wiczenie 2 - Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej

Seminarium 7 - Przygotowanie schematu kasety ekspresyjnej oraz opracowanie strategii klonowania
kasety ekspresyjnej
Cel ćwiczenia:
Przygotowanie konstruktu ekspresyjnego DNA zawierającego różne elementy funkcjonalne pozwalające na
syntezę białka enzymatycznego (katalazy) oraz tzw. białka reporterowego – EGFP. Elementy są zawarte w
różnych wektorach i należy je połączyć wewnątrz wektora pBluescript II KS (standardowy plazmid do
klonowania DNA). Ostatecznie całość tzw. kasety ekspresyjnej (sekwencji DNA zbudowanej z różnych
elementów/genów tworzących funkcjonalną całość) należy przeklonować do specyficznego eukariotycznego
wektora ekspresyjnego umożliwiającego wykorzystanie w hodowli komórek np. ssaczych.
Zadanie 1
Odnajdź sekwencję mRNA ludzkiej katalazy. Zidentyfikuj kluczowe parametry sekwencji: długość całej
cząsteczki mRNA, położenie CDS, położenie kluczowych miejsc restrykcyjnych. Naszkicuj schemat cDNA
katalazy.
Zadanie 2
Naszkicuj schemat kasety ekspresyjnej, zwracając uwagę na wielkość i kolejność ułożenia elementów, tak
aby zawierała w sobie sekwencje: intronu, cDNA katalazy (minimum CDS w całości), IRES, EGFP.
Założenie jest takie, że w wyniku ekspresji takiej kasety powinniśmy otrzymać katalazę oraz niezależne
białko EGFP.
Zadanie 3
Przyjrzyj się posiadanym mapom i sekwencjom konstruktów DNA pod kątem możliwości
wycięcia/sklonowania wymaganego elementu
Zadanie 4
Mając następujące konstrukty DNA do dyspozycji:
 pUC/CAT – zawierający cDNA katalazy (identyczne z mRNA odnalezionym w Genbank) w całości
zawarte w plazmidzie pUC19, wklonowane w miejsce XbaI
 pTarget – zawierający syntetyczny intron (numer w Genbank: AY540613)
 pIRES2-EGFP – zawierający IRES (ang. Internal Ribosome Entry Site, dodatkowe miejsce wiązania
rybosomu) oraz EGFP (ang. Enhanced Green Fluorescence Protein, białko zielonej fluorescencji)
 pBluescript II KS – wektor do klonowania DNA
 pcDNA3.1(+) – wektor ekspresyjny
oraz posługując się następującymi technikami:
 enzymy restrykcyjne (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/index.php)
 reakcja PCR (NCBI>BLAST> Primer-BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
 linkery
zaplanuj kolejne kroki procedury klonowania kasety ekspresyjnej w wektorze pBluescript, a następnie
utworzenia konstruktu ekspresyjnego przez przeniesienie całej kasety ekspresyjnej do wektora
ekspresyjnego pcDNA3.1.
Sprawozdanie:
Musi zawierać:
Zadanie 1 – schemat katalazy
Zadanie 2- schemat kasety ekspresyjnej
Zadanie 4 - instrukcję postępowania krok po kroku.
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej
MANIPULACJE MOLEKULARNE IN SILICO