Ćwiczenia

Ćwiczenia.doc
(200 KB) Pobierz
ĆW. 1 - DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA W MEDYCYNIE
Główne kierunki analizy DNA
Genomowy DNA:
- Amplifikacja DNA  Amplifikacja in-vitro, PCR
- Hybrydyzacja molekularna  Southern Blot, Northern Blot, Dot Blot, DNA Fingerprinting
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
- metoda badania oparta na zdolności tworzenia kompleksu dwuniciowego przez jednoniciowe fragmenty kwasów nukleinowych,
- polega na wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy badanym fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną, które prowadzi do wytworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze,
- w przypadku dwuniciowego fragmentu kwasu nukleinowego tworzenie hybrydu poprzedzone jest denaturacją pod wpływem działania zasad lub wysokich temperatur,
- proces łączenia sondy molekularnej z fragmentem docelowym kwasu nukleinowego jest wysoce specyficzny i zachodzi zgodnie z zasadą komplementarności,
- odpowiednio przygotowana sonda molekularna, w optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe kompleksy,
- badany kwas nukleinowy może być denaturowany i unieruchamiany na filtrach, a następnie poddawany procesowi identyfikacji za pomocą znakowanej radioaktywnie lub nieradioaktywnie sondy
molekularnej.
- Tm (odwrotny punkt topnienia) – temperatura przy której istnieje równowaga dynamiczna pomiędzy hybrydami rozpadającymi się w wyniku denaturacji i tworzenia się w wyniku renaturyzacji
- Ze statycznego punktu widzenia w tej temperaturze 50% hybryd ulega rozpadowi
- Tm zależy od wielu czynników: stężenia jonów Na, liczby par G-C, długości hybrydy, stężenia formamidu lub mocznika
Tm = 2 x nA-T + 4 x nC-G
Zjawisko hybrydyzacji umożliwia tworzenie kompleksów różnych molekuł zwanych inaczej hybrydami:
- DNA – DNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) wiąże się do komplementarnego ssDNA analizowanej sekwencji,
- DNA – RNA, gdy sonda (wyznakowany ssDNA) tworzy hybryd z komplementarną cząsteczką RNA,
- RNA – RNA, gdy sonda (wyznakowany RNA) łączy się z komplementarna cząsteczką RNA.
Stabilność wyżej wymienionych hybrydów jest zróżnicowana:
RNA –RNA > DNA –RNA > DNA –DNA
Sondy molekularne
W analityce molekularnej wykorzystuje się sondy oligonukleotydowe pochodzenia naturalnego (kilkaset nukleotydów), które można otrzymać przez określone zabiegi molekularne np. klonowanie lub
sondy syntetyzowane chemicznie (zwykle o długości 10 – 50 nukleotydów).
Zalety sond syntetycznych:
- stosunkowo łatwa dostępność,
- możliwość dowolnego programowania sekwencji sond,
- nie ma potrzeby denaturacji, gdyż sonda jest jednoniciowa,
- krótki czas hybrydyzacji,
- wysoka selektywność.
Znakowanie sond molekularnych
Znakowanie najczęściej wykonuje się poprzez wprowadzenie radioizotopu 32P w miejsce niepromieniotwórczych atomów fosforu.
Można tego dokonać poprzez:
- przeniesienie z udziałem kinazy polinukleotydowej reszty fosfonowej [γ 32P] ze znakowanego ATP na koniec 5’ cząsteczki sondy
lub
- wbudowując w łańcuch sondy [γ 32P] – deoksyfosfonukleozydy w procesie „nick translation” (uzupełnienie przerw w dwuniciowej cząsteczce DNA, wywołanych uprzednio przez endonukleazę).
W korzystaniu z tego typu sond metodą wykrywania utworzonych struktur hybrydowych jest bezpośrednia autoradiografia.
Powszechnie stosuje się również techniki niepromieniotwórcze w znakowaniu sond molekularnych, polegające na dołączaniu biotyny lub digoksygeniny. Produkty hybrydyzacji wykrywa się wówczas
w procesach dwustopniowych:
Etap I:
- użycie streptawidyny wiążącej się wybiórczo z biotyną lub przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko biotynie czy digoksygeninie,
- streptawidyna i przeciwciała sprzężone są z enzymami (peroksydaza chrzanowa lub fosfataza zasadowa).
Etap II:
- w/w enzymy w obecności odpowiednich substratów powodują reakcje barwne lub wywołują zjawisko chemiluminescencji.
Hybrydyzacja Southern (ang. Southern blot hybridization)
- hybrydyzacja mająca na celu identyfikację określonego fragmentu DNA,
- najczęściej dotyczy hybrydyzacji DNA – DNA,
Etapy :
1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.
2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.
3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ.
4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy.
5. Związanie DNA z filtrem: w temperaturze 80°C lub poprzez naświetlanie UV.
6. Hybrydyzacja z sondą.
7. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii i reakcji barwnych lub fluorescencji
Hybrydyzację z sondą dzielimy na trzy etapy:
- Prehybrydyzacja:
- eliminacja niespecyficznego tła poprzez moczenie filtru w roztworze, którego składniki blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze,
- w celu zminimalizowania tła dodaje się również niehomologiczne DNA nośnikowe.
- Właściwa hybrydyzacja:
- wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi,
- wysoka homologia: temperatura (65°C), mniejsze stężenie soli, dodatek formamidu,
- częściowa homologia: temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli.
- Płukanie filtru:
- usunięcie niezhybrydyzowanej sondy – jest to warunek specyficznego obrazu hybrydyzacji.
Zastosowanie hybrydyzacja Southern umożliwia:
- wykrycie rearanżacji genowych (np. delecje, insercje) większych niż 50 pz,
- badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych DNA – RFLP (restriction fragment length polymorphism).
Polimorfizm może mieć charakter naturalny lub może wystąpić w wyniku zmian mutacyjnych w DNA, które powodują zanikanie bądź pojawianie się miejsc restrykcyjnych.
Analiza RFLP wykorzystywana jest m.in. w badaniach dziedzicznych uwarunkowań chorób jak również w wykrywaniu mutacji somatycznych w badanych genach.
Hybrydyzacja Northern (ang. Northern blot hybridization)
Jest to metoda służąca detekcji kwasów rybonukleinowych (RNA). Najczęściej stosuje się ją do badania aktywności określonych genów(badanie ekspresji genów).
Metodyka zbliżona jest do hybrydyzacji Southern:
- rozdział elektroforetyczny RNA na żelu w warunkach denaturujących,
- przeniesienie RNA na odpowiednią membranę,
- utrwalenie RNA na membranie,
- hybrydyzacja RNA z sondą,
- odpłukanie nadmiaru sondy i detekcja.
Sonda daje sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.
Hybrydyzacja DOT – BLOT
- metoda półilościowa,
- umożliwia jednoczesne wykrywanie i identyfikację wielu próbek na tym samym filtrze,
- pozwala na bezpośrednie stosowanie komórek hodowanych in vitro lub bakterii w miejsce kwasów nukleinowych,
- stosowana do wykrywania wirusów w diagnostyce chorób zakaźnych zwierząt chodowlanych.
DNA Fingerprinting (genetyczny odcisk palca)
- Metoda oparta na hybrydyzacji Southerna.
- Opracowana w 1984 roku przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa.
- Polega na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów DNA.
- Wykorzystuje obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem repeats) – zmienna liczba tandemowych powtórzeń.
Występowanie w eukariotycznym DNA sekwencji powtórzonych, cechujących się dużą zmiennością, nadaje DNA poszczególnych osobników cechy indywidualne.
Metodyka:
- trawienie wyizolowanego DNA odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, które tną kwasy nukleinowe w specyficznych miejscach,
- rozdzielenie i sortowanie poprzez rozdział elektroforeteczny pocięte fragmenty DNA,
- przeniesienie rozdzielonych fragmentów DNA na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzacja z wyznakowanymi sondami,
- detekcja.
W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznajacymi jednocześnie od kilkunastu do kilkudziesięciu loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny
obraz fragmentów DNA tzw. DNA fingerprint.
Zastosowanie:
- badania medyczno – sądowe,
- ustalanie ojcostwa.
PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction)
- Należy do najczęściej stosowanych technik biologii molekularnej.
- W znaczny sposób przyśpieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.
- Umożliwia specyficzną amplifikacje in vitro wybranych odcinków DNA i RNA.
- Charakteryzuje się wysoką czułością.
Rys historyczny
- Izolacja polimerazy DNA z Thermus aquaticus (Chien 1974).
- Wydłużanie starterów przy udziale fragmentu Klenowa polimerazy I z E.coli (Panet i Khorana 1974).
- Cykliczne wydłużanie starterów (Saiki i wsp. 1985).
- Zastosowanie termostabilnej polimerazy (Mullis i Faloona 1987, Saiki i wsp. 1998).
- Klonowanie genu (Lawyer i wsp. 1989).
Rekordy
1. Długość fragmentu 6 kpz (obecnie 40 kpz fag lambda)
Ponce MR, Micol JL. PCR amplification of long fragments.
Nucleic Acids Res. 20, 623, 1992
2. Pojedynczy włos
Higuchi R., von Beroldingen C.H., Sensabauch S.A., Erlich H.A.
DNA typing from single cells. Nature 340, 35-42, 1988
3. Pojedyncza komórka
Li H., Gyllensten U.B., Cui X., Saiki R.K., Erlich H.A., Arnheim N.
Amplification and analysis of DNA sequences in single human
sperm and diploid cells. Nature 335, 414-417, 1988
4. Pojedynczy oocyt
Coutelle C., Williams C., Handyside A., Hardy K., Winston R.,
Williamson R. Genetic analysis of DNA from single human
oocytes: a model for preimplantation diagnosis of cystic fibrosis.
Br. Med.. J. 299, 22-24, 1989
Założenia reakcji
- Technika enzymatycznej amplifikacji określonych sekwencji DNA.
- Specyficzność reakcji zapewniają dwa startery komplementarne do sekwencji docelowej.
- Czułość reakcji pozwala amplifikować DNA pojedynczych genów ponad 1 000 000 razy mimo obecności innych sekwencji.
- Możliwość amplifikacji pojedynczych matryc.
Przebieg reakcji, cykle reakcji PCR:
- Denaturacja wstępna - 92-95 ºC
- Cykle (25-35): Denaturacja - 92-95 ºC, Wiązanie starterów - 40-62 ºC, Synteza - 68-72 ºC
- Synteza końcowa - 68-72 ºC
- Przechowywanie - 4 ºC
Skład mieszaniny reakcyjnej: Matryca DNA (RNA), Startery, dNTP, MgCl2, Polimeraza Taq, Bufor
Przebieg
1.
denaturacja 94-95ºC – rozplecenie podwójnej nici DNA, czas ok. 30-60s
2.
wiązanie starterów – przyłączanie (hybrydyzacja) starterów do matrycy ustalana doświadczalnie w zależności od składu nukleotydowego starterów czas ok. 30-60 s
3.
synteza nici przez polimeryzację Taq 72ºC- na tym etapie zachodzi właściwa amplifikacja pożądanego fragmentu genu czas ok. 30-60s
- reakcja PCR prowadzi do wzrostu ilości pożądanego fragmentu DNA
- przerost ilości produktu wzrasta 2^n, gdzie n oznacza liczbę cykli, tak więc liczba matryc wzrasta wykładniczo np., po 30 cyklach liczba matryc wynosi 107 374 824 (2^30)
- produkty jednego cyklu amplifikacji służą jako matryca dla następnego cyklu
- produkt PCR jest dwuniciowym fragmentem DNA, którego końce określone SA przez sekwencję obu starterów
Analiza produktów PCR
1. Elektroforeza w żelach agarozowych: barwienie bromkiem etydyny, autoradiografia.
2. Elektroforeza w żelach poliakryloamidowych: barwienie bromkiem etydyny, srebrzenie, autoradiografia, fluorografia.
Zastosowanie PCR:
- klonowanie (YAC, BAC, minigeny), hybrydyzacja (klony cDNA, produkty PCR), amplifikacja
- analiza funkcji i ekspresji genów, diagnostyka prenatalna, wykrywanie GMO
- mikrobiologiczne – wykrywanie bakterii, wirusów, pasożytów (np. wirus HIV, prądki gruźlicy)
- onkologia – wykrywanie mutacji w onkogenach, genach supresorowych, monitorowanie przebiegu choroby, określenie predyspozycji do chorób nowotworowych
- wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych
- transplantologia – badania zmienności genów HLA decydujących o przyjęciu/odrzuceniu przeszczepu
- medycyna sadowa – badania ojcostwa, kryminalistyka, identyfikacja osobnicza
RT-PCR PCR (ang. Reverse transcriptase PCR)
Matrycą wyjściową jest mRNA, które w procesie odwrotnej transkrypcji jest przepisywane na komplementarne DNA (ang. complementary DNA – cDNA). Następnie cDNA ulega amplifikacji, jak w
zwykłym PCR.
Zastosowanie: Badanie ekspresji genów.
PCR multipleks
Metoda polega na jednoczesnej amplifikacji kilku fragmentów DNA, różniących się wielkością, co w praktyce polega na użyciu w jednej mieszaninie reakcyjnej kilku par starterów.
Zastosowanie: Jednoczesna amplifikacja kilku regionów jednego lub kilku genów. W jednej reakcji uzyskać można nawet 13 amplikonów.
PCR-RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism PCR)
Połączenie reakcji PCR z analizą restrykcyjną. Produkty amplifikacji poddaje się działaniu enzymu restrykcyjnego i porównuje wzór powstałych prążków.
Zastosowanie: Wykrywanie znanych mutacji/polimorfizmów. Analiza bezpośrednia – mutacje. Analiza pośrednia – polimorfizmy
Real-time PCR (PCR w czasie rzeczywistym)
Metoda ilościowa pozwalająca na obserwowanie amplifikacji w czasie rzeczywistym. Wraz z przybywaniem produktów PCR wzrasta intensywność fluorescencji rejestrowanej przez detektor.
Odzwierciedlone jest to w postaci wykresu na monitorze komputera.
Zastosowanie: Pomiar liczby cząsteczek wirusów lub bakterii w materiałach klinicznych, u
możliwia monitorowanie postępów leczenia (określenie wyjściowego poziomu wiremii lub
bakteriemii jest wskazaniem koniecznym do rozpoczęcia właściwego leczenia).
Nested-PCR (PCR gniazdowy)
Stosowane są dwie pary starterów: zewnętrzna (komplementarna do końców poszukiwanej sekwencji) i wewnętrzna (przyłącza się przyśrodkowo w stosunku do pierwszej pary starterów). Produkt
powstały po amplifikacji z pierwszą parą starterów poddaje się kolejnej amplifikacji z druga parą. Zapewnia to większą specyficzność metody.
Zastosowanie: Szybka diagnostyka zakażeń wirusowych.
RAPD-PCR (ang. random amplified polymorphic DNA)
...
Plik z chomika:
que-hiciste
Inne pliki z tego folderu:



2.doc (222 KB)
1.doc (200 KB)
 Wykłady.doc (226 KB)
Choroby monogenowe.doc (32 KB)
 Ćwiczenia.doc (200 KB)
Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin





Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dział Pomocy
Opinie


Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Copyright © 2012 Chomikuj.pl
 Egzamin
GENETYKA VI
 Materiały
 Ściągi 2014
 Seminaria