HYDROLIZA LIPIDÓW MLEKA ZA POMOCĄ LIPAZY TRZUSTKOWEJ

WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI ŚLĄSKIEJ W GLIWICACH
KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII
HYDROLIZA LIPIDÓW MLEKA
ZA POMOCĄ LIPAZY TRZUSTKOWEJ
Prowadzący: mgr inż. Katarzyna Goj
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
WSTĘP TEORETYCZNY
Enzymy lipolityczne na przykładzie Lipazy
Lipaza należy do grupy enzymów lipolitycznych (klasa:hydrolazy, podgrupa:esterazy),
hydrolizuje ona wiązanie estrowe występujące pomiędzy glicerolem i kwasami tłuszczowymi w
obrębie różnorodnej grupy lipidów. Lipazy są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, występują w
nasionach i organach wegetatywnych wielu roślin, w niektórych mikroorganizmach oraz w
organizmach ludzi i zwierząt (trzustka, wątroba, ściana żołądka i jelit). Lipazy katalizują hydrolizę
nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli (TAG). Reakcja ta zachodzi na granicy faz a produktami
są kwasy tłuszczowe, diacyloglicerole (DAG), monoacyloglicerole (MAG) oraz glicerol. Lipazy
katalizują również hydrolizę rozpuszczalnych w wodzie, krótkołańcuchowych estrów kwasów
karboksylowych (reakcja zachodzi bardzo powoli).
H2 O
TRIACETYLOGLICEROL (TAG) LIPAZA DIACETYLOGLICEROL (DAG)
H2 O
WOLNY KWAS
T£USZCZOWY
H2O
DIACETYLOGLICEROL (DAG) LIPAZA MONOACETYLOGLICEROL (MAG)
WOLNY KWAS
T£USZCZOWY
H2O
H2 O
MONOACETYLOGLICEROL (MAG) LIPAZA GLICEROL
WOLNY KWAS
T£USZCZOWY
H2 O
Hydroliza triacylogliceroli jest reakcją odwracalną, kierunek reakcji jest zależny od
środowiska, przy czym nadmiar wody wywołuje hydrolizę, natomiast niska zawartość wody wywołuje
estryfikacje glicerolu-reakcja odwrotna. Szybkość hydrolizy triacylogliceroli wzrasta z liczbą reszt
kwasów tłuszczowych, długością łańcucha oraz stopniem nienasycenia kwasów tłuszczowych. Reakcje
katalizowane przez lipazy można prowadzić w rozpuszczalnikach organicznych oraz roztworach
buforowych możliwa jest wtedy kontrola zawartości wody (współczynnik aktywności wodnej).
Lipazy katalizują następujące typy reakcji:
1. hydrolizę (środowisko wodne, z nadmiarem wody),
2. estryfikację (środowisko z małym udziałem wody lub środowisko bezwodne),
3. transestryfikacja (wymiana kwasów tłuszczowych w TAG),
 acydoliza (grupy acylowe pochodzą od wolnych kwasów),
 interestryfikacja (wymiana grup arylowych pomiedzy estrami),
 alkoholiza (reakcja pomiedzy alkoholem i estrem w wyniku której powstaje nowy
alkohol i ester).
Optymalne pH reakcji dla lipaz pochodzenia zwierzęcego wynosi 7.0-8.0, a dla lipaz roślinnych
w granicach pH 4.7-5.0, natomiast temperatura efektywnego działania mieści się między 35 a 37˚C.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Aktywność lipaz można sprawdzić poprzez określenie ilości uwolnionych kwasów
tłuszczowych w wyniku działania enzymu w reakcji prowadzonej w optymalnych warunkach
doświadczalnych. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych w próbkach badanego substratu,
pobieranych w równych odstępach czasu, oznacza się przez miareczkowanie mianowanym
roztworem wodorotlenku potasu.
Utlenianie lipidów zachodzi pod wpływem dwóch enzymów : lipazy i lipooksygenazy
(schemat poniżej).
T£USZCZOWCE
lipaza
KWASY T£USZCZOWE
GLICEROL
lipooksygenaza
WODORONADTLENKI KWASÓW T£USZCZOWYCH
ALDEHYDY I KETONY
Reakcja zaczyna się od działania lipazy uwalniającej z cząsteczek triacylogliceroli kwasy
tłuszczowe, z których następnie powstają produkty utleniania. Rozkład tłuszczów zachodzi szybko,
np. podczas przemiału pszenicy wtedy mąka posiada gorzki smak. Wysoką aktywność lipolityczną
mają zarodki pszenne a przede wszystkim otręby pszenne.
Lipazy wykorzystywane aktualnie w procesach przetwórczych są pochodzenia głównie
mikrobiologicznego. Znaczne ich ilości syntezowane są przez różne szczepy drożdży, pleśni czy
bakterii (Candida rugosa, Candida cylindracea, Candida antarctica, Aspergillus niger, Bacillus
piocyaneum). Wykorzystane są w przemyśle spożywczym do otrzymywania komercyjnie ważnych
niskocząsteczkowych estrów o określonych walorach smakowo-zapachowych, stosowane są
najczęściej do napojów, soków, nektarów, a także do takich produktów jak budynie, kisiele, dżemy,
ciastka i wiele innych. Niektóre z nich posiadają charakterystyczny smak np.:




octan izoamylu-bananowy,
maślan metylu-ananasowy,
propionian metylu-owocowy,
estry tolilu-aromat miodowy,
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)


octan cytronellylu-aromat różany,
octan terpinylu-aromat owocowy.
Niektóre lipazy pochodzenia mikrobiologicznego hydrolizują tłuszcz mleka krowiego i uwalnianą
są wtedy głównie lotne kwasy tłuszczowe (krótkołańcuchowe), których zawartość wynosi 8-10%
ogólnej ilości związanych w tłuszczu kwasów, inne lipazy odszczepiają przede wszystkim kwasy o
długich łańcuchach, w przemyśle mleczarskim odpowiedzialne są za intensyfikację cech
organoleptycznych, w tym głównie serów twardych, którym uwolnione kwasy krótkołańcuchowe
nadają pikantny smak. W ostatnim czasie lipazy wykorzystywane są do syntezy estrów kwasów
tłuszczowych np. z kwasem askorbinowym oraz witaminą A. Przeciwutleniacze te posiadają
zmienione właściwości hydrofobowo-hydrofilowe (kwas askorbinowy w postaci estru kwasu
tłuszczowego rozpuszcza się w olejach) i mogą mieć szerokie zastosowanie w przemysle tłuszczowym
lub kosmetycznym.
W procesach trawiennych mających miejsce w organizmach ludzi i zwierząt największe znaczenie
mają lipazy: trzustkowa, wątrobowa i jelitowa. W produktach enzymatycznego rozkładu tłuszczu
występują obok uwolnionych kwasów tłuszczowych i glicerolu, także mono- i diacyloglicerole. Lipaza
trzustkowa odszczepia wyłącznie kwasy tłuszczowe w pozycjach α i α’ w cząsteczce triacylogliceroli
(wiązania estrowe utworzone w reakcji kwasów karboksylowych z pierwszorzędowymi grupami
hydroksylowymi). Natomiast lipaza jelitowa działa na wiązania estrowe w położeniu β, powstające w
reakcji kwasów tłuszczowych z drugorzędową grupą hydroksylową glicerolu. W warunkach
fizjologicznych równowaga reakcji jest przesunięta na korzyść produktów rozkładu dlatego biosynteza
estrów praktycznie nie zachodzi.
Przemysłowe zastosowanie lipaz zarówno pochodzenia zwierzęcego jak i mikrobiologicznego:







przemysł mleczarski-produkcja serów typu roquefort, cheddar, oraz serów włoskich,
częściowa hydroliza tłuszczu (poprawa aromatu, smaku), skrót czasu dojrzewania,
przemysł cukierniczy-hydroliza pozostałości tłuszczu w suchej albuminie jaj, ponieważ
obecność tłuszczu obniża zdolność białka do tworzenia piany (traktuje się lipazą masę
jajeczną przed suszeniem przez co wzrasta organoleptyczna jakość gotowego produktu), w
produkcji czekolady mlecznej lipaza powoduje powstawanie kwasów tłuszczowych, które
poprawiają jej smak i aromat,
przemysł tłuszczowy-modyfikacja tłuszczów, niekorzystna w przypadku transportu i
przechowywania nasion oleistych, przy zbyt wysokiej zawartości wody wzrasta kwasowość
nasion co niekorzystnie wpływa z uwagi na zachodzącą pod wpływem lipazy hydrolizę
acylogliceroli i uwalnianie kwasów tłuszczowych,
przemysł skórzany-odtłuszczanie skór, wełny, szczeciny,
przemysł tekstylny-produkcja jedwabiu, odtłuszczanie włókien,
przemysł chemiczny-składnik detergentów, bioemulgatorów do produkcji środków piorących,
preparatów usuwających tłuste plamy z tekstyliów,
przemysł farmaceutyczny-otrzymywanie preparatów leczniczych, leków wspomagających
działanie trzustki i wątroby.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
WYKONANIE ĆWICZENIA
Aktywność lipazy określa się na podstawie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych, w czasie
działania enzymu w optymalnych warunkach w substracie zawierającym tłuszcz. Ilość uwolnionych
kwasów tłuszczowych w próbkach badanego substratu, pobieranych w kolejnych odstępach czasu,
oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem wodorotlenku potasowego wobec
fenoloftaleiny jako wskaźnika.
Cześć analityczna
Materiały i odczynniki:

















Kolba (250-500cm3) – 1szt
Kolba stożkowa (100cm3) – 7szt
3
Kolba stożkowa (300-400 cm ) – 2szt
Cylinder (100cm3)
Pipety (5cm3; 2x10cm3; 25cm3)
Lejek
Łaźnia wodna (38°C)
Zestaw do miareczkowania
Homogenizator
0,05 M roztwór KOH
1% roztwór fenoloftaleiny
Metanol
Badany produkt
Trzustka wieprzowa
Uniwersalne papierki wskaźnikowe
Sączki
Gaza
Postępowanie
Otrzymanie wyciagu lipazy z trzustki
Zhomogenizować 200g świeżej, pokrojonej trzustki wieprzowej z 300cm3 wody destylowanej.
Zawiesinę przesączyć przez gazę. Otrzymany przesącz, stanowiący roztwór enzymu, zobojętnić do pH
7 przy użyciu 0,1M roztworu KOH wobec papierka wskaźnikowego.
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
Oznaczenie
Do kolby stożkowej o pojemności 250cm3 odmierzyć 100cm3 mleka lub śmietanki, a następnie kolbę
umieścić w łaźni wodnej w temperaturze 38°C. Przygotować sześć ponumerowanych kolb stożkowych
o pojemności 100cm3 i do każdej z nich odmierzyć po 25cm3 metanolu. Po upływie 10 minut od
momentu wstawienia kolby z mlekiem do łaźni, dodać do mleka 30cm3 przygotowanego wstępnie
wyciągu enzymatycznego z trzustki i dokładnie wymieszać. Kolbe pozostawić w łaźni wodnej i co kilka
minut powtarzać mieszanie. Po upływie 15 minut od dodania wyciągu enzymatycznego pobrać z
mieszaniny reakcyjnej 10cm3 roztworu do kolby stożkowej o pojemności 100cm3 (próba nr 1). W
analogiczny sposób pobrać kolejne próby w ciągu 90min., w odstępach 15-minutowych (łącznie sześć
prób). Poszczególne próbki miareczkować 0,05 M roztworem KOH wobec fenoloftaleiny, do
pojawienia się lekko różowego zabarwienia.
Próba zerowa
Przenieść 50cm3 uzyskanego na wstępie wyciągu enzymatycznego do kolby stożkowej o pojemności
100cm3 i ogrzewać do wrzenia w celu inaktywacji enzymu. Po oziębieniu gotowanego roztworu
ewentualny wytracony osad odsączyć. Następnie do kolby stożkowej o pojemności 100cm3 (nr 0)
odpipetować 10cm3 mleka lub śmietanki, 3cm3 przesączu z ogrzewanego wyciągu enzymatycznego
oraz 25cm3 metanolu. Próbę miareczkować analogicznie jak próby badane 0,05 M roztworem KOH
wobec fenoloftaleiny. Wyniki zebrać i przedstawić w postaci tabel i wykresów w sprawozdaniu z
ćwiczeń.
• Uzyskane wyniki z miareczkowania zestawić w tabeli.
Nr
Czas
próby
(min.)
0
0
1
15
2
30
3
45
4
60
5
75
6
90
Ilość cm3 0.05M KOH zużytego do miareczkowania
próby:
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)
• Obliczyć mikroekwiwalenty uwolnionych kwasów tłuszczowych z równania:
(A-B) x C x 1000
mikroekw.=
D
Gdzie:
A – ilość cm3 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby właściwej
B – ilość cm3 0,05 M KOH zużyta do miareczkowania próby zerowej
C – molowość użytego do miareczkowania KOH
D – ilość cm3 wyciągu enzymatycznego w próbie poddanej miareczkowaniu
Mikroekwiwalenty kwasów tluszczow
ych
• Sporządzić wykres zależności ilości hydrolizowanych kwasów tłuszczowych (mikroekwiwalenty) w
czasie (min.)
0
15
30
45
60
75
90
Czas [min.]
Create PDF files without this message by purchasing novaPDF printer (http://www.novapdf.com)