Hodowla tkankowa – zamrażanie, problem infekcji

Hodowla tkankowa – zamrażanie, problem infekcji
Andrzej Wójcik
Zakład Radiobiologii i Immunologii
[email protected]
Zamrażanie i rozmrażanie komórek
Podstawowa zasada zamrażania i rozmrażania
wolno: 1-30C / min
370C
-800C
zamrażarka
prędko: 3-5 min w 370C
-1350C
ciekły
azot
Komórki powinny być w logarytmicznej fazie wzrostu
Ilość surowicy: 20 – 90% (reszta: pożywka)
Ilość DMSO: 10%
Dewar
Wyjaławianie sprzętu i płynów – różne metody
Warunki sterylizacji prowadzące do wyjałowienia
http://www.sterilizers.com
Sterylizacja radiacyjna – http://www.ichtj.waw.pl
Wyjaławianie przez traktowanie wysoką temperaturą
Autoklawowanie
121 °C przez 15 minut
Przy ciśnieniu ok. 103 kPa
Nawiew (laminar) – laminar air flow
Filtr HEPA: high efficiency particulate air filter
filtr
Zatrzymuje 99,97% cząstek o wielkości
ponad 0,3 µm.
Wymyślony w latach 40-tych w ramach projektu
Manhattan do filtracji cząstek radioaktywnych.
70% alkohol
Zakażenia
Źródła zakażenia:
Bakterie
Antybiotyki: penicylina/streptomycyna
Grzyby
Amfoterycyna B, „antimycoticum”
Mykoplazma
Mała, atypowa bakteria całkowicie pozbawiona ściany komórkowej.
Żyje przyczepiona do zewnętrznej strony ściany komórkowej.
Makrolidy, tetracykliny
+
-
Metody detekcji
Barwienie DAPI – bawnik DNA
Hybrydyzacja z mykoplazmatycznym DNA
Przeciwciała monoklonalne
Mikroskopia elektrnowa
PCR: swoiste primery
Pomiar komórek - cytometria przepływowa
Zasada działania
Becton-Dickinson FACScan Flow Cytometer
Cytometria przepływowa
Analiza jednowymiarowa - pomiar zawartości DNA w komórkach w hodowli
Komórki utrwalamy, permeabilzujemy i barwimy fluorochromem
łączącym się z DNA, np jodek propidyny - PI
G0
G1
G2
S
Liczba komórek
M
G0 / G1
G2 / M
S
0
200
400
600
800
4N
2N
zawartość DNA
1000
Cytometria przepływowa
Analiza dwuwymiarowa - pomiar liczby komórek martwych i żywych
Komórki barwimy przyżyciowo dwoma fluorochromami: PI i FITC
komórki martwe
PI
•FL2-H
Intensywność barwienia PI
PI – jodek
propidyny
– barwi DNA martwych komórek
Aneksyna- FITC (fluoresceina) –
łączy się z fosfatydyloserną
obecną na zewnątrz błony
komórek apoptotycznych
aneksyna V-FITC
•FL1-H
Intensywność barwienia FITC
komórki żywe
komórki apoptotyczne
70% etanol
inkubatory
inkubator
Nawiew