Wytwarzanie penicylinazy przez szczepy Neisseria gonorrhoeae

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: 115 - 120
Beata Młynarczyk-Bonikowska, Grażyna Przedpełska, Magdalena Malejczyk,
Sławomir Majewski
Wytwarzanie penicylinazy przez szczepy Neisseria gonorrhoeae
izolowane od pacjentów kliniki dermatologii i wenerologii WUM
w latach 2006-2009
Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii WUM
Kierownik: prof. dr hab. Sławomir Majewski
Badano wytwarzanie penicylinazy przez izolaty dwoinek rzeżączki wyosobnionych od pacjentów zgłaszających się do Poradni Kliniki Dermatologii
i Wenerologii w latach 2006-2009. Stwierdzono, że powyższy enzym wytwarzało średnio 0,8% badanych szczepów, jest to najniższy odsetek w Europie
i jeden z najniższych na świecie.
Rzeżączka jest częstą chorobą przenoszoną drogą płciową, rozpowszechnioną na całym
świecie. W wielu krajach obserwuje się narastającą oporność czynnika etiologicznego tej
choroby (dwoinki rzeżączki) na antybiotyki. Geny oporności mogą być łatwo przenoszone
z jednego szczepu dwoinek rzeżączki do drugiego a nawet pobierane od innych bakterii np.
niepatogennych dwoinek Neisseria kolonizujących gardło.
Pierwsze przypadki oporności N. gonorrhoeae na penicylinę pojawiły się niedługo po
zastosowaniu tego antybiotyku w leczeniu rzeżączki. Pierwszym poznanym i w dalszym
ciągu istotnym mechanizmem oporności na penicylinę jest wytwarzanie penicylinazy.
Zwykle jest to kodowana przez plazmidy (np. pSJ5.2 o wielkości 5,2 kb) beta-laktamaza
TEM-1(1, 9). Niedawno opisano pojedyncze szczepy wytwarzające beta-laktamazę TEM135 kodowaną przez inne typy plazmidów (15).
Można wyróżnić tzw. PPNG (penicyllinase producing N. gonorrhoeae) oraz PPNG-TRNG (penicyllinase producing N. gonorrhoeae - tetracycline resistant N. gonorrheae),
u których genowi dla penicylinazy towarzyszy gen warunkujący oporność na tetracykliny.
Oporność na tetracykliny zlokalizowana w plazmidach wiąże się z aktywną ochroną miejsca
docelowego dla antybiotyku poprzez produkcję białka TetM (1,9).
Oporność na penicylinę warunkowana przez geny chromosomalne (CMRNG chromosomally mediated resistant N. gonorrhoeae) zwykle wiąże się ze współdziałaniem kilku różnych
mechanizmów. Należą do nich :1.modyfikacja miejsca przyłączenia antybiotyku (mutacje
i reorganizacje w obrębie genu penA kodującego transpeptydazę PBP-2 oraz w mniejszym
stopniu mutacje w genie ponA kodującym PBP-1), 2. aktywne usuwanie leku z komórki
przez białko- pompę błonową Mtr (multiple transferable resistance) CDE. Przyczyną zwiększonego wytwarzania Mtr CDE są mutacje w genach represora lub promotora pompy mtrR,
116
B. Młynarczyk i inni
Nr 2
3. zmniejszenie przepuszczalności błony zewnętrznej dla leku (mutacje genach kodujących
białka porynowe PIB (gen penB) i PIA). U części szczepów opornych stwierdzono również
mutację genu penC kodującego białko sekretyny PilQ (1, 9, 20). W przypadku towarzyszącej
obniżonej wrażliwości na cefalosporyny najważniejszą rolę odgrywają mutacje w genie
kodującym PBP-2, zwykle wiążące się z większymi zmianami w tym genie, niż gdy występuje tylko oporność na penicylinę. U szczepów N. gonorrhoeae o obniżonej wrażliwości
na cefalosporyny opisywano również mozaikową strukturę PBP-2 (20, 4).
Chromosomalna oporność na tetracykliny może być wynikiem mutacji w genie rpsJ
kodującym rybosomalne białko S10 (10).
Oporność na inne antybiotyki jest kodowana przez geny chromosomalne. Przyczyną
oporności na fluorochinolony mogą być mutacje w genach parC i gyrA kodujących podjednostki topoizomerazy IV i topoizomerazy II (gyrazy). Najczęściej są to mutacje powodujące
zamianę aminokwasów GyrA-Ser91Phe/GyrA-Asp95Gly/ParC-Ser87Arg (15).
Oporność na azytromycynę (makrolidy) może być spowodowana przez syntezę metylaz
23SrRNA w podjednostce 50S rybosomu – najczęściej ErmB, a u pojedynczych szczepów
ErmA i ErmF, a także mutacje w obrębie V domeny 23SrRNA (6) oraz mutacje powodujące
aktywację pompy błonowej MtrCDE (16).
Oporność na spektynomycynę wiąże się z mutacjami w genach kodujących 16SrRNA
w podjednostce 30S rybosomu (w wewnętrznym regionie genu rrs zawierającego helix 34:
transwersja G1064C oraz tranzycja C1192U) (9).
Celem pracy było zbadanie wytwarzania penicylinazy przez szczepy rzeżączki izolowane od pacjentów zgłaszających się do Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego
Uniwersytetu Medycznego w latach 2006-2009.
MATERIAŁ I METODY
Materiał pobierano z cewki moczowej, szyjki macicy, gardła lub odbytu od pacjentów
zgłaszających się do Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu
Medycznego w latach 2006-2009. Jako kryterium zapalenia cewki moczowej przyjęto
obecność powyżej 4 leukocytów w polu widzenia mikroskopu przy powiększeniu 100 krotnym. W pozostałych przypadkach stan zapalny rozpoznawano na podstawie objawów
klinicznych lub materiał pobierano od pacjentów z podejrzeniem zakażenia bezobjawowego.
Każdy szczep pochodził od innego pacjenta. Bakterie hodowano na podłożu Roiron (Biomed) w atmosferze wzbogaconej w dwutlenek węgla i identyfikowano przy użyciu testu
oksydazowego i testu wykorzystywania węglowodanów (spośród 5 cukrów N. gonorrhoeae
fermentuje tylko glukozę).
Obecność beta-laktamazy badano w testem jodometrycznym lub testem krążkowym BBL
Cefinase discs (BD). Część próbek zbadano równolegle oboma testami uzyskując identyczne
wyniki. W teście BD BBL na zwilżone wodą destylowaną krążki zawierające chromogeniczny antybiotyk nitrocefinę nanoszono kilka kolonii N. gonorrhoeae. Wynik odczytywano po
co najmniej 1 minucie. W przypadku dodatniego wyniku następowała zmiana koloru krążka
z żółtego na czerwony (spowodowana hydrolizą wiązania amidowego przez beta-laktamazę).
W teście jodometrycznym rozmazy badanych szczepów (o średnicy 2-3mm) na paskach
bibuły skrobiowej nasączonej roztworem penicyliny benzylowej (1000000 jm/0,65ml)
Nr 2
117
Wytwarzanie penicylinazy przez N. gonorrhoeae
inkubowano przez 30 min. w temperaturze 37˚C a następnie pokrywano rozcieńczonym
odczynnikiem Lugola (zabarwienie granatowo-czarne) i odsączano. Wystąpienie odbarwienia
wokół miejsca naniesienia bakterii do 5 min świadczyło o wytwarzaniu beta-laktamazy.
WYNIKI
Dodatnie wyniki posiewów w kierunku N. gonorrhoeae uzyskano u 516 z 1853 przebadanych pacjentów. Tylko w 4 przypadkach na 516, testy na wytwarzanie beta-laktamazy
były dodatnie (0,8%) Dwa przypadki wytwarzania beta-laktamazy przez badane w naszym
laboratorium szczepy dwoinek rzeżączki miały miejsce w 2006r. (183 badane próbki -1,1%)
i po 1 w 2007(111 badanych próbek -0,9%) i 2008(91 badanych próbek 1,1%), a w 2009 r.
nie wykryto ani jednego przypadku (na 94 zbadane dodatnie posiewy). Ponad 90% dodatnich
posiewów w kierunku rzeżączki i wszystkie beta-laktamazo –dodatnie izolaty pochodziły
od mężczyzn (Tabela I).
Tabela I. Wyniki badań mikrobiologicznych w kierunku N. gonrrhoeae w latach 2006-2009
Lata
Liczba
2006
2007
2008
2009
K
M
K
M
K
M
K
M
Wykonanych posiewów
196
419
130
290
105
233
131
303
Wyników dodatnich
Izolatów wytwarzających betalaktamazę
17
166
9
102
6
85
7
94
-
2
-
1
-
1
-
-
DYSKUSJA
Beta-laktamazę wytwarzało zaledwie 0,8% badanych przez nas szczepów N. gonorrhoeae. Jest to wynik wyraźnie niższy w porównaniu z większością opublikowanych danych na
ten temat pochodzących z innych krajów Europy i świata. Wcześniejsze dane pochodzące
z raportów wysyłanych przez Katedrę i Klinikę Dermatologii i Wenerologii do Wojewódzkiej
Stacji Sanitarno-Epidemiologicznej w Warszawie potwierdzają podobny odsetek szczepów
wytwarzających penicylinazę (poniżej 1%) w Polsce w latach 2000-2006.
Badanie wrażliwości N. gonorrhoeae na antybiotyki jest w wielu rejonach świata
objęte specjalnymi programami m.in. GISP(Gonococcal Isolate Surveillence Project)
w USA, Australian Gonococcal Surveillance Programme, Euro GASP (European Gonococcal Antimicrobial. Surveillance Programme), RU-GASP (The Russian Gonococcal
Antimicrobial Susceptibility Programme). W wielu krajach ze względu na wysoki odsetek
szczepów opornych penicylina przestała być zalecana w leczeniu rzeżączki (m.in. wg CDC
centers for disease control and prevention, USA oraz wg IUSTI -The International Union
against Sexually Transmitted Infections), co spowodowało ponowny spadek oporności.
Wytwarzanie penicylinazy przez N. gonorrhoeae w USA spadło z 11% w 1991 do 0,4%
w 2007. Oporność na penicylinę warunkowana przez geny chromosomalne w 1999 w USA
118
B. Młynarczyk i inni
Nr 2
wynosiła 5,7% następnie w 2004 spadła do 1% i w 2007 ponownie wzrosła do 2,5%(5).
W krajach Ameryki Południowej w latach 1990 -1999 wytwarzanie penicylinazy przez
dwoinki rzeżączki wynosiło zależnie od regionu 17,9–38,8%, a chromosomalna oporność
na penicylinę 1,0–11,9% (8). Badania przeprowadzane w 2004 w 12 krajach Europy Zachodniej (Austria, Belgia, Dania, Anglia i Walia, Francja, Grecja, Włochy, Holandia, Portugalia, Szkocja, Hiszpania i Szwecja) wykazały że penicylinazę wytwarza 12,1% (6,7%
PPNG i 5,9% PPNG-TRNG) oporność warunkowana chromosomalnie wynosiła 8,7 % (13).
Dalsze badania w 17 krajach europejskich uczestniczących w programie badania oporności
dwoinek rzeżączki na antybiotyki w latach 2006-2008 wykazały wysoki poziom oporności
na penicylinę u 12% badanych szczepów (7). W Grecji wytwarzanie penicylinazy przez
badane szczepy N. gonorrhoeae zmniejszyło się z 11,6% w 2004 r. do 3,9% w 2008 (19).
W Danii w 2007 r. stwierdzono oporność na penicylinę o różnych mechanizmach u 33,9%
badanych szczepów dwoinek rzeżączki, a beta-laktamazę wytwarzało 7,75% (12). W Rosji
w 2008 beta-laktamazę wytwarzało 2,2% badanych izolatów dwoinek rzeżączki, jednak
odsetek oporności lub obniżonej wrażliwości na penicylinę (we wszystkich mechanizmach)
wynosił 81,3% (11). W Indiach w latach 2002-2006 wyizolowano 16, 5% PPNG, 4,7%
PPNG-TRNG, a u 14,9% badanych izolatów N. gonorrhoeae stwierdzono oporność na
penicylinę warunkowaną chromosomalnie (3). Jeszcze wyższy odsetek szczepów wytwarzających penicylinazę wykazały badania przeprowadzone w Chinach (Nanjing) i w 1999
wynosił on 8%, ale w 2004 wzrósł do 57,36% a w 2006 spadł do 44% (17).W Japonii w latach 2000-2008 penicylinazę wytwarzało około 1,4% badanych szczepów N. gonorrhoeae,
jest to wyraźnie niższy odsetek niż w innych krajach azjatyckich (15). W Australii w latach
1997-2006 oporność na penicylinę różniła się znacznie zależnie od badanego regionu i na
północy kraju wynosiła poniżej 5% (różne mechanizmy). W pozostałych rejonach Australii
penicylinazę wytwarzało 6-14% badanych szczepów, ale oporność o różnych mechanizmach
stwierdzono u prawie 50% izolatów. W 2008 r. Oporność na penicylinę średnia z różnych
rejonów Australii, o różnych mechanizmach wynosiła 44% (18). Wysoki odsetek PPNG
stwierdzono w Afryce Środkowej i Południowej; 25,8% szczepów dwoinek rzeżączki w RPA
i aż 65% w Mozambiku wytwarzało penicylinazę (2, 10).
Wysoka skuteczność kliniczna penicyliny prokainowej stosowanej w poradni Kliniki
Dermatologii i Wenereologii w leczeniu rzeżączki potwierdza uzyskane w tej populacji
wyniki i wskazuje na również niski odsetek oporności związanej z mechanizmami innymi
niż produkcja beta-laktamazy (poniżej 5%).
W podsumowaniu można stwierdzić że mimo stosowania penicyliny w leczeniu zakażeń
N. gonnorhoeae odsetek szczepów wytwarzających beta-laktamazę w Polsce utrzymuje się
na niskim poziomie (średnio 0,8% wszystkich badanych szczepów).
Nr 2
Wytwarzanie penicylinazy przez N. gonorrhoeae
119
B. Młynarczyk-Bonikowska, G. Przedpełska, M. Malejczyk, S. Majewski
Penicillinase production by Neisseria gonorrhoeae strains isolated from the patients of
Dermatology and Wenerology Clinic, Warsaw Medical University in 2006 – 2009
SUMMARY
In recent years the resistance of Neisseria gonorrhoeae to antibiotics is increasing in many
countries. The aim of the study was to investigate penicillinase production by Neisseria gonorrhoeae
strains isolated from the patients of Clinic of Dermatology and Wenerology WUM in a period between
2006 - 2009. We cultured the bacteria on Roiron medium and we used the iodometric test or BBL
Cefinase discs to detect penicillinase. The enzyme was produced by 1,1% of 183, 0,9% of 111, 1,1%
of 94 and 0% of 91 of investigated strains, respectively in 2006, 2007, 2008 and 2009 year -on average
by 0,8%. This is the lowest result in Europe and one of the lowest in the world.
PIŚMIENNICTWO
1. Allen VG, Farrell DJ, Rebbapragada A i inni. Molecular analysis of antimicrobial resistance
mechanisms in Neisseria gonorrhoeae from Ontario, Canada. Antimicrob Agents Chemother,
2010;55: 703-12.
2. Apalata T, Zimba TF, Sturm WA, Moodley P. Antimicrobial susceptibility profile of Neisseria
gonorrhoeae isolated from patients attending a STD facility in Maputo, Mozambique Sex Transm
Dis 2009; 36: 341-3.
3. Bala M, Jain RK, Ray K. Antimicrobial susceptibility profile of resistance phenotypes of Neisseria
gonorrheae in India. Sex Transm Dis 2008; 35: 588-91.
4. Bala M, Sood S Cephalosporin Resistance in Neisseria gonorrhoeae. J Glob Infect Dis 2010; 2:
284-90
5. Centers for Disease Control and Prevention. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2007
Suppl. , Gonococcal Isolate Surveillance Project (GISP) Annual Report 2007. Atlanta, GA: U.S.
Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention,2009.
6. Chisholm SA, Dave J, Ison CA. High-Level Azithromycin Resistance Occurs in Neisseria gonorrhoeae as a Result of a Single Point Mutation in the 23S rRNA Genes. Antimicrob Agents
Chemother 2010, 54: 3812–16.
7. Cole MJ, Chisholm SA, Hoffmann S i inni. European Surveillance of Sexually Transmitted Infections Network European surveillance of antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae.
Sex Transm Infect 2010; 86: 427-32.
8. Dillon JA, Ruben M, Li H, Borthagaray G i inni. Challenges in the control of gonorrhea in South
America and the Caribbean: monitoring the development of resistance to antibiotics. Sex Transm
Dis 2006; 33: 87-95.
9. Dillon JA, Pagotto F. Importance of drug resistance in gonococci: from mechanisms to monitoring.
Curr Opin Infect Dis 1999; 12:35-40.
10. Fayemiwo SA, Müller EE, Gumede L, Lewis DA. Plasmid-Mediated Penicillin and Tetracycline
Resistance Among Neisseria gonorrhoeae Isolates in South Africa: Prevalence, Detection and
Typing Using a Novel Molecular Assay. Sex Transm Dis 2010. (publikacja w internecie, przed
wydrukowaniem, PMID:21042234 )
11. Kubanova A, Frigo N, Kubanov A i inni. The Russian gonococcal antimicrobial susceptibility
programme (RU-GASP)-national resistance prevalence in 2007 and 2008, and trends during
2005-2008. Euro Surveill 2010; 15: 19533.
120
B. Młynarczyk i inni
Nr 2
12. Lis-Tønder J, Cybulski Z Antimicrobial susceptibility and biochemical patterns of Neisseria
gonorrhoeae strains in Vejle area, Denmark. J Eur Acad Dermatol Venereol 2009; 23: 1193-6.
13. Martin IM, Hoffmann S, Ison CA; ESSTI Network European Surveillance of Sexually Transmitted
Infections (ESSTI): the first combined antimicrobial susceptibility data for Neisseria gonorrhoeae
in Western Europe. J Antimicrob Chemother 2006; 58: 587-93.
14. Ohnishi M, Ono E, Shimuta K i inni. Identification of TEM-135 beta-lactamase in penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae strains in Japan. Antimicrob Agents Chemother 2010; 54:
3021-3.
15. Starnino S, Dal Conte I, Matteelli A i inni. Trend of ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Italy and analysis of the molecular determinants. Diagn Microbiol Infect
Dis. 2010; 67:350-4.
16. Starnino, S. and P. Stefanelli on behalf of the Neisseria gonorrhoeae Italian Study Group.
Azithromycin-resistant Neisseria gonorrhoeae strains recently isolated in Italy. J. Antimicrob.
Chemother 2009; 63: 1200-4.
17. Su X, Jiang F, Qimuge, Dai X, Sun H, Ye S Surveillance of antimicrobial susceptibilities in Neisseria gonorrhoeae in Nanjing, China, 1999-2006. Sex Transm Dis. 2007; 34: 995-9.
18. Tapsall JW, Limnios EA, Murphy D. Australian Gonococcal Surveillance Programme Analysis
of trends in antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae isolated in Australia, 1997- 2006.
J Antimicrob Chemother 2008; 61: 150-5.
19. Tzelepi E, Avgerinou H, Flemetakis A i inni. Changing figures of antimicrobial susceptibility
and serovar distribution in Neisseria gonorrhoeae isolated in Greece. Sex Transm Dis 2010; 37:
115-20.
20. Zhao, S., M. Duncan, J. Tomberg, C. i inni. Genetics of chromosomally mediated intermediate
resistance to ceftriaxone and cefixime in Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother
2009; 53: 3744-51.
Otrzymano: 24 V 2011 r.
Adres Autora: 02-008 Warszawa, ul. Koszykowa 82a,
Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii WUM