Izolacja DNA zd - Uniwersytet Rzeszowski

44
IZOLACJA GENOMOWEGO DNA Z DROŻDŻY PIEKARNICZYCH
SACCHAROMYCES CEREVISIAE Z WYKORZYSTANIEM
ELEKTROFOREZY W ŻELU AGAROZOWYM
W CELU WIZUALIZACJI WYNIKÓW
Autorzy: Sylwia Czyjt, Gabriela Jasińska, Katarzyna Kloc, Małgorzata Piela, Radosław Zawół,
Maciej Kluz
Opiekun: mgr Maciej Kluz
SKN Technologów Żywności „Ferment” Sekcja Biotechnologii i Mikrobiologii
Uniwersytet Rzeszowski, Wydział Biologiczno-Rolniczy
e-mail: [email protected], [email protected], [email protected] , [email protected], [email protected]
Słowa kluczowe: elektroforeza, izolacja, Saccharomyces cerevisiae, DNA
Wstęp
Kto z nas nie widział, jak rośnie ciasto, czy nie pił piwa lub wina? To produkty
wytwarzane przy udziale drożdży. Ale przecież jest to tylko jeden z wielu organizmów
związanych z człowiekiem od zarania cywilizacji. Dlaczego więc akurat drożdże stały się tym
pierwszym organizmem eukariotycznym, którego genom poddano tak intensywnym badaniom?
Drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae), jako odrębny gatunek opisano
w roku 1883. Ten prosty, jednokomórkowy grzyb zaliczany do workowców jest organizmem
"przyjaznym" człowiekowi nie tylko ze względu na swą użyteczność kulinarną; nie jest również
zakaźny, a więc praca z nim nie pociąga za sobą ryzyka zachorowania. Eksperymentowanie
z drożdżami nie nastręcza również problemów etycznych. Przynajmniej takich, z jakimi
borykają się badacze prowadzący doświadczenia na zwierzętach. Podobnie jak Escherichia coli
wśród bakterii, tak drożdże wśród organizmów eukariotycznych są szeroko wykorzystywanym
modelowym obiektem badań. Drożdże pod względem budowy komórki, jak i przebiegu
szlaków metabolicznych, w dużej mierze przypominają organizmy wielokomórkowe
z człowiekiem włącznie. Model to tym bardziej atrakcyjny, że 75 % jego genomu zajmują geny,
a tylko 25 % to sekwencje niekodujące. U człowieka sytuacja jest odmienna - większość, bo aż
95 % genomu, to niekodujące "wypełnienie", którego rola ciągle jest mało zrozumiała, a geny
stanowią pozostałe 5 %. Oznacza to w uproszczeniu, że znalezienie nowego genu u drożdży
wymaga około piętnastokrotnie mniejszego nakładu pracy niż u człowieka [3,4].
Od
pierwszego
opisania
gatunku
do
lat
osiemdziesiątych
naszego
stulecia
zidentyfikowano ponad tysiąc genów drożdżowych rozmieszczonych na 16 chromosomach.
Drożdże stały się jednym z najlepiej poznanych organizmów żywych. Jednak, mimo wiedzy
i doświadczenia kilku tysięcy naukowców pracujących na całym świecie nad drożdżami, tempo
odkrywania nowych genów wyraźnie słabło. W takiej właśnie sytuacji przystąpiono do
45
realizacji projektu sekwencjonowania całego drożdżowego genomu, czyli systematycznego
ustalania jego sekwencji nukleotydowej [5].
Międzynarodowa współpraca 600 naukowców sponad 100 laboratoriów doprowadziła do
tego, że 24 kwietnia 1996 roku w sieci Internet udostępniona została pełna sekwencja
nukleotydowa genomu drożdży piekarniczych. Tym samym weszły one do historii genetyki
jako pierwszy organizm eukariotyczny, którego genom został w całości odczytany. Wstępna
analiza komputerowa genomu ujawniła, oprócz tysiąca wcześniej opisanych genów
drożdżowych, prawie 5000 nowych. Nie wiemy jeszcze, czy wszystkie one obecnie
funkcjonują, czy też są tylko "niemymi" świadkami ewolucji. Blisko 3000 genów wykazuje
istotny stopień podobieństwa do genów uprzednio odkrytych w innych organizmach. Z tego
około 1/3 jest podobnych do genów ludzkich kodujących białka biorące udział w tak
podstawowych procesach jak replikacja i naprawa DNA, synteza białek oraz transport przez
błony. Dodatkowo w tej grupie znajdują się geny niezwykle interesujące dla lekarzy, gdyż
mutacje w ich ludzkich odpowiednikach wywołują wiele chorób nowotworowych oraz zaburzeń
układu nerwowego i kostnego. Tak znaczne podobieństwo do genów człowieka oraz łatwość
prowadzenia badań w komórkach drożdżowych być może uczynią z tych grzybów atrakcyjny
model do badania mechanizmów zmian nowotworowych [4].
Wraz z rozwojem wiedzy o budowie materii pojawiła się potrzeba rozdzielania cząsteczek
wykazujących zróżnicowane właściwości. Opracowano szereg metod, opierających się na
wykorzystaniu różnych zjawisk fizycznych, w celu separacji makrocząsteczek ze względu na
ich cechy. Spośród tych metod najbardziej popularnymi technikami stały się techniki
elektroforetyczne.
Elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym, w którym pod wpływem przyłożonego
pola elektrycznego przemieszczają się makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym
ładunkiem
elektrycznym.
Prędkość
przemieszczania
się
naładowanej
elektrycznie
makrocząsteczki zależy od jej ładunku, rozmiaru, kształtu oraz oporów ruchu środowiska.
W elektroforezie żelowej DNA ośrodkiem, w którym przemieszczają się badane
substancje jest żel elektroforetyczny wykonany z agarozy, uformowany w płytkę długości
kilkunastu do kilkudziesięciu centymetrów. Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się
w zagłębienia w żelu- studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej
gęstości, dzięki czemu rozpływa się na dnie studzienki a po włączeniu zasilania migruje do żelu,
jako wąski prążek. Żel agarozowy zanurzony jest w przewodzącym prąd roztworze buforowym.
Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki biegną elektrody, do
których przykłada się stałe lub asymetryczne, pulsujące napięcie elektryczne rzędu 50-3000 V.
Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze)
46
cząsteczki oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Do żelu dodajemy substancję
barwiącą DNA – bromek etydyny [2].
Bromek etydyny jest to organiczny związek chemiczny interkalujący w DNA. Pod
wpływem promieniowania UV fluoryzuje w kolorze różowo-pomarańczowym.
Intensywność fluorescencji wzrasta około 20x po przyłączeniu do DNA, pozwalając
tym samym na obrazowanie prążków DNA w żelu. Jest to silny mutagen o działaniu
kancerogennym i teratogennym [2].
Elektroforeza powszechnie stosowana jest w takich dziedzinach jak: biochemia białek
i kwasów nukleinowych, biologia molekularna, farmakologia, medycyna sądowa, weterynaria,
diagnostyka medyczna oraz kontrola jakości żywienia.
Znanych jest wiele procedur izolacji DNA, w wyniku, których otrzymuje się DNA
biologicznie aktywny, chemicznie stabilny oraz wolny od RNA i białek. Jednakże ze względu
na wielkość i wrażliwość chromosomalnego DNA praktycznie niemożliwa jest jego izolacja
w formie niezmienionej. Część DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom. Opracowanie
procedury izolacji DNA wymaga szerokiej wiedzy na temat jego chemicznej stabilności
iwarunków w jakich znajduje się w swoim naturalnym środowisku (komórka) [1].
Materiał i Metody
Wirówka Eppendorf 12 – 14 000 obr./min.; Zestaw do elektroforezy poziomej BIO-RAD,
Transiluminator UV firmy UVP
Do izolacji DNA użyto trzy rodzaje drożdży piekarniczych pochodzące od różnych
producentów.
Odczynniki:







0,8 % żel agarozowy: (0,4g agarozy na 50 ml TAE 1x)
bufor TAE 1x 50 ml: (4,84 g Tris-Base; 2 ml 0,5 M EDTA; 1,142 ml 99% lodowy kwas
octowy; pH 8, woda)
bromek etydyny: 3 µl na 50 ml
bufor obciążający 6x: (błękit bromofenolowy; 10% SDS; 0,5 M EDTA; glicerol)
bufor TE: (1 M Tris – HCl pH 8; 0,5 M EDTA pH 8; woda)
96 % etanol
Roztwór I: skład na 2 ml: (40 µl Triton X-100; 250 µl 10 % SDS; 40 µl 5 M NaCl;
25 µl 1 M Tris o pH 8; 4 µl 0,5 M EDTA) [1]
Izolacja DNA z drożdży piekarniczych
1.
Przygotowano wodny roztwór komórek drożdżowych zawieszony w 10 ml wody
dejonizowanej
2.
Zawiesinę drożdży rozlano po 1,5 ml do probówek typu Epperndorf i wirowano 10 min
przy prędkości 4000 rpm
47
3.
Następnie zlano supernatant
4.
Do osadu komórek drożdżowych dodano 200 µl roztworu I, 200 µl mieszaniny fenolchloroform i 0,3 g kulek szklanych, całość worteksowano przez 2 min.
5.
Dodano 200 µl TE buforu, następnie wirowano przez 5 min przy prędkości 13 200
obrotów/min.
6.
Po wirowaniu supernatant przeniesiono przy użyciu pipety do nowych eppendorfów
i dodano po 1 ml 96 % etanolu
7.
Mieszaninę wirowano przez 2 min przy prędkości 13200 rpm., zlano supernatant
dodano 400 µl TE buforu, oraz RNA-zę w stężeniu 10 mg/ml
8.
Po dodaniu RNA-zy, roztwór inkubowano przez 5 min. w temp 37 °C, dodano 18 µl
5 M octanu amonu i 1 ml 96 % etanolu
9.
Mieszaninę wirowano przez 10 min przy prędkości 13200 rpm.
10. Otrzymany osad DNA suszono przez 15 min w temp 37 °C
11. Po wysuszeniu DNA zawieszono w 50 µl wody dejonizowanej [1]
Rozdział elektroforetyczny wyizolowanego DNA
1.
Przygotowano 0,8 % żel agarozowy i umieszczono w aparacie do elektroforezy
poziomej
2.
Do studzienek w żelu naniesiono po 2 µl wyizolowanego DNA zmieszanego
z 5 µl buforu do nanoszenia próbek
3.
Rozdział DNA przeprowadzono przy stałym napięciu 80 V przez 45 min.
4.
Po przeprowadzonej elektroforezie żel umieszczono w transiluminatorze i obserwowano
wyniki po naświetleniu promieniami UV [1]
Wyniki
Zastosowanie metody wg protokołu Ambergsa pozwoliło na wyizolowanie DNA, a następnie
jego wizualizację w żelu jak na rys.1.
Genomowe DNA
Rys. 1 Genomowe DNA Saccharomyces cerevisiae po wybarwieniu bromkiem etydyny
w żelu agarozowym
48
Wnioski
1.
W wyniku zastosowania wyżej opisanej metody udało się wyizolować genomowe
DNA drożdży piekarniczych (Saccharomyces cerevisiae)
2.
Rozdział elektroforetyczny przeprowadzony w żelu agarozowym potwierdził obecność
wyizolowanego DNA
3.
Bromek etydyny zawarty w żelu interkalował nici DNA dzięki czemu po umieszczeniu
żelu w transiluminatorze i naświetleniu go promieniami UV obserwowano silnie
świecące pomarańczowo-żółte prążki w żelu
4.
Metoda ta z powodzeniem może być wykorzystywana do szybkiej izolacji genomowego
drożdżowego DNA
5.
Genom drożdżowy ma wielkość ok. 12 mln par zasad dlatego podczas zwykłej
elektroforezy w żelu agarozowym nie jesteśmy w stanie odróżnić genomu 3 rodzajów
drożdży pochodzących od różnych producentów, dlatego widoczne są one w jednej lini.
Do rozdzielenia takich genomów potrzebne byłoby przeprowadzenie elektroforezy
pulsacyjnej
Literatura
1.
2.
3.
4.
5.
Amberg David C., Burke Daniel J., Strathern Jeffrey N. 2007. Isolation of Plasmid DNA
from Yeast Cells: A Ten-Minute Preparation
Brown T. A. 2001. Genomy. Wyd. PWN. Warszawa.
Chmiel A. 2001. Biotechnologia. Wyd. PWN. Warszawa.
Skała J. 1997. Drożdże w komputerze. Wiedza i Życie, 1.
Drożdże jako organizm modelowy. Genetyka z inżynierią genetyczną. 2005. Skrypt Wydział
Biologii UW
ISOLATION DNA FROM YEAST CELLS SACCHAROMYCES CEREVISIAE WITH USING
ELECTROPHORESIS TO VISUALISATION RESULTS
Summary
The method utilized the molecular characteristics of covalently closed circular deoxyribonucleic
acid (DNA) that is released from cells under conditions that denature chromosomal DNA by using
alkaline sodium dodecyl sulfate (pH 12.6) at elevated temperatures. Proteins and cell debris were removed
by extraction with phenol-chloroform. Under these conditions chromosomal DNA concentrations were
reduced or eliminated. The clarified extract was used directly for electrophoretic analysis. These
procedures also permitted the selective isolation of plasmid DNA that can be used directly in nick
translation, restriction endonuclease analysis, transformation, and DNA cloning experiments.
Key words: electrophoresis, isolation, Saccharomyces cerevisiae, DNA