wzór strony tytułowej pracy doktorskiej
advertisement
Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Wydział Lekarski Piotr Wójcik Analiza ekspresji genu SNAI2 (SLUG) i metylacji jego promotora w rakach jelita grubego względem stopnia zaawansowania, niestabilności mikrosatelitarnej DNA oraz mutacji genów KRAS i BRAF. Praca doktorska Promotor: dr hab. Dariusz Adamek Pracę wykonano w Katedrze Patomorfologii UJ CM Kierownik Katedry: dr hab. Dariusz Adamek Kraków, 2010 Spis treści SPIS TREŚCI....................................................................................................................................................... 2 1. SPIS SKRÓTÓW ........................................................................................................................................ 3 2. WSTĘP ..................................................................................................................................................... 4 2.1 ZABURZENIA GENETYCZNE I EPIGENETYCZNE W RAKU JELITA GRUBEGO. ..................................................................... 5 2.1.1 Niestabilnośd chromosomalna ........................................................................................................ 5 2.1.2 Niestabilnośd mikrosatelitarnego DNA i metylacja genów supresorowych .................................. 10 2.1.3 Molekularna klasyfikacja raków jelita grubego ............................................................................ 15 2.2 CZYNNIKI PREDYKCYJNE PRZERZUTÓW W RAKACH JELITA GRUBEGO......................................................................... 19 2.3 GENY KRAS I BRAF ..................................................................................................................................... 19 2.4 GEN SNAI2 (SLUG) .................................................................................................................................... 22 3. CEL PRACY ............................................................................................................................................. 27 4. MATERIAŁ I METODY............................................................................................................................. 28 4.1 MATERIAŁ .................................................................................................................................................. 28 4.2 METODY .................................................................................................................................................... 30 4.2.1 ekspresja genu SNAI2 (SLUG) ........................................................................................................ 30 4.2.2 izolacja DNA .................................................................................................................................. 31 4.2.3 analiza metylacji promotora genu SNAI2 (SLUG) .......................................................................... 32 4.2.4 analiza niestabilności mikrosatelitarnego DNA ............................................................................. 36 4.2.5 analiza mutacji genów KRAS i BRAF .............................................................................................. 41 4.2.6 stosowane testy statystyczne ........................................................................................................ 48 5. WYNIKI .................................................................................................................................................. 49 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 6. LOKALIZACJA I STOPIEO ZAAWANSOWANIA. ....................................................................................................... 49 NIESTABILNOŚD MIKROSATELITARNEGO DNA .................................................................................................... 50 MUTACJE GENÓW KRAS I BRAF .................................................................................................................... 51 EKSPRESJA SNAI2 ....................................................................................................................................... 52 METYLACJA PROMOTORA GENU SNAI2 ........................................................................................................... 60 PODSUMOWANIE WYNIKÓW .......................................................................................................................... 67 OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA ..................................................................................................... 69 6.1 6.2 6.3 6.4 EKSPRESJA GENU SNAI2 ............................................................................................................................... 69 METYLACJA PROMOTORA GENU SNAI2 ........................................................................................................... 72 NIESTABILNOŚD MIKROSATELITARNEGO DNA .................................................................................................... 78 MUTACJE GENÓW KRAS I BRAF .................................................................................................................... 79 7. WNIOSKI ............................................................................................................................................... 83 8. STRESZCZENIE ....................................................................................................................................... 85 9. ABSTRACT ............................................................................................................................................. 89 10. BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................................... 92 2 1. Spis skrótów APS - nadsiarczan amonu (ang. ammonium persulfate) CG (wyspy) - regiony DNA o zwiększonej częstości występowania sekwencji CG CIMP – fenotyp metylowanych wysp CG (ang. CG island methylator phenotype) CIMP-H – częsta metylacja wysp CG CIMP-L – rzadka metylacja wysp CG DNA - kwas deoksyrybonukleinowy EMT – przemiana nabłonkowo-mezenchymalna (ang. epithelial-mesenchymal transition) FAM – karboksyfluoresceina FAP – rodzinna polipowatość gruczolakowata (ang. familial adenomatous polyposis) HEX - heksachloro-6- karboksyfluoresceina HNPCC – dziedziczny rak jelita grubego niezwiązany z polipowatością (ang. hereditary nonpolyposis colorectal cancer) IS – istotne statystycznie MAP kinazy, MAPK – element szlaku sygnalizacyjnego, przekazującego sygnał od receptorów czynników wzrostu, związany z proliferacją (ang. Mitogen Activated Protein kinases) MSP - metoda analizy metylacji promotorów genów oparta na reakcji PCR (ang. Methylation-Specyfic PCR) MSI - niestabilność mikrosatelitarnego DNA (ang. Microsatellite Instability) MSI-L – niska niestabilność mikrosatelitarnego DNA MSI-H – wysoka niestabilność mikrosatelitarnego DNA MSS – stabilny mikrosatelitarnie (ang. Microsatellite Stable) NS – nieistotne statystycznie PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction) rpm – obroty na minutę (ang. revolutions per minute) RTK – receptor o aktywności kinazy tyrozynowej (ang. Receptor Tyrosine Kinase) SSCP - polimorfizm konformacyjny jednoniciowego DNA (ang. Single-Stranded Conformational Polymorphism). Metoda wykrywania mutacji i polimorfizmów. TBE – bufor Tris/kwas borowy/EDTA (ang. Tris-Borate-EDTA) TEMED - N,N,N’,N’- tetrametyloetylenodiamina. Katalizator polimeryzacji akrylamidu. TET - tetrachloro-6-karboksyfluoresceina 3 2. Wstęp Rak jelita grubego jest jedną z częściej rozpoznawanych chorób nowotworowych w Polsce. Według danych Centrum Onkologii, w 2006 roku rozpoznano nowotwór złośliwy jelita grubego u 13624 pacjentów, porównując z rokiem 1999 był to wzrost o 2826 przypadków. Stanowi drugą w kolejności przyczynę zgonu z powodu choroby nowotworowej u mężczyzn (po raku płuc) oraz trzecią u kobiet (po rakach płuc i sutka). W 2006 roku odnotowano 8437 zgony i w porównaniu z rokiem 1999 było ich o 1298 więcej [1]. Im bardziej zaawansowana jest choroba w momencie diagnozy tym mniejsza szansa na 5-letnie przeżycie pacjenta, dlatego poznanie mechanizmów zdolności do migracji i przerzutów jest wciąż aktualnym celem badań molekularnych. liczba zdiagnozowanych przypadków rocznie nowotwory złośliwe jelita grubego w Polsce 14000 13000 12000 11000 10000 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 rok Wykres 1 Zachorowania na nowotwór złośliwy jelita grubego rocznie w Polsce w latach 1999-2006 wg danych Centrum Onkologii [1]. Rok Zachorowania Zgony 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 5195 5310 5464 5607 5943 5956 6215 6063 Mężczyźni 5603 5819 6286 6360 6974 6921 7485 7561 Kobiety 3433 3754 3964 3922 3984 4042 4197 4151 Mężczyźni 3706 3903 4111 4286 4321 4526 4571 4286 Kobiety Tabela 1. Zachorowania i zgony na nowotwór złośliwy jelita grubego rocznie w Polsce wg danych Centrum Onkologii [1]. 4 2.1 Zaburzenia genetyczne i epigenetyczne w raku jelita grubego. 2.1.1 Niestabilność chromosomalna Raki jelita grubego podobnie jak inne raki charakteryzuje niestabilność materiału genetycznego. Najczęściej jest to niestabilność chromosomalna, która przejawia się jako aneuploidia oraz amplifikacje i delecje fragmentów chromosomów. Proces karcynogenezy, związanej z niestabilnością chromosomów, rozpoczyna się zazwyczaj aktywacją szlaku Wnt poprzez uszkodzenie genu APC, co prowadzi do funkcjonowania -kateniny w roli czynnika transkrypcyjnego. W prawidłowych komórkach nabłonkowych -katenina związana jest z transbłonowym białkiem E-kadheryną. Wolna -katenina w cytoplazmie jest fosforylowana przez kompleks białkowy APC/aksyna/kinaza GSK3 i ostatecznie degradowana w proteasomie. Proces fosforylacji i degradacji cytoplazmatycznej -kateniny może być powstrzymany przez pojawienie sygnalizacyjne przyłącza Wnt się się zewnątrzkomórkowego do kompleksu sygnału receptorowego Wnt. Białko Frizzled/LRP zlokalizowanego w błonie komórkowej aktywując w ten sposób cytoplazmatyczne białko Dvl (dishevelled). Następstwem tego procesu jest dysocjacja kompleksu APC/aksyna/kinaza GSK3 fosforylującego -kateninę i związanie aksyny z Dvl w nowo powstałym kompleksie Frizzled/LRP/Dvl/aksyna. Wolna -katenina nie jest już fosforylowana, nie ulega degradacji i zaczyna funkcjonować w roli czynnika transkrypcyjnego aktywującego geny związane z progresją cyklu komórkowego. Ten mechanizm jest aktywny w rozwoju embrionalnym oraz w komórkach krypt jelitowych odpowiedzialnych za regenerację nabłonka jelitowego [2, 3]. W komórce raka jelita grubego aktywność szlaku Wnt wynika najczęściej z mutacji genu APC. Produkt białkowy tego genu liczy 2843 aminokwasów. W jego centralnej części znajdują się domeny wiążące β-kateninę i aksynę. Około 60% mutacji somatycznych zlokalizowanych jest między kodonami 1286 i 1513. Są to kilkunukleotydowe insercje i delecje zmieniające ramkę odczytu lub substytucje, które najczęściej prowadzą do utworzenia kodonu stop w transkrypcie i skrócenia produktu białkowego. W wyniku tych mutacji dochodzi do powstania białka niezdolnego do utworzenia funkcjonalnego kompleksu z aksyną i kinazą GSK3, który mógłby zainicjować degradację -kateniny. Podobnie jak pod wpływem białka Wnt, stabilna -katenina uruchamia ekspresję genów związanych z proliferacją (c-myc, cyklina D1) oraz antyapoptotycznych (surwiwina) [4, 5, 6]. Mutacje APC 5 wykrywane są z podobną częstotliwością w gruczolakach i rakach (około 60%), co może oznaczać, że odgrywają rolę we wczesnych etapach karcynogenezy [7]. Germinalne mutacje APC związane są z dziedzicznym rakiem jelita grubego w postaci zespołu rodzinnej polipowatości gruczolakowatej (FAP - Familial Adenomatous Polyposis). Charakterystyczną cechą tego zespołu jest występowanie mnogich gruczolaków w jelicie grubym (ponad 100), które poprzedzają rozwój raka. Około 25% mutacji germinalnych zlokalizowanych jest w regionie MCR genu (mutation cluster region) między kodonami 1055 a 1309. Z lokalizacją mutacji związany jest przebieg choroby. Najcięższe formy FAP z wczesnym pojawieniem się gruczolaków i szybką progresją do raka związane są z mutacjami blisko kodonu 1300 natomiast mutacje bliżej końców 5’ i 3’ genu prowadzą do rozwinięcia się zespołu FAP o łagodniejszym przebiegu tzw. AFAP (attenuated FAP) z mniejszą liczbą gruczolaków (poniżej 100), które pojawiają się w późniejszym wieku [8, 9, 10]. Istnieje także rzadki zespół MAP (MUTYH associated polyposis) o przebiegu zbliżonym do AFAP i związany z mutacjami germinalnymi genu MUTYH kodującego białko naprawcze DNA [11, 12]. Alternatywą dla mutacji APC są mutacje genu AXIN1 kodującego podjednostkę aksyny. Wykryto je w 11% raków. Również w tym przypadku mutant nie jest zdolny do utworzenia kompleksu fosforylującego -kateninę [13]. Rycina 1. Schemat funkcjonowania APC i β-kateniny w normalnej komórce (A) i nowotworowej (B). 6 Białko APC pełni w komórce jeszcze jedną ważną funkcję. Uczestniczy w segregacji chromosomów poprzez łączenie kinetochoru z mikrotubulami. Za tworzenie połączeń z mikrotubulami odpowiada domena między aminokwasami w pozycjach 2200 i 2400 zwykle tracona w wyniku mutacji skracającej białko. Obecność skróconej formy białka APC w czasie podziału komórki skutkuje luźniejszymi połączeniami chromosomu z mikrotubulami wrzeciona podziałowego oraz zmniejszoną stabilnością samych mikrotubul [14, 15]. Następstwem tych nieprawidłowości są błędy w podziale materiału genetycznego między komórki potomne. W komórkach z ekspresją mutanta APC wykrywane są często chromosomy dicentryczne ściśle związane z obserwowaną w raku aneuploidią. Do wystąpienia zaburzeń w segregacji chromosomów w czasie mitozy wystarcza obecność skróconej postaci białka APC niezależnie od obecności prawidłowej formy, a więc mutant APC ma również cechy onkogenu aktywnie uczestniczącego w procesie karcynogenezy [16, 17, 18]. Inną cechą komórek raka jelita grubego jest amplifikacja genu AURKA kodującego białko Aurora-A. Stwierdzono ją w 29% raków i była związana z niestabilnością chromosomalną [19, 20]. Komórka wykazująca nadekspresję tego genu przechodzi do anafazy w trakcie podziału mimo nieprawidłowości w formowaniu wrzeciona podziałowego i aktywności mitotycznego punktu kontrolnego. Z nadekspresją AURKA wiąże się istotna klinicznie właściwość nowotworów – oporność na leczenie inhibitorem depolimeryzacji mikrotubul, paklitakselem [21]. W osiągnięciu niestabilności chromosomalnej sugeruje się również udział wirusa JC należącego do poliomawirusów. Nosicielami tego wirusa jest większość ludzkiej populacji. Występuje on w formie latentnej u osób z prawidłowo funkcjonującym układem odporności, a do zakażenia dochodzi już we wczesnym dzieciństwie. Obecność jego DNA stwierdzono w 81% próbek pobranych z okrężnicy [22]. Jednak w 35% raków stwierdzono metodą immunohistochemiczną ekspresję antygenu T wirusa, która korelowała z niestabilnością chromosomalną [23]. Zdolność JCV do wywołania aberacji chromosomalnych potwierdzono eksperymentalnie na infekowanych liniach komórkowych [24]. Około 90% raków z niestabilnością chromosomalną to raki aneuploidalne pozostałe 10% jest diploidalne, ale podobnie jak raki aneuploidalne posiadają liczne zaburzenia struktury chromosomów [25]. Raki jelita grubego wykazują częste amplifikacje i delecje konkretnych fragmentów chromosomów. W przypadku heterozygotycznych alleli, utrata jednego z nich obserwowana jest jako utrata heterozygotyczności (LOH). Jedną z najczęściej wykrywanych LOH jest delecja występująca na dłuższym ramieniu chromosomu 18 w locus 7 18q21-23. Stwierdza się ją w 50-80% badanych raków [26, 27, 28, 29]. Ten fragment DNA zawiera trzy istotne geny dla prawidłowego funkcjonowania nabłonka jelitowego DCC, SMAD2 i SMAD4. Białka Smad uczestniczą w przekazywaniu sygnału od receptorów czynników TGFβ i BMP. Utrata wrażliwości na supresyjny wpływ czynników TGFβ w wyniku obniżonej ekspresji Tgfbr2 lub Smad2 związana była z mnogimi gruczolakorakami u transgenicznych myszy z mutacją Apc. W grupie kontrolnej z samą mutacją Apc rozwijały się gruczolaki. Zaburzenia w sygnalizacji TGFβ mogą być niezbędnym elementem w transformacji nowotworowej nabłonka jelitowego [30, 31]. Germinalne mutacje SMAD4 związane są z zespołem polipowatości młodzieńczej, który niesie zwiększone ryzyko raka jelita grubego i żołądka [32]. DCC (Deleted in Colorectal Carcinoma) koduje receptor netryny-1, który wymaga stałej stymulacji ligandem. W przypadku jego nieobecności receptor uruchamia apoptozę komórki. Utrata receptora powoduje, że komórka przestaje być wrażliwa na proapoptotyczny sygnał wynikający z braku ligandu. Prawdopodobnie proces ten ma znaczenie przy przejściu z raka in situ do inwazyjnego [33, 34]. W rakach jelita grubego wykryto utratę heterozygotyczności także w loci innych receptorów netryny. Odsetki raków z LOH dla badanych genów wynosiły: 52% UNC5A (5q35.2), 39% UNC5C (4q21-q23), 26% UNC5B (10q22.1) [35]. Utrata ekspresji Unc5c przyspiesza progresję z gruczolaka do raka u myszy transgenicznych z mutacją Apc [36]. Kolejna częsta delecja dotyczy krótszego ramienia chromosomu 17. Obejmuje ona locus 17p13, gdzie zlokalizowany jest supresorowy gen TP53 ulegający częstym mutacjom w ludzkich nowotworach. LOH w tym fragmencie chromosomu wykrywa się w około 60% raków inwazyjnych [29, 37]. Mutacje genu wykrywane są w 50-75% raków jelita grubego, natomiast rzadko w gruczolakach, co świadczy o ich późnym występowaniu w karcynogenezie [38]. Białko p53 jest odpowiedzialne za zachowanie i przekazywanie prawidłowej informacji genetycznej komórkom potomnym. Uszkodzenie DNA powoduje aktywację przez p53 genu CDKN1A, kodującego białko Cip1 (WAF1/p21). Białko to jest inhibitorem aktywności cyklinozależnych kinaz CDK2 i CDK4, koniecznych do przejścia z fazy G1 cyklu komórkowego do fazy S, co powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G1 i umożliwia naprawę DNA. W przypadku zbyt dużych uszkodzeń DNA, p53 kieruje komórkę na drogę apoptozy poprzez aktywację ekspresji proapoptotycznego genu BAX [39, 40]. W rakach z niestabilnością chromosomalną obserwuje się także utratę ekspresji CDKN1A [41]. Utrata heterozygotyczności w locus 5q21 zdarza się w około 30-40% raków [29, 42]. W tym fragmencie znajdują się geny APC i MCC (Mutated in Colorectal Cancer). MCC jest 8 uważany za potencjalny gen supresorowy. Białko MCC posiada zdolność wiązania β-kateniny w jądrze komórkowym i hamowania w ten sposób szlaku sygnalizacyjnego Wnt [43]. Delecje krótszego ramienia chromosomu 1 (1p) zdarzają się w około 35-50% raków [44, 45]. W locus 1p36.1-p35 znajduje się gen supresorowy EPHB2 kodujący receptor efryny. Efryny i ich receptory kontrolują architekturę nabłonka jelitowego. Ekspresja receptorów jest związana z aktywnością szlaku Wnt i maleje w stronę powierzchni jelita. Natomiast ekspresja efryny jest najwyższa na powierzchni śluzówki i maleje w dół krypty jelitowej. Błonowa lokalizacja obu białek decyduje o konieczności bezpośredniego kontaktu między komórkami. Tylko zróżnicowane komórki, w których ekspresja receptora zanika, mogą osiągnąć powierzchnię śluzówki. Mechanizm ten utrzymuje niedojrzałe komórki progenitorowe we wnętrzu krypty jelitowej. Ekspresja EPHB2 maleje z zaawansowaniem choroby. Stwierdzono ją w 78% gruczolaków, 55% pierwotnych raków, 38% przerzutów do węzłów chłonnych i 33% przerzutów do wątroby [46]. U myszy z mutacją Apc pozbawionych dodatkowo ekspresji EphB rozwijały się gruczolakoraki [47]. Delecje 10q zdarzają się w 17-25% raków. W tym ramieniu chromosomu 10 zlokalizowane są dwa znane geny supresorowe: BMPR1A (10q22.3) oraz PTEN (10q23.3) [48, 49]. BMPR1A koduje receptor białek BMP należących do nadrodziny TGFβ. Mutacje germinalne tego genu podobnie jak SMAD4 związane są z młodzieńczą polipowatością [32] oraz zespołem mieszanej polipowatości [50]. PTEN jest antagonistą szlaku kinazy fosfoinozytolu PI3K/Akt często aktywnego w rakach jelita grubego [51]. W około 20% raków stwierdza się również inaktywujące mutacje punktowe w tym genie [49]. Ponadto częste delecje wykryto w rakach na ramionach chromosomów: 4q (36-63%), 15q (27-44%), 4p (38%), 18p (>35%), 21q (>35%), 8p (27-38%), 14q (31%), Xq (31%), 6q (20%), 9p (16%), 3p (11%). Natomiast amplifikacje często dotyczyły regionów: 20q (6769%), 19 (63%), 16p (56%), 9q (50%), 16q (50%)), 13q21-31 (>50%), 13q (31-45%), 8q2122 (>50%), 8q (33-44%), 17q (44%), 12q (38%), 20p (38%), 1 (31%), 7q (31%), 7p (>35%), 11q (>35%), Xq (36%), 5p (13%), 6p (11%) [27, 52, 53, 54]. Częste aberacje chromosomalne obserwuje się w niepolipowatych rakach jelita, o płaskim typie wzrostu (flat-type carcinoma). Odsetki raków z LOH w poszczególnych loci wynosiły: 18q21-18q23 (81-96%), 4q27-4q28 (32-96%), 17p (92%), 4p14 (87%), 5q21 (6181%), 18p (81%), 1p21-1p22 (72%), 21q21 (74%), 6q16 (72%), 3p12 (66%), 8p24-8p21 (66%), 9p21 (64%), 11q22 (64%), 14q13-14q21 (44-64%), 22q (51%), 15q (41%), 2q (39%), 12q (36%). Częste były amplifikacje w regionach: 20q (92-100%), 7q12-7q11.2 (75%), 9 16p11-16p12 (70%), 19p13 (70%), 9q34 (67%), 19q13 (67%), 13q34 (64%), 13q13 (64%), 17q21 (59%), 22q11 (61%), 8q24 (57%), 1q21 (57%) [55, 56, 57]. Istnieją korelacje między poszczególnymi zmianami w genomie. Zaobserwowano, że w gruczolakach amplifikacje 8q i 13q oraz delecja 18q i amplifikacja 20q często występują razem [58]. W rakach mutacje TP53 korelowały z amplifikacjami 20q, 13q, 8q oraz LOH na 18q, mutacje APC z amplifikacją 7p, natomiast mutacje KRAS z amplifikacją 12p [59, 60]. Niektóre aberacje chromosomalne mają związek z konkretnymi etapami rozwoju nowotworu. Delecje fragmentów chromosomów 8p21-ter, 15q11–q21, 17p12–13 i 18q12–21 oraz amplifikacje 8q23, 13q14–31 i 20q13 częściej występują w rakach niż gruczolakach [58, 61]. Utraty fragmentów 1p32-ter oraz 9q33-ter były częstsze w guzach przerzutujących niż w guzach ograniczonych do ściany jelita [62]. Delecje ramion chromosomów 1p, 4q, 8p, 14q, 17p, 18q oraz amplifikacja 20q związane były z krótszymi czasami przeżycia [63, 64]. 2.1.2 Niestabilność mikrosatelitarnego DNA i metylacja genów supresorowych Alternatywną drogą powstania raka jelita grubego jest ciąg zaburzeń prawidłowej replikacji mikrosatelitarnego DNA oraz wyciszenie ekspresji niezbędnych genów w wyniku metylacji ich promotorów. Mikrosatelitarny DNA to sekwencje 1-5 nukleotydów powtórzone kilka lub kilkanaście razy. W trakcie replikacji DNA często dochodzi do pomyłek polimerazy w tych fragmentach. Za ich korektę odpowiedzialny jest kompleks naprawczy składający się z homologów bakteryjnych białek MutS i MutL. Kompleks białek MSH6/MSH2 (heterodimer MutSα) rozpoznaje niekoplementarnie sparowane zasady oraz pętle jednonukleotydowe. Kompleks MSH6/MSH3 (heterodimer MutSβ) odpowiedzialny jest za wykrywanie kilkunukleotydowych wypętleń. W miejscu błędu, heterodimery MutS pierwsze łączą się z DNA, następnie dołącza heterodimer MutLα tworzony przez białka MLH1 i PMS2. Powstaje w ten sposób kompleks naprawczy, który z egzonukleazą I posiada zdolność korekty błędów replikacji [65, 66]. Jeżeli w wyniku mutacji białko naprawcze utraci swe właściwości, te błędy będą utrwalone w kolejnych pokoleniach komórek. W efekcie obserwuje się zmienną długość powtarzalnych sekwencji mikrosatelitarnego DNA, a więc pojawienie się fenotypu z niestabilnością mikrosatelit DNA (MSI). Raki MSI różnią się pod względem ilości 10 niestabilnych loci. Zauważa się istotną biologicznie gradację intensywności niestabilności. Zgodnie z wytycznymi „Bethesda Guidelines” raki z niską niestabilnością mikrostatelitarną (MSI-L) wykazują MSI w mniej niż 40% badanych loci, natomiast te, które wykazują MSI w co najmniej 40% badanych loci klasyfikowane są jako wysoce niestabilne (MSI-H) [67]. Rycina 2. Schemat funkcjonowania kompleksów naprawczych MutS i MutL. Mutacje genów mutatorowych i wysoka niestabilność mikrosatelitarnego DNA (MSIH) leżą u podstaw dziedzicznego raka jelita grubego niezwiązanego z polipowatością (HNPCC - hereditary nonpolyposis colorectal cancer). Germinalne mutacje wykryto w genach: MLH1 [68], MSH2 [69], MSH6 [70], MLH3 [71], PMS1 i PMS2 [72].Około 80% pacjentów z HNPCC posiada mutację germinalną w MLH1 lub MSH2 [73]. Do rzadkości należą przypadki HNPCC wynikające z germinalnej metylacji MLH1 [74, 75] lub MSH2 [76]. Około 10% sporadycznych raków jelita grubego również wykazuje fenotyp wysokiej niestabilności mikrosatelit. Zarówno raki dziedziczne jak i sporadyczne wykazują cechy wspólne takie jak naciek limfocytarny, produkcja śluzu, prawostronna lokalizacja, wyższy 11 stopień zróżnicowania. Istnieją jednak różnice. Prekursorami raków w zespole HNPCC są klasyczne gruczolaki (cewkowe, cewkowo-kosmkowe, kosmkowe), natomiast raki sporadyczne poprzedzają polipy o ząbkowanym nabłonku (polipy hiperplastyczne, gruczolaki ząbkowane, nieuszypułowane („siedzące”) gruczolaki ząbkowane, polipy mieszane) [77, 78, 79]. Charakterystyczne dla raków MSI-H są mutacje stabilizujące -kateninę (CTNNB1) jednak w zdecydowanej większości występują w rakach związanych z zespołem HNPCC, natomiast w rakach sporadycznych MSI-H są rzadkie [80]. Specyficzne dla sporadycznych raków są mutacje genu BRAF oraz częsta metylacja promotorów genów, w tym genu MLH1. Epigenetyczne wyciszenie ekspresji MLH1 jest główną przyczyną fenotypu MSI-H w tej grupie [81, 82]. Mutacje BRAF występują we wczesnym etapie karcynogenezy, stwierdza się je w ponad 50% polipów ząbkowanych [83]. Raki MSI-H uznaje się za stabilne chromosomalnie. Są diploidalne i znacznie rzadziej niż w rakach stabilnych mikrosatelitarnie stwierdza się aberacje fragmentów chromosomów, które częściej mają postać amplifikacji niż LOH [84, 85]. Metylacja DNA jest procesem epigenetycznego (tzn. bez ingerencji w sekwencję) wyłączenia ekspresji genu. Polega na enzymatycznej reakcji przyłączenia grupy metylowej do atomu węgla cytozyny w pozycji 5, katalizowanej przez metylotransferazę. Metylacji ulega tylko cytozyna w sekwencjach CG. Znane są trzy geny kodujące ludzkie metylotransferazy DNA. Enzymy DNMT3A i DNMT3B uczestniczą w metylacji de novo, natomiast DNMT1 odpowiada za odwzorowanie metylacji na nowo syntetyzowanej nici DNA w procesie replikacji. Do metylowanego promotora przyłączają się białka posiadające domenę wiążącą metylocytozynę MBD (methyl-CpG-binding domain) i uczastniczą w represji genu. Metylacja DNA jest procesem obecnym w rozwoju embrionalnym, imprintingu, inaktywacji chromosomu X u kobiet oraz w karcynogenezie [86]. Częsta metylacja DNA (CIMP-H, CpG island methylator phenotyp) występuje w kilkunastu procentach raków jelita grubego. Ten fenotyp najlepiej charakteryzuje panel pięciu markerów CACNA1G, IGF2, NEUROG1, RUNX3 i SOCS1. Metylacja co najmniej trzech z nich kwalifikuje badany nowotwór do grupy CIMP-H [87]. Większość raków sporadycznych z wysoką niestabilnością mikrosatelitarnego DNA wykazuje częstą metylację, występuje ona także w nielicznej grupie raków stabilnych mikrosatelitarnie, które podobnie jak raki MSI-H są związane z mutacjami BRAF, prawostronną lokalizacją [88, 89, 90] oraz stabilnością chromosomalną [91, 92]. Fenotypy MSI-H w sporadycznych rakach i CIMP-H korelują ze sobą i w dużej mierze odnoszą się do tych samych przypadków [87]. 12 Zmiana długości mikrosatelitarnego DNA w sekwencji kodującej genu prowadzi do przesunięcia ramki odczytu w transkrypcie. Jej efektem jest powstanie niefunkcjonalnego białka. Somatyczne mutacje kodujących mikrosatelit obserwuje się w genach związanych z naprawą DNA. Są to geny mutatorowe MSH3 i MSH6 [93] oraz RAD50 [94] i MRE11 [95] uczestniczące w rekombinacji homologicznej. Niesprawny mechanizm rekombinacji jest prawdopodobnie związany z aberacjami chromosomalnymi wykrywanymi w rakach MSI-H. Częstą niestabilność kodujących mikrosatelit (>50%) obserwuje się w genach receptorów związanych z sygnalizacją białkami z nadrodziny TGFβ: TGFBR2 [96], BMPR2 [97], ACVR2A [98]. W rakach jelita grubego stwierdzono również metylację BMP3, która korelowała z MSI-H, CIMP-H i mutacjami BRAF [99]. Podobnie jak w rakach niestabilnych chromosomalnie, w rakach MSI-H także dochodzi do zaburzeń w funkcjonowaniu receptora efryny. Odpowiedzialne za to są mutacje mikrosatelitarnego DNA w sekwencji kodującej genu EPHB2 oraz metylacja jego promotora [100]. W przeciwieństwie do raków niestabilnych chromosomalnie, aktywność szlaku Wnt w sporadycznych rakach z wysoką niestabilnością mikrosatelitarną nie jest jednoznaczna. Obecne są w nich mutacje mikrosatelitarnego DNA w sekwencji kodującej aksyny (AXIN2) [101] oraz metylacja promotora tego genu [102], które powinny ułatwić przemieszczenie βkateniny do jądra komórkowego. Również epigenetyczne wyciszenie ekspresji jądrowego supresora β-kateniny, genu MCC, związane jest z fenotypami MSI-H i CIMP-H [43]. Sporadyczne raki MSI-H z jądrową lokalizacją β-kateniny należą jednak do rzadkości [103]. Około 50% raków posiada mutację mikrosatelitarnego DNA w genie TCF7L2, kodującym białko TCF tworzące kompleks transkrypcyjny z β-kateniną [101]. Stwierdzono, że te zmutowane formy TCF tracą zdolność funkcjonowania w roli czynnika transkrypcyjnego [104]. Jednak 28% raków MSI-H wykazuje ekspresję cykliny D1, uważanej za marker aktywności Wnt w jelicie grubym, która koreluje z mutacjami BRAF oraz utratą ekspresji genów związanych z opóźnianiem cyklu komórkowego CDKN1B (p27) i CDKN2A (p16), kodujących inhibitory cyklinozależnych kinaz [105]. Metylacja CDKN2A (p16) jest główną przyczyną utraty ekspresji i koreluje z niestabilnością mikrostalitarną oraz prawostronną lokalizacją [106]. W rakach MSI-H stwierdzono także odwrotną korelację ekspresji cykliny D1 z Cip1 [105]. Te obserwacje są zbieżne z wynikami innych badań, w których utrata jądrowej ekspresji p27 (CDKN1B) koreluje z fenotypami MSI-H oraz CIMP-H [107], natomiast utrata ekspresji Cip1 (CDKN1A) z niestabilnością chromosomalną [41]. 13 Gen CDKN2A koduje również białko p14, którego ekspresja kontrolowana jest przez inny promotor niż p16. Rolą p14 jest tworzenie kompleksu z białkiem mdm2 i blokowanie jego funkcji. Niezwiązane mdm2 łączy się z p53 uniemożliwiając jego dalsze działanie i w ten sposób promuje progresję cyklu komórkowego. Metylacja promotora p14 występuje w rakach niestabilnych mikrosatelitarnie i koreluje z brakiem mutacji TP53 [108]. Wykryto także związek między brakiem mutacji TP53 a fenotypami MSI-H oraz CIMP-H [41]. W normalnej komórce nagromadzenie uszkodzeń DNA powoduje aktywację ekspresji proapoptotycznego genu BAX zależną od p53. Większość raków MSI-H posiada niesprawne białko BAX w wyniku mutacji mikrosatelitarnego DNA w sekwencji kodującej genu [109]. Aktywacja szlaku sygnalizacyjnego kinazy fosfoinozytolu PI3K/Akt obserwowana jest w rakach z wysoką niestabilnością mikrosatelitarnego DNA i częstą metylacją promotorów. Antagonista tego szlaku, fosfataza PTEN ulega inaktywacji w wyniku mutacji w dwóch mikrosatelitach w sekwencji kodującej [101, 110]. Obniżenie ekspresji związane jest z metylacją promotora PTEN [111]. Aktywujące mutacje genu PIK3CA, kodującego podjednostkę kinazy fosfoinozytolu, najczęściej zdarzają się w rakach CIMP-H [112]. Raki, które cechuje wysoka niestabilność mikrosatelitarna, mają mniejsze ryzyko przerzutów oraz lepiej rokują [113, 114, 115]. Pacjenci, których rak był MSI-H nie odnoszą korzyści z leczenia 5-fluorouracylem [116], ale odnoszą większą korzyści z terapii skojarzonej zwierającej irynotekan [117]. Oporność raków MSI-H na 5-fluorouracyl wynika z wysokiej ekspresji syntazy tymidylowej [118], utraty ekspresji MLH1 [119], oraz niesprawnego kompleksu naprawczego MutSα [120, 121]. Badania na liniach komórkowych wykazały, że wysoka wrażliwość raków MSI-H na irynotekan wiąże się z niestabilnymi mikrosatelitami w genach RAD50 i MRE11 [122]. Odrębność raków MSI-H i raków stabilnych mikrosatelitarnie jest wyraźna. Kwestionowane jest natomiast istnienie raków o niskiej niestabilności (MSI-L) jako oddzielnej grupy, różniącej się istotnie od raków stabilnych mikrosatelitarnie (MSS). Nowotwory MSI-L w przeciwieństwie do MSI-H są niestabilne chromosomalnie. Nie stwierdzono różnic histologicznych między rakami o niskiej niestabilności mikrosatelitarnego DNA a MSS [123, 124, 125, 126, 127]. Jednak w tej grupie obserwuje się częstsze mutacje genu KRAS, utratę ekspresji MGMT, lewostronne umiejscowienie i niską frakcję proliferacyjną [128, 129, 130]. Mononukleotydowe sekwencje mikrosatelitarnego DNA są stabilne w rakach MSI-L, natomiast niestabilność dotyczy powtórzeń dwu- lub trójnukleotydowych [131, 132]. Główną przyczyną utraty ekspresji MGMT jest metylacja promotora, która koreluje z mutacjami KRAS. Białko MGMT jest odpowiedzialne za 14 rozpoznawanie metylowanej guaniny w DNA i naprawę tych uszkodzeń. Sugeruje się udział niedoboru MGMT w pojawieniu się fenotypu MSI-L [133]. Kolejnym genem, który może być związany z niską niestabilnością jest MSH3. Utrata ekspresji tego genu w liniach komórkowych powoduje pojawienie się fenotypu niskiej niestabilności mikrosatelitarnej w sekwencjach dwunukleotydowych [134]. Prekursorami tej grupy raków mogą być gruczolaki kosmkowe lub cewkowo-kosmkowe, w których najczęściej stwierdza się metylację MGMT i mutacje KRAS [83, 135, 136]. Z metylacją MGMT i mutacjami KRAS koreluje także fenotyp rzadkiej metylacji promotorów genów (CIMP-L) określany jako metylacja 1-2 markerów z 5 badanych [88, 137, 138]. Niestabilność chromosomów może być związana z częstymi mutacjami KRAS w tej grupie. Wprowadzenie do komórek onkogennej formy KRAS lub HRAS prowadziło do pojawienia się aneuploidii [139, 140]. Raki MSI-L są grupą gorzej rokującą od stabilnych mikrosatelitarnie [141, 142]. Ze względu na częstość występowania konkretnych cech molekularnych w rakach z niską niestabilnością mikrosatelitarnego DNA podejrzewa się, że za ich powstaniem może kryć się kolejny, specyficzny szlak karcynogenezy. 2.1.3 Molekularna klasyfikacja raków jelita grubego Pierwszym modelem karcynogenezy w stabilnym mikrosatelitarnie raku jelita grubego była sekwencja kolejnych zdarzeń molekularnych zaproponowana przez Fearona i Vogelsteina. Zakłada ona występowanie mutacji genów w następującej kolejności: APC, KRAS, TP53 [143]. Jednak te trzy zmiany rzadko współistnieją ze sobą. Mutacje trzech genów stwierdzono jedynie w 5-12% raków [144, 145, 146, 147]. Ponadto wyniki badań wykazały istnienie grupy raków stabilnych chromosomalnie i mikrosatelitarnie [25, 148]. Bardziej aktualną klasyfikację molekularną zaproponował J.R. Jass, która uwzględnia również zaburzenia epigenetyczne (ilustracją tego podziału jest Rycina 3) [149]. Wyróżnia on następujące grupy nowotworów: 1. Zespół HNPCC związany z mutacjami genów białek naprawczych DNA. Cechy charakterystyczne raków: brak mutacji BRAF, brak metylacji promotorów genów supresorowych, stabilność chromosomalna i wysoka niestabilność mikrosatelitarnego DNA. Rozwijają się z gruczolaków. Około 3% raków. 2. Sporadyczne raki z częstą metylacją DNA i wysoką niestebilnością mikrostatelitarnego DNA (CIMP-H/MSI-H). Cechy charakterystyczne: mutacje 15 BRAF, metylacja promotora genu MLH1, stabilność chromosomalna i wysoka niestabilność mikrosatelitarnego DNA. Raka poprzedza polip hiperplastyczny, gruczolak ząbkowany, nieuszypułowany gruczolak ząbkowany lub polip mieszany. Około 12% raków. 3. Raki z częstą metylacją DNA bez wysokiej niestabilności mikrosatelit (CIMPH/MSS). Są najczęściej stabilne mikrosatelitarnie (MSS) lub stwierdza się niską niestabilność mikrosatelit (MSI-L). Mutacje genu BRAF. Stabilne chromosomalnie. Podobnie jak w poprzedniej grupie raka najczęściej poprzedza polip hiperplastyczny, gruczolak ząbkowany, nieuszypułowany gruczolak ząbkowany lub polip mieszany. Około 8% raków. 4. Raki z rzadką metylacją DNA (CIMP-L). Cechy charakterystyczne: mutacje KRAS, metylacja promotora genu MGMT, niestabilność chromosomalna. Mikrosatelitarny DNA wykazuje niską niestabilność (MSI-L) lub jest stabilny (MSS). Mogą rozwinąć się z gruczolaków zawierających kosmki (tj. cewkowo-kosmkowych lub kosmkowych) lub prekursorów wykazujących ząbkowanie nabłonka. Około 20% raków. 5. Raki niestabilne chromosomalnie (CIN) bez metylacji DNA (CIMP-neg). W tej grupie nie stwierdza się niestabilności mikrosatelitarnego DNA (MSS). Do grupy należą zarówno raki sporadyczne jak i zespół rodzinnej polipowatości związany z germinalnymi mutacjami APC lub MUTYH. Częste mutacje TP53. Rozwój raka poprzedza etap gruczolaka. Około 57% raków. Wyszczególnione grupy stanowią zbiory cech molekularnych, które wykazują pozytywną korelację, jednak nie wszystkie cechy są wyłączne i specyficzne dla danej grupy. Rodzinne i sporadyczne raki z wysoką niestabilnością stanowią dwie najbardziej homogenne grupy nowotworów. W tym ujęciu grupa MSI-L jest traktowana jako nieróżniąca się od grupy raków ze stabilnymi mikrosatelitami (MSS), chociaż w dużej mierze zawiera się w grupie 4 (raki CIMP-L). Różne zmiany genetyczne i epigenetyczne mające miejsce w rakach jelita grubego związane są z konkretnymi szlakami sygnalizacyjnymi. Najistotniejsze procesy przebiegające w karcynogenezie w tym narządzie to: Aktywacja szlaku Wnt i funkcjonowanie β-kateniny w roli czynnika transkrypcyjnego. Aktywacja szlaków związanych z receptorami czynników wzrostu (szlak MAPK, szlak PI3K/Akt) 16 Utrata wrażliwości na supresorowe białka z nadrodziny TGF-β Zaburzenie sygnalizacji utrzymującej właściwą architekturę nabłonka jelitowego (efryna/receptory efryn, netryna/receptory netryny) Zwiększenie oporności na apoptozę Przyspieszenie cyklu komórkowego Rycina 3. Podział raków jelita grubego ze względu na różnice molekularne wg Jass i wsp. [149] Poniższa tabela jest podsumowaniem zmian genetycznych i epigenetycznych obserwowanych w rakach jelita grubego związanych z funkcjonowaniem konkretnych genów. Gen Szlak Wnt/β-katenina APC AXIN1 AXIN2 CTNNB1 (β-katenina) TCF7L2 (TCF4) Zmiana genetyczna/epigenetyczna wpływająca na funkcjonowanie genu insercje i delecje zmieniające ramkę odczytu mutacje punktowe zmiany sensu delecje fragmentu chromosomu 5q21-22 mutacje punktowe zmiany sensu mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu metylacja promotora genu mutacje punktowe zmiany sensu mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu 17 Receptory efryny i netryny DCC EPHB2 delecja fragmentu chromosomu 18q mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu metylacja promotora genu delecje fragmentu chromosomu 1p Szlaki sygnalizacyje związane z receptorami czynników wzrostu KRAS mutacje punktowe zmiany sensu BRAF mutacje punktowe zmiany sensu PIK3CA mutacje punktowe zmiany sensu PTEN delecja fragmentu chromosomu 10q23 mutacje punktowe zmiany sensu mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu Szlaki sygnalizacyjne związane z nadrodziną białek TGFβ TGFBR2 mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu BMPR1A mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu SMAD4 delecja fragmentu chromosomu 18q SMAD2 delecja fragmentu chromosomu 18q ACVR2A mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu BMP3 metylacja promotora genu Naprawa DNA MLH1 mutacje punktowe zmiany sensu metylacja promotora genu delecje zmieniające ramkę odczytu MSH2 mutacje punktowe zmiany sensu delecje zmieniające ramkę odczytu MSH3 mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu MSH6 mutacje punktowe zmiany sensu mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu MGMT metylacja promotora genu MUTYH mutacje punktowe zmiany sensu MRE11 mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu RAD50 mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu Apoptoza i cykl komórkowy TP53 mutacje punktowe zmiany sensu delecja fragmentu chromosomu 17p CDKN2A (transkrypt p14) metylacja promotora genu BAX mutacja mikrosatelitarnego DNA zmieniająca ramkę odczytu CDKN2A (transkrypt p16) metylacja promotora genu AURKA Amplifikacja genu Tabela 2. Geny uczestniczące w karcynogenezie jelita grubego. 18 2.2 Czynniki predykcyjne przerzutów w rakach jelita grubego Rozwinięcie się przerzutów odległych stanowi najbardziej zaawansowany etap choroby nowotworowej. Między guzami ograniczonymi do ściany jelita a przerzutującymi obserwuje się różnice w ekspresji poszczególnych genów. Raki o określonych zmianach genetycznych i ekspresji specyficznych genów preferencyjnie przerzutują do konkretnych lokalizacji. Podstawowym czynnikiem predykcyjnym przerzutów do węzłów chłonnych jest naciek naczyń limfatycznych w guzie pierwotnym [150, 151]. W ocenie ryzyka tych przerzutów może być pomocna analiza eskpresji kilku markerów. Związek z przerzutami do węzłów chłonnych stwierdzono w przypadku ekspresji S100A4 [152], aktywnej formy RhoA [153], białka szoku cieplnego HSP-27, S-transferazy glutationu, anexyny II [154, 155]. Utrata lub obniżona ekspresja SMAD4 [156] oraz wątrobowego białka wiążącego kwasy tłuszczowe (LFABP) [155] również korelują z przerzutami do węzłów chłonnych. Mikroprzerzuty do węzłów chłonnych i szpiku kostnego związane są z ekspresją białka adhezyjnego L1 [157]. Zaobserwowano związek między ekspresją FasL [158] oraz utratą ekspresji inhibitora kinaz Raf (RKIP) [159, 160] a przerzutami odległymi. Raki wykazujące ekspresję fosfatazy PRL3 (PTP4A3) preferencyjnie przerzutują do wątroby i płuc [161, 162]. Zaobserwowano, że przerzuty do wątroby związane są z utratą ekspresji SMAD4, natomiast mutacje KRAS wiążą się z przerzutami odległymi o innej lokalizacji niż wątroba [163, 164]. 2.3 Geny KRAS i BRAF Onkogenne mutacje genów KRAS i BRAF stanowią istotny element w karcynogenezie raka jelita grubego oraz innych nowotworów [165]. Białka Ras pośredniczą w przekazywaniu sygnału w komórce od receptorów czynników wzrostu. Aktywacja białek Ras wymaga udziału białek GEF (guanine nucleotide-exchange factor), które umożliwiają powstanie kompleksu z nukleotydem guaninowym (Ras-GTP). W stanie aktywnym, białko Ras związane z nukleotydem GTP przyjmuje odpowiednią konformację. Powrót do stanu nieaktywnego wiąże się z hydrolizą GTP do GDP przy udziale białek GAP (GTP-ase activating protein) i zmianą konformacji. Białka Ras wykazują nieznaczną wewnętrzną aktywność GTP-azy, która wzrasta dopiero w kompleksie z białkiem GAP. Ponowna aktywacja wymaga wymiany GDP na GTP, którą umożliwiają białka GEF [166, 167]. 19 Obecnie do rodziny genów RAS zalicza się 36 ludzkich genów. Najlepiej poznane są trzy geny KRAS, HRAS i NRAS często pełniące funkcje onkogenów w ludzkich nowotworach [168, 169]. Gen KRAS zlokalizowany jest na krótszym ramieniu chromosomu 12 (12p12.1). Znane są dwa transkrypty tego genu różniące się sekwencją ostatnich aminokwasów w Ckońcowej części białka. Izoforma KRAS4B jest dominująca jelicie grubym i stanowi ok. 99% ekspresji. Onkogenne mutacje KRAS prowadzą do upośledzenia funkcji GTPazy i zatrzymania białka Ras w stanie aktywnym w kompleksie z nukleotydem GTP. Zdecydowana większość z nich to punktowe mutacje zmiany sensu w kodonach 12, 13 w eksonie 1 lub kodonie 61 w eksonie 2. Glutamina w pozycji 61 jest niezbędna do hydrolizy GTP. Każdy inny aminokwas w tej pozycji z wyjątkiem kwasu glutaminowego uniemożliwia zajście tej enzymatycznej reakcji [170, 171]. Kodony 12 i 13 kodują glicynę w prawidłowym genie. Jest to fragment domeny P-loop - pętli wiążącej fosforan nukleotydu guaninowego (phosphate binding loop), którą tworzą aminokwasy w pozycji 10-17. Aktywność GPTazy białka Ras jest możliwa w obecności konserwatywnej reszty argininy białka GAP, która oddziałuje na tą domenę [172]. Stwierdzono, że substytucja każdego innego aminokwasu z wyjątkiem proliny w pozycji 12 powoduje znaczącą utratę funkcji GTPazy, przez co białko Ras pozostaje w aktywnym stanie w kompleksie z GTP [165]. Białka Ras uczestniczą w regulacji zachowania komórki poprzez aktywację kolejnych białek efektorowych. Kaskada kinaz MAP (Mitogen Activated Protein kinases) jest jednym z głównych szlaków przekazywania sygnału, aktywowanych przez białko Ras. Najczęściej tworzą ją kolejno aktywujące się kinazy Raf-MEK-ERK. Pierwszym elementem tej kaskady enzymatycznej jest kinaza Raf, która fosforyluje kolejną kinazę, aktywując ją w ten sposób. W wyniku aktywacji tego szlaku, czynniki transkrypcyjne Jun i Fos uruchamiają ekspresję genów związanych z proliferacją m.in. Cykliny D1 (CCND1) [165]. Możliwa jest aktywacja także innych kinaz MAP związanych z migracją – MKK i p38 [173, 174]. Kompleks RasGTP aktywuje również kinazę fosfoinozytolu (PI3K) poprzez wiązanie się z jej podjednostką p110 [175]. Ten enzym katalizuje fosforylację 4,5-dwufosforanu fosfatydyloinozytolu do 3,4,5-trójfosforanu fosfatydyloinozytolu. Kolejnymi elementami tego szlaku są: zależna od fosfatydyloinozytolu kinaza PDK1 (PDPK1, 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1) oraz kinaza Akt [176]. Kinaza Akt jest często aktywna w komórkach nowotworowych, zwiększając ich zdolność do przeżycia poprzez fosforylację i inaktywację proapoptotycznych białek (m.in. Bad, Kaspaza 9) [177]. Rycina 4 przedstawia najważniejsze szlaki przekazywania sygnału wewnątrz komórki z udziałem białka Ras. 20 Rycina 4. Schemat przekazywania sygnału przez białka Ras oraz najważniejsze szlaki sygnalizacyjne aktywowane przez te białka. P – fosforylacja. Y – fosforylowana tyrozyna w wewnątrzkomórkowej części receptora. U człowieka istnieją trzy geny kodujące kinazy Raf: ARAF, BRAF, RAF1. Gen BRAF zlokalizowany jest na dłuższym ramieniu chromosomu 7 (7q34). Białko B-Raf jest cytoplazmatyczną kinazą serynowo-treoninową. W wyniku aktywacji przez białko Ras, fosforyluje kolejną kinazę szlaku kinaz MAP aktywując ją [178]. Mutacje tego genu skutkują zwiększeniem aktywności kinazy, tym samym prowadząc do wzmocnienia sygnału przekazywanego za pomocą szlaku kinaz MAP. Zwykle mutacje zlokalizowane są w eksonie 15 tego genu w kodonie 600 (p.V600E), rzadziej w eksonie 11 [179, 180]. Mutacje KRAS oraz utrata ekspresji receptora TGFβ mogą być wystarczające do transformacji nowotworowej na drodze niezależnej od β-kateniny [181]. Transgeniczne myszy z mutacją Apc i aktywnym onkogenem Kras w jelicie posiadały 10-krotnie więcej 21 ognisk pierwotnych nowotworu i szybszą progresję do raka niż kontrolna grupa z samą mutacją Apc. W grupie badanej z mutacją Kras obserwowano w nowotworach wyższą jądrową ekspresję β-kateniny [182]. W guzie pierwotnym niezwykle rzadko stwierdza się współistnienie mutacji w obu genach jednak w około 1/3 przerzutów stwierdzono obecność mutacji zarówno w KRAS jaki i BRAF [183, 184]. Mutacje w genie KRAS wykrywane są już na etapie gruczolaka jednak częstość ich występowania rośnie wraz z zawansowaniem nowotworu. Częściej wykrywane są w przerzutach niż w guzie pierwotnym [183, 185]. Zarówno mutacje KRAS jak i BRAF związane są z gorszym rokowaniem i krótszymi czasami przeżycia pacjentów [144, 186].oraz opornością na celowaną terapię monoklonalnymi przeciwciałami anty-EGRF [187, 188] Wykazano, że ekspresja SNAI2 związana była z aktywnością kinaz MEK, ERK oraz Raf1 ze szlaku kinaz MAP [189, 190, 191, 192]. Również onkogenne mutacje genu HRAS wpływały na wzrost ekspresji SNAI2 [193]. 2.4 Gen SNAI2 (SLUG) Rodzina genów SNAIL grupuje geny będące homologami genu snail (Drosophila melanogaster). U człowieka występują 3 geny należące do tej rodziny: SNAI1(SNAIL), SNAI2(SLUG) i SNAI3(SMUC). Homologi typu 2 (SLUG) występują tylko u kręgowców. Kodują one białka będące czynnikami transkrypcyjnymi, które posiadają konserwatywne domeny „cynkowych palców” wiążące DNA. Regulują ekspresję genów związanych z połączeniami komórkowymi. Są aktywne w komórkach zdolnych do migracji. Ekspresja genów z tej rodziny w komórkach nabłonkowych wiąże się z utratą cech fenotypu nabłonkowego i pojawieniem się cech fenotypu mezenchymalnego. Komórki przybierają kształt wrzecionowaty, uzyskują zdolność do migracji. Obniża się ekspresja białek tworzących połączenia międzykomórkowe (E-kadheryna, Desmoplakina, Okludyna), wzrasta natomiast ekspresja Wimentyny i Firbronektyny. Proces ten nosi nazwę przemiany nabłonkowo-mezenchymalnej (EMT – epithelial-mesenchymal transition). Zdolność komórek raka do przemiany nabłonkowo-mezenchymalnej jest związana ze zdolnością do przerzutów [194, 195, 196, 197]. Gen SNAI2 (SLUG) zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu 8 (8q11). Promotor genu SNAI2 zawiera wyspę CpG (fragment z częstymi sekwencjami -CG-) 22 zlokalizowaną w pozycji -959 +61 względem startu translacji (kodon ATG metioniny). W pozycji -1396 -1391 znajduje się sekwencja E-BOX (CATGTG) rozpoznawana przez czynniki transkrypcyjne m.in. MITF związany z aktywnością receptora CKIT [198]. Pierwotny transkrypt rozpoczyna się -164bp względem kodonu ATG (sekwencja mRNA AK223368.1). Rycina 5 przedstawia schemat promotora genu SNAI2 z zaznaczonymi sekwencjami CG, E-BOX i startem translacji. Rycina 5. Promotor genu SNAI2. Wizualizacja wyspy CpG (niebieska linia) w programie CpG Island Searcher (http://www.cpgislands.com) [199]. Pionowe kreski na osi symbolizują sekwencje CG. CATGTG - sekwencja E-BOX rozpoznawana przez czynniki transkrypcyjne. ATG – kodon metioniny rozpoczynający translację. Pierwotny transkrypt rozpoczyna się -164bp względem kodonu ATG (sekwencja mRNA AK223368.1). Ludzkie białko Slug składa się z 268 aminokwasów i zawiera w swojej budowie 5 konserwatywnych domen „cynkowych palców”. Wykazuje ono 95%, 93% i 88% homologii, odpowiednio z białkiem mysim, kurczaka i żaby Xenopus [200]. N-terminalną część białka stanowi domena SNAG (Snail/Gfi1) odgrywająca rolę w regulacji ekspresji genów [201, 202]. Białko Slug bierze udział w rozwoju embrionalnym między innymi w gastrulacji i migracji komórek grzebienia nerwowego. W czasie organogenezy u myszy stwierdzono ekspresję m.in. w mezenchymie płuc i nerek, w komórkach kości wywodzących się z mezodermy i z grzebienia nerwowego, mezenchymie twarzoczaszki, tworzącej się przegrodzie serca i ścianie przewodu pokarmowego z wyjątkiem linii nabłonka. Nie stwierdzono ekspresji w centralnym systemie nerwowym i nerwach obwodowych, jedynie mezenchymalne komórki splotu naczyniówki w mózgu wykazują ekspresję [203, 204]. W endodermalnym nabłonku jelita pierwotnego ekspresja pojawia się w czasie formowania zawiązków trzustki i trwa w czasie organogenezy. W rozwiniętej trzustce stwierdza się jedynie nikłą ekspresję w komórkach beta [205]. Białko Slug bierze również udział w procesie gojenia ran. Stwierdzono ekspresję genu Snai2 w migrujących keratynocytach uczestniczących w reepitelializacji [206, 207]. 23 Ekspresja Snai2 u myszy zachodzi w migrujących komórkach grzebienia nerwowego, gdzie jest konieczna dla migracji i/lub przeżycia melanoblastów, nie jest natomiast niezbędna dla samego formowania się grzebienia nerwowego [198, 208]. Myszy pozbawione aktywnego genu Snai2 są żywotne, stwierdza się u nich jednak niepłodność oraz anemię makrocytarną. Posiadają charakterystyczną białą plamę na czole oraz liczne ogniskowe obszary hipopigmentacji na ciele wskazujące na upośledzenie migracji melanoblastów. Powyższe objawy wskazują na istotną rolę tego czynnika transkrypcyjnego w funkcjonowaniu komórek rozrodczych oraz melanocytów [209]. Heterozygotyczna delecja SNAI2 związana jest z piebaldyzmem u ludzi, natomiast homozygotyczna delecja ujawnia się w postaci zespołu Waardenburga typu 2. Charakterystyczne objawy dla tego zespołu to: utrata barwnika włosów (poliosis), niedobór barwnika w tęczówkach, wczesne siwienie, bielactwo, niedosłuch (spowodowany brakiem melanocytów w rąbku barwnikowym ślimaka) [198, 210, 211]. U transgenicznych myszy z nadekspresją Snai2 rozwijały się nowotwory mezenchymalne. Były to głównie białaczki (ostra białaczka szpikowa, ostra białaczka limfoblastyczna komórek B), rzadziej mięsaki tkanek miękkich. U części osobników rozpoznano kardiomiopatię. Nie stwierdzono natomiast nowotworów pochodzenia nabłonkowego. Na uwagę zasługuje fakt, że u myszy z genem fuzyjnym bcr/abl+ pozbawionych aktywnego genu Snai2 nie rozwijały się białaczki [212, 213]. Białko Slug pełni w komórce rolę czynnika transkrypcyjnego regulującego ekspresję innych genów. Tworzy kompleks z białkami CtBP1, Sin3A oraz HDAC1/2 (deacetylaza histonów), który uczestniczy w wyciszaniu ekspresji (represji) genów poprzez sekwencje EBOX (5’-CANNTG-3’) w promotorze genu [201, 214, 215, 216]. Białko Slug jest represorem ekspresji istotnych białek adhezji międzykomórkowej takich jak: E-kadheryna, Klaudyna-1, Desmoplakina, Desmogleina 1, Desmogleina 2, Okludyna, ZO-1 oraz białek cytoszkieletu: Cytokeratyna 8, Cytokeratyna 18, Cytokeratyna 19 [191, 217, 218, 219, 220]. E-kadheryna jest jedną z najważniejszych molekuł adhezji międzykomórkowej, jej obniżona ekspresja związana jest z zaburzeniem hamowania kontaktowego komórek, rozwojem raka i występowaniem przerzutów. Stwierdzono, że z ekspresją genu SNAI2 związane jest obniżenie ekspresji istotnego genu supresorowego w karcynogenezie raka sutka BRCA2 [214] jak również genu CDX2 kodującego czynnik transkrypcyjny odpowiedzialny m.in. za prawidłowe różnicowanie nabłonka jelitowego [221]. Ekspresja SNAI2 w komórkach nabłonkowych skutkowała ekspresją Wimentyny i Fibronektyny [207, 222]. Oprócz zdolności do regulacji ekspresji białek połączeń komórkowych i cytoszkieletu, białko Slug wykazuje również właściwości antyapoptotyczne. Hematopoetyczne komórki 24 progenitorowe myszy posiadające ekspresję genu Snai2, wykazywały oporność na apoptozę po napromieniowaniu promieniami gamma. U myszy pozbawionych aktywnego genu Snai2 poddanych napromieniowaniu promieniami gamma, komórki te ulegały apoptozie [223, 224]. Za główną przyczynę tej oporności uznano blokowanie przez białko Slug ekspresji genu Bbc3 kodującego proapoptotyczne białko Puma. Białko Puma wiąże antyapoptotyczne białko BclxL, jego brak skutkował opornością na apoptozę [215, 225 226, 227, 228]. Wykazano również wpływ białka Slug na przeżycie komórek nabłonkowych sutka i nerki w procesie tubulogenezy poprzez obniżenie ekspresji proapoptotycznego genu TP53. Jednocześnie stwierdzono, że ekspresja CDH1 (E-kadheryny) pozostała bez zmian w tym procesie, co sugeruje istnienie dodatkowego czynnika regulującego wpływ białka Slug na promotor genu CDH1 [229, 230]. Antyapoptotyczne właściwości białka Slug przejawiały się również w oporności na cytostatyki. Ekspresja SNAI2 w linii komórkowej raka sutka MCF7 i czerniaka A375 związana była z opornością na doksorubicynę. Stwierdzono w tych komórkach związek między ekspresją SNAI2 a obniżeniem ekspresji proapoptotycznych genów TP53 i BID [231]. W linii komórkowej złośliwego międzybłoniaka wykazującej wielolekową oporność MM-DX wyciszenie ekspresji SNAI2 przywracało wrażliwość tych komórek na doksorubicynę, paklitaksel i winkrystynę. Ekspresję genu SNAI2 wykazano w wielu nowotworach zarówno nabłonkowych jak i mezenchymalnych. Stwierdzono ekspresję SNAI2 w komórkach białaczek wykazujących ekspresję genów fuzyjnych BCR-ABL (translokacja 9;22) oraz E2A-HLF (translokacja 17;22) [209, 225]. Obecność białka Slug w komórkach mięsaka poprzecznie prążkowanego związana była z translokacją PAX3-FKHR [232]. Stwierdzono ją również w glejakach [233], rakach trzustki [234], oraz rakach pęcherzykowych i brodawkowatych tarczycy [235]. W przerzutujących rakach jajnika ekspresja SNAI2 związana była z ekspresją MMP2 (metaloproteinazy-2) [236]. W rakach sutka stwierdzono wyższą ekspresję w rakach z przerzutami do węzłów chłonnych niż w nieprzerzutujących, oraz związek ekspresji z gorszym rokowaniem i redukcją ekspresji E-kadheryny [237, 238, 239]. W gruczolakorakach płuc ekspresja SNAI2 związana była z większym ryzykiem wznowy oraz krótszymi czasami przeżycia pacjentów [240]. Ekspresja wiązała się z krótszym przeżyciem również w rakach żołądka, gdzie dodatkowo stwierdzono związek ekspresji z przerzutami odległymi, stopniem zaawansowania i redukcją ekspresji E-kadheryny [241]. Około połowa raków płaskonabłonkowych przełyku wykazała ekspresję SNAI2, która związana była z głębszym naciekiem i przerzutami do węzłów chłonnych, redukcją E-kadheryny i gorszym przeżyciem [242]. Metaplastyczny nabłonek przełyku Barrett’a wykazywał głównie cytoplazmatyczną 25 lokalizację ekspresji, natomiast w gruczolakorakach była głównie jądrowa. W prawidłowym nabłonku przełyku ekspresja zlokalizowana była w warstwie podstawnej nabłonka [243], czyli w warstwie odpowiedzialnej za odnowę nabłonka, w której znajdują się komórki macierzyste [244]. Związek ekspresji z przerzutami badano w mysim modelu raka płaskonabłonkowego skóry na wysoce inwazyjnych liniach komórkowych HaCa4 i CarB z ekspresją Snai2. Wyciszenie ekspresji Snai2 wiązało się ze znacznym ograniczeniem przerzutów, głównie do płuc i wątroby [245]. Również linie komórkowe czerniaka z wyciszonym genem za pomocą siRNA miały znacznie obniżoną zdolność do dawania przerzutów [246]. Ekspresja SNAI2 w rakach jelita grubego związana była ze stopniem zaawansowania (w skali Dukes’a), przerzutami odległymi oraz gorszym przeżyciem pacjentów [247]. Badania na liniach komórkowych wykazały udział białka Slug w sygnalizacji Wnt (istotnego elementu karcynogenezy w jelicie grubym), w tym udział w aktywacji ekspresji CCND1 (Cyklina D1) - genu typowego dla szlaku Wnt, kodującego regulator cyklu komórkowego [248]. Związek białka Slug ze zdolnością komórek do migracji, z przerzutami oraz jego antyapoptotyczne właściwości czynią go atrakcyjnym celem badań nad zastosowaniem jako czynnik prognostyczny i/lub predykcyjny oraz potencjalnym celem terapii. 26 3. Cel pracy 1. Ustalenie, czy ekspresja SNAI2 ma miejsce w rakach jelita grubego. 2. Ustalenie, czy metylacja promotora SNAI2 ma związek z ekspresją tego genu. 3. Porównanie metylacji i ekspresji SNAI2 ze stopniem zaawansowania. Sprawdzenie, czy metylacja i/lub ekspresja może być użytecznym markerem zdolności do przerzutu. 4. Porównanie metylacji i ekspresji SNAI2 w rakach o różnym poziomie stabilności mikrosatelitarnego DNA. Sprawdzenie, czy metylacja i/lub ekspresja mogą być związane z konkretnym szlakiem karcynogenezy. 5. Sprawdzenie, czy metylacja i/lub ekspresja może mieć związek z mutacjami genów KRAS i BRAF. 27 4. Materiał i metody 4.1 Materiał Do badań wykorzystano nieutrwalony materiał chirurgiczny nadsyłany do diagnostyki do Katedry Patomorfologii CMUJ z I Katedry Chirurgii Ogólnej i Gastroenterologicznej CMUJ w latach 2003-2005. Pobrane świeże tkanki zamrożono w -80C w celu późniejszej izolacji DNA. Część świeżego materiału została utrwalona w formalinie i zatopiona w parafinie w celach diagnostycznych. Zgromadzony materiał stanowiły sporadyczne gruczolakoraki jelita grubego oraz tkanka prawidłowa spoza guza od 163 pacjentów. Dane kliniczne oraz historia choroby nie wskazywały na rodzinne występowanie raka jelita grubego w żadnym z analizowanych przypadków. W badanej grupie było 56% mężczyzn 44% kobiet. Pacjenci byli w wieku 34-81 lat. Przyjęto podział jelita grubego na 3 odcinki: okrężnica prawostronna (do okrężnicy poprzecznej) okrężnica lewostronna (od zgięcia śledzionowego do esicy) odbytnica (połączenie esiczo-odbytnicze, odbytnica) Materiał został oceniony pod kątem histopatologicznym przez patologa (dr Krzysztof Okoń). Stopień zaawansowania oceniono wg skali TNM oraz skali Astlera-Collera [249]. Stosowane klasyfikacje scharakteryzowano poniżej. Klasyfikacja TNM Cecha T (wielkość guza) Tx - brak możliwości oceny guza pierwotnego Tis - carcinoma in situ (rak przedinwazyjny) T1 - guz nacieka błonę podśluzową T2 - guz nacieka warstwę mięśniową właściwą T3 - guz przechodzi poprzez warstwę mięśniową właściwą i nacieka błonę surowiczą lub tkankę okołoodbytniczą T4 - guz nacieka bezpośrednio okoliczne narządy lub struktury, bądź przechodzi poza otrzewną ścienną 28 Cecha N (węzły chłonne) Nx - nie można ocenić węzłów chłonnych N0 - nie stwierdza się obecności przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych N1 - przerzuty obecne w 1 - 3 regionalnych węzłach chłonnych N2 - przerzuty obecne w 4 i więcej regionalnych węzłach chłonnych Cecha M (przerzuty odległe) Mx - nie można ocenić obecności przerzutów odległych M0 - nie stwierdza się obecności przerzutów odległych M1 - stwierdza się obecność przerzutów odległych Klasyfikacja Astlera-Collera Stopień A - guz ograniczony do śluzówki Stopień B1 - guz przekracza warstwę mięśniową błony śluzowej, ale nie przekracza warstwy mięśniowej właściwej Stopień B2 - guz przekracza ścianę jelita (naciekanie tkanki tłuszczowej okołoodbytniczej lub błony surowiczej jelita) Stopień C1 - B1 + zajęte regionalne węzły chłonne Stopień C2 - B2 + zajęte regionalne węzły chłonne Stopień D - zmiany nieoperacyjne, z powodu zaawansowania miejscowego lub obecności przerzutów odległych T N M T1 T2 T3 T4 T1, T2, T3, T4 Każdy T N0 N0 N0 N0 N1, N2 N1, N2 Każdy N M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1 KLASYFIKACJA ASTLERA-COLLERA A B1 B2 B2 C1 C2 D Tabela 3. Porównanie klasyfikacji TNM i Astlera-Collera. W ocenie histologicznej uwzględniono również stopień zróżnicowania grading (G1 – rak wysoko zróżnicowany, G2 – rak średnio zróżnicowany, G3 – rak nisko zróżnicowany); obecność komórek nowotworowych w naczyniach krwionośnych - cecha pV (V0 brak; V1 obecność) oraz w naczyniach limfatycznych - cecha pL (L0 brak; L1 obecność). 29 4.2 Metody Do realizacji celów badania wykorzystano następujące metody: analiza obecności białka Slug w komórkach nowotworowych – immunohistochemia ekstrakcja DNA do badań molekularnych – izolacja w kolumnach krzemionkowych analiza metylacji promotora SNAI2 – inkubacja DNA z wodorosiarczynem, PCR, elektroforeza analiza niestabilności mikrosatelitarnego DNA – PCR, elektroforeza, elektroforeza kapilarna analiza mutacji genów KRAS i BRAF – PCR, SSCP, sekwencjonowanie 4.2.1 Ekspresja genu SNAI2 (SLUG) Obecność białka Slug w komórkach nowotworowych badano metodą immunohistochemii. Z kostki parafinowej z tkanką nowotworową wycięto cylindryczny fragment tkanki (średnica 2mm) i przeniesiono do nowej kostki parafinowej, w ten sposób w jednej kostce umieszczono 19 fragmentów różnych raków. Skrawki parafinowe z tak przygotowanej kostki (wielobloczka) tworzyły macierz tkankową, na której przeprowadzono reakcję immunohistochemiczną. Skrawki o grubości 4m kładziono na szkiełka podstawowe i suszono w cieplarce przez 24 godziny w temperaturze 56C. Wykorzystano królicze poliklonalne przeciwciało (SLUG H-140, Santa Cruz Biotechnology), dla którego antygenem jest fragment ludzkiego białka Slug odpowiadający aminokwasom 21-160. Protokół zastosowanej metody przedstawiono poniżej. 1. Inkubacja w 3 zmianach ksylenu przez 10 minut w temperaturze 60C. 2. Inkubacja w kolejnych stężeniach alkoholu etylowego (90%, 70%, 50%) po 5 minut w temperaturze pokojowej. 3. Płukanie wodą destylowaną. 4. Blokowanie endogennej peroksydazy przez inkubację w 3% nadtlenku wodoru przez 8 minut w temperaturze pokojowej. 5. Odmaskowanie antygenu w buforze cytrynianowym (pH 6.0; 0.01M). 6 Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym SLUG-H (rozcieńczenie 1:100); 18 godzin w temperaturze 4C. 7. Płukanie preparatów buforem TBS (50mM Tris-HCl; 150mM NaCl; DAKO Corporation). 30 8. Uwidocznienie kompleksu antygen-przeciwciało za pomocą systemu EnVision+ (kozie immunoglobuliny sprzężone z polimerem dekstranu znakowanym peroksydazą; DAKO Corporation). Inkubacja 30 minut w temperaturze pokojowej. 9. Płukanie preparatów buforem TBS. 10. wykonanie reakcji enzymatycznej peroksydazy przy pomocy systemu AEC SubstrateChromogen (nadtlenek wodoru, 3-amino-9-etylokabazol, N,N-dimetyloformamid w buforze octanowym pH 5.0; DAKO Corporation). 10 minut. 11. Płukanie preparatów w wodzie destylowanej. 12. Kontrastowanie jąder komórkowych hematoksyliną Mayera. 13. Płukanie preparatów w wodzie bieżącej. 14. Zamknięcie preparatów w glicerożelu. Odczyny zostały ocenione przez patologa (dr Sergiusz Demczuk) przy powiększeniu obiektywu 40x. Oceniono odsetek komórek z jądrową lokalizacją odczynu w centrum badanej tkanki w 116 rakach. 4.2.2 Izolacja DNA Izolację DNA przeprowadzono z nieutrwalonej tkanki normalnej i nowotworowej przy użyciu komercyjnego zestawu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH). Metoda ta polega na lizie komórek i separacji DNA na złożu krzemionkowym. Postępowano zgodnie z instrukcją producenta, którą przedstawiono poniżej: 1. Rozdrobnienie tkanki (ok. 20mg) i umieszczenie w probówce 1.5ml 2. Dodanie 180l buforu ATL. 3. Dodanie 20l proteinazy K; worteksowanie. 4. Inkubacja przez 24 godziny (do uzyskania klarownego roztworu) w 56C. 5. Dodanie 200l buforu lizującego AL; worteksowanie. 6. Inkubacja przez 10 minut w 70C (inaktywacja proteinazy); worteksowanie. 7. Dodanie 200l etanolu 99%; worteksowanie. 8. Przeniesienie zawartości probówki na kolumnę QIAamp ze złożem krzemionkowym i wirowanie z prędkością 8000rpm przez 1 minutę. Usunięcie przesączu. 31 9. Dodanie 500l buforu AW1 i wirowanie z prędkością 8000rpm przez 1 minutę. Usunięcie przesączu. 10. Dodanie 500l buforu AW2 i wirowanie z prędkością 14000rpm przez 3 minuty. Usunięcie przesączu. 11. Dodanie wody destylowanej, wykonanie krótkiego spinu (do 2000rpm) w celu uwodnienia kolumny. Inkubacja w temperaturze pokojowej ok. 10 minut. 12. Wirowanie przez 1 minutę przy 8000rpm. Uzyskany wodny roztwór DNA (przesącz) przechowywano w temperaturze 4C. 4.2.3 Analiza metylacji promotora genu SNAI2 (SLUG) Metylację promotora analizowano metodą MSP (Methylation-Specyfic PCR). Jest to metoda oparta na reakcji PCR pozwalająca stwierdzić obecność lub brak 5-metylocytozyny w miejscu hybrydyzacji primerów. DNA poddano inkubacji z wodorosiarczynem sodu (NaHSO3). Jej efektem jest deaminacja cytozyny do uracylu, który w reakcji PCR traktowany jest przed polimerazę DNA jako tymina, natomiast 5-metylocytozyna jest oporna na konwersję. Schemat reakcji deaminacji przedstawiono na rycinie poniżej. HSO3OH- + OHH2O - cytozyna - HSO3- uracyl Rycina 6. Reakcja deaminacji cytozyny pod wpływem wodorosiarczynu. W reakcji PCR zastosowano pary primerów komplementarnych do metylowanej i niemetylowanej matrycy DNA. Primery zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencję 32 promotora genu SNAI2. Przy projektowaniu wykorzystano programy komputerowe: CpG Island Searcher [199], CpG_Analyzer [250], FastPCR [255]. Rycina 7 przedstawia lokalizację miejsc hybrydyzacji zaprojektowanych primerów w promotorze SNAI2. ttagcattatacaggaaactggtagatactgagatggattttaatggctttatactgagaaaatagcaccacata aaagcaggggaatattagaaataaaaataattgtctctaaagacccatacaaccctttttcccataaaaaaaaag atgcactgtaatacatgaaaagataagatctcttgtcaaaagtgtgagagaatgtcCGgtggttccaaatgacag ttacctcttgccccccttctctgccagagttcctttttatctttgcaatcttccagttgttcCGatcagcctgcc tttagagggctacaaagcatttctttcaagccaccatagctaacaCGgtgacatgagtacttaatttgcaCGCGg cCGCGctgcccctggcttCGCGgaagccctgagtagCGcagCGccctCGcCGcaCGcaaggctgcagtccCGctc caggccagagtcccaggagagCGtcctcCGCGctcacaggCGcctttgtcttccCGcttcccccttcctttttca aaagccaagaggtaattatttggtctttgtgcaaggcaaacctctccagatgccacttccaaatataggctctca ttaacaccagaggctggcctggtgtggtgcagggCGgcccttccttctcctg gCGgacactgtgtcccCGC GCGc tggCGctgcaccacatctggaagccaggCGggcagggcagagacccCGgctcctgCGcccctcctagctcccaga gagCGtggatCGCGggCGgggctcac CGagCGaggttacctctcttgaaa atacttaaacactttttttcctctc cactgaaatctcaaaaaacagcccattttgaaccagaataatttagtctgacaacagattcttcctctgttcaca gctgtcccagagggaggagctgaaatctgaacctctcagctgtgattggatctttcttgcaaaagagaggaaaaa aaaaccctcccagccaaaaCGggctcagttCGtaaaggagcCGggtgacttcagaggCGcCGgccCGtcCGtctg cCGcacctgagcaCGgcccctgccCGagcctggccCGcCGCGatgctgtagggacCGcCGtgtcctccCGcCGga cCGttatcCGCGcCGggCGccCGccagaccCGctggcaagATGcCGCGctccttcctggtcaagaagcatttcaa CGcctccaaaaagccaaactacagCGaactggacacacatacaggtaaaaagagaaaaatatatctagaactaCG tatctagagctttgcaaatatgaat Rycina 7. Lokalizacja miejsc hybrydyzacji primerów w promotorze SNAI2. Sekwencja w ramce – primery dla metylowanej matrycy, sekwencja podkreślona – primery dla niemetylowanej matrycy. Kolorem szarym zaznaczono transkrypt mRNA (sekwencja AK223368.1). ATG – kodon metioniny rozpoczynający translację. Powstanie odpowiedniego produktu PCR świadczyło o metylacji lub hipometylacji promotora. Ze względu na brak możliwości rozróżnienia czy metylowane były oba allele lub tylko jeden, termin metylacja odnosi się do stwierdzenia obecności 5-metylocytozyny w badanym fragmencie DNA w badanej próbce. Brak 5-metylocytozyny w badanej sekwencji DNA oznaczał hipometylację, czyli brak metylacji DNA na obu allelach. Niemożność rozróżnienia wynika ze specyfiki badanego materiału, na którą składają się heterogenność guza oraz obecność DNA podścieliska. Możliwości takie daje jedynie analiza DNA z linii komórkowych. Metoda składała się z trzech etapów: reakcji deaminacji cytozyny, oczyszczania matrycy DNA, reakcji PCR. Dokładny opis zamieszczono poniżej: CZĘŚĆ I. Deaminacja cytozyny. 1. W probówce 1.5ml umieścić: 35l buforu TE (10mM Tris-HCl /0.1mM EDTA; pH 7.5) 5.5l 3M NaOH 15l roztworu DNA 33 2. Inkubacja w 37C przez 15 minut. 3. Inkubacja w 95C przez 4 minuty. 4. Przeniesienie probówek na lód. 5. Sporządzenie mieszaniny: 15ml 3M wodorosiarczynu sodu (NaHSO3) (Sigma-Aldrich) 1ml 40mM hydrochinonu (Sigma-Aldrich) 600l 10M NaOH 6. Dodanie po 500l powyższej mieszaniny do probówki; worteksowanie. 7. Nałożenie na wierzch warstwę oleju mineralnego. 8. Inkubacja w 55C przez 16 godzin w ciemności. CZĘŚĆ II. Oczyszczanie DNA zestawem Wizard Cleenup i precypitacja. 1. Przeniesienie mieszaniny reakcyjnej z DNA bez oleju mineralnego do nowej probówki 2.0ml. 2. Dodanie 1ml Wizard Cleenup (Promega GmbH); worteksowanie. 3. Przygotowanie kolumn do izolacji wraz ze statywem manifold (Promega GmbH), podłączenie pompy. 4. Przeniesienie do kolumny zawartości probówki i uruchomienie pompy. 5. Przemycie złoża kolumny 2ml 80% izopropanolu. 6. Przeniesienie kolumny do nowej probówki 1.5ml, wirowanie z prędkością 11000rpm przez 2 minuty. 7. Przeniesienie kolumny do nowej probówki 1.5ml; dodanie 50μl ciepłego buforu TE (3750C). 8. Wirowanie z prędkością 11000rpm przez 1 minutę; przeniesienie przesączu do nowej probówki 1.5ml. 9. Dodanie 3M NaOH; inkubacja w 37C przez 15 minut. 10. Dodanie 55μl 6M octanu amonu (pH7). 11. Dodanie 220μl etanolu 96%. 12. Umieszczenie probówki w -20C na 1 godzinę; wirowanie z prędkością 14000rpm przez 30minut w 4C. 13. Usunięcie supernatantu i dodanie 500μl etanolu 70%. 14. Wirowanie z prędkością 14000rpm przez 15minut, usunięcie supernatantu i suszenie wytrąconego DNA. 34 15. Rozpuszczenie DNA w 25μl wody destylowanej. CZĘŚĆ III. Reakcje PCR. Uzyskane DNA było matrycą dla dwóch reakcji PCR. W reakcji wykrywającej metylowany promotor, wykorzystano primery o sekwencji: SLUGM_F 5’-GCGGATATTGTGTTTTCGC-3’ SLUGM_R 5’-TTTCAAAAGAAATAACCTCGCTCG-3’ W reakcji wykrywającej niemetylowany promotor, wykorzystano primery o sekwencji: SLUGU_F 5’-TTTGGTGGATATTGTGTTTTTGTGT-3’ SLUGU_R 5’-CTCAATAAACCCCACCCACA-3’ Reakcję wykrywającą metylowany promotor przeprowadzono w mieszanie o składzie: 12.7l woda destylowana 2l bufor RedTaq (10x stężony; zawiera 15mM MgCl2) (Sigma-Aldrich) 0.4l dNTP (10mM) 0.4l MgCl2 (25mM) 1l primer F (20M) 1l primer R (20M) 0.5l polimeraza RedTaq (1U/l) (Sigma-Aldrich) 2l DNA Warunki termiczne dla tej reakcji były następujące (Termocykler T3; Biometra GmbH): 95C – 5 minut 95C – 30 sekund 56C – 30 sekund 35 cykli 72C – 30 sekund 72C – 7 minut Reakcję wykrywającą niemetylowany promotor przeprowadzono w mieszanie o składzie: 12.7l woda destylowana 2l bufor RedTaq (10x stężony; zawiera 15mM MgCl2) 0.4l dNTP (10mM) 35 1l primer F (20M) 1l primer R (20M) 0.5l polimeraza RedTaq 2l DNA Warunki termiczne dla tej reakcji były następujące (Termocykler T3; Biometra GmbH): 95C – 5 minut 95C – 30 sekund 60C – 30 sekund 35 cykli 72C – 30 sekund 72C – 7 minut Analizę dla każdej z badanych próbek przeprowadzono co najmniej dwukrotnie, w celu sprawdzenia powtarzalności wyniku. Produkty reakcji PCR sprawdzano wykonując elektroforezę (100V, 20 minut) na 2% żelu agarozowym (Sigma-Aldrich). 4.2.4 Analiza niestabilności mikrosatelitarnego DNA Analiza długości sekwencji mikrosatelitarnego DNA oparta była o reakcje PCR. Primery do reakcji zostały tak dobrane, aby powstający produkt PCR zawierał w wewnątrz swojej sekwencji badany odcinek mikrosatelitarnego DNA. Zastosowanie wysokorozdzielczej elektroforezy pozwoliło na identyfikację produktów PCR różniących się długością. Obecność w próbce nowotworowej produktów PCR o odmiennej długości względem produktów PCR z próbki prawidłowej wskazywała na niestabilność mikrosatelitarnego DNA w badanym locus. Ze względu na wysoką heterozygotyczność badanych sekwencji mikrosatelitarnych, potwierdzenie ich niestabilności możliwe jest jedynie przez porównanie materiału nowotworowego i prawidłowego od tego samego pacjenta. W pierwszym etapie do identyfikacji raków z niestabilnością mikrosatelitarnego DNA wykorzystano pięć markerów mikrosatelitarnych (APC [251], BAX [252], BATRII [253], p53 [251], BAT26 [254]). Różnice w długości produktów PCR weryfikowano poprzez elektroforezę na żelu akrylamidowym w warunkach denaturujących. 36 Sekwencje primerów 5’-AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT 5’-ACTCACTCTAGTGATAAATCG 5’-TGACTACTTTTGACTTCAGCC 5’-AACCATTCAACATTTTTAACCC 5’-CTTTATTCTGGAAGATGCTGC 5’-GAAGAAAGTCTCACCAGGC 5’-ATCCAGGATCGAGCAGGGCG 5’-ACTCGCTCAGCTTCTTGGTG 5’-AGGGATACTATTCAGCCCGAGGTG 5’-ACTGCCACTCCTTGCCCCATTC Marker APC BAT26 BATRII BAX p53 Tabela 4. Sekwencje primerów dla stosowanych markerów mikrosatelitarnych. Mieszanina reakcyjna dla tych markerów składała się z: 14l woda destylowana 2l bufor STR (Promega) 0.5l primer 1 (20M) 0.5l primer 2 (20M) 1l polimeraza Taq 1U/l (Fermentas) 2l genomowego DNA Warunki termiczne reakcji dla markerów p53, APC, BAX były następujące: 94C 94C 47C 65C 92C 55C 70C 72C p53 5min 30s 20s 10s 30s 20s 10s 10min 10 cykli 30 cykli 95C 94C 48C 66C 94C 58C 70C 72C APC 5min 30s 20s 10s 30s 30s 1min 10min 10 cykli 30 cykli 94C 94C 48C 65C 92C 55C 70C 72C BAX 5min 30s 20s 10s 30s 30s 2min 10min 10 cykli 30 cykli Tabela 5. Warunki termiczne reakcji PCR dla markerów p53, APC, BAX. Warunki termiczne reakcji dla markerów BAT26, BATRII były następujące: 95C 94C 52C 72C 72C BAT 26 5min 30s 45s 1min 10min 95C 94C 58C 72C 72C 40 cykli BATRII 5min 30s 45s 1min 10min Tabela 6. Warunki termiczne reakcji PCR dla markerów BAT26, BATRII. 37 35 cykli Elektroforezę wykonano na żelu akrylamidowym z mocznikiem, jako czynnikiem denaturującym. Skład żelu przedstawiono poniżej: 35g mocznik 17.5ml woda destylowana 14ml TBE 5x stężony 10.5ml 40% akrylamid (proporcja akrylamid : bisakrylamid 19:1) 1ml 10% APS 20l TEMED Płyty szklane, między które wylewano żel, były pokryte przed elektroforezą związkami silanu. Jedną z płyt pokrywano dimetylosilanem (MERCK) by umożliwić po elektroforezie jej odklejenie od żelu, natomiast drugą, do której przywierał żel, pokrywano silanem A (MERCK). Przed nałożeniem próbek na żel wykonywano preelektroforezę w celu podgrzania żelu (1 godzina, 55W). Na żel nakładano 4l próbki DNA, wymieszane z 4l formamidu (Applera Corporation), denaturowano w 95C przez 10 minut. Elektroforeza trwała 2 godziny (50W). Żele po elektroforezie wybarwiano metodą srebrzenia. DNA ujawniał się w postaci ciemnych prążków. srebrzenie żelu akrylamidowego: Po zakończonej elektroforezie, rozdzielano płyty szklane. Żel, przyklejony do silanizowanej płyty, umieszczono w kuwecie. 1. Płukanie żelu w wodzie destylowanej przez 10 minut. 2. Płukanie żelu w 10% etanolu przez 20 minut. 3. Płukanie żelu w 1% kwasie azotowym przez 3 minuty. 4. Płukanie żelu w 0,012M roztworze azotanu srebra w ciemności przez 20 minut. 5. Krótkie płukanie żelu wodą destylowaną (3x pół minuty). 6. Płukanie żelu w roztworze 0,28M węglanu sodu i formaliny (3l węglanu + 15ml 10% formaliny) do uzyskania ciemnego zabarwienia roztworu. Wymiana roztworu. 7. Płukanie w świeżym, bezbarwnym roztworze węglanu sodu i formaliny (wymiana roztworu w przypadku ciemnego zabarwienia) aż do pojawienia się prążków DNA (15-20 minut). 8. Płukanie żelu w 10% kwasie octowym przez 5 minut (zatrzymanie reakcji). 9. Płukanie żelu 5 minut wodą destylowaną. 10. Suszenie żelu w temperaturze pokojowej w pozycji stojącej. 38 W przypadku stwierdzenia niestabilności mikrosatelitarnego DNA w co najmniej jednym markerze wykonywano test komercyjnym zestawem 9 markerów na sekwenatorze ABI PRISM 310 (Applera Corporation). Primery znakowane były barwnikiem fluorescencyjnym by możliwa była detekcja produktów PCR. Zestaw stosowanych markerów przedstawia tabela poniżej. marker locus gen amplikon [bp] fluorochrom D1S2883 1q24 HPC1 179-199 FAM D2S123 2p16 MSH2 150-180 TET D3S1611 3p22 MLH1 184-200 TET D5S346 5q21 APC 107-137 FAM D7S501 7q31 MET 217-233 TET TP53-Di 17p13 TP53 106-138 HEX TP53-Penta 17p13 TP53 140-175 FAM NM23 17q21 NME1 (NM23-H1) 95-105 FAM D18S35 18q21 DCC 104-126 TET Tabela 7. Komercyjny zestaw 9 markerów zastosowany w analizie niestabilności DNA (Applera Corporation). Stężenia primerów dla stosowanych markerów wynosiły: 0.13M (NM23; D2S123; 3S1611; D7S501), 0.26M (TP53-Di; D18S35; D5S346), 0.39M (D1S2883), 0.66M (TP53-Penta). Do wykonania reakcji PCR przygotowano następujące mieszaniny: MIX I (1l PE PCR Buffer II 10x; 1.08l MgCl2 25mM; 0.68l dNTP 10mM) MIX II (30l genomowego DNA; 2.5l polimerazy GoldTaq 5U/l) Mieszanina reakcyjna PCR dla pojedynczego markera zawierała: 2.76l MIX I 4.74l roztwór pary primerów 2.5l MIX II 39 Reakcje PCR przeprowadzono w termocyklerze T3 (Biometra GmbH). Warunki reakcji dla wszystkich markerów z tego panelu były następujące: 95°C – 1 minuta 96°C – 10 sekund 55°C – 30 sekund 30 cykli 70°C – 3 minuty 70°C – 30 minut Produkty PCR wymieszano w probówce 1.5ml w następującej proporcji: 2l D1S2883, 2l D2S123, 2l D3S1611, 2l D5S346, 3l D7S501, 3l TP53-Di, 2l TP53Penta, 3l NM23, 3l D18S35. Pobrano 2l przygotowanej mieszaniny do nowej probówki 0.5ml, dodano 12l formamidu i 0.5l standardu długości TAMRA-500 (Applera Corporation). Przygotowaną w ten sposób próbkę denaturowano w 95°C przez 4 minuty. Po ochłodzeniu próbki na lodzie, przeprowadzano elektroforezę kapilarną na sekwenatorze ABI PRISM 310 (Applera Corporation). Warunki elektroforezy były następujące: kapilara 47cm, polimer POP4, czas iniekcji 5 sekund, czas elektroforezy 24 minuty, 15kV, temperatura 60C. Wyniki analizowano firmowym programem GeneScan. Rycina 8. Wynik analizy MSI na aparacie ABI PRISM 310. Niestabilność mikrosatelitarna w locus APC; rak nr 4. 4N – DNA spoza guza; 4T – DNA z nowotworu. Raki wykazujące niestabilność w więcej niż 40% markerów klasyfikowano jako wysoceniestabilne (MSI-H). Niestabilność poniżej 40% markerów, ale więcej niż jeden 40 niestabilny klasyfikowano jako niską (MSI-L). Pozostałe raki uznano za stabilne (MSS). Stopniowanie niestabilności przyjęto wg wytycznych „Bethesda Guidelines” [67]. 4.2.5 Analiza mutacji genów KRAS i BRAF Pierwszym etapem analizy była amplifikacja wybranych fragmentów genów metodą PCR. Amplifikacji poddano eksony 1, 2, 3, genu KRAS oraz 11, 15 genu BRAF. Wybrane eksony kodują kluczowe fragmenty, w których zdarzają się onkogenne mutacje. Dla amplikonów KRAS 1, KRAS 2, BRAF 11, BRAF 15 wykorzystano sekwencje primerów opublikowane w literaturze [Tabela 8]. Sekwencje primerów do amplifikacji eksonu 3 genu KRAS zostały zaprojektowane na podstawie referencyjnej sekwencji NG_007524.1 z banku genów. Przy projektowaniu wykorzystano program komputerowy FastPCR [255]. Sekwencje primerów przestawia Tabela 8. Gen /ekson KRAS 1 para primerów źródło 5’-GACTGAATATAAACTTGTGG długość produktu Ta [C] PCR [bp] [256] 163 55 [256] 161 55 * 164 52 [257] 193 57 [179] 224 57 5’-CTGTATCAAAGAATGGTCCT KRAS 2 5’-GACTGTGTTTCTCCCTTCT 5’-TGGCAAATACACAAAGAAAG KRAS 3 5'-AAAGAGTTAAGGACTCTG 5'-TTCAGTGTTACTTACCTG BRAF 11 5'-TTCTGTTTGGCTTGACTTGACTT 5'-ACTTGTCACAATGTCACCACATT BRAF 15 5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA 5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA Tabela 8. Sekwencje primerów zastosowane do amplifikacji wybranych fragmentów genów. *projekt własny. Reakcję amplifikacji dla amplikonów KRAS 1, KRAS 2 przeprowadzono w mieszanie reakcyjnej o składzie: 12.78l woda destylowana 2l bufor RedTaq (10x stężony; zawiera 11mM MgCl2) (Sigma-Aldrich) 0.4l dNTP (10mM) 0.32l MgCl2 (25mM) (stężenie w mieszaninie 1.5mM) 41 1l primer F (20M) 1l primer R (20M) 0.5l polimeraza RedTaq (1U/l) (Sigma-Aldrich) 2l DNA Reakcję amplifikacji dla amplikonów KRAS 3, BRAF 11, BRAF 15 przeprowadzono w mieszanie reakcyjnej o składzie: 12.38l woda destylowana 2l bufor RedTaq (10x stężony; zawiera 11mM MgCl2) (Sigma-Aldrich) 0.4l dNTP (10mM) 0.72l MgCl2 (25mM) (stężenie w mieszaninie 2.0mM) 1l primer F (20M) 1l primer R (20M) 0.5l polimeraza RedTaq (1U/l) (Sigma-Aldrich) 2l DNA Warunki termiczne dla tych reakcji były następujące (Termocykler T3; Biometra GmbH): 95C – 5 minut 95C – 30 sekund TaC – 30 sekund 35 cykli 72C – 30 sekund 72C – 7 minut Obecność produktów reakcji PCR sprawdzano poprzez elektroforezę na 2% żelu agarozowym (110V; 15minut). Kolejnym etapem wykrywania mutacji była analiza SSCP (ang. Single-Stranded Conformational Polymorphism). Jednoniciowy DNA przybiera konformację przestrzenną zależną od sekwencji zasad. Mobilność elektroforetyczna takich fragmentów zależy od ich konformacji. W tej metodzie wykorzystuje się odmienną migrację elektroforetyczną jednoniciowych fragmentów DNA różniących się konformacją, a tym samym sekwencją. Istotne w tej metodzie jest zachowanie stałych, niedenaturujących warunków elektroforezy, aby jednoniciowe fragmenty DNA zachowały właściwą sobie konformację. 42 Produkt PCR (5l) wymieszano z 5l formamidu (Applera Corporation) i poddano denaturacji w 95C przez 10 minut. Dodanie formamidu zapobiegało odtwarzaniu wiązań wodorowych między komplementarnymi fragmentami. Próbki przeniesiono następnie na lód na co najmniej 5 minut. Po schłodzeniu, nakładano próbki na żel MDE w celu rozdziału elektroforetycznego. Sposób przygotowania żeli przedstawiono poniżej: 5.6ml buforu TBE 5x 14ml MDE 2x (Cambrex Inc) – żel 0.8 lub 10.5ml MDE 2x – żel 0.6 Dopełnienie wodą dejonizowaną do 35ml 300l 10% APS (Sigma-Aldrich) 35l TEMED Żel polimeryzował godzinę między szklanymi płytami. Elektroforezę przeprowadzono na aparacie Protean II XI Cell (Bio-Rad Laboratories) w buforze TBE 1x. Stałą temperaturę żeli osiągnięto poprzez zastosowanie systemu chłodzenia MultiTemp III (Amersham Pharmacia Biotech). Stężenie żelu MDE oraz warunki elektroforezy dla poszczególnych amplikonów przedstawia Tabela 9. stężenie żelu temperatura napięcie MDE żelu [C] prądu [V] KRAS 1 0,6 18 170 15 KRAS 2 0,8 8 170 18 KRAS 3 0,8 8 170 18 BRAF 11 0,8 8 170 18 BRAF 15 0,8 8 170 18 Gen/ekson czas elektroforezy [h] Tabela 9. Warunki elektroforezy i stężenia żelu MDE. Żele wizualizowano metodą srebrzenia po zakończonej elektroforezie. Warunki zostały zmodyfikowane względem srebrzenia żeli akrylamidowych, stosowanych przy detekcji niestabilności mikrosatelitarnego DNA. Uzyskany obraz prążków odpowiadał migracji jednoniciowych fragmentów DNA. Protokół tej metody przedstawiono poniżej. srebrzenie żelu MDE: Po zakończonej elektroforezie, żel odklejono od szklanych płyt i umieszczono w kuwecie. 1. Płukanie żelu w 10% etanolu przez 5 minut. 43 2. Płukanie żelu w 1% kwasie azotowym przez 3 minuty. 3. Płukanie żelu w wodzie destylowanej nie dłużej niż 1 minutę. 4. Płukanie żelu w 0,012M roztworze azotanu srebra w ciemności przez 20 minut. 5. Płukanie żelu 2 minuty wodą destylowaną. 6. Płukanie żelu w roztworze 0,28M węglanu sodu, nie dłużej niż 1 minutę. 7. Płukanie żelu w roztworze 0,28M węglanu sodu i formaliny w stężeniu 0.02% (SigmaAldrich) do uzyskania ciemnego zabarwienia roztworu. Wymiana roztworu. 8. Płukanie w świeżym, bezbarwnym roztworze węglanu sodu i formaliny (wymiana roztworu przypadku ciemnego zabarwienia) aż do pojawienia się prążków DNA (15-20 minut). 9. Płukanie żelu w 10% kwasie octowym przez 2 minuty (zatrzymanie reakcji). 10. Płukanie żelu 2 minuty wodą destylowaną. 11. Suszenie żelu w 80C przez 50 minut. Wysrebrzony żel przenoszono na bibułę filtracyjną (Whatman) i suszono w suszarce do żeli 583 Gel Dryer (Bio-Rad Laboratories) połączonej z pompą próżniową Hydro-Tech (Bio-Rad Laboratories). Obecność dodatkowych prążków w materiale nowotworowym, względem układu prążków tkanki prawidłowej, świadczyła o mutacji. Rycina 9 przedstawia przykładowy wynik analizy SSCP. Rycina 9. Wysrebrzony żel MDE. Wynik analizy SSCP dla eksonu 1 genu KRAS; próbki 10-14. N – amplikon z tkanki prawidłowej, T – amplikon z tkanki nowotworowej. Dodatkowe prążki w próbkach 10T; 11T; 12T; 13T; świadczą o obecności mutacji w nowotworze. 44 Kolejnym etapem analizy było ustalenie sekwencji mutanta. W tym celu dodatkowe prążki DNA, migrujące w odmienny sposób względem materiału z tkanki prawidłowej, wycięto z wysuszonego żelu MDE i poddano ekstrakcji wodnej. Wycięty fragment żelu wraz z prążkiem DNA umieszczono w 2.0ml probówce i dodano 50l wody. Próbkę inkubowano w 65C przez 15 minut, a następnie w -20C przez 15 minut. Inkubację w naprzemiennych temperaturach powtórzono jeszcze dwukrotnie. Uzyskany wodny roztwór DNA posłużył jako matryca do reakcji PCR, w której reamplifikowano badany fragment. Reakcję PCR przeprowadzono podobnie jak dla genomowego DNA dodając jako matrycę 10l roztworu DNA i odpowiednio mniej wody destylowanej, tak by końcowa objętość reakcji wynosiła 20l. Uzyskany produkt PCR poddano elektroforezie na 2% żelu agarozowym z bromkiem etydyny (100V; 25minut), w celu oczyszczenia powielonego fragmentu DNA z innych składników mieszaniny reakcyjnej. Produkt PCR, w postaci prążka w żelu agarozowym, został wycięty skalpelem, przeniesiony do probówki 1.5ml i zważony. Następnie oczyszczano DNA z agarozy komercyjnym zestawem Agarose QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH) wg procedury przedstawionej poniżej. 1. Dodanie buforu QG w proporcji 300l buforu : 100mg agarozy. 2. Inkubacja w 50C przez 10 minut lub do całkowitego rozpuszczenia agarozy. 3. Dodanie izopropanolu w proporcji 100l izopropanolu : 100mg agarozy. 4. Przeniesienie roztworu na kolumnę do izolacji. 5. Wirowanie 13000rpm przez 1 minutę. 6. Dodanie do kolumny 750l buforu PE i odczekanie 3 minuty. 7. Wirowanie 13000rpm przez 1 minutę. 8. Ponowne wirowanie kolumny 13000rpm przez 1 minutę w nowych probówkach w celu usunięcia resztek buforu PE. 9. Naniesienie na złoże kolumny 30l wody destylowanej i odczekanie 5 minut. 10. Wirowanie 13000rpm przez 1 minutę. DNA znajdował się w wodnym przesączu otrzymanym po wirowaniu. W celu oceny izolacji, 5l przesączu sprawdzono wykonując elektroforezę na 2% żelu agarozowym (110V; 15 minut). Oczyszczony w ten dideoksynukleotydami sposób znakowanymi DNA stanowił matrycę do fluorochromami reakcji PCR z (sekwencyjny PCR). Dideoksynukleotyd dołączony do nowo syntetyzowanej nici DNA uniemożliwia dalszy przebieg polimeryzacji ze względu na brak grupy hydroksylowej w pozycji 3’, która jest 45 niezbędna do reakcji z resztą kwasu fosforowego kolejnego nukleotydu. Zastosowanie dideoksynukleotydów w odpowiednim niskim stężeniu w reakcji PCR umożliwia zatrzymanie polimeryzacji nici DNA w każdej możliwej pozycji. Znakowanie dideoksynukleotydu fluorochromem umożliwia detekcję produktu PCR, który na końcu 3’ posiada wstawiony taki nukleotyd. Zastosowanie odpowiednich fluorochromów dla każdej zasady azotowej pozwala na ich rozróżnienie na podstawie długości fali emitowanego światła, a tym samym poznanie sekwencji badanego fragmentu DNA. Skład mieszaniny reakcyjnej dla tej reakcji przedstawiono poniżej. 2l BD Seq Buffer 5x (Applera Corporation) 4l Ready Reaction Mix v3.1 (Applera Corporation) 1l primer (2M) (F lub R) 11l woda destylowana 2l matryca DNA Warunki reakcji były następujące: 96C – 1 minuta 96C – 10 sekund 50C – 5 sekund 25 cykli 60C – 4 minuty Uzyskany produkt PCR poddano precypitacji w celu oczyszczenia. Procedurę opisano poniżej. 1. Koncentracja Produktu PCR do objętości około 5l. 2. Dodanie 50l 99.8% etanolu schłodzonego do temperatury -20C. 3. Dodanie 20l 2mM MgCl2 schłodzonego do temperatury 4C; worteksowanie. 4. Inkubacja w -20C przez 30 minut. 5. Wirowanie w temperaturze 4C przez 20 minut przy 14000 rpm. 6. Usunięcie supernatantu. 7. Dodanie 250l 70% etanolu schłodzonego do temperatury -20C. 8. Wirowanie w temperaturze 4C przez 20 minut przy 14000 rpm. 9. Usunięcie supernatantu. 10. Suszenie precypitatu w temperaturze 60C przez 10 minut. 46 Oczyszczony produkt PCR rozpuszczono w 20l formamidu (Applera Corporation) i denaturowano w temperaturze 95C przez 4 minuty. Po schłodzeniu na lodzie, próbkę poddawano elektroforezie kapilarnej na aparacie ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Warunki elektroforezy były następujące: kapilara 60cm, polimer POP6, czas iniekcji 30 sekund, czas elektroforezy 70 minut, 15kV, temperatura 50C. Uzyskane surowe dane analizowano w programie producenta (Sequencing Analysis Software). Przetworzone dane przenoszono z komputera Macintosh na komputer PC i analizowano w programie CHROMAS. Obraz sekwencji w programie CHROMAS przedstawia Rycina 10. Rycina 10. Wynik sekwencjonowania dla próbek 10T, 11T, 12T, 13T. Mutacje zaznaczono czerwoną ramką. Wynik analizy SSCP dla tych próbek przedstawia Rycina 9. 47 Sekwencję referencyjną zapisano w formacie fasta i porównywano z prawidłową sekwencją z banku genów za pomocą programu BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Ustalano typ mutacji oraz jej efekt na poziomie białka. 4.2.6 Stosowane testy statystyczne Analizę statystyczną wykonano w programie STATISTICA 7. Wykorzystano testy 2 (Pearsona i NW), ANOVA Kruskala-Wallisa i U Manna-Whitneya. Poziom istotności ustalono na p<0,05. 48 5. Wyniki 5.1 Lokalizacja i stopień zaawansowania. Obiektem analizy były 163 sporadyczne gruczolakoraki. Większość z nich (58%) przerzutowała do węzłów chłonnych i/lub lokalizacji odległych w momencie resekcji. Odsetek guzów pierwotnych w jelicie wzrastał w kierunku dystalnym. Najczęściej raki wykazywały pośredni stopień zróżnicowania G2 (63%). Produkcja śluzu cechowała co piąty nowotwór (19%). Lokalizacja okrężnica prawostronna 24% okrężnica lewostronna 35% odbytnica 41% Tabela 10. Podział badanej grupy raków ze względu na lokalizację. 24% 35% 41% Rycina 11. Lokalizacja badanych raków w jelicie grubym. 49 Klasyfikacja Astlera – Collera A 3% B1 25% B2 13% C1 9% C2 36% D 13% Tabela 11. Podział badanej grupy raków ze względu na stopień zaawansowania. Stopień zróżnicowania G1 26% G2 63% G3 11% Tabela 12. Podział badanej grupy raków ze względu na stopień zróżnicowania. 5.2 Niestabilność mikrosatelitarnego DNA Wysoką niestabilność mikrosatelitarnego DNA stwierdzono w 14 (9%) rakach. W tej grupie znamienna statystycznie była częstsza prawostronna lokalizacja - 71% (10/14; p=0,00003) oraz sekrecja śluzu – 43% (6/14; p=0,017). 64% (9/14) związanych było z płcią żeńską (p=0,14; NS). Niską niestabilność mikrosatelitarnego DNA stwierdzono w 16 (10%) nowotworach. 10 (63%) zlokalizowanych było w okrężnicy lewostronnej, a 5 (31%) w odbytnicy. Tylko 1 rak MSI-L (6%) miał prawostronną lokalizację. Różnica w lokalizacji jest bliska istotności statystycznej w porównaniu z rakami MSS (p=0,068). 69% (11/16) związanych było z płcią męską (p=0,34; NS). niestabilnośd mikrosatelitarnego DNA MSI-H 9% MSI-L 10% MSS 81% Rycina 12. Podział raków ze względu na stabilność mikrosatelitarnego DNA. 50 Nie stwierdzono znamiennych różnic w zaawansowaniu nowotworów. Odsetek raków przerzutujących (Astler-Coller C1, C2, D) wynosił w badanych grupach: 50% MSI-H, 56% MSI-L, 59% MSS (p=0,78). 5.3 Mutacje genów KRAS i BRAF Wykryto mutacje KRAS w 58 (35,6%) nowotworach. Zdecydowana większość to mutacje punktowe zmiany sensu. Wykryto tylko jedną insercję. 51 mutacji zlokalizowanych było w eksonie 1, 5 w eksonie 2, 2 w eksonie 3. Mutację BRAF wykryto w 6 rakach (3,7%). Tylko 1 mutacja zlokalizowana była w eksonie 11, pozostałe w eksonie 15. Mutacje KRAS białko G12C G12S G12V G12D G12A G13C G13D A59G Q61H Q61H A66_M67insEEYSA K117N K117N DNA 34G>T 34G>A 35G>T 35G>A 35G>C 37G>T 38G>A 176C>G 183A>T 183A>C 198_199insGAGGA GTACAGTGCA 351A>T 351A>C ekson 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 l. przypadków 10 3 12 9 4 1 12 2 1 1 2 1 3 3 1 1 ekson 11 15 15 15 15 l. przypadków 1 1 1 2 1 Mutacje BRAF białko G469A D594G G596R V600E K601N DNA 1406G>C 1781A>G 1786G>C 1799T>A 1803A>T Tabela 13. Mutacje genów KRAS i BRAF wykryte w badanych nowotworach. 51 Mutacje najczęściej występowały w okrężnicy lewostronnej – 49% (26 mutacji KRAS, 2 mutacje BRAF, 29 raków bez mutacji). W odbytnicy odsetek mutacji wynosił 35,8% (22 mutacji KRAS, 2 mutacje BRAF, 43 raków bez mutacji). Najrzadziej występowały w okrężnicy prawostronnej – 31,6% (10 mutacji KRAS, 2 mutacje BRAF, 26 raków bez mutacji). Różnice w odsetkach mutacji w lokalizacjach nie były istotne statystycznie (p=0,15). Wykryto 7 mutacji KRAS i 2 mutacje BRAF w rakach MSI-L (56,3%; 9/16). W grupie MSI-H były 2 mutacje KRAS i 2 mutacje BRAF (28,6%; 4/14). Odsetek mutacji w rakach MSS wyniósł 38,3% (49 mutacji KRAS, 2 mutacje BRAF, 82 raki bez mutacji). Nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic pod względem częstości mutacji między grupami MSI-H a MSS (KRAS+BRAF p=0,47; KRAS p=0,09) oraz MSI-L a MSS (KRAS+BRAF p=0,17; KRAS p=0,59). Mutacje KRAS najczęściej występowały w rakach z przerzutami odległymi (M0 33% vs M1 50%), ten wynik również nie był istotny statystycznie (p=0,13). Nie stwierdzono współistnienia mutacji obu genów w jednym nowotworze. Mutacje KRAS i BRAF a niestabilnośd mikrosateliarna 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% brak mutacji BRAF KRAS MSI-H MSI-L MSS Wykres 2. Odsetek mutacji KRAS i BRAF w grupach o różnej stabilności mikrosateliarnego DNA. 5.4 Ekspresja SNAI2 Wszystkie raki wykazywały obecność białka Slug z jądrową lokalizacją. Spośród 116 analizowanych raków tylko 3 miały odsetek pozytywnych komórek na poziomie 10%, w pozostałych przypadkach odsetki były wyższe. Wyniki analizy ekspresji genu SNAI2 pod kątem cech klinicznych, histologicznych i molekularnych przedstawia Tabela 14. Odsetek komórek nowotworowych z ekspresją genu wzrasta ze stopniem zaawansowania. Różnice w ekspresji między stopniami wg klasyfikacji Astlera – Collera oraz zaawansowaniem nacieku 52 ściany jelita (cecha pT) są bliskie istotności statystycznej. Znamienna statystycznie jest wyższa ekspresja w rakach przerzutujących (C1, C2, D) niż ograniczonych do ściany jelita (A, B1, B2). Analizując stopień zajęcia węzłów chłonnych (cecha pN) obserwuje się istotną, pozytywną korelację przerzutów z ekspresją. Brak jest różnicy dla cechy M (przerzuty odległe). Obecność komórek nowotworowych w naczyniach krwionośnych ma związek ze znamiennie wyższą ekspresją. Odsetek komórek pozytywnych w guzie wzrasta z pogarszającym się stopniem zróżnicowania (G). Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w zależności od lokalizacji, wytwarzania śluzu przez nowotwór, stopnia stabilności mikrosatelitarnego DNA oraz mutacji KRAS i BRAF. Średni odsetek komórek z jądrową ekspresją SNAI2 Lokalizacja o. prawostronna o. lewostronna odbytnica 60,2% 65,8% 68,4% Stopień zaawansowania wg Astlera – Collera A B1 B2 C1 C2 D 51,7% 57,7% 63,8% 59% 72,7% 68,1% Stopień zaawansowania wg Astlera – Collera A, B1, B2 C1, C2, D 59,2% 69,7% Zaawansowanie guza pierwotnego (pT) T1 T2 T3 T4 51,7% 59,5% 70,1% 69,2% Przerzuty do węzłów chłonnych (pN) N0 N1 N2 58,9% 67,2% 72,1% Przerzuty odległe (M) M0 M1 65,4% 68,1% Obecność komórek raka w naczyniach krwionośnych (pV) V0 V1 61,6% 70,5% Obecność komórek raka w naczyniach limfatycznych (pL) L0 L1 63,3% 67,9% Ciąg dalszy na następnej stronie 53 Test KruskalaWallisa p=0,34 p=0,072 p=0,012; IS p=0,079 p=0,02; IS p=0,86 p=0,036; IS p=0,42 Test KruskalaWallisa Średni odsetek komórek z jądrową ekspresją SNAI2 Stopień zróżnicowania G2 65,6% Obecność śluzu G1 59,4% p=0,055 G1 vs G3: p=0,01; IS G3 77,7% obecny nieobecny 63,3% 66% Niestabilność mikrosatelitarna MSI-H MSI-L MSS 61,7% 70,7% 65,1% Mutacje KRAS+BRAF nie wykryto wykryto mutację 66,3% 64,6% Mutacje KRAS nie wykryto wykryto mutację 67% 63% p=0,29 p=0,53 p=0,75 p=0,47 Tabela 14. Porównanie eskpresji SNAI2 z cechami klinicznymi, histologicznymi i molekularnymi. Ekspresję genu SNAI2 w zależności od stopnia zaawansowania, niestabilności mikrosatelitarnej oraz mutacji KRAS i BRAF przedstawiono graficznie na poniższych wykresach. 100% 90% Ekspresja SNAI2 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% A B-1 B-2 C-1 C-2 D Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Stopień zaawansowania wg Astlera - Collera Wykres 3. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od stopnia zaawansowania wg klasyfikacji Astlera – Collera. 54 100 % 90 % Ekspresja SNAI2 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std 30 % AB CD Stopień zaawansowania wg Astlera - Collera Wykres 4. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od stopnia zaawansowania. Raki ograniczone do ściany jelita (AB), raki przerzutujące (CD). 100 % 90 % Ekspresja SNAI2 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % 20 % 10 % 1 2 3 4 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Zaawansowanie guza pierwotnego (pT) Wykres 5. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od zaawansowania guza pierwotnego (cecha pT). 55 100% 90% Ekspresja SNAI2 80% 70% 60% 50% 40% 30% 0 1 2 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Przerzuty do węzłów chłonny ch (pN) Wykres 6. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od przerzutów do węzłów chłonnych (cecha pN). 100% 90% Ekspresja SNAI2 80% 70% 60% 50% 40% 30% 0 1 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Przerzuty odległe (cecha M) Wykres 7. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od przerzutów odległych (cecha M). 56 100% 90% Ekspresja SNAI2 80% 70% 60% 50% 40% 30% 0 1 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Obecność komórek nowotworowy ch w n. krwionośny ch (pV) Wykres 8. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od obecności komórek nowotworowych w naczyniach krwionośnych (cecha pV). 100% 90% Ekspresja SNAI2 80% 70% 60% 50% 40% 30% 0 1 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Obecność komórek nowotworwy ch w n. limf aty czny ch (pL) Wykres 9. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od obecności komórek nowotworowych w naczyniach limfatycznych (cecha pL). 57 100 % 90 % Ekspresja SNAI2 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % MSS MSI-L MSI-H Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std niestabilność mikrosatelitarna Wykres 10. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od stopnia stabilności mikrosatelitarnego DNA. 100 % 90 % Ekspresja SNAI2 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % brak mutacji mutacja Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Mutacje KRAS i BRAF Wykres 11. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od mutacji genów KRAS i BRAF. 58 Rycina 13. Ekspresja SNAI2. Jądrowa lokalizacja odczynu w komórkach nowotworowych. Powiększenie obiektywu 40x. Rycina 14. Ekspresja SNAI2. Cytoplazmatyczny odczyn w niektórych komórkach nabłonka jelita grubego. Powiększenie obiektywu 60x. 59 5.5 Metylacja promotora genu SNAI2 Wykryto metylację promotora genu SNAI2 w 54 (33%) rakach. 109 (67%) raków cechowała hipometylacja. Hipometylacja promotora koreluje znamiennie z ekspresją genu (odsetek komórek pozytywnych w rakach z metylacją średnia=58%; mediana=60%, odsetek komórek pozytywnych w rakach z hipometylacją średnia=70%; mediana=75%, p=0,01). Poniższy wykres jest graficzną prezentacją tej zależności. 100 % 90 % Ekspresja SNAI2 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % hipometylacja metylacja Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std metylacja SNAI2 Wykres 12. Ekspresja SNAI2. Średni odsetek komórek pozytywnych w zależności od metylacji promotora SNAI2. Wyniki analizy metylacji genu SNAI2 pod kątem cech klinicznych, histologicznych i molekularnych przedstawia Tabela 15. Odsetek raków z hipometylacją promotora genu wzrasta ze stopniem zaawansowania. Znamiennie częściej obserwuje się hipometylację ze wzrostem stopnia zaawansowania wg klasyfikacji Astlera – Collera, z zaawansowaniem nacieku ściany jelita (cecha pT), stopniem zajęcia węzłów chłonnych (cecha pN), obecnością przerzutów odległych (cecha M) oraz obecnością komórek nowotworowych w naczyniach krwionośnych i limfatycznych (cechy pV i pL). Różnice w metylacji między stopniami stabilności mikrosatelitarnego DNA są istotne statystycznie. Najniższy odsetek raków z hipometylacją był w grupie z wysoką niestabilnością, najwyższy w rakach MSI-L. Rzadsza 60 hipometylacja w rakach wytwarzających śluz jest bliska istotności statystycznej. Istnieje nieznamienna tendencja do częstszej hipometylacji w rakach gorzej zróżnicowanych. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w zależności od lokalizacji oraz mutacji KRAS i BRAF. Hipometylacja promotora SNAI2 ze względu na związek z obecnością komórek w naczyniach i przerzutami może być potencjalnym markerem zdolności do migracji komórek nowotworowych. Raki naciekające mięśniówkę właściwą (T2) podzielono na wykazujące cechy migracji (obecność przerzutów lub komórek w naczyniach) – 27 przypadków i pozostałe – 30. Hipometylację wykryto w 52% (14/27) raków „migrujących” i w 46,7% (14/30) pozostałych. Wynik ten nie był istotny statystycznie (p=0,69). Statystycznie znamienna różnica istnieje w przypadku raków przekraczających mięśniówkę (T3) (p=0,006). 76% (57/75) raków „migrujacych” w tej grupie cechowała hipometylacja w porównaniu z 38,5% (5/13) pozostałych raków. Podobny rezultat uzyskano analizując raki ograniczone do ściany jelita B1 i B2 w klasyfikacji Astlera – Collera. Guzy pierwotne B1 ( nieprzekraczające mięśniówki właściwej) wykazujące obecność komórek nowotworowych w naczyniach były metylowane w 50% (5/10), natomiast w guzach B1 nie wykazujących obecności nowotworu w naczyniach hipometylację wykryto w 44,8%. Ta różnica nie była znamienna statystycznie (p=0,77). Statystycznie istotna różnica została zaobserwowana w bardziej zaawansowanych rakach przekraczających mięśniówkę właściwą B2 (p=0,004). Hipometylacja w rakach B2 bez obecności komórek nowotworu w naczyniach wynosiła 33,3% (4/12), ale w rakach wykazujących obecność komórek nowotworu w naczyniach 100% (7/7). Odsetek raków z hipometylacją SNAI2 Test χ2 Lokalizacja o. lewostronna 70,2% (40/57) p=0,23 o. prawostronna 55,3% (21/38) odbytnica 57,4% (39/68) Stopień zaawansowania wg Astlera – Collera A B1 B2 C1 C2 D 47,5% 57,1% 46,7% 72% 85% 20% (1/5) (19/40) (12/21) (7/15) (41/57) (17/20) Stopień zaawansowania wg Astlera – Collera A, B1, B2 C1, C2, D 48,5% (32/66) 70,7% (65/92) Ciąg dalszy na następnej stronie 61 p=0,007; IS p=0,004; IS Odsetek raków z hipometylacją SNAI2 Zaawansowanie guza pierwotnego (pT) T1 T2 T3 T4 20% (1/5) 49,1% (28/57) 69,7% (62/89) 75% (6/8) Przerzuty do węzłów chłonnych (pN) N0 N1 N2 50% (34/68) 58,3% (21/36) 77,8% (42/54) Przerzuty odległe (M) M0 M1 57,7% (79/137) 85% (17/20) Obecność komórek raka w naczyniach krwionośnych (pV) V0 V1 53,8% (57/106) 75% (36/48) Obecność komórek raka w naczyniach limfatycznych (pL) L0 L1 53,4% (55/103) 74,5% (38/51) Stopień zróżnicowania G1 G2 G3 48,8% (20/41) 66,3% (67/101) 58,8% (10/17) Obecność śluzu obecny nieobecny 48,4% (15/31) 64,4% (85/132) Niestabilność mikrosatelitarna MSI-H MSI-L MSS 42,9% (6/14) 93,8% (15/16) 59,4% (79/133) Mutacje KRAS+BRAF obecna mutacja brak mutacji 64,1% (41/64) 59,6% (59/99) Mutacje KRAS obecna mutacja brak mutacji 65,5% (38/58) 59% (62/105) Test χ2 p=0,015; IS p=0,007; IS p=0,019; IS p=0,013; IS p=0,012; IS p=0,15 p=0,09 p=0,009; IS Tabela 15. Porównanie metylacji promotora SNAI2 z cechami klinicznymi, histologicznymi i molekularnymi. 62 p=0,57 p=0,42 Metylację promotora genu SNAI2 w zależności od stopnia zaawansowania, niestabilności mikrosatelitarnej oraz mutacji KRAS i BRAF przedstawiono graficznie na poniższych wykresach. 100% 90% odsetek raków 80% 70% 60% 50% 40% metylacja 30% hipometylacja 20% 10% 0% A B1 B2 C1 C2 D stopieo zaawansowania wg Astlera Collera odsetek raków Wykres 13. Metylacja i hipometylacja promotora genu SNAI2 w zależności od stopnia zaawansowania. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% metylacja hipometylacja AB CD stopieo zaawansowania - raki nieprzerzutujące (AB) vs przerzutujące (CD) Wykres 14. Metylacja i hipometylacja promotora genu SNAI2 w zależności od obecności przerzutów. 63 100% 90% odsetek raków 80% 70% 60% 50% 40% metylacja 30% hipometylacja 20% 10% 0% T1 T2 T3 T4 stopieo zaawansowania guza pierwotnego Wykres 15. Metylacja i hipometylacja promotora genu SNAI2 w zależności od stopnia zaawansowania guza pierwotnego (cecha pT). 100% 90% odsetek raków 80% 70% 60% 50% metylacja 40% hipometylacja 30% 20% 10% 0% N0 N1 N2 przerzuty do węzłów chłonnych Wykres 16. Metylacja i hipometylacja promotora genu SNAI2 w zależności od przerzutów do węzłów chłonnych (cecha pN). 64 100% 90% odsetek raków 80% 70% 60% 50% 40% metylacja 30% hipometylacja 20% 10% 0% M0 M1 przerzuty odległe Wykres 17. Metylacja i hipometylacja promotora genu SNAI2 w zależności od przerzutów odległych (cecha M). 100% 90% odsetek raków 80% 70% 60% 50% 40% metylacja 30% hipometylacja 20% 10% 0% V0 V1 komórki nowotworowe w n. krwionośnych Wykres 18. Metylacja i hipometylacja promotora genu SNAI2 w zależności od obecności komórek nowotworowych w naczyniach krwionośnych (cecha pV). 65 100% 90% odsetek raków 80% 70% 60% 50% 40% metylacja 30% hipometylacja 20% 10% 0% L0 L1 komórki nowotworowe w n. limfatycznych Wykres 19. Metylacja i hipometylacja promotora genu SNAI2 w zależności od obecności komórek nowotworowych w naczyniach limfatycznych (cecha pL). 100% 90% odsetek raków 80% 70% 60% 50% 40% metylacja 30% hipometylacja 20% 10% 0% MSS MSI-L MSI-H niestabilnośd mikrosatelitarna Wykres 20. Metylacja i hipometylacja promotora genu SNAI2 w zależności od stopnia stabilności mikrosatelitarnego DNA. 66 100% 90% odsetek raków 80% 70% 60% 50% 40% metylacja 30% hipometylacja 20% 10% 0% brak mutacji obecna mutacja mutacje KRAS i BRAF Wykres 21. Metylacja i hipometylacja promotora genu SNAI2 w zależności od mutacji genów KRAS i BRAF. 5.6 Podsumowanie wyników 1. Wszystkie raki wykazywały obecność białka Slug z jądrową lokalizacją, jednak różniły się odsetkiem pozytywnych komórek. 2. Odsetek komórek pozytywnych korelował z zaawansowaniem choroby nowotworowej. Wyższą, istotną statystycznie (p<0,05) ekspresję wykazywały raki: Przerzutujące (C1, C2, D wg Astlera – Collera) niż ograniczone do ściany jelita (A, B1, B2 wg Astlera – Collera) 3. Przerzutujące do węzłów chłonnych (cecha pN) Nisko zróżnicowane (G3) niż wysoko zróżnicowane (G1) Wykryto metylację promotora SNAI2 w 54 (33%) rakach. Pozostałe 109 (67%) raków cechowała hipometylacja. 4. Wykazano istotną statystycznie korelację hipometylacji promotora z ekspresją SNAI2. 5. Stwierdzono znamienną statystycznie (p<0,05) korelację hipometylacji SNAI2 z następującymi cechami nowotworu: stopień zaawansowania wg Astlera – Collera z wielkością guza pierwotnego (cecha pT) z przerzutami do węzłów chłonnych (cecha pN) z przerzutami odległymi (cecha M) z obecnością komórek nowotworowych w naczyniach limfatycznych (cecha pL) 67 6. z obecnością komórek nowotworowych w naczyniach krwionośnych (cecha pV) Poziom stabilności mikrosatelitarnego DNA związany jest z metylacją SNAI2. Odsetek raków z hipometylacją wzrastał w kolejności MSI-H, MSS, MSI-L. 7. Wykryto 14 (9%) raków z wysoką niestabilnością mikrosatelitarną DNA (MSI-H), 16 (10%) raków z niską niestabilnością DNA (MSI-L). Pozostałe 133 (81%) przypadki nie wykazywały niestabilności (MSS). Raki MSI-H miały istotną statystycznie prawostronną lokalizację oraz sekrecję śluzu. Raki MSI-L wykazywały tendencję do lewostronnej lokalizacji i częstszych mutacji KRAS i BRAF. 8. 58 (35,6%) raków posiadało mutację genu KRAS i tylko 6 (3,7%) genu BRAF. Nie stwierdzono współistnienia mutacji obu genów w jednym nowotworze. 68 6. Omówienie wyników i dyskusja 6.1 Ekspresja genu SNAI2 Ekspresja SNAI2 została oceniona w 116 przypadkach gruczolakoraków jelita grubego. We wszystkich badanych fragmentach stwierdzono jądrową lokalizację białka Slug w komórkach nowotworowych. Analizowane nowotwory różniły się odsetkiem komórek pozytywnych. Jedynie w 3 nowotworach był on był na poziomie 10%, w pozostałych był wyższy. Więcej pozytywnych komórek było w bardziej zaawansowanych rakach. Stwierdzono statystycznie istotny związek ekspresji z przerzutami (raki C1, C2, D w klasyfikacji Astlera – Collera) oraz korelację odsetka pozytywnych komórek ze stopniem zajęcia węzłów chłonnych (cecha pN w klasyfikacji TNM) (Tabela 14, Wykres 4, Wykres 6). Te wyniki potwierdzają wcześniejsze obserwacje związku białka Slug z przerzutami w innych nowotworach. Związek ekspresji z przerzutami zauważono w rakach sutka [237, 238], żołądka [241] oraz przełyku [242]. Korelacja ekspresji z głębokością nacieku ściany jelita (cecha pT) jest bliska istotności statystycznej (Tabela 14, Wykres 5). Znamienny statystycznie związek z głębokością nacieku stwierdzono w rakach żołądka [241] oraz przełyku [242]. Ekspresję SNAI2 w gruczolakach jelita grubego analizowali również Shioiri i wsp. [247]. Nowotwór uznawano za pozytywny, gdy co najmniej 10% jego komórek wykazywało ekspresję. Wspomniani autorzy stwierdzili ekspresję SNAI2 w 37% badanych przypadkach raków, która jednakże miła charakter cytoplazmatyczny, a nie jądrowy. Wykryli oni również związek ekspresji ze skalą zaawansowania Dukesa (uproszczony pierwowzór klasyfikacji Astlera – Collera) oraz przerzutami odległymi (cecha pM w klasyfikacji TNM). Wyniki naszego badania nad rakami jelita grubego, podobnie jak Shioiri i wsp., wskazują na związek ekspresji SNAI2 ze zdolnością do przerzutowania. Istotna różnica między nimi dotyczy odsetka pozytywnych raków i lokalizacji odczynu w komórce. W naszym badaniu cytoplazmatyczny odczyn towarzyszy jądrowej ekspresji (Rycina 13). Brak jądrowej lokalizacji odczynu w badaniu Shioiri i wsp. może wynikać z niedostatecznego odmaskowania antygenu (autorzy jednak nie precyzują zastosowanej metody odmaskowania) oraz zastosowania innego przeciwciała anty-Slug D-19 (Santa Cruz Biotechnology). To przeciwciało wykorzystane było w analizie ekspresji SNAI2 w rakach płaskonabłonkowych przełyku przez Uchikado i wsp., gdzie również stwierdzono tylko cytoplazmatyczną lokalizację w 48% badanych przypadków [242]. Zespół badaczy Kojc i wsp. zaobserwował 69 natomiast jądrową lokalizację odczynu w 80% raków płaskonabłonkowych głowy i szyi (w tym 37% wykazujący ekspresję w powyżej 10% komórek) oraz 100% raków wrzecionowatokomórkowych. Autorzy podają jedynie producenta przeciwciała (Santa Cruz Biotechnology), a immunohistochemia została wykonana z wykorzystaniem automatu Discovery (Ventana, USA) [258]. W badaniu przeprowadzonym przez Jethwa i wsp. stwierdzono jądrową lokalizację w gruczolakorakach towarzyszących metaplazji jelitowej przełyku Barrett’a (przeciwciało SNAI2 clone G18, Autogen Bioclear, UK) [243]. Białko Slug jest czynnikiem transkrypcyjnym regulującym ekspresję przez wiązanie z promotorem genu, dlatego dla białka pełniącego taką funkcję spodziewana jest jądrowa lokalizacja. Badania na liniach komórkowych z ekspresją SNAI2, potwierdzają tą lokalizację w komórce [201]. Analizy ekspresji nie przeprowadzono w całym przekroju guza pierwotnego. Do zbadania pobrano z parafinowego bloczka cylindryczny fragment tkanki o średnicy przekroju około 2mm. 19 takich cylindrów umieszczono w nowym bloczku parafinowym, z którego skrawki tworzyły na szkiełku podstawowym macierz tkankową składającą się z 19 kolistych fragmentów tkanki. W doborze obiektu badawczego kierowano się przede wszystkim dużą zawartością komórek nowotworowych w utkaniu guza. Biorąc pod uwagę wewnętrzną heterogenność raków jelita grubego [259, 260] i niewielką średnicę tkanki, taka selekcja materiału może wpływać na wynik analizy. Rozrost nowotworu wiąże się ze zwiększonym zapotrzebowaniem na tlen, dochodzi wówczas do ekspresji czynnika hipoksji HIF-1. Białko to pełni funkcję czynnika transkrypcyjnego uruchamiającego ekspresję genów związanych z angiogenezą m.in. naczyniowego czynnika wzrostu VEGF [261]. Stwierdzono, że HIF-1 uruchamia również ekspresję genów uczestniczących w przemianie nabłonkowo- mezenchymalnej takich jak SNAI1 oraz TWIST1, zwiększających zdolność do migracji komórek nowotworowych [262, 263, 264, 265]. Gruczolakoraki jelita grubego wykazują ekspresję HIF-1 [266, 267, 268, 269, 270]. Ten czynnik transkrypcyjny rozpoznaje w promotorze genu sekwencję 5'-[A/G]CGTG-3', która może być dodatkowo flankowana sekwencją 5'-[A/C]ACAG-3' [271]. Promotor genu SNAI2 posiada w pozycji -413 do -409 (względem pierwszego kodonu ATG) sekwencję 5'-GCGTG-3' oraz sekwencje 5'-CACAG-3' (-681 -677, -269 -265) i 5'-AACAG-3' (-324 -321, -289 -284). Jeżeli HIF-1 uczestniczy również w aktywacji ekspresji genu SNAI2, to należy się spodziewać wyższej ekspresji w miejscach z niedoborem tlenu, a więc o dużej zawartości komórek nowotworowych. Kurrey i wsp. badali wpływ hipoksji in vitro na komórki raka jajnika SKOV3. Hodowle komórkowe prowadzono w normalnych warunkach tlenowych oraz w atmosferze zawierającej 1-5% tlenu. 70 Badano poziom transkryptu genu SNAI2 co 12 godzin przez 3 doby. Hipoksja spowodowała wzrost ekspresji SNAI2 po 12 godzinach około 1,7× powyżej wyjściowego poziomu, który stopniowo malał i po 48 godzinach ekspresja spadła do wyjściowego poziomu [219]. Autorzy nie precyzują jednak, które stężenie tlenu miało taki wpływ na ekspresję. Niedobór tlenu na poziomie 5% określany jest jako umiarkowana hipoksja, natomiast 1% jako ostra. Nie wiadomo jak wpływa przewlekłe niedotlenienie komórek na poziom transkryptu SNAI2. Wyniki badań nad wpływem hipoksji na ekspresję SNAI2 w liniach komórkowych raka jelita grubego nie zostały dotąd opublikowane. W naszym badaniu stwierdziliśmy znamienny, wyższy odsetek komórek z pozytywnym odczynem w rakach niskozróżnicowanych (Tabela 14). Furlan i wsp. zaobserwowali wyższą ekspresję czynnika hipoksji HIF-1 w niskozróżnicowanych rakach jelita grubego, co sugeruje przynajmniej jego pośredni związek z ekspresją SNAI2 [266]. Białko Slug jest represorem ekspresji genu CDX2 kodującego czynnik transkrypcyjny odpowiedzialny za prawidłowe różnicowanie nabłonka jelitowego [221]. Około 96% raków wysokozróżnicowanych i tylko 56% niskozróżnicowanych raków jelita grubego wykazuje ekspresję CDX2 [272]. ttagcattatacaggaaactggtagatactgagatggattttaatggctttatactgagaaaatagcaccacata aaagcaggggaatattagaaataaaaataattgtctctaaagacccatacaaccctttttcccataaaaaaaaag atgcactgtaatacatgaaaagataagatctcttgtcaaaagtgtgagagaatgtcCGgtggttccaaatgacag ttacctcttgccccccttctctgccagagttcctttttatctttgcaatcttccagttgttcCGatcagcctgcc tttagagggctacaaagcatttctttcaagccaccatagctaacaCGgtgacatgagtacttaatttgcaCGCGg cCGCGctgcccctggcttCGCGgaagccctgagtagCGcagCGccctCGcCGcaCGcaaggctgcagtccCGctc caggccagagtcccaggagagCGtcctcCGCGctCACAGgCGcctttgtcttccCGcttcccccttcctttttca aaagccaagaggtaattatttggtctttgtgcaaggcaaacctctccagatgccacttccaaatataggctctca ttaacaccagaggctggcctggtgtggtgcagggCGgcccttccttctcctggCGgacactgtgtcccCGCGCGc tggCGctgcaccacatctggaagccaggCGggcagggcagagacccCGgctcctgCGcccctcctagctcccaga ga GCGTG gatCGCGggCGgggctcacCGagCGaggttacctctcttgaaaatacttaaacactttttttcctct ccactgaaatctcaaaaAACAG cccattttgaaccagaataatttagtctgac AACAGattcttcctctgtt CA CAGctgtcccagagggaggagctgaaatctgaacctctcagctgtgattggatctttcttgcaaaagagaggaaa aaaaaaccctcccagccaaaaCGggctcagttCGtaaaggagcCGggtgacttcagaggCGcCGgccCGtcCGtc tgcCGcacctgagcaCGgcccctgccCGagcctggccCGcCGCGatgctgtagggacCGcCGtgtcctccCGcCG gacCGttatcCGCGcCGggCGccCGccagaccCGctggcaagATGcCGCGctccttcctggtcaagaagcatttc aaCGcctccaaaaagccaaactacagCGaactggacacacatacaggtaaaaagagaaaaatatatctagaacta CGtatctagagctttgcaaatatgaat Rycina 15. Prawdopodobne miejsce wiązania czynnika hipoksji w promotorze SNAI2 zaznaczone podwójną ramką. Konserwatywne sekwencje [A/C]ACAG zaznaczone pojedynczą ramką. Miejsca hybrydyzacji primerów do wykrywania metylowanej matrycy podkreślono. Kolorem szarym zaznaczono transkrypt mRNA (sekwencja AK223368.1). ATG – kodon metioniny rozpoczynający translację. Niewielka różnica w odsetku komórek pozytywnych między rakami ograniczonymi do ściany jelita a przerzutującymi powoduje, że ekspresja SNAI2 nie kwalifikuje się jako 71 użyteczny marker zagrożenia przerzutami u pacjentów z zaawansowanym miejscowo nowotworem, mimo istotnej statystycznie, wyższej ekspresji w rakach przerzutujących (Tabela 14, Wykres 4). Są to jednak wyniki oparte na analizie niewielkich fragmentów nowotworów. Potrzebne są badania przeprowadzone na dużych wycinkach obejmujących przekrój guza pierwotnego w celu pełniejszego poznania związku białka Slug z przerzutami w rakach jelita grubego. Związek ekspresji z przerzutami badano w mysim modelu raka płaskonabłonkowego skóry na wysoce inwazyjnych liniach komórkowych HaCa4 i CarB oraz w ludzkich transformowanych melanocytach. Wyciszenie ekspresji zarówno mysiego homologu Snai2, jaki i ludzkiego SNAI2 wiązało się ze znacznym ograniczeniem przerzutów przy niewielkim wpływie na rozrost guza pierwotnego u myszy pozbawionych odporności (nude mice) [245, 246]. Przeprowadzenie analogicznych badań nad związkiem ekspresji SNAI2 z przerzutami w liniach komórkowych ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego pozwoliłoby ustalić wpływ białka Slug na zdolność do tworzenia przerzutów tego nowotworu. 6.2 Metylacja promotora genu SNAI2 Metylacja promotora genu prowadzi do wyciszenia jego ekspresji [86]. W naszym badaniu wykryta metylacja wiązała się z istotnym statystycznie mniejszym odsetkiem komórek wykazujących ekspresję SNAI2 (Wykres 12). Należy wziąć pod uwagę, że z oczywistych powodów badanie immunohistochemiczne nie może być wykonane na dosłownie identycznym materiale (tych samych komórkach), który służy do izolacji DNA. W rezultacie nie można wykluczyć, że dwa fragmenty pobrane z tego samego guza mogą różnić się pod względem cech molekularnych. Stosując metodę MSP, poddano analizie tylko kilka sekwencji CG zlokalizowanych w promotorze tego genu. Pełniejszą wiedzę o zależności ekspresji od metylacji dałyby sekwencjonowanie pełnej sekwencji wyspy CG i analiza poziomu transkryptu w liniach komórkowych, ponieważ gęstość 5-metylocytozyny w promotorze wpływa na poziom ekspresji genu [273, 274]. Badania będące przedmiotem tej pracy wskazują, że im bardziej zaawansowany jest nowotwór, tym częściej cechuje go hipometylacja promotora SNAI2. Odsetek raków z hipometylacją wzrasta ze stopniem głębokości nacieku ściany jelita (cecha pT, Wykres 15), stopniem zajęcia węzłów chłonnych (cecha pN, Wykres 16), obecnością przerzutów odległych (cecha M, Wykres 17) oraz obecnością komórek nowotworowych w naczyniach 72 krwionośnych (pV, Wykres 18) i limfatycznych (pL, Wykres 19). Analiza raków o takim samym stopniu zaawansowania guza pierwotnego wykazała istotny statystycznie związek hipometylacji z cechami migracji (przerzuty, obecność komórek nowotworowych w naczyniach) w rakach przekraczających mięśniówkę właściwą jelita grubego (T3). Związek hipometylacji z cechami migracji nie był istotny statystycznie w rakach naciekających mięśniówkę właściwą, ale jej nie przekraczających (T2). Metylacja promotora SNAI2 jest prawdopodobnie mechanizmem zabezpieczającym nabłonek jelitowy przed nadmierną ekspresją tego genu, a hipometylacja może pojawiać się na późnym etapie karcynogenezy. Utrata tego epigenetycznego zabezpieczenia przyczynia się do wzrostu ekspresji SNAI2 w komórce i zwiększenia jej potencjału migracyjnego. Prawdopodobnie hipometylacja pojawia się w komórkach raka inwazyjnego, a ich liczba wzrasta w miarę zaawansowania guza pierwotnego. Rodenhiser i wsp. analizowali metylację promotorów w liniach komórkowych gruczolakoraka sutka o niskim (468GFP) i wysokim (468LN) potencjale przerzutowym. Autorzy zastosowali sekwencjonowanie mikromacierze DNA po konwersji do analizy metylacji wodorosiarczynem w promotorów celu oraz potwierdzenia obserwowanych różnic. Stwierdzono, że linia 468LN o wysokim potencjale przerzutowym zawierała subpopulację komórek, którą cechowała całkowita hipometylacja promotora SNAI2. Linia komórkowa 468LN posiadała także wyższą ekspresję tego genu [275]. Na potrzeby tego badania zastosowano metodę MSP do analizy metylacji DNA. Jej czułość określana jest jako zdolność do wykrycia 1 metylowanej matrycy DNA z 500 badanych [276]. Jeżeli ze wzrostem guza pierwotnego wzrasta liczba komórek nowotworowych z hipometylacją, to ilość komórek z metylowanym promotorem może obniżyć się poniżej granicy detekcji metodą MSP, wówczas w badanym DNA nie stwierdza się metylacji, czyli hipometylację (co nie wyklucza pojedynczych komórek z metylacją promotora, których wykrycie jest poniżej czułości metody). Efekt ilościowy może tłumaczyć fakt wykrycia metylacji promotora w 80% wczesnych raków (T1) i tylko 25% najbardziej zaawansowanych (T4). Może on być też przyczyną braku istotności statystycznej między hipometylacją, a cechami migracji w mniej zaawansowanych rakach T2. Shahrzad i wsp. badali wpływ hipoksji na poziom 5metylocytozyny w liniach komórkowych ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego (HCT116, DLD-1, SW480, SW620) oraz czerniaka (WM115, WM239). Niedotlenienie spowodowało obniżenie zawartości 5-metylocytozyny w nowotworowym DNA [277]. W rakach jelita grubego obserwuje się wzrost ekspresji czynników hipoksji ze stopniem zaawansowania, co stanowi pośrednią informację o niedotlenieniu nowotworu. Stwierdzono korelację ekspresji HIF-1 ze stopniem zaawansowania wg Dukesa [267, 268, 269, 270] oraz z głębokością 73 nacieku guza pierwotnego [267, 270]. Yoshimura i wsp. nie zaobserwowali takiej korelacji dla HIF-1, ale ekspresja HIF-2 wzrastała ze stopniowaniem Dukesa i cechą pT [278]. Jeżeli hipoksja ma związek z hipometylacją promotora SNAI2, to wyższe jest prawdopodobieństwo wykrycia hipometylacji tego genu w bardziej zaawansowanych nowotworach. W celu określenia przydatności analizy metylacji/hipometylacji promotora SNAI2 do oceny zagrożenia wznową choroby należałoby przeprowadzić kilkuletnią obserwację pacjentów po resekcji guza pierwotnego. Analizując tak heterogenny materiał jakim jest guz pierwotny, który oprócz różnych populacji komórek nowotworowych zawiera podścielisko, nie można ustalić czy obserwowana metylacja promotora dotyczy pierwotnie dwóch alleli lub jest wynikiem imprintingu tylko jednego allelu w nabłonku jelita grubego. Stosując w reakcji PCR primery zaprojektowane do wykrycia niemetylowanej matrycy, w każdej badanej próbce uzyskano produkt PCR, co może być wynikiem obecności DNA podścieliska w analizowanym materiale. Hipometylacja DNA jest częstym zjawiskiem występującym w raku jelita grubego. Proces karcynogenezy związany jest globalnym zmniejszaniem się zawartości 5metylocytozyny w DNA względem prawidłowego nabłonka. Analiza statystyczna wskazuje na pozytywną korelację hipometylacji DNA i niestabilności chromosomalnej. Demetylacja nowotworowego DNA obserwowana jest również w rakach z fenotypem częstej metylacji genów supresorowych (CIMP-H). Obecność w niektórych rakach hipo- i hipermetylacji DNA, czyli dwóch przeciwstawnych zjawisk epigenetycznych sugeruje, że są to procesy niezależne, mogące podlegać innym mechanizmom molekularnym. Odsetek metylowanych sekwencji CG retrotranspozonu LINE-1 jest wykorzystywany jako marker globalnej hipometylacji DNA. Mniejszy odsetek metylowanych wysp CG względem normalnego nabłonka obserwuje się już w gruczolakach i polipach hiperplastycznych [279, 280, 281, 282]. Ogino i wsp. odnotowali zmniejszającą się zawartość 5-metylocytozyny w sekwencjach LINE-1 wraz ze wzrostem stopnia zaawansowania nowotworu [283], a Iacopetta i wsp. stwierdzili istotny statystycznie związek hipometylacji LINE-1 z przerzutami do węzłów chłonnych [284]. Niski poziom 5-metylocytozyny w LINE-1 koreluje z śmiertelnością z powodu choroby nowotworowej [285]. SNAI2 nie jest jedynym znanym genem, który ulega demetylacji. Przykładem innego genu, o którym wiadomo, że jest demetylowany w raku jelita grubego jest gen SNCG kodujący γ-synukleinę. Synukleiny są grupą białek, których ekspresja zachodzi głównie w układzie nerwowym. Naturalna ekspresja SNCG jest wykrywana w mózgu i zakończeniach 74 synaptycznych. Rola γ-synukleiny nie jest do końca poznana, ale stwierdzono jej udział w kontroli podziałów mitotycznych oraz funkcjonowaniu mikrotubul. Nadekspresja w nowotworowych liniach komórkowych wiązała się z proliferacją, zwiększeniem zdolności do migracji, niestabilnością chromosomalną i opornością na cytostatyki, których aktywność farmakologiczna związana jest z mikrotubulami (paklitaksel, winblastyna). Ekspresję SNCG stwierdzono m.in. w rakach sutka, płuc, prostaty, przełyku, żołądka, wątroby i szyjki macicy. Korelowała ona z przerzutami niezależnie od lokalizacji guza pierwotnego. Głównym mechanizmem odpowiedzialnym za ekspresję SNCG w nowotworach jest hipometylacja DNA [286]. W rakach jelita grubego hipometylacja i ekspresja genu korelowała ze stopniem zaawansowania, zajęciem węzłów chłonnych i przerzutami odległymi. Ye i wsp. uznali hipometylację SNCG za bardziej czuły marker progresji choroby niż ekspresja na poziomie białka [287]. W naszych badaniach większe różnice między stopniami zaawansowania wystąpiły również w przypadku hipometylacji genu SNAI2 niż ekspresji wyrażonej odsetkiem pozytywnych komórek. Gen S100A4 koduje białko należące do rodziny białek wiążących wapń S100, które w normalnej komórce zlokalizowane jest w cytoszkielecie. Nadekspresja w komórkach nowotworowych zwiększa ich inwazyjność i zdolność do migracji. Również w przypadku tego białka odsetek pozytywnych raków wzrastał ze stopniem zaawansowania wg Dukesa oraz był wyższy w guzach przerzutujących do węzłów chłonnych [288]. Nakamura i wsp. analizowali ekspresję S100A4 w liniach komórkowych ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego. Stwierdzono ekspresję w komórkach linii HT-29, SW480, SW620, WiDr i Colo201, która związana była z hipometylacją w drugim intronie genu. Komórki SW837, LoVo i DLD1 posiadały metylowany gen i śladową ekspresję S100A4 [289]. Kolejnym genem ulegającym demetylacji jest PROM1 kodujący CD133. Hibi i wsp. stwierdzili obecność odmetylowanego genu w 40% badanych gruczolakoraków jelita grubego. Cecha ta korelowała z zaawansowaniem guza pierwotnego, a związek z przerzutami do węzłów chłonnych miał charakter nieistotnej statystycznie tendencji [290]. Wyniki innego badania, przeprowadzonego przez Choi i wsp., wykazały ekspresję CD133 w 25% badanych raków, która również związana była z głębokością nacieku guza pierwotnego (cecha pT) [291]. Komórki raka jelita grubego wykazujące immunofenotyp CD133+ posiadają zdolność do wykładniczego tempa wzrostu in vitro oraz tworzenia guzów u myszy pozbawionych odporności w przeciwieństwie do komórek CD133-, dlatego uważane są grupę inicjującą powstanie nowotworu. Stanowią populację odróżnicowanych komórek, nieposiadających ekspresji CDX2 i KRT20 (CK20, cytokeratyna 20). Po przeszczepieniu do organizmu myszy 75 tworzą guz wykazujący immunofenotyp CDX2+ i CK20+ oraz cechy morfologiczne guza pierwotnego, z którego zostały pobrane komórki [292, 293]. Choi i wsp. nie stwierdzili związku między ekspresją CD133 w guzie pierwotnym a stopniem zróżnicowania. Ten wynik może jednak wynikać z faktu, że komórki CD133+ stanowią nieliczną populację ok. 1-3% komórek nowotworowych w guzie [292]. Możliwe, że w przypadku tego genu warunki tlenowe wpływają na epigenetyczną kontrolę jego ekspresji. Wiadomo, że hipoksja może wywołać odróżnicowanie komórek nowotworowych [294]. W przypadku genu IGF2 zaobserwowano somatyczną utratę imprintingu, która jest wynikiem hipometylacji promotora genu. W prawidłowych komórkach ekspresji ulega tylko ojcowski allel, utrata epigenetycznego zabezpieczenia matczynego allelu związana jest z nadekspresją. Kodowany przez ten gen insulinopodobny czynnik wzrostu typu 2 może w sposób auto- i parakrynny pobudzać nowotwór do wzrostu [295, 296]. Hipometylację IGF2 wykryto w 57-80% badanych raków. Nie stwierdzono zależności ze stopniem zaawansowania nowotworu [296, 297]. Badania linii komórkowych nerwiaka zarodkowego oraz raka wątrobowokomórkowego wykazały związek hipoksji z ekspresją IGF2 [298, 299]. Ekspresja genu L1CAM, kodującego białko adhezyjne L1, związana jest z przerzutami raka jelita grubego. Analiza transkryptu genu w liniach komórkowych potwierdziła związek ekspresji z hipometylacją promotora [157, 300]. Przytoczone przykłady wskazują, że progresji nowotworu towarzyszy ekspresja genów, która związana jest z ich hipometylacją. Hipoksja może być przyczyną utraty epigenetycznego zabezpieczenia i wzrostu ekspresji proinwazyjnych genów. Istnieje kilka potencjalnych mechanizmów przyczyniających się do obserwowanej hipometylacji. Demetylacja DNA może być wynikiem aktywnej enzymatycznej demetylacji, bierną demetylacją wynikającą z braku aktywności metylotransferazy DNA lub w przypadku imprintingu utratą wyciszonego allelu na skutek niestabilności chromosomalnej. W rozwoju embrionalnym stwierdzono istnienie molekularnego procesu aktywnej demetylacji DNA. Jego pierwszym etapem jest enzymatyczna deaminacja 5-metylocytozyny. Zdolność do katalizowania tej reakcji stwierdzono u białek AID, APOBEC1 oraz metylotransferaz DNA DNMT3A i DNMT3B. Metylotransferazy mogą funkcjonować w roli deaminazy tylko w przypadku niedostępności substratu S-adenozylometioniny, która jest donorem grupy metylowej. Tymina, będąca produktem deaminacji 5-metylocytozyny, tworzy niekomplementarną parę z guaniną. Białka o aktywności glikozylazy tyminy TDG i MBD4 usuwają z DNA błędnie sparowaną zasadę. Proces kończy naprawa DNA z udziałem polimerazy β i ligazy I [301, 302, 303]. W przypadku białka MBD4 stwierdzono in vitro 76 również aktywność glikozylazy 5-metylocytozyny, jest ona jednak znacznie mniejsza w porównaniu z aktywnością glikozylazy tyminy [304]. Związek z demetylacją stwierdzono również w białku MBD2. Wyciszenie ekspresji genu MBD2 skutkowało ponowną metylacją DNA [305]. W rakach jelita grubego stwierdzono jednak spadek poziomu transkryptu tego genu względem prawidłowego nabłonka [306]. Niedobór S-adenozylometioniny zaobserwowano w komórkach poddanych hipoksji. Związek ten jest produktem reakcji katalizowanej przez adenozylotransferazę metioniny. Niskie stężenie tlenu powoduje inaktywację enzymu [307, 308]. S-adenozylometionina jest niezbędnym substratem dla metylotransferaz DNA, jej niedobór powoduje upośledzenie prawidłowej metylacji mającej miejsce po replikacji DNA oraz przyczynia się do demetylacji DNA poprzez wzrost aktywności deaminazy 5-metylocytozyny białek DNMT3A i DNMT3B. Stwierdzono, że Sadenozylometionina jest inhibitorem aktywnej demetylacji DNA [309]. Kolejny możliwy mechanizm związany jest z aktywnością polimerazy poli(ADP-rybozy) I, (PARP-1). Aktywowany enzym ulega automodyfikacji przez przyłączenie polimerów ADP-rybozy i w takiej postaci jest zdolny do trwałej inhibicji enzymu DNMT1. Zahamowanie aktywności tej metylotransferazy spowoduje, że po replikacji DNA nie zostanie odwzorowany wzór metylacji na nowo syntetyzowanej nici, co prowadzi do hipometylacji DNA [310, 311]. Ten proces może tłumaczyć współistnienie hipometylacji z fenotypem częstej metylacji genów supresorowych (CIMP-H) w niektórych rakach, ponieważ metylacja DNA de novo katalizowana jest przez enzymy DNMT3A i DNMT3B. W sporadycznych rakach jelita grubego fenotyp CIMP-H towarzyszący wysokiej niestabilności mikrosatelitarnej koreluje z nadekspresją DNMT3B [312, 313]. Aktywność PARP-1 w komórkach nowotworowych może być związana z ekspresją czynnika hipoksji HIF-1. Martin-Oliva i wsp. analizowali ekspresję genów zależnych od HIF-1. Inhibicja enzymu PARP-1 lub wyciszenie ekspresji kodującego go genu spowodowały spadek ekspresji genów związanych z aktywnością czynnika hipoksji [314]. Inhibicja polimerazy poli(ADP-rybozy) w mysich komórkach raka okrężnicy prowadziła do zmniejszenia ekspresji metaloproteinaz i zdolności do migracji [315]. Teoretycznie istnieje jeszcze jedno wytłumaczenie obserwowanej utraty metylacji. Jeżeli pierwotnie metylowany jest tylko jeden allel może on zostać utracony w wyniku niestabilności chromosomalnej. Gen SNAI2 znajduje się w locus 8q11. Stwierdzono, że na dłuższym ramieniu chromosomu 8 (8q) może dochodzić do jednorodzicielskiej disomii w rakach jelita grubego [260]. W wyniku tego procesu metylowany allel może być zastąpiony przez duplikację niemetylowanego allelu z chromosomu homologicznego. 77 Biorąc pod uwagę związek hipoksji z hipometylacją DNA oraz pozytywną korelację ekspresji czynników hipoksji z zaawansowaniem raków jelita grubego, najbardziej prawdopodobny jest wpływ wewnątrzkomórkowego stężenia S-adenozylometioniny i aktywności enzymu PARP-1 na hipometylację promotora SNAI2. Dotychczas uwaga badaczy skupiała się na hipermetylacji jako mechanizmie wyłączania ekspresji genów supresorowych w karcynogenezie. Możliwość przywrócenia ich ekspresji poprzez zahamowanie aktywności metylotransferaz DNA stwarza nadzieję na wykorzystanie inhibitorów (np. decytabina) w praktyce klinicznej. Obecnie trwają lub są planowane badania kliniczne testujące przydatność decytabiny w terapii nowotworów, w tym raka jelita grubego [316]. Potencjalnym działaniem niepożądanym inhibitorów metylotransferaz DNA może być jednak wzrost ekspresji genów związanych z przerzutami m.in. genu SNAI2. Badania na liniach komórkowych wskazują, że decytabina powoduje demetylację promotorów proinwazyjnych genów i ich ekspresję m.in. PLAU, CXCR4, HPSE, SNCG (γ-synukleina), S100A4 [287, 289, 317]. 6.3 Niestabilność mikrosatelitarnego DNA W naszym badaniu raki z niestabilnością mikrosatelitarnego DNA MSI-H i MSI-L stanowiły odpowiednio 9% i 10% zebranych nowotworów. Odsetek raków z wysoką niestabilnością mieści się w przedziale danych literaturowych. Zależenie od badanej grupy raki MSI-H stanowiły 6-20%. Większy rozrzut występuje w grupie MSI-L, według publikowanych danych te nowotwory stanowią 4-35%. Odsetek raków MSI-L w dużej mierze zależy od rodzaju i liczby wykorzystanych markerów mikrosatelitarnych. Sposób scharakteryzowania grupy MSI-L wpływa także na uzyskane wyniki, dlatego istnienie tej grupy jest kwestionowane. [123-131, 137, 138, 318, 319]. Analiza statystyczna wyników tego badania wskazuje, że raki MSI-H cechuje prawostronna lokalizacja, sekrecja śluzu oraz częstsze występowanie u kobiet. Raki MSI-L najczęściej występowały poza prawostronną lokalizacją. Cechy te znajdują potwierdzenie w danych literaturowych [129, 130, 149, 318, 319, 320, 321]. W przypadku raków MSI-H nie potwierdziło się częste występowanie mutacji genu BRAF, jedynie 14% z nich (2/14) posiadało mutację. Wg danych literaturowych, w tej grupie odsetek nowotworów z mutacją waha się w przedziale 31-46% [81, 138, 318, 322]. Zgodna z literaturą jest tendencja do rzadkiego występowania mutacji KRAS w grupie z wysoką niestabilnością [128, 138, 320]. Wyniki niektórych badań wskazują na znamiennie 78 wyższy odsetek mutacji KRAS w grupie MSI-L w porównaniu z MSS [128, 138, 323]. W naszym badaniu odsetek raków MSI-L z mutacją KRAS jest tylko o kilka punktów procentowych wyższy niż w grupie raków stabilnych mikrosatelitarnie, zauważalna jest natomiast tendencja do częstszego występowania mutacji obu genów aktywujących szlak MAPK (KRAS lub BRAF). Znamienna różnica między rakami różniącymi się stabilnością mikrosatelitarnego DNA dotyczy metylacji promotora genu SNAI2 (Tabela 15, Wykres 20). Odsetek raków z hipometylacją wzrasta w kolejności MSI-H, MSS, MSI-L. W tej samej kolejności wzrasta również średni odsetek komórek z ekspresją genu, jednak są to tylko kilkuprocentowe, nieistotne różnice. Odmienność pod względem hipometylacji SNAI2 nie wynika z różnic w zaawansowaniu nowotworów, w każdej z trzech grup stopień zaawansowania był zbliżony (patrz: strona 51). Wyniki dwóch badań przeprowadzonych przez Ogino i wsp. oraz Estecio i wsp. wskazują, że sekwencję retrotranspozonu LINE-1 cechuje znamienny statystycznie mniejszy stopień demetylacji w rakach MSI-H niż w rakach stabilnych mikrosatelitarnie. Ogino i wsp. podają, że raki MSI-L wykazują wyższy stopień demetylacji niż grupa MSS, jednak brak informacji o istotności statystycznej tego wyniku [283, 324]. Rzadziej występująca hipometylacja w rakach MSI-H może być związana z genem MBD4. Posiada on w sekwencji kodującej mikrosatelitarny DNA ulegający częstym mutacjom. Następstwem niestabilności tego fragmentu jest zmiana ramki odczytu i powstanie skróconego białka, niezdolnego do pełnienia swojej funkcji w procesie aktywnej demetylacji DNA [325]. Stwierdzono także, że ekspresja genu MBD4 w rakach jelita grubego może ulec obniżeniu w wyniku metylacji jego promotora [326]. Raki MSI-H są grupą lepiej rokującą niż stabilne mikrosatelitarnie [113, 114, 115], natomiast MSI-L związane są z krótszymi czasami przeżycia niż MSS [141, 142]. Te różnice w czasach przeżyć pacjentów mogą być odzwierciedleniem utraty epigenetycznych zabezpieczeń proinwazyjnych genów. Wyjątkowo częsta hipometylacja promotora SNAI2 w rakach MSI-L sugeruje, że mogą one stanowić odrębną grupę nowotworów. 6.4 Mutacje genów KRAS i BRAF Nie stwierdziliśmy w przeprowadzonych badaniach związku między ekspresją SNAI2 oraz mutacjami KRAS i BRAF (Tabela 14, Wykres 11). Ta obserwacja znajduje potwierdzenie w doświadczeniu Joyce i wsp., w którym do linii komórkowej ludzkiego gruczolakoraka jelita 79 grubego Caco-2 z prawidłową sekwencją KRAS wprowadzono onkogenną formę tego genu z mutacją G12V. Transfekcja nie spowodowała wzrostu ekspresji SNAI2 powyżej poziomu z komórek nietransfekowanych [327]. Ekspresja SNAI2 jest zależna od kinazy MEK i ERK ze szlaku MAPK związanego z onkogenami KRAS i BRAF oraz β-kateniny związanej ze szlakiem Wnt, które są często aktywne w rakach jelita grubego [190, 192, 248]. Kusewitt i wsp. stwierdzili, że migrujące keratynocyty w procesie reepitelializacji wykazują ekspresję SNAI2 zależną od aktywności receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) [328]. Około 72% gruczolakoraków jelita grubego wykazuje ekspresję receptora EGFR w co najmniej 10% komórek [329]. Związek ekspresji SNAI2 z aktywnością MAPK, Wnt oraz EGFR również może tłumaczyć obecność białka Slug we wszystkich badanych nowotworach oraz brak istotnych różnic między nowotworami z mutacją KRAS i BRAF, a posiadającymi prawidłową sekwencję tych genów. Nie stwierdziliśmy w naszych badaniach związku hipometylacji promotora SNAI2 z mutacjami genów KRAS i BRAF (Tabela 15, Wykres 21). Wyniki dwóch badań przeprowadzonych przez Frigola i wsp. [280] oraz Ogino i wsp. [283] również wskazują na brak istotnych różnic w poziomie metylacji DNA w rakach jelita grubego z mutacją KRAS i bez mutacji. Związek mutacji tego genu z hipometylacją DNA stwierdzono jednak w rakach trzonu macicy [330]. Zdolność do regulacji metylacji DNA wykazano dla innego onkogenu HRAS. W zależności od linii transfekowanych komórek i badanych sekwencji DNA obserwowano hipermetylację [331, 332] lub hipometylację [333]. W badanej grupie raków wykryto tylko 6 przypadków z mutacją genu BRAF (3,7%) (Tabela 13). Podobny niski odsetek raków jelita grubego z mutacją stwierdzono w badaniach Miranda i wsp. – 3,5% [334], Maestro i wsp. – 3,7% [335], Lee i wsp. – 4,5% [89], Asaka i wsp. – 4,6% [318]. W nieselekcjonowanej grupie nowotworów mogą one stanowić do 14% – Ogino i wsp. [336]. Są to jednak wyniki oparte o analizę tylko najczęstszej mutacji p.V600E w eksonie 15. W naszym badaniu poddano analizie 2 eksony (11 i 15). Lokalizacja mutacji w genie była zróżnicowana, p.V600E została wykryta tylko 2 razy (33% wszystkich mutacji BRAF). Zbliżone wyniki uzyskali Yuen i wsp. Analiza 2 eksonów ujawniła obecność mutacji w 5% raków, p.V600E stanowiła 36% z nich [184]. W badaniach, w których analizowano sekwencję eksonów 11 i 15, częstość mutacji p.V600E wśród raków z mutacją genu BRAF waha się w przedziale 36% do 95% [337]. Zgodna z danymi literaturowymi jest najczęstsza lokalizacja mutacji w eksonie 15 [179]. Tylko 1 mutacja (1/6; 17%) została wykryta w eksonie 11. Mutacje zlokalizowane w tym eksonie stanowią 2% [337] do 18% [184] wszystkich mutacji genu BRAF wykrytych w rakach jelita grubego. 80 W naszych badaniach wykryto mutację KRAS w 58 (35,6%) nowotworach (Tabela 13). W eksonie 1 zlokalizowanych było 51 mutacji (31,3% raków), 5 w eksonie 2 (3,1% raków), 2 w eksonie 3 (1,2% raków). Wszystkie mutacje wykryte w eksonie 1 wprowadzały punktową zmianę sekwencji w kodonie 12 lub 13. Dwie z 5 mutacji w eksonie 2 zlokalizowane były w kodonie 61. Wyniki są zbliżone do literaturowych danych. Ze względu na częstość mutacji w kodonach 12 i 13 w wielu badaniach ograniczono analizę tylko do tych miejsc w genie. W takich badaniach odsetek raków z mutacją wynosił: 30% - Jass i wsp. [128], 31% - Nagasaka i wsp. [138], 33,6% - Lee i wsp. [89], 33,6% - Chiang i wsp [145], 37% - Ogino i wsp. [283], 39,2% Suehiro i wsp. [185], 40,5% - Gonzalez-Garcia i wsp. [320], 48% - Samowitz i wsp. [147]. Smith i wsp. wykryli punktowe mutacje w kodonach 12, 13 i 61 w 27% raków [146]. W badaniach, w których analizowano sekwencję eksonów 1 i 2, odsetek raków z mutacją wynosił: 34% - Yuen i wsp. [184], 39,4% - Asaka i wsp. [318], 51% - Rajagopalan i wsp. [322]. Trzy eksony genu KRAS analizowali Edkins i wsp. Wykryto mutację w 52,3% raków. Raki z mutacją w eksonie 3 stanowiły 4,1% badanego zbioru, wszystkie zlokalizowane były w kodonie 146 [338]. W naszym badaniu nie stwierdziliśmy mutacji w kodonie 146, wykryte zostały natomiast 2 mutacje w kodonie 117. Mutacje KRAS częściej występowały w nowotworach z przerzutami odległymi, jest to jednak tylko nieznamienna statystycznie tendencja. Publikacje wskazujące na pozytywną korelację mutacji KRAS ze stopniem zaawansowania należą do mniejszości [89, 183, 185]. Najczęściej mutacje genu KRAS są punktowymi mutacjami zmiany sensu. Insercje należą do rzadkości i zazwyczaj są duplikacją pojedynczego kodonu w eksonie 1 [339, 340, 341]. Jedyna wykryta w naszym badaniu insercja była tandemową duplikacją pięciu kodonów w eksonie 2. Jest to pierwsza opisana tego typu mutacja w eksonie 2 genu KRAS w raku jelita grubego. Identyczna insercja została wykryta dwukrotnie w pierwotnych gruczolakorakach płuc [342]. Onkogenne, kilkukodonowe duplikacje w eksonie 2 stwierdzono także w mysim genie homologicznym Kras w indukowanych chemicznie nowotworach [343]. W żadnym z analizowanych nowotworów nie stwierdzono współistniejących mutacji genów KRAS i BRAF. Nowotwory, w których wykryto mutację w obu genach należą do rzadkości. Zwykle współistniejąca mutacja BRAF jest inna niż p.V600E [138, 184, 185, 186, 318, 322]. Opisane przez Oliveira i wsp. częste mutacje obu genów w przerzutach do węzłów chłonnych nie zostały dotąd potwierdzone w innym niezależnym badaniu [183]. Mutacje w kodonach 12 i 13 genu KRAS okazały się jako pierwsze czynnikami predykcyjnymi oporności na terapię celowaną anty-EGFR [188, 344]. Późniejsze badania wykazały związek z opornością na leczenie również mutacji zlokalizowanych w eksonie 2 i 3 81 genu KRAS oraz mutacji genu BRAF [187, 345], które zostały wykryte łącznie w 8% nowotworów analizowanych w naszym badaniu. Stosowane w Polsce testy diagnostyczne ograniczone są do analizy sekwencji 1 eksonu [346]. Jeżeli ten wynik można odnieść do polskiej populacji oznacza to, że około 8% pacjentów z rakiem jelita grubego może być narażonych na działania niepożądane nieskutecznej i kosztownej terapii. 82 7. Wnioski 1. Wszystkie badane przypadki raków wykazywały obecność białka Slug z jądrową lokalizacją, lecz różniły się odsetkiem pozytywnych komórek. Odsetek komórek dodatnich korelował z zaawansowaniem choroby nowotworowej. Wyższą, istotną statystycznie ekspresję wykazywały raki przerzutujące (C1, C2, D wg Astlera – Collera) niż ograniczone do ściany jelita (A, B1, B2 wg Astlera – Collera), przerzutujące do węzłów chłonnych (cecha pN), nisko zróżnicowane (G3). Bliska istotności statystycznej jest tendencja do wzrostu ekspresji SNAI2 ze zwiększeniem głębokości nacieku ściany jelita (cecha pT). 2. Hipometylacja promotora genu SNAI2 ma istotny statystycznie związek z jego ekspresją. Istnieje znamienna statystycznie pozytywna korelacja hipometylacji SNAI2: ze stopniem zaawansowania wg Astlera – Collera, z wielkością guza pierwotnego (cecha pT), z przerzutami do węzłów chłonnych (cecha pN), z przerzutami odległymi (cecha M), z obecnością komórek nowotworowych w naczyniach limfatycznych (cecha pL), z obecnością komórek nowotworowych w naczyniach krwionośnych (cecha pV). 3. Raki MSI-H cechowała istotna statystycznie prawostronna lokalizacja oraz sekrecja śluzu. Związek z płcią żeńską oraz rzadkie występowanie mutacji KRAS nie osiągają istotności statystycznej. Raki MSI-H rzadziej niż pozostałe wykazują hipometylację promotora genu SNAI2. 4. Raki MSI-L w tym badaniu stanowiły odrębną grupę, którą cechuje częsta hipometylacja promotora genu SNAI2. Lokalizacja inna niż prawostronna oraz częstsze występowanie mutacji w genach KRAS lub BRAF są bliskie istotności statystycznej. 5. W badanej grupie nowotworów 35,6% posiadało mutację genu KRAS i 3,7% genu BRAF. Nie stwierdzono współistnienia mutacji obu genów w jednym nowotworze. 8% raków posiadało mutację nie wykrywalną stosowanymi w Polsce testami diagnostycznymi określającymi oporność nowotworu na terapię celowaną anty-EGFR. 6. Częstsze występowanie mutacji KRAS w rakach z przerzutami odległymi ma charakter nieistotnej statystycznie tendencji. 7. Warto zwrócić uwagę na fakt, że próby nad zastosowaniem w onkologii inhibitorów metylotransferaz DNA (decytabina) mogą, oprócz przywrócenia ekspresji genów 83 supresorowych, nieść ze sobą ryzyko stymulacji genów proinwazyjnych takich jak SNAI2. 84 8. Streszczenie WSTĘP: Rak jelita grubego jest jedną z częściej rozpoznawanych chorób nowotworowych w Polsce. Stanowi drugą w kolejności przyczynę zgonu z powodu choroby nowotworowej u mężczyzn oraz trzecią u kobiet. Im bardziej zaawansowana jest choroba w momencie diagnozy tym mniejsza szansa na 5-letnie przeżycie pacjenta, dlatego poznanie mechanizmów zdolności do migracji i przerzutów jest wciąż aktualnym celem badań molekularnych. Raki jelita grubego podobnie jak inne raki charakteryzuje niestabilność materiału genetycznego. Najczęściej jest to niestabilność chromosomalna. Proces karcynogenezy rozpoczyna się zazwyczaj aktywacją szlaku WNT poprzez uszkodzenie genu APC co prowadzi do funkcjonowania β-kateniny w roli czynnika transkrypcyjnego uruchamiającego ekspresję genów związanych z proliferacją i przeżyciem. Raki z niestabilnością chromosomalną cechuje aneuploidia i liczne aberacje chromosomalne. Częste są zaburzenia w obrębie genów związanych z apoptozą, cyklem komórkowym, wewnątrzkomórkowymi szlakami przekazywania sygnału od TGFβ, efryny, netryny i czynników wzrostu. Alternatywną drogą powstania raka jelita grubego są utrwalone błędy w replikacji mikrosatelitarnych sekwencji DNA wynikające z niesprawnego mechanizmu naprawczego. Dochodzi do powstania fenotypu częstej niestabilności mikrosatelitarnej (MSI-H). Zmiana długości odcinków mikrosatelitarnych w sekwencji kodującej genu prowadzi do powstania niefunkcjonalnych białek. Fenotypowi MSI-H towarzyszy fenotyp częstej metylacji genów supresorowych (CIMP-H). Raki jelita grubego z wysoką niestabilnością mikrosatelitarną cechuje prawostronna lokalizacja, częstsze mutacje genu BRAF, sekrecja śluzu, naciek zapalny i lepsze rokowanie. Kwestionowane jest istnienie raków o niskiej niestabilności (MSI-L) jako oddzielnej grupy, różniącej się istotnie od raków stabilnych mikrosatelitarnie (MSS). Nowotwory MSI-L w przeciwieństwie do MSI-H są niestabilne chromosomalnie. Wyniki niektórych badań sugerują, że raki z niską niestabilnością mikrosatelitarną cechuje częstsze występowanie mutacji genu KRAS, utrata ekspresji MGMT, lewostronne umiejscowienie i niska frakcja proliferacyjna. Raki MSI-L są uważane za grupę gorzej rokującą niż MSS. KRAS i BRAF są onkogenami w karcynogenezie raka jelita grubego. Mutacje w genie KRAS wykrywane są już na etapie gruczolaka jednak wg niektórych badań częstość ich występowania rośnie wraz z zawansowaniem nowotworu. Białko Ras odpowiada za aktywację szlaku kinaz MAP, którego kolejnym elementem jest kinaza Raf kodowana przez gen BRAF. Wykazano, że aktywność szlaku kinaz MAP wpływała na ekspresję SNAI2. 85 Gen SNAI2 jest homologiem genu snail Drosophila melanogaster. Kodowane przez niego białko Slug jest czynnikiem transkrypcyjnym, które posiada konserwatywną domenę „cynkowych palców” wiążącą DNA. Ekspresja genu w komórce nabłonkowej związana jest z przemianą nabłonkowo-mezenchymalną, represją genów kodujących białka połączeń komórkowych oraz zdolnością do migracji. Ekspresję wykazano w licznych nowotworach i miała ona związek z przerzutami. CEL PRACY: Analiza metylacji i ekspresji genu SNAI2 w rakach jelita grubego. Ustalenie związku metylacji i ekspresji ze stopniem zaawansowania nowotworu, stopniem stabilności mikrosatelitarnego DNA i obecnością mutacji genów KRAS i BRAF. MATERIAŁ I METODY: Zgromadzony materiał stanowiły gruczolakoraki jelita grubego oraz tkanka prawidłowa spoza guza od 163 pacjentów. Świeży pobrany materiał został utrwalony w formalinie i zatopiony w parafinie w celach diagnostycznych. Nowotwory sklasyfikowano wg skali Astler-Collera oraz pTNMLV. Część pobranego świeżego materiału zamrożono w -80C w celu późniejszej izolacji DNA. Analizę metylacji promotora genu SNAI2 wykonano metodą MSP po uprzedniej inkubacji z wodorosiarczynem sodu. W reakcji PCR zastosowano pary primerów komplementarnych do metylowanej i niemetylowanej matrycy. Obecność białka Slug w komórkach nowotworowych badano metodą immunohistochemii na macierzach tkankowych. Wykorzystano królicze poliklonalne przeciwciało (SLUG H-140, Santa Cruz Biotechnology). Oceniono jądrową lokalizację odczynu w 116 rakach. Analizę niestabilności mikrosatelitarnego DNA wykonano na żelu poliakrylamidowym dla 5 markerów (APC, p53, BATRII, BAT26, BAX). W przypadku stwierdzenia niestabilności w przynajmniej jednym markerze, wykonywano reakcje PCR dla zestawu 9 markerów (D2S123, D5S346, D3S1611, D18S35, NM-23, D7S501, D1S2883, TP53-pentanukleotydowy, TP53-dinukleotydowy), które analizowano na sekwenatorze ABI PRISM 310. Raki wykazujące niestabilność w więcej niż 40% markerów klasyfikowano jako wysoceniestabilne (MSI-H). Niestabilność poniżej 40% markerów klasyfikowano jako niską (MSI-L). Pozostałe raki uznano za stabilne (MSS). Analizę mutacji przeprowadzono dla eksonów 1-3 genu KRAS oraz eksonów 11 i 15 genu BRAF. Analizę sekwencji wykonano metodą SSCP. Wykryte mutacje potwierdzono sekwencjonowaniem. 86 WYNIKI: 1. Wszystkie raki wykazywały obecność białka Slug z jądrową lokalizacją, natomiast różniły się odsetkiem pozytywnych komórek. 2. Ekspresja SNAI2 wyrażona odsetkiem pozytywnych komórek znamiennie korelowała z: a) zaawansowaniem choroby nowotworowej (odsetek w rakach ograniczonych do ściany jelita wg Astler-Collera A,B1,B2: średnia=59%; odsetek w rakach przerzutujących wg AstlerCollera C1,C2,D: średnia=70%; p=0.01) b) przerzutami do węzłów chłonnych – cecha pN (średni odsetek w grupach pN0 58,9%; pN1 67,2%; pN2 72,1%; p=0.02) c) stopniem zróżnicowania (odsetek komórek w grupie raków wysoko zróżnicowanych G1=59,4%, w grupie raków nisko zróżnicowanych G3=77,7%; p=0.01) 3. Hipometylację promotora SNAI2 wykryto w 67% raków. 4. Hipometylacja promotora SNAI2 związana była: a) z ekspresją genu (średni odsetek komórek pozytywnych w rakach z metylacją =58, średni odsetek komórek pozytywnych w rakach z hipometylacją =70, p=0.01) b) ze skalą Astler-Collera (odsetek raków z hipometylacją w grupach: A 20%; B1 47,5%; B2 57,1%; C1 46,7%; C2 72%; D 85%; p=0.007) c) z wielkością guza – cecha pT (odsetek raków z hipometylacją w grupie: pT1 20%; pT2 49,1%; pT3 69,7%, pT4 75%; p=0.01) d) przerzutami do węzłów chłonnych – cecha pN (odsetek raków z hipometylacją w grupie: pN0 50%; pN1 58,3%; pN2 77,8%; p=0.007) e) z przerzutami odległymi – cecha M (odsetek raków z hipometylacją w grupie: M0 57,7%; M1 85%; p=0.02) f) z obecnością komórek nowotworowych w naczyniach limfatycznych – cecha pL (odsetek raków z hipometylacją w grupie: pL0 53,4%; pL1 74,5%; p=0.01) g) z obecnością komórek nowotworowych w naczyniach krwionośnych – cecha pV (odsetek raków z hipometylacją w grupie: pV0 53,8%; pV1 75%; p=0.01) h) z niestabilnością mikrosatelitarną (odsetek raków z hipometylacją w grupach: MSI-L 93,8%; MSS 59,4%, MSI-H 42,9%; p=0.009) 5. Wykryto 14 (9%) przypadków raków z wysoką niestabilnością mikrosatelitarną DNA (MSI-H), 16 (10%) raków z niską niestabilnością DNA (MSI-L), Pozostałe 133 (81%) przypadki to raki stabilne (MSS). 87 6. Mutacje genu KRAS stwierdzono w 58 (35,6%) rakach (z tego 51 przypadków mutacji w eksonie 1, 5 w eksonie 2, 2 w eksonie 3). Mutacje genu BRAF wykryto tylko w 6 przypadkach raków. 5 mutacji było zlokalizowanych w eksonie 15 i tylko 1 w eksonie 11. Nie stwierdzono związku ekspresji i metylacji SNAI2 z mutacjami genów KRAS i BRAF. WNIOSKI: Ekspresja SNAI2 w rakach jelita grubego ma związek z przerzutami. Hipometylacja SNAI2 ma związek z ekspresją SNAI2 i koreluje z zaawansowaniem nowotworu wyrażonym stopniami w skalach Astler-Collera i TNMLV. Raki różniące się poziomem stabilności mikrosatelitarnego DNA różnią się częstością hipometylacji promotora SNAI2. Odsetek raków z hipometylacją wzrastał w kolejności MSI-H, MSS, MSI-L. Mutacje KRAS i BRAF nie mają związku z hipometylacją i ekspresją SNAI2. Progresji raka jelita grubego towarzyszy utrata epigenetycznego zabezpieczenia – metylacji promotora SNAI2 oraz wzrost liczby komórek nowotworowych z ekspresją tego genu. 88 9. Abstract INTRODUCTION: The colorectal cancer is one of the most common neoplastic diseases in Poland. The more advanced disease is at time of diagnosis, the shorter the survival, and therefore insight into cancer cell motility and metastases is an important aim of molecular studies. The colorectal cancer is characterized by genomic instability. The chromosomal instability is frequently observed as the aneuploidy and numerous chromosomal abnormalities. The initial event in the colorectal carcinogenesis is usually a damage of APC gene leading to subsequent β-catenin functioning as a transcription factor, responsible for proliferation and cell survival. Highly instable microsatellite DNA is a hallmark of alternative carcinogenic pathway (MSI-H). Replication errors are preserved due to defective DNA repair within these tumors. Microsatellite instability in coding sequences leads to proteins’ dysfunction. This group (MSI-H cancers) differs from microsatellite stable one (MSS) and is characterized by chromosomal stability, right-sided localization, frequent BRAF mutations, mucus secretion, tumor-infiltrating inflammatory cells and better prognosis. Some researchers recognize low level of microsatellite instability (MSI-L) as a distinct entity from MSS. Tumors MSI-L are chromosomally instable like MSS but a few studies have indicated poorer prognosis and distinct features like higher frequency of KRAS mutations, loss of MGMT, left-sided localization, low proliferation fraction. KRAS and BRAF are oncogenes in colorectal carcinogenesis. Ras protein activates Raf kinase, a first component of the MAPK pathway. Both proteins belong to intracellular signal transduction pathway responsible for reaction to growth factors. A SNAI2 gene expression is associated with the activity of the MAPK pathway. The SNAI2 gene encodes transcription factor Slug associated with the epithelialmesenchymal transition and cell motility. Its expression has been detected in numerous tumors and is associated with formation of metastases. AIM: The analysis of SNAI2 gene methylation and expression in colorectal cancers in comparison with tumor stage, microsatellite instability level and KRAS/BRAF mutations. MATERIAL AND METHODS: Analysis was performed on 163 colorectal adenocarcinomas and on corresponding healthy tissue. Fresh surgical material has been fixed in formalin and embedded in paraffin for diagnostics. The tumors have been classified according to Astler-Coller and TNMLV staging systems. A part of fresh material was frozen for further DNA extraction. 89 Incubation with sodium bisulfate and methylation specific PCR were used for SNAI2 methylation status assessment. Two primers sets have been designed for methylated and unmethylated DNA template. Immunohistochemistry with anti-Slug rabbit polyclonal antibody (SLUG H-140, Santa Cruz Biotechnology) was performed to detect Slug protein in cancer cells. Nuclear staining has been evaluated in 116 tumors. For determination of the MSI status all cases have been screened with a panel of five markers (APC, p53, BATRII, BAT26, BAX). All the cases demonstrating MSI were subjected to further analysis with an additional set of nine markers (D2S123, D5S346, D3S1611, D18S35, NM-23, D7S501, D1S2883, TP53-penta, TP53-di) on ABI PRISM 310 sequencer. The tumors were classified as MSI-H when MSI was detected at 40% or more loci. MSI-L group was defined as showing instability at less than 40% of loci. The remaining cases were classified as microsatellite-stable (MSS) carcinomas. All cases were screened for mutations in exons 1-3 of KRAS gene and exons 11 and 15 of BRAF gene. SSCP was performed to detect DNA sequence alterations. Detected mutations were confirmed by direct sequencing. RESULTS: 1. All cases were positive for Slug protein with nuclear immunostaining; however there were differences in percentage of positive cells. 2. SNAI2 expression (as a percentage of Slug-positive cells) significantly correlated with: a) staging (mean percentage of positive cells in tumors restricted to intestine wall, AstlerColler’s groups A, B1 ,B2 =59%; mean percentage of positive cells in metastatic tumors, Astler-Coller’s groups C1, C2 ,D =70%; p=0.01) b) lymph nodes metastases – parameter pN (mean percentage of positive cells within groups: pN0 58,9%; pN1 67,2%; pN2 72,1%; p=0.02) c) grading (mean percentage of positive cells in low grade group G1=59,4%, and in high grade group G3=77,7%; p=0.01) 3 SNAI2 promoter hypomethylation has been detected in 67% of the cases. 4. The hypomethylation was associated with: a) gene expression (mean percentage of positive cells in methylated cancers =58%, mean percentage of positive cells in hypomethylated cancers =70%, p=0.01) b) the Astler-Coller’s classification (percentage of hypomethylated tumors within groups: A 20%; B1 47,5%; B2 57,1%; C1 46,7%; C2 72%; D 85%; p=0.007) 90 c) the depth of invasion – parameter pT (percentage of hypomethylated tumors within groups: pT1 20%; pT2 49,1%; pT3 69,7%, pT4 75%; p=0.01) d) lymph nodes metastases – parameter pN (percentage of hypomethylated tumors within groups: pN0 50%; pN1 58,3%; pN2 77,8%; p=0.007) e) distant metastases – parameter M (percentage of hypomethylated tumors within groups: M0 57,7%; M1 85%; p=0.02) f) invasion into lymphatic vessels – parameter pL (percentage of hypomethylated tumors within groups: pL0 53,4%; pL1 74,5%; p=0.01) g) invasion into blood vessels – parameter pV (percentage of hypomethylated tumors within groups: pV0 53,8%; pV1 75%; p=0.01) h) microsatellite instability (percentage of hypomethylated tumors within groups: MSI-L 93,8%; MSS 59,4%, MSI-H 42,9%; p=0.009) 5. 14 (9%) cases with high level of microsatellite instability (MSI-H) have been detected, 16 (10%) cases have been classified as low instability (MSI-L). The remaining 133 (81%) cases were stable (MSS). 6. KRAS mutations have been detected in 58 (35,6%) cases (51 cases in exon 1; 5 in exon 2; 2 in exon 3). BRAF mutations have been detected only in 6 cases. Five mutations were localized in exon 15 and only 1 in exon 11. KRAS and BRAF mutation were not associated with SNAI2 expression and methylation. CONCLUSION: The SNAI2 gene expression in colorectal cancers is associated with metastases. The SNAI2 promoter hypomethylation is associated with the expression of this gene and correlates positively with advanced stages according to Astler-Coller and TNMLV classifications. Microsatellite instability levels are significantly different with regard to hypomethylation. The percentage of hypomethylated cancers within groups increases as follows: MSI-H, MSS and MSI-L. KRAS and BRAF mutations have no connection with the expression and the hypomethylation. The progression of the disease is associated with loss of epigenetic protection – SNAI2 promoter methylation and with increase of population of SNAI2 expressing cells. 91 10. Bibliografia 1 Raporty na podstawie danych Centrum Onkologii. http://epid.coi.waw.pl/krn/ 2 Liu X, Rubin JS, Kimmel AR. Rapid, Wnt-induced changes in GSK3beta associations that regulate betacatenin stabilization are mediated by Galpha proteins. Curr Biol. 2005; 15(22):1989-97. 3 Davies PS, Dismuke AD, Powell AE, Carroll KH, Wong MH. Wnt-reporter expression pattern in the mouse intestine during homeostasis. BMC Gastroenterol. 2008; 8:57. 4 Groden J, Thliveris A, Samowitz W, Carlson M, Gelbert L, Albertsen H, Joslyn G, Stevens J, Spirio L, Robertson M, et al. Identification and characterization of the familial adenomatous polyposis coli gene. Cell. 1991; 66(3):589-600. 5 Miyaki M, Konishi M, Kikuchi-Yanoshita R, Enomoto M, Igari T, Tanaka K, Muraoka M, Takahashi H, Amada Y, Fukayama M, Characteristics of somatic mutation of the adenomatous polyposis coli gene in colorectal tumors. Cancer Res. 1994; 54(11):3011-20. 6 Rowan AJ, Lamlum H, Ilyas M, Wheeler J, Straub J, Papadopoulou A, Bicknell D, Bodmer WF, Tomlinson IP. APC mutations in sporadic colorectal tumors: A mutational "hotspot" and interdependence of the "two hits". Proc Natl Acad Sci U S A. 2000; 97(7):3352-7. 7 Powell SM, Zilz N, Beazer-Barclay Y, Bryan TM, Hamilton SR, Thibodeau SN, Vogelstein B, Kinzler KW. APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature. 1992; 359(6392):235-7. 8 Friedl W, Caspari R, Sengteller M, Uhlhaas S, Lamberti C, Jungck M, Kadmon M, Wolf M, Fahnenstich J, Gebert J, Möslein G, Mangold E, Propping P. Can APC mutation analysis contribute to therapeutic decisions in familial adenomatous polyposis? Experience from 680 FAP families. Gut. 2001; 48(4):515-21. 9 Mandl M, Paffenholz R, Friedl W, Caspari R, Sengteller M, Propping P. Frequency of common and novel inactivating APC mutations in 202 families with familial adenomatous polyposis. Hum Mol Genet. 1994 Jan;3(1):181-4. 10 Nielsen M, Hes FJ, Nagengast FM, Weiss MM, Mathus-Vliegen EM, Morreau H, Breuning MH, Wijnen JT, Tops CM, Vasen HF. Germline mutations in APC and MUTYH are responsible for the majority of families with attenuated familial adenomatous polyposis. Clin Genet. 2007; 71(5):427-33. 11 Lefevre JH, Rodrigue CM, Mourra N, Bennis M, Flejou JF, Parc R, Tiret E, Gespach C, Parc YR. Implication of MYH in colorectal polyposis.Ann Surg. 2006; 244(6):874-9 12 Bouguen G, Manfredi S, Blayau M, Dugast C, Buecher B, Bonneau D, Siproudhis L, David V, Bretagne JF. Colorectal adenomatous polyposis Associated with MYH mutations: genotype and phenotype characteristics. Dis Colon Rectum. 2007; 50(10):1612-7. 13 Jin LH, Shao QJ, Luo W, Ye ZY, Li Q, Lin SC. Detection of point mutations of the Axin1 gene in colorectal cancers. Int J Cancer. 2003; 107(5):696-9. 14 Kaplan, K. B.; Burds, A. A.; Swedlow, J. R.; Bekir, S. S.; Sorger, P. K.; Nathke, I. S. : A role for the adenomatous polyposis coli protein in chromosome segregation. Nature Cell Biol. 2001; 3: 429-432, 15 Zumbrunn J, Kinoshita K, Hyman AA, Näthke IS. Binding of the adenomatous polyposis coli protein to microtubules increases microtubule stability and is regulated by GSK3 beta phosphorylation. Curr Biol. 2001; 11(1):44-9. 16 Dikovskaya D, Schiffmann D, Newton IP, Oakley A, Kroboth K, Sansom O, Jamieson TJ, Meniel V, Clarke A, Näthke IS. Loss of APC induces polyploidy as a result of a combination of defects in mitosis and apoptosis. J Cell Biol. 2007; 176(2):183-95. 92 17 Tighe A, Johnson VL, Taylor SS. Truncating APC mutations have dominant effects on proliferation, spindle checkpoint control, survival and chromosome stability. J Cell Sci. 2004; 117(Pt 26):6339-53. 18 Green RA, Kaplan KB. Chromosome instability in colorectal tumor cells is associated with defects in microtubule plus-end attachments caused by a dominant mutation in APC. J Cell Biol. 2003; 163(5):949-61. 19 Nishida N, Nagasaka T, Kashiwagi K, Boland CR, Goel A. High copy amplification of the Aurora-A gene is associated with chromosomal instability phenotype in human colorectal cancers. Cancer Biol Ther. 2007; 6(4):525-33. 20 Baba Y, Nosho K, Shima K, Irahara N, Kure S, Toyoda S, Kirkner GJ, Goel A, Fuchs CS, Ogino S. Aurora-A expression is independently associated with chromosomal instability in colorectal cancer. Neoplasia. 2009; 11(5):418-25. 21 Anand S, Penrhyn-Lowe S, Venkitaraman AR. AURORA-A amplification overrides the mitotic spindle assembly checkpoint, inducing resistance to Taxol. Cancer Cell. 2003; 3(1):51-62. 22 Ricciardiello L, Laghi L, Ramamirtham P, Chang CL, Chang DK, Randolph AE, Boland CR. JC virus DNA sequences are frequently present in the human upper and lower gastrointestinal tract. Gastroenterology. 2000; 119(5):1228-35. 23 Nosho K, Shima K, Kure S, Irahara N, Baba Y, Chen L, Kirkner GJ, Fuchs CS, Ogino S. JC virus T-antigen in colorectal cancer is associated with p53 expression and chromosomal instability, independent of CpG island methylator phenotype. Neoplasia. 2009; 11(1):87-95. 24 Ricciardiello L, Baglioni M, Giovannini C, Pariali M, Cenacchi G, Ripalti A, Landini MP, Sawa H, Nagashima K, Frisque RJ, Goel A, Boland CR, Tognon M, Roda E, Bazzoli F. Induction of chromosomal instability in colonic cells by the human polyomavirus JC virus. Cancer Res. 2003; 63(21):7256-62. 25 Tang R, Changchien CR, Wu MC, Fan CW, Liu KW, Chen JS, Chien HT, Hsieh LL. Colorectal cancer without high microsatellite instability and chromosomal instability--an alternative genetic pathway to human colorectal cancer. Carcinogenesis. 2004; 25(5):841-6. 26 Alcock HE, Stephenson TJ, Royds JA, Hammond DW. Analysis of colorectal tumor progression by microdissection and comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes Cancer. 2003; 37(4):369-80. 27 Nakao K, Mehta KR, Fridlyand J, Moore DH, Jain AN, Lafuente A, Wiencke JW, Terdiman JP, Waldman FM. High-resolution analysis of DNA copy number alterations in colorectal cancer by array-based comparative genomic hybridization. Carcinogenesis. 2004; 25(8):1345-57. 28 Hermsen M, Postma C, Baak J, Weiss M, Rapallo A, Sciutto A, Roemen G, Arends JW, Williams R, Giaretti W, De Goeij A, Meijer G. Colorectal adenoma to carcinoma progression follows multiple pathways of chromosomal instability. Gastroenterology. 2002;123(4):1109-19. 29 Matsuzaki K, Deng G, Tanaka H, Kakar S, Miura S, Kim YS. The relationship between global methylation level, loss of heterozygosity, and microsatellite instability in sporadic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2005; 11(24 Pt 1):8564-9. 30 Hamamoto T, Beppu H, Okada H, Kawabata M, Kitamura T, Miyazono K, Kato M. Compound disruption of smad2 accelerates malignant progression of intestinal tumors in apc knockout mice. Cancer Res. 2002; 62(20):5955-61. 31 Munoz NM, Upton M, Rojas A, Washington MK, Lin L, Chytil A, Sozmen EG, Madison BB, Pozzi A, Moon RT, Moses HL, Grady WM. Transforming growth factor beta receptor type II inactivation induces the malignant transformation of intestinal neoplasms initiated by Apc mutation. Cancer Res. 2006; 66(20):983744. 32 Howe JR, Sayed MG, Ahmed AF, Ringold J, Larsen-Haidle J, Merg A, Mitros FA, Vaccaro CA, Petersen GM, Giardiello FM, Tinley ST, Aaltonen LA, Lynch HT. The prevalence of MADH4 and BMPR1A 93 mutations in juvenile polyposis and absence of BMPR2, BMPR1B, and ACVR1 mutations. J Med Genet. 2004; 41(7):484-91. 33 Mehlen P, Llambi F. Role of netrin-1 and netrin-1 dependence receptors in colorectal cancers. Br J Cancer. 2005; 93(1):1-6. 34 Mehlen P, Rabizadeh S, Snipas SJ, Assa-Munt N, Salvesen GS, Bredesen DE. The DCC gene product induces apoptosis by a mechanism requiring receptor proteolysis. Nature. 1998; 395(6704):801-4. 35 Thiebault K, Mazelin L, Pays L, Llambi F, Joly MO, Scoazec JY, Saurin JC, Romeo G, Mehlen P. The netrin-1 receptors UNC5H are putative tumor suppressors controlling cell death commitment. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(7):4173-8. 36 Bernet A, Mazelin L, Coissieux MM, Gadot N, Ackerman SL, Scoazec JY, Mehlen P. Inactivation of the UNC5C Netrin-1 receptor is associated with tumor progression in colorectal malignancies. Gastroenterology. 2007; 133(6):1840-8. 37 Risio M, Casorzo L, Chiecchio L, De Rosa G, Rossini FP. Deletions of 17p are associated with transition from early to advanced colorectal cancer. Cancer Genet Cytogenet. 2003; 147(1):44-9. 38 Leslie A, Carey FA, Pratt NR, Steele RJ. The colorectal adenoma-carcinoma sequence. Br J Surg. 2002; 89(7):845-60. 39 Lane DP. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 1992; 358(6381):15-6. 40 el-Deiry WS, Harper JW, O'Connor PM, Velculescu VE, Canman CE, Jackman J, Pietenpol JA, Burrell M, Hill DE, Wang Y, et al. WAF1/CIP1 is induced in p53-mediated G1 arrest and apoptosis. Cancer Res. 1994; 54(5):1169-74. 41 Ogino S, Kawasaki T, Kirkner GJ, Ogawa A, Dorfman I, Loda M, Fuchs CS. Down-regulation of p21 (CDKN1A/CIP1) is inversely associated with microsatellite instability and CpG island methylator phenotype (CIMP) in colorectal cancer. J Pathol. 2006; 210(2):147-54. 42 Camps J, Armengol G, del Rey J, Lozano JJ, Vauhkonen H, Prat E, Egozcue J, Sumoy L, Knuutila S, Miró R. Genome-wide differences between microsatellite stable and unstable colorectal tumors. Carcinogenesis. 2006; 27(3):419-28. 43 Fukuyama R, Niculaita R, Ng KP, Obusez E, Sanchez J, Kalady M, Aung PP, Casey G, Sizemore N. Mutated in colorectal cancer, a putative tumor suppressor for serrated colorectal cancer, selectively represses betacatenin-dependent transcription. Oncogene. 2008; 27(46):6044-55. 44 Zhou CZ, Qiu GQ, Zhang F, He L, Peng ZH. Loss of heterozygosity on chromosome 1 in sporadic colorectal carcinoma. World J Gastroenterol. 2004; 10(10):1431-5. 45 Thorstensen L, Qvist H, Heim S, Liefers GJ, Nesland JM, Giercksky KE, Lothe RA. Evaluation of 1p losses in primary carcinomas, local recurrences and peripheral metastases from colorectal cancer patients. Neoplasia. 2000; 2(6):514-22. 46 Guo DL, Zhang J, Yuen ST, Tsui WY, Chan AS, Ho C, Ji J, Leung SY, Chen X. Reduced expression of EphB2 that parallels invasion and metastasis in colorectal tumours. Carcinogenesis. 2006; 27(3):454-64. 47 Batlle E, Bacani J, Begthel H, Jonkheer S, Gregorieff A, van de Born M, Malats N, Sancho E, Boon E, Pawson T, Gallinger S, Pals S, Clevers H. EphB receptor activity suppresses colorectal cancer progression. Nature. 2005; 435(7045):1126-30. 48 Karoui M, Tresallet C, Julie C, Zimmermann U, Staroz F, Brams A, Muti C, Boulard C, Robreau AM, Puy H, Malafosse R, Penna C, Pruvot FR, Thiery JP, Boileau C, Rougier P, Nordlinger B, Radvanyi F, Franc B, Hofmann-Radvanyi H. Loss of heterozygosity on 10q and mutational status of PTEN and BMPR1A in colorectal primary tumours and metastases. Br J Cancer. 2004; 90(6):1230-4. 94 49 Nassif NT, Lobo GP, Wu X, Henderson CJ, Morrison CD, Eng C, Jalaludin B, Segelov E. PTEN mutations are common in sporadic microsatellite stable colorectal cancer. Oncogene. 2004; 23(2):617-28. 50 Cao X, Eu KW, Kumarasinghe MP, Li HH, Loi C, Cheah PY. Mapping of hereditary mixed polyposis syndrome (HMPS) to chromosome 10q23 by genomewide high-density single nucleotide polymorphism (SNP) scan and identification of BMPR1A loss of function. J Med Genet. 2006; 43(3):e13. 51 Roy HK, Olusola BF, Clemens DL, Karolski WJ, Ratashak A, Lynch HT, Smyrk TC. AKT proto-oncogene overexpression is an early event during sporadic colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 2002; 23(1):201-5. 52 Camps J, Armengol G, del Rey J, Lozano JJ, Vauhkonen H, Prat E, Egozcue J, Sumoy L, Knuutila S, Miró R. Genome-wide differences between microsatellite stable and unstable colorectal tumors. Carcinogenesis. 2006; 27(3):419-28. 53 De Angelis PM, Clausen OP, Schjølberg A, Stokke T. Chromosomal gains and losses in primary colorectal carcinomas detected by CGH and their associations with tumour DNA ploidy, genotypes and phenotypes. Br J Cancer. 1999; 80(3-4):526-35. 54 Liu XP, Kawauchi S, Oga A, Sato T, Ikemoto K, Ikeda E, Sasaki K. Chromosomal aberrations detected by comparative genomic hybridization predict outcome in patients with colorectal carcinoma. Oncol Rep. 2007; 17(1):261-7. 55 Knösel T, Petersen S, Schwabe H, Schlüns K, Stein U, Schlag PM, Dietel M, Petersen I. Incidence of chromosomal imbalances in advanced colorectal carcinomas and their metastases. Virchows Arch. 2002; 440(2):187-94. 56 Orita H, Sakamoto N, Ajioka Y, Terai T, Hino O, Sato N, Shimoda T, Kamano T, Tsurumaru M, Fujii H. Allelic loss analysis of early-stage flat-type colorectal tumors. Ann Oncol. 2006; 17(1):43-9. 57 Postma C, Hermsen MA, Coffa J, Baak JP, Mueller JD, Mueller E, Bethke B, Schouten JP, Stolte M, Meijer GA. Chromosomal instability in flat adenomas and carcinomas of the colon. J Pathol. 2005; 205(4):514-21. 58 Hermsen M, Postma C, Baak J, Weiss M, Rapallo A, Sciutto A, Roemen G, Arends JW, Williams R, Giaretti W, De Goeij A, Meijer G. Colorectal adenoma to carcinoma progression follows multiple pathways of chromosomal instability. Gastroenterology. 2002; 123(4):1109-19. 59 Leslie A, Stewart A, Baty DU, Mechan D, McGreavey L, Smith G, Wolf CR, Sales M, Pratt NR, Steele RJ, Carey FA. Chromosomal changes in colorectal adenomas: relationship to gene mutations and potential for clinical utility. Genes Chromosomes Cancer. 2006; 45(2):126-35. 60 Leslie A, Pratt NR, Gillespie K, Sales M, Kernohan NM, Smith G, Wolf CR, Carey FA, Steele RJ. Mutations of APC, K-ras, and p53 are associated with specific chromosomal aberrations in colorectal adenocarcinomas. Cancer Res. 2003; 63(15):4656-61. 61 Lips EH, de Graaf EJ, Tollenaar RA, van Eijk R, Oosting J, Szuhai K, Karsten T, Nanya Y, Ogawa S, van de Velde CJ, Eilers PH, van Wezel T, Morreau H. Single nucleotide polymorphism array analysis of chromosomal instability patterns discriminates rectal adenomas from carcinomas. J Pathol. 2007; 212(3):26977. 62 Ghadimi BM, Grade M, Mönkemeyer C, Kulle B, Gaedcke J, Gunawan B, Langer C, Liersch T, Becker H. Distinct chromosomal profiles in metastasizing and non-metastasizing colorectal carcinomas. Cell Oncol. 2006; 28(5-6):273-81. 63 De Angelis PM, Stokke T, Beigi M, Mjåland O, Clausen OP. Prognostic significance of recurrent chromosomal aberrations detected by comparative genomic hybridization in sporadic colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 2001 Feb;16(1):38-45. 95 64 Diep CB, Thorstensen L, Meling GI, Skovlund E, Rognum TO, Lothe RA. Genetic tumor markers with prognostic impact in Dukes' stages B and C colorectal cancer patients. J Clin Oncol. 2003; 21(5):820-9. 65 Harfe BD, Jinks-Robertson S. DNA mismatch repair and genetic instability. Annu Rev Genet. 2000; 34:359399. 66 Li GM. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res. 2008; 18(1):85-98. 67 Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW, Meltzer SJ, Rodriguez-Bigas MA, Fodde R, Ranzani GN, Srivastava S. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998; 58(22):5248-57. 68 Bronner CE, Baker SM, Morrison PT, Warren G, Smith LG, Lescoe MK, Kane M, Earabino C, Lipford J, Lindblom A, et al. Mutation in the DNA mismatch repair gene homologue hMLH1 is associated with hereditary non-polyposis colon cancer. Nature. 1994; 368(6468):258-61. 69 Fishel R, Lescoe MK, Rao MR, Copeland NG, Jenkins NA, Garber J, Kane M, Kolodner R. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell. 1993; 75(5):1027-38. 70 Barnetson RA, Tenesa A, Farrington SM, Nicholl ID, Cetnarskyj R, Porteous ME, Campbell H, Dunlop MG. Identification and survival of carriers of mutations in DNA mismatch-repair genes in colon cancer. N Engl J Med. 2006; 354(26):2751-63. 71 Wu Y, Berends MJ, Sijmons RH, Mensink RG, Verlind E, Kooi KA, van der Sluis T, Kempinga C, van dDer Zee AG, Hollema H, Buys CH, Kleibeuker JH, Hofstra RM. A role for MLH3 in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Nat Genet. 2001; 29(2):137-8. 72 Nicolaides NC, Papadopoulos N, Liu B, Wei YF, Carter KC, Ruben SM, Rosen CA, Haseltine WA, Fleischmann RD, Fraser CM, Mutations of two PMS homologues in hereditary nonpolyposis colon cancer. Nature. 1994; 371(6492):75-80. 73 Anwar S, Hall C, White J, Deakin M, Farrell W, Elder JB. Hereditary non-polyposis colorectal cancer: an updated review. Eur J Surg Oncol. 2000; 26(7):635-45. 74 Suter CM, Martin DI, Ward RL. Germline epimutation of MLH1 in individuals with multiple cancers. Nat Genet. 2004; 36(5):497-501. 75 Valle L, Carbonell P, Fernandez V, Dotor AM, Sanz M, Benitez J, Urioste M. MLH1 germline epimutations in selected patients with early-onset non-polyposis colorectal cancer. Clin Genet. 2007; 71(3):232-7. 76 Chan TL, Yuen ST, Kong CK, Chan YW, Chan AS, Ng WF, Tsui WY, Lo MW, Tam WY, Li VS, Leung SY. Heritable germline epimutation of MSH2 in a family with hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Nat Genet. 2006; 38(10):1178-83. 77 Jass JR, Walsh MD, Barker M, Simms LA, Young J, Leggett BA. Distinction between familial and sporadic forms of colorectal cancer showing DNA microsatellite instability. Eur J Cancer. 2002; 38(7):858-66. 78 Jass JR. HNPCC and sporadic MSI-H colorectal cancer: a review of the morphological similarities and differences. Fam Cancer. 2004; 3(2):93-100. 79 Hawkins NJ, Ward RL. Sporadic colorectal cancers with microsatellite instability and their possible origin in hyperplastic polyps and serrated adenomas. J Natl Cancer Inst 2001; 93:1307–13 80 Johnson V, Volikos E, Halford SE, Eftekhar Sadat ET, Popat S, Talbot I, Truninger K, Martin J, Jass J, Houlston R, Atkin W, Tomlinson IP, Silver AR. Exon 3 beta-catenin mutations are specifically associated with colorectal carcinomas in hereditary non-polyposis colorectal cancer syndrome. Gut. 2005; 54(2):264-7. 96 81 Koinuma K, Shitoh K, Miyakura Y, Furukawa T, Yamashita Y, Ota J, Ohki R, Choi YL, Wada T, Konishi F, Nagai H, Mano H. Mutations of BRAF are associated with extensive hMLH1 promoter methylation in sporadic colorectal carcinomas. Int J Cancer. 2004; 108(2):237-42. 82 Weisenberger DJ, Siegmund KD, Campan M, Young J, Long TI, Faasse MA, Kang GH, Widschwendter M, Weener D, Buchanan D, Koh H, Simms L, Barker M, Leggett B, Levine J, Kim M, French AJ, Thibodeau SN, Jass J, Haile R, Laird PW. CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer. Nat Genet. 2006; 38(7):787-93. 83 Spring KJ, Zhao ZZ, Karamatic R, Walsh MD, Whitehall VL, Pike T, Simms LA, Young J, James M, Montgomery GW, Appleyard M, Hewett D, Togashi K, Jass JR, Leggett BA. High prevalence of sessile serrated adenomas with BRAF mutations: a prospective study of patients undergoing colonoscopy. Gastroenterology. 2006; 131(5):1400-7. 84 Gaasenbeek M, Howarth K, Rowan AJ, Gorman PA, Jones A, Chaplin T, Liu Y, Bicknell D, Davison EJ, Fiegler H, Carter NP, Roylance RR, Tomlinson IP Combined array-comparative genomic hybridization and single-nucleotide polymorphism-loss of heterozygosity analysis reveals complex changes and multiple forms of chromosomal instability in colorectal cancers. Cancer Res. 2006; 66(7):3471-9. 85 Muleris M, Chalastanis A, Meyer N, Lae M, Dutrillaux B, Sastre-Garau X, Hamelin R, Fléjou JF, Duval A. Chromosomal instability in near-diploid colorectal cancer: a link between numbers and structure. PLoS One. 2008; 3(2):e1632. 86 Vaissière T, Sawan C, Herceg Z. Epigenetic interplay between histone modifications and DNA methylation in gene silencing. Mutat Res. 2008; 659(1-2):40-8. 87 Weisenberger DJ, Siegmund KD, Campan M, Young J, Long TI, Faasse MA, Kang GH, Widschwendter M, Weener D, Buchanan D, Koh H, Simms L, Barker M, Leggett B, Levine J, Kim M, French AJ, Thibodeau SN, Jass J, Haile R, Laird PW. CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer. Nat Genet. 2006; 38(7):787-93. 88 Barault L, Charon-Barra C, Jooste V, de la Vega MF, Martin L, Roignot P, Rat P, Bouvier AM, Laurent-Puig P, Faivre J, Chapusot C, Piard F. Hypermethylator phenotype in sporadic colon cancer: study on a population-based series of 582 cases. Cancer Res. 2008; 68(20):8541-6. 89 Lee S, Cho NY, Choi M, Yoo EJ, Kim JH, Kang GH. Clinicopathological features of CpG island methylator phenotype-positive colorectal cancer and its adverse prognosis in relation to KRAS/BRAF mutation. Pathol Int. 2008; 58(2):104-13. 90 Tanaka H, Deng G, Matsuzaki K, Kakar S, Kim GE, Miura S, Sleisenger MH, Kim YS. BRAF mutation, CpG island methylator phenotype and microsatellite instability occur more frequently and concordantly in mucinous than non-mucinous colorectal cancer. Int J Cancer. 2006; 118(11):2765-71. 91 Goel A, Nagasaka T, Arnold CN, Inoue T, Hamilton C, Niedzwiecki D, Compton C, Mayer RJ, Goldberg R, Bertagnolli MM, Boland CR. The CpG island methylator phenotype and chromosomal instability are inversely correlated in sporadic colorectal cancer. Gastroenterology. 2007; 132(1):127-38. 92 Cheng YW, Pincas H, Bacolod MD, Schemmann G, Giardina SF, Huang J, Barral S, Idrees K, Khan SA, Zeng Z, Rosenberg S, Notterman DA, Ott J, Paty P, Barany F. CpG island methylator phenotype associates with low-degree chromosomal abnormalities in colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2008; 14(19):6005-13. 93 Yin J, Kong D, Wang S, Zou TT, Souza RF, Smolinski KN, Lynch PM, Hamilton SR, Sugimura H, Powell SM, Young J, Abraham JM, Meltzer SJ. Mutation of hMSH3 and hMSH6 mismatch repair genes in genetically unstable human colorectal and gastric carcinomas. Hum Mutat. 1997; 10(6):474-8. 94 Kim NG, Choi YR, Baek MJ, Kim YH, Kang H, Kim NK, Min JS, Kim H. Frameshift mutations at coding mononucleotide repeats of the hRAD50 gene in gastrointestinal carcinomas with microsatellite instability. Cancer Res. 2001; 61(1):36-8. 97 95 Giannini G, Rinaldi C, Ristori E, Ambrosini MI, Cerignoli F, Viel A, Bidoli E, Berni S, D'Amati G, Scambia G, Frati L, Screpanti I, Gulino A. Mutations of an intronic repeat induce impaired MRE11 expression in primary human cancer with microsatellite instability. Oncogene. 2004; 23(15):2640-7. 96 Grady WM, Rajput A, Myeroff L, Liu DF, Kwon K, Willis J, Markowitz S. Mutation of the type II transforming growth factor-beta receptor is coincident with the transformation of human colon adenomas to malignant carcinomas. Cancer Res. 1998; 58(14):3101-4. 97 Kodach LL, Wiercinska E, de Miranda NF, Bleuming SA, Musler AR, Peppelenbosch MP, Dekker E, van den Brink GR, van Noesel CJ, Morreau H, Hommes DW, Ten Dijke P, Offerhaus GJ, Hardwick JC. The bone morphogenetic protein pathway is inactivated in the majority of sporadic colorectal cancers. Gastroenterology. 2008; 134(5):1332-41. 98 Olaru A, Mori Y, Yin J, Wang S, Kimos MC, Perry K, Xu Y, Sato F, Selaru FM, Deacu E, Sterian A, Shibata D, Abraham JM, Meltzer SJ. Loss of heterozygosity and mutational analyses of the ACTRII gene locus in human colorectal tumors. Lab Invest. 2003; 83(12):1867-71. 99 Loh K, Chia JA, Greco S, Cozzi SJ, Buttenshaw RL, Bond CE, Simms LA, Pike T, Young JP, Jass JR, Spring KJ, Leggett BA, Whitehall VL. Bone morphogenic protein 3 inactivation is an early and frequent event in colorectal cancer development. Genes Chromosomes Cancer. 2008; 47(6):449-60. 100 Alazzouzi H, Davalos V, Kokko A, Domingo E, Woerner SM, Wilson AJ, Konrad L, Laiho P, Espín E, Armengol M, Imai K, Yamamoto H, Mariadason JM, Gebert JF, Aaltonen LA, Schwartz S Jr, Arango D. Mechanisms of inactivation of the receptor tyrosine kinase EPHB2 in colorectal tumors. Cancer Res. 2005; 65(22):10170-3. 101 Thorstensen L, Lind GE, Løvig T, Diep CB, Meling GI, Rognum TO, Lothe RA. Genetic and epigenetic changes of components affecting the WNT pathway in colorectal carcinomas stratified by microsatellite instability. Neoplasia. 2005; 7(2):99-108. 102 Koinuma K, Yamashita Y, Liu W, Hatanaka H, Kurashina K, Wada T, Takada S, Kaneda R, Choi YL, Fujiwara SI, Miyakura Y, Nagai H, Mano H. Epigenetic silencing of AXIN2 in colorectal carcinoma with microsatellite instability. Oncogene. 2006; 25(1):139-46. 103 Ortega P, Morán A, de Juan C, Frías C, Hernández S, López-Asenjo JA, Sánchez-Pernaute A, Torres A, Iniesta P, Benito M. Differential Wnt pathway gene expression and E-cadherin truncation in sporadic colorectal cancers with and without microsatellite instability. Clin Cancer Res. 2008; 14(4):995-1001. 104 Chang HR, Cheng TL, Liu TZ, Hu HS, Hsu LS, Tseng WC, Chen CH, Tsao DA. Genetic and cellular characterizations of human TCF4 with microsatellite instability in colon cancer and leukemia cell lines. Cancer Lett. 2006; 233(1):165-71. 105 Nosho K, Kawasaki T, Chan AT, Ohnishi M, Suemoto Y, Kirkner GJ, Fuchs CS, Ogino S. Cyclin D1 is frequently overexpressed in microsatellite unstable colorectal cancer, independent of CpG island methylator phenotype. Histopathology. 2008; 53(5):588-98. 106 Norrie MW, Hawkins NJ, Todd AV, Meagher AP, O'Connor TW, Ward RL Inactivation of p16INK4a by CpG hypermethylation is not a frequent event in colorectal cancer. J Surg Oncol. 2003; 84(3):143-50. 107 Ogino S, Kawasaki T, Kirkner GJ, Yamaji T, Loda M, Fuchs CS. Loss of nuclear p27 (CDKN1B/KIP1) in colorectal cancer is correlated with microsatellite instability and CIMP. Mod Pathol. 2007; 20(1):15-22. 108 Shen L, Kondo Y, Hamilton SR, Rashid A, Issa JP. P14 methylation in human colon cancer is associated with microsatellite instability and wild-type p53. Gastroenterology. 2003; 124(3):626-33. 109 Fernández-Peralta AM, Nejda N, Oliart S, Medina V, Azcoita MM, González-Aguilera JJ. Significance of mutations in TGFBR2 and BAX in neoplastic progression and patient outcome in sporadic colorectal tumors with high-frequency microsatellite instability. Cancer Genet Cytogenet. 2005; 157(1):18-24. 98 110 Zhou XP, Loukola A, Salovaara R, Nystrom-Lahti M, Peltomäki P, de la Chapelle A, Aaltonen LA, Eng C. PTEN mutational spectra, expression levels, and subcellular localization in microsatellite stable and unstable colorectal cancers. Am J Pathol. 2002; 161(2):439-47. 111 Goel A, Arnold CN, Niedzwiecki D, Carethers JM, Dowell JM, Wasserman L, Compton C, Mayer RJ, Bertagnolli MM, Boland CR. Frequent inactivation of PTEN by promoter hypermethylation in microsatellite instability-high sporadic colorectal cancers. Cancer Res. 2004; 64(9):3014-21. 112 Nosho K, Kawasaki T, Ohnishi M, Suemoto Y, Kirkner GJ, Zepf D, Yan L, Longtine JA, Fuchs CS, Ogino S. PIK3CA mutation in colorectal cancer: relationship with genetic and epigenetic alterations. Neoplasia. 2008; 10(6):534-41. 113 Malesci A, Laghi L, Bianchi P, Delconte G, Randolph A, Torri V, Carnaghi C, Doci R, Rosati R, Montorsi M, Roncalli M, Gennari L, Santoro A. Reduced likelihood of metastases in patients with microsatelliteunstable colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2007; 13(13):3831-9. 114 Sarli L, Bottarelli L, Bader G, Iusco D, Pizzi S, Costi R, D'Adda T, Bertolani M, Roncoroni L, Bordi C. Association between recurrence of sporadic colorectal cancer, high level of microsatellite instability, and loss of heterozygosity at chromosome 18q. Dis Colon Rectum. 2004; 47(9):1467-82. 115 Buckowitz A, Knaebel HP, Benner A, Bläker H, Gebert J, Kienle P, von Knebel Doeberitz M, Kloor M. Microsatellite instability in colorectal cancer is associated with local lymphocyte infiltration and low frequency of distant metastases. Br J Cancer. 2005; 92(9):1746-53. 116 Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, Thibodeau SN, French AJ, Goldberg RM, Hamilton SR, Laurent-Puig P, Gryfe R, Shepherd LE, Tu D, Redston M, Gallinger S. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. N Engl J Med. 2003; 349(3):24757. 117 Bertagnolli MM, Niedzwiecki D, Compton CC, Hahn HP, Hall M, Damas B, Jewell SD, Mayer RJ, Goldberg RM, Saltz LB, Warren RS, Redston M. Microsatellite instability predicts improved response to adjuvant therapy with irinotecan, fluorouracil, and leucovorin in stage III colon cancer: Cancer and Leukemia Group B Protocol 89803. J Clin Oncol. 2009; 27(11):1814-21. 118 Ricciardiello L, Ceccarelli C, Angiolini G, Pariali M, Chieco P, Paterini P, Biasco G, Martinelli GN, Roda E, Bazzoli F. High thymidylate synthase expression in colorectal cancer with microsatellite instability: implications for chemotherapeutic strategies. Clin Cancer Res. 2005; 11(11):4234-40. 119 Meyers M, Wagner MW, Hwang HS, Kinsella TJ, Boothman DA. Role of the hMLH1 DNA mismatch repair protein in fluoropyrimidine-mediated cell death and cell cycle responses. Cancer Res. 2001; 61(13):5193-201. 120 Tajima A, Hess MT, Cabrera BL, Kolodner RD, Carethers JM. The mismatch repair complex hMutS alpha recognizes 5-fluorouracil-modified DNA: implications for chemosensitivity and resistance. Gastroenterology. 2004; 127(6):1678-84. 121 Carethers JM, Chauhan DP, Fink D, Nebel S, Bresalier RS, Howell SB, Boland CR. Mismatch repair proficiency and in vitro response to 5-fluorouracil. Gastroenterology. 1999; 117(1):123-31. 122 Vilar E, Scaltriti M, Balmaña J, Saura C, Guzman M, Arribas J, Baselga J, Tabernero J. Microsatellite instability due to hMLH1 deficiency is associated with increased cytotoxicity to irinotecan in human colorectal cancer cell lines. Br J Cancer. 2008; 99(10):1607-12. 123 Rowan A, Halford S, Gaasenbeek M, Kemp Z, Sieber O, Volikos E, Douglas E, Fiegler H, Carter N, Talbot I, Silver A, Tomlinson I. Refining molecular analysis in the pathways of colorectal carcinogenesis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005; 3(11):1115-23. 124 Yearsley M, Hampel H, Lehman A, Nakagawa H, de la Chapelle A, Frankel WL. Histologic features distinguish microsatellite-high from microsatellite-low and microsatellite-stable colorectal carcinomas, but 99 do not differentiate germline mutations from methylation of the MLH1 promoter. Hum Pathol. 2006; 37(7):831-8. 125 Laiho P, Launonen V, Lahermo P, Esteller M, Guo M, Herman JG, Mecklin JP, Järvinen H, Sistonen P, Kim KM, Shibata D, Houlston RS, Aaltonen LA. Low-level microsatellite instability in most colorectal carcinomas. Cancer Res. 2002; 62(4):1166-70. 126 Graham T, Halford S, Page KM, Tomlinson IP. Most low-level microsatellite instability in colorectal cancers can be explained without an elevated slippage rate. J Pathol. 2008; 215(2):204-10. 127 Tomlinson I, Halford S, Aaltonen L, Hawkins N, Ward R. Does MSI-low exist? J Pathol. 2002; 197(1):6-13. 128 Jass, JR, Biden KG,et al. Characterization of a subtype of colorectal cancer combining features of the suppressor and mild mutator pathways. J. Clin. Pathol. 1999; 52: 455–460 129 Rudzki Z, Zazula M, et al. Low-level microsatellite instability colorectal carcinomas: do they really belong to a "gray zone" between high-level microsatellite instability and microsatellite-stable cancers? Int J Colorectal Dis. 2003; 18(3):216-21 130 Oliart S, Martínez-Santos C, Moreno-Azcoita M, Cerquella C, Nejda N, Daimiel L, Iglesias D, FernándezPeralta AM, González-Aguilera JJ. Do MSI-L sporadic colorectal tumors develop through "mild mutator pathway"? Am J Clin Oncol. 2006; 29(4):364-70. 131 Hatch SB, Lightfoot HM Jr, Garwacki CP, Moore DT, Calvo BF, Woosley JT, Sciarrotta J, Funkhouser WK, Farber RA. Microsatellite instability testing in colorectal carcinoma: choice of markers affects sensitivity of detection of mismatch repair-deficient tumors. Clin Cancer Res. 2005; 11(6):2180-7. 132 Iglesias D, Fernández-Peralta AM, Nejda N, Daimiel L, Azcoita MM, Oliart S, González-Aguilera JJ. RIS1, a gene with trinucleotide repeats, is a target in the mutator pathway of colorectal carcinogenesis. Cancer Genet Cytogenet. 2006; 167(2):138-44. 133 Whitehall VL, Walsh MD, Young J, Leggett BA, Jass JR. Methylation of O-6-methylguanine DNA methyltransferase characterizes a subset of colorectal cancer with low-level DNA microsatellite instability. Cancer Res. 2001; 61(3):827-30. 134 Haugen AC, Goel A, Yamada K, Marra G, Nguyen TP, Nagasaka T, Kanazawa S, Koike J, Kikuchi Y, Zhong X, Arita M, Shibuya K, Oshimura M, Hemmi H, Boland CR, Koi M. Genetic instability caused by loss of MutS homologue 3 in human colorectal cancer. Cancer Res. 2008; 68(20):8465-72. 135 Maltzman T, Knoll K, Martinez ME, Byers T, Stevens BR, Marshall JR, Reid ME, Einspahr J, Hart N, Bhattacharyya AK, Kramer CB, Sampliner R, Alberts DS, Ahnen DJ. Ki-ras proto-oncogene mutations in sporadic colorectal adenomas: relationship to histologic and clinical characteristics. Gastroenterology. 2001; 121(2):302-9. 136 Kakar S, Deng G, Cun L, Sahai V, Kim YS. CpG island methylation is frequently present in tubulovillous and villous adenomas and correlates with size, site, and villous component. Hum Pathol. 2008; 39(1):30-6. 137 Ogino S, Kawasaki T, Kirkner GJ, Suemoto Y, Meyerhardt JA, Fuchs CS. Molecular correlates with MGMT promoter methylation and silencing support CpG island methylator phenotype-low (CIMP-low) in colorectal cancer. Gut. 2007; 56(11):1564-71. 138 Nagasaka T, Sasamoto H, Notohara K, Cullings HM, Takeda M, Kimura K, Kambara T, MacPhee DG, Young J, Leggett BA, Jass JR, Tanaka N, Matsubara N. Colorectal cancer with mutation in BRAF, KRAS, and wild-type with respect to both oncogenes showing different patterns of DNA methylation. J Clin Oncol. 2004; 22(22):4584-94. 139 Nigro S, Geido E, Infusini E, Orecchia R, Giaretti W: Transfection of human mutated K-ras in mouse NIH3T3 cells is associated with increased cloning efficiency and DNA aneuploidization. Int J Cancer 1996, 67:871-875 100 140 Saavedra HI, Knauf JA, Shirokawa JM, Wang J, Ouyang B, Elisei R, Stambrook PJ, Fagin JA: The RAS oncogene induces genomic instability in thyroid PCCL3 cells via the MAPK pathway. Oncogene 2000, 19:3948-3954 141 Wright CM, Dent OF, Newland RC, et al. Low level microsatellite instability may be associated with reduced cancer specific survival in sporadic stage C colorectal carcinoma. Gut. 2005; 54(1):103-8 142 Kohonen-Corish MR, Daniel JJ, Chan C, Lin BP, Kwun SY, Dent OF, Dhillon VS, Trent RJ, Chapuis PH, Bokey EL. Low microsatellite instability is associated with poor prognosis in stage C colon cancer. J Clin Oncol. 2005; 23(10):2318-24. 143 Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 1990; 61(5):759-67. 144 Conlin A, Smith G, Carey FA, Wolf CR, Steele RJ. The prognostic significance of K-ras, p53, and APC mutations in colorectal carcinoma. Gut. 2005; 54(9):1283-6. 145 Chiang JM, Wu Chou YH, Ma SC, Chen JR. Influence of age on adenomatous polyposis coli and p53 mutation frequency in sporadic colorectal cancer-rarity of co-occurrence of mutations in APC, K-ras, and p53 genes. Virchows Arch. 2004; 445(5):465-71. 146 Smith G, Carey FA, Beattie J, Wilkie MJ, Lightfoot TJ, Coxhead J, Garner RC, Steele RJ, Wolf CR. Mutations in APC, Kirsten-ras, and p53--alternative genetic pathways to colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99(14):9433-8. 147 Samowitz WS, Slattery ML, Sweeney C, Herrick J, Wolff RK, Albertsen H. APC mutations and other genetic and epigenetic changes in colon cancer. Mol Cancer Res. 2007; 5(2):165-70. 148 Cai G, Xu Y, Lu H, Shi Y, Lian P, Peng J, Du X, Zhou X, Guan Z, Shi D, Cai S. Clinicopathologic and molecular features of sporadic microsatellite- and chromosomal-stable colorectal cancers. Int J Colorectal Dis. 2008; 23(4):365-73. 149 Jass JR. Classification of colorectal cancer based on correlation of clinical, morphological and molecular features. Histopathology. 2007; 50(1):113-30. 150 Fang WL, Chang SC, Lin JK, Wang HS, Yang SH, Jiang JK, Chen WC, Lin TC. Metastatic potential in T1 and T2 colorectal cancer. Hepatogastroenterology. 2005; 52(66):1688-91. 151 Chok KS, Law WL. Prognostic factors affecting survival and recurrence of patients with pT1 and pT2 colorectal cancer. World J Surg. 2007; 31(7):1485-90. 152 Hemandas AK, Salto-Tellez M, Maricar SH, Leong AF, Leow CK. Metastasis-associated protein S100A4--a potential prognostic marker for colorectal cancer. J Surg Oncol. 2006; 93(6):498-503. 153 Takami Y, Higashi M, Kumagai S, Kuo PC, Kawana H, Koda K, Miyazaki M, Harigaya K. The activity of RhoA is correlated with lymph node metastasis in human colorectal cancer. Dig Dis Sci. 2008; 53(2):467-73. 154 Zhao L, Liu L, Wang S, Zhang YF, Yu L, Ding YQ. Differential proteomic analysis of human colorectal carcinoma cell lines metastasis-associated proteins. J Cancer Res Clin Oncol. 2007; 133(10):771-82. 155 Pei H, Zhu H, Zeng S, Li Y, Yang H, Shen L, Chen J, Zeng L, Fan J, Li X, Gong Y, Shen H. Proteome analysis and tissue microarray for profiling protein markers associated with lymph node metastasis in colorectal cancer. J Proteome Res. 2007; 6(7):2495-501. 156 Tanaka T, Watanabe T, Kazama Y, Tanaka J, Kanazawa T, Kazama S, Nagawa H. Loss of Smad4 protein expression and 18qLOH as molecular markers indicating lymph node metastasis in colorectal cancer--a study matched for tumor depth and pathology. J Surg Oncol. 2008; 97(1):69-73. 101 157 Kaifi JT, Reichelt U, Quaas A, Schurr PG, Wachowiak R, Yekebas EF, Strate T, Schneider C, Pantel K, Schachner M, Sauter G, Izbicki JR. L1 is associated with micrometastatic spread and poor outcome in colorectal cancer. Mod Pathol. 2007; 20(11):1183-90. 158 Nozoe T, Yasuda M, Honda M, Inutsuka S, Korenaga D. Fas ligand expression is correlated with metastasis in colorectal carcinoma. Oncology. 2003; 65(1):83-8. 159 Minoo P, Zlobec I, Baker K, Tornillo L, Terracciano L, Jass JR, Lugli A. Loss of raf-1 kinase inhibitor protein expression is associated with tumor progression and metastasis in colorectal cancer. Am J Clin Pathol. 2007; 127(5):820-7. 160 Zlobec I, Baker K, Minoo P, Jass JR, Terracciano L, Lugli A. Node-negative colorectal cancer at high risk of distant metastasis identified by combined analysis of lymph node status, vascular invasion, and Raf-1 kinase inhibitor protein expression. Clin Cancer Res. 2008; 14(1):143-8. 161 Kato H, Semba S, Miskad UA, Seo Y, Kasuga M, Yokozaki H. High expression of PRL-3 promotes cancer cell motility and liver metastasis in human colorectal cancer: a predictive molecular marker of metachronous liver and lung metastases. Clin Cancer Res. 2004; 10(21):7318-28. 162 Peng L, Ning J, Meng L, Shou C. The association of the expression level of protein tyrosine phosphatase PRL-3 protein with liver metastasis and prognosis of patients with colorectal cancer. J Cancer Res Clin Oncol. 2004; 130(9):521-6. 163 Losi L, Luppi G, Benhattar J. Assessment of K-ras, Smad4 and p53 gene alterations in colorectal metastases and their role in the metastatic process. Oncol Rep. 2004; 12(6):1221-5 164 Losi L, Bouzourene H, Benhattar J. Loss of Smad4 expression predicts liver metastasis in human colorectal cancer. Oncol Rep. 2007; 17(5):1095-9. 165 Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer. 2007; 7(4):295-308. 166 Boguski MS, McCormick F. Proteins regulating Ras and its relatives. Nature. 1993; 366(6456):643-54. 167 Donovan S, Shannon KM, Bollag G. GTPase activating proteins: critical regulators of intracellular signaling. Biochim Biophys Acta. 2002; 1602(1):23-45. 168 Wennerberg K, Rossman KL, Der CJ. The Ras superfamily at a glance. J Cell Sci. 2005; 118(Pt 5):843-6. 169 Takai Y, Sasaki T, Matozaki T. Small GTP-binding proteins. Physiol Rev. 2001; 81(1):153-208. 170 Vetter IR, Wittinghofer A. The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions. Science. 2001; 294(5545):1299-304. 171 Der CJ, Finkel T, Cooper GM. Biological and biochemical properties of human rasH genes mutated at codon 61. Cell. 1986; 44(1):167-76. 172 Saraste M, Sibbald PR, Wittinghofer A. The P-loop--a common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biochem Sci. 1990; 15(11):430-4. 173 Shin I, Kim S, Song H, Kim HR, Moon A. J. H-Ras-specific activation of Rac-MKK3/6-p38 pathway: its critical role in invasion and migration of breast epithelial cells. Biol Chem. 2005; 280(15):14675-83. 174 Behren A, Binder K, Vucelic G, Herberhold S, Hirt B, Loewenheim H, Preyer S, Zenner HP, Simon C. The p38 SAPK pathway is required for Ha-ras induced in vitro invasion of NIH3T3 cells. Exp Cell Res. 2005; 303(2):321-30. 175 Vanhaesebroeck B, Waterfield MD. Signaling by distinct classes of phosphoinositide 3-kinases. Exp Cell Res 1999; 253: 239–254. 102 176 Bader AG, Kang S, Zhao L, Vogt PK. Oncogenic PI3K deregulates transcription and translation. Nat Rev Cancer. 2005; 5(12):921-9. 177 Vivanco I, Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer. Nat Rev Cancer. 2002; 2(7):489-501. 178 Kolch W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochem J. 2000; 351 Pt 2:289-305. 179 Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, Teague J, Woffendin H, Garnett MJ, Bottomley W, Davis N, Dicks E, Ewing R, Floyd Y, Gray K, Hall S, Hawes R, Hughes J, Kosmidou V, Menzies A, Mould C, Parker A, Stevens C, Watt S, Hooper S, Wilson R, Jayatilake H, Gusterson BA, Cooper C, Shipley J, Hargrave D, Pritchard-Jones K, Maitland N, Chenevix-Trench G, Riggins GJ, Bigner DD, Palmieri G, Cossu A, Flanagan A, Nicholson A, Ho JW, Leung SY, Yuen ST, Weber BL, Seigler HF, Darrow TL, Paterson H, Marais R, Marshall CJ, Wooster R, Stratton MR, Futreal PA. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002; 417(6892):949-54. 180 Ikenoue T, Hikiba Y, Kanai F, Tanaka Y, Imamura J, Imamura T, Ohta M, Ijichi H, Tateishi K, Kawakami T, Aragaki J, Matsumura M, Kawabe T, Omata M. Functional analysis of mutations within the kinase activation segment of B-Raf in human colorectal tumors. Cancer Res. 2003; 63(23):8132-7. 181 Trobridge P, Knoblaugh S, Washington MK, Munoz NM, Tsuchiya KD, Rojas A, Song X, Ulrich CM, Sasazuki T, Shirasawa S, Grady WM. TGF-beta receptor inactivation and mutant Kras induce intestinal neoplasms in mice via a beta-catenin-independent pathway. Gastroenterology. 2009; 136(5):1680-8.e7 182 Janssen KP, Alberici P, Fsihi H, Gaspar C, Breukel C, Franken P, Rosty C, Abal M, El Marjou F, Smits R, Louvard D, Fodde R, Robine S. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 2006; 131(4):1096-109. 183 Oliveira C, Velho S, Moutinho C, Ferreira A, Preto A, Domingo E, Capelinha AF, Duval A, Hamelin R, Machado JC, Schwartz S Jr, Carneiro F, Seruca R. KRAS and BRAF oncogenic mutations in MSS colorectal carcinoma progression. Oncogene. 2007; 26(1):158-63 184 Yuen ST, Davies H, Chan TL, Ho JW, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Tsui WW, Chan AS, Futreal PA, Stratton MR, Wooster R, Leung SY. Similarity of the phenotypic patterns associated with BRAF and KRAS mutations in colorectal neoplasia. Cancer Res. 2002; 62(22):6451-5. 185 Suehiro Y, Wong CW, Chirieac LR, Kondo Y, Shen L, Webb CR, Chan YW, Chan AS, Chan TL, Wu TT, Rashid A, Hamanaka Y, Hinoda Y, Shannon RL, Wang X, Morris J, Issa JP, Yuen ST, Leung SY, Hamilton SR. Epigenetic-genetic interactions in the APC/WNT, RAS/RAF, and P53 pathways in colorectal carcinoma. Clin Cancer Res. 2008; 14(9):2560-9. 186 Samowitz WS, Sweeney C, Herrick J et al. Poor survival associated with the BRAF V600E mutation in microsatellitestable colon cancers. Cancer Res. 2005; 65; 6063–6069. 187 Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, Sartore-Bianchi A, Arena S, Saletti P, De Dosso S, Mazzucchelli L, Frattini M, Siena S, Bardelli A. Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 2008; 26(35):5705-12. 188 Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, Boige V, Landi B, Emile JF, Côté JF, Tomasic G, Penna C, Ducreux M, Rougier P, Penault-Llorca F, Laurent-Puig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 2006; 66(8):3992-5. 189 Zhou C, Nitschke AM, Xiong W, Zhang Q, Tang Y, Bloch M, Elliott S, Zhu Y, Bazzone L, Yu D, Weldon CB, Schiff R, McLachlan JA, Beckman BS, Wiese TE, Nephew KP, Shan B, Burow ME, Wang G. Proteomic analysis of tumor necrosis factor-alpha resistant human breast cancer cells reveals a MEK5/Erk5mediated epithelial-mesenchymal transition phenotype. Breast Cancer Res. 2008; 10(6):R105. 103 190 Conacci-Sorrell M, Simcha I, Ben-Yedidia T, Blechman J, Savagner P, Ben-Ze'ev A. Autoregulation of Ecadherin expression by cadherin-cadherin interactions: the roles of beta-catenin signaling, Slug, and MAPK. J Cell Biol. 2003; 163(4):847-57 191 Wang Z, Wade P, Mandell KJ, Akyildiz A, Parkos CA, Mrsny RJ, Nusrat A. Raf 1 represses expression of the tight junction protein occludin via activation of the zinc-finger transcription factor slug. Oncogene. 2007; 26(8):1222-30. 192 Lemieux E, Bergeron S, Durand V, Asselin C, Saucier C, Rivard N. Constitutively active MEK1 is sufficient to induce epithelial-to-mesenchymal transition in intestinal epithelial cells and to promote tumor invasion and metastasis. Int J Cancer. 2009; 125(7):1575-86. 193 Schmidt CR, Gi YJ, Patel TA, Coffey RJ, Beauchamp RD, Pearson AS. E-cadherin is regulated by the transcriptional repressor SLUG during Ras-mediated transformation of intestinal epithelial cells. Surgery. 2005; 138(2):306-12. 194 Grünert S, Jechlinger M, Beug H. Diverse cellular and molecular mechanisms contribute to epithelial plasticity and metastasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003; 4(8):657-65. 195 De Craene B, van Roy F, Berx G. Unraveling signalling cascades for the Snail family of transcription factors. Cell Signal. 2005; 17(5):535-47. 196 Barrallo-Gimeno A, Nieto MA. The Snail genes as inducers of cell movement and survival: implications in development and cancer. Development. 2005; 132(14):3151-61. 197 Nieto MA. The snail superfamily of zinc-finger transcription factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002; 3(3):155-66. 198 Sánchez-Martín M, Rodríguez-García A, Pérez-Losada J, Sagrera A, Read AP, Sánchez-García I. SLUG (SNAI2) deletions in patients with Waardenburg disease. Hum Mol Genet. 2002; 11(25):3231-6. 199 Takai D, Jones PA. The CpG island searcher: a new WWW resource. In Silico Biol. 2003; 3(3):235-40. 200 Cohen ME, Yin M, Paznekas WA, Schertzer M, Wood S, Jabs EW. Human SLUG gene organization, expression, and chromosome map location on 8q. Genomics. 1998; 51(3):468-71. 201 Hemavathy K, Guru SC, Harris J, Chen JD, Ip YT. Human Slug is a repressor that localizes to sites of active transcription. Mol Cell Biol. 2000; 20(14):5087-95. 202 Grimes HL, Chan TO, Zweidler-McKay PA, Tong B, Tsichlis PN. The Gfi-1 proto-oncoprotein contains a novel transcriptional repressor domain, SNAG, and inhibits G1 arrest induced by interleukin-2 withdrawal. Mol Cell Biol. 1996; 16(11):6263-72. 203 Savagner P, Karavanova I, Perantoni A, Thiery JP, Yamada KM. Slug mRNA is expressed by specific mesodermal derivatives during rodent organogenesis. Dev Dyn. 1998; 213(2):182-7. 204 Oram KF, Carver EA, Gridley T. Slug expression during organogenesis in mice. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 2003; 271(1):189-91. 205 Rukstalis JM, Habener JF. Snail2, a mediator of epithelial-mesenchymal transitions, expressed in progenitor cells of the developing endocrine pancreas. Gene Expr Patterns. 2007; 7(4):471-9. 206 Savagner P, Kusewitt DF, Carver EA, Magnino F, Choi C, Gridley T, Hudson LG. Developmental transcription factor slug is required for effective re-epithelialization by adult keratinocytes. J Cell Physiol. 2005; 202(3):858-66. 207 Ikuta T, Kawajiri K. Zinc finger transcription factor Slug is a novel target gene of aryl hydrocarbon receptor. Exp Cell Res. 2006; 312(18):3585-94. 104 208 Jiang R, Lan Y, Norton CR, Sundberg JP, Gridley T. The Slug gene is not essential for mesoderm or neural crest development in mice. Dev Biol. 1998; 198(2):277-85. 209 Pérez-Losada J, Sánchez-Martín M, Rodríguez-García A, Sánchez ML, Orfao A, Flores T, Sánchez-García I. Zinc-finger transcription factor Slug contributes to the function of the stem cell factor c-kit signaling pathway. Blood. 2002; 100(4):1274-86. 210 Sánchez-Martín M, Pérez-Losada J, Rodríguez-García A, González-Sánchez B, Korf BR, Kuster W, Moss C, Spritz RA, Sánchez-García I. Deletion of the SLUG (SNAI2) gene results in human piebaldism. Am J Med Genet A. 2003; 122(2):125-32. 211 Liu XZ, Newton VE, Read AP. Waardenburg syndrome type II: phenotypic findings and diagnostic criteria. Am J Med Genet. 1995; 55(1):95-100. 212 Pérez-Mancera PA, González-Herrero I, Pérez-Caro M, Gutiérrez-Cianca N, Flores T, Gutiérrez-Adán A, Pintado B, Sánchez-Martín M, Sánchez-García I. SLUG in cancer development. Oncogene. 2005; 24(19):3073-82. 213 Pérez-Mancera PA, González-Herrero I, Maclean K, Turner AM, Yip MY, Sánchez-Martín M, García JL, Robledo C, Flores T, Gutiérrez-Adán A, Pintado B, Sánchez-García I. SLUG (SNAI2) overexpression in embryonic development. Cytogenet Genome Res. 2006; 114(1):24-9. 214 Tripathi MK, Misra S, Khedkar SV, Hamilton N, Irvin-Wilson C, Sharan C, Sealy L, Chaudhuri G. Regulation of BRCA2 gene expression by the SLUG repressor protein in human breast cells. J Biol Chem. 2005; 280(17):17163-71. 215 Haupt S, Alsheich-Bartok O, Haupt Y. Clues from worms: a Slug at Puma promotes the survival of blood progenitors. Cell Death Differ. 2006; 13(6):913-5. 216 Bailey CK, Misra S, Mittal MK, Chaudhuri G. Human SLUG does not directly bind to CtBP1. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 353(3):661-4. 217 Savagner P, Yamada KM, Thiery JP. The zinc-finger protein slug causes desmosome dissociation, an initial and necessary step for growth factor-induced epithelial-mesenchymal transition. J Cell Biol. 1997; 137(6):1403-19. 218 Martínez-Estrada OM, Cullerés A, Soriano FX, Peinado H, Bolós V, Martínez FO, Reina M, Cano A, Fabre M, Vilaró S. The transcription factors Slug and Snail act as repressors of Claudin-1 expression in epithelial cells. Biochem J. 2006; 394(Pt 2):449-57. 219 Kurrey NK, K A, Bapat SA. Snail and Slug are major determinants of ovarian cancer invasiveness at the transcription level. Gynecol Oncol. 2005; 97(1):155-65. 220 Tripathi MK, Misra S, Chaudhuri G. Negative regulation of the expressions of cytokeratins 8 and 19 by SLUG repressor protein in human breast cells. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 329(2):508-15. 221 Gross I, Duluc I, Benameur T, Calon A, Martin E, Brabletz T, Kedinger M, Domon-Dell C, Freund JN. The intestine-specific homeobox gene Cdx2 decreases mobility and antagonizes dissemination of colon cancer cells. Oncogene. 2008; 27(1):107-15. 222 Bolos V, Peinado H, Pérez-Moreno MA, Fraga MF, Esteller M, Cano A. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. J Cell Sci. 2003; 116(Pt 3):499-511. 223 Pérez-Losada J, Sánchez-Martín M, Pérez-Caro M, Pérez-Mancera PA, Sánchez-García I. The radioresistance biological function of the SCF/kit signaling pathway is mediated by the zinc-finger transcription factor Slug. Oncogene. 2003; 22(27):4205-11. 105 224 Inoue A, Seidel MG, Wu W, Kamizono S, Ferrando AA, Bronson RT, Iwasaki H, Akashi K, Morimoto A, Hitzler JK, Pestina TI, Jackson CW, Tanaka R, Chong MJ, McKinnon PJ, Inukai T, Grosveld GC, Look AT. Slug, a highly conserved zinc finger transcriptional repressor, protects hematopoietic progenitor cells from radiation-induced apoptosis in vivo. Cancer Cell. 2002; 2(4):279-88. 225 Inukai T, Inoue A, Kurosawa H, Goi K, Shinjyo T, Ozawa K, Mao M, Inaba T, Look AT. SLUG, a ces-1related zinc finger transcription factor gene with antiapoptotic activity, is a downstream target of the E2AHLF oncoprotein. Mol Cell. 1999; 4(3):343-52. 226 Becker MW, Clarke MF. SLUGging away at cell death. Cancer Cell. 2002; 2(4):249-51. 227 Wu WS, Heinrichs S, Xu D, Garrison SP, Zambetti GP, Adams JM, Look AT. Slug antagonizes p53mediated apoptosis of hematopoietic progenitors by repressing puma. Cell. 2005; 123(4):641-53. 228 Zilfou JT, Spector MS, Lowe SW. Slugging it out: fine tuning the p53-PUMA death connection. Cell. 2005; 123(4):545-8. 229 Leroy P, Mostov KE. Slug is required for cell survival during partial epithelial-mesenchymal transition of HGF-induced tubulogenesis. Mol Biol Cell. 2007; 18(5):1943-52. 230 Come C, Arnoux V, Bibeau F, Savagner P.Roles of the transcription factors snail and slug during mammary morphogenesis and breast carcinoma progression. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2004; 9(2):183-93. 231 Kajita M, McClinic KN, Wade PA. Aberrant expression of the transcription factors snail and slug alters the response to genotoxic stress. Mol Cell Biol. 2004; 24(17):7559-66. 232 Khan J, Bittner ML, Saal LH, Teichmann U, Azorsa DO, Gooden GC, Pavan WJ, Trent JM, Meltzer PS. cDNA microarrays detect activation of a myogenic transcription program by the PAX3-FKHR fusion oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96(23):13264-9. 233 Scrideli CA, Carlotti CG Jr, Okamoto OK, Andrade VS, Cortez MA, Motta FJ, Lucio-Eterovic AK, Neder L, Rosemberg S, Oba-Shinjo SM, Marie SK, Tone LG. Gene expression profile analysis of primary glioblastomas and non-neoplastic brain tissue: identification of potential target genes by oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR. J Neurooncol. 2008; 88(3):281-91. 234 Hotz B, Arndt M, Dullat S, Bhargava S, Buhr HJ, Hotz HG. Epithelial to mesenchymal transition: expression of the regulators snail, slug, and twist in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 2007; 13(16):476976. 235 Hardy RG, Vicente-Dueñas C, González-Herrero I, Anderson C, Flores T, Hughes S, Tselepis C, Ross JA, Sánchez-García I. Snail family transcription factors are implicated in thyroid carcinogenesis. Am J Pathol. 2007; 171(3):1037-46. 236 Elloul S, Elstrand MB, Nesland JM, Tropé CG, Kvalheim G, Goldberg I, Reich R, Davidson B. Snail, Slug, and Smad-interacting protein 1 as novel parameters of disease aggressiveness in metastatic ovarian and breast carcinoma. Cancer. 2005; 103(8):1631-43. 237 Martin TA, Goyal A, Watkins G, Jiang WG. Expression of the transcription factors snail, slug, and twist and their clinical significance in human breast cancer. Ann Surg Oncol. 2005; 12(6):488-96 238 Côme C, Magnino F, Bibeau F, De Santa Barbara P, Becker KF, Theillet C, Savagner P. Snail and slug play distinct roles during breast carcinoma progression. Clin Cancer Res. 2006; 12(18):5395-402. 239 Hajra KM, Chen DY, Fearon ER. The SLUG zinc-finger protein represses E-cadherin in breast cancer. Cancer Res. 2002; 62(6):1613-8. 240 Shih JY, Tsai MF, Chang TH, Chang YL, Yuan A, Yu CJ, Lin SB, Liou GY, Lee ML, Chen JJ, Hong TM, Yang SC, Su JL, Lee YC, Yang PC. Transcription repressor slug promotes carcinoma invasion and predicts outcome of patients with lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 2005; 11(22):8070-8. 106 241 Castro Alves C, Rosivatz E, Schott C, Hollweck R, Becker I, Sarbia M, Carneiro F, Becker KF. Slug is overexpressed in gastric carcinomas and may act synergistically with SIP1 and Snail in the down-regulation of E-cadherin. J Pathol. 2007; 211(5):507-15. 242 Uchikado Y, Natsugoe S, Okumura H, Setoyama T, Matsumoto M, Ishigami S, Aikou T. Slug Expression in the E-cadherin preserved tumors is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 2005; 11(3):1174-80. 243 Jethwa P, Naqvi M, Hardy RG, Hotchin NA, Roberts S, Spychal R, Tselepis C. Overexpression of Slug is associated with malignant progression of esophageal adenocarcinoma. World J Gastroenterol. 2008; 14(7):1044-52. 244 Croagh D, Phillips WA, Redvers R, Thomas RJ, Kaur P. Identification of candidate murine esophageal stem cells using a combination of cell kinetic studies and cell surface markers. Stem Cells. 2007; 25(2):313-8. 245 Olmeda D, Montes A, Moreno-Bueno G, Flores JM, Portillo F, Cano A. Snai1 and Snai2 collaborate on tumor growth and metastasis properties of mouse skin carcinoma cell lines. Oncogene. 2008; 27(34):4690701. 246 Gupta PB, Kuperwasser C, Brunet JP, Ramaswamy S, Kuo WL, Gray JW, Naber SP, Weinberg RA. The melanocyte differentiation program predisposes to metastasis after neoplastic transformation. Nat Genet. 2005; 37(10):1047-54. 247 Shioiri M, Shida T, Koda K, Oda K, Seike K, Nishimura M, Takano S, Miyazaki M. Slug expression is an independent prognostic parameter for poor survival in colorectal carcinoma patients. Br J Cancer. 2006; 94(12):1816-22. 248 Esufali S, Charames GS, Pethe VV, Buongiorno P, Bapat B. Activation of tumor-specific splice variant Rac1b by dishevelled promotes canonical Wnt signaling and decreased adhesion of colorectal cancer cells. Cancer Res. 2007; 67(6):2469-79. 249 Spiessl B, Beahrs OH, Hermanek P, Hutter RVP, Scheibe O, Sobin LH, Wagner G. Atlas TNM. Sanmedica 1994 Warszawa. 250 Xu YH, Manoharan HT, Pitot HC. CpG analyzer, a Windows-based utility program for investigation of DNA methylation. Biotechniques. 2005; 39(5):656 251 Schlegel J, Bocker T, Zirngibl H, Hofstaedter F, Rueschoff J. Detection of microsatellite instability in human colorectal carcinomas using a non-radioactive PCR-based screening technique. Virchows Arch 1995; 426:223–227 252 Rampino N, Yamamoto H, Ionov Y, Li Y, Sawai H, Reed JC, Perucho M. Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype. Science 1997; 275:967–969 253 Parsons R, Myeroff LL, Liu B, Willson JK, Markowitz SD, Kinzler KW, Vogelstein B Microsatellite instability and mutations of the transforming growth factor beta type II receptor gene in colorectal cancer. Cancer Res 1995; 55:5548–5550 254 Hoang J-M, Cottu PH, Thuille B, Salmon RJ, Thomas G, Hamelin R BAT-26, an indicator of the replication error phenotype in colorectal cancers and cell lines. Cancer Res 1997; 57:300–303 255 Kalendar, R. FastPCR: a PCR primer design and repeat sequence searching software with additional tools for the manipulation and analysis of DNA and protein. 2006. http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/programs/fastpcr.htm 256 Garcia-Rostan G, Zhao H, Camp RL, Pollan M, Herrero A, Pardo J, Wu R, Carcangiu ML, Costa J, Tallini G. ras mutations are associated with aggressive tumor phenotypes and poor prognosis in thyroid cancer. J Clin Oncol. 2003; 21(17):3226-35. 107 257 Chan TL, Zhao W, Leung SY, Yuen ST; Cancer Genome Project. BRAF and KRAS mutations in colorectal hyperplastic polyps and serrated adenomas. Cancer Res. 2003; 63(16):4878-81. 258 Kojc N, Zidar N, Gale N, Poljak M, Fujs Komlos K, Cardesa A, Höfler H, Becker KF. Transcription factors Snail, Slug, Twist, and SIP1 in spindle cell carcinoma of the head and neck. Virchows Arch. 2009; 454(5):549-55. 259 Losi L, Baisse B, Bouzourene H, Benhattar J. Evolution of intratumoral genetic heterogeneity during colorectal cancer progression. Carcinogenesis. 2005; 26(5):916-22. 260 Andersen CL, Wiuf C, Kruhøffer M, Korsgaard M, Laurberg S, Ørntoft TF. Frequent occurrence of uniparental disomy in colorectal cancer. Carcinogenesis. 2007; 28(1):38-48. 261 Choi KS, Bae MK, Jeong JW, Moon HE, Kim KW. Hypoxia-induced angiogenesis during carcinogenesis. J Biochem Mol Biol. 2003; 36(1):120-7. 262 Imai T, Horiuchi A, Wang C, Oka K, Ohira S, Nikaido T, Konishi I. Hypoxia attenuates the expression of Ecadherin via up-regulation of SNAIL in ovarian carcinoma cells. Am J Pathol. 2003; 163(4):1437-47. 263 Evans AJ, Russell RC, Roche O, Burry TN, Fish JE, Chow VW, Kim WY, Saravanan A, Maynard MA, Gervais ML, Sufan RI, Roberts AM, Wilson LA, Betten M, Vandewalle C, Berx G, Marsden PA, Irwin MS, Teh BT, Jewett MA, Ohh M. VHL promotes E2 box-dependent E-cadherin transcription by HIF-mediated regulation of SIP1 and snail. Mol Cell Biol. 2007; 27(1):157-69. 264 Yang MH, Wu KJ. TWIST activation by hypoxia inducible factor-1 (HIF-1): implications in metastasis and development. Cell Cycle. 2008; 7(14):2090-6. 265 Yang MH, Wu MZ, Chiou SH, Chen PM, Chang SY, Liu CJ, Teng SC, Wu KJ. Direct regulation of TWIST by HIF-1alpha promotes metastasis. Nat Cell Biol. 2008; 10(3):295-305. 266 Furlan D, Sahnane N, Carnevali I, Cerutti R, Bertoni F, Kwee I, Uccella S, Bertolini V, Chiaravalli AM, Capella C. Up-regulation of the hypoxia-inducible factor-1 transcriptional pathway in colorectal carcinomas. Hum Pathol. 2008; 39(10):1483-94. 267 Kuwai T, Kitadai Y, Tanaka S, Onogawa S, Matsutani N, Kaio E, Ito M, Chayama K: Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha is associated with tumor vascularization in human colorectal carcinoma. Int J Cancer 2003, 105(2):176-181. 268 Jiang YA, Fan LF, Jiang CQ, Zhang YY, Luo HS, Tang ZJ, Xia D, Wang M: Expression and significance of PTEN, hypoxia-inducible factor-1 alpha in colorectal adenoma and adenocarcinoma. World J Gastroenterol 2003, 9(3):491-494. 269 Lu XG, Xing CG, Feng YZ, Chen J, Deng C: Clinical significance of immunohistochemical expression of hypoxia-inducible factor-1alpha as a prognostic marker in rectal adenocarcinoma. Clin Colorectal Cancer 2006, 5(5):350-353. 270 Yu JX, Cui L, Zhang QY, Chen H, Ji P, Wei HJ, Ma HY: Expression of NOS and HIF-1alpha in human colorectal carcinoma and implication in tumor angiogenesis. World J Gastroenterol 2006, 12:4660-4664. 271 Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1 and the molecular physiology of oxygen homeostasis. J Lab Clin Med. 1998; 131(3):207-14. 272 Kaimaktchiev V, Terracciano L, Tornillo L, Spichtin H, Stoios D, Bundi M, Korcheva V, Mirlacher M, Loda M, Sauter G, Corless CL. The homeobox intestinal differentiation factor CDX2 is selectively expressed in gastrointestinal adenocarcinomas. Mod Pathol. 2004; 17(11):1392-9. 108 273 Yu J, Leung WK, Ebert MP, Leong RW, Tse PC, Chan MW, Bai AH, To KF, Malfertheiner P, Sung JJ. Absence of cyclin D2 expression is associated with promoter hypermethylation in gastric cancer. Br J Cancer. 2003; 88(10):1560-5. 274 Hsieh CL. Dependence of transcriptional repression on CpG methylation density. Mol Cell Biol. 1994; 14(8):5487-94. 275 Rodenhiser DI, Andrews J, Kennette W, Sadikovic B, Mendlowitz A, Tuck AB, Chambers AF. Epigenetic mapping and functional analysis in a breast cancer metastasis model using whole-genome promoter tiling microarrays. Breast Cancer Res. 2008; 10(4):R62. 276 Umbricht CB, Evron E, Gabrielson E, Ferguson A, Marks J, Sukumar S. Hypermethylation of 14-3-3 sigma (stratifin) is an early event in breast cancer. Oncogene. 2001; 20(26):3348-53. 277 Shahrzad S, Bertrand K, Minhas K, Coomber BL. Induction of DNA hypomethylation by tumor hypoxia. Epigenetics. 2007; 2(2):119-25. 278 Yoshimura H, Dhar DK, Kohno H, Kubota H, Fujii T, Ueda S, Kinugasa S, Tachibana M, Nagasue N: Prognostic impact of hypoxiainducible factors 1alpha and 2alpha in colorectal cancer patients: correlation with tumor angiogenesis and cyclooxygenase-2 expression. Clin Cancer Res 2004, 10(24):8554-8560. 279 Rodriguez J, Frigola J, Vendrell E, Risques RA, Fraga MF, Morales C, Moreno V, Esteller M, Capellà G, Ribas M, Peinado MA. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Res. 2006; 66(17):8462-9468. 280 Frigola J, Solé X, Paz MF, Moreno V, Esteller M, Capellà G, Peinado MA. Differential DNA hypermethylation and hypomethylation signatures in colorectal cancer. Hum Mol Genet. 2005; 14(2):319-26. 281 Matsuzaki K, Deng G, Tanaka H, Kakar S, Miura S, Kim YS. The relationship between global methylation level, loss of heterozygosity, and microsatellite instability in sporadic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2005; 11(24 Pt 1):8564-9. 282 Bariol C, Suter C, Cheong K, Ku SL, Meagher A, Hawkins N, Ward R. The relationship between hypomethylation and CpG island methylation in colorectal neoplasia. Am J Pathol. 2003; 162(4):1361-71 283 Ogino S, Kawasaki T, Nosho K, Ohnishi M, Suemoto Y, Kirkner GJ, Fuchs CS. LINE-1 hypomethylation is inversely associated with microsatellite instability and CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Int J Cancer. 2008; 122(12):2767-73. 284 Iacopetta B, Grieu F, Phillips M, Ruszkiewicz A, Moore J, Minamoto T, Kawakami K. Methylation levels of LINE-1 repeats and CpG island loci are inversely related in normal colonic mucosa. Cancer Sci. 2007; 98(9):1454-60. 285 Ogino S, Nosho K, Kirkner GJ, Kawasaki T, Chan AT, Schernhammer ES, Giovannucci EL, Fuchs CS. A cohort study of tumoral LINE-1 hypomethylation and prognosis in colon cancer. J Natl Cancer Inst. 2008; 100(23):1734-8. 286 Liu H, Liu W, Wu Y, Zhou Y, Xue R, Luo C, Wang L, Zhao W, Jiang JD, Liu J. Loss of epigenetic control of synuclein-gamma gene as a molecular indicator of metastasis in a wide range of human cancers. Cancer Res. 2005; 65(17):7635-43. 287 Ye Q, Zheng MH, Cai Q, Feng B, Chen XH, Yu BQ, Gao YB, Ji J, Lu AG, Li JW, Wang ML, Liu BY. Aberrant expression and demethylation of gamma-synuclein in colorectal cancer, correlated with progression of the disease. Cancer Sci. 2008; 99(10):1924-32. 288 Cho YG, Kim CJ, Nam SW, Yoon SH, Lee SH, Yoo NJ, Lee JY, Park WS. Overexpression of S100A4 is closely associated with progression of colorectal cancer. World J Gastroenterol. 2005; 11(31):4852-6. 289 Nakamura N, Takenaga K. Hypomethylation of the metastasis-associated S100A4 gene correlates with gene activation in human colon adenocarcinoma cell lines. Clin Exp Metastasis. 1998; 16(5):471-9. 109 290 Hibi K, Sakata M, Kitamura YH, Sakuraba K, Shirahata A, Goto T, Mizukami H, Saito M, Ishibashi K, Kigawa G, Nemoto H, Sanada Y. Demethylation of the CD133 gene is frequently detected in advanced colorectal cancer. Anticancer Res. 2009; 29(6):2235-7. 291 Choi D, Lee HW, Hur KY, Kim JJ, Park GS, Jang SH, Song YS, Jang KS, Paik SS. Cancer stem cell markers CD133 and CD24 correlate with invasiveness and differentiation in colorectal adenocarcinoma. World J Gastroenterol. 2009; 15(18):2258-64. 292 Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, Biffoni M, Todaro M, Peschle C, De Maria R. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 2007; 445(7123):111-5. 293 O'Brien CA, Pollett A, Gallinger S, Dick JE. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 2007; 445(7123):106-10. 294 Axelson H, Fredlund E, Ovenberger M, Landberg G, Påhlman S. Hypoxia-induced dedifferentiation of tumor cells--a mechanism behind heterogeneity and aggressiveness of solid tumors. Semin Cell Dev Biol. 2005; 16(4-5):554-63. 295 Cui H, Onyango P, Brandenburg S, Wu Y, Hsieh CL, Feinberg AP. Loss of imprinting in colorectal cancer linked to hypomethylation of H19 and IGF2. Cancer Res 2002; 62:6442–6. 296 Ito Y, Koessler T, Ibrahim AE, Rai S, Vowler SL, Abu-Amero S, Silva AL, Maia AT, Huddleston JE, Uribe-Lewis S, Woodfine K, Jagodic M, Nativio R, Dunning A, Moore G, Klenova E, Bingham S, Pharoah PD, Brenton JD, Beck S, Sandhu MS, Murrell A. Somatically acquired hypomethylation of IGF2 in breast and colorectal cancer. Hum Mol Genet. 2008; 17(17):2633-43. 297 Ohta M, Sugimoto T, Seto M, Mohri D, Asaoka Y, Tada M, Tanaka Y, Yamaji Y, Kanai F, Kawabe T, Omata M. Genetic alterations in colorectal cancers with demethylation of insulin-like growth factor II. Hum Pathol. 2008; 39(9):1301-8. 298 Hedborg F, Ulleras E, Grimelius L, Wassberg E, Maxwell PH, Hero B, Berthold F, Schilling F, Harms D, Sandstedt B, Franklin G. Evidence for hypoxia-induced neuronal-to-chromaffin metaplasia in neuroblastoma. FASEB J. 2003; 17(6):598-609. 299 Kim KW, Bae SK, Lee OH, Bae MH, Lee MJ, Park BC. Insulin-like growth factor II induced by hypoxia may contribute to angiogenesis of human hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 1998; 58(2):348-51. 300 Kato K, Maesawa C, Itabashi T, Fujisawa K, Otsuka K, Kanno S, Tada H, Tatemichi Y, Kotani K, Oikawa H, Sugai T, Wakabayashi G, Masuda T. DNA hypomethylation at the CpG island is involved in aberrant expression of the L1 cell adhesion molecule gene in colorectal cancer. Int J Oncol. 2009; 35(3):467-76. 301 Métivier R, Gallais R, Tiffoche C, Le Péron C, Jurkowska RZ, Carmouche RP, Ibberson D, Barath P, Demay F, Reid G, Benes V, Jeltsch A, Gannon F, Salbert G. Cyclical DNA methylation of a transcriptionally active promoter. Nature. 2008; 452(7183):45-50. 302 Gallais R, Demay F, Barath P, Finot L, Jurkowska R, Le Guével R, Gay F, Jeltsch A, Métivier R, Salbert G. Deoxyribonucleic acid methyl transferases 3a and 3b associate with the nuclear orphan receptor COUP-TFI during gene activation. Mol Endocrinol. 2007; 21(9):2085-98. 303 Gehring M, Reik W, Henikoff S. DNA demethylation by DNA repair. Trends Genet. 2009; 25(2):82-90. 304 Zhu B, Zheng Y, Angliker H, Schwarz S, Thiry S, Siegmann M, Jost JP. 5-Methylcytosine DNA glycosylase activity is also present in the human MBD4 (G/T mismatch glycosylase) and in a related avian sequence. Nucleic Acids Res. 2000; 28(21):4157-65. 305 Shukeir N, Pakneshan P, Chen G, Szyf M, Rabbani SA. Alteration of the methylation status of tumorpromoting genes decreases prostate cancer cell invasiveness and tumorigenesis in vitro and in vivo. Cancer Res. 2006; 66(18):9202-10. 110 306 Kanai Y, Ushijima S, Nakanishi Y, Hirohashi S. Reduced mRNA expression of the DNA demethylase, MBD2, in human colorectal and stomach cancers. Biochem Biophys Res Commun. 1999; 264(3):962-6. 307 Avila MA, Carretero MV, Rodriguez EN, Mato JM. Regulation by hypoxia of methionine adenosyltransferase activity and gene expression in rat hepatocytes. Gastroenterology 1998; 114(2):403-7. 308 Chawla RK, Watson WH, Jones DP. Effect of hypoxia on hepatic DNA methylation and tRNA methyltransferase in rat: similarities to effects of methyl-deficient diets. J Cell Biochem 1996; 61(1):72-80. 309 Detich N, Hamm S, Just G, Knox JD, Szyf M. The methyl donor S-Adenosylmethionine inhibits active demethylation of DNA: a candidate novel mechanism for the pharmacological effects of SAdenosylmethionine. J Biol Chem. 2003; 278(23):20812-20. 310 Caiafa P, Guastafierro T, Zampieri M. Epigenetics: poly(ADP-ribosyl)ation of PARP-1 regulates genomic methylation patterns. FASEB J. 2009; 23(3):672-8. 311 Guastafierro T, Cecchinelli B, Zampieri M, Reale A, Riggio G, Sthandier O, Zupi G, Calabrese L, Caiafa P. CCCTC-binding factor activates PARP-1 affecting DNA methylation machinery. J Biol Chem. 2008; 283(32):21873-80. 312 Nosho K, Shima K, Irahara N, Kure S, Baba Y, Kirkner GJ, Chen L, Gokhale S, Hazra A, Spiegelman D, Giovannucci EL, Jaenisch R, Fuchs CS, Ogino S. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2009; 15(11):3663-71. 313 Linhart HG, Lin H, Yamada Y, Moran E, Steine EJ, Gokhale S, Lo G, Cantu E, Ehrich M, He T, Meissner A, Jaenisch R. Dnmt3b promotes tumorigenesis in vivo by gene-specific de novo methylation and transcriptional silencing. Genes Dev. 2007; 21(23):3110-22. 314 Martin-Oliva D, Aguilar-Quesada R, O'valle F, Muñoz-Gámez JA, Martínez-Romero R, García Del Moral R, Ruiz de Almodóvar JM, Villuendas R, Piris MA, Oliver FJ. Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase modulates tumor-related gene expression, including hypoxia-inducible factor-1 activation, during skin carcinogenesis. Cancer Res. 2006; 66(11):5744-56. 315 Li M, Threadgill MD, Wang Y, Cai L, Lin X. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition down-regulates expression of metastasis-related genes in CT26 colon carcinoma cells. Pathobiology. 2009; 76(3):108-16. 316 www.clinicaltrials.gov 317 Ateeq B, Unterberger A, Szyf M, Rabbani SA. Pharmacological inhibition of DNA methylation induces proinvasive and prometastatic genes in vitro and in vivo. Neoplasia. 2008; 10(3):266-78. 318 Asaka SI, Arai Y, Nishimura Y, Yamaguchi K, Ishikubo T, Yatsuoka T, Tanaka Y, Akagi K. Microsatellite instability-low colorectal cancer acquires a KRAS mutation during the progression from Dukes' A to Dukes' B. 2009; 30(3):494-9. 319 Thibodeau SN, French AJ, Cunningham JM, Tester D, Burgart LJ, Roche PC, McDonnell SK, Schaid DJ, Vockley CW, Michels VV, Farr GH Jr, O'Connell MJ. Microsatellite instability in colorectal cancer: different mutator phenotypes and the principal involvement of hMLH1. Cancer Res. 1998; 58(8):1713-8. 320 González-García I, Moreno V, Navarro M, Martí-Ragué J, Marcuello E, Benasco C, Campos O, Capellà G, Peinado MA. Standardized approach for microsatellite instability detection in colorectal carcinomas. J Natl Cancer Inst. 2000; 92(7):544-9. 321 Malkhosyan SR, Yamamoto H, Piao Z, Perucho M. Late onset and high incidence of colon cancer of the mutator phenotype with hypermethylated hMLH1 gene in women. Gastroenterology. 2000; 119(2):598. 322 Rajagopalan H, Bardelli A, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B, Velculescu VE. Tumorigenesis: RAF/RAS oncogenes and mismatch-repair status. Nature. 2002; 418(6901):934. 111 323 Konishi M, Kikuchi-Yanoshita R, Tanaka K, Muraoka M, Onda A, Okumura Y, Kishi N, Iwama T, Mori T, Koike M, Ushio K, Chiba M, Nomizu S, Konishi F, Utsunomiya J, Miyaki M. Molecular nature of colon tumors in hereditary nonpolyposis colon cancer, familial polyposis, and sporadic colon cancer. Gastroenterology. 1996; 111(2):307-17. 324 Estécio MR, Gharibyan V, Shen L, Ibrahim AE, Doshi K, He R, Jelinek J, Yang AS, Yan PS, Huang TH, Tajara EH, Issa JP. LINE-1 hypomethylation in cancer is highly variable and inversely correlated with microsatellite instability. PLoS One. 2007; 2(5):e399. 325 Bader SA, Walker M, Harrison DJ. A human cancer-associated truncation of MBD4 causes dominant negative impairment of DNA repair in colon cancer cells. Br J Cancer. 2007; 96(4):660-6. 326 Howard JH, Frolov A, Tzeng CW, Stewart A, Midzak A, Majmundar A, Godwin A, Heslin M, Bellacosa A, Arnoletti JP. Epigenetic downregulation of the DNA repair gene MED1/MBD4 in colorectal and ovarian cancer. Cancer Biol Ther. 2009; 8(1):94-100. 327 Joyce T, Cantarella D, Isella C, Medico E, Pintzas A. A molecular signature for Epithelial to Mesenchymal transition in a human colon cancer cell system is revealed by large-scale microarray analysis. Clin Exp Metastasis. 2009; 26(6):569-87. 328 Kusewitt DF, Choi C, Newkirk KM, Leroy P, Li Y, Chavez MG, Hudson LG. Slug/Snai2 is a downstream mediator of epidermal growth factor receptor-stimulated reepithelialization. J Invest Dermatol. 2009; 129(2):491-5. 329 Penault-Llorca F, Cayre A, Arnould L, Bibeau F, Bralet MP, Rochaix P, Savary J, Sabourin JC. Is there an immunohistochemical technique definitively valid in epidermal growth factor receptor assessment? Oncol Rep. 2006; 16(6):1173-9. 330 Postawski K, Semczuk A, Miturski R, Jakowicki JA, Keith G, Baranowski W. Totalna metylacja genomowego DNA w relacji do mutacji punktowych kodonu 12 genu K-ras w pierwotnych rakach endometrium. Przegląd Menopauzalny 2002, 2: 14 –17 331 Ordway JM, Williams K, Curran T. Transcription repression in oncogenic transformation: common targets of epigenetic repression in cells transformed by Fos, Ras or Dnmt1. Oncogene. 2004; 23(21):3737-48. 332 MacLeod AR, Rouleau J, Szyf M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. J Biol Chem. 1995; 270(19):11327-37. 333 Szyf M, Theberge J, Bozovic V. Ras induces a general DNA demethylation activity in mouse embryonal P19 cells. J Biol Chem. 1995; 270(21):12690-6. 334 Miranda E, Destro A, Malesci A, Balladore E, Bianchi P, Baryshnikova E, Franchi G, Morenghi E, Laghi L, Gennari L, Roncalli M. Genetic and epigenetic changes in primary metastatic and nonmetastatic colorectal cancer. Br J Cancer. 2006; 95(8):1101-7. 335 Maestro ML, Vidaurreta M, Sanz-Casla MT, Rafael S, Veganzones S, Martínez A, Aguilera C, Herranz MD, Cerdán J, Arroyo M. Role of the BRAF mutations in the microsatellite instability genetic pathway in sporadic colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 2007; 14(3):1229-36. 336 Ogino S, Kawasaki T, Kirkner GJ, Loda M, Fuchs CS. CpG island methylator phenotype-low (CIMP-low) in colorectal cancer: possible associations with male sex and KRAS mutations. J Mol Diagn. 2006; 8(5):5828. 337 Wang L, Cunningham JM, Winters JL, Guenther JC, French AJ, Boardman LA, Burgart LJ, McDonnell SK, Schaid DJ, Thibodeau SN. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer Res. 2003; 63(17):5209-12. 338 Edkins S, O'Meara S, Parker A, Stevens C, Reis M, Jones S, Greenman C, Davies H, Dalgliesh G, Forbes S, Hunter C, Smith R, Stephens P, Goldstraw P, Nicholson A, Chan TL, Velculescu VE, Yuen ST, Leung SY, 112 Stratton MR, Futreal PA. Recurrent KRAS codon 146 mutations in human colorectal cancer. Cancer Biol Ther. 2006; 5(8):928-32. 339 Servomaa K, Kiuru A, Kosma VM, Hirvikoski P, Rytömaa T. p53 and K-ras gene mutations in carcinoma of the rectum among Finnish women. Mol Pathol. 2000; 53:24-30. 340 Reimann C, Arola M, Bierings M, Karow A, van den Heuvel-Eibrink MM, Hasle H, Niemeyer CM, Kratz CP. A novel somatic K-Ras mutation in juvenile myelomonocytic leukemia. Leukemia. 2006; 20:1637-8. 341 Bollag G, Adler F, elMasry N, McCabe PC, Conner E, Thompson P, McCormick F, Shannon K. Biochemical characterization of a novel KRAS insertion mutation from a human leukemia. J Biol Chem. 1996; 271:32491-4. 342 Schmid K, Oehl N, Wrba F, Pirker R, Pirker C, Filipits M. EGFR/KRAS/BRAF mutations in primary lung adenocarcinomas and corresponding locoregional lymph node metastases. Clin Cancer Res. 2009; 15(14):4554-60. 343 Wiest JS, Burnett VL, Anderson MW, Reynolds SH. A novel mechanism of in vivo ras gene activation involving tandem duplication of coding sequences. Oncogene. 1994; 9(9):2449-54. 344 Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van Cutsem E, Siena S, Freeman DJ, Juan T, Sikorski R, Suggs S, Radinsky R, Patterson SD, Chang DD. Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 2008; 26(10):1626-34. 345 Loupakis F, Ruzzo A, Cremolini C, Vincenzi B, Salvatore L, Santini D, Masi G, Stasi I, Canestrari E, Rulli E, Floriani I, Bencardino K, Galluccio N, Catalano V, Tonini G, Magnani M, Fontanini G, Basolo F, Falcone A, Graziano F. KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer. 2009; 101(4):715-21. 346 Andrzej Tysarowski, Anna Fabisiewicz, Iwona Kolasa, Jolanta Kupryjańczyk,Dorota Ścieglińska, Marek Rusin, Zdzisław Krawczyk, Agnieszka Woźniak,Lucyna Morzuch, Janusz Limon, Oksana Kowalczuk, Lech Chyczewski, Piotr Wójcik, Jerzy Stachura, Karolina Wieruszewska-Kowalczyk, Monika Pokrzepa,Włodzimierz P. Olszewski, Marek P. Nowacki, Janusz A. Siedlecki. Walidacja wybranych technik molekularnych oznaczania mutacji w kodonie 12 i 13 genu K-RAS przeprowadzona w pięciu ośrodkach badawczo-naukowych Polski. Onkol. Prak. Klin. 2008; 6: 232–244 113
