I Wrocławskie Spotkania Naukowe
advertisement
I Wrocławskie Spotkania Naukowe I Wrocławskie Spotkania Naukowe Wrocław 2017 I Wrocławskie Spotkania Naukowe Wrocław, 3 marca 2017 r. Redakcja: Julita Kulbacka Anna Choromańska Joanna Weżgowiec Skład i łamanie: Ilona Żuchowska Projekt okładki: Marcin Szklarczyk Nina Rembiałkowska © Copyright by Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o. o. ISBN 978-83-65598-44-8 Wydawca: Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o. o. ul. Głowackiego 35/341, 20-060 Lublin www.wydawnictwo-tygiel.pl Komitet Naukowy: prof. Janina Kwiatkowska-Korczak Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu prof. dr hab. Andrzej Gamian Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu prof. Grzegorz Bartosz Uniwersytet Rzeszowski dr hab. Jolanta Saczko Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu dr hab. Małgorzata Daczewska Uniwersytet Wrocławski dr hab. Małgorzata Latocha Śląski Uniwersyet Medyczny w Katowicach dr hab. Izabela Sadowska-Bartosz Uniwersytet Rzeszowski dr hab. Marek Drab Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk dr hab. Małgorzata Kotulska Politechnika Wrocławska dr inż. Julita Kulbacka Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu dr inż. Anna Choromańska Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu Komitet Organizacyjny: prof. dr hab. Andrzej Gamian Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu dr hab. Jolanta Saczko Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu dr inż. Julita Kulbacka Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu dr inż. Anna Choromańska Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu dr Agnieszka Chwiłkowska Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu dr Ewa Sawicka Katedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu dr inż. Joanna Weżgowiec Zakład Materiałoznawstwa, Katedra Protetyki Stomatologicznej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu mgr inż. Nina Rembiałkowska Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej oraz Katedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu mgr inż. Justyna Mączyńska Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu mgr Olga Michel Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu mgr Katarzyna Bieżuńska-Kusiak Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu Organizator: Sponsor: Spis treści PROGRAM KONFERENCJI ...................................................................................................................15 WYKŁADY ..............................................................................................................................................19 PREZENTACJE USTNE ..........................................................................................................................25 PREZENTACJE POSTEROWE ...............................................................................................................47 INDEKS AUTORÓW ...............................................................................................................................72 Szanowni Państwo, W tym roku Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego podjęła inicjatywę zorganizowania konferencji pt.: ”I Wrocławskie Spotkania Naukowe” dedykowanej młodym naukowcom. Celem konferencji jest wymiana informacji o badaniach naukowych między młodymi ludźmi, pasjonatami nauki z ośrodków z całej Polski. Konferencja ma charakter multidyscyplinarny i obejmuje zagadnienia szeroko rozumianej biologii komórki w zakresie oddziaływań leków w komórkach nowotworowych i prawidłowych, interakcji komórka-lek, odpowiedzi komórkowej na stres oksydacyjny, inżynierii komórkowej włączając modelowanie komputerowe. Podczas konferencji młodzi naukowcy będą mieli okazję przedstawić wyniki swoich badań i przedyskutować je również z doświadczonymi i cenionymi ludźmi nauki, którzy zostali zaproszeni do udziału w I Wrocławskich Spotkaniach Naukowych. Wszystkim uczestnikom konferencji życzymy owocnych dyskusji i mile spędzonych chwil we Wrocławiu. Mamy nadzieję, że Wrocławskie Spotkania Naukowe będą kontynuowane i staną się coroczną tradycją wymiany wiedzy między młodymi naukowcami. Konferencja ta jest zadedykowana Pani prof. dr hab. Janinie Kwiatkowskiej-Korczak, Kierownikowi Katedry i Zakładu Biochemii w latach 1980-1997, która w ubiegłym roku obchodziła okrągły jubileusz. Pani Profesor J. Kwiatkowska-Korczak przyjechała do Wrocławia ze Lwowa, gdzie miała możliwość i zaszczyt pracować z kontynuatorami lwowskiej szkoły biochemicznej wybitnego naukowca prof. Jakuba Parnasa. Do chwili obecnej Profesor J. Kwiatkowska-Korczak aktywnie uczestniczy w życiu Katedry Biochemii Lekarskiej i służy swoim doświadczeniem, za co należą jej się podziw i ogromne podziękowania. Dr hab. Jolanta Saczko, prof. nadzw. 11 Prof. dr hab. Janina Kwiatkowska-Korczak obecnie emerytowany kierownik Katedry Biochemii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu. Była związana z Wydziałem Lekarskim we Lwowie. Nie sposób mówić o rozwoju biochemii we Wrocławiu, nie odnosząc się do Zakładu Chemii Lekarskiej Uniwersytetu Jana Kazimierza we Lwowie i powstałej tam polskiej szkoły biochemicznej, której jest kontynuacją zarówno personalną jak i tematyczną. Zakład Chemii istniał na Wydziale Lekarskim od 1894 r., ale jego pełny rozwój zaczął się w 1921 r, po objęciu kierownictwa przez profesora Jakuba Karola Parnasa, uczonego o światowej renomie w dziedzinie enzymologii i przemiany cukrowej w tkankach zwierzęcych, wykształconego w Berlinie, pracującego w Zurichu, Strassburgu i Cambridge. Pod jego kierownictwem rozwinęła się prężna placówka naukowa. Powstał znakomity zespół, złożony ze studentów i absolwentów Wydziału Lekarskiego, którzy po wojnie utworzyli placówki biochemiczne na Akademiach Medycznych we Wrocławiu, Gdańsku, Warszawie i w instytutach PAN. Lwowski Zakład miał znakomite osiągnięcia w dziedzinie metabolizmu amoniaku i nukleotydów w mięśniach, a przede wszystkim – przemiany glikogenu i glukozy. Prof. J. Kwiatkowska-Korczak na Wydziale Lekarskim we Lwowie, w Katedrze Biochemii w 1959 r. uzyskała stopień doktora. W tym samym roku po repatriacji rozpoczęła pracę pod kierunkiem prof. Tadeusza Baranowskiego na naszej uczelni. Habilitowała się w 1971 r., stopień profesora nadzwyczajnego uzyskała w 1980 r., a profesora zwyczajnego – w 1990 r. Odbyła stypendia na Uniwersytecie w Rzymie i w Narodowych Instytutach Zdrowia w Bethesdzie (USA). W latach 1980-1997 kierowała Zakładem Biochemii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu. Jest autorem wielu prac doświadczalnych, przeglądowych oraz rozdziałów w podręcznikach. Jest honorowym członkiem Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, była członkiem Komitetu Biochemii i Biofizyki PAN, redakcji Postępów Biochemii, Acta Biochimica Polonica, i nadal – Postępów Higieny i Medycyny Doświadczalnej. Uczestniczy nadal w pracach Komisji Dziekańskiej Wydziału Lekarskiego Posiadane i pracach naukowych i dydaktycznych prowadzonych w Katedrze i Zakładzie Biochemii Lekarskiej. Prof. J. Kwiatkowska-Korczak została odznaczona: Złotym Krzyżem Zasługi, Krzyżem Kawalerskim Orderu Odrodzenia Polski, Medalem Edukacji Narodowej. 13 PROGRAM KONFERENCJI PROGRAM KONFERENCJI 9:00 – rejestracja 10:00 – rozpoczęcie konferencji 10:30 –11:15 dr hab. Małgorzata Latocha „W poszukiwaniu lepszego jutra – czyli o dobrych stronach “złego” (W1) 11:30 -13:30 sesje młodych naukowców (8-10 min prezentacje) 11:30-11:40 O1. Otrzymywanie białek eukariotycznych w systemie heterologicznym. Krzysztof Wycisk 11:40-11:50 O2. Ocena żywotności mechanicznie izolowanych pęcherzyków jajnikowych kota domowego. Olga Rodak, Agnieszka Partyka, Wojciech Niżański 11:50-12:00 O3. Badanie wartości diagnostycznej uroplakiny IIIA w raku pęcherza w aspekcie narażenia środowiskowego. Michał Matuszewski, Beata Szymańska, Anna Długosz 12:10-12:20 O4. Częstość występowania przeciwciał skierowanych do antygenów układu Rh u dawców krwi w latach 2012-2015. Marta Leońska, Elżbieta Klausa, Agnieszka Piwowar 12:10-12:20 O5. Mutacje punktowe Hsp67Bc wpływają na strukturę i funkcję mięśni larwalnych Drosophila melanogaster. Jadwiga Jabłońska, Magda DubińskaMagiera, Małgorzata Daczewska, Krzysztof Jagła 12:20-12:30 O6. Wzór ekspresji genu PYGM oraz lokalizacja białka miofosforylazy w miogenezie Danio rerio oraz Drosophila melanogaster. Anna Lewicka, Marta Migocka-Patrzałek, Małgorzata Daczewska 12:30-12:40 O7. Glikacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej w tętnicach. Aleksandra Kuzan 12:40-12:50 O8. Wpływ wybranych parametrów na proces tworzenia mikrosfer polisacharydowych. Justyna Gawenda, Marta Tsirigotis-Maniecka 12:50-13:00 O9. Nowa metoda analizy ilościowo-jakościowej komórek układu odpornościowego w obrębie układu rozrodczego myszy. Katarzyna Mikołajewicz, Anna Chełmońska-Soyta, Grzegorz Chodaczek 13:00-13:10 O10. Zastosowanie fosfatydylocholiny w projektowaniu proleków na bazie kwasu weratrowego. Marta Czarnecka, Magdalena Rychlicka, Natalia Niezgoda, Marta Świtalska, Joanna Wietrzyk, Czesław Wawrzeńczyk, Anna Gliszczyńska 13:10-13:20 O11. Porównanie wyników operacyjnego leczenia przerzutów z pierwotnego raka płuc i metachronicznych guzów płuc. Piotr Błasiak, Adam Rzechonek, Beata Muszczyńska-Bernhard, Jarosław Grzegrzółka 17 Adamiak, Konrad Pawełczyk, Jędrzej 13:30-14:30 lunch 14:30-15:15 wykład: dr hab. Marek Drab „Kaweole – zagadkowa organella oknem pomiędzy medycyną translacyjną a naukami podstawowymi” (W2) 15:15 -17:00 sesje młodych naukowców (8-10 min prezentacje) 15:15-15:25 O12. Hodowla pierwotna fibroblastów w augmentacji dziąsła i pokrywaniu mnogich recesji. Barbara Sterczała, Jolanta Saczko, Marzena Dominiak 15:25-15:35 O13. Optymalizacja hodowli mysich mieloidalnych komórek supresorowych. Natalia Anger, Joanna Rossowska 15:35-15:45 O14. Wpływ estradiolu i jego metabolitów na komórki raka jajnika eksponowane na związki chromu i kadmu. Martyna Szydełko, Joanna Roik, Julita Kulbacka, Ewa Sawicka 15:45-15:55 O15. Zaburzenia funkcjonowania komórek indukowane przez nanokryształy NaGdF4:Yb3+Er3+. Edyta Wysokińska, Jakub Ciochos, Mirosław Karbowiak, Leon Strządała, Wojciech Kałas 15:55-16:05 O16. Izoprenoidy oraz ich pochodne jako terapeutyki skuteczne w leczeniu chorób nowotworowych. Magdalena Rychlicka, Marta Czarnecka, Anna Gliszczyńska 16:05-16:15 O17. Metabolomika jako potencjalne narzędzie do określania wpływu spożywania nabiału. Joanna Piechowicz, Mariusz G. Fleszar, Andrzej Gamian 16:15-16:25 O18. Mikrosekundowa elektroporacja komórek glejaka – badania in vitro. Natalia Niedzielska, Małgorzata Kotulska, Julita Kulbacka 16:25-16:35 O19. Zastosowanie elektroporacji z leukoworyną na lekoopornych komórkach raka trzustki. Olga Michel, Justyna Mączyńska, Nina Rembiałkowska, Katarzyna Bieżuńska-Kusiak, Anna Szewczyk, Julita Kulbacka, Jolanta Saczko 16:35-16:45 O20. Wpływ elektroporacji na ludzkie komórki gruczolakoraka jelita grubego (LOVO/DX). Agata Błaszczyńska, Julita Kulbacka 17:00 – przerwa kawowa 17:20 wykład: dr hab. Izabela Sadowska-Bartosz „Efekt Warburga piętą Achillesa komórki nowotworowej, czyli o inhibitorach glikolizy w terapii chorób nowotworowych” (W3) 18:05 Ogłoszenie wyników na najlepszą prezentację i zakończenie konferencji, certyfikaty 18 WYKŁADY W1. W POSZUKIWANIU LEPSZEGO JUTRA – CZYLI O DOBRYCH STRONACH „ZŁEGO” Małgorzata Latocha Zakład Biologii Komórki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach; 41-200 Sosnowiec, ul. Jedności 8; [email protected] Słowa kluczowe: trucizna, lek, hormeza Oceniając zjawiska zachodzące w naszym otoczeniu często klasyfikujemy je jako jednoznacznie korzystne/dobre, neutralne lub niekorzystne/złe. Czasami dostrzegamy odmienne działanie tej samej substancji czy jakiegoś czynnika na różne organizmy, ale w odniesieniu do siebie samych rzadziej zastanawiamy się nad całym wachlarzem – często krańcowo odmiennych – działań tej samej substancji. Z łatwością tworzymy katalog rzeczy dobrych i złych bardzo jenostronnie i subiektywnie oceniając daną substancję, proces, oddziaływanie. Znamy powiedzenia „o dwóch stronach medalu” lub „zgłaskaniu kogoś na śmierć” (coś dobrego i przyjemnego, ale w nadmiarze powodującego negatywne efekty), jednak zwykle nie zastawiamy się nad tym, że dotyczą one wszystkich zjawisk zachodzących w przyrodzie, a etykietka: „lek”, „substancja niezbędna do życia” czy „trucizna” – dotyczy tylko pewnego zakresu stężeń, czasu działania tej samej substancji czy czynnika fizycznego lub opisuje wrażliwość ściśle określonego organizmu. Zaczynając zgłębiać zagadnienia jakimi zajmuje się toksykologia, już na wstępie dowiadujemy się jednak, że trucizna to substancja, która po dostaniu się -w określonej dawce- do organizmu powoduje niekorzystne zmiany, zaburzenia funkcjonowania lub nawet jego śmierć. Najważniejszą część tej definicji stanowi informacja dotycząca „określonej dawki”. To już – żyjący w latach 1493–1541, szwajcarski lekarz – Paracelsus (Phillippus Aureolus Theophrastus Bombastus von Hohenheim) stwierdził, że: …„wszystko jest trucizną i nic nie jest trucizną”… (dawka czyni substancję trucizną). A naukowców od lat fascynuje zjawisko zwane hormezą – polegające na tym, że różne substancje występujące w przyrodzie w większych ilościach uznawane za szkodliwe dla organizmu, w małych dawkach mogą działać na niego korzystnie. Obecnie wydaje się, że najwięcej zagrożeń jakie pojawiają się w naszym życiu wynika ze zbyt dużego tempa codziennego funkcjonowania i chęci szybkiego wprowadzania na rynek, mających jakieś korzystne cechy lub działanie, nowości. Optymistyczne jest to, że praktycznie każde negatywne zjawisko/proces/oddziaływanie jakiegoś czynnika na organizm, może być również wykorzystane w dobrym celu – np. w terapiach, które mają spowodować eliminację wybranych komórek. 21 W2. KAWEOLE – ZAGADKOWA ORGANELLA OKNEM POMIĘDZY MEDYCYNĄ TRANSLACYJNĄ A NAUKAMI PODSTAWOWYMI Marek Drab1* USI, Pracownia Interakcji nanostruktur Biologicznych, Zakład Immunologii Chorób Zakaznych, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. L. Hirszfelda, Polska Akademia Nauk, Wrocław 1 *e-mail: [email protected] Słowa kluczowe: kaweole, komórkowe generatory sił, proliferacja, cholesterol Kaweole są platformami integrującymi sygnały komórkowe, szczególnie sygnał wapniowy oraz tlenku azotu. Wykazaliśmy, że sterują one proliferacją komórkową, a ich utrata prowadzi do niekontrolowanego rozplemu komórkowego u dotkniętych zwierząt, licznych zaburzeń architektury narządów i funkcjonowania układu naczyniowego. Na poziomie molekularnym stwierdziliśmy nadmierną aktywność syntazy tlenku azotu w tkankach. Dokonana przez nas delecja genu kaweoliny-1 wywołała szereg fenotypowych defektów u myszy. U zwierząt tych, Cav1KO, większość tkanek produkuje nadmiar tlenku azotu, konstytucyjnie i przez wszystkie 3 syntazy NO; są one jedynym znanym modelem zwierzęcym nadmiaru tlenku azotu. Wykazaliśmy, że kaweole sprawują kontrolę nad proliferacją komórek, a co równie ważne, że w funkcji supresora nowotworów istotną rolę pełnią mechano-sensoryczne właściwości kaweol, co udowodniliśmy metodami genetycznymi oraz analizy tkankowej. Cholesterol jest jednym z istotnych biomolekuł realizujących biologiczną misję kaweol. 22 W3. EFEKT WARBURGA PIĘTĄ ACHILLESA KOMÓRKI NOWOTWOROWEJ, CZYLI O INHIBITORACH GLIKOLIZY W TERAPII CHORÓB NOWOTWOROWYCH Izabela Sadowska-Bartosz1* Katedra Biochemii i Biologii Komórki, Uniwersytet Rzeszowski *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: kwas 3-bromopirogronowy, 2-deoksyglukoza, efekt Warburga, glikoliza, stres oksydacyjny Komórki nowotworowe są bardziej zależne niż komórki prawidłowe od glikolizy jako źródła energii (efekt Warburga). Winny być zatem bardziej wrażliwe niż komórki prawidłowe na działanie inhibitorów glikolizy. Z tego względu inhibitory glikolizy (m. in. 2-deoksyglukoza) testowanesą jako potencjalne leki przeciwnowotworowe. Kwas 3-bromopirogronowy (3-BP) jest związkiem szczególnie obiecującym z tego punktu widzenia. Ten czynnik alkilujący hamuje niektóre enzymy glikolityczne, zwłaszcza dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego i obniża poziom ATP w komórkach. Jednak mechanizm działania 3-BP na komórki jest bardziej złożony. Stwierdziliśmy, że ten związek hamuje także enzymy antyoksydacyjne (dysmutazę ponadtlenkową, peroksydazę glutationową, reduktazę glutationową i S-transferazę glutationową), obniża poziom glutationu i indukuje przejściowy wzrost wytwarzania reaktywnych form tlenu i azotu w komórkach. Wykazaliśmy, że 3-BP tworzy koniugat z glutationem (S-pirogronianoglutation); ten proces wydaje się być głównym procesem odpowiedzialnym za obniżenie stężenia glutationu w komórkach traktowanych 3-BP. Porównanie wrażliwości na 3-BP komórek MDCK II transfekowanych genami kodującymi transportery wielolekowe i komórek wyjściowych wykazało, że komórki wykazujące nadekspresję białka ABCB1 (glikoproteiny P) są bardziej wrażliwe niż komórki wyjściowe na działanie 3-BP. Wskazuje to na możliwość wspomagania przez 3-BP terapii nowotworów wykazujących oporność wielolekową. Jako analog pirogronianu, 3-BP wnika do komórek za pośrednictwem transporterów kwasów monokarboksylowych (MCT). Scharakteryzowaliśmy kinetykę transportu 3-BP do erytrocytów wykazując, że jest on hamowanyprzez flawonoidy, zwłaszcza takie jak luteolina i kwercetyna oraz przez resweratrol. Te wyniki wskazują na konieczność unikania spożywania pożywienia i napojów bogatych w te związki w trakcie terapii 3-BP. Stwierdziliśmy także, że 3-BP wpływa na ekspresję genów. Ekspozycja komórek raka piersi MCF-7 na 3-BP (50 µM) powodowała zmiany ekspresji około 180 genów, w tyme genów odpowiedzialnych za regulację cyklu komórkowego i mitozę. Realizacja badań w ramach projektu badawczego: „Oddziaływanie potencjalnego leku przeciwnowotworowego, kwasu 3-bromopirogronowego, z komórkami prawidłowymi i nowotworowymi ” (nr rejestracyjny wniosku 2012/07/B/NZ7/03618), finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki w ramach konkursu „OPUS 4”. 23 PREZENTACJE USTNE O 1. OTRZYMYWANIE BIAŁEK EUKARIOTYCZNYCH W SYSTEMIE HETEROLOGICZNYM Krzysztof Wycisk1* 1 * Zakład Biochemii, Politechnika Wrocławska, Wrocław [email protected] Słowa kluczowe: Ultraspiracle, ekspresja białek, analiza rozpuszczalności Cel: Otrzymanie dwóch homologicznych białek eukariotycznych w heterologicznym systemie prokariotycznym. Metody: Sekwencje cDNA homologicznych białek Ultraspiracle (Usp) pochodzących z dwóch organizmów – Drosophila melanogaster oraz Tribolium castaneum zamówiono w firmie GenArt. Sekwencje kodujące białka wycięto z otrzymanych wektorów za pomocą enzymów restrykcyjnych BamHI oraz HindIII a następnie wklonowano do specjalnie przygotowanych wektorów pQE80L posiadających homologiczne lepkie końce. Obecność prawidłowo wklonowanych insertów potwierdzono za pomocą PCR kolonijnego. Następnie białka ekspresjonowano w komórkach bakteryjnych Escherichia coli, szczepie BL21(DE3)pLysS, indukując ekspresję za pomocą izopropylotiogalaktozydu (IPTG). Podczas hodowli pobierano próbki zawiesiny hodowlanej w celu analizy rozpuszczalności kolejno po: 0 h, 0,5 h, 1 h, 2 h i 3 h. Obecność ekspresjonowanego białka analizowano za pomocą techniki SDS-PAGE oraz Western-blot. Wyniki: Zastosowanie technik inżynierii genetycznej pozwoliło na przygotowanie konstruktów ekspresyjnych homologicznych Usp. Przygotowane konstrukty wykorzystano do ekspresji białek w systemie heterologicznym. Pomimo znacznego stopnia homologii, białko pochodzące z D. melanogaster znajdowało się głównie we frakcjach rozpuszczalnych, natomiast białko pochodzące z T. castaneum znajdowało się w przewadze w ciałach inkluzyjnych. Wnioski: Uzyskane wzory ekspresji wskazują, że pomimo znacznej homologii (71%) białko z D. melanogaster otrzymywane jest w formie rozpuszczalnej, podczas gdy białko z T. castaneum otrzymywane jest w formie nierozpuszczalnej. Forma nierozpuszczalna znacznie utrudnia jego proces oczyszczania. W tam przypadku konieczne może być zoptymalizowanie warunków ekspresji np. poprzez zastosowanie innego wektora ekspresyjnego. Przykładem może być wektor pCOLDTM, który pozwala na otrzymanie białka w fuzji ze białkiem opiekuńczym (TF, ang. trigger factor) wspomagającym poprawne fałdowanie białek. Inną możliwością jest zastosowanie innego szczepu komórek bakteryjnych, który również może ułatwić poprawne fałdowanie białek. Przykładem takiego szczepu jest szczep ArcticExpress, który pozwala na powolną ekspresję białek w obniżonej temperaturze. 27 O 2. OCENA ŻYWOTNOŚCI MECHANICZNIE IZOLOWANYCH PĘCHERZYKÓW JAJNIKOWYCH KOTA DOMOWEGO Olga Rodak1*, Agnieszka Partyka1, Wojciech Niżański1 Katedra Rozrodu z Kliniką Zwierząt Gospodarskich, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: tkanka jajnikowa, pęcherzyki jajnikowe, kot domowy, barwniki do oceny żywotności Cel: Ocena żywotności izolowanych mechanicznie pęcherzyków jajnikowych kota domowego z wykorzystaniem różnych barwień. Materiały i metodyka: W wyniku rutynowej sterylizacji kotów domowych pozyskano 11 par jajników. Jajniki pochodziły od kotek dzikich lub utrzymywanych w domach, dojrzałych płciowo, będących w różnym wieku i fazach cyklu płciowego. Materiał dostarczano do analizy w ciągu 24h, w medium transportowym z dodatkiem antybiotyków w 4-8°C. Izolację pęcherzyków jajnikowych skalpelem chirurgicznym poprzez zeskrobywanie tkanki przeprowadzono w medium Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS). Uzyskany płyn przelewano przez sitko 100 μm, wirowano (1 min.), a osad zawieszano w 1ml DPBS. Materiał dzielono na trzy grupy badawcze: 1. Barwienie fluorescencyjne Calcein acetoxylmethyl ester – zielone świecenie komórek żywych; Ethidium homodimer-1 – czerwone świecenie martwych komórek (CAM/EthD-1); 2. Barwienie Neutral Red (NR) – czerwone wybarwienie lizosomów żywych komórek; 3. Barwienie Trypan Blue (TB) – niebieskie zabarwienie martwych komórek z uszkodzoną błoną komórkową oraz brak zabarwienia komórek z integralną błoną komórkową. W każdej grupie oceniono min. 100 pęcherzyków jajnikowych w różnym stadium dojrzałości. Pęcherzyki klasyfikowano jako żywe, gdy zarówno oocyt jak i do 50% komórek ziarnistych było żywych. Wyniki: Odsetek żywych pęcherzyków jajnikowych w świeżej tkance w barwieniach NR, TB, CAM/EthD-1 wyniósł kolejno 87,94% ± 0,08, 82,61% ± 0,08, 86,35% ± 0,07. Uzyskana średnia dla żywotności pęcherzyków z wszystkich barwień wyniosła 85,63% ± 0,03. Dyskusja oraz wnioski: Wcześniejsze badania pokazują, że pozyskując pęcherzyki poprzez przeciskanie tkanki jajnikowej przez sito (250 μm) uzyskano 42,3% całkowicie żywych, oceniając barwieniem TB (Jewgenow i wsp., 1998). Z kolei Tanpranid i wsp., (2015), siekając korę jajnika ostrzem skalpela, uzyskali 82,4% żywych pęcherzyków w barwieniu CAM/EthD-1/Hoechst33342. Uzyskany w niniejszym badaniu wynik żywotności pęcherzyków pozwala stwierdzić, że zastosowana technika izolacji jest efektywną metodą pozyskania wysokiego odsetka żywych pęcherzyków ze świeżej tkanki jajnikowej kota domowego w odniesieniu do opublikowanych wyników innych metod izolacji. Piśmiennictwo: 1. Jewgenow i wsp., J Reprod Fertil 1998; 112:39-47. 2. Tanpranid i wsp., Theriogenology 2015; 83:1553–1561. Badania finansowane przez Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu z dotacji statutowej celowej nr B030/0046/16. 28 O 3. BADANIE WARTOŚCI DIAGNOSTYCZNEJ UROPLAKINY IIIA W RAKU PĘCHERZA W ASPEKCIE NARAŻENIA ŚRODOWISKOWEGO Michał Matuszewski1,2, Beata Szymańska1, Anna Długosz1 Katedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu; 2Klinika Urologii i Onkologii Urologicznej, Uniwersytecki Szpital Kliniczny we Wrocławiu [email protected] 1 Słowa kluczowe: markery nowotworowe, rak pęcherza moczowego, uroplakina IIIA, transferaza glutationowa, 8-hydroksy 2’deoksyguanozyna Cel: Celem badań jest ocena wartości diagnostycznej i prognostycznej uroplakiny IIIa (UPKIIIa), oznaczanej w moczu i osoczu chorych na raka pęcherza moczowego (BC) o różnym stopniu inwazyjności i złośliwości. Oceniono, czy istnieje korelacja między wydalaniem uroplakin a uszkodzeniem DNA mierzonym poziomem 8-hydroksy-2’deoksyguanozyny (8-OHdG) w moczu, markera ekspozycji na ksenobiotyki i zdolnością detoksykacyjną mierzoną aktywnością izoenzymu transferazy glutationowej π (GSTπ). Materiały i Metody: Grupę badaną (n=61) stanowili pacjenci z rakiem pęcherza moczowego, leczeni w Klinice Urologii i Onkologii Urologicznej USK we Wrocławiu. Grupę kontrolną stanowiły zdrowe osoby (n=33) z bazy Biobanku. Analiza histopatologiczna została przeprowadzona Zakładzie Patomorfologii i Cytologii Onkologicznej UM we Wrocławiu. Oznaczenia laboratoryjne wykonano metodą immunoenzymatyczną (Elisa) w Katedrze i Zakładzie Toksykologii UM we Wrocławiu, z wykorzystaniem testów wykrywających: UPKIIIa w moczu i osoczu, 8-OHdG oraz GSTπ w moczu. Wyniki przeliczono na kreatyninę, uwzględniając w ten sposób rozcieńczenie moczu. Wyniki: Stężenia UPKIIIa, 8-OHdG i GSTπ były istotne statystycznie wyższe w grupie BC w każdym badanym materiale. Nie stwierdzono natomiast istotnych różnic w oznaczeniach UPKIIIa i GSTπ pomiędzy chorymi w zależności od stadium zaawansowania oraz stopnia złośliwości raka. Stwierdzono natomiast istotną statystycznie różnicę w wynikach 8-OHdG w grupie osób z rakami inwazyjnymi a nieinwazyjnymi (p=0,0129), oraz w zależności od stopnia złośliwośći nowotworu (p=0,0011). Zauważono dodatnie korelacje pomiędzy GSTπ a UPKIIIA oznaczaną w moczu (R=0,34), oraz pomiędzy 8-OHdG a GSTπ w moczu (R=0,35). Wnioski: Wykazano, że zastosowany panel markerów (UPKIIIa, 8-OHdG, GSTπ) ma wartość diagnostyczną w raku pęcherza, a oznaczanie 8-OHdG ma ponadto wartość prognostyczną. Wyniki wskazują, że nie UPKIIIa, lecz 8-OHdG może być wartościowym markerem ekspozycji na ksenobiotyki u chorych na BC. Badanie finansowano z grantu STM.D150.16.037. 29 O 4. CZĘSTOŚĆ WYSTĘPOWANIA PRZECIWCIAŁ SKIEROWANYCH DO ANTYGENÓW UKŁADU RH U DAWCÓW KRWI W LATACH 2012-2015 Marta Leońska1*, Elżbieta Klausa2, Agnieszka Piwowar1 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej, Katedra i Zakład Toksykologii; 2Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa im. Tadeusza Dorobisza we Wrocławiu e-mail: [email protected] Słowa kluczowe : przeciwciała, przeciwciała naturalne, pośredni test antyglobulinowy 1 Wstęp i cel pracy: Przygotowanie bezpiecznych składników krwi do przetoczenia, wymaga wykonywania testów antyglobulinowych, pozwalających między innymi na wykrycie obecności przeciwciał nieregularnych w surowicy krwi, co ma kluczowe znaczenie w procesie doboru dawcy krwi. Celem pracy było ustalenie swoistości wykrytych przeciwciał skierowanych do antygenów z układu Rh w populacji dawców krwi objętych działalnością Regionalnego Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa we Wrocławiu (RCKiK) w latach 2012-2015 i określenie częstości ich występowania. Materiał i metody: Badania wykonano w próbkach krwi pobranych od 100 dawców. Przeprowadzono analizę otrzymanych wyników wraz z udostępnionymi danymi dotyczącymi wykonanych w RCKiK od stycznia 2012 r. do maja 2015 r. badań u 220 089 dawców krwi. W celu wykrycia obecności przeciwciał i ustalenia ich swoistości wykonano pośredni test antyglobulinowy (PTA) przy zastosowaniu mikrometody kolumnowej w żelu. Wyniki: W analizowanym materiale, dodatnie wyniki PTA uzyskano u 74 tj. 0,03% dawców krwi. Przeciwciała skierowane do antygenów z układu Rh stanowiły 44,6 % wszystkich wykrytych przeciwciał, w tym: 37% wykazywało swoistość anty-E, 24% – anty-D, 18% – anty-Cw, 12% – anty C, 6% – anty-c i 3% – anty-G. Dodatkowa analiza jednego przypadku pozwoliła na wykrycie naturalnych przeciwciał o swoistości anty-D. Wnioski: Otrzymane wyniki potwierdzają konieczność wykonywania u dawców krwi badań w kierunku wykrycia przeciwciał nieregularnych, w celu zapobiegania reakcjom poprzetoczeniowym u biorców. Ponadto zaobserwowano, iż spośród przeciwciał wytwarzanych do antygenów układu Rh najczęściej występującymi są przeciwciała anty-E, a nie jak można byłoby przypuszczać przeciwciała skierowane do najczęściej występującego w rasie kaukaskiej antygenu RhD. 30 O 5. HSP67BC POINT MUTATIONS AFFECTS STRUCTURE AND FUNCTION OF D. MELANOGASTER LARVAL MUSCLES Jadwiga Jabłońska1,2, Magda Dubińska-Magiera1, Małgorzata Daczewska1, Krzysztof Jagła2 1 University of Wroclaw, Institute of Experimental Biology, Department of Animal Developmental Biology, Wroclaw, Poland; 2GReD, INSERM U1103, CNRS UMR6293, University of Clermont-Ferrand, Clermont-Ferrand, France Background/Objectives: Small Heat Shock Proteins (sHSPs) are abundant molecular chaperones, involved in proper protein folding and autophagy. Genetic mutations which cause changes of highly conserved residues in these proteins underlay some severe genetic diseases such as muscle dystrophies and neuropathies. Here we examine whether the mutated forms of Hsp67Bc – one of the Drosophila melanogaster sHSPs – affect structure and function of 3rd larval muscles. Material and Methods: D. melanogaster is a valuable model to investigate various inherited diseases. To reduce the toxic effect of mutated proteins we chose tissue specific induction. We used immunofluorescence assays to determine muscle morphology and protein localization, and TEM for detailed ultrastructure examination of larval muscle fibers. Muscle performance was tested both in vitro (contractility) and in vivo (behavioral assays). Results: Hsp67BcR126E and R126N mutants have strikingly different localization patterns. The Hsp67Bc R126 Emutation shows regular ‘wild-type’-like localization with some additional nuclear pattern, whereasHsp67Bc R126N protein forms extensive aggregates, some placed in neuromuscular junction vicinity. However both seem to cause similar defects in muscle structure like distorted Z-disc and increased glycogen storage. Moreover TEM analysis revealed clusters of mitochondria with altered morphology and organization in the Hsp67BcR126N mutant. Surprisingly muscle performance, both in vivo and in vitro, was more affected in the Hsp67Bc R126E mutant. Conclusions: Our experiments show two potential pathogenesis mechanisms underlying genetic disorders. On one hand aggregate forming seems to promote storage of dysfunctional organelle (mitochondria clusters in Hsp67Bc R126N), which may be caused by impaired autophagy. The another mechanism may be connected with less specific and/or more stable protein-protein interactions (Hsp67Bc R126E slightly different pattern than ‘wild-type’), that significantly changes all other primary functions. Research supported with National Science Centre grant NCN 2014/13/D/NZ4/02038 31 O 6. THE MYOPHOSPHORYLASE EXPRESSION AND PROTEIN DISTRIBUTION IN VERTEBRATE MYOGENESIS Anna Lewicka1, Marta Migocka-Patrzałek1, Małgorzata Daczewska1 1 Department of Animal Developmental Biology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Biological Sciences, University of Wroclaw, Sienkiewicza 21, 50-335 Wroclaw, Poland, e-mail: [email protected] Key words: glycogen phosphorylase, myophosphorylase, Danio rerio Background: Myophosphorylase (PYGM) is a muscle-specific isoform of glycogen phosphorylase, it is the enzyme that catalyses the first step of glycogenolysis. So far there are more than 150 different mutations of the PYGM gene, that give rise to McArdle disease. Mutations mostly result in deficiency of this key enzyme in the muscle metabolism. The disease manifests symptoms such as reduced ability to increased physical activity, premature fatigue, muscle pain and/ or muscle cramps that can lead to myoglobinuria. So far there is no effective treatment available. Objectives: Our goal is to analyze a pattern of expression and protein distribution of myophosphorylase in developing muscles. Material and Methods: We have chosen Danio rerio (zebrafish) and Drosophila melanogaster (fruit fly) as models in our research. Transparent and externally developing embryos of Danio allow us to use in situ hybridization, Western Blot and fluorescent confocal microscopy analysis at all developmental stages. Drosophila, a well-known model of various inherited diseases, was used to perform tissue specific knock-down in 3rd instar larvae. Fluorescent confocal microscopy visualized muscle morphology and protein location. Results: The mRNA of PYGM is present in both developing and fully developed muscle tissue. Myophosphorylase is present in skeletal muscle cells in the proximity of the Z line. Myophosphorylase is evenly present in the whole muscle tissue for up to 24 hours post fertilization. After 24 hours PYGM accumulates in slow muscle fibers. Reduced level of glycogen phosphorylase changes muscle fibers morphology. Conclusions: We conclude that myophosphorylase has an important role in the vertebrate myogenesis. The reduction of the protein level, leads to other than normal development of muscle fibers morphology. Moreover, it is expressed at early stages of development and the protein distribution changes in a controlled way. 32 O 7. GLIKACJA BIAŁEK MACIERZY ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ W TĘTNICACH Aleksandra Kuzan1 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ul. T. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław, e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: kolagen, elastyna, glikacja, końcowe produkty zaawansowanej glikacji Cel: Glikacja jest to powolny, fizjologiczny, acz uznany za degeneracyjny proces, w którym cukry redukujące oddziałują z grupami aminowymi białek, zmieniając trwale ich właściowści. Celem pracy było wyłonienie zależności miądzy zwartością głównych białek macierzy zewnątrzkomórkowej w tętnicach – kolagenu typu I, III, IV i elastyny a zawartością produktów końcowych zaawansowanej glikacji (AGE) w próbce, z uwzględnieniem parametru wieku i stopnia zaawansowania miażdżycy. Hipoteza zakłada, że im więcej substratu glikacji – białek macierzy, tym więcej AGE. Spodziewanym wynikiem jest również wzrost zawartości AGE wraz z wiekiem osoby od której pochodziła próbka i stopniem zaawansowania miażdżycy. Materiały i metody: Materiał badawczy stanowiły 103 wycinki aort, a analizę biochemiczną wykonano posługując się testem ELISA i immunoblotingiem. Wyniki poddano analizie korelacji Spermana oraz regresji wieloczynnikowej. Wyniki: W analizowanych wycinkach tętnic stwierdzono zawartość produktów zaawansowanej glikacji w ilości 0,522 (+/- 0,373) mg/g tkanki. Wykazano słabą ujemną korelację między zawartością AGE a zawartością kolagenu typu III (r=-0,258, p=0, 0122) i IV (r=-0,206, 0,0456), a także ujemną słabą korelację między kolagenem typu III a wiekiem osoby, od której pochodziła próbka (r=-0,218, p= 0,0262). Jest to wynik odwrotny niż zakładała hipoteza. Jednak wraz ze wzrostem wieku maleje korelacja pomiędzy AGE a kolagenem typu III. Wnioski: Postuluje się, że wyniki tego, a także innych badań wykonywanych technikami immunoenzymatycznymi mogą być wynikiem artefaktów wynikających z glikacji, która może modyfikować na tyle cząsteczki białek, że przeciwciała nie rozpoznają antygenu, bądź skutki glikacji (powstawanie wiązań krzyżowych) mogą blokować dostęp przeciwciał do antygenu. Analiza próbek pochodzących od osób w różnym wieku, zróżnicowanych pod względem chorób, szczególnie cukrzycy, może być obarczona dużym błędem, co należy mieć na uwadze przy projektowaniu badań i interpretowaniu wyników. 33 O 8. WPŁYW WYBRANYCH PARAMETRÓW NA PROCES TWORZENIA MIKROSFER POLISACHARYDOWYCH Justyna Gawenda1*, Marta Tsirigotis-Maniecka1 Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny, Zakład Technologii Organicznej i Farmaceutycznej *e-mail:[email protected] 1 Słowa kluczowe: enkapsulacja, karboksymetyloceluloza, mikronośnik Cel: Celem wykonanych badań była optymalizacja procesu formowania mikrosfer zbudowanych z karboksymetylocelulozy, tak aby otrzymać trwałe produkty o określonych cechach morfologicznych. Materiały i metody: Materiałem budulcowym otrzymywanych mikrosfer była karboksymetyloceluloza o masie cząsteczkowej 250 kDa. Proces enkapsułowania modelowego barwnika przeprowadzono metodą wkraplania, a otrzymane produkty stabilizowano jonami trójwartościowymi. Optymalizację procesu formowania mikrosfer wykonano modyfikując wybrane parametry procesu: stężenie użytego polisacharydu, stężenie jonów sieciujących, wysokość z jakiej wkraplano mieszaniny oraz szybkość wkraplania mieszaniny do medium sieciującego. Charakterystykę morfologiczną otrzymanych mikrosfer przeprowadzono za przy użyciu mikroskopu optycznego. Określono także wydajność procesu enkapusłowania barwnika na podstawie pomiarów spektrofotometrycznych. Wyniki: Wyznaczono najbardziej optymalny czas stabilizowania utworzonych mikrononośników. Prześledzono profile dyfuzji barwnika z utworzonych produktów w trakcie ich zestalania. Otrzymano 36 produktów, o średnicach w zakresie 697-1012 µm. Otrzymane produkty różniły się strukturą powierzchni i kształtem, choć większość z nich była kulista. Wydajność procesu enkapsułowania barwnika w mikrosferach zawierała się w granicach 11-62%. Podsumowanie: Zoptymalizowano proces formowania mikronośników zbudowanych z karboksymetylocelulozy. Dobrano odpowiednie parametry ich formowania, tak aby otrzymane produkty posiadały oczekiwane właściwości użytkowe – umożliwiały skuteczną enkapsulację małocząsteczkowego związku. 34 O 9. NOWA METODA ANALIZY ILOŚCIOWO-JAKOŚCIOWEJ KOMÓREK UKŁADU ODPORNOŚCIOWEGO W OBRĘBIE UKŁADU ROZRODCZEGO MYSZY Katarzyna Mikołajewicz1,2, Anna Chełmońska-Soyta1, Grzegorz Chodaczek2* Laboratorium Immunologii Rozrodu, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN, Wrocław, Polska 2 Laboratorium Mikroskopii Konfokalnej, Wrocławskie Centrum Badań EIT+, Wrocław, Polska *email: [email protected] 1 Słowa kluczowe: układ rozrodczy, układ odpornościowy, optyczne oczyszczanie tkanek, cytometria przepływowa, mikroskopia konfokalna Cel. Homeostaza układu rozrodczego utrzymywana jest m.in. przez obecne w nim komórki układu odpornościowego, a w szczególności limfocyty T γδ. Mechanizmy kontroli immunologicznej mikrośrodowiska śluzówki rozrodczej są bardzo słabo poznane, po części z uwagi na brak informacji o składzie jakościowym i ilościowym oraz przestrzennej dystrybucji komórek odpornościowych w obrębie układu rozrodczego. Celem prowadzonych badań jest opracowanie metody pozwalającej na dogłebną charakterystykę ilościowo-jakościową głównych populacji komórek układu immunologicznego w różnych stanach fizjologicznych układu rozrodczego myszy. Materiały i metody. W poszukiwaniu najlepszej metody charakterystyki komórek odpornościowych w układzie rozrodczym zastosowano dwa podejścia: cytometria ex vivo po trawieniu enzymatycznym tkanki oraz mikroskopia konfokalna in situ po chemicznym oczyszczaniu tkanki. W eksperymentach wykorzystano myszy transgeniczne Tcrd-H2BeGFP, które są myszami reporterowymi komórek T γδ dzięki swoistej ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP). Trawienie enzymatyczne prowadzono za pomocą dyspazy i kolagenazy. Do optycznego oczyszczania układu rozrodczego zastosowano metody CUBIC i ScaleS oraz odczynnik ProlongGold. Wyniki. Trawienie enzymatyczne jest standardową metodą izolacji komórek z tkanek poprzedzającą analizę cytometryczną. Zastosowanie kolagenazy pozwoliło na uzyskanie największej ilości komórek T γδ z pojedynczego układu rozrodczego, co zostało potwierdzone cytometrycznie. Z kolei, metoda CUBIC była najskuteczniejsza w optycznym oczyszczaniu tkanek, które stały się niemal przezroczyste, co znacznie poprawiło jakość obrazowania fluorescencyjnego, bez pogorszenia sygnału białka GFP. Porównując metody ex vivo i in situ wykazaliśmy, że średnia liczba komórek T γδ uzyskanych w wyniku trawienia jest znacząco mniejsza niż liczba komórek widocznych in situ po oczyszczaniu. Wnioski. Oczyszczanie optyczne układu rozrodczego myszy reporterowych metodą CUBIC, a następnie analiza preparatów za pomocą mikroskopii konfokalnej i technik obróbki obrazów w programie ImageJ pozwala na ilościowe scharakteryzowanie limfocytów T γδ zasiedlających układ rozrodczy ze wskazaniem ich lokalizacji w obrębie tkanki. Opracowana metoda in situ przewyższa metodę ex vivo, z uwagi na straty komórek po enzymatycznym trawieniu tkanki oraz na brak informacji o ich dystrybucji przestrzennej w tkance. Metoda CUBIC będzie w przyszłości zastosowana do analizy myszy potrójnie fluorescencyjnych, które umożliwią jednoczesną charakterystykę trzech populacji komórek układu odpornościowego: komórek T γδ, komórek T αβ oraz komórek dendrytycznych. 35 O 10. ZASTOSOWANIE FOSFATYDYLOCHOLINY W PROJEKTOWANIU PROLEKÓW NA BAZIE KWASU WERATROWEGO Marta Czarnecka1*, Magdalena Rychlicka1, Natalia Niezgoda1, Marta Świtalska2, Joanna Wietrzyk2, Czesław Wawrzeńczyk1, Anna Gliszczyńska1 Katedra Chemii, Wydział Nauk o Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 25, 50-375 Wrocław; 2 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszwelda, PAN, ul. R. Weigla 12, 53-114 Wrocław *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: fosfatydylocholina, kwas weratrowy (kwas 3,4-dimetoksybenzoesowy), aktywność antynowotworowa Cel: Celem badań było połączenie dwóch aktywnych terapeutycznie cząsteczek: fosfatydylocholiny i kwasu weratrowego. Podstawą tej koncepcji badań było otrzymanie pochodnych kwasu weratrowego o zwiększonej biodostępności i aktywności cytotoksycznej względem wybranych linii komórek nowotworowych. Materiał i metody: 1,2-Diweratroilo-sn-glicero-3-fosfocholinę otrzymano w reakcji estryfikacji Steglicha. Kompleks kadmu z sn-glicero-3-fosfocholiną (GPC x CdCl2) poddano acetylacji kwasem weratrowym w obecności 4-(N,N-dimetyloamino)pirydyny (DMAP) i N,N’-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) jako czynnika sprzęgającego. Analogicznie otrzymano pochodą fosfatydylocholiny zwierającą cząsteczkę kwasu palmitynowego w pozycji sn-1 oraz kwas weratrowy w pozycji sn-2. W pierwszym etapie 1,2dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę poddano selektywnej hydrolizie z udziałem fosfolipazy A2 (PLA2) do lizofosfocholiny, którą następnie zacetylowano według metody opisanej przez d’Arrigo i wsp. 1Weratroilo-2-palmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę otrzymano w wyniku 2-etapowej syntezy. W pierwszym etapie uzyskano lizofosfocholinę w reakcji chorku kwasu fenolowego z cyklicznym acetalem utworzonym z GPC i DBTO (tlenku t-butylocyny), którą następnie poddano estryfikacji kwasem palmitynowym. Uzyskane fosfatydylocholiny oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej, a ich struktury potwierdzono w oparciu o dane spektroskopowe. Wszystkie pochodne fosfatydylocholiny przebadano na aktywność przeciwnowotworową w stosunku do linii komórkowych: ludzkiej białaczki (MV4-11), raka piersi (MCF-7), raka płuc (A549), raka okrężnicy (LOVO), typu lekoopornego raka okrężnicy (LOVO-DX) oraz nowotworu wątroby (HepG2), a także sprawdzono cytotoksyczność otrzymanych związków wobec mysich fibroblastów (Balb/3T3). Wyniki: W trakcie badań otrzymano 3 nowe, nieopisane dotąd w literaturze pochodne fosfocholiny zawierające w swej strukturze cząsteczki kwasu weratrowego. Związki te wykazały aktywność antynowotworową nawet 9-krotnie silniejszą niż wolny kwas fenolowy. Wnioski: Połączenie kwasu weratrowego z cząsteczką fosfatydylocholiny prawdopodobnie wpłynęło na zwiększenie biodostępność, co zostało udowodnione przez porównanie właściwości antyproliferacyjnych wolnego kwasu i fenolowych fosfolipidów. Badania realizowane są w ramach projektu nr 2013/09/D/NZ9/02457 finansowanego ze środków Narodowego Centrum Nauki. 36 O 11. PORÓWNANIE WYNIKÓW OPERACYJNEGO LECZENIA PRZERZUTÓW Z PIERWOTNEGO RAKA PŁUC I METACHRONICZNYCH GUZÓW PŁUC Piotr Błasiak1, Adam Rzechonek1, Julita Kulbacka4, Olga Michel4, Beata Muszczyńska-Bernhard3, Jarosław Adamiak3, Konrad Pawełczyk1, Ewa Żak1, Jolanta Saczko4, Jędrzej Grzegrzółka2 Katedra i Klinika Chirurgii Klatki Piersiowej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, ul. Grabiszyńska 105, 53-439 Wrocław; 2 Katedra i Zakład Histologii i Embriologii, Uniwersytet Medyczny We Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 6a, 50-368 Wrocław; 3 Zakład Patomorfologii, Dolnośląskie Centrum Chorób Płuc, ul. Grabiszyńska 105, 53-439 Wrocław; 4 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny We Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław, Poland e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: rak płuca, przerzuty do płuc, metachroniczne guzy płuc, leczenie chirurgiczne, kryteria Martini'ego-Melamed'a Cel: Badanie wykazało efektywność chirurgicznego leczenia mnogich nowotworów płuc. Materiał i metody: Analizie poddano 49 pacjentów, u których wykonano dwukrotnie resekcję guzów nowotworowych płuc pojawiających się dwukrotnie w okresie 2001-2014. Zależnie od wyniku histopatologicznego wydzielono: grupę I, którą stanowiło 26 chorych z przerzutami i grupę II, do której włączono 23 chorych z nowymi pierwotnymi nowotworami płuca. Średni wiek pacjentów w obu grupach wynosił odpowiednio w grupie I – 66,1 lat (+/- 11 lat, mediana – 66) i w grupie II – 65,5 lat (mediana – 64). W grupie I było 9 kobiet i 17 mężczyzn, w grupie II – 8 kobiet i 15 mężczyzn. W rozpoznaniu różnicowym guzów metachronicznych i przerzutów uwzględniono kryteria Martini'egoMelameda. Chorobowość i rodzaje przeprowadzonych operacji były porównywalne. Anatomiczne resekcje przeprowadzono odpowiednio w 22% i 17% przypadków. Wyniki: Długoterminowe skutki resekcji są podobne, choć wskazują na trend lepszego rokowania u pacjentów po resekcji przerzutów. Czas wolny od choroby u pacjentów z guzami metachronicznymi okazał się dłuższy. Wnioski: 1. Wyniki metastazektomii płucnej po pierwotnym raku płuca wykazują tendencję lepszego rokowania niż resekcji metachronicznych raków płuca. 2. Wystąpienie drugiego guza płuca wymaga różnicowania pomiędzy guzem metachronicznym, a przerzutem. 3. Powyższe informacje są przydatne przy podejmowaniu decyzji terapeutycznej dotyczącej zakresu resekcji i określenia ryzyka u pacjentów po przebytej resekcji raka płuca. 37 O 12. HODOWLA PIERWOTNA FIBROBLASTÓW W AUGMENTACJI DZIĄSŁA I POKRYWANIU MNOGICH RECESJI Barbara Sterczała1, Jolanta Saczko2, Marzena Dominiak1 Katedra i Zakład Chirurgii Stomatologicznej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu e-mail: [email protected] 1 2 Słowa kluczowe: hodowla fibroblastów, augmentacja dziąsła, mnogie recesje, cienki biotyp Szacuje się że ok. 60% populacji ludzkiej cierpi na recesje dziąsłowe. Coraz częściej patologia ta dotyka osób młodych, u których zdiagnozowano cienki biotyp, będący powodem niestabilności tkankowej oraz ich dużej wrażliwości na wszelkiego rodzaju urazy, również jatrogenne. Cienki biotyp jest wskazaniem do augmentacji w przypadku możliwości powstawania zapalenia okolicznych tkanek miękkich, a z czasem dehiscencji i fenestracji kości. Obecne osiągnięcia inżynierii tkankowej dają możliwości pozyskania autogennej tkanki o dowolnej wielkości, z zachowaniem minimum inwazyjności przy pobieraniu tkanki i przy zachowaniu optymalnych efektów estetycznych, zwłaszcza w odcinku przednim jamy ustnej. Wyizolowane fibroblasty z ok. 2mm2 dziąsła zrogowaciałego jamy ustnej, poddane hodowli, zostają przeniesione na matrycę kolagenową 3D i w postaci uwodnionej matrycy komórkowej wszczepione w miejsce biorcze, w ilościach determinowanych przez ubytek tkankowy. Zastosowanie tej metody warunkuje wydolny estetycznie i funkcjonalnie narząd żucia, bądź możliwość jego rehabilitowania poprzez uzyskanie prawidłowej szerokości biologicznej. Wybór wskazań do zastosowania rzeczonej metody pozwoli na osiągnięcie satysfakcjonujących i długoczasowych efektów klinicznych. 38 O 13. OPTYMALIZACJA HODOWLI MYSICH MIELOIDALNYCH KOMÓREK SUPRESOROWYCH Natalia Anger1, Joanna Rossowska1* Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu *[email protected] 1 Słowa kluczowe: Mieloidalne komórki supresorowe, komórki MDSC, interleukina 10 Cel: Mieloidalne komórki supresorowe (MDSC) to heterogenna populacja niedojrzałych komórek pochodzenia mieloidalnego, której zwiększoną liczebność obserwuje się podczas rozwoju nowotworu. Ze względu na dużą aktywność supresorową, komórki MDSC mogą stać się celem terapii przeciwnowotworowych, powodujących osłabienie supresji w nowotworze poprzez eliminację komórek MDSC lub ich różnicowanie w kierunku dojrzałych komórek mieloidalnych. Jednak ze względu na niską wydajność izolacji komórek MDSC z guzów nowotworowych, konieczne jest opracowanie metody pozyskiwania tych komórek w warunkach in vitro. Celem przeprowadzonych badań była optymalizacja warunków różnicowania mysich komórek szpikowych w kierunku komórek MDSC. Materiały i metody: Komórki wyizolowane ze szpiku kostnego zdrowych myszy C57BL/6 hodowano w warunkach ex vivo w obecności rmGM-CSF i supernatantu znad komórek mysiego raka jelita grubego MC38. Po sześciu dniach hodowli, zbadano zdolność uzyskanych komórek do produkcji cytokin oraz określono fenotyp powierzchniowy komórek w oparciu o markery charakterystyczne dla komórek mieloidalnych. Wyniki: Komórki uzyskane po sześciu dniach hodowli w obecności 75% supernatantu znad komórek MC38 hodowanych w warunkach hipoksji były zdolne do produkcji interleukiny 10, cytokiny o właściwościach immunosupresorowych. Ponadto, w hodowli prowadzonej w opisanych warunkach odnotowano wysoki odsetek monocytarnych i granulocytarnych komórek MDSC, a także niski odsetek dojrzałych komórek dendrytycznych. Badane komórki wykazywały również niski poziom ekspresji białek głównego układu zgodności tkankowej klasy II oraz cząsteczek kostymulujących CD80 i CD86. Wnioski: Hodowla mysich komórek szpikowych w obecności rmGM-CSF i 75% supernatantu znad komórek MC38 uzyskanego w warunkach hipoksji pozwala na uzyskanie komórek o charakterystyce niedojrzałych komórek MDSC. Opracowana metoda indukcji komórek MDSC umożliwi prowadzenie badań in vitro nad wpływem nowych terapeutyków na zahamowanie supresji w nowotworze. Badania są finansowane ze środków NCN w ramach projektu grantowego nr 2014/15/N/NZ4/04817. 39 O 14. WPŁYW ESTRADIOLU I JEGO METABOLITÓW NA KOMÓRKI RAKA JAJNIKA EKSPONOWANE NA ZWIĄZKI CHROMU I KADMU Martyna Szydełko1*, Joanna Roik1*, dr Julita Kulbacka2, dr Ewa Sawicka3 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu; 2. Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu; 3. Katedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu *[email protected], [email protected] 1. Słowa kluczowe: rak jajnika, skov – 3, estradiol, chrom, kadm Cel: Wzrastająca zachorowalność na raka jajnika (około 30% nowotworów złośliwych narządów płciowych kobiet w Polsce) uzasadnia badania nad wpływem czynników środowiskowych i ich oddziaływaniem na procesy estrogenozależne. Celem pracy było poznanie efektu działania 17β-estradiolu i jego metabolitów (2-metoksyestradiolu i 16α- hydroksyestronu), a także związków należących do ksenoestrogenów: K2CrO4 oraz CdCl2 na proliferację komórek raka jajnika. Interesujące jest, czy estrogeny pełnią funkcję detoksykacyjną w tego typu narażeniu, czy dochodzi do toksycznego synergizmu z metaloestrogenem. Materiały i metody: Materiałem do badań były komórki raka jajnika linii SKOV-3 (opornej na cytosatyki), które hodowano na podłożu DMEM z dodatkiem FBS. 17β-Estradiol, 2-metoksyestradiol oraz 16α-hydroksyestron rozpuszczono w 96% etanolu, K2CrO4 oraz CdCl2 w wodzie dest., uzyskując roztwory wyjściowe do dalszych eksperymentów. Komórki inkubowano z ksenobiotykami 24 i 48h, a następnie za pomocą testu MTT określono aktywność metaboliczną komórek raka jajnika. Dobór dawek był podyktowany wcześniejszymi badaniami własnymi oraz danymi literaturowymi. Wyniki: Na podstawie badań wstępnych ustalono, że optymalnym przedziałem stężeń związków chromu i kadmu były stężenia od 0,1 μM do 50 μM. Wraz ze wzrostem dawki K2CrO4 oraz CdCl2 obserwowano znaczący spadek aktywności metabolicznej komórek raka jajnika. Dla najwyższej dawki Cr(VI) aktywność ta wynosiła tylko 9%, natomiast dla kadmu 14%. 17β-Estradiol, stosowany w większym przedziale dawek (0,01-200 μM) obniżał aktywność komórek SKOV-3, jednak słabiej niż metale, bowiem nawet przy 200 μM aktywność wynosiła 30%. Z kolei oba metabolity 17β-estradiolu wykazywały silniejsze niż estradiol, niekorzystne działanie na komórki, szczególnie dla 16α-hydroksyestronu. Wnioski: Podczas badania zaobserwowano wrażliwość linii SKOV-3 na badane ksenobiotyki. Zanotowano znacznie obniżoną aktywność komórek pod wpływem działania wysokich stężeń związków, a szczególnie metaloestrogenów: kadmu i Cr(VI). Wykazano ponadto znaczenie biotransformacji estradiolu na skutki toksyczne oceniane testem MTT. Dalszym etapem badań będzie ocena interakcji estrogenów i metali w aspekcie zagrożeń środowiskowych przy równoczesnej terapii hormonami. 40 O 15. ZABURZENIA FUNKCJONOWANIA KOMÓREK INDUKOWANE 3+ 3+ PRZEZ NANOKRYSZTAŁY NAGDF4:YB ER Edyta Wysokińska1*, Jakub Ciochos2, Mirosław Karbowiak2, Leon Strządała1, Wojciech Kałas1,3 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda Polskiej Akademii Nauk, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław, Polska; 2 Wydział Chemii, Uniwersytet Wrocławski, ul. F. Joliot-Curie 14, 50-383 Wrocław,; 3 Wydział Matematyczno-Przyrodniczy, Akademia im. Jana Długosza w Częstochowie, ul. Armii Krajowej13, 42-200 Częstochowa, Polska *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: Nanokryształy lantanowców, cytotoksyczność, lizosomy, makrofagi Celem pracy jest zdefiniowanie mechanizmu toksyczności zdolnych do up-konwersji nanokryształów fluorku gadolinu domieszkowanego iterbem oraz erbem NaGdF4:Yb3+Er3+ (18, 2%) (UCNC). Obecnie fluorki gadolinu oraz podobne nanokryształy zawierające w swojej strukturze jony lantanowców uważane są za mało toksyczne. Jednak nasze wyniki pokazują, że badane nanokryształy są wysoce toksyczne dla makrofagów. Analiza mechanizmu śmierci komórkowej została oparta o metody cytometryczne. Sprawdzono fragmentację DNA, zmiany w strukturze błony komórkowej (podwójne barwienie Aneksyną V-FITC i jodkiem propidyny) oraz aktywność kaspazy 3 i 7. Zaburzenia w budowie oraz funkcji mitochondrium zbadano poprzez ocenę spadku potencjału błonowego oraz poziomu białka Bcl-2 (Western blotting). Żywotność sprawdzono testem MTS. Zakwaszenie komórki oraz ilość mitochondriów oceniono barwiąc komórki znacznikami fluorescencyjnymi (LysoTracker, MitoTracker). Mikroskopia fluorescencyjna oraz elektronowa umożliwiła zbadanie interakcji pomiędzy UCNC a komórkami. Fluorki gadolinu wykazały toksyczność względem mysich makrofagów RAW264.7 oraz J774A.1. Zaobserwowano zależny od stężenia oraz średnicy UCNC spadek żywotności komórek oraz indukcję apoptozy. Ponieważ mitochondria odgrywają kluczową rolę w wewnętrznym szlaku apoptozy sprawdzono zmiany zachodzące w ich błonie. Fluorki gadolinu indukowały depolaryzację błony mitochondrialnej oraz obniżenie poziomu antyapoptotycznego białka Bcl-2. Inkubacja komórek z GdCl3 i NaF wykluczyła toksyczność związaną z wypływem jonów z nanokryształów do pożywki hodowlanej, jednak nie wykluczyła toksyczności jonów uwolnionych we wnętrzu komórki. Ponieważ makrofagi wyspecjalizowane są w degradowaniu materiału różnego pochodzenia, niskie pH w ich lizosomach może także wpływać na zmiany w budowie nanokryształów. Kilkugodzinna inkubacjaz NaGdF4:Yb3+Er3+ wskazała na wzrost poziomu kwaśnych kompartymentów w komórkach. Ponadto zaobserwowano równoczesny wzrost ilości mitochondriów w makrofagach. Uzyskane wyniki wskazują na wysoką toksyczność nanokryształów NaGdF4:Yb3+Er3+. Fluorki gadolinu wpływają za zaburzenia funkcji mitochondriów oraz indukują zależną od stężenia oraz ich średnicy apoptozę. Wzrost zakwaszenia komórek sugeruje, że fluorki gadolinu ulegają zniszczeniu wewnątrz lizosomów w wyniku czego do wnętrza komórek uwalniane są toksyczne jony lantanowców oraz fluoru. 41 O 16. IZOPRENOIDY ORAZ ICH POCHODNE JAKO TERAPEUTYKI SKUTECZNE W LECZENIU CHORÓB NOWOTWOROWYCH Magdalena Rychlicka*, Marta Czarnecka, Anna Gliszczyńska Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, wydział nauk o Żywności, Katedra Chemii, ul. C. K. Norwida 25, 50-375 Wrocław *e-mail: [email protected] Słowa kluczowe: Izoprenoidy, aktywność antyproliferacyjna, fosfolipidy, cytostatyki W literaturze szeroko opisywana jest aktywność terapeutyczna związków izoprenoidowych, m. in. przeciwnowotworowa, chemoprewencyjna, immunomodulacyjna, przeciwzapalna czy antydrobnoustrojowa. Wśród wspomnianych właściwości na szczególną uwagę zasługuje aktywność cytotoksyczna. Jednym z najbardziej znanych związków izoprenoidowych stosowanych w terapii raka jajników, płuc i piersi jest taksol [1]. W II fazie badań klinicznych znajduje się również alkohol perylowy, który zarówno w testach in vitro jak i in vivo wykazuje zdolność indukowania apoptozy komórek raka prostaty [2]. Najnowsze wyniki badań dowodzą, że także acykliczne terpenoidy takie jak: geraniol, geranylogeraniol czy farnezol charakteryzują się aktywnością antyproliferacyjną w stosunku do wybranych linii nowotworowych [3]. Związki te w testach in vitro w znacznie większym stopniu hamują rozwój komórek z zaburzonym procesem proliferacji w porównaniu do komórek zdrowych, co jest cechą odróżniającą je od powszechnie stosowanych cytostatyków takich jak cisplatyna. Niestety, możliwości aplikacyjne związków pochodzenia naturalnego jako farmaceutyków napotykają na ograniczenia związane z ich niską biodostępnością w organizmie człowieka. W związku z tym poszukuje się chemicznych i biotechnologicznych metod otrzymywania ich pochodnych o zwiększonej aktywności biologicznej i absorbcji w warunkach in vivo. Przedmiotem prezentacji będzie zatem przedstawienie chemoenzymatycznych metod modyfikacji związków izoprenoidowych cząsteczkami kwasów tłuszczowegch lub fosfolipidami, jako sposób otrzymywania nowej generacji terapeutyków skutecznych w leczeniu chorób nowotworowych. Badania realizowane w ramach projektu nr 2013/09/D/NZ9/02457 finansowanego ze środków Narodowego Centrum Nauki 42 O 17. METABOLOMIKA JAKO POTENCJALNE NARZĘDZIE DO OKREŚLANIA WPŁYWU SPOŻYWANIA NABIAŁU Joanna Piechowicz, Mariusz G. Fleszar, Andrzej Gamian Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu [email protected] Słowa kluczowe: metabolomika, nabiał, biomarkery Współczesne poglądy na temat spożywania mleka i przetworów nabiałowych są bardzo zróżnicowane. Większość oficjalnych zaleceń i raportów wymienia dobroczynny wpływ wyżej wymienionych produktów na zdrowie człowieka. Nabiał jest przedstawiany jako ważny składnik w nowej piramidzie żywności. Część z obecnie publikowanych wyników badań, naukowców, na podstawie swoich badań, przedstawia opinie o szkodliwym wpływie mleka na zdrowie, wykazując wpływ nabiału na rozwój osteoporozy, miażdżycy, próchnicy, reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby wrzodowej, zaburzeń żołądkowojelitowych czy chorób układu krążenia. Ponadto istnieją przypuszczenia o związku pomiędzy różnymi rodzajami nowotworów a dietą bogatą w duże ilości mleka krowiego. Wśród czynników kancerogennych związanych ze spożyciem nadmiaru mleka wymienia się obecność hormonów wzrostu w mleku czy ostrą blokadę śluzową spowodowaną przez przewlekła anemię i wygłodzenie. Metabolomika, rozwijająca się dziedzina w naukach biolochemicznych, może służyć jako potencjalne narzędzie do szacowania wpływu spożywania produktów nabiałowych. Poprzez identyfikacje i analizę związków o niskiej masie cząsteczkowej (<1,5 kDa) można określić profil metabolomiczny, który jest bezpośrednio powiązany ze stanem zdrowia pacjenta. Ostatnio za najbardziej obiecujące biomarkery uważa się 14:1 i 17:1 kwasy tłuszczowe oraz 15:0 estry cholesterolu. Zestaw zróżnicowanych metabolitów powiązanych ze spożywaniem nabiału został wstępnie określony. Dokładna identyfikacja szlaków metabolomicznych wymaga jednak dalszej walidacji potencjalnych biomarkerów. Z tego względu dalsze badania są zalecane w celu pełnego wyjaśnienia roli produktów nabiałowych na zdrowie i odżywianie człowieka. 43 O 18. MIKROSEKUNDOWA ELEKTROPORACJA KOMÓREK GLEJAKA- BADANIA IN VITRO Natalia Niedzielska1*, Małgorzata Kotulska1, Julita Kulbacka2 Katedra Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Wrocławska; 2 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: elektroporacja mikrosekundowa, wapń, komórki nowotworowe glejaka Cel: Celem pracy było doświadczalne zbadanie przeżywalności komórek glejaka poddanych elektroporacji mikrosekundowej (ang. Microsecond Pulsed Electric Fields, μsPEF) i określenie odpowiednich stężeń jonów wapnia (CaCl2) oraz optymalnych warunków pola elektrycznego, które wpływają na komórki nowotworowe. Materiały i metody: Doświadczenia przeprowadzono na linii komórkowej SNB19 (linia ludzkich komórek nowotworowych glejaka). Komórki hodowano w sterylnych warunkach w butelkach hodowlanych w postaci monowarstwy. Komórki SNB19 elektroporowano w obecności i bez obecności jonów wapnia. Ocenę aktywności mitochondriów wykonano testem cytotoksyczności MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) po inkubacji 24 h i 72 h. Dodatkowo dokonano immunocytochemicznej oceny ekspresji markera nowotworów mózgu MGMT (ang. O6-alkylguanine DNA alkyltransferase) i markera apoptozy: kaspazy-3, kaspazy-8, kaspazy-12 w komórkach poddanych eksperymentom. Wyniki: Otrzymane wyniki wskazują, że odpowiednio dobrane parametry elektroporacji (natężenie pola elektrycznego i stężenie wapnia) eliminują badane komórki glejaka. Zastosowanie metody połączonej z podawaniem jonów wapnia powoduje wzrost śmiertelności komórek nowotworowych o 50%. Ocena immunocytochemiczna pokazuje podwyższoną ekspresję białek zaangażowanych w proces apoptozy. Wraz ze wzrostem natężenia pola elektrycznego, obserwujemy na zdjęciach mikroskopowych silne zabarwianie świadczące o większej śmiertelność komórek. Wnioski: Otrzymane wyniki mogą mieć wpływ na rozwój elektrochemioterapii (ang. Electrochemotherapy, ECT) przy leczeniu guzów głębiej zlokalizowanych. Chlorek wapnia w porównaniu do standardowo stosowanych cytostatyków wykazuje niską toksyczność wobec zdrowych komórek. Finansowanie: Grant nr 210/2016 koła naukowego BioNanopor Politechniki Wrocławskiej 44 O 19. ZASTOSOWANIE ELEKTROPORACJI Z LEUKOWORYNĄ NA LEKOOPORNYCH KOMÓRKACH RAKA TRZUSTKI Olga Michel1*, Justyna Mączyńska1, Nina Rembiałkowska1, Katarzyna Bieżuńska-Kusiak1, Anna Szewczyk2, Julita Kulbacka1, Jolanta Saczko1 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław; 2Uniwersytet Wrocławski, Instytut Biologii Eksperymentalnej, ul. H. Sienkiewicza 21, 50-335 Wrocław *e-mail: [email protected]. wroc.pl 1 Słowa kluczowe: leukoworyna, gruczolakorak przewodowy trzustki, elektroporacja, lekooporność Cel: Pomimo znaczącego postępu w diagnozowaniu i leczeniu raka trzustki, gruczolakorak przewodowy wciąż stanowi jeden z najbardziej śmiertelnych nowotworów. Za główne przyczyny uważa się przede wszystkim późne diagnozowanie oraz wysoki stopień lekooporności komórek rakowych. Dlatego też w przypadku tego nowotworu duże nadzieje wiąże się z leczeniem eksperymentalnym. Za takie uważ się elektrochemioterapię (ECT) – metodę terapeutyczną polegającą na dostarczeniu do komórki krótkich pulsów elektrycznch w celu zwiększenia skuteczności transportu leków przeciwnowotworowych. Szybkie nabywanie przez komórki raka oporności na znane cytostatyki stanowi przesłankę do poszukiwania nowych leków, które w normalnych warunkach nie wnikają do komórek. Celem niniejszej pracy jest ocena efektywności elektrochemioterapii z leukoworyną na lekoopornych komórkach raka trzustki. Materiały i metody: Materiał do badań stanowiły dwie ludzkie linie komórkowe gruczolakoraka przewodowego trzustki: oporna na daunorubicynę (EPP-85 181 RDB) oraz wrażliwa (EPP-85 181 P). Komórki były utrzymywane w hodowli i następnie i poddane elektroporacji w buforze zawierającym lekoworynę w stężeniu 5, 10 lub 25µM. Aktywność mitochondrialną zmierzono za pomocą testu MTT po 24- i 72-godzinnej inkubacji. W celu dokładniejszego zbadania odpowiedzi komórek na zwiększony transport leku wykonano barwienie immunocytochemiczne oceniające aktywność s-transferazy glutationu (GSTπ) oraz kanałów wapniowych aktywowanych niskim napięciem (α1H). Wyniki: Zgodnie z przewidywaniem, linia komórkowa 181 RDB charakteryzuje się większą niż linia 181 P opornością, również w odniesieniu do leukoworyny. Zaobserwowano natomiast, że elektroporacja powoduje zmniejszenie aktywności mitochondrialnej w linii opornej, co było szczególnie widoczne po 72-godzinnej inkubacji. Barwienie immunocytochemiczne wykazało nieznaczne zwiększenie aktywności GSTπ oraz znaczący wzrost ekspresji α1H na skutek zastosowanej terapii. Wnioski: Uzyskane rezultaty wskazuja, że elektroporacja może stanowić dodatkową drogę transportu leku do wnętrza komórki i dzięki temu wpływać na jego skuteczność. Wstępne wyniki pokazują potencjał elektrochemioterapii w leczeniu nowotworów charakteryzujących się wysokim stopniem lekooporności. Należy jednak podkreślić, że dogłębne zrozumienie procesów zachodzących w komórce pod wpływem elektroporacji z alternatywnymi lekami wymagają dalszych badań. Finansowanie: Badania wykonano w ramach projektu PREL.A040.16.005 (Nina Rembiałkowska). 45 O 20. WPŁYW ELEKTROPORACJI NA LUDZKIE KOMÓRKI GRUCZOLAKORAKA JELITA GRUBEGO (LOVO/DX) Agata Błaszczyńska1*, Julita Kulbacka2 Wydział Chemiczny, Biotechnologia, Politechnika Wrocławska; 2 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: elektroporacja, elektrochemioterapia, LOVO-DX, biochanina A, jony wapnia Cel: Ocena skuteczności elektroporacji oraz elektrochemioterapii na komórki gruczolakoraka jelita grubego (LOVO/DX) z opornością wielolekowej z wykorzystaniem jonów wapnia i biochaniny A w badaniach in vitro. Materiały i metody: Badania były wykonywane w Laboratorium Biochemicznym Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu przy Katedrze i Zakładzie Biochemii Lekarskiej. Elektroporację przeprowadzano stosując 8 impulsów 100 µs o odpowiednim napięciu dla danej próby (400-2000 V/cm) o częstotliwości 1 Hz każda. Kolejny etap eksperymentu polegał na określeniu wpływu inkubacji komórek z jonami wapnia i biochaniny A (flawonu pochodzącego z czerwonej koniczyny). W tym celu korzystano z roztworów o stężeniach: jony wapnia – 0.25-10 mM oraz biochanina A – 0.0152-1 µmol/ml. W ostatnim etapie badano wpływ elektrochemioterapii z wykorzystaniem jonów wapnia i biochaniny A. W tym celu zastosowano napięcie o wartości 800 i 1200 V/cm połączone z roztworem jonów wapnia o wartości 0.5 i 1 mM lub biochaniny A o wartości 0.0152; 0.03125; 0.0625 i 0.125 µmol/ml. Przeżywalność komórek weryfikowano za pomocą testu MTT po 24h lub 72h inkubacji. Wyniki: Zarówno przy zastosowaniu elektroporacji i zmierzeniu przeżywalności komórek po czasie inkubacji 24h jak i 72h widoczna jest zwiększona śmiertelność komórek wraz ze wzrostem napięcia. Okazuje się, że inkubacja z jonami wapnia przy zastosowaniu niższych stężeń powoduje stymulację komórek do wzrostu. Zastosowanie samej biochaniny A, bez elektroporacji spowodowało zmniejszoną żywotność komórek nowotworowych – roztwór biochaniny A o stężeniu 0.125 μmol/ml spowodował śmierć praktycznie całej populacji komórek. Połączenie elektroporacji z jonami wapnia przyniosło oczekiwany cytotoksyczny efekt. W doświadczeniu tym przy niskich stężeniach jonów wapnia jest zauważalny spadek przeżywalności komórek. Elektrochemioterapia z biochaniną A przyczyniła się do śmierci większej ilości komórek niż w przypadku zastosowaniu jedynie inkubacji z tym związkiem. Wnioski: Uzyskane efekty świadczą o zwiększeniu przepuszczalności błony komórkowej w wyniku zastosowania elektroporacji, dzięki której w błonie tworzą się nanopory, co umożliwia niekontrolowany przepływ związków do jak i z komórki. Okazuje się, że inkubacja hodowli komórkowej z biochaniną A powoduje śmierć części komórek i na podstawie uzyskanych wyników można wnioskować, że połączenie elektroporacji z naturalnym związkiem – biochaniną A może okazać się świetną metodą walki z nowotworami o oporności wielolekowej. Finansowanie: Grant nr 210/2016 koła naukowego BioNanopor Politechniki Wrocławskiej 46 PREZENTACJE POSTEROWE P 1. OCENA WPŁYWU ELEKTROPORACJI NA KOMÓRKI PC12 MODELOWE I Z NGF W BADANIACH IN VITRO Michał Andruszkiewicz1,2*, Julita Kulbacka2, Anna Szewczyk3, Małgorzata Kotulska1 Katedra Inżynierii Biomedycznej, Wydział Podstawowych Problemów Techniki, Politechnika Wrocławska; 2 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu; 3Zakład Biologii Rozwoju Zwierząt, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Uniwersytet Wrocławski *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: Elektroporacja, PC-12, NGF, MTT, test klonogenny, cytoszkielet komórkowy Cel: Elektroporacja powoduje powstawanie w komórkach hydrofilowych porów. W zależności od natężenia różny jej jej wpływ. Celem badania było sprawdzenie wpływu odwracalnej elektroporacji na mysich komórkach guza chromochłonnego (linia PC12) oraz tych samych komórkach stymulowanych neuronalnym czynnikiem wzrostu (NGF). Pod wpływem NGF komórki PC12 zmieniają się fenotypowo z chromochłonnych na komórki podobne do neuronów układu współczulnego i są dobrym modelem do w badaniach neurobiologicznych. Materiały i Metody: Komórki PC12 wraz z NGF hodowano przed badaniem przez 30 dni. W badaniu zastosowano następujące parametry elektroporacji: natężenie pola elektrycznego: 800 V/cm, 1200 V/cm, 1600 V/cm oraz 2000 V/cm; 8 impulsów o długości równej 100 µs i częstotliwości 1 Hz. Przeżywalność komórkową badano za pomocą testu klonogennego, który pozwala na analizę przeżywalności komórek oraz ich zdolności do tworzenia kolonii, oraz testu MTT, który służy do oznaczania aktywności przemian energetycznych w mitochondriach. Wykonano także barwienie immunofluorescencyjne z F-aktyną znakowaną fluorescencyjnie (Alexa Fluor® 546 Phalloidin). Wyniki: Uzyskane wyniki wykazują różnicę w odpowiedzi komórek zróżnicowanych i niezróżnicowanych na natężenie pola elektrycznego. Jak zaobserwowano komórki PC12 z NGF wykazały znacznie większą wrażliwość na zewnętrzne pulsowe pole elektryczne. Różnice widać zarówno w testach MTT, klonogennym jak i w przypadku zmian w cytoszkielecie komórkowm. Wnioski: Wyniki jednoznacznie wskazują na różnice w odpowiedzi komórek na zewnętrzne pole elektryczne. Komórki PC12 z NGF były znacznie bardziej wrażliwe na samo pole elektryczne. Otrzymane wyniki mogą służyć za podstawę do wykonywania badań modelujących komórki nerwowe, do których wnętrza wprowadzane będą substancje hydrofilowe za pomocą elektroporacji. W dalszej perspektywie umożliwi to badanie mechanizmów i potencjalnych leków chorób neurodegeneracyjnych. Finansowanie: Grant nr 210/2016 koła naukowego BioNanopor Politechniki Wrocławskiej 49 P 2. WPŁYW JONÓW WAPNIA WPROWADZONYCH DO KOMÓRKI METODĄ ELEKTROPORACJI NA INDUKCJĘ APAPTOZY ORAZ EKSPRESJĘ KANAŁÓW WAPNIOWYCH TYPU T W KOMÓRKACH GRUCZOLAKORAKA GRUCZOŁU PIERSIOWEGO MCF7/WT (WRAŻLIWYCH) I MCF7/DX (OPORNYCH NA DOKSORUBICYNĘ) Katarzyna Bieżuńska-Kusiak1*, Justyna Mączyńska1, Olga Michel1, Anna Szewczyk2, Julita Kulbacka1, Jolanta Saczko1 Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, ul. Chałubińskiego 10, 50- 368 Wrocław; 2 Uniwersytet Wrocławski, Instytut Biologii Eksperymentalnej, ul. Sienkiewicza 21, 50- 335 Wrocław *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: gruczolakorak gruczołu piersiowego, wapń, elektroporacja, kanały wapniowe, apoptoza Cel: Celem projektu była ocena skuteczności przeciwnowotworowej aktywności jonów wapnia z elektroporacją wobec komórek gruczolakoraka gruczołu sutkowego wrażliwych i opornych na działanie doksorubicyny. Oceniono stopień ekspresji podjednostek alpha 1G i alpha 1H kanałów wapniowych oraz stopień indukcji apoptozy. Materiały i metody: Badania przeprowadzono na ludzkich liniach komórkowych gruczolakoraka piersi: wrażliwej (MCF-7/WT) i opornej na doksorubicynę (MCF-7/DX). Do elektroporacji zastosowano następujące parametry (przy 8 impulsach 100us, 1 Hz): 800V/cm, 1000V/cm, 1200V/cm, 1400V/cm. Użyto następujących roztworów wapnia: 0.25mM, 0.5mM, 1mM, 5mM. Przeprowadzono 2 rodzaje doświadczeń: z zastosowaniem EP oraz EP z roztworem jonów wapnia. Apoptozę oceniono metodą TUNEL, która polega na wykryciu in situ fragmentów DNA powstających w czasie apoptozy. Metodą immunocytochemiczną określono wpływ EP z jonami wapnia na ekspresję podjednostek alpha 1G i alpha 1H kanałów wapniowych. Preparaty oceniono za pomocą mikroskopu prostego Olympus BX51. Wyniki: Otrzymane wyniki wskazują, że jony wapnia transportowany przy pomocy elektroporacji ma wpływ na otwieranie kanałów wapniowych oraz na indukcję apoptozy wprost proporcjonalnie do wzrostu poziomu wapnia oraz przyłożonego napięcia. Najlepsze efekty uzyskano po zastosowaniu EP z wapniem; wzrost liczby komórek apopototycznych obserwowano nawet przy niskim nateżeniu przyłożonego pola elektrycznego (800 V/cm). W obu liniach liczba apoptotycznych jąder wzrosła wraz ze wzrostem intensywności zastosowanego pola elektrycznego. Ekspresja podjednostek alfa 1G i alfa 1H wzrastała proporcjonalnie do przyłożonego napięcia w obu badanych liniach komórkowych i była ona wyższa dla komórek linii MCF-7/WT. Silniejsza ekspresję wykazała jednostka alfa 1H. Komórki MCF-7/DX okazały się bardziej wrażliwe na EP bez jonów wapnia. Wnioski: Otrzymane wyniki wskazują, że optymalne parametry dla ECT (elektrochemioterapii) in vitro to 1200 oraz 1400 V/cm. W tych warunkach zaobserwowano najsilniejszą indukcję apoptozy. Komórki linii MCF-7/WT okazały się bardziej wrażliwe na leczenie. Wyniki otrzymane w ramach projektu pokazują możliwość zastosowania elektroporacji przy obciążeniu komórek nowotworowych wapniem, jako skutecznego działania przeciwnowotworowego. Praca powstała w ramach działalności koła naukowego UMED "Biologia komórki nowotworowej" (SKN nr 161). 50 P 3. OCENA WPŁYWU TERAPII FOTODYNAMICZNEJ NA PRZEŻYWALNOŚĆ RAKA JAJNIKA I PIERSI Marta Gołba1*, Jolanta Saczko2 Technische Universitat Dresden, Drezno, Niemcy, 2Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny, Wrocław, Polska [email protected] 1 Słowa kluczowe: terapia fotodynamiczna, rak jajnika, rak piersi, fotouczulacz Cel: Terapia fotodynamiczna, jest rzadko używana w terapii klinicznej. Głównie stosuje się ją do leczenia różnych rodzajów raka skórnego. Jednakże terapia ta mogłaby stanowić alternatywę do tradycjonalnych terapii, takich jak chemiterapia czy radioterapia. Zaletą terapii fotodynamicznej jest jej selektywność, a także łatwa kontrola aktywności poprzez manipulację światłem. Ocena skuteczności tej terapii w przeciwdziałaniu rozwojowi raka piersi i jajników, to główny cel przeprowadzonego badania. Materiały i metody: Badania zostały przeprowadzone na dwóch liniach komórkowych: raka piersi (MB231) i raka jajnika (SKOV-3). Fotouczulaczem użytym do przeprowadzanych reakcji dynamicznej była cyjanina IR-775. Dziłanie fotouczulacza było modyfikowane poprzez inkubację komórek w różnych jego koncentracjach, oraz poprzez połączenie cyjaniny z 2-metokstradiolem o działaniu antynowotworowym. Komórki następnie były naświetlane w celu rozpoczęcia reakcji fotodynamicznej. Przeżywalność komórek o różnych czasach inkubacji w roztworach, została zbadana przy pomocy testu MTT. Dodatkowo lokalizacja fotouczulacza w komórkach została przenalizowana przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. W celu zbadania szlaków apoptotycznych, przez które przechodziły komórki, została przeprowadzona imunocytochemia z użyciem przeciwciał SOD2 i CASP-12. Wyniki: Cyjanina IR-775 wykazała dobry efekt fotodynamiczny w komórkach nowotworowych. Reakcja fotodynamiczna spowodowała spadek przeżywalności obu analizowanych linii komórkowych. Komórki raka piersi okazały się bardziej wrażliwe na terapię, niż komórki raka jajnika. Modulator w postaci 2mtoksyestradiolu wykazał działanie wspomagające ogólny efekt zastosowanej terapii. Immunocytochemiczna ocena SOD2 i CASP-12 udowodniła, że mechanizmy antyoksydacyjne zostały aktywowane w komórkach. Wnioski: Reakcja fotodynamiczna może doprowadzić do spadku przeżywalność komórek rakowych, poprzez aktywowanie mechanizmów uwalniających reaktywne formy tlenu, które wprowadzając cytotoksyczność komórkową. Terapia ta mogłaby zostać dalej rozwinięta, jednak należy wziąć pod uwagę negatywny wpływ cząsteczek tlenu we wzbudzonym stanie na organizm. Badanie zfinansowano z działalności statutowej UMED ST.E130.16.060. 51 P 4. ZASTOSOWANIE BIO-NANO-CELULOZY W IMPLANTOLOGII I LECZENIU RAN Adam F. Junka1*, Karolina Dydak1, Patrycja Szymczyk2, Marzenna Bartoszewicz1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii UMed Wrocław, Borowska 211a 50-534 Centum Zaawansowanych Systemów Produkcyjnych, ul. Łukasiewicza 5 50-371 Wrocław *e-mail: [email protected] 1 2 Słowa kluczowe: bio-nano-celuloza, implanty, opatrunki Cel: Celem przeprowadzonych badań było określenie przydatności bio-nano-celulozy produkowanej przez szczep Komagataeibacter xylinus do opłaszczania implantów oraz do tworzenia opatrunków o zmodyfikowanych właściwościach biologicznych. Materiał i metody: Implanty tytanowo-glinowo-niobowe (Ti-Al)-Nb pokryto bio-nanocelulozą i wysycono antybiotykiem gentamycyną. Prototypowe opatrunki celulozowe stworzono z błon wytworzonych przez K.xylinus i wysycono dichlorowodorkiem oktenidyny. Pokrycie implantów celulozą oceniano za pomocą mikroskopii elektronowej, a skuteczność przeciwdrobnoustrojową tego biopolimeru wysyconego środkami przeciwdrobnoustrojowymi oszacowano za pomocą metody dyfuzyjno-krążkowej. Wyniki: Implanty Ti-Al.-Nb pokryte wysyconą antybiotykiem celulozą cechowały się aktywnością przeciwdrobnustrojową względem Staphylococcus aureus. Aktywne przeciwdrobnoustrojowo opatrunki bio-nano-celulozowe hamowały namnażanie się tego patogenu. Wnioski: Zastosowanie bio-nano-celulozy do opłaszczania implantów oraz do tworzenia aktywnych przeciwdrobnoustrojowo opatrunków prowadzić może do zmniejszenia liczby komplikacji, do których dochodzi na skutek procesu infekcyjnego. 52 P 5. KOMÓRKI MACIERZYSTE W POWSTAWANIU, PRZERZUTOWANIU I OPORNOŚCI NOWOTWORÓW NA TERAPIĘ Iwona Kamińska Zakład Immunopatologii i Biologii Molekularnej Katedry Patomorfologii i Cytologii Onkologicznej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ul. Borowska 213, 50-556 Wrocław e-mail: [email protected] Słowa kluczowe: komórki macierzyste, nowotworowe komórki macierzyste, nowotwory Komórki macierzyste są to pierwotne i niedojrzałe komórki organizmu człowieka. Ich unikalną cechą jest zdolność do samoodnawiania się, a także różnicowania się w dowolne komórki danej tkanki. Najnowsze badania dowodzą, że komórki macierzyste mogą być odpowiedzialne przerzutowanie oraz za powstawanie oporności nowotworów na terapię. W heterogennym guzie nowotworowym zidentyfikowano obecność niewielkiej populacji komórek (ok. 1%), która ma zwiększoną zdolność różnicowania się, a także samoodnowy i niesymetrycznych podziałów. Komórki te są określane jako macierzyste komórki nowotworowe (ang. cancer stem cells lub stem – like cells), ponieważ posiadają te same cechy co prawidłowe komórki macierzyste lecz prawdopodobnie z uszkodzonymi genami supresorowymi oraz onkogenami. Nowotworowe komórki macierzyste należą do komórek o niskiej proliferacji, co wpływa na oporność tej subpopulacji komórek na stosowaną chemioterapię. Podobieństwo nowotworowych komórek macierzystych do prawidłowych komórek macierzystych pod względem biologicznym oraz molekularnym utrudnia prace badawcze nad heterogennością nowotworów. Jednak zidentyfikowanie specyficznych biomarkerów na powierzchni tych komórek może posłużyć do celów terapeutycznych w terapii celowanej nowotworów zmniejszając ryzyko wznowy procesów nowotworowych. 53 P 6. BADANIE EFEKTYWNOŚCI FLEOMYCYNY W POŁĄCZENIU Z ELEKTROPORACJĄ NA KOMÓRKI NOWOTWOROWE RAKA PIERSI MCF-7 Kamila Karkoszka1*, Julita Kulbacka2 Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny; 2 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej * [email protected] 1 Słowa kluczowe: fleomycyna, elektroporacja, elektrochemioterapia Cel: Elektrochemioterapia (ECT) jest metodą, która wykorzystuje zjawisko elektroporacji, czyli odwracalnego zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych za pomocą pola elektrycznego, w celu efektywnego dostarczenia cząsteczek leku do wnętrza komórek nowotworowych. Obecnie często stosowanym w tej metodzie chemioterapeutykiem jest bleomycyna – antybiotyk glikopeptydowy otrzymywany ze Streptomyces verticillus. Celem pracy było zbadanie czy fleomycyna, antybiotyk podobny strukturalnie do bleomycyny, wykazuje aktywność przeciwnowotworową w warunkach in vitro. Materiały i metody: Badania były prowadzone na linii komórkowej raka piersi MCF-7/WT (komórki wrażliwe) oraz MCF-7/DOX (komórki oporne na doksorubicynę). Komórki były hodowane na pożywce DMEM z 10% FBS w 37ºC, w atmosferze 5% CO2. Przed eksperymentami komórki poddawano trypsynizacji w celu odseparowania ich od podłoża. Efektywność działania samej fleomycyny badano inkubując komórki na płytkach 96-dołkowych w pożywce DMEM z roztworami fleomycyny o stężeniach 10nM, 30nM, 100nM i 300nM przez 24h oraz 72h. Elektroporację komórek przeprowadzano umieszczając komórki w buforze do elektroporacji z fleomycyną o stężeniu 10nM, i działając na nie polem elektrycznym o napięciu 800V i 1000V, następnie komórki inkubowano 24h i 72h na płytkach 96-dołkowych. Przeżywalność komórek oceniano za pomocą testu MTT – do płytek 96-dołkowych dodawano odczynnik MTT, inkubowano 1.5h, po czym powstały po redukcji soli tetrazolowej formazan rozpuszczano za pomocą izopropanolu i odczytywano spektrofotometrycznie gęstość optyczną przy dł. fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek (EnSpire, PerkinElmer). Na tej podstawie oceniano procent przeżywalności komórek wobec kontroli. Wyniki: Podczas analizy wyników zauważono, że wraz ze wzrostem stężenia fleomycyny zarówno komórki MCF-7 dzikiego typu, jak i komórki oporne na doksorubicynę wykazywały coraz mniejszą przeżywalność w stosunku do komórek kontrolnych. W przypadku wyników eksperymentów z elektroporacją stwierdzono, że komórki poddawane elektroporacji w buforze z dodatkiem fleomycyny wykazywały znacznie mniejszą przeżywalność niż komórki kontrolne. Wnioski: W wyniku przeprowadzonych eksperymentów można stwierdzić, że fleomycyna wykazuje działanie cytotoksyczne w stosunku do komórek nowotworowych raka piersi MCF-7. Jednocześnie efektywność działania fleomycyny może być zwiększona przez zastosowanie elektroporacji. Finansowanie: Grant nr 210/2016 koła naukowego BioNanopor Politechniki Wrocławskiej 54 P 7. OCENA IMMUNOHISTOCHEMICZNA BIAŁEK MACIERZY ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEJ W TĘTNIAKU AORTY BRZUSZNEJ Emilia Krzywiecka*1, Agnieszka Chwiłkowska2 Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska; 2 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu *[email protected] 1 Słowa kluczowe: tętniak aorty brzusznej, macierz zewnątrzkomórkowa Cel: Opisanie budowy biologicznej tętniaka aorty brzusznej, głównie udziału włókien elastynowych i kolagenowych w tej budowie. Materiały i metody: Materiał badawczy stanowiły pobrane śródoperacyjnie fragmenty czterech tętniaków aorty brzusznej oraz fragment tętnicy prawidłowej pobrany podczas autopsji. Ocenę białek macierzy zewnątrzkomórkowej przeprowadzono techniką immunohistochemiczną barwiąc preparaty na obecność kolagenu typu I, III, IV oraz elastyny. Wyniki: Obserwowano rozrzedzenie warstwy środkowej tętniaka medii ze zmniejszeniem ilości i uszkodzeniem struktury elastyny oraz redukcją ilości kolagenu typu I i III, poszerzenie przydanki, w której nagromadziły się komórki zapalne wokół naczyń naczynia powstałych w procesie neowaskularyzacji i przyrost neointimy – nowej nadmiernie przerośniętej błony wewnętrznej, zbudowanej z macierzy zewnątrzkomórkowej. Wnioski: Obserwowane cechy wraz z degradacją włókien elastynowych wydają się być kluczowe w patogenezie tętniaka. Praca zrealizowana z projektu w ramach działalności statutowej UMED ST.C010.16.086 55 P 8. WPŁYW ELEKTROPORACJI NANOSEKUNDOWEJ NA KOMÓRKI GLEJAKA Emilia Krzywiecka*1, Agnieszka Chwiłkowska2, Małgorzata Kotulska3 Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska; 2 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu; 3 Katedra Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Wrocławska *[email protected] 1 Słowa kluczowe: elektroporacja nanosekundowa, glejak, badania in vitro Cel: Zbadanie wpływu elektroporacji nanosekundowej z dodatkiem jonów wapnia oraz bez dodatku tych jonów na przeżywalność komórek glejaka in vitro. Materiały i metody: Badania prowadzono na komórkach glejaka, linia komórkowa SNB-19 pochodząca od 47-letniego mężczyzny. Komórki hodowano w medium hodowlanym DMEM w sterylnych warunkach w postaci monowarstwy. Zastosowano elektroporację nanosekundową (ang. Nanosecond Pulsed Electric Fields, nsPEF). Polegaja ona na przerwaniu ciągłości błony komórkowej na skutek działania nansekundowych (10ns) impulsów elektrycznych. Impulsy te charakteryzują się dużymi wartościami natężenia pola elektrycznego i krótkim czasem trwania. Do oceny przeżywalności posłużono się kolorymetrycznym testem MTT. Wyniki: Otrzymano wyniki z trzech prowadzonych testów: inkubacji komórek z jonami wapnia (CaCl2), elektroporacji nanosekundowej oraz elektroporacji nanosekundowej w obecności jonów wapnia. Jony wapnia powodują nieznaczny spadek przeżywalności komórek glejaka. Odpowiednie dobranie parametrów elektroporacji nanosekundowej oraz stężenia jonów wapnia pozwala zwiększyć efektywność prowadzonych badań – zmniejszyć przeżywalność komórek. Wnioski: Wraz ze wzrostem natężenia prądu spada przeżywalność komórek. Wyniki wskazują, że jony wapnia w odpowiednim stężeniu pogłębiają efekt elektroporacji. Może mieć to pozytywny wpływ na leczenie guzów głębiej zlokalizowanych. Stosowane jony wapnia (w postaci chlorku wapnia) wykazują niską toksyczność dla zdrowych komórek, mogłyby więc zastąpić obecnie stosowane cytostatyki, jednocześnie obniżając cenę elektrochemioterapii. Finansowanie: Grant nr 210/2016 koła naukowego BioNanopor Politechniki Wrocławskiej 56 P 9. WPŁYW Β-GLUKANU Z OWSA NA LUDZKIE KOMÓRKI CZERNIAKA Sandra Łubińska1,, Anna Choromańska2 Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska, C. K. Norwida 5/6, 50-373 Wrocław; 2 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Chałubińskiego 10, 50 -368 Wrocław, Polska e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: β-glukan, komórki czerniaka, ekspresja GLUT1 Cel: Celem pracy była ocena wpływu β-glukanu z owsa na proliferację ludzkich komórek czerniaka oraz ocena ekspresji białka transportującego glukozę GLUT1 w tych komórkach. Materiały i metody: W badaniach użyto dwie linie komórkowe ludzkiego czerniaka: Me45 (linia przerzutowa) oraz MeWo (linia wyprowadzona z ogniska pierwotnego zmiany nowotworowej). Zbadano przeżywalność komórek po 24 i 72 godzinach inkubacji z β-glukanem z owsa. Metodą immunocytochemiczną oceniono poziom ekspresji białka GLUT1. Testowano pięć stężeń β-glukanu: 50, 100, 200, 400, 500 µg/ml. Wyniki: Po inkubacji komórek z β-glukanem zaobserwowano, że wraz ze wzrostem dawki β-glukanu oraz z wydłużeniem czasu inkubacji, przeżywalność komórek maleje. W przypadku komórek linii Me45 po 72 godzinnej inkubacji z najwyższą badaną dawką β-glukanu spadła ona do 43%, a w przypadku komórek linii MeWo do 90%. W badaniu immunocytochemicznym zaobserwowano silną ekspresję białka GLUT1 w komórkach obu badanych linii niezależnie od dawki β-glukanu. Wnioski: β-glukan z owsa powoduje obniżenie przeżywalności komórek czerniaka, a w szczególności czerniaka linii przerzutowej. Zaobserwowano wysoką ekspresja transportera glukozy GLUT1. Być może jest to droga umożliwiająca transport β-glukanu do wnętrza badanych komórek. Potrzebne są jednak dokładniejsze badania, aby dokładnie ustalić mechanizm indukowanej śmierci komórkowej, a także przyczynę tak słabej odpowiedzi na działanie β-glukanu komórek linii pierwotnej (linia MeWo). Finansowanie z projektu Fundacji Nutricia, projekt pt.:” The influence of β-glucans derived from oat on biological parameters and metabolism of human cancer and normal cells from gastrointestinal tract”. 57 P 10. ELEKTROPORACJA JAKO WSPOMAGANIE CHEMIOTERAPII – BADANIA IN VITRO NA LINI PIERWOTNEJ Justyna Mączyńska1*, Olga Michel1, Adam Rzechonek2, Julita Kulbacka1, Jolanta Saczko1 Katedra i Zaklad Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 10. 50-367 Wrocław; 2 Katedra i Klinika Chirurgii Klatki Piersiowej, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ul. Grabiszyńska 10, 53-439 Wrocław *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: elektroporacja, hodowla pierwotna, rak nerki, cisplatyna Cel: Elektroporacja (EP) to metoda polegająca na zastosowaniu zewnętrznego pola elektrycznego, w celu zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej. Krótkie impulsy elektryczne o wysokim napięciu wywołują dezorganizację lipidów i tworzenie porów w błonie umożliwiajac zwiekszony transport makrocząsteczek z przestrzeni pozakomórkowej do komórek. W skojarzeniu z chemioterapią technika ta może stanowić dodatkowy sposób leczenia raka. Główną zaletą jest zwiększenie dostępności i efektywności leków przeciwnowotworowych oraz zmniejszenie ogólnoustrojowych efektów ubocznych. Celem pracy była ocena efektywności elektroporacji w połączeniu z chemioterapią z zastosowaniem wybranego związku cytotoksycznego na pierwotnej linii raka nerki. Materiały i metody: W badaniach wykorzystano hodowlę pierwotną otrzymaną z fragmentu guza – przerzutu raka nerki do płuc. Hodowla była prowadzona w standardowych warunkach, z wykorzystaniem medium DMEM, wzbogaconego surowicą oraz antybiotykami. Komórki były traktowane cisplatyną, doksorubicyną lub leukoworyną (0-50 µM), a następnie inkubowane w standardowych warunkach przez 24 i 48 h. EP została przeprowadzona z zastosowaniem ustalonych parametrów: 8 impulsów, trwających po 100 μs każdy z interwałem 1 s oraz przy zmiennych wartościach napięcia. Efektywność metody oceniano za pomocą testu MTT. Wyniki. Niezależnie od zastosowanego stężenia wybrane leki nie wykazały cytotoksycznosci po 24 h inkubacji. Efekt toksyczny zauważalny był dopiero po dłuższym czasie (48 h) inkubacji. Do dalszych badań wybrana została cisplatyna. Zastosowanie elektroporacji znacznie wzmocniło jej efekt toksyczny. Już po 24 h od EP z ciplatyna (10 µM) zaobserowano spadek żywnotność komórek o ok. 40%. Wnioski. Otrzymane wyniki wskazują, że kombinacja EP i chemioterapii może powodowac zwiekszenie smiertelnosci komórek nowotworowych. Metoda ta skutecznie poprawia transport cisplatyny do komórek, a tym samym skraca ich żywotność. Potencjalnie może to powodowac skrócenie czasu leczenia przeciwnowotworowego. Finansowanie: Badania wykonano w ramach projektu działalności statutowej ST.C010.16.086 58 P 11. WŁAŚCIWOŚCI PRZECIWUTLENIAJĄCE POLIFENOLOWYCH EKSTRAKTÓW Z KWIATÓW, LIŚCI I NASION KROKOSZA BARWIERSKIEGO W ODNIESIENIU DO BŁON LIPIDOWYCH Katarzyna Męczarska1*, Sylwia Cyboran1, Dorota Bonarska-Kujawa1, Jan Oszmiański2, Halina Kleszczyńska1 Katedra Fizyki i Biofizyki, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Norwida 25, 50-375 Wrocław; Katedra Technologii Owoców, Warzyw i Zbóż, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Norwida 25, 50-375 Wrocław *e-mail: [email protected] 1 2 Słowa kluczowe: krokosz barwierski, antyoksydanty, promieniowanie UVC, związki polifenolowe. Cel: Badania miały na celu ilościowe określenie zawartości związków polifenolowych w ekstraktach z krokosza barwierskiego oraz ustalienie ich aktywności przeciwutleniającej w stosunku do błony lipidowej utworzonej z fosfatydylocholiny jajecznej. Materiały i metody: Ekstrakty z krokosza barwierskiego otrzymano w Katedrze Owoców, Warzyw i Zbóż Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Fosfatydylocholinę wyekstrahowaną z żółtka jaja kurzego (Egg PC) rozpuszczoną w mieszaninie chloroform/metanol o czystości 95% zakupiono w firmie Lipid Products (South Nutfield, Redhill). Małe jednoswarstwowew pęcherzyki lipidowe otrzymano metodą dezinetegracji ultradzwiękami. Metodą spektrofotometryczną zbadano zawartość związków polifenolowych (TFC) w wodnych ekstraktach z liści, kwiatów i nasion krokosza barwierskiego. Przy użyciu metody spektrofotometrycznej określono zdolność związków zawartych w ekstraktach do ochrony lipidów przed utlenianiem indukowanym promieniowaniem UVC. Wyniki: Uzyskane wyniki wskazują, że najbogatszym źródłem związków polifenolowych jest ekstrakt z kwiatów krokosza barwierskiego. Ponado, wykazały one że, substancje polifenolowe zawarte różnych częściach krokosza skutecznie chronią lipidy przed utlenianiem. Najwyższą aktywność antyoksydacyjną spośród badanych ekstraktów wykazuje ekstrakt z nasion tej rośliny. Uzyskane wyniki wskazują, że wodne ekstrakty z krokosza są skutecznymi antyoksydantami, jednak posiadają one niższą aktywność antyoksydacyjną od standardowego przeciwutleniacza Troloxu®. Ponadto, brak korelacji pomiędzy zawartością związków polifenolowych w ekstraktach a ich aktywnością przeciwutleniającą oznacza, że ich zdolność do ochrony lipidów przed utlenieniem zależy nie tylko od ilości, ale także od rodzaju zawartych w nich związków polifenolowych. Wnioski: Ekstrakty z liści, nasion i kwiatów krokosza barwierskiego są cennym źródłem substancji polifenolowych, które skutecznie zmiatają wolne rodnikami, chroniąc lipidy błonowe przed utlenieniem. Ekstrakty z krokosza barwierskiego mogą więc znaleźć zastosowanie w profilaktyce i liczeniu wielu schorzeń powstających na skutek zaburzenia procesów oksydacyjnych w organizmie. 59 P 12. CZY KATECHINA MOŻE ZWIĘKSZAĆ WRAŻLIWOŚĆ KOMÓREK RAKA TRZUSTKI NA CHEMIOTERAPIĘ? BADANIA WSTĘPNE NA LINII PIERWOTNEJ Olga Michel1, Adam Rzechonek2, Piotr Błasiak2, Katarzyna Bieżuńska-Kusiak1, Justyna Mączyńska1, Julita Kulbacka1, Jolanta Saczko1 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław; 2 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Katedra i Klinika Chirurgii Klatki Piersiowej, ul. Grabiszyńska 10, 53-439 Wrocław *e-mail: [email protected]. wroc.pl 1 Słowa kluczowe: katechina, rak trzustki, hodowla pierwotna, cisplatyna Cel: Rak trzustki zalicza się do jednych z najbardziej opornych na leczenie nowotworów, co znacząco przyczynia się do wysokiej śmiertelności pacjentów obarczonych tą chorobą. Dlatego też wiele ostatnich badań zognioskowanych jest na poszukiwaniu modulatorów lekooporności, które mogłyby uwrażliwić komórki nowotworowe na stosowane leczenie. Według ostatnich badań katechiny, obecne w zielonej herbacie flawonoidy, mogą wpływać na lekooporność poprzez oddziaływanie na białka błonowe z rodzicy ABC. Celem badań jest ocena wpływu katechiny na wrażliwość komórek raka trzustki na standardowy lek cytostatyczny – cisplatynę. Materiał i metody: Materiał do badań stanowiła hodowla pierwotna otrzymana z fragmentu guza – przerzutu gruczolakoraka trzuski do płuc. Komórki preinkubowano w medium zawierającym katechinę w stężeniu 10µM przez 72h. Następnie poddano je testom cytotoksyczności z roztworami cisplatyny o stężeniach: 5, 10, 15, 25 i 50µM. Po 24- i 48-godzinnej inkubacji komórki poddano testom aktywności mitochondrialnej MTT. Wyniki: W wyniku zastosowanej preinkubacji zaobserwowano niewielki spadek aktywności mitochondrialej w porównaniu do komórek niepoddanych preinkubacji. Efekt utrzymywał się po 48-godzinnej inkubacji. Wnioski: Uzyskane rezultaty wskazuja, że katechina może mieć udział w modulacji oporności wielolekowej. Kolejnym etapem badań będzie ocena ekspresji białek z rodziny ABC, co pozwoli na potwierdzenie lub wyeliminowanie przyczyn występowania zaobserwowanego zjawiska. Finansowanie: Badania wykonano w ramach projektu STM.C010.16.007 (kier. Piotr Błasaiak). 60 P 13. OCENA WPŁYWU BETULINY I JEJ POCHODNYCH NA KOMÓRKI FIBROBLASTÓW LUDZKICH IN VITRO Roksana Pańszczyk1, Małgorzata Drąg-Zalesińska2, Agnieszka Chwiłkowska3 Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska; 2Katedra i Zakład Histologii i Embriologii, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Chałubińskiego 6a, 50-368 Wrocław; 3 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław 1 Słowa kluczowe: betulina, pochodne betuliny, cytotoksyczność, fibroblasty Cel: Zbadanie wpływu betuliny oraz jej pochodnych na komórki ludzkich fibroblastów z dziąsła in vitro. Metody i metody: Badania przeprowadzono na hodowli pierwotnej ludzkich fibroblastów z dziąsła. Komórki hodowano w warunkach sterylnych w medium hodowlanym (DMEM) z 5% surowicą i antybiotykiem w stałych warunkach temperatury 37°C, wilgotności 90% i obecności 5% CO2. Badano cytotoksyczność betuliny, kwasu betulinowego oraz pochodnych betuliny: Betulin-LYS-NH2, BetulinORN-NH2, Betulin-DAB-NH2 po 72 godz. za pomocą kolorymetrycznego testu MTT oraz ekspresję Ki67 jako ocenę zdolności proliferacyjnych komórek. Badano wpływ związków na wydzielanie przez fibroblasty kolagenu oceniając ilość tego białka w medium przez pomiar hydroksyproliny używając QuickZyme Total Collagen Assay (QuickZyme BioSciences, Leiden, The Netherlands). Wyniki: Największe zastosowane stężenie pochodnych betuliny (50 µM) powoduje spadek przeżywalności komórek fibroblastów ludzkich, natomiast wzrost proliferacji komórek następuje przy stężeniach Betulin-ORN-NH2 < ~0,70μM. Nie zaobserwowano znaczącego wzrostu indukcji kolagenu przez badane pochodne betuliny. Wnioski: Chemiczne modyfikacje betuliny mogą wpłynąć na poprawę właściwości leczniczych tego związku. Badanie finansowano z działalności statutowej UMED ST.E130.16.060. 61 P 14. POWRÓT DO KORZENI – CZERPIĄC Z NATURY: JAK NATURALNE LEKI POMAGAJĄ W WALCE Z NOWOTWORAMI? PRZEGLĄD I PODSUMOWANIE OBECNEJ WIEDZY Dawid Przystupski, Dominika Chrzanowska Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Wydział Lekarski, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu e-mail: [email protected] Słowa kluczowe: leki naturalne, terapie niskotoksyczne, substancje przeciwnowotworowe Choroby nowotworowe dotykają milionów osób na całym świecie i obecnie są jedną z najczęstszych przyczyn zgonów. Wciąż trwają poszukiwania coraz to nowszych leków, które umożliwią skuteczną walkę z różnego typu nowotworami. Metabolity naturalnych związków są używane w terapii przeciwnowotworowej od dawna, jednak na przestrzeni ostatnich lat wciąż odkrywane są nowe, wcześniej nieznane aktywne substancje pochodzenia naturalnego o udowodnionym wpływie ingerującym w metabolizm komórek nowotworowych. Jednym z najstarszych naturalnych ziół była stosowana w lecznictwie już przez samego Galena (130-200 r. n.e.) Psianka słodkogórz – Solanum dulcamara L. i zawarta w niej beta-solimaryna o udowodnionym działaniu onkostatycznym wobec mięsaka, oraz glikoalkaloidy o hamującym działaniu na komórki raka wątroby (Hep3B; human hepatoma cells). Ze względu na mechanizm działania substancje pochodzenia naturalnego o działaniu przeciwnowotworowym można przydzielić do kilku grup, m.in. inhibitorów topoizomerazy I, wykazujących aktywność przeciwonkogenną w raku jelita grubego, jajnika i płuc; inhibitorów topoizomerazy II, o udowodnionym działaniu w białaczkach dziecięcych, raku drobnokomórkowym płuc, guzach jąder, chorobie Hodgkina i chłoniakach wielkokomórkowych; inhibitorów mitozy – tu wymienić można popularne cytostatyki takie jak kolchicyna, winblastyna i winkrystyna, które mimo obecności ciężkich skutków ubocznych znajdują zastosowanie w leczeniu wielu nowotworów; a także antybiotyków cytostatycznych izolowanych z wielu gatunków grzybów o szerokim spektrum zastosowań w terapii nowotworowej. Szczególnym zainteresowaniem cieszą się związki niskotoksyczne. Dużo uwagi poświęca się w ostatnim czasie działaniu związków polifenolowych, zawartych w wielu powszechnych produktach spożywczych. Celem pracy jest przegląd literatury i podsumowanie obecnego stanu wiedzy na temat wykorzystania leków pochodzenia naturalnego w terapii różnych typów nowotworów oraz zapoznanie się z prognozami ich wykorzystania w tego typu terapii w przyszłości. Praca powstała w ramach działalności koła naukowego "Biologia komórki nowotworowej" (SKN nr 161). 62 P 15. OCENA STRUKTURALNA I BIOCHEMICZNA ŚCIAN TĘTNIAKÓW AORTY BRZUSZNEJ PODDANYCH SELEKTYWNEMU TRAWIENIU Maria Ratajek*1, Magdalena Kobielarz2, Agnieszka Chwiłkowska3 Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska; 2 Wydział Mechaniczny, Politechnika Wrocławska; 3 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu *[email protected] 1 Słowa kluczowe: tętniak aorty brzusznej, macierz zewnątrzkomórkowa Cel: Ocena selektywnego trawienie włókien elastynowych, kolagenowych oraz składników komórkowych w ścianie tętniaka aorty brzusznej. Materiały i metody: Materiał badawczy stanowiły pobrane śródoperacyjnie fragmenty tętniaków aorty brzusznej. Tkanki poddano selektywnemu trawieniu kolagenazą, elastazą oraz decelularyzacji. Ocenę białek macierzy zewnątrzkomórkowej przeprowadzono techniką immunohistochemiczną barwiąc preparaty na obecność kolagenu typu I, elastyny oraz α-aktyny komórek mięśni gładkich. Wyniki: Elastyna obecna w ścianach worka tętniaka jest mocno zdegradowana, błona elastyczna wewnętrzna jest nieciągła lub jest jej całkowity brak. Zaobserwowano, że trawienie elastazą wpływa znacząco na zmniejszenie ilości elastyny oraz rozluźnienie struktury ściany tętniaka. Trawienie kolagenazą zmniejsza znacząco ilość kolagenu typu I. Po decelularyzacji widoczne jest zmniejszenie ilości α-aktyny lub niemal całkowity jej brak. Wnioski: Obserwowane zmiany potwierdzają skuteczność zastosowanych trawień. Otrzymane ściany naczyń będą materiałem do dalszych badań biomechanicznych w celu oceny funkcji poszczególnych komponentów w procesie przenoszenia obciążeń. Badania sfinansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji numer DEC-2013/09/D/ST8/04007. 63 P 16. ZMIANA EKSPRESJI BIAŁKA P-GP PO ZASTOSOWANIU ECT Nina Rembiałkowska1,2*, Marta Harasiewicz2, Zofia Marchewka2, Julita Kulbacka1, Jolanta Saczko1 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, ul.Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław. 2Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu,Katedra i Zakład Toksykologii, ul. Borowska 211, 50-556 Wrocław *e-mail: nina.rembiał[email protected] 1 Słowa kluczowe: elektrochemioterapia, białko P-gp, oporność wielolekowa Cel: Oporność wielolekowa jest zjawiskiem ograniczającym skuteczność chemioterapii. Mechanizmy oporności komórek nowotworowych na przyjmowane leki mogą być różne. Mechanizmem klasycznym, najlepiej poznanym jest wzmożone usuwanie leków z komórek przez białka błonowe zwane transporterami ABC (ang. ATP-binding cassette). W wyniku ich działania osiągnięcie stężenia letalnego cytostatyka dla komórki nowotworowej staje się niemożliwe. Najistotniejszym spośród tych białek jest glikoproteina P (P-gp). Mechanizm działania glikoproteiny P jest określany mianem „odkurzacza molekularnego” czy też „zmiatacza hydrofobowego. Cząsteczki substratu są rozpoznawane i przechwytywane przez transportera w czasie biernego przepływu do cytoplazmy przez błonę lipidową, zgodnie z gradientem stężeń, a następnie zostają usunięte z komórki. Istnieją różne metody zwiększające skuteczność dostarczania cytostatyków do komórek. Jedną z nich jest elektrochemioterapia (ECT), która wykorzystuje zjawisko elektroporacji. W jej przebiegu komórki poddaje się działaniu impulsów elektrycznych, w efekcie czego dochodzi do zmiany potencjału transbłonowego i zaburzenia ciągłości błony komórkowej. Celem badań była ocena zmiany ekspresji białka P-gp po zastosowaniu elektroporacji w komórkach raka gruczołu sutkowego opornych na leczenie. Materiał i metody: Badania przeprowadzone zostały w warunkach in vitro na dwóch ludzkich liniach komórkowych gruczolakoraka gruczołu sutkowego: wrażliwych (MCF-7/WT) i opornych (MCF-7/DOX) na doksorubicynę. Komórki poddano elektrochemioterapii z bleomycyną (300 nM) w warunkach in vitro. Zastosowano następujące parametry: 1000 V/cm, 1500 V/cm, 2000 V/cm oraz 5 impulsów 50 µs o częstotliwości 1 Hz. Półilościowo, metodą immunocytochemiczną oceniono ekspresję białek oporności lekowej (P-gp) po 24 h i 72 h po terapii. Wyniki: Uzyskane wyniki wykazały, że ECT wpływa na ekspresję białek odpowiadających za oporność wielolekową, a wydłużony czas inkubacji dodatkowo potęguje ekspresję. Wnioski: wzrost parametrów elektroporacji, czas inkubacji mają wpływ na ekspresję białka P-gp, po zastosowaniu ECT. Projekt został sfinansowany ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji nr DEC-2015/19/N/NZ7/01105. 64 P 17. OCENA SKUTECZNOŚCI ELEKTROCHEMIOTERAPII W WARUNKACH IN VITRO Nina Rembiałkowska1,2*, Julita Kulbacka1, Jolanta Saczko1 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław 2 Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu,Katedra i Zakład Toksykologii, ul. Borowska 211, 50-556 Wrocław *e-mail: nina.rembiał[email protected] 1 Słowa kluczowe: elektroporacja, elektrochemioterapia,doksorubicyna, bleomycyna, gruczolakorak gruczołu sutkowego Pomimo tak szybkiego postępu medycyny i nauki, choroby nowotworowe powodują wysoką śmiertelność u ludzi w krajach rozwiniętych. Jednym czynnikiem odpowiedzialnym za brak sukcesów chemioterapii jest pierwotna i wtórna odporność nowotworów na stosowane cytostatyki. Oprócz standardowych metod leczenia nowotworu gruczołu sutkowego, takich jak mastektomia, radioterapia, chemioterapia czy hormonoterapia, wielkie nadzieje terapeutyczne wiąże się z wykorzystaniem chemioterapii z innymi rodzajami terapii. Zastosowanie chemioterapii w połączeniu ze zjawiskiem elektroporacji otwiera perspektywy w walce z nowotworami. Chemioterapia wspomagana elektroporacją, inaczej elektrochemioterapia (ECT), jest metodą leczenia zmian nowotworowych wykorzystującą krótkie impulsy elektryczne. Powstające wówczas mikropory w błonach komórkowych powodują wzrost efektywności transportu chemioterapeutyków do wnętrza komórek nowotworowych. Celem pracy była zbadanie skuteczności chemioterapii modyfikowanej elektroporacją z wykorzystaniem dwóch cytostatyków (doksorubicyny i bleomycyny) w warunkach in vitro na ludzkich komórkach gruczolakoraka gruczołu sutkowego (MCF-7/WT) i komórkach opornych na doksorubicynę (MCF7/DOX). Uzyskane wyniki miały na celu określenie wrażliwości różnych typów komórek gruczołu sutkowego na zastosowanie w terapii różnych cytostatyków. Materiały i metody: Materiałem do badań były ludzkie komórki nowotworowe gruczolakoraka gruczołu sutkowego (MCF-7/WT) i komórek opornych na doksorubicynę (MCF-7/DOX). Cytostatykami użytymi w doświadczeniach były: doksorubicyna (1,7 µM) i bleomycyna (30 nM i 300 nM). Cytotoksyczność badanych metod oceniono trzema niezależnymi testami: testem MTT, SRB oraz testem klonogennym. Lokalizację doksorubicyny w komórkach oceniono z zastosowaniem metody mikroskopii konfokalnej (CLSM). Metodą immunocytochemiczną oceniono ekspresję białek szoku cieplnego (HSP-27 i HSP-70). Wyniki: Wraz ze wzrostem parametrów elektroporacji obserwujemy spadek przeżywalności komórek gruczolakoraka gruczołu sutkowego. Wnioski: Elektroporacja powoduje wzrost efektywności transportu chemioterapeutyków do wnętrza komórek nowotworowych. Projekt został sfinansowany ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji nr DEC-2015/19/N/NZ7/01105. 65 P 18. ZASTOSOWANIE JONÓW WAPNIA W ELEKTROCHEMIOTERAPII Anna Szewczyk1*, Julita Kulbacka2, Jolanta Saczko2, Katarzyna Bieżuńska-Kusiak2, Olga Michel2, Nina Rembiałkowska2, Anna Choromańska2, Małgorzata Daczewska1 Zakład Biologii Rozwoju Zwierząt, Uniwersytet Wrocławski,ul.Sienkiewicza 21, 50-335 Wrocław Katedia i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław *[email protected] 1 2 Słowa kluczowe: elektrochemioterapia, jony wapnia, komórki nowotworowe, apoptoza Elektrochemioteriapia (ECT) stanowi alternatywę dla klasycznej chemioterapii poprzez selektywne dozowanie cytostatyków wyłącznie do komórek nowotworowych. Wysokonapięciowe pulsy elektryczne rozszczelniają błonę komórkową i wspomagają wnikanie leków do wnętrza nowotworów. Taka miejscowa terapia podwyższa standard życia chorego (brak długiej hospitalizacji, brak efektów ubocznych, np. wypadanie włosów) oraz zmniejsza dawki stosowanych leków. Elektrochemioterapia jest już z powodzeniem stosowana w wielu krajach Europy tj. Wielka Brytania, Niemcy, Dania. Obecnie trwające badania skupiają się testowaniu nowych substancji pod kątem ich właściwości przeciwnowotworowych. Jony wapnia powszechnie występujące w komórkach wykazują silne działanie degradujące komórki nowotworowe. Wapń odgrywa kluczową rolę w rozmaitych procesach fizjologicznych m.in. regulacja cyklu komórkowego, ekspresja genów, indukcja proliferacji i śmierci komórkowej, dlatego też jego wewnątrzkomórkowe stężenie jest pod ścisłą kontrolą wielu kanałów i pomp wapniowych. Zaburzenie homeostazy wapniowej prowadzi do zakłócenia pracy organelli komórowych tj. mitochondrium, siateczki śródplazmatycznej, cytoszkieletu komórkowego oraz jądra, co w konsekwencji powoduje niewydolność całego układu komórkowego. Elektroporacja zastosowana do wprowadzania jonów wapnia do wnętrza komórek nowotworowych i drastycznego podnoszenie ich steżenia wykazuję wysoką efektywność antynowotoworową. Frandsen i in. potwierdzili, że elektroporacja w obecności jonów wapnia (1 mM) obniża przeżywalność komórek nowotoworowych o 60-90% w stosunku do komórek nietraktowanych terapią. Wyniki te są porównywalne z uzyskanymi po zastosowaniu cytostatyku – bleomycyny [1]. Dodaktowo, udowodniono, że drastyczny napływ wapnia powoduje wyrzut wewnątrzkomórkowego wapnia z magazynów ER, a tym samym przeciążenie mitochondrów i utratę ATP [2]. W konsekwencji niewydolna komórka nowotworowa zostaje wprowadzona na drogę śmierci komórkowej. Wykazano również silnie toksyczny wpływ terapii łączonej opartej na jonach wapnia i elektroporacji wykazano dla komórek włókniakomięsaka (Fibrosarcoma), które obumierały głównie na drodze programowanej śmieci komórkowej – apoptozy. Jednocześnie te same parametry terapii nie wpływały szkodliwie na prawidłowe komórki mięśniowe [3]. O dominacji jonów wapnia nad cytostatykami świadczy brak ich cytotoksyczności bez elektoporacji. Dualne działanie jonów wapnia może mieć swoje podłoże w odmiennej budowie komórek nowotworowych i prawidłowych. Antynowotworowa skuteczność elektroporacji w obecności jonów wapnia zarówno in vitro, jak i in vivo wydaje się obiecująca w przyszłych terapiach. Gehl i in. rozpoczęli także pierwsze badania kliniczne nad zastosowaniem terapii w leczeniu ludzkich nowotworów. Zgłębianie tego zagadnienia na poziomie komórkowym pozwoli wyjaśnić wiele procesów komórkowych uruchamianych po aplikacji elektroporacji z jonami wapnia. Literatura: [1] Frandsen SK,Gissel H, Hojman P, Eriksen J, Gehl J. Calcium electroporation in three cell lines: a comparison of bleomycin and calcium, calcium compounds, and pulsing conditions. Biochim Biophys Acta. 2014; 1840: 1204–1208 [2] Frandsen SK, Gissel H, Hojman P, Tramm T, Eriksen J, Gehl J. Direct therapeutic applications of calcium electroporation to effectively induce tumor necrosis. Cancer Res. 2012; 72:1336–1341 [3] Zielichowska A, Daczewska M, Saczko J, Michel O, Kulbacka J. Application of calcium electroporation to effective apoptosis induction in fibrosarcoma cells and stimulation of normal muscle cells. Bioelectrochemistry, 109, 2016, 70-78 66 P 19. ANALIZA EFEKTÓW KOMÓRKOWYCH ZASTOSOWANIA METODY ELEKTROPORACJI DO WSPOMAGANIA TERAPII PRZECIWNOWOTWOROWYCH Joanna Weżgowiec1*, Julita Kulbacka2, Jolanta Saczko2, Małgorzata Kotulska3 Zakład Materiałoznawstwa, Katedra Protetyki Stomatologicznej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Krakowska 26, 50-425 Wrocław, Polska; 2 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Chałubińskiego 10, 50-368 Wrocław, Polska; 3 Katedra Inżynierii Biomedycznej, Wydział Podstawowych Problemów Techniki, Politechnika Wrocławska, Wybrzeże Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław, Polska *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: reakcja elektro-fotodynamiczna, elektrochemioterapia, rak piersi, oporność wielolekowa Celem zrealizowanego projektu była ocena w warunkach in vitro możliwości zastosowania elektroporacji do wspomagania transportu substancji przeciwnowotworowych, w tym związków światłoczułych, do komórek nowotworowych gruczołu sutkowego z wykształconą opornością wielolekową. Materiał i metody: Efekty reakcji fotodynamicznej wspomaganej elektroporacją oraz elektrochemioterapii zostały ocenione na poziome komórkowym w modelu komórek raka piersi wrażliwym (MCF-7/WT) i opornym lekowo (MCF-7/DX). Analizowano potencjał wykorzystania metody elektroporacji w celu poprawy skuteczności działania dwóch związków o aktywności fotodynamicznej (cyjaniny IR-775 i Photofrinu) oraz jednego cytostatyku (bleomycyny). Wyniki: Wykazane zostało zwiększenie efektu toksycznego stosowanych związków dostarczanych metodą elektroporacji zarówno w komórkach wrażliwych (MCF-7/WT), jak i opornych (MCF-7/DX) na doksorubicynę. Ponadto, dzięki elektroporacji błon komórkowych możliwe było uzyskanie zadowalającej skuteczności przeciwnowotworowej nawet przy zastosowaniu niewielkich stężeń badanych związków oraz krótkich czasów ich oddziaływania na komórki. Wnioski: Uzyskane wyniki sugerują, iż wspomaganie terapii przeciwnowotworowych poprzez elektroporację może pozwolić na poszerzenie spektrum stosowanych leków oraz zmniejszyć skutki uboczne leczenia dzięki możliwości zmniejszenia dawki podawanego leku. Uwzględniając obserwowane efekty komórkowe, elektroporacja może być rozważana jako atrakcyjna metoda wspomagania nie tylko chemioterapii, ale również terapii fotodynamicznej. Badania były częściowo finansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki w ramach programu Preludium (grant nr 2014/15/N/NZ7/02983, J. Weżgowiec). 67 P 20. OCENA WPŁYWU ELEKTROPORACJI ORAZ ELEKTROCHEMIOTERAPII NA KOMÓRKI LUDZKIEGO NOWOTOWRU TRZUSTKI W BADANIACH IN VITRO Wioleta Więckowska1,2*, Anna Choromańska2, Małgorzata Kotulska1 Katedra Inżynierii Biomedycznej, Wydział Podstawowych Problemów Techniki, Politechnika Wrocławska; 2 Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: elektroporacja, elektrochemioterapia, EPP85-181 P, EPP85-181 RDB, test klonogenny Cel: Elektroporacja to zjawisko powstawnaia tymczasowych, hydrofilowych porów w błonie komórkowej pod wpływem działania polem elektrycznym o różnym natężeniu. Celem badania było sprawdzenie wpływu elektropracji oraz elektroporacji łączonej z bleomycyną na dwie linie ludzkiego nowotworu trzustki: linię oporną na daunorubicynę (EPP85-181RDB) oraz linię wrazliwą na daunorubicynę (EPP85-181P). Materiały i Metody: Badania in vitro były przeprowadzane na dwóch liniach komórkowych: EPP85181RDB oraz EPP85-181P. Są to linie komórkowe ludzkiego nowotworu trzustki, a dokładniej gruczolakoraka. W celu zbadania wpływu elektroporacji na ludzkie komórki nowotworu trzustki zastosowano następujące parametry pole elektrycznego: natężenie pola elektrycznego: 800 V/cm, 1200 V/cm, 1600 V/cm oraz 2000 V/cm, ilość impulsów: 8, długość impulsu: 100 µs, częstotliwość: 1 Hz oraz interwał: 1s. Elektroporację łączoną z bleomycyną przeprowadzono dla dwóch natężeń pola elektrycznego: 1200 V/cm i 2000 V/cm przy stężeniu bleomycyny równym 300nM. Zastosowany test klonogenny pozwalał na ocenę przeżywalności komórkowej oraz zdolności komórek do tworzenia kolonii. Wyniki: Linia komórkowa ludzkiego nowotworu trzustki EPP85- 181RDB wykazała wyższą przeżywalność w porówaniu do linii komórkowej EPP85-181P. Linia wrażliwa na daunorubicynę była bardziej wrażliwa na działanie pola elektrycznego. Zastosowanie elektroporacji łączonej z bleomycyną spowodowało bardzo wyraźny spadek przeżywalności komórek. Wnioski: Zastosowanie procedury elektroporacji w celu zwiększenia efektywności transportu bleomycyny do wnętrza badanych komórek powoduje wzrost śmiertelności obu badanych linii komórkowych. Linia komórkowa raka trzustki wrażliwa na daunorubicynę wykazuje większą wrażliwość na działanie elektroporacji łączonej z bleomycyną w porównaniu do linii opornej na daunorubicynę. Finansowanie: Grant nr 210/2016 koła naukowego BioNanopor Politechniki Wrocławskiej 68 P 21. PROZDROWOTNE I ANTYOKSYDACYJNE WŁAŚCIWOŚCI WYBRANYCH GATUNKÓW WARZYW Z RODZINY KRZYŻOWYCH Remigiusz Olędzki1 Katedra Biotechnologii i Analizy Żywności, Instytut Chemii i Technologii Żywności, Wydział Inżynieryjno-Ekonomiczny, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu, ul. Komandorska 118/120, 53-345 Wrocław, e-mail:[email protected] 1 Słowa kluczowe: związki bioaktywne w żywności, metody pomiaru potencjału antyoksydacyjnego, przeciwutleniacze polifenolowe, profilaktyka schorzeń cywilizacyjnych Cel: Celem pracy była ocena jakości zdrowotnej wybranych gatunków warzyw z rodziny krzyżowych pod względem właściwości antyoksydacyjnych oraz zawartości związków polifenolowych. Materiał i metody: Materiałem badawczym były dojrzałe warzywa należące do siedmiu gatunków warzyw kapustnych: kapusta włoska (Brassica oleracea var. sabauda), kapusta pekińska (Brassica pekinensis), kapusta warzywna głowiasta (Brassica oleracea L. var. capitata L.) kapusta warzywna brukselska (Brassica oleracea var. gemmifera), kalafior (Brassica oleracea var. botrytis), brokuł (Brassica oleracea var. botrytis italica), kalarepa (Brassica oleracea var. gongylodes) oraz jarmuż (Brassica oleracea convar. acephala var. sabellica). Oznaczenie wartości potencjału antyoksydacyjnego przeprowadzono metodą ABTS, DPPH oraz testem FRAP. Pomiar całkowitej zawartości związków fenolowych przeprowadzono metodą Folina-Ciocalteau. Wyniki: Analiza uzyskanych wyników pomiaru potencjału antyoksydacyjnego wykazała istotne pod względem statystycznym różnice w aktywności przeciwutleniającej badanych gatunków i odmian warzyw kapustnych. Również zawartość związków fenolowych była istotnie zróżnicowana w zależności od gatunku i odmiany badanych warzyw. Najwyższą aktywność antyoksydacyjną wśród badanych warzyw stwierdzono dla świeżego brokułu, natomiast najwyższą koncentrację związków polifenolowych wykazano w świeżym brokule, liściach jarmużu oraz kapuście włoskiej. Wnioski: Przebadane gatunki warzyw są zasobnym źródłem związków przeciwutleniających. Zawartość związków polifenolowych oraz ogólna aktywność związków o właściwościach antyoksydacyjnych zależała nie tylko od gatunku, ale również od odmiany w obrębie tego samego gatunku warzyw z rodziny krzyżowych. 69 P 22. LECZENIE CHIRURGICZNE KOBIET Z GUZAMI PŁUC PO LECZENIU RAKA GRUCZOŁU PIERSIOWEGO Maciej Ornat1, Piotr Błasiak1, Beata Muszczyńska-Bernhard3, Jarosław Adamiak3, Konrad Pawełczyk1, Ewa Żak1, Jędrzej Grzegrzółka2, Adam Rzechonek1 Katedra i Klinika Chirurgii Klatki Piersiowej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, ul. Grabiszyńska 105, 53-439 Wrocław; 2 Katedra i Zakład Histologii i Embriologii, Uniwersytet Medyczny We Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 6a, 50-368 Wrocław; 3 Zakład Patomorfologii, Dolnośląskie Centrum Chorób Płuc, ul. Grabiszyńska 105, 53-439 Wrocław *e-mail: [email protected] 1 Słowa kluczowe: rak gruczołu piersiowego, przerzuty do płuc, rak płuca Cel: Badanie wykazało efektywność chirurgicznego leczenia pacjentek z guzami płuc po uprzedniej resekcji i terapii skojarzonej raka gruczołu piersiowego. Materiał i metody: Analizie poddano 65 pacjentek leczonych wcześniej onkologicznie z powodu raka piersi, u których wykryto w badaniach kontrolnych guzki płuc. Do badania włączono pacjentki, które po wykonaniu badań czynnościowych i tomografii komputerowej, zostały zakwalifikowane do radykalnej resekcji wszystkich wykrytych zmian w płucach. W badaniu nie uwzględniono przypadków pacjentek nieoperacyjnych. U wszystkich chorych wykonano torakotomie i w zależności od wyniku histopatologicznego podejmowano decyzje terapeutyczne związane z zakresem resekcji. U większości wykonano resekcje klinowe zmian, u pozostałych lobektomie. W zależności od wyniku histopatologicznego wydzielono: grupę I, którą stanowiło 35 pacjentek z przerzutami raka piersi, do grupy II włączono 18 chorych z nowymi pierwotnymi nowotworami płuca, grupę III stanowiły pacjentki z łagodnymi guzkami płuc. Z uwagi na rozpoznanie pierwotnego nowotworu płuca u pacjentek w grupie I wykonywano rzadziej lobektomię (6%), najczęściej resekcję klinową 94%. Wyniki: Długoterminowe przeżycia były najdłuższe kolejno u pacjentek ze zmianami łagodnymi w płucach – mediana 46,6; poddanych radykalnej resekcji pierwotnego raka płuc – średnia 43,4 mediana 40,8), a najkrótszy u kobiet po metastazektomii – mediana 34,4. Wnioski: 1. W kwalifikacji do operacji guzków w płucach u pacjentek leczonych wcześniej z powodu raka piersi należy wziąć pod uwagę możliwość wystąpienie drugiego pierwotnego nowotworu w płucach. Wiąże się to najczęściej z potrzebą resekcji o większym zakresie niż w przypadku zmian łagodnych lub przerzutowych 2. Pacjentki, u których wykryto drugi pierwotny nowotwór rokują lepiej niż chore operowane z powodu przerzutów raka piersi do płuc. 3. Duży odsetek zmian łagodnych w płucach u poddanych analizie pacjentek skłania do uszczegółowienia diagnostyki obrazowej przed kwalifikacją do operacji torakochirurgicznej. Badania finansowane z grantu ST C010.16.007. 70 P 23. CYTOTOKSYCZNOŚĆ SUBSTYTUTÓW ŚLINY – BADANIE IN VITRO NA PIERWOTNEJ LINII LUDZKICH FIBROBLASTÓW DZIĄSŁOWYCH Agnieszka Nowakowska-Toporowska1*, Julita Kulbacka2, Justyna Piłat2, Włodzimierz Więckiewicz1, Jolanta Saczko2 Katedra Protetyki Stomatologicznej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Polska Katedra i Zakład Biochemii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, Polska e-mail: [email protected] 1 2 Słowa kluczowe: substytuty śliny, cytotoksyczność, ludzkie fibroblasty dziąsłowe Cel: Ocena in vitro cytotoksyczności czterech preparatów zastępujących ślinę (Mucinox, Xerostom, Biotene, GC Dry Mouth Gel), przeznaczonych do leczenia objawowego pacjentów cierpiących z powodu suchości jamy ustnej powstałej w wyniku Zespołu Sjögrena, przyjmowania niektórych leków oraz po radio- i chemioterapii lub powstałej z przyczyn idiopatycznych. Materiał i metody: W celu określenia stopnia cytotoksyczności wybranych substytutów śliny przeprowadzono analizę MTT na ludzkich fibroblastach dziąsłowych (HGFs) pochodzących z pierwotnej kultury komórkowej izolowanych od kobiety oraz od mężczyzny. Żele zastosowano w stężeniu oryginalnym oraz w rozcieńczeniach 1:2 i 1:10. Przeżywalność komórek oceniono po 5 i 10 min., 1h, 24h oraz 72h czasu inkubacji. Wyniki: Dla wszystkich badanych substytutów śliny zaobserwowano efekt cytotoksyczności na ludzkie fibroblasty dziąsłowe. Był on zróżnicowany w zależności od składu chemicznego, rozcieńczenia i czasu działania preparatu zastępującego ślinę a także płci pacjenta, od którego pochodziła kultura fibroblastów dziąsłowych. Wnioski: Substytuty śliny mogą wywierać efekt cytotoksyczny na tkanki jamy ustnej. 71 INDEKS AUTORÓW Adamiak Jarosław..................................... 37, 70 Andruszkiewicz Michał .................................. 49 Anger Natalia .................................................. 39 Bartoszewicz Marzenna .................................. 52 Bieżuńska-Kusiak Katarzyna........ 45, 50, 60, 66 Błasiak Piotr........................................ 37, 60, 70 Błaszczyńska Agata ........................................ 46 Bonarska-Kujawa Dorota ............................... 59 Chełmońska-Soyta Anna ................................ 35 Chodaczek Grzegorz....................................... 35 Choromańska Anna ............................ 57, 66, 68 Chrzanowska Dominika.................................. 62 Chwiłkowska Agnieszka .............. 55, 56, 61, 63 Ciochos Jakub ................................................. 41 Cyboran Sylwia .............................................. 59 Czarnecka Marta ....................................... 36, 42 Daczewska Małgorzata ....................... 31, 32, 66 Długosz Anna ................................................. 29 Dominiak Marzena ......................................... 38 Drab Marek ..................................................... 22 Drąg-Zalesińska Małgorzata........................... 61 Dubińska-Magiera Magda .............................. 31 Dydak Karolina............................................... 52 Fleszar Mariusz G. .......................................... 43 Gamian Andrzej .............................................. 43 Gawenda Justyna ............................................ 34 Gliszczyńska Anna ................................... 36, 42 Gołba Marta .................................................... 51 Grzegrzółka Jędrzej .................................. 37, 70 Harasiewicz Marta .......................................... 64 Jabłońska Jadwiga .......................................... 31 Jagła Krzysztof ............................................... 31 Junka Adam F. ................................................ 52 Kałas Wojciech ............................................... 41 Kamińska Iwona ............................................. 53 Karbowiak Mirosław ...................................... 41 Karkoszka Kamila .......................................... 54 Klausa Elżbieta ............................................... 30 Kleszczyńska Halina ....................................... 59 Kobielarz Magdalena ...................................... 63 Kotulska Małgorzata............... 44, 49, 56, 67, 68 Krzywiecka Emilia ................................... 55, 56 Kulbacka Julita ............................ 37, 40, 44, 45, 46, 49, 50, 54, 58, 60, 64, 65, 66, 67, 71 Kuzan Aleksandra........................................... 33 Latocha Małgorzata ........................................ 21 Leońska Marta ................................................ 30 Lewicka Anna ................................................. 32 Łubińska Sandra ............................................. 57 Marchewka Zofia............................................ 64 Matuszewski Michał....................................... 29 Mączyńska Justyna ....................... 45, 50, 58, 60 Męczarska Katarzyna ..................................... 59 Michel Olga ...................... 37, 45, 50, 58, 60, 66 Migocka-Patrzałek Marta ............................... 32 Mikołajewicz Katarzyna ................................. 35 Muszczyńska-Bernhard Beata .................. 37, 70 Niedzielska Natalia ......................................... 44 Niezgoda Natalia ............................................ 36 Niżański Wojciech.......................................... 28 Nowakowska-Toporowska Agnieszka ........... 71 Olędzki Remigiusz ......................................... 69 Ornat Maciej ................................................... 70 Oszmiański Jan ............................................... 59 Pańszczyk Roksana ........................................ 61 Partyka Agnieszka .......................................... 28 Pawełczyk Konrad .................................... 37, 70 Piechowicz Joanna.......................................... 43 Piłat Justyna .................................................... 71 Piwowar Agnieszka ........................................ 30 Przystupski Dawid .......................................... 62 Ratajek Maria ................................................. 63 Rembiałkowska Nina.................... 45, 64, 65, 66 Rodak Olga ..................................................... 28 Roik Joanna .................................................... 40 Rossowska Joanna .......................................... 39 Rychlicka Magdalena ............................... 36, 42 Rzechonek Adam ......................... 37, 58, 60, 70 Saczko Jolanta ....................... 37, 38, 45, 50, 51, 58, 60, 64, 65, 66, 67, 71 Sadowska-Bartosz Izabela .............................. 23 Sawicka Ewa .................................................. 40 Sterczała Barbara ............................................ 38 Strządała Leon ................................................ 41 Szewczyk Anna ............................ 45, 49, 50, 66 Szydełko Martyna ........................................... 40 Szymańska Beata ............................................ 29 Szymczyk Patrycja ......................................... 52 Świtalska Marta .............................................. 36 Tsirigotis-Maniecka Marta ............................. 34 Wawrzeńczyk Czesław................................... 36 Weżgowiec Joanna ......................................... 67 Wietrzyk Joanna ............................................. 36 Więckiewicz Włodzimierz ............................. 71 Więckowska Wioleta ...................................... 68 Wycisk Krzysztof ........................................... 27 Wysokińska Edyta .......................................... 41 Żak Ewa .................................................... 37, 70 72
