Wykorzystanie odczynu ELISA do poszukiwania przeciwciał dla

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 299 - 304
Natalia Rokosz, Waldemar Rastawicki, Marek Jagielski
Wykorzystanie odczynu ELISA do poszukiwania przeciwciał dla
lipopolisacharydów werotoksycznych pałeczek okrężnicy u osób
podejrzanych o zakażenie szczepem Escherichia coli O104:H4 w Polsce
Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego
– Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie
Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski
Przedstawiono wyniki badania poziomu przeciwciał dla lipopolisacharydów
(LPS) uzyskanych z wybranych serotypów pałeczek okrężnicy u 7 osób podejrzanych w badaniu klinicznym o zakażenie werotoksycznym szczepem E.
coli O104:H4. Diagnostycznie znamienny poziom swoistych przeciwciał dla
LPS tego serotypu stwierdzono u wszystkich 3 osób powiązanych rodzinnym
ogniskiem epidemicznym wywołanym przez pałeczki E. coli O104:H4. Dodatkowo, u dwóch dalszych badanych osób z krwawą biegunką, pochodzących
spoza tego ogniska, stwierdzono występowanie podwyższonego poziomu
przeciwciał, odpowiednio dla LPS pałeczek E. coli serotypu O157 oraz serotypu O103. Uzyskane wyniki wskazują na przydatność badań serologicznych
w laboratoryjnej diagnostyce zakażeń werotoksycznymi szczepami pałeczek
E. coli u ludzi.
Werotoksyczne pałeczki E. coli (VTEC/STEC) odpowiedzialne są za występowanie
u zakażonych nimi ludzi krwawych biegunek, zespołu hemolityczno–mocznicowego (hemolytic–uremic syndrome -HUS) oraz krwotocznego zapalenia okrężnicy (haemorrhagic
colitis-HC) (12,15). Drobnoustroje te należą do różnych grup serologicznych, z tym że
najczęściej spotyka się chorobotwórcze szczepy wśród pałeczek okrężnicy należących do
grupy serologicznej O157 oraz, znacznie rzadziej do O26, O103, O111, O121, O145 (15).
Zakażenia werotoksycznymi szczepami E. coli powodują najczęściej zachorowania sporadyczne oraz małe epidemiczne ogniska, ograniczone z reguły do członków najbliższej
rodziny (12). Ze względu jednak na swój wysoki potencjał chorobotwórczy, szczepy te mogą
niekiedy wywoływać także zakażenia obejmujące duże skupiska ludności. W maju i czerwcu
bieżącego roku, początkowo w Niemczech a później w pozostałych krajach europejskich,
a nawet w USA i w Kanadzie, wystąpiło ognisko zakażenia werotoksycznymi pałeczkami
E. coli O104:H4. Zakażenie tym szczepem wykryto ogółem u 4321 osób w Niemczech,
z czego u 852 osób wystąpił zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS) z licznymi przypadkami śmiertelnymi oraz 76 osób w innych krajach europejskich (w tym 49 przypadków
HUS i jeden zgon) (2).
300
N. Rokosz, W. Rastawicki, M. Jagielski
Nr 4
Pomimo tego, że w rutynowej diagnostyce zakażeń pałeczkami VTEC stosuje się głównie
metody hodowlane, to jednak ze względu na krótki okres wydalania tych drobnoustrojów
z kałem (średnio do 6-7 dni) ich izolacja nie zawsze jest możliwa (15). W tych przypadkach
oznaczenie poziomu przeciwciał dla tych drobnoustrojów w próbkach surowicy osób chorych pozwoliłoby wykryć przyczynę zakażenia. Dodatkowo, wyniki badań serologicznych
mogłyby być wykorzystane w retrospektywnych badaniach dotyczących rozpowszechnienia
zakażeń wywoływanych przez pałeczki VTEC w populacji (7, 12).
Celem podjętych badań była próba wykorzystania odczynu ELISA do poszukiwania
przeciwciał dla lipopolisacharydów werotoksycznych pałeczek okrężnicy u osób podejrzanych o zakażenie szczepem Escherichia coli O104:H4 w Polsce.
MATERIAŁ I METODY
Próbki surowicy. Głównym przedmiotem badań było 11 próbek surowicy uzyskanych
w czerwcu 2011 roku od 7 osób zamieszkałych w Polsce, podejrzanych w badaniu klinicznym
o zakażenie werotoksycznym szczepem pałeczek E. coli O104:H4. Od 3 osób uzyskano
po jednej próbce surowicy natomiast od 4 osób chorych po dwie próbki, w odstępach 2-3
tygodniowych. W próbkach kału dwóch pacjentów: 7-letniego chłopca z objawami HUS oraz
jego 68-letniej opiekunki wykazano obecność werotoksycznego szczepu E. coli serotypu
O104:H4. U trzeciej osoby, powiązanej epidemiologicznie z tym ogniskiem, 37-letniego
ojca chłopca, który tydzień wcześniej powrócił z Niemiec i w wywiadzie podał przebycie
krwawej biegunki, nie stwierdzono obecności werotoksycznych pałeczek E. coli. Pozostałe
osoby podejrzane o zakażenie pałeczkami E. coli O104:H4 pochodziły z różnych regionów
kraju i nie były związane z rodzinnymi ogniskami epidemicznymi. Nie wyizolowano od
nich werotoksycznych pałeczek E. coli. Dodatkowo, w celu wyznaczenia diagnostycznie
znamiennego poziomu przeciwciał, zbadano próbki surowicy uzyskane od 75 klinicznie
zdrowych osób – krwiodawców.
Odczyn serologiczny. W badaniach wykorzystano test ELISA opracowany we
własnym zakresie. Przeprowadzano go na metapleksowych płytkach firmy Nunc zgodnie
z metodyką opisaną w poprzednich publikacjach, oznaczając poziom przeciwciał klasy IgA,
IgG oraz IgM (14). Jako antygeny w odczynie ELISA wykorzystano preparaty lipopolisacharydów uzyskane we własnym zakresie zmodyfikowaną metodą Boivina (14) ze szczepów
E. coli należących do następujących grup serologicznych: O26, O103, O104, O111, O121,
O145 oraz O157. W wyniku przeprowadzonego miareczkowania metodą szachownicy
ustalono użytkowe stężenie wszystkich preparatów LPS na 25 µg/ml.
WYNIKI
W pierwszym etapie badań, w celu ustalenia diagnostycznie znamiennego poziomu
przeciwciał w odczynie ELISA dla każdego preparatu antygenowego, wyznaczono wartość cut-off, obliczoną na podstawie wyników badania próbek surowicy uzyskanych od 75
krwiodawców (średnia wartość arytmetyczna plus dwa odchylenia standardowe).
Przeprowadzone badania próbek surowicy uzyskanych od 7 chorych, podejrzanych
o zakażenie werotoksycznymi szczepami okrężnicy, wykazały u trzech osób diagnostycznie
Nr 4
Serodiagnostyka zakażeń E. coli O104:H4
301
znamienny poziom przeciwciał dla LPS z pałeczek E. coli O104:H4, u jednej osoby dla
LPS pałeczek E. coli O157 i u jednej dla LPS pałeczek E. coli O103. U żadnej z badanych
osób chorych nie stwierdzono podwyższonego poziomu przeciwciał dla LPS uzyskanych
z pałeczek E. coli należących do grupy serologicznej O26, O111, O121 i O145.
W tabeli I przedstawiono szczegółowe wyniki badania próbek surowicy uzyskanych
dwukrotnie w różnym okresie choroby od trzech osób z rodzinnego ogniska epidemicznego
wywołanego przez pałeczki E. coli O104:H4. W próbkach surowicy uzyskanych w ostrej
fazie choroby od syna i ojca wykazano diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał klasy
IgA, IgG i IgM natomiast w próbce surowicy opiekunki wyłącznie przeciwciał klasy IgA
dla LPS pałeczek E. coli O104. We wszystkich trzech próbkach surowicy uzyskanych od
tych samych pacjentów po 2 tygodniach od momentu pobrania pierwszej próbki stwierdzono spadek poziomu swoistych przeciwciał klasy IgA. W próbce surowicy uzyskanej
od 7-letniego chłopca w przewlekłej fazie choroby stwierdzono również spadek poziomu
przeciwciał klasy IgG i przede wszystkim bardzo wyraźny spadek poziomu przeciwciał
klasy IgM dla LPS pałeczek E. coli serotypu O104.
Tabela I. Wyniki badania odczynem ELISA próbek surowicy uzyskanych od trzech osób z rodzinnego
ogniska epidemicznego wywołanego przez werotoksyczne pałeczki E. coli O104:H4.
Pacjent
Wiek
Syn
7 lat
Ojciec
37 lat
Opiekunka
68 lat
Okres choroby
Ostry
Przewlekły
Ostry
Przewlekły
Ostry
Przewlekły
Poziom przeciwciał (OD450/640nm) dla LPS E. coli
O104:H4w klasie przeciwciał:
IgA
IgG
IgM
1,70
1,68
1,42
0,98
1,10
0,56
1,54
1,16
1,06
1,25
1,10
1,15
1,40
0,61
0,55
1,10
0,46
0,46
Wartości diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał (cut-off): IgA≥0,68; IgG≥1,0; IgM≥0,95.
DYSKUSJA
W prezentowanej pracy przedstawiono wyniki poszukiwania przeciwciał dla preparatów
lipopolisacharydowych uzyskanych ze szczepów E. coli należących do grup serologicznych:
O26, O103, O104, O111, O121, O145 oraz O157 w próbkach surowicy osób podejrzanych
w badaniu klinicznym o zakażenie werotoksycznymi pałeczkami okrężnicy. U osób tych
stwierdzono występowanie krwawej biegunki, a u 7-letniego chłopca również zespołu hemolityczno-mocznicowego. O ile w przypadku chłopca i jego opiekunki, zakażenie pałeczkami
E. coli O104:H4 zostało potwierdzone metodami hodowlanymi to w przypadku ojca nie
udało wyizolować drobnoustroju z próbek kału. Jednakże jak wynika z danych epidemiologicznych, to właśnie ojciec, u którego doszło do zakażenia kilkanaście dni wcześniej, był
źródłem werotoksycznych pałeczek odpowiedzialnych za wywołanie objawów chorobowych
u syna i jego opiekunki. Przykład tego rodzinnego ogniska epidemicznego najlepiej ilustruje
302
N. Rokosz, W. Rastawicki, M. Jagielski
Nr 4
jak krótko werotoksyczne pałeczki E. coli przebywają w układzie pokarmowym zakażonych
osób oraz potwierdza przydatność poszukiwania swoistych przeciwciał u osób chorych.
Wykazanie u dwóch dalszych osób z objawami krwawej biegunki, diagnostycznie
znamiennego poziomu przeciwciał, we wszystkich trzech klasach immunoglobulin, dla
LPS pałeczek E. coli z grupy serologicznej O103, a zwłaszcza O157, może przemawiać za
tym, że zakażenie werotoksycznymi pałeczkami jest częstą przyczyną takich dolegliwości.
Oczywiście te wstępne wyniki powinny być potwierdzone badaniami przeprowadzonymi na
reprezentatywnej grupie surowic uzyskanych od osób podejrzanych w badaniach klinicznych
o zakażenie pałeczkami VTEC.
Przydatność poszukiwania swoistych przeciwciał dla antygenów werotoksycznych
pałeczek E. coli u osób z krwawą biegunką i zespołem HUS opisywana była także przez
innych autorów. Chart i wsp. (3, 4,5,6,7,10) wykazali, że osoby zakażone werotoksycznymi
pałeczkami E. coli O157 wytwarzają swoiste przeciwciała dla LPS tych bakterii, utrzymujące się niekiedy na diagnostycznie znamiennym poziomie przez kilka kolejnych miesięcy.
Najczęściej u osób zakażonych, zwłaszcza w początkowej fazie choroby, stwierdzano
wysoki poziom przeciwciał klasy IgM. Przeciwciała klasy IgA występowały tylko u 76%
badanych pacjentów z objawami HUS, w zdecydowanej większości łącznie z przeciwciałami klasy IgG i IgM. Według tych autorów podwyższony poziom przeciwciał klasy IgG dla
LPS pałeczek E. coli O157 może świadczyć nie tylko o przebytym objawowym zakażeniu
werotoksycznymi pałeczkami ale może również wynikać z bezpośredniego, stałego kontaktu
badanych osób z bydłem, będącym nosicielami tych drobnoustrojów (3, 15).
Ludwig i wsp. (11) badając próbki surowicy dzieci zakażonych pałeczkami E. coli O157,
z objawami krwotocznej biegunki i HUS, stwierdzili, że diagnostycznie znamienny poziom
immunoglobulin klasy M oraz G dla LPS utrzymywał się przez 11 tygodni natomiast klasy
A tylko przez 5 tygodni. Zaobserwowali oni, że w ciągu pierwszego tygodnia dochodzi do
znaczącego wzrostu przeciwciał klasy IgA i IgM natomiast poziom przeciwciał klasy IgG
osiąga swoje maksimum w przeciągu trzech tygodni od wystąpienia objawów zakażenia .
Wielu badaczy podczas opracowywania odczynu ELISA do serodiagnostyki zakażeń
wywoływanych przez VTEC, a szczególnie przez szczepy E. coli O157, stwierdziło występowanie krzyżowych reakcji pomiędzy przeciwciałami swoistymi dla LPS E. coli O157
a antygenami takich bakterii jak Brucella abortus, Yersinia enterocolitica O9, Vibrio cholerae
O1 Inaba, pałeczek Salmonella grupy N, oraz Citrobacter freundii czy Escherichia hermanni
(3,13). Ponadto, wykazanie podwyższonego poziomu przeciwciał dla LPS pałeczek E. coli
należących do określonych grup serologicznych nie musi świadczyć o zakażeniu szczepami
zdolnymi do produkcji werotoksyn czy też innych czynników chorobotwórczych. Z tych
względów podjęto badania mające na celu wykorzystanie w odczynie ELISA jak i w odczynie
western-immunobloting rekombinowanych białek charakterystycznych dla werotoksycznych
pałeczek E. coli, takich jak: intymina, białko Tir, białka sekrecyjne (EspA i EspB), werotoksyna 1 i werotoksyna 2 (8,10). Wstępne badania wykazały, że najbardziej obiecujące
wydaje się być zastosowanie w odczynach serologicznych jako swoistego antygenu białka
Tir oraz intyminy (8,10).
Nr 4
Serodiagnostyka zakażeń E. coli O104:H4
303
N. R o k o s z , W. R a st a wi c ki , M. Ja gi e l ski
Evaluation of usefulness of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the
detection of antibodies to lipopolysaccharides of VTEC strains in patients suspected for
Escherichia coli O104:H4 infection in Poland.
SUMMARY
The aim of the study was to investigate the presence of antibodies to lipopolysaccharides obtained
by modified Boivin’s method from E. coli serotype O104:H4 and O26, O103, O111, O121, O145,
O157 in sera of 7 patients with acute diarrhea, suspected in clinical investigation for infection caused
by E. coli O104:H4. Additionally, to determine the cut-off levels, the 75 sera from blood donors were
tested. The high level of antibodies to LPS E. coli O104 was diagnosed in three patients from family
outbreak caused by E. coli serotype O104:H4. In one of those patients, 7-years boy with HUS, we
observed also a significant decrease of level of IgA, IgG and IgM antibodies in serum sample obtained
in chronic phase of the disease. Furthermore, we showed that two others patients with clinical evidence
of VTEC infection, not connected with this family outbreak, had a high level of antibodies to E. coli
of other serotypes: one to O157 and one to O103. We did not observe presence of antibodies to LPS
from E. coli O26, O111, O121 i O145 in the sera of tested patients. In conclusion, we confirmed that
ELISA based on lipopolysaccharides obtained from different serotypes of E. coli may be helpful in
laboratory diagnosis of infection caused by VTEC in humans.
PIŚMIENNICTWO
1. Barrett T, Green J, Griffin P i inni. Enzyme-linked immunosorbent assays for detecting antibodies
to Shiga-like toxin I, Shiga – like toxin II, and Escherichia coli O157: H7 lipopolysaccharide in
human serum. Curr Microbiol 1991; 23:189-95.
2. Buchholz U, Bernand H, Werber D i inni. German outbreak of Escherichia coli O104:H4 associated with sprouts. N Engl J Med 2011; (10.1056/nejmoa1106482 6 nejm.org) (w druku).
3. Chart H, Jenkins C. The serodiagnosis of infections caused by verocytotoxin-producing Escherichia coli. J App Microbiol 1999; 86:731-40.
4. Chart H, Perry N, Cheasty T, Wright P. The kinetics of antibody production to antigens of
Escherichia coli O157 in a pregnant woman with haemolytic uraemic syndrome. J Med Microbiol
2002; 51:522-5.
5. Chart H, Rowe B. A simple dot immunoassay for detecting antibodies to the lipopolysaccharide
of verocytotoxine- producing Escherichia coli in patients with haemolytic uraemic syndrome. J
Microbiol Meth 1997; 28:85-8.
6. Chart H, Rowe B. Improved detection of infection by Escherichia coli O157 in patients with
haemolytic uraemic syndrome by means of IgA antibodies to lipopolysaccharide. J Infect 1992;
24:257-61.
7. Chart H. Serodiagnosis of infections caused by Escherichia coli O157:H7 and other VTEC.
Serodiag Immunother Infect Dis 1993; I:8-12.
8. Jenkins C, Chart H, Smith H i inni. Antibody response of patients infected with verocytotoxin –
producing Escherichia coli to protein antigens encoded on the LEE locus. J Med Microbiol 2000;
49:97-101.
9. Kulkarni H, Goldwater P, Martin A i inni. Escherichia coli ‘O’ group serological responses and
clinical correlations in epidemic HUS patients. Microbiol Infect Dis 2002; 25:249-68.
10. Li Y, Frey E, Mackenzie A i inni. Human response to Escherichia coli O157:H7 infection: antibodies to secreted virulence factors. Infect Immun 2000, 68:5090-5.
304
N. Rokosz, W. Rastawicki, M. Jagielski
Nr 4
11. Ludwig K, Bitzan M, Bobrowski Ch i inni. Escherichia coli O157 fails to induce a long-lasting
lipopolysaccharide specific, measurable humoral immune response in children with hemolyticuremic syndrome. J Infect Dis 2002; 186:566–9.
12. Łoś J, Węgrzyn G. Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące
toksyny Shiga. Post Mikrobiol 2011; 50:175-90.
13. Navarro A, Eslava C, Hernandez U i inni. Antibody responses to Escherichia coli O157 and other
lipopolysaccharides in healthy children and adults. Clin Diag Lab Immunol 2003; 10:797-801.
14. Rastawicki W. Humoralna odpowiedź na wybrane antygeny pałeczek Yersinia enterocolitica
i Yersinia pseudotuberculosis w przebiegu jersiniozy u ludzi. III. Występowanie i poziom przeciwciał dla antygenu wspólnego pałeczkom enterobacteriacae (ECA). Med Dośw Mikrobiol
2007, 59:93-102.
15. Szych J. W etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka ostrych zakażeń i zarażeń przewodu pokarmowego oraz zatruć pokarmowych. Pod redakcją Marka Jagielskiego. Biblioteka Diagnosty
Laboratoryjnego. Fundacja Pro Pharmacia Futura, Warszawa 2011, str. 17-89.
Otrzymano: 10 XI 2011r.
Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24,
Zakład Bakteriologii NIZP – PZH w Warszawie