IB_02-2008 [PL_2]_paginy.qxd - Acta Bio

IB_02-2008 [PL_2]_paginy.qxd
2008-06-24
15:05
Page 181
Optical methods for pathogenic bacteria identification
Igor Buzalewicz, Halina Podbielska
Grupa Bio-Optyki, Instytut Inżynierii Biomedycznej i Pomiarowej, Wydział Podstawowych Problemów Techniki,
Politechnika Wrocławska, Wybrzeże Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław, tel. + 48 (0) 71 320 2825,
e-mail: [email protected]
Streszczenie
Problem szybkiej detekcji i identyfikacji bakterii jest jednym z najważniejszych zagadnień związanych z zachowaniem zasad higieny, ochrony zdrowia i żywności. W artykule omówione zostały podstawowe problemy metrologii pomiarowej związanej z identyfikacją i charakteryzacją bakterii. Przedstawiono przegląd głównych technik rozpoznawania patogenów, z szczególnym uwzględnieniem metod
optycznych, zapewniających bezkontaktowy, małoinwazyjny charakter pomiaru. Opisano wybrane techniki fluorescencyjne oraz analizy światła rozproszonego na bakteriach i koloniach bakterii.
Słowa kluczowe: identyfikacja bakterii, fluorescencja, rozpraszanie, dyfrakcja
Abstract
Problem of efficent bacteria detection and identification is
important in life science medicine, health and food protection. This paper presents some problems of bacteria detection metrology, related to bacteria identification and characterization. Methods of bacteria identification, especially based on non-contact and non-invasive optical techniques, are described. Fluorescence measurements techniques and analysis of light scattering on bacteria cells and
bacteria colonies are presented.
Keywords: bacteria identification, fluorescence, scattering,
diffraction
Wstęp
jest dużym problemem [2-5], dlatego też obserwuje się ostatnio rozwój różnych nowych metod identyfikacji bakterii chorobotwórczych, a także technik sterylizacji.
Dotychczas stosowane metody identyfikacji bakterii bazują
w głównej mierze na analizie łańcucha DNA za pomocą PCR
(Polymerase Chain Reaction) ­ reakcja łańcuchowa polimerazy
DNA, detekcji biochemicznej (np. barwienie metodą Grama),
z wykorzystaniem różnego rodzaju odczynników, np. enzymów restrykcyjnych oraz znaczników immunologicznych
w postaci wysoce selektywnych przeciwciał.
Badanie DNA jest najdokładniejszą metodą identyfikacji
bakterii, gdyż analizowana jest ich struktura genowa. Proces
klasyfikacji bakterii jest poprzedzony wyodrębnieniem próbki DNA, potem następuje trawienie enzymami restrykcyjnymi, rozdzielenie elektroforetyczne oraz hybrydyzacja połączona ze znakowaniem radioaktywnym.
Barwienie metodą Grama jest techniką, umożliwiającą klasyfikację bakterii ze względu na budowę ich ścian komórkowych poprzez ich zaszeregowanie do dwóch podstawowych
grup bakterii: gram dodatnich i gram ujemnych. Proces ten
przebiega wieloetapowo: utrwalenie preparatu, wstępne barwienie fioletem krystalicznym, zastosowanie płynu Lugola,
odbarwienie roztworem alkoholu, dodanie fuksyny zasadowej. Efektem końcowym jest wybarwienie próbki. Do głównych wad zaliczyć można m.in. konieczność wstępnego przygotowania badanych próbek, wysokie koszty, długi czas identyfikacji. Dodatkowo w barwieniu metodą Grama obserwuje
się brak jednoznaczności w klasyfikacji mykobakterii oraz
krętków, jak również wpływ dodatkowych czynników, np. penicyliny, lizozymu, które mogą powodować zmiany w ścianach komórkowych bakterii.
Istnieje zatem konieczność opracowania nowych technik,
które pozwoliłyby na wyeliminowanie tych niedogodności.
Potrzebne są więc nowe metody, które cechowałyby się większą efektywnością i skutecznością detekcji, a tym samym byłyby w stanie wyeliminować dotychczasowe niedogodności.
Szczególnie istotną pozycję zajmują tu optyczne metody detekcji bakterii, jak również charakteryzacji ich właściwości
oraz kinematyki oddziaływania z otaczającym je środowiskiem. Techniki optyczne mają nieniszczący charakter, ponieważ analizie podlega zawsze światło, podczas gdy patogeny
pełnią jedynie funkcję swoistego rodzaju elementu modulującego falę świetlną. Fala świetlna jest wysoce efektywnym nośnikiem informacji o otaczającym nas świecie ­ zarówno
o badanej przestrzeni, jak i zlokalizowanych w niej obiektach.
W wyniku oddziaływania światła z materią mamy do czynie-
Od chwili odkrycia bakterii chorobotwórczych problematyka
ich detekcji, identyfikacji oraz charakteryzacji ich podstawowych właściwości jest punktem zainteresowania wielu naukowców różnych dziedzin. Związane jest to przede wszystkim z powszechną obecnością bakterii w otaczającym środowisku, jak również ich chorobotwórczym działaniem na organizm ludzki. Częste stosowanie antybiotyków może mieć
szkodliwy wpływ na organizm człowieka, a także prowadzić
do zwiększenia odporności bakterii na dostępne antybiotyki,
związanej z ich wrodzonymi mechanizmami adaptacyjnymi,
a tym samym powstania odmian bakterii niewrażliwych na
konwencjonalne terapie lekowe. Możliwe zagrożenia, wynikające z indukowanej odporności bakterii, zostały przedstawione przez Colsky'ego i innych w pracy [1], która zawiera
analizę wyników skuteczności leczenia pacjentów w latach 1992-1996. Badania porównawcze odporności antybiotykowej bakterii
wskazują na wzrost odporności bakterii S. aureus i P. aeruginosa na takie leki, jak oxacillina
oraz ciproflaxicin. Na przykład w owrzodzeniach podudzi obserwuje się wzrost odporności S. aureus na oxacillinę z 24% do 50%,
a w przypadku zakażeń skóry z 9% do 24% Rys. 1 Zmiany odporności bakterii Staphylococcus aureus na antybiotyki w owrzodze(rys. 1). Wzrost odporności bakterii na leki niach podudzi (A) oraz w zakażeniach skóry (B) [1]
Acta Bio-Optica et Informatica Medica 2/2008, vol. 14
181
inżynieria biomedyczna / biomedical engineering
Optyczne techniki identyfikacji bakterii
chorobotwórczych