U ssaków mtDNA dziedziczony
jest niemal wyłącznie w linii Ŝeńskiej (dziedziczenie matczyne), a mitochondria plemnika są niszczone we
wczesnych fazach rozwoju zygoty. Podczas podziału komórki mitochondria są losowo rozdzielanie do komórek
potomnych (tzw. przypadkowa segregacja mitotyczna).
Pozajądrowy DNA występuje jako dwuniciowe cząsteczki koliste, czyli genofory. Pojedyncze ludzkie
mitochondrium zawiera 4 – 10 kolistych cząsteczek DNA. KaŜda z nich ma długość 16569 bp i zawiera 37
genów, z czego 13 koduje enzymy łańcucha oddechowego i fosforylacji oksydacyjnej (podjednostki syntazy
ATP, dehydrogenazy NADH oraz oksydazy cytochromu c; por. punkty III-5 i 6), 22 – tRNA, a 2 – rRNA. Jest to
o wiele za mało, aby pozwolić na w pełni samodzielne funkcjonowanie – większość białek w obecnych w
mitochondriach kodowanych jest przez genom jądrowy, syntetyzowanych w cytoplazmie i importowanych do
miejsc docelowych. Z tego względu poprawniejsze byłoby określenie mirochondriów jako organella
półautonomiczne. Z dwu pasm mtDNA jedno określa się jako cięŜkie (H), drugie zaś lekkie (L). Na obydwu z
nich zlokalizowane są geny, przy czym na nici L transkrypcja rozpoczyna się z jednego promotora, a na H z
dwóch. Geny mitochondrialne nie są podzielone, tj. nie zawierają intronów, a powstały na nich RNA nie musi
być składany. Mitochondrialny kod genetyczny róŜni się nieco od jądrowego (patrz punkt VIII-4-a).
mtDNA ma znacznie wyŜsze tempo mutacji niŜ DNA jądrowy. Przyjmuje się, Ŝe wynika to z braku
systemów naprawy mitchondrialnego DNA, z braku histonów oraz z obecności duŜej ilości wolnych rodników
(RFT – por. punkt III-8). Mutacje pojawiające się w mitochondrialnym DNA komórek linii płciowej mogą
powodować choroby występujące w rodzinie, zaś mutacje pojawiające się w komórkach somatycznych mogą
być związane ze spadającą z wiekiem wydolnością układu fosforylacji oksydacyjnej. W tym pierwszym
przypadku są to choroby genetyczne dziedziczone w linii matczynej, uderzające głównie w tkanki rzadko
dzielące się, a o wysokim zapotrzebowaniu energetycznym – gł. mięśniową i nerwową. Mutacje często nie są
jedyną przyczyną chorób, a na ich efekty wpływają inne, nieznane jeszcze czynniki, najprawdopodobniej
sekwencja samego mtDNA, proporcje i dystrybucja do róŜnych tkanek zmutowanych cząsteczek DNA oraz
genotyp jądrowy. Niektóre choroby mitochondrialne mogą być spowodowane właśnie mutacjami genomu
jądrowego – genów kodujących białka strukturalne mitochondriów bądź regulujące ich pracę. Objawy chorób
obejmują najczęściej: paraliŜ, miopatię, utratę siły mięśniowej, sztywność mięśni, neuropatię, encefalopatię,
157
- -
degenerację jąder podstawnych, w niektórych chorobach równieŜ cukrzycę, głuchotę i ślepotę. Diagnostyka jest
trudna, a postępowanie i leczenie wyłącznie objawowe. Przykłady:
LHON (dziedziczna neuropatia n. wzrokowego, z. Lebera),
NARP (neuropatia obwodowa, ataksja i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki),
MERRF (padaczka miokloniczna z poszarpanymi – tzw. szmatowanymi – włóknami mm.),
MELAS (encefalopatia mitochondrialna, kwasica mleczanowa, napady udaropodobne),
CPEO (przewlekły postępujący paraliŜ mm. oka),
KSS (z. Kearsa – Sayre’a),
z. Paersona (szpikowo – trzustkowy),
z. Leigha.
mtDNA wykorzystuje się w antropologii, genetyce populacyjnej i medycynie sądowej. UmoŜliwia to
obecność tzw. nadzmiennych (hiperzmiennych) obszarów mtDNA, czyli fragmentów niekodujących, róŜniących
się u poszczególnych ososbników. WyróŜnia się 2 regiony hiperzmienne – pierwszy (HVR1) obejmuje
sekwencję 16024-16365, a drugi (HVR2) – 73-340. W antropologii mtDNA słuŜy analizie rozprzestrzeniania się
gatunku ludzkiego ze swej pierwotnej kolebki – Afryki Środkowej – na pozostałe kontynenty. Ponadto badanie
mtDNA pochodzących od ludzi w róŜnych grup etnicznych pozwoliło na obliczenie, Ŝe kobieta, od której
pochodzi genom mitochondrialny wszystkich Ŝyjących obecnie ludzi (tzw. mitochondrialna Ewa) Ŝyła ok. 200
tys. lat temu. Podstawą badań nt. neandertalczyka są równieŜ próbki mtDNA. W medycynie sądowej słuŜy ono
natomiast identyfikacji osób (równieŜ nieznanych zwłok) i ustalaniu między nimi pokrewieństwa.
158
- -