Podstawy technik mikroskopowych / Jan A. Litwin, Mariusz Gajda

Podstawy technik mikroskopowych / Jan A. Litwin, Mariusz Gajda. wyd. 7. – Kraków, cop. 2011
Spis treści
Od autorów
13
1.
1.1.
1.1.1.
1.1.2.
1.2.
1.2.1.
1.2.2.
1.2.3.
1.3.
1.3.1.
1.3.2.
1.3.3.
1.3.4.
1.3.5.
1.3.6.
1.3.7.
1.3.8.
1.3.9.
1.3.10.
1.4.
1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
Mikroskopy świetlne
Budowa mikroskopu świetlnego
Zespół mechaniczny
Zespół optyczny
Teoria mikroskopu
Powstawanie obrazu mikroskopowego
Powiększenie całkowite mikroskopu
Zdolność rozdzielcza mikroskopu
Specjalne odmiany mikroskopów świetlnych
Ciemne pole
Mikroskop polaryzacyjny
Mikroskop fazowo-kontrastowy
Mikroskop interferencyjny
Kontrast interferencyjno-róŜnicowy (optyka Nomarskiego)
Mikroskop fluorescencyjny
Mikroskop konfokalny
Mikroskop dwufotonowy
Mikroskop odwrócony
Mikroskop cyfrowy
Rejestracja obrazu mikroskopowego
Mikrofotografia
Wideo mikroskopia
Mikroskopia wirtualna
15
15
15
17
20
20
20
21
23
23
24
25
27
27
28
30
32
32
33
34
34
35
35
2.
2.1.
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.2.3.
2.2.4.
2.2.5.
2.2.6.
2.2.7.
2.2.8.
2.2.9.
2.3.
2.4.
2.5.
2.6.
Mikroskopy elektronowe
Zasady optyki elektronowej
Transmisyjny mikroskop elektronowy
Działo elektronowe
Kondensor
Soczewka obiektywowa
Soczewki projekcyjne
Stolik przedmiotowy
Ekran luminescencyjny
System fotograficznej rejestracji obrazu
Zespól pomp próŜniowych
Pulpit sterowniczy
Wysokonapięciowy mikroskop elektronowy
Skaningowy mikroskop elektronowy
Niskonapięciowy mikroskop elektronowy
Mikroanalizator rentgenowski
37
37
40
41
42
42
42
42
43
43
44
44
45
45
47
47
3.
3.1.
3.2.
3.3.
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
3.3.4.
3.3.5.
3.3.6.
3.4.
3.5.
3.6.
3.6.1.
3.6.2.
3.6.3.
3.7.
3.8.
3.8.1.
3.8.2.
3.9.
3.9.1.
3.9.2.
3.9.3.
3.9.4.
3.9.5.
3.9.6.
3.10.
3.10.1.
3.10.2.
3.10.3.
3.10.4.
3.10.5.
3.10.6.
3.10.7.
3.11.
3.12.
3.13.
3.13.1.
3.13.2.
3.14.
3.14.1.
3.14.2.
Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie
świetlnym
Rodzaje preparatów mikroskopowych
Pobieranie materiału
Utrwalanie
Cele utrwalania
Rodzaje utrwalaczy
Metody utrwalania
Chemiczne podstawy procesu utrwalania
Oddziaływanie mikrofal na tkankę
Wypłukiwanie utrwalacza
Odwadnianie
Płyny pośrednie
Zatapianie w parafinie
Formowanie bloczków
Alternatywna technika parafinowa: opracowanie materiału bez
rozpuszczalników organicznych za pomocą mikrofal
(ang. microwave paraffin processing)
Zalety i ograniczenia techniki parafinowej
Zatapianie w celoidynie
Zatapianie w Ŝywicach
Zatapianie w Ŝywicach akrylowych
Zatapianie w Ŝywicach epoksydowych
Krojenie skrawków
Mikrotomy
Zasady krojenia
Krojenie skrawków parafinowych
Krojenie skrawków celoidynowych
Krojenie skrawków z Ŝywic akrylowych
Krojenie skrawków z Ŝywic epoksydowych
Barwienie
Przygotowanie skrawków do barwienia
Barwienie barwnikami kwaśnymi i zasadowymi
Barwienie przyŜyciowe
Impregnacja związkami metali
Bejcowanie
RóŜnicowanie
Płukanie
Zamykanie preparatów
Automatyzacja procesów opracowania materiału do badań
mikroskopowych
Przygotowanie tkanek zmineralizowanych do badań
mikroskopowych
Technika szlifów
Technika skrawków
Przepisy praktyczne
Utrwalacze
Odwadnianie
49
49
50
51
51
52
52
54
55
55
55
56
56
57
58
58
59
59
60
60
60
60
62
63
64
65
65
65
65
66
67
67
67
68
68
68
69
70
70
71
73
73
74
3.14.3. Zatapianie w parafinie
75
3.14.4. Zatapianie w celoidynie
76
3.14.5. Zatapianie w Ŝywicy akrylowej Histocryl
77
3.14.6. Barwienie hematoksyliną i eozyną
77
3.14.7. Barwienie trichromem Massona
78
3.14.8. Barwienie włókien spręŜystych rezorcyno-fuksyną
78
3.14.9. Impregnacja srebrem włókien kratkowych (metoda Gomoriego) 79
3.14.10. Barwienie rozmazów krwi i szpiku metodą
Maya-Grxinwalda i Giemsy
80
3.14.11. Barwienie wymazów pochwowych metodą Papanicolaou
80
4.
4.1.
4.1.1.
4.1.2.
4.1.3.
4.1.4.
4.1.5.
4.2.
4.3.
4.4.
4.4.1.
4.4.2.
4.5.
4.5.1.
4.5.2.
4.5.3.
4.5.4.
4.6.
4.7.
4.8.
4.8.1.
4.8.2.
4.8.3.
4.8.4.
4.9.
4.9.1.
4.9.2.
4.9.3.
4.10.
4.10.1.
4.10.2.
4.10.3.
4.10.4.
4.10.5.
Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie
elektronowym
Utrwalanie pierwotne
Rodzaje utrwalaczy
pH utrwalacza
Osmolarność utrwalacza
Temperatura utrwalania
Wypłukiwanie utrwalacza
Osmowanie (utrwalanie wtórne)
Odwadnianie
Zatapianie
Zatapianie w Ŝywicach epoksydowych
Zatapianie w Ŝywicach akrylowych
Krojenie skrawków
Przygotowanie bloczka do krojenia (trymowanie)
Ultramikrotomy
Przygotowanie noŜa szklanego
Krojenie i ocena grubości skrawków
Montowanie skrawków
Kontrastowanie skrawków
Specjalne techniki przygotowania materiału do badań w
transmisyjnym mikroskopie elektronowym
Technika barwienia negatywowego
Technika cieniowania metalami
Technika replik
Technika mroŜenia i łamania (ang. freeze-fracture)
Przygotowanie materiału do badań w skaningowym mikroskopie
elektronowym
Suszenie w punkcie krytycznym
Napylanie próŜniowe
Technika odlewów mikrokorozyjnych
Przepisy praktyczne
Utrwalacze
Odwadnianie
Zatapianie w Ŝywicy Epon 812
Zatapianie w Ŝywicy Araldite
Barwienie skrawków półcienkich do celów mikroskopii świetlnej
83
83
83
84
84
84
84
85
85
85
85
86
86
86
87
88
89
90
90
91
91
92
92
93
95
95
95
97
97
97
98
98
99
99
4.10.6. Barwienie (kontrastowanie) skrawków ultracienkich do celów
mikroskopii elektronowej
100
5.
5.1.
5.1.1.
5.1.2.
5.1.3.
5.1.4.
5.1.5.
5.2.
5.3.
5.3.1.
5.3.2.
5.4.
5.5.
5.5.1.
5.5.2.
5.5.3.
5.5.4.
Technika mroŜeniowa
101
ZamraŜanie materiału
101
Fizyczne podstawy zamraŜania materiału biologicznego
101
ZamraŜanie w ciekłych gazach
102
ZamraŜanie dwutlenkiem węgla
103
ZamraŜanie w kriostacie
103
Krioprotekcja
104
Przechowywanie zamroŜonego materiału
104
Krojenie skrawków z zamroŜonego materiału
104
Kriostat
104
Krioultramikrotom
106
MroŜenie z substytucją (podstawianiem)
107
Liofilizacja
107
Fizyczne podstawy procesu liofilizacji
107
Przebieg procesu liofilizacji
108
Przygotowanie materiału liofilizowanego do badań mikroskopowych 109
Zastosowanie liofilizacji
109
6.
6.1.
6.1.1.
6.1.2.
6.2.
6.2.1.
6.2.2.
6.2.3.
Podstawy klasycznej histochemii
111
Reakcje histochemiczne
111
Podstawy reakcji histochemicznych
111
Typy reakcji histochemicznych
112
Przygotowanie materiału do badań histochemicznych
112
Utrwalanie
113
Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym
113
Przygotowanie materiału do badań w transmisyjnym mikroskopie
elektronowym
114
Wykrywanie białek
114
Wykrywanie cukrowców
115
Reakcja PAS (ang. Periodic Acid-Schiff)
115
Wykrywanie kwaśnych glikozoaminoglikanów błękitem alcjanowym 116
Wykrywanie kwaśnych glikozoaminoglikanów Ŝelazem koloidalnym 116
Metachromazja
117
Wykrywanie lipidów
117
Wykrywanie kwasów nukleinowych
118
Reakcja Feulgena
118
Metoda Bracheta
118
Metody fluorescencyjne
119
Wykrywanie amin biogennych
120
Wykrywanie wybranych składników patologicznych
120
Hemosyderyna i złogi Ŝelaza
120
Lipofuscyny
121
Amyloid
121
Wykrywanie enzymów
121
Reakcja histoenzymatyczna
122
6.3.
6.4.
6.4.1.
6.4.2.
6.4.3.
6.4.4.
6.5.
6.6.
6.6.1.
6.6.2.
6.6.3.
6.7.
6.8.
6.8.1.
6.8.2.
6.8.3.
6.9.
6.9.1.
6.9.2.
Reakcja precypitacji z kationami metali (reakcja Gomoriego)
6.9.3.
Reakcja sprzęgania do związków azowych
6.9.4.
Reakcja indygogenna
6.9.5.
Reakcja utleniania lub redukcji substratu
6.10.
Reakcje kontrolne
6.11.
Przepisy praktyczne
6.11.1. Reakcja PAS
6.11.2. Reakcja Feulgena
6.11.3. Wykrywanie białek błękitem bromofenolowym
6.11.4. Barwienie lipidów Sudanem III i IV
6.11.5. Fluorescencyjna metoda wykrywania amin biogennych
6.11.6. Wykrywanie fosfatazy alkalicznej metodą sprzęgania
6.11.7. Wykrywanie kwaśnych hydrolaz lizosomowych metodą sprzęgania
6.11.8. Wykrywanie dehydrogenaz
6.11.9. Wykrywanie peroksydaz
6.11.10. Metoda „score"
7.
7.1.
7.2.
7.2.1.
7.2.2.
7.3.
7.3.1.
7.3.2.
7.3.3.
7.3.4.
7.4.
7.4.1.
7.4.2.
7.4.3.
7.4.4.
7.5.
7.5.1.
7.5.2.
7.6.
7.6.1.
7.6.2.
7.6.3.
7.6.4.
7.6.5.
7.6.6.
7.6.7.
7.6.8.
7.7.
7.8.
Podstawy immunohistochemii
Antygen i przeciwciało
Otrzymywanie i oczyszczanie przeciwciał do badań
immunohistochemicznych
Otrzymywanie przeciwciał poliklonałnych
Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych
Znakowanie przeciwciał
Znakowanie fluorochromami
Znakowanie enzymami
Znakowanie ferrytyną
Znakowanie koloidalnym złotem
Przygotowanie materiału do badań immunohistochemicznych
Utrwalanie
Zatapianie
Naklejanie skrawków
Odsłanianie miejsc antygenowych
Wykonanie reakcji immunohistochemicznej
Mikroskopia świetlna
Mikroskopia elektronowa
Typy reakcji immunohistochemicznych
Reakcja bezpośrednia
Reakcja pośrednia dwuetapowa
Reakcja z mostkiem immunoglobulinowym i kompleksem enzymantyenzym
Reakcja z białkiem A
Reakcja z awidyną i biotyną
Reakcja z łańcuchami polimerowymi
Wzmocnienie reakcji za pomocą tyramidów
Jednoczesne wykrywanie kilku antygenów
Reakcje kontrolne
Wykrywanie reszt cukrowcowych za pomocą lektyn
122
123
123
123
124
125
125
126
126
127
127
127
128
129
129
130
131
131
133
133
134
136
136
137
138
139
139
139
140
140
141
141
141
142
143
143
144
145
147
147
149
149
151
151
152
7.9.
7.9.1.
Przepisy praktyczne
Pośrednia reakcja immunofluorescencyjna na skrawkach
parafinowych
154
8.
8.1.
8.2.
8.3.
8.3.1.
8.3.2.
8.3.3.
8.3.4.
8.4.
8.4.1.
8.4.2.
8.5.
8.6.
8.7.
8.8.
Hybrydyzacja in situ
Wytwarzanie i rodzaje sond
Znakowanie sond
Przygotowanie materiału do hybrydyzacji in situ
Utrwalanie
Zatapianie
Permeabilizacja
Zapobieganie reakcjom nieswoistym
Hybrydyzacja
Denaturacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja i wpływające na nią czynniki
Wykrywanie sond związanych z tkanką
Reakcje kontrolne
Łańcuchowa reakcja polimerazy in situ (in situ PCR)
Metoda PRINS
157
158
159
160
160
160
160
161
162
162
162
163
163
164
165
9.
9.1.
9.2.
167
167
9.3.
9.4.
9.4.1.
9.4.2.
9.4.3.
Fluorescencyjne metody badania Ŝywych komórek
Znaczniki organelli komórkowych
Znaczniki wewnątrzkomórkowego stęŜenia jonów i potencjału
elektrycznego
Metoda FRET
Białka fluoryzujące
Białka fluoryzujące jako znaczniki białek wewnątrzkomórkowych
Białka fluoryzujące jako wskaźniki ekspresji genów
Białka fluoryzujące jako znaczniki linii komórkowych
10.
10.1.
10.2.
10.3.
10.4.
10.5.
10.5.1.
10.5.2.
10.6.
10.7.
10.8.
10.9.
10.10.
10.11.
10.12.
10.13.
Podstawy autoradiografii
ZałoŜenia techniki autoradiograficznej
Zastosowanie autoradiografii
Izotopy promieniotwórcze stosowane w autoradiografii
Wprowadzanie znakowanych substancji do komórek i tkanek
Przygotowanie preparatu autoradiograficznego (autoradiogramu)
Technika emulsji zdzieranej
Technika emulsji płynnej
Ekspozycja
Wywołanie autoradiogramu
Procedura histologiczna towarzysząca autoradiografii
Zdolność rozdzielcza autoradiogramów
Tło
Reakcje kontrolne
Opracowanie i ocena wyników
WyposaŜenie pracowni autoradiograficznej
173
173
174
175
175
176
176
176
177
178
178
178
179
180
180
181
154
168
169
170
170
171
172
11.
Hodowla komórek i tkanek
11.1.
Klasyfikacja i terminologia
11.2.
Ustalone linie komórkowe
11.3.
PoŜywki i warunki hodowli
11.4.
Metodyka hodowli
11.5.
Kontrola Ŝywotności komórek w hodowli
11.6.
Transformacja komórek
11.7.
Agregacja i segregacja komórek
11.8.
Fuzja i hybrydyzacja komórek
11.9.
Hodowla fibroblastów, leukocytów i limfocytów
11.10. Zastosowanie hodowli komórek i tkanek
11.11. Przepisy praktyczne
11.11.1. Zakładanie hodowli fibroblastów
11.11.2. Zakładanie hodowli leukocytów
11.11.3. Ocena Ŝywotności komórek
183
183
184
184
186
187
188
188
189
189
190
191
191
191
191
12.
12.1.
12.1.1.
12.1.2.
12.1.3.
12.2.
12.2.1.
12.2.2.
12.2.3.
12.2.4.
12.3.
12.3.1.
12.3.2.
12.3.3.
12.4.
12.4.1.
12.4.2.
12.4.3.
12.4.4.
12.4.5.
12.4.6.
193
194
194
195
196
196
197
197
199
200
201
201
201
202
202
203
204
208
208
208
Analiza ilościowa preparatów mikroskopowych
Densytometria i fluorymetria
Fizyczne podstawy densytometrii
Metodyka pomiarów densytometrycznych i fluorymetrycznych
Urządzenia stosowane w densytometrii i fluorymetrii
Cytometria przepływowa
Fizyczne podstawy pomiaru cytometrycznego
Budowa cytometru
Przygotowanie komórek do pomiarów cytometrycznych
Zastosowanie badań cytometrycznych
Morfometria
Planimetria
Stereologia
Tradycyjne narzędzia stosowane w badaniach morfometrycznych
Komputerowa (cyfrowa) analiza obrazu
Przekształcanie obrazu mikroskopowego w formę cyfrową
Przetwarzanie obrazu cyfrowego
Analiza morfometryczna wybranych obiektów
Analiza fotometryczna wybranych obiektów
Urządzenia do komputerowej analizy obrazu
Przygotowanie preparatów do automatycznych pomiarów
ilościowych
oprac. BPK
209