Porównanie metody diagnostycznej Real-Time PCR z

advertisement
Ewa Skulska
Porównanie metody diagnostycznej Real-Time
PCR z tradycyjną diagnostyką
bakteriologiczną i metodą
immunofluorescencji bezpośredniej
wykorzystywaną do rozpoznania infekcji
Neisseria gonorrhoeae i Chlamydia
trachomatis.
Praca doktorska
2016
Promotor:
Promotor pomocniczy:
Miejsce wykonywania pracy doktorskiej:
dr hab. n. med. Magdalena Malejczyk
dr n. med. Beata Młynarczyk
Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii,
Zakład Diagnostyki Chorób Przenoszonych
Drogą Płciową, Katedra i Zakład Mikrobiologii
Lekarskiej.
1 Streszczenie
1.1 Wstęp
Zakażenia N. gonorrhoeae i C. trachomatis należą do najczęściej występujących
bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową (Sexually Transmitted Infections –
STI). Według WHO częstość zachorowań na te infekcje stale rośnie. W 2008 roku
stwierdzono na świecie 106 i 105 milionów zakażeń odpowiednio dwoinką rzeżączki
i bakterią chlamydii. W Europie częściej występuje zakażenie C. trachomatis. W 2012
roku w 25 krajach Unii Europejskiej zanotowano średnio na 100 tysięcy mieszkańców
199 przypadków zakażeń C. trachomatis, a tylko 13 przypadków zakażeń
N. gonorrhoeae. Infekcje wywołane przez C. trachomatis często mogą mieć charakter
bezobjawowy. W USA, gdzie od pewnego czasu prowadzi się rutynowo badania
przesiewowe, wykazano, że większość z potwierdzonych przypadków zakażeń
C. trachomatis miało właśnie taki przebieg. W wielu badaniach wykazano również, że
u bezobjawowych mężczyzn wykrywalność chlamydiozy wynosi od 3% do 5%.
Badania przeprowadzone we Francji u aktywnych seksualnie, bezobjawowych osób
poniżej 30 roku życia wykazały, że 0,36% spośród nich było zakażonych rzeżączką.
W Polsce w 2014 roku zachorowalność na rzeżączkę i chlamydiozę, według danych
Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny,
wynosiła odpowiednio 1,19 i 0,42 na 100 tysięcy mieszkańców. Jednak dane dotyczące
Polski nie są w pełni wiarygodne ze względu na brak diagnostyki przesiewowej i brak
zgłaszania wszystkich leczonych przypadków.
Zakażenia N. gonorrhoeae i C. trachomatis wiążą się z ryzykiem groźnych
powikłań, w tym bezpłodności kobiet i zwiększonej liczby ciąż pozamacicznych.
Ciężkie zapalenie spojówek u zakażonych okołoporodowo noworodków może grozić
utratą wzroku. Zwiększa się również 3 – 6 krotnie ryzyko zakażenia wirusem HIV.
Dlatego tak ważne jest szybkie rozpoznanie i leczenie tych infekcji. CDC (Centers for
Disease Control and Prevention, USA) rekomenduje wprowadzenie diagnostycznych
badań przesiewowych w grupie wszystkich kobiet w wieku rozrodczym.
Do niedawna klasyczne metody diagnostyczne w przypadku rzeżączki opierały
się na ocenie preparatu mikroskopowego wydzieliny z cewki moczowej lub szyjki
macicy oraz na hodowli bakteryjnej. W przypadku chlamydiozy diagnostyka opierała
2
się na metodzie immunoenzymatycznej (Enzyme Immunoessay – EIA) lub metodzie
immunofluorescencji bezpośredniej (Direct Immunofluorescence – DIF). Pojawienie się
metod opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych (Nucleic Acid Amplification
Test, NAAT) sprawiło, że diagnostyka chorób zakaźnych, w tym przenoszonych drogą
płciową, stała się bardzo czuła, swoista i szybka. NAAT jest metodą o najwyższej
czułości polegającą na identyfikacji DNA drobnoustroju w badanym materiale.
Obecnie CDC w diagnostyce rzeżączki i chlamydiozy na pierwszym miejscu
zaleca stosowanie NAAT, w tym metodę Real-Time PCR. W przypadku rzeżączki
zalecane jest stosowanie dodatkowo hodowli bakteryjnej w celu monitorowania
antybiotykoodporności. Jako niezalecane wymienione są „metody inne niż NAAT
i hodowla”.
IUSTI (International Union against Sexually Transmitted Infections) również
zaleca w diagnostyce chlamydiozy NAAT, a w diagnostyce rzeżączki NAAT lub
hodowlę, podkreślając, że w przypadku podejrzenia niepowodzenia w leczeniu lepszą
metodą jest hodowla, a w przypadkach bezobjawowych oraz gdy konieczny jest
transport materiału do laboratorium zalecane jest NAAT.
1.2 Cel pracy
Celem przeprowadzonych badań było porównanie efektywności metody opartej
na hodowli w przypadku rzeżączki oraz bezpośredniej immunofluorescencji (DIF)
w przypadku chlamydiozy z metodą Real-Time PCR w laboratoryjnej diagnostyce
rzeżączki i chlamydiozy u chorych zgłaszających się do Poradni przy Klinice
Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego.
1.3 Materiały i metody
Rzeżączka:
Badano materiał pochodzący z wymazów z cewki moczowej, szyjki macicy,
gardła lub odbytu od 94 pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego
Uniwersytetu Medycznego. W grupie tej było 73 mężczyzn i 21 kobiet. Spośród
wszystkich pacjentów 22 osoby zgłosiły się na badanie kontrolne po antybiotykoterapii.
Wśród pozostałych 72 pacjentów, 48 miało objawy mogące sugerować zakażenie
N. gonorrhoeae (wyciek, pieczenie lub dyskomfort w cewce moczowej, ból gardła, ból
3
lub wydzielina zapalna z odbytu, u kobiet upławy, pobolewania w podbrzuszu), 8 osób
nie miało objawów, ale zgłaszało ekspozycję na zakażenie (kontakt seksualny z osobą
zakażoną), a 16 osób nie wykazywało żadnych objawów, ani nie miało kontaktów
seksualnych z osobami chorymi na STI.
Materiał do posiewu pobierano za pomocą ezy jednorazowego użytku. Posiew,
bezpośrednio po pobraniu materiału, wykonywano na agarze czekoladowym
z antybiotykami (bioMerieux), hodowlę prowadzono przez 24 godziny w atmosferze
zawierającej 5% CO2, w temperaturze 37⁰ C. Zakażenie potwierdzano na podstawie
morfologii kolonii bakteryjnych w hodowli, morfologii komórek w preparatach
mikroskopowych barwionych metodą Gram’a, wyników testu oksydazowego oraz testu
fermentacji cukrów (API NH, bioMerieux, Francja).
Chlamydioza:
Do badania zostało zakwalifikowanych 152 pacjentów Kliniki Dermatologii
i Wenerologii WUM. W badanej grupie 59 osób prezentowało objawy kliniczne
chlamydiozy (wyciek, pieczenie lub dyskomfort w cewce moczowej, ból gardła, ból lub
wydzielina zapalna z okolicy odbytu, u kobiet upławy, pobolewanie w dole brzucha),
8 osób miało kontakt z osobami zakażonymi C. trachomatis, a 24 osoby zgłosiły się na
badanie kontrolne po antybiotykoterapii. 61-osobową grupę kontrolną stanowili zdrowi
pacjenci, którzy nie zgłaszali żadnych dolegliwości, nie prezentowali żadnych objawów
chorobowych i nie mieli kontaktów seksualnych z chorymi na STI, a powodem ich
przyjścia do naszej placówki była chęć wykonania badań diagnostycznych w kierunku
chorób przenoszonych drogą płciową. Do tej grupy zakwalifikowano również 43
zdrowe kobiety, które zostały skierowane do nas z kliniki ginekologicznej na badanie
w kierunku chlamydiozy, w celu dopełnienia procedury kwalifikacyjnej do zabiegu
zapłodnienia „in vitro” (program prowadzony przez Klinikę Ginekologii WUM).
Materiał (cewka moczowa, szyjka macicy, gardło, odbyt) do metody DIF
pobierano bawełnianą sterylną wymazówką firmy Copan, Włochy.
Do przeprowadzenia badania metodą DIF wykorzystano gotowy zestaw –
MicroTrack Chlamydia trachomatis Direct Specimen Test, firmy Trinity Biotech. Test
ten służy do wykrywania ciałek podstawowych EB (Elementary Body) C. trachomatis
w materiale bezpośrednio pobranym od pacjenta. Pobrany materiał służył do wykonania
rozmazu na specjalnym szkiełku przeznaczonym do badania mikroskopowego. Po
wyschnięciu
rozmaz
utrwalano
metanolem,
a
następnie
poddawano
reakcji
4
z przeciwciałami
monoklonalnymi
znakowanymi
fluoresceiną
(Fluorescein
isothiocyanate – FITC), skierowanymi przeciwko antygenom zewnętrznej błony
komórkowej
EB
C.
trachomatis.
Preparaty oglądane
były
w
mikroskopie
fluorescencyjnym (Axioskop firmy Opton) z obiektywami immersyjnymi 40x i 100x.
Wynik dodatni stwierdzano na podstawie obecności w preparacie co najmniej 10 EB
C. trachomatis. Jako wynik ujemny przyjęto preparaty, w których obecne były tylko
komórki nabłonkowe zabarwione na czerwono, a jaskrawozielone nieregularne punkty
traktowano jako artefakty. Wynik uznawano za ujemny tylko wtedy, gdy w preparacie
widoczne były wybarwione na czerwono komórki nabłonka, co świadczyło o tym, że
materiał został prawidłowo pobrany od pacjenta.
Diagnostyka metodą Real-Time PCR w przypadku obydwu drobnoustrojów
została przeprowadzona w identyczny sposób:
W celu wyizolowania DNA N. gonorrhoeae i C. trachomatis materiał pobierano
z tych samych okolic, jak w przypadku diagnostyki klasycznymi metodami, używając
wymazówki transportowej Transystem firmy Copan, Włochy.
Izolacja DNA z pobranych próbek została przeprowadzona przy użyciu
komercyjnego zestawu DNA Bact Extra Pure Kit firmy Euroclone®. Procedurę
przeprowadzono według protokołu podanego przez producenta. Metoda oparta jest na
adsorpcji DNA na specjalnej kolumnie. Procedurę izolacji DNA wykonywano
natychmiast po uzyskaniu materiału badawczego lub w ciągu 24 godzin. Do czasu
izolacji DNA wymazówka z pobranym materiałem przechowywana była w temp 5 – 8⁰
C. Wyizolowane DNA przechowywano w temperaturze -20⁰ C do czasu wykonania
reakcji amplifikacji. W celu wykrycia w badanych próbach DNA N. gonorrhoeae
i C. trachomatis wykorzystano reakcję Real-Time PCR. Metoda ta pozwala śledzić
proces amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym dzięki wykorzystaniu zjawiska
fluorescencji, a także pozwala oznaczyć ilość produktu w fazie jego wykładniczego
wzrostu. W metodzie tej każda sonda, czyli krótki fragment DNA komplementarny do
sekwencji znajdujących się na początku i końcu poszukiwanego genu, posiada na końcu
5’ cząsteczkę fluorochromu, zaś na końcu 3’ wygaszacz. Bliskie położenie obu
cząsteczek tłumi fluorescencję wzbudzanego fluorochromu. Na etapie wydłużania nici
DNA dochodzi do hydrolizy sondy przez polimerazę Taq posiadającą także aktywność
5-egzonukleazy, co powoduje oddzielenie się fluorochromu od cząsteczki wygaszacza
i wyzwala zjawisko fluorescencji. Doświadczenia zostały wykonane na termocyklerze
5
SmartCycler® Dx przy użyciu komercyjnego zestawu amplifikacyjnego odpowiednio
DUPLICα® RealTime Neisseria gonorrhoeae 2nd Generation Detection KIT
(Euroclone®) oraz DUPLICα® RealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis
Kit (Euroclone®) zgodnie z zaleceniami producenta. Startery i sonda użyte do badań
w kierunku N. gonorrhoeae służą do wykrywania sekwencji DNA w obrębie plazmidu
pJD1 i genu 16S rRNA. W przypadku diagnostyki zakażeń C. trachomatis poszukiwane
są sekwencje w obrębie plazmidu oraz genu 16S rRNA. Dokładna sekwencja starterów
i sond oraz dokładne miejsce ich przyłączenia stanowią tajemnicę firmy. Zestawy
posiadają
kontrolę
wewnętrzną,
której
rolą
jest
wykluczenie
ewentualnego
zahamowania reakcji PCR. Sonda typu TaqMan® dla wykrycia N. gonorrhoeae oraz
C. trachomatis
została
fluorescein) oraz
wyznakowana
wygaszaczem
fluorochromem
typu
FAM
(6-carboxy-
BHQ-1. Sonda wykorzystywana
w kontroli
wewnętrznej zestawu została wyznakowana fluorochromem typu HEX (hexachloro-6carboxyfluorescein) oraz wygaszaczem BHQ-1.
1.4 Wyniki
Rzeżączka (NG):
Ogółem w 94-osobowej grupie pacjentów diagnozowanych w kierunku
N. gonorrhoeae wyniki zgodne – uzyskanie tego samego wyniku zarówno metodą
hodowli, jak i Real-Time PCR (oba wyniki negatywne lub oba wyniki pozytywne)
stwierdzono u 79 osób, co stanowi 84% wszystkich wyników. Wyniki rozbieżne (wynik
hodowli negatywny przy pozytywnym Real-Time PCR) stwierdzono u 15 osób, co
stanowi 16% wszystkich wyników. Nie uzyskano u żadnego pacjenta pozytywnego
wyniku hodowli przy negatywnym wyniku Real-Time PCR. Stosunek liczby
wszystkich wyników zgodnych (WWZ) do liczby wszystkich prób badanych (WPB)
wśród mężczyzn wynosił 0,84, a wśród kobiet 0,86, w grupie pacjentów objawowych
wynosił 0,83, a w grupie pacjentów po leczeniu 0,82. Najniższy współczynnik
WWZ/WPB stwierdzono w grupie pacjentów będących partnerami, a najwyższy
w grupie pacjentów zdrowych i wynosił odpowiednio 0,75 i 0,94.
Stosunek liczby zgodnych wyników dodatnich (ZWD) do liczby wszystkich
wyników dodatnich (WWD) wyniósł 0,44 w grupie wszystkich pacjentów, podczas gdy
w grupie pacjentów objawowych wyniósł on 0,38, w grupie partnerów – 0,6 a w grupie
pacjentów po leczeniu – 0,5.
6
W grupie mężczyzn uzyskano 31% wyników dodatnich wskazujących na
obecność infekcji N.gonorrhoeae (15% obie metody, 16% jedna z metod potwierdziła
infekcję). W grupie kobiet wyniki dodatnie stanowiły 19% (5% obie metody, 14% jedna
metoda).
Chlamydioza (CT):
Ogółem w całej 152-osobowej grupie pacjentów diagnozowanych w kierunku
C. trachomatis wyniki zgodne – uzyskanie tego samego wyniku zarówno metodą DIF
jak i Real-Time PCR (oba wyniki negatywne lub oba wyniki pozytywne), stwierdzono
u 137 osób, co stanowi 90% wszystkich wyników. Wyniki rozbieżne (DIF negatywny
przy pozytywnym Real-Time PCR lub DIF pozytywny przy negatywnym Real-Time
PCR) stwierdzono u 15 osób, co stanowi 10% wszystkich wyników, z tym, że 9% (13
osób) stanowiły ujemne wyniki DIF przy dodatnim wyniku Real-Time PCR oraz 1%
(2 osoby – w obu przypadkach byli to objawowi mężczyźni z wyciekiem z cewki
moczowej i dyzurią) dodatnie wyniki DIF przy ujemnym wyniku Real-Time PCR.
Stosunek liczby wszystkich wyników zgodnych (WWZ) do liczby wszystkich prób
badanych (WPB) wynoszący 0,9 stwierdzono zarówno w grupie obejmującej
wszystkich pacjentów, jak również po wyłączeniu pacjentów po leczeniu. Zwraca
uwagę wysoki stosunek WWZ/WPB = 0,98 w grupie wszystkich kobiet, podczas gdy
w grupie wszystkich mężczyzn wyniósł on 0,84. Najwyższy stosunek WWZ/WPB =
0,97 dotyczył grupy pacjentów zdrowych, czyli bezobjawowych, nie będących
partnerami, ani nie będących po leczeniu. Stosunek WWZ/WPB w grupie pacjentów
objawowych, partnerów i po leczeniu wyniósł odpowiednio 0,85, 0,88 i 0,88.
Stosunek liczby zgodnych wyników dodatnich (ZWD) do liczby wszystkich
wyników dodatnich (WWD) wyniósł 0,42 w grupie wszystkich pacjentów, podczas gdy
w grupie pacjentów objawowych wyniósł on 0,53, a w grupie pacjentów po leczeniu –
0,25.
W grupie mężczyzn uzyskano 28% wyników dodatnich wskazujących na
obecność infekcji C. trachomatis (12% obie metody, 16% jedna z metod potwierdziła
infekcję). W grupie kobiet wyniki dodatnie stanowiły 4% (2% obie metody, 2% jedna
metoda).
7
1.5 Wnioski
1. W diagnostyce zakażeń wywołanych przez N. gonorrhoeae i C. trachomatis
metody molekularne (NAATs) wykazują wyższą czułość niż metody klasyczne.
2. Obie metody klasyczne: hodowla w diagnostyce rzeżączki i DIF w diagnostyce
chlamydiozy wykazują stosunkowo wysoką czułość i wysoką swoistość.
3. W diagnostyce zakażeń wywołanych przez N. gonorrhoeae i C. trachomatis
NAATs znajdują zastosowanie zwłaszcza w przypadkach skąpoobjawowych lub
bezobjawowych oraz w diagnostyce partnerów seksualnych osób zakażonych.
4. W diagnostyce zakażeń wywołanych przez N. gonorrhoeae zlokalizowanych
w gardle NAATs mogą wykazywać niższą swoistość ze względu na możliwość
reakcji krzyżowych.
5. W diagnostyce zakażeń wywołanych przez N. gonorrhoeae hodowla jest
zalecana:
– ze względu na konieczność monitorowania antybiotykoodporności
dwoinek rzeżączki
– w przypadku niepowodzeń terapeutycznych
6. W przypadku diagnostyki molekularnej przeprowadzanej u pacjentów po
leczeniu rzeżączki lub chlamydiozy badanie kontrolne metodą NAAT powinno
odbywać się nie wcześniej niż 2 tygodnie po zakończeniu leczenia
8
Download
Random flashcards
bvbzbx

2 Cards oauth2_google_e1804830-50f6-410f-8885-745c7a100970

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Pomiary elektr

2 Cards m.duchnowski

słowka

2 Cards kksenia.kot1997

Create flashcards