markery dna - Janusz Piechota

MARKERY MOLEKULARNE
dr Janusz Piechota
dr Magdalena Wołoszyńska
Plan wykładów:
• Definicja słowa „marker”
• Markery związane z kwasami nukleinowymi
 rodzaje
 wykrywanie
 zastosowanie w diagnostyce medycznej, medycynie sądowej,
archeologii, analizie behawioralnej, systematyce organizmów żywych
• Wybrane przykłady markerów białkowych – przykłady wykorzystania w
diagnostyce medycznej, podstawowe metody wykrywania markerów
białkowych.
MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE
Definicje markerów
„Marker” – ang. znacznik, wskaźnik
Marker molekularny – cząsteczka DNA, RNA lub inna cząsteczka
biochemiczna, której występowanie lub postać (np. sekwencja) odróżnia dwa
stany. Dwoma rozróżnianymi stanami mogą być np. dwie różne osoby, lub dwa
stany fizjologiczne (stan zdrowia i choroby), obecność patogenu itp.
MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE
Definicje markerów
Marker biochemiczny – substancja wielkocząsteczkowa umożliwiająca
odróżnienie organizmu lub komórki prawidłowej od zmienionej chorobowo (np.
nowotworowej)– białko, aktywność enzymatyczna, cząsteczka będąca
wynikiem aktywności (lub braku aktywności) enzymu.
MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE
Przykłady typowych markerów biochemicznych/molekularnych
LDH (dehydrogenaza mleczanowa)
• Katalizuje ostatni etap szlaku glikolitycznego – przekształcenie pirogronianu
w mleczan
• U człowieka występuje 5 izomerów (LDH1-LDH5), różniących się
specyficznością tkankową. W surowicy występują wszystkie, ale największą
aktywność posiadają izoformy LDH1 i LDH2 występujące głównie w sercu.
• Poziom LDH we krwi silnie wzrasta we wczesnym okresie zawału mięśnia
sercowego.
• Poziom LDH we krwi jest podwyższony w różnych chorobach wątroby
MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE
Przykłady typowych markerów biochemicznych/molekularnych
enzymy wątrobowe: aminotransferazy ALAT i AspAT i alkaliczna fosfataza
• ALAT (aminotransferaza alaninowa) – przekształca pirogronian w alaninę
(izoforma cytozolowa) lub na odwrót (izoforma mitochondrialna)
• AspAT (aminotransferaza asparaginowa) – przekształca szczawiooctan w
asparaginian (izoforma cytozolowa) lub na odwrót (izoforma mitochondrialna)
• alkaliczna fosfataza – katalizuje defosforylację estrów fosforanowych.
Optimum działania w środowisku zasadowym.
• Podwyższona aktywność we krwi: nieprawidłowa funkcja wątroby, wysoka
aktywność: uszkodzenie wątroby, marskość wątroby.
•
Badania aktywności enzymów wątrobowich połączonych oznaczaniem poziomu
bilirubiny nazywa się próbami wątrobowymi.
MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE
Przykłady typowych markerów biochemicznych/molekularnych
Bilirubina – powstaje na drodze rozpadu
hemu uwolnionego z hemoglobiny. Cały proces
zachodzi w śledzionie, wątrobie i szpiku kostnym
podczas niszczenia czerwonych krwinek.
Podwyższony poziom wraz z enzymami wątrobowymi – zaburzenie funkcji
wątroby
Podwyższony izolowany poziom – zespół Gilberta (choroba metaboliczna
spowodowana mutacją w genie UGT1A1 kodującym UDPglukuronylotranferazę, prowadzącą do zaburzeń metabolizmu bilirubiny w
wątrobie.
Wysoki poziom – hiperbilirulemia (żółtaczka) – wskazuje na uszkodzenie wątroby
spowodowane np. wirusowym zapaleniem wątroby (HAV, HBV, HCV).
MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE
Cechy dobrego markera molekularnego
•
Łatwy do wykrycia za pomocą specyficznej metody
•
Niskie koszty wykrycia/określenia poziomu
•
Możliwie specyficzny dla danego stanu chorobowego
•
Diagnoza w próbce, którą łatwo pobrać od człowieka (osoby zdrowej,
pacjenta itp.). Idealnie, jeżeli obecny jest w moczu, ślinie, krwi, włosach,
skórze.
MARKERY MOLEKULARNE – DEFINICJA i RODZAJE
Marker genetyczny – charakterystyczna właściwość organizmu,
wykorzystywania do określenia jego genotypu. Zwykle jest to gen
występujący przynajmniej w dwóch łatwo rozróżnialnych allelach. Markery
genetyczne można wykorzystać do rozróżnienia osobników, gatunków,
szczepów mikroorganizmów, jak również do określenia położenia innych
genów w genomie (tzw. mapy genowe).
Markery morfologiczne – cechy zewnętrzne organizmu, będące wynikiem
ekspresji genów. Są łatwe do zaobserwowania, ale posiadają wiele wad
(ograniczona liczba, mała ilość alleli, epistaza, wpływ środowiska).
Markery DNA – sekwencje DNA występujące w dwóch
lub większej liczbie łatwych do rozróżnienia wersji (allelach). Stosunkowo
łatwe do analizy (wiele technik detekcji). Dla wielu schorzeń i cech nie
przypisano genów, które leżą u ich podstawy.
Markery biochemiczne/molekularne – są bezpośrednio oparte na
właściwościach kwasów nukleinowych. Np. białka o zmienionej sekwencji,
enzymy o zmienionej aktywności, zmieniony poziom związków
drobnocząsteczkowych, będących wynikiem działania enzymów itp.
Geny jako markery molekularne
Geny odpowiadające fenotypom rozróżnialnym wzrokowo
Różne fenotypy = różne allele
Muszka owocowa – barwa ciała, kolor oczu
geny koloru oczu – czerwony, jasnoczerwony, cynober, kolor granatu, cielisty, sepia, szkarłat, różowy, purpura, bordo
Markery biochemiczne – allele wielokrotne w wielu istotnych genach
Grupy krwi
Białka immunologiczne – antygeny leukocytów człowieka
(HLA – ang. Human leukocyte antigens)
HLA-DRB1 – 59 alleli
HLA-B – 60 alleli
Geny jako markery molekularne
Czasami markerem genetycznym może być stwierdzenie
obecności danego genu lub cechy, którą on warunkuje.
Przykłady:
Markerem transformacji bakterii są geny nadające
opornoć na antybiotyki – oporność na antybiotyk
oznacza posiadanie określonego genu wprowadzanego do
komórki bakteryjnej podczas transformacji.
Wykrywanie patogenów (wirusów, bakterii grzybów)
warunkujących określone choroby może być wykonywane
poprzez wykrywanie genów (sekwencji DNA)
charakterystycznych dla danego patogenu. Wykazanie
obecności danego genu wskazuje na obecność
określonego. Zatem geny takie są markerami określonej
choroby (np. SeptiTest).
Markery DNA/RNA
Sekwencja DNA/RNA występująca w dwóch lub większej
liczbie łatwych do odróżnienia wersji.
Obecność sekwencji DNA/RNA lub jej brak wskazujący
na określony stan fizjologiczny (np. zakażenie określonym
patogenem.
Obecność sekwencji w różnych wariantach jest wynikiem
istnienia mutacji i polimorfizmów.
Polimorfizmy (mutacje) DNA
 Polimorfizm długości prostych sekwencji (ang. SSLP – simple sequence
length polymorphism)
- minisatelity – zmienna liczba powtórzeń tandemowych (ang. VNTR –
variable number of tandem repeats),
jednostka powtarzana to kilkanaście lub kilkadziesiąt nukleotydów
- mikrosatelity – proste powtórzenia tandemowe (ang. STR – simple
tandem repeats lub SSR – simple sequence repeats)
jednostka powtarzana to 1 – 6 nukleotydów
 Polimorfizmy punktowe (ang. SNP – single nucleotide polymorphism),
pojedyncze mutacje punktowe
•
Sekwencje powtórzone – 40% ludzkiego genomu
rozproszone
tandemowe
krótkie (SINES)
długie (LINES)
minisatelity
mikrosatelity
130 – 300 nt
10% genomu
Alu – 1 mln kopii
kilka tys. nt
20% genomu
10 – 100 nt
1 – 6 nt
w centromerach
kilka tys. loci
co 6 – 10 kpz
tworzenie par chromosomów
są w centromerach:
homologicznych, rekombinacja sekwencja (GGAAT)n
struktura chromosomów –
są w centromerach: sekwencja α,
trwałość transkryptów,
regulacja ekspresji
Inne typy polimorfizmów DNA
RFLP (restriction fragment length polymorphism) – polimorfizm
długości fragmentów restrykcyjnych.
PCR-RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
namnożonych w reakcji PCR.
AFLP (Amplified fragment length polymorphism) – polimorfizm długości
powielonych fragmentów DNA
cDNA-AFLP – podobnie, jak AFLP, tylko materiałem do trawienia
enzymem restrykcyjnym jest cDNA.
RFLP (restriction fragment length polymorphism) – polimorfizm
długości fragmentów restrykcyjnych.
Wykrywa polimorfizmy typu SNP i VNTR
SNP
VNTP
PCR-RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
namnożonych w reakcji PCR.
Bardzo wygodny w użyciu. Najczęściej jest to polimorfizm typu SNP.
AFLP (Amplified fragment length polymorphism) – polimorfizm długości
powielonych fragmentów DNA
Wykrywa polimorfizmy typu SNP i VNTR.
Szczególnie przydatny do wykrywania nowych polimorfizmów
cDNA-AFLP – podobnie, jak AFLP, tylko materiałem do trawienia
enzymem restrykcyjnym jest cDNA.
Wykrywa polimorfizmy typu SNP.
Szczególnie przydatny do wykrywania polimorfizmów w sekwencjach
ulegających ekspresji.
Polimorfizmy typu RFLP i AFLP to nie
jest specjalna klasa polimorfizmów
DNA. Są raczej wynikiem stosowania
określonych technik do ich
wykrywania!!!
Minisatelity
•
•
•
•
•
•
Można je zapisać w postać motywu nukleotydów typu (TCAGGC)n;
Długość sekwencji powtórzonej: 6-100 nukleotydów (najczęściej
kilkadziesiąt);
Wszystkie powtórzenia w tej samej orientacji;
Ilość powtórzeń bywa bardzo różna (od kilku do 1000);
Duża zmienność powtórzeń w populacji – nadają się do identyfikacji
poszczególnych osobników.
Zmienność ilości powtórzeń jest generowana w wyniku błędów w
rekombinacji.
Minisatelity
HaeIII
5'-GGCC-3'
Fragmenty restrykcyjne zawierające VNTR – duża zmienność
VNTR 17-pz powtórzony 70-450 razy wykazuje różnorodność długości od
1.2 do 7.6 kpz
Trzy allele VNTR (A, B i C) u sześciu osób
Trzy różne allele – 3
układy
heterozygotyczne i 3
homozygotyczne
Dla n różnych alleli
(n)x(n+1)/2 możliwych
genotypów
Markery DNA – biologiczny
dowód tożsamości
Polimorfizmy VNTR są idealnymi markerami wykorzystywanymi w
medycynie sądowej i kryminalistyce.
Dobrze nadają się do określania podobieństwa/pokrewieństwa
pomiędzy dwoma próbkami DNA.
Są pomocne np. w ustalaniu ojcostwa, sprawców gwałtów itp.
Markery DNA – biologiczny
dowód tożsamości
Kryteria, jakie muszą spełniać markery genetyczne stosowane w ekspertyzie sądowej
Sekwencje satelitarne w ustalaniu pokrewieństwa
•
•
•
•
•
•
•
Ustalenie genetycznych cech śladu biologicznego jest dla sądów, prokuratury i
policji ważnym i najbardziej obiektywnym dowodem, chociaż oficjalnie jest tylko
dowodem pomocniczym.
Ustalanie pokrewieństwa: łączenie rodzin, sprawy spadkowe, obowiązek
alimentacyjny.
Matka – kobieta, która urodziła dziecko; ojciec – mężczyzna wskazany przez
matkę – brak zgody – sporne ojcostwo.
Dzieci urodzone w związku małżeńskim: „Jeżeli dziecko urodziło się w czasie
trwania małżeństwa albo przed upływem 300 dni od jego ustania lub
unieważnienia, domniemywa się, że pochodzi ono od męża matki.”
Zaprzeczenie ojcostwa wymaga „wykazania niepodobieństwa, aby mąż matki
dziecka mógł być ojcem tegoż dziecka”.
Dzieci urodzone poza małżeństwem: uznanie albo orzeczenie sądowe.
Powództwo o ustalenie ojcostwa (jeden mężczyzna w jednym procesie): matka
przedstawia fakty uprawdopodabniające ojcostwo danego mężczyzny, mężczyzna
musi udowodnić, „że niepodobieństwem jest” aby był ojcem.
Ekspertyza genetyczna jest zlecana przez sąd lub wykonywana na zlecenie
prywatne jeśli zgadzają się na to prawni opiekunowie dziecka.
Uzasadnienie Sądu Najwyższego do wyroku z 2001
roku:
„Wynik badania DNA przeprowadzony przez uznaną
placówkę naukową wyposażoną w nowoczesną
aparaturę i opracowany, tzn. wyrażający w
liczbach zarówno szansę, jak i prawdopodobieństwo
ojcostwa pozwanego, odzwierciedla w sposób
praktycznie pewny (co najmniej w tysięcznych
częściach procentu) rzeczywiste związki biologiczne
między parą rodzicielską a dzieckiem.”
Lokalizacja markerów
W sprawach kryminalnych stosuje się zazwyczaj 4 do 6 sond VNTR
Markery VNTR rozróżniają do 30 alleli w jednym locus.
Może istnieć 200 – 300 genotypów w jednym locus.
6 markerów może dostarczyć aż do 4 trylionów różnych profili DNA
Częstotliwość występowania alleli VNTR D1S80 w populacji
Jeśli dwa allele mają częstotliwości p i q w populacji, to dla osobnika
heterozygotycznego prawdopodobieństwo P posiadania obu alleli wynosi:
P= 2pq
Oczekiwana częstotliwość danego profilu DNA w populacji – iloczyn
prawdopodobieństw dla każdego locus
Prawdopodobieństwo Profilu = (P1) (P2) ... (Pn)
Diagnostyka prenatalna ofiar gwałtów – ustalanie ojcostwa
DNA profiling
SLS (ang. single locus system) – analiza pojedynczego locus, analiza jednopunktowa
Aby potwierdzić ojcostwo lub ustalić pokrewieństwo za pomocą SLS należy wykonać
badania co najmniej 4 (7) niezależnych loci.
Sondy
Opis sondy:
- nazwa:
D4S139 – specyficzne locus na chromosomie 4
DNA
chromosom
-
precyzyjna lokalizacja sondy
S – unikatowy segment DNA
Z – fragment wysoce powtarzalny w danym miejscu
F – rodzina homologicznych fragmentów na licznych
chromosomach
Sprzężenia ze znanymi loci
Liczba alleli
Typ dziedziczenia
Częstość mutacji i rekombinacji
Wielkość w liczbie par zasad
DNA fingerprinting
MLS (ang. multilocus system) – jednoczesna analiza wielu loci,
analiza wielopunktowa –Jeffreys, 1985
DNA trawiono enzymem HinfI, zastosowano sondę (CAC)5
Sondy wielu loci
•
Sondy Jeffreysa 33.15 i 33.6 – wielokrotne powtórzenie sekwencji 16 i 37 zasad,
pochodzą z genu mioglobiny ludzkiej
dziedziczonych alleli
- hybrydyzują z 16 – 19 prążkami
- stosowane razem pozwalają zbadać 35 niezależnie
- 20-25% oznaczanych alleli jest wspólnych dla
osób niespokrewnionych, a 62% dla rodzeństwa niejednojajowego
•
Sonda MZ1.3 – dziki fag M13
•
Sondy oligonukleotydowe (CAC)5, (GTG)5 i (GACA)4 – hybrydyzują z krótkimi
powtarzalnymi sekwencjami leżącymi w wielu miejscach genomu
Szansa powtórzenia się wzoru fragmentów oznaczanych sondą MZ1.3 u dwóch
niespokrewnionych osób wynosi 1 na 6x1012
DNA trawiono HinfI,
Hybrydyzacja z sondą MZ1.3
Długość żelu – 140 mm
Grubość prążka – 1.4 mm
100 stref elektroforetycznych
W każdej strefie jedna z 8 kombinacji
prążków
Współczynnik wartości prążków
wspólnych BSR (band sharing rate):
BSRAB= SAB/2 x (1/nA+1/nB) x 100%
BSR dla osób niespokrewnionych: do
45%
Dla par rodzic-dziecko: 35 – 85%
Jeśli BSR powyżej 45% - uznanie
ojcostwa, poniżej 35% - wykluczenie
1 – pozwany, 2 – dziecko, 3 – matka, 4 – DNA pozwanego i dziecka
BSR = 28%
BSR = 65%
Próba wykorzystania VNTR jako markera zwiększonego ryzyka
wystąpienia defektów centralnego układu nerwowego (ang. NTD –
neural tube defect)
NTD
- poważne defekty polegające na niedorozwoju mózgu, rdzenia kręgowego i tkanek
okrywających te organy.
- wynikają z niekompletnego zamknięcia cewki nerwowej, które powinno nastąpić w 3 i
4 tygodniu ciąży.
- rozszczep kręgosłupa – bardzo częsty defekt, w USA dotyka jednego na 1000
noworodków.
Przyczyny NTD
Zaburzony metabolizm homocysteiny - dzieci chore i ich matki mają podwyższony
poziom homocysteiny
homocysteina
kwas foliowy
MTHFR
metionina
MTHFR – metylenetetrahydrofolate
CBS – cystathionine β-synthase
CBS
cystationina
Mutacje w genach kodujących MTHFR i CBS
 MTHFR 677 C > T – zmniejszona aktywność MTHFR
podwyższony poziom homocysteiny
 CBS 31 pz VNTR – powtórzenie o długości 31 pz, którego liczba powtórzeń
osiąga 15-21,
- 18 powtórzeń to najpowszechniejszy allel
- aktywność CBS maleje wraz ze wzrostem liczby powtórzeń
- poziom homocysteiny rośnie
Czy te mutacje mogą być markerami zwiększonego
ryzyka NTD?
Zaobserwowano wyraźny związek między CBS VNTR i polimorfizmem
MTHFR 677 C>T a poziomem homocysteiny, ale nie ma korelacji z ryzykiem NTD.
Polimorfizmy VNTR w genie DRD4 oraz w promotorze
genu 5HTT a osobowość
DRD4 – receptor dopaminowy D4
- w egzonie 3 genu DRD4 występuje zmienna liczba powtórzeń o
długości 48 pz (48 pz VNTR)
- najpowszechniejsza forma genu zawiera 4 powtórzenia, nieco
rzadsza jest forma posiadająca 7 powtórzeń
- występowanie 7 powtórzeń jest skorelowane z 2-3- krotnym
spadkiem wiązania receptora z cyklazą adenylową
5HTT – gen transportera serotoniny
- w promotorze tego genu występuje 22 pz VNTR
- dwa warianty: długi – 16 powtórzeń – częsty
krótki – 14 powtórzeń
- forma krótka powoduje zmniejszenie wydajności transkrypcji
genu transportera serotoniny i wiązania receptora z serotoniną
Dopamina
– należy do neurotransmiterów katecholaminowych
(epinefryna, norepinefryna, L-dopa)
- nadprodukcja dopaminy w mózgu oraz nadwrażliwość
receptorów powoduje objawy psychotyczne i schizofrenię
- niedobór – choroba Parkinsona
- receptor D4 – inhibicja cyklazy adenylowej,
Serotonina
– należy do grupy neurotransmiterów aminokwasowych i ich
pochodnych
- działa poprzez receptor związany z białkiem G
- powoduje gwałtowny wzrost stężenia cAMP w komórce
- wiele leków antydepresyjnych (Prozac) hamuje zwrotne
wychwytywanie serotoniny – w efekcie w synapsach jest
więcej serotoniny
• Novelty seeking – osoby wykazujące tę cechę są „ciekawe świata”, łatwo
się nudzą, są impulsywne, ekstrawaganckie, nieuporządkowane
• Externalizing behavior – agresja wobec przedmiotów i osób, kłótliwość,
skłonność do kradzieży, kłamstwa, oszukiwania, brak samokontroli,
niezdolność do rozwijania i utrzymywania satysfakcjonujących relacji z
ludźmi
Allele DRD4 i 5HTT a osobowość
 Kombinacja allelu DRD4 zawierającego 7 powtórzeń i przynajmniej
jednego długiego allelu 5HTT koreluje ze wzrostem współczynnika
„poszukiwania nowości” (ang. novelty seeking)


Brak allelu DRD4 zawierającego 7 powtórzeń przy jednoczesnej
homozygotyczności pod względem krótkiego allelu 5HTT – gorsza
orientacja, większa skłonność do złości
Krótki allel 5HTT koreluje z negatywnymi cechami emocjonalności
 Allel DRD4 zawierający 7 powtórzeń zwiększa prawdopodobieństwo
wystąpienia zespołu niedoboru koncentracji i nadpobudliwości (ang. ADHD
attention deficit/hyperactivity disorder)
 Allel DRD4 zawierający 7 powtórzeń występuje częściej u rocznych dzieci,
które nie mają dobrego kontaktu z matką
 Dzieci posiadające dwa długie allele 5HTT wykazywały częściej
„externalizing behavior’ jeśli ich rodzice byli nieprzystosowani do
funkcjonowania w społeczeństwie
 Jeden bądź dwa krótkie allele 5HTT sprzyjają externalizing behavior”
jeśli w rodzinie występował alkoholizm