Porównanie metody diagnostycznej Real-Time PCR z
advertisement
Ewa Skulska Porównanie metody diagnostycznej Real-Time PCR z tradycyjną diagnostyką bakteriologiczną i metodą immunofluorescencji bezpośredniej wykorzystywaną do rozpoznania infekcji Neisseria gonorrhoeae i Chlamydia trachomatis. Praca doktorska 2016 Promotor: Promotor pomocniczy: Miejsce wykonywania pracy doktorskiej: dr hab. n. med. Magdalena Malejczyk dr n. med. Beata Młynarczyk Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii, Zakład Diagnostyki Chorób Przenoszonych Drogą Płciową, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej. 1 Streszczenie 1.1 Wstęp Zakażenia N. gonorrhoeae i C. trachomatis należą do najczęściej występujących bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową (Sexually Transmitted Infections – STI). Według WHO częstość zachorowań na te infekcje stale rośnie. W 2008 roku stwierdzono na świecie 106 i 105 milionów zakażeń odpowiednio dwoinką rzeżączki i bakterią chlamydii. W Europie częściej występuje zakażenie C. trachomatis. W 2012 roku w 25 krajach Unii Europejskiej zanotowano średnio na 100 tysięcy mieszkańców 199 przypadków zakażeń C. trachomatis, a tylko 13 przypadków zakażeń N. gonorrhoeae. Infekcje wywołane przez C. trachomatis często mogą mieć charakter bezobjawowy. W USA, gdzie od pewnego czasu prowadzi się rutynowo badania przesiewowe, wykazano, że większość z potwierdzonych przypadków zakażeń C. trachomatis miało właśnie taki przebieg. W wielu badaniach wykazano również, że u bezobjawowych mężczyzn wykrywalność chlamydiozy wynosi od 3% do 5%. Badania przeprowadzone we Francji u aktywnych seksualnie, bezobjawowych osób poniżej 30 roku życia wykazały, że 0,36% spośród nich było zakażonych rzeżączką. W Polsce w 2014 roku zachorowalność na rzeżączkę i chlamydiozę, według danych Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny, wynosiła odpowiednio 1,19 i 0,42 na 100 tysięcy mieszkańców. Jednak dane dotyczące Polski nie są w pełni wiarygodne ze względu na brak diagnostyki przesiewowej i brak zgłaszania wszystkich leczonych przypadków. Zakażenia N. gonorrhoeae i C. trachomatis wiążą się z ryzykiem groźnych powikłań, w tym bezpłodności kobiet i zwiększonej liczby ciąż pozamacicznych. Ciężkie zapalenie spojówek u zakażonych okołoporodowo noworodków może grozić utratą wzroku. Zwiększa się również 3 – 6 krotnie ryzyko zakażenia wirusem HIV. Dlatego tak ważne jest szybkie rozpoznanie i leczenie tych infekcji. CDC (Centers for Disease Control and Prevention, USA) rekomenduje wprowadzenie diagnostycznych badań przesiewowych w grupie wszystkich kobiet w wieku rozrodczym. Do niedawna klasyczne metody diagnostyczne w przypadku rzeżączki opierały się na ocenie preparatu mikroskopowego wydzieliny z cewki moczowej lub szyjki macicy oraz na hodowli bakteryjnej. W przypadku chlamydiozy diagnostyka opierała 2 się na metodzie immunoenzymatycznej (Enzyme Immunoessay – EIA) lub metodzie immunofluorescencji bezpośredniej (Direct Immunofluorescence – DIF). Pojawienie się metod opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych (Nucleic Acid Amplification Test, NAAT) sprawiło, że diagnostyka chorób zakaźnych, w tym przenoszonych drogą płciową, stała się bardzo czuła, swoista i szybka. NAAT jest metodą o najwyższej czułości polegającą na identyfikacji DNA drobnoustroju w badanym materiale. Obecnie CDC w diagnostyce rzeżączki i chlamydiozy na pierwszym miejscu zaleca stosowanie NAAT, w tym metodę Real-Time PCR. W przypadku rzeżączki zalecane jest stosowanie dodatkowo hodowli bakteryjnej w celu monitorowania antybiotykoodporności. Jako niezalecane wymienione są „metody inne niż NAAT i hodowla”. IUSTI (International Union against Sexually Transmitted Infections) również zaleca w diagnostyce chlamydiozy NAAT, a w diagnostyce rzeżączki NAAT lub hodowlę, podkreślając, że w przypadku podejrzenia niepowodzenia w leczeniu lepszą metodą jest hodowla, a w przypadkach bezobjawowych oraz gdy konieczny jest transport materiału do laboratorium zalecane jest NAAT. 1.2 Cel pracy Celem przeprowadzonych badań było porównanie efektywności metody opartej na hodowli w przypadku rzeżączki oraz bezpośredniej immunofluorescencji (DIF) w przypadku chlamydiozy z metodą Real-Time PCR w laboratoryjnej diagnostyce rzeżączki i chlamydiozy u chorych zgłaszających się do Poradni przy Klinice Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. 1.3 Materiały i metody Rzeżączka: Badano materiał pochodzący z wymazów z cewki moczowej, szyjki macicy, gardła lub odbytu od 94 pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. W grupie tej było 73 mężczyzn i 21 kobiet. Spośród wszystkich pacjentów 22 osoby zgłosiły się na badanie kontrolne po antybiotykoterapii. Wśród pozostałych 72 pacjentów, 48 miało objawy mogące sugerować zakażenie N. gonorrhoeae (wyciek, pieczenie lub dyskomfort w cewce moczowej, ból gardła, ból 3 lub wydzielina zapalna z odbytu, u kobiet upławy, pobolewania w podbrzuszu), 8 osób nie miało objawów, ale zgłaszało ekspozycję na zakażenie (kontakt seksualny z osobą zakażoną), a 16 osób nie wykazywało żadnych objawów, ani nie miało kontaktów seksualnych z osobami chorymi na STI. Materiał do posiewu pobierano za pomocą ezy jednorazowego użytku. Posiew, bezpośrednio po pobraniu materiału, wykonywano na agarze czekoladowym z antybiotykami (bioMerieux), hodowlę prowadzono przez 24 godziny w atmosferze zawierającej 5% CO2, w temperaturze 37⁰ C. Zakażenie potwierdzano na podstawie morfologii kolonii bakteryjnych w hodowli, morfologii komórek w preparatach mikroskopowych barwionych metodą Gram’a, wyników testu oksydazowego oraz testu fermentacji cukrów (API NH, bioMerieux, Francja). Chlamydioza: Do badania zostało zakwalifikowanych 152 pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii WUM. W badanej grupie 59 osób prezentowało objawy kliniczne chlamydiozy (wyciek, pieczenie lub dyskomfort w cewce moczowej, ból gardła, ból lub wydzielina zapalna z okolicy odbytu, u kobiet upławy, pobolewanie w dole brzucha), 8 osób miało kontakt z osobami zakażonymi C. trachomatis, a 24 osoby zgłosiły się na badanie kontrolne po antybiotykoterapii. 61-osobową grupę kontrolną stanowili zdrowi pacjenci, którzy nie zgłaszali żadnych dolegliwości, nie prezentowali żadnych objawów chorobowych i nie mieli kontaktów seksualnych z chorymi na STI, a powodem ich przyjścia do naszej placówki była chęć wykonania badań diagnostycznych w kierunku chorób przenoszonych drogą płciową. Do tej grupy zakwalifikowano również 43 zdrowe kobiety, które zostały skierowane do nas z kliniki ginekologicznej na badanie w kierunku chlamydiozy, w celu dopełnienia procedury kwalifikacyjnej do zabiegu zapłodnienia „in vitro” (program prowadzony przez Klinikę Ginekologii WUM). Materiał (cewka moczowa, szyjka macicy, gardło, odbyt) do metody DIF pobierano bawełnianą sterylną wymazówką firmy Copan, Włochy. Do przeprowadzenia badania metodą DIF wykorzystano gotowy zestaw – MicroTrack Chlamydia trachomatis Direct Specimen Test, firmy Trinity Biotech. Test ten służy do wykrywania ciałek podstawowych EB (Elementary Body) C. trachomatis w materiale bezpośrednio pobranym od pacjenta. Pobrany materiał służył do wykonania rozmazu na specjalnym szkiełku przeznaczonym do badania mikroskopowego. Po wyschnięciu rozmaz utrwalano metanolem, a następnie poddawano reakcji 4 z przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi fluoresceiną (Fluorescein isothiocyanate – FITC), skierowanymi przeciwko antygenom zewnętrznej błony komórkowej EB C. trachomatis. Preparaty oglądane były w mikroskopie fluorescencyjnym (Axioskop firmy Opton) z obiektywami immersyjnymi 40x i 100x. Wynik dodatni stwierdzano na podstawie obecności w preparacie co najmniej 10 EB C. trachomatis. Jako wynik ujemny przyjęto preparaty, w których obecne były tylko komórki nabłonkowe zabarwione na czerwono, a jaskrawozielone nieregularne punkty traktowano jako artefakty. Wynik uznawano za ujemny tylko wtedy, gdy w preparacie widoczne były wybarwione na czerwono komórki nabłonka, co świadczyło o tym, że materiał został prawidłowo pobrany od pacjenta. Diagnostyka metodą Real-Time PCR w przypadku obydwu drobnoustrojów została przeprowadzona w identyczny sposób: W celu wyizolowania DNA N. gonorrhoeae i C. trachomatis materiał pobierano z tych samych okolic, jak w przypadku diagnostyki klasycznymi metodami, używając wymazówki transportowej Transystem firmy Copan, Włochy. Izolacja DNA z pobranych próbek została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego zestawu DNA Bact Extra Pure Kit firmy Euroclone®. Procedurę przeprowadzono według protokołu podanego przez producenta. Metoda oparta jest na adsorpcji DNA na specjalnej kolumnie. Procedurę izolacji DNA wykonywano natychmiast po uzyskaniu materiału badawczego lub w ciągu 24 godzin. Do czasu izolacji DNA wymazówka z pobranym materiałem przechowywana była w temp 5 – 8⁰ C. Wyizolowane DNA przechowywano w temperaturze -20⁰ C do czasu wykonania reakcji amplifikacji. W celu wykrycia w badanych próbach DNA N. gonorrhoeae i C. trachomatis wykorzystano reakcję Real-Time PCR. Metoda ta pozwala śledzić proces amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym dzięki wykorzystaniu zjawiska fluorescencji, a także pozwala oznaczyć ilość produktu w fazie jego wykładniczego wzrostu. W metodzie tej każda sonda, czyli krótki fragment DNA komplementarny do sekwencji znajdujących się na początku i końcu poszukiwanego genu, posiada na końcu 5’ cząsteczkę fluorochromu, zaś na końcu 3’ wygaszacz. Bliskie położenie obu cząsteczek tłumi fluorescencję wzbudzanego fluorochromu. Na etapie wydłużania nici DNA dochodzi do hydrolizy sondy przez polimerazę Taq posiadającą także aktywność 5-egzonukleazy, co powoduje oddzielenie się fluorochromu od cząsteczki wygaszacza i wyzwala zjawisko fluorescencji. Doświadczenia zostały wykonane na termocyklerze 5 SmartCycler® Dx przy użyciu komercyjnego zestawu amplifikacyjnego odpowiednio DUPLICα® RealTime Neisseria gonorrhoeae 2nd Generation Detection KIT (Euroclone®) oraz DUPLICα® RealTime Advanced Dual Easy Chlamydia trachomatis Kit (Euroclone®) zgodnie z zaleceniami producenta. Startery i sonda użyte do badań w kierunku N. gonorrhoeae służą do wykrywania sekwencji DNA w obrębie plazmidu pJD1 i genu 16S rRNA. W przypadku diagnostyki zakażeń C. trachomatis poszukiwane są sekwencje w obrębie plazmidu oraz genu 16S rRNA. Dokładna sekwencja starterów i sond oraz dokładne miejsce ich przyłączenia stanowią tajemnicę firmy. Zestawy posiadają kontrolę wewnętrzną, której rolą jest wykluczenie ewentualnego zahamowania reakcji PCR. Sonda typu TaqMan® dla wykrycia N. gonorrhoeae oraz C. trachomatis została fluorescein) oraz wyznakowana wygaszaczem fluorochromem typu FAM (6-carboxy- BHQ-1. Sonda wykorzystywana w kontroli wewnętrznej zestawu została wyznakowana fluorochromem typu HEX (hexachloro-6carboxyfluorescein) oraz wygaszaczem BHQ-1. 1.4 Wyniki Rzeżączka (NG): Ogółem w 94-osobowej grupie pacjentów diagnozowanych w kierunku N. gonorrhoeae wyniki zgodne – uzyskanie tego samego wyniku zarówno metodą hodowli, jak i Real-Time PCR (oba wyniki negatywne lub oba wyniki pozytywne) stwierdzono u 79 osób, co stanowi 84% wszystkich wyników. Wyniki rozbieżne (wynik hodowli negatywny przy pozytywnym Real-Time PCR) stwierdzono u 15 osób, co stanowi 16% wszystkich wyników. Nie uzyskano u żadnego pacjenta pozytywnego wyniku hodowli przy negatywnym wyniku Real-Time PCR. Stosunek liczby wszystkich wyników zgodnych (WWZ) do liczby wszystkich prób badanych (WPB) wśród mężczyzn wynosił 0,84, a wśród kobiet 0,86, w grupie pacjentów objawowych wynosił 0,83, a w grupie pacjentów po leczeniu 0,82. Najniższy współczynnik WWZ/WPB stwierdzono w grupie pacjentów będących partnerami, a najwyższy w grupie pacjentów zdrowych i wynosił odpowiednio 0,75 i 0,94. Stosunek liczby zgodnych wyników dodatnich (ZWD) do liczby wszystkich wyników dodatnich (WWD) wyniósł 0,44 w grupie wszystkich pacjentów, podczas gdy w grupie pacjentów objawowych wyniósł on 0,38, w grupie partnerów – 0,6 a w grupie pacjentów po leczeniu – 0,5. 6 W grupie mężczyzn uzyskano 31% wyników dodatnich wskazujących na obecność infekcji N.gonorrhoeae (15% obie metody, 16% jedna z metod potwierdziła infekcję). W grupie kobiet wyniki dodatnie stanowiły 19% (5% obie metody, 14% jedna metoda). Chlamydioza (CT): Ogółem w całej 152-osobowej grupie pacjentów diagnozowanych w kierunku C. trachomatis wyniki zgodne – uzyskanie tego samego wyniku zarówno metodą DIF jak i Real-Time PCR (oba wyniki negatywne lub oba wyniki pozytywne), stwierdzono u 137 osób, co stanowi 90% wszystkich wyników. Wyniki rozbieżne (DIF negatywny przy pozytywnym Real-Time PCR lub DIF pozytywny przy negatywnym Real-Time PCR) stwierdzono u 15 osób, co stanowi 10% wszystkich wyników, z tym, że 9% (13 osób) stanowiły ujemne wyniki DIF przy dodatnim wyniku Real-Time PCR oraz 1% (2 osoby – w obu przypadkach byli to objawowi mężczyźni z wyciekiem z cewki moczowej i dyzurią) dodatnie wyniki DIF przy ujemnym wyniku Real-Time PCR. Stosunek liczby wszystkich wyników zgodnych (WWZ) do liczby wszystkich prób badanych (WPB) wynoszący 0,9 stwierdzono zarówno w grupie obejmującej wszystkich pacjentów, jak również po wyłączeniu pacjentów po leczeniu. Zwraca uwagę wysoki stosunek WWZ/WPB = 0,98 w grupie wszystkich kobiet, podczas gdy w grupie wszystkich mężczyzn wyniósł on 0,84. Najwyższy stosunek WWZ/WPB = 0,97 dotyczył grupy pacjentów zdrowych, czyli bezobjawowych, nie będących partnerami, ani nie będących po leczeniu. Stosunek WWZ/WPB w grupie pacjentów objawowych, partnerów i po leczeniu wyniósł odpowiednio 0,85, 0,88 i 0,88. Stosunek liczby zgodnych wyników dodatnich (ZWD) do liczby wszystkich wyników dodatnich (WWD) wyniósł 0,42 w grupie wszystkich pacjentów, podczas gdy w grupie pacjentów objawowych wyniósł on 0,53, a w grupie pacjentów po leczeniu – 0,25. W grupie mężczyzn uzyskano 28% wyników dodatnich wskazujących na obecność infekcji C. trachomatis (12% obie metody, 16% jedna z metod potwierdziła infekcję). W grupie kobiet wyniki dodatnie stanowiły 4% (2% obie metody, 2% jedna metoda). 7 1.5 Wnioski 1. W diagnostyce zakażeń wywołanych przez N. gonorrhoeae i C. trachomatis metody molekularne (NAATs) wykazują wyższą czułość niż metody klasyczne. 2. Obie metody klasyczne: hodowla w diagnostyce rzeżączki i DIF w diagnostyce chlamydiozy wykazują stosunkowo wysoką czułość i wysoką swoistość. 3. W diagnostyce zakażeń wywołanych przez N. gonorrhoeae i C. trachomatis NAATs znajdują zastosowanie zwłaszcza w przypadkach skąpoobjawowych lub bezobjawowych oraz w diagnostyce partnerów seksualnych osób zakażonych. 4. W diagnostyce zakażeń wywołanych przez N. gonorrhoeae zlokalizowanych w gardle NAATs mogą wykazywać niższą swoistość ze względu na możliwość reakcji krzyżowych. 5. W diagnostyce zakażeń wywołanych przez N. gonorrhoeae hodowla jest zalecana: – ze względu na konieczność monitorowania antybiotykoodporności dwoinek rzeżączki – w przypadku niepowodzeń terapeutycznych 6. W przypadku diagnostyki molekularnej przeprowadzanej u pacjentów po leczeniu rzeżączki lub chlamydiozy badanie kontrolne metodą NAAT powinno odbywać się nie wcześniej niż 2 tygodnie po zakończeniu leczenia 8
