AmpliTest Escherichia coli (Real Time PCR)

AmpliTest Escherichia coli
(Real Time PCR)
Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych
dla bakterii Escherichia coli techniką Real Time PCR
Nr kat.: BAC06-50
Wielkość zestawu: 50 oznaczeń
Objętość pojedynczej reakcji: 20 µL
Limit detekcji: 6 kopii bakteryjnego DNA
Przed użyciem zestawu należy uważnie zapoznać się z niniejszą instrukcją.
Amplicon sp. z o. o. ul. Duńska 9 54-427 Wrocław Polska, NIP: 8943052339, KRS: 0000501830
www.amplicon.pl email: [email protected], tel. +48 71 733 67 06, fax +48 71 733 67 24
ZASTOSOWANIE
Zestaw AmpliTest Escherichia coli (Real Time PCR) jest przeznaczony do
wykrywania sekwencji specyficznych dla bakterii Escherichia coli w próbkach
DNA uzyskanych z tkanek zwierzęcia, kału, moczu lub próbek wody. W celu
uniknięcia problemów z wydajnością reakcji Real Time PCR próbki DNA powinny
być przygotowane przy użyciu metod pozwalających otrzymać wysokiej jakości
DNA pozbawiony inhibitorów reakcji PCR. Zalecane są zestawy do izolacji DNA
oparte o złoża krzemionkowe (tzw. zestawy kolumienkowe).
ZAKRES STOSOWANIA
 Diagnostyka weterynaryjna in vitro
 Badanie czystości mikrobiologicznej wody
 Badania i rozwój (B+R)
SKŁADNIKI ZESTAWU
Nazwa
Opis
Ilość
Kolor wieczka
RM
Mieszanina reakcyjna 2 × 300 µL Zielony
PC
Kontrola pozytywna
2 × 50 µL
Czerwony
NC
Kontrola negatywna
2 × 50 µL
Niebieski
Woda
Woda
2 × 300 µL Biały
TRANSPORT i PRZECHOWYWANIE
 Transport odbywa się w suchym lodzie. Po otrzymaniu przesyłki należy ją
natychmiast rozpakować.
 Składniki testu przechowywać -20°C.
 UNIKAĆ EKSPOZYCJI SKŁADNIKA RM NA ŚWIATŁO;
 Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania składników testu w
szczególności składnika RM. Trzy cykle zamrożenia i rozmrożenia składnika
RM nie wpływają znacząco na jakość wyników. WSKAZÓWKA: na etykietach
probówek zawierających składnik RM znajdują się pola, w których można
zaznaczać ilość rozmrożeń danej porcji.
 Nie używać składników testu po upływie daty przydatności do użycia.
2
ZASADA DZIAŁANIA
Zestaw AmpliTest Escherichia coli (Real Time PCR) zawiera startery namnażające
fragment genomu bakterii Escherichia coli. Detekcja obecności bakteryjnego DNA
następuje dzięki specyficznej sondzie typu TaqMan®, która przyłączając się do
powstającego amplikonu (powielanego fragmentu bakteryjnego DNA) ulega
hydrolizie. Podczas hydrolizy z sondy jest uwalniany barwnik fluorescencyjny
FAM, który jest następnie wykrywany przez układ optyczny aparatu do Real Time
PCR. Odpowiednio dobrane sekwencje starterów i sondy zapewniają wysoką
specyficzność reakcji.
W celu zwiększenia wiarygodności wyników Zestaw AmpliTest Escherichia coli
(Real Time PCR) zawiera kontrolę wewnętrzną (egzogenny fragment DNA) oraz
układ starterów i sondy do jej namnożenia i detekcji. Detekcja kontroli
wewnętrznej
odbywa
fluorescencyjnego
HEX.
się
dzięki
uwalnianiu
Obecność
kontroli
przez
sondę
wewnętrznej
barwnika
pozwala
na
monitorowanie prawidłowego przebiegu reakcji Real Time PCR. Amplifikacja
kontroli wewnętrznej nie wpływa na wydajność wykrywania sekwencji
specyficznej dla Escherichia coli. Pozytywny wynik kontroli wewnętrznej stanowi
potwierdzenie prawidłowego przebiegu reakcji Real Time PCR.
3
POTRZEBNY SPRZĘT I DODATKOWE MATERIAŁY
 Aparat do Real Time PCR:
LightCycler 480 (Roche)
LightCycler 96 (Roche)
LightCycler 2.0 (Roche)
RotorGene 3000/6000 (Qiagen)
Inne urządzenia umożliwiające detekcję barwników fluorescencyjnych FAM
i HEX.
Zestaw AmpliTest Escherichia coli (Real Time PCR) nie zawiera barwnika
normalizacyjnego
ROX.
W
przypadku
urządzeń
wymagających
takiej
normalizacji należy do mieszaniny reakcyjnej dodać barwnik ROX do
odpowiedniego stężenia. Barwnik ROX nie jest dołączony do zestawu.
 Probówki reakcyjne (próbówki PCR, płytki PCR, kapilary w zależności od
posiadanego urządzenia do Real Time PCR)
 Wirówka do probówek reakcyjnych
 Wirówka stołowa
 Pipety automatyczne w zakresie 1-1000 µL
 Sterylne końcówki z filtrami do pipet automatycznych
 Zestaw do izolacji DNA
W zależności od użytego zestawu do izolacji DNA może być potrzeby
dodatkowy sprzęt i materiały.
IZOLACJA DNA
Z poszczególnych osobników pobrać fragmenty tkanek, a następnie wyizolować
DNA. Ilość potrzebnego materiału zależy od użytej metody izolacji DNA. Do
izolacji DNA zaleca się stosowanie zestawów opartych o złoża krzemionkowe
(tzw. zestawów kolumienkowych), gdyż zapewniają one uzyskanie próbek DNA o
odpowiedniej jakości pozbawionych inhibitorów reakcji PCR. W przypadku
innych metod izolacji preparat DNA może zawierać związki, które istotnie
zmniejszają wydajność reakcji PCR. Prowadzi to do obniżenia czułości testu, a w
skrajnych przypadkach do braku amplifikacji DNA. Próbki DNA należy
przechowywać w +4°C (krótki okres przechowywania) lub w -20°C (długi okres
przechowywania).
4
REAKCJA REAL TIME PCR
1. Określić liczbę próbek DNA poddawanych analizie (n).
2. Rozmrozić składniki testu. Po rozmrożeniu składników dokładnie wymieszać
zawartość probówek i krótko je zwirować. Składniki po rozmrożeniu
przechowywać w +4°C lub na lodzie. UNIKAĆ EKSPOZYCJI składnika RM NA
ŚWIATŁO.
3. Określić ilość DNA dodawanego do reakcji (x µL).
Optymalna ilość DNA w reakcji wynosi 100-200 ng. Ilość DNA dodawanego do
reakcji nie powinna przekroczyć 400 ng. Duże ilości DNA dodanego do reakcji PCR
hamują aktywność polimerazy DNA i obniżają czułość testu. Typowo 100-200 ng
DNA jest zawarte w 1-5 µL próbki DNA uzyskanej przy użyciu zestawu
kolumienkowego.
4. Dokładnie wymieszać ze sobą (n + 3) × 12 µL mieszaniny reakcyjnej RM oraz
(n + 3) × (8 - x) µL wody.
5. Do n + 2 probówek reakcyjnych (probówek PCR, kapilar, studzienek na płytce)
nanieść po (20 – x) µL przygotowanej mieszaniny.
6. Do n probówek reakcyjnych dodać po x µl przygotowanych próbek DNA. Do
jednej z pozostałych dwóch próbówek reakcyjnych dodać kontrolę negatywną
NC, a do drugiej kontrolę pozytywną PC. UWAGA: kontrolę pozytywną należy
dodać jako ostatnią.
7. Zamknąć probówki reakcyjne, a następnie krótko je zwirować.
8. Probówki reakcyjne umieścić w aparacie do Real Time PCR i wykonać reakcję
według następującego protokołu:
9.
Denaturacja wstępna
Amplifikacja (45 cykli)
Schłodzenie aparatu
95°C 5 min
95°C 10 s
58°C 25 s*
30-40°C 30s (zależnie od typu aparatu)
*Na końcu tego etapu ustawić odczyt fluorescencji w kanałach dla FAM i HEX.
Kanał dla FAM służy do wykrywania sekwencji specyficznej dla bakterii
Escherichia coli. Kanał dla HEX służy do wykrywania kontroli wewnętrznej.
5
INTERPRETACJA WYNIKÓW
L.p. Rodzaj próbki
FAM
HEX
Wynik
1
Kontrola pozytywna
+
+
Prawidłowy
2
Kontrola negatywna
-
+
Prawidłowy
3
Oznaczenie 1
+
+
Dodatni
4
Oznaczenie 2
-
+
Ujemny
Brak odczytu w kanale dla HEX* oznacza, że reakcja Real Time PCR nie
przebiegła w sposób prawidłowy. Jednoczesny brak pozytywnego odczytu
fluorescencji w kanale dla HEX w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej
wskazuje na złą jakość Zestawu AmpliTest Escherichia coli (Real Time PCR)
(niewłaściwe przechowywanie, transport, wygaśnięcie terminu przydatności do
użycia itp.) Pozytywny odczyt fluorescencji w kanale dla HEX w przypadku
kontroli pozytywnej i negatywnej i brak pozytywnego odczytu dla badanych
próbek DNA oznacza złą jakość próbek DNA (obecność związków hamujących
reakcję PCR) lub zbyt dużą ilość DNA użytego w reakcji. W tym przypadku należy
do reakcji dodać mniejszą objętość próbki DNA, jednocześnie dodając taką
objętość wody, aby końcowa objętość reakcji wynosiła 20 µL.
*Przy bardzo wysokim mianie bakterii może wystąpić brak odczytu w kanale HEX przy
jednoczesnym odczycie w kanale FAM. Zaleca się wtedy powtórzenie reakcji z zmniejszoną
(10-100-krotnie) ilością DNA dodanego do reakcji.
UWAGI DODATKOWE
 Zastosowane sondy TaqMan® posiadają wygaszacze (Quenchers) typu BHQ
(Black
Hole
Quencher™),
które
nie
generują
dodatkowych
sygnałów
fluorescencyjnych. W aparatach, które tego wymagają (np. RotorGene 6000),
jako typ wygaszacza należy wybrać opcję „none”.
 Przygotowany test wykrywa powyżej 6 kopii bakteryjnego DNA obecnych w
dodawanej próbce. Próbki DNA uzyskane z pojedynczych osobników można ze
sobą pulować i wykorzystywać w pojedynczym oznaczeniu. W tym celu równe
objętości próbek DNA (np. 10 µL) przeznaczonych do pulowania należy ze
sobą dokładnie wymieszać i użyć jako matrycy w reakcji Real Time PCR.
Pulowaniu można również poddawać kleszcze, tj. ilozolować DNA z kilku
6
osobników jednocześnie. Należy jednak pamiętać, że pulowanie próbek DNA
zmniejsza możliwość uzyskania pozytywnego wyniku w przypadku próbek
zawierających niewielką ilość bakterii.
 Nie stosować objętości reakcji mniejszych niż 20 µL. Zmniejszenie objętości
reakcji powoduje znaczące zmniejszenie czułości testu.
 Należy zachować szczególną ostrożność podczas izolacji DNA, a materiał
biologiczny uzyskany od chorych zwierząt traktować jako potencjalnie
zakażony.
 Izolację DNA oraz detekcję obecności bakterii Escherichia coli powinien
wykonać odpowiednio przeszkolony personel w laboratorium spełniającym
odpowiednie wymogi i dopuszczonym do pracy z zakażonym materiałem
biologicznym. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby podczas izolacji DNA nie
doszło do krzyżowego zanieczyszczenia próbek DNA izolowanych równolegle.
 W celu maksymalnego wyeliminowania fałszywych wyników powinno się
przestrzegać następujących zasad:
- w miarę możliwości wyznaczyć osobne stanowiska do izolacji DNA,
przygotowania reakcji Real Time PCR oraz jej wykonania/analizy.
- pomiędzy etapami izolacji DNA, przygotowania reakcji Real Time PCR
należy dokonać zmiany odzieży laboratoryjnej (fartucha) oraz zmiany
rękawiczek jednorazowych.
- powierzchnię stanowisk do izolacji DNA i przygotowania reakcji Real Time
PCR należy przemywać środkami usuwającymi/niszczącymi DNA.
- do pipet automatycznych należy stosować wyłącznie sterylne końcówki z
filtrem.
- podczas przygotowywania reakcji Real Time PCR kontrolę pozytywną PC
należy dodać jako ostatnią. Przed jej dodaniem, w miarę możliwości, należy
zamknąć probówki z dodanymi próbkami DNA i kontrolą negatywną NC.
TaqMan® jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Applied Biosystems, Inc.
LightCycler® jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Roche Diagnostics GmbH.
Black Hole Quencher™ jest znakiem towarowym zastrzeżonym dla Biosearch Technologies, Inc.
7