ruchome elementy genetyczne bakterii

RUCHOME ELEMENTY GENETYCZNE
BAKTERII
Skrypt do ćwiczeń
dr hab. Dariusz Bartosik (koordynator zajęć)
mgr Łukasz Dziewit
mgr Anna Klicka
mgr Magdalena Szuplewska
Zakład Genetyki Bakterii
Instytut Mikrobiologii
Wydział Biologii
Uniwersytet Warszawski
I. Regulamin pracowni
1. W pracowni obowiązuje noszenie fartucha ochronnego (najlepiej białego).
2. Na stołach laboratoryjnych mogą znajdować się wyłącznie materiały potrzebne do
wykonywania ćwiczenia.
3. W pracowni zabronione jest spożywanie posiłków oraz palenie tytoniu.
4. Należy zachować daleko idącą ostrożność przy pracy z materiałem mikrobiologicznym:
a) stosować się do zasad pracy jałowej (zachować szczególną ostrożność przy pracy w
bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika);
b) hodowle bakteryjne w probówkach wstawiać do statywów (nie wolno ich kłaść na
stole);
c) każdą posianą próbę dokładnie opisywać (rodzaj posiewu, inicjały osoby
wykonującej posiew, data itp.);
d) po skończeniu posiewów wyżarzać ezy, opalać głaszczki, a pipety wkładać do
specjalnych pojemników.
5. Po zakończeniu pracy należy posprzątać stół laboratoryjny, niepotrzebny już sprzęt
odłożyć na miejsce, pozostawić w porządku mikroskop.
6. Niepotrzebne hodowle drobnoustrojów oraz szkło używane w trakcie pracy należy odłożyć
do specjalnie przygotowanych pojemników, po uprzednim usunięciu wszelkich napisów, i
zanieść do zmywalni.
7. Nie wolno wynosić z pracowni żadnych hodowli bakteryjnych i preparatów bez
pozwolenia.
8. Po zakończeniu pracy należy sprawdzić, czy został wyłączony gaz oraz używana aparatura
nie przeznaczona do pracy ciągłej.
9. Przed wyjściem z sali należy umyć ręce.
10. W razie jakichkolwiek problemów należy niezwłocznie zgłosić się do osoby prowadzącej
zajęcia.
2
SPIS TREŚCI
IZOLACJA PLAZMIDÓW, ICH ANALIZA I
WYKORZYSTANIE W INŻYNIERII GENETYCZNEJ
Ćw. 1
Ćw. 2
Ćw. 3
Ćw. 4
METODY OCZYSZCZANIA PLAZMIDOWEGO DNA
Oczyszczanie DNA plazmidowego na dużą skalę
- ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu (CsCl) z bromkiem etydyny (EtBr)
Oczyszczanie DNA plazmidowego na małą skalę
- miniliza alkaliczna
KONSTRUKCJA MINIREPLIKONU. ENZYMY I WEKTORY
Wykorzystanie różnych wektorów do klonowania
Konstrukcja minireplikonów
METODY WPROWADZANIA DNA DO KOMÓRKI BAKTERYJNEJ
Transformacja metodą rubidowo-wapniową
Elektroporacja
Koniugacja trójrodzicielska
5
6
8
9
9
9
11
12
13
13
MOLEKULARNA CHARAKTERYSTYKA SYSTEMÓW
KODUJĄCYCH TOKSYNĘ I ANTYTOKSYNĘ
Ćw. 5
Ćw. 6
Ćw. 7
Ćw. 8
SYSTEMY ADDYKCYJNE
Analiza organizacji genetycznej systemu addycyjnego
Izolacja i elektroforeza RNA
RT-PCR
Oznaczanie siły promotorów systemów addykcyjnych oraz badanie interakcji
białek z wykorzystaniem układu dwuhybrydowego
Badanie efektu toksycznego wywołanego przez trucizny różnych systemów
addykcyjnych oraz zdolności antidotum do jego odwracania
15
15
15
17
19
23
IDENTYFIKACJA I ANALIZA FUNKCJONALNYCH
ELEMENTÓW TRANSPOZYCYJNYCH
Ćw. 9
Ćw. 10
i 11
IDENTYFIKACJA I ANALIZA ELEMENTÓW TRANSPOZYCYJNYCH Z
WYKJORZYSTANIEM WEKTORÓW PUŁAPKOWYCH
Identyfikacja elementów transpozycyjnych w szczepie Paracoccus
aminophilus JCM7686R z wykorzystaniem wektora pułapkowego
pEBB10
Określenie liczby kopii zidentyfikowanego TE i jego lokalizacja w genomie
Paracoccus aminophilus JCM7686R
Rozpowszechnienie zidentyfikowanego TE w wybranych szczepach z
rodzaju Paracoccus sp.
Izolacja totalnego DNA
Hybrydyzacja DNA-DNA i immunodetekcja wyznakowanego DNA
Hybrydyzacja DNA-DNA metodą „Dot-Blot”
Ćw. 12
26
27
29
29
29
30
35
ANALIZY BIOINFORMATYCZNE
3
CZĘŚĆ I
IZOLACJA PLAZMIDÓW, ICH ANALIZA I
WYKORZYSTANIE W INŻYNIERII GENETYCZNEJ
4
Ćwiczenie nr 1
Metody oczyszczania plazmidowego DNA
I. Oczyszczanie DNA plazmidowego na dużą skalę
Izolacja plazmidowego DNA metodą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu (CsCl)
z bromkiem etydyny (EtBr).
Metoda ta została po raz pierwszy zastosowana przez Radloff’a, Bauer’a i Vinograd‘a w
1967 roku do oczyszczenia mitochondrialnego DNA z linii komórkowej HeLa. Później
znalazła zastosowanie w oczyszczaniu i izolacji na dużą skalę (pozwala na uzyskanie mg
DNA) plazmidowego DNA.
Zasada działania: Bromek etydyny interkaluje w strukturę dwuniciowych kwasów
nukleinowych, co prowadzi do nieznacznego rozplecenia helisy. Forma kowalentnie
zamkniętego DNA (cccDNA) włącza znacznie mniej bromku etydyny niż formy OC i liniowego
DNA, więc jej gęstość pławna zmienia się w mniejszym stopniu niż ma to miejsce w
przypadku pozostałych form. Stosowany w tej metodzie chlorek cezu (CsCl) jest
wysokocząsteczkową solą, której stężony (8 M) roztwór ma gęstość podobną do gęstości
DNA (1,7 g/cm3). W wyniku wirowania w wysokich obrotach (45 tys. rpm, 48 godz) wytwarza
się gradient CsCl (Rys. 1a), zaś DNA, w zależności od formy, przesuwa się w miejsce, w
którym jego gęstość pławna jest równa gęstości rozpuszczalnika (Rys. 1b). Różnice w
gęstości pławnej form superhelikalnej (np. plazmidowe DNA) i liniowej (np. pofragmentowane
DNA chromosomalne) powodują, że powstają dwa prążki DNA: cccDNA lokuje się bliżej dna
probówki, a liniowe DNA nad nim. Znajdujące się w surowym lizacie komórkowym RNA
osiada na dnie komórki, a białka unoszą się w stronę korka.
Należy pamiętać, że ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu (CsCl) z bromkiem
etydyny pozwala na różnicowanie DNA ze względu na jego strukturę i gęstość pławną, a nie
wielkość cząsteczki kwasu nukleinowego. Jeśli w tej metodzie zastosowany zostanie szczep
posiadający kilka plazmidów, niezależnie od wielkości ich cząsteczek, wszystkie znajdą się w
jednym paśmie DNA, a do ich rozdzielenia konieczne będzie zastosowanie innych metod,
np. wirowania w gradiencie alkalicznej lub neutralnej sacharozy, czy też elektroforezy w żelu
agarozowym.
gradient CsCl
[g/cm3]
1,60
DNA liniowy i OC
siła odśrodkowa
1,70
1,80
Rys. 1.
białka
a) gradient CsCl
superhelikalny DNA
(cccDNA)
RNA
b) obraz w UV po wirowaniu
w gradiencie CsCl i EtBr.
5
Celem ćwiczenia jest izolacja dużych plazmidów, pochodzących z bakterii
izolowanych z endemicznych środowisk, poprzez ultrawirowanie w gradiencie
CsCl+EtBr.
Część praktyczna:
Oczyszczanie formy cccDNA plazmidowego metodą ultrawirowania w
gradiencie chlorku cezu z bromkiem etydyny (procedura).
1. Załóż hodowlę odpowiedniego szczepu bakteryjnego przez zaszczepienie 10 ml
podłoża LB z odpowiednim antybiotykiem materiałem z pojedynczej kolonii i inkubuj w
odpowiedniej temperaturze dla danego szczepu z wytrząsaniem przez noc.
2. Dodaj 10 ml hodowli do 1 litra podłoża z antybiotykiem i inkubuj przez kilkanaście
godzin z wytrząsaniem.
3. Odwiruj hodowlę w wirówce Sorval (6000 obr/min, 20 min, 4ºC).
4. Po zwirowaniu komórek dokładnie usuń supernatant.
5. Zawieś komórki w 40 ml (na 1 litr hodowli!) roztworu I (50 mM glukoza, 25 mM TrisHCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). Wymieszaj bardzo dokładnie.
6. Dodaj 80 ml roztworu II (0,2 M NaOH, 1% SDS w/v).
7. Wymieszaj dokładnie lecz łagodnie i pozostaw probówki w lodzie na 10 min.
8. Dodaj 60 ml zimnego roztworu III (5 M octan potasu, pH 4,8). Wymieszaj dokładnie
przez łagodne odwracanie probówki i pozostaw w lodzie na 15 min.
9. Odwiruj przez 15 min w wirówce Sorval (7 000 obr/min, 4ºC).
10. Zlej ostrożnie supernatant przez kilka warstw gazy do cylindra. Jeżeli w zlanym
supernatancie pozostanie biały precypitat, powtórz wirowanie.
11. Zmierz objętość supernatantu. Dodaj 0,6 objętości izopropanolu. Wymieszaj i
pozostaw w temperaturze pokojowej przez 15 min.
12. Odwiruj w wirówce Sorval (7 000 obr/min, 15 min, temperatura pokojowa).
13. Zlej ostrożnie supernatant, tak aby zachować nienaruszony osad. Osad należy
wysuszyć pod próżnią lub w termostacie na 37ºC.
14. Wysuszony osad rozpuść w 8 ml buforu TE. Zneutralizuj pH (do pH 7-8) dodając
kroplami 2 M Tris-base i kontrolując pH papierkiem wskaźnikowym.
UWAGA: PRACA W RĘKAWICZKACH
Bromek etydyny jest rakotwórczy,
należy zachować ostrożność pracując z tym roztworem.
6
15. Przenieś całą objętość z probówki wirowniczej do probówki „Corex” zawierającej
8,6 g CsCl (uprzednio wysuszonego). Wymieszaj dokładnie przez obracanie probówki
zabezpieczonej parafilmem. Dodaj 1 ml bromku etydyny (roztwór EtBr – 10 mg/ml).
Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 min.
16. Odwiruj przez 5 min w wirówce Sorval (10 000 obr/min, temperatura pokojowa).
17. Usuń warstwę białek i właściwy roztwór przenieś do probówki do ultrawirowania.
Zmierz gęstość roztworu przez zważenie 1 ml. Gęstość powinna być w zakresie 1,55
– 1,59 g/ml. Jeżeli wykracza poza te granice doprowadź do właściwego poziomu
przez dodanie buforu TE lub roztworu CsCl (10 g CsCl/ 10 ml TE).
18. Probówki zrównoważ bardzo dokładnie.
19. Wiruj w ultrawirówce Beckman, rotor kątowy Ti50 przez 48 godz. (40 000 obr/min,
15ºC).
20. Po zakończeniu wirowania obejrzyj probówki w świetle UV (320 nm). Powinny być
widoczne dwa wyraźnie oddzielone pasma DNA (Rys. 1). Używając pipety
pasterowskiej zbierz DNA z dolnego pasma starając się nie pobrać materiału z
pasma górnego (DNA chromosomalne).
21. Z zebranego materiału należy usunąć EtBr przez kilkukrotną ekstrakcję alkoholem
izopropanowym nasyconym CsCl, aż do zaniku różowej barwy roztworu DNA.
22. Następnie preparat należy oczyścić z CsCl. W tym celu przenieś preparat pipetą
pasterowską do worka dializacyjnego. Dializa w chłodni w 1 litrze buforu TE przez
noc, zmiana buforu 1-2 razy.
23. Oczyszczony preparat nałóż na żel i sprawdź elektroforetycznie jego gęstość i
czystość.
7
Ćwiczenie nr 2
Metody oczyszczania plazmidowego DNA (cd)
II. Oczyszczanie DNA plazmidowego na małą skalę
Celem ćwiczenia jest krytyczna ocena dwóch metod umożliwiających izolację
plazmidowego DNA na małą skalę.
Część praktyczna:
Miniliza alkaliczna (modyfikacja metody Birnboim i Doly, 1979)
Roztwór I:
Roztwór II:
Roztwór III:
50 mM glukoza; 10 mM EDTA; 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)
0,2 M NaOH; 1% SDS
octan potasu (pH 4,8)
1. Odwiruj w eppendorfówce 1,5 ml nocnej hodowli bakterii (3 min w mikrowirówce).
2. Bardzo dokładnie zlej supernatant.
3. Osad zawieś w 100 μl roztworu I.
4. Dodaj 200 μl roztworu II. Zawartość eppendorfówki wymieszaj przez kilkukrotne
odwracanie probówki i inkubuj w lodzie przez 5 min.
5. Dodaj zimnego roztworu III, delikatnie wymieszaj i inkubuj w lodzie przez 5 min.
6. Dodaj kilka kropli mieszaniny fenolu z chloroformem (1:1) w celu odbiałczenia
preparatu.
7. Wymieszaj łagodnie i zwiruj 10 min w temp. pokojowej.
8. Zbierz fazę wodną (górna warstwa) do nowej probówki. Dodaj 2 objętości 96%
etanolu (1 ml), wymieszaj i trzymaj 15 min w temp. -20ºC (precypitacja DNA).
9. Odwiruj wytrącony DNA w mikrowirówce (10 min, 4ºC).
10. Zlej dokładnie supernatant i przemyj osad 70% etanolem (70 μl). Krótko odwiruj (5
min).
11. Dokładnie usuń supernatant (tak aby alkohol nie pozostawał na ściankach). Wysusz
osad przez wstawienie otwartej probówki do termostatu na 37ºC.
12. Osad zawieś w 40 μl buforu TE (pH 8,0).
Oczyszczanie plazmidowego DNA przy pomocy komercyjnie dostępnych
zestawów.
8
Ćwiczenie nr 3
Konstrukcja minireplikonów. Enzymy restrykcyjne i wektory.
I. Wykorzystanie wektorów do klonowania DNA.
Klonowanie to proces polegający na uzyskaniu wielu identycznych kopii interesującego nas
genu (lub fragmentu DNA), poprzez jego wstawienie do tzw. wektora do klonowania, a
następnie namnożenie zrekombinowanego wektora w odpowiednim gospodarzu.
Cechy wektorów do klonowania:
•
muszą by zdolne do autonomicznej replikacji w komórkach określonego gospodarza;
•
muszą mieć miejsce do klonowania, w które można wbudować obcy fragment DNA;
•
powinny mieć odpowiedni marker selekcyjny, kodujący łatwo wyróżnialne cechy
fenotypowe, dzięki którym będzie można wyselekcjonować komórki niosące
plazmidy;
•
powinny mieć odpowiednią kasetę selekcyjną, kodującą łatwo wyróżnialne cechy
fenotypowe, dzięki którym będzie można wyselekcjonować komórki niosące
zrekombinowany plazmid;
•
powinny by małe, aby łatwo dały się wprowadzać do komórek gospodarza.
Celem tego cyklu zajęć jest zapoznanie uczestników z różnymi typami wektorów do
klonowania oraz różnymi typami selekcji zrekombinowanych klonów.
II. Konstrukcja minireplikonów
Replikon – fragment DNA występujący autonomicznie w cytoplazmie zdolny do samodzielnej replikacji.
Minimalny replikon – minireplikon zawierający najmniejszy fragment macierzystego
plazmidu zdolny do autonomicznej replikacji. Nie charakteryzuje się on cechami plazmidu
wyjściowego. Zwykle jest niestabilny.
Podstawowy replikon – jest to minimalna część plazmidu naturalnego zdolna do replikacji,
ale jednocześnie zachowująca większość cech plazmidu macierzystego (liczba kopii,
stabilność, zakres gospodarza).
Replikon złożony – w cząsteczce takiego replikon (np. plazmid F) występuje kilka systemów
replikacyjnych.
Celem ćwiczenia jest konstrukcja minireplikonów naturalnych plazmidów poprzez
ligację fragmentów restrykcyjnych (powstałych w wyniku trawienia tych plazmidów
różnymi enzymami restrykcyjnymi) z tzw. kasetą kanamycynową.
9
Część praktyczna:
1. Plazmid oczyszczony na zajęciach nr 2 za pomocą zestawu PlasmidMini strawić
enzymami restrykcyjnymi: EcoRI, BamHI, SmaI. Trawienie 1 godz. w temp. 37 οC.
Mieszanina reakcyjna:
plazmid
enzym
bufor (10 x)
----------------RAZEM
- 17 μl
- 1 μl
- 2 μl
- 20 μl
2. Plazmid pKRP11 oczyszczony przez ultrawirowanie w gradiencie CsCl+EtBr (źródło
kasety kanamycynowej) należy strawić analogicznym enzymem. Trawienie 1 godz.
w temp. 37 οC.
Mieszanina reakcyjna:
pKRP11
enzym
bufor (10 x)
H2O
dejonizowana
----------------RAZEM
-
6 μl
1 μl
2 μl
11 μl
- 20 μl
3. Po zakończeniu trawienia plazmidu pKRP11 należy całą próbę nanieść na 0,8% żel
agarozowy i przeprowadzić elektroforezę DNA.
4. Po zakończeniu elektroforezy należy wyizolować fragment DNA (zawierający kasetę
kanamycynową) z żelu agarozowego za pomocą zestawu „Gel Out” (fragment
wielkości około 1,4 kb).
5. Strawione odpowiednimi enzymami DNA plazmidu F należy oczyścić po trawieniu za
pomocą zestawu „Clean Up”.
6. Następnie należy nastawić reakcję ligacji preparatów uzyskanych po oczyszczeniu
trawień plazmidu F z wyizolowaną kasetą kanamycynową. Ligacja 2 godz. w temp.
pokojowej.
Mieszanina reakcyjna:
mieszanina fragmentów restrykcyjnych plazmidu F
wyizolowana kaseta kanamycynowa
ligaza DNA bakteriofaga T4
bufor do ligazy (10 x)
----------------------------------------------RAZEM
- 10
- 7
- 1
- 2
μl
μl
μl
μl
- 20 μl
======================================================================
Na następnych zajęciach (ćwiczenia nr 5):
7. Transformacja mieszaniny ligacyjnej do szczepu E. coli MC11061 i wysiew na
podłoże selekcyjne LA+Km (LA – podłoże LB zestalone agarem).
10
Ćwiczenie nr 4
Metody wprowadzania DNA do komórki bakteryjnej
Transformacja
Transformacją nazywamy proces pobierania egzogennego DNA przez komórkę biorcy.
Zjawisko naturalnej transformacji jest częste w przypadku bakterii rosnących w strukturze
biofilmu a w regulacji tego procesu znaczącą rolę odgrywa zjawisko wyczuwania liczebności
(ang. quorum sensing). Transformacja większość bakterii wymaga zastosowania
specyficznych metod laboratoryjnych. Jedynie komórki znajdujące się w stanie tzw.
kompetencji są zdolne do pobrania DNA ze środowiska. Niektóre rodzaje bakterii osiągają
stan kompetencji spontanicznie np. Bacillus, Streptococcus, Azotobacter czy Helicobacter,
bądż też są w stanie konstytutywnej kompetencji jak Neisseria gonorrhoeae. Bakterie są
zdolne do pobrania każdego DNA, jedynie w przypadku N. gonorrhoeae i H. pylori
wymagana jest homologia sekwencji do chromosomowego DNA.
W warunkach laboratoryjnych transformację chemiczną przeprowadza się dodając
mieszaninę DNA do zawiesiny komórek uprzednio traktowanych czynnikami chemicznymi
w niskiej temperaturze. Całość poddaje się szokowi termicznemu, a po odpowiednim czasie
inkubacji wysiewa na podłoża selekcyjne. Odmianą transformacji jest elektrotransformacja
(elektroporacja) wykorzystywana w przypadku bakterii, które nie uzyskują stanu
kompetencji pod wpływem czynników chemicznych lub gdy wydajność procesu transformacji
jest niska. W tej metodzie mieszaninę DNA i bakterii poddaje się krótkiemu (5 -10 msec)
pulsowi prądu elektrycznego o napięciu rzędu 2,5 kV.
Wydajność transformacji w przypadku E. coli zależy od formy DNA: najwyższa dla formy
CCC, niższa dla OC a najniższa dla formy liniowej. Do komórki bakterii wnika najczęściej
tylko jedna cząsteczka DNA, o czym warto pamiętać w przypadku przeprowadzania
transformacji mieszaniną różnych cząsteczek DNA.
Koniugacja
Koniugacja jest definiowana jako proces przekazywania materiału genetycznego z jednej
komórki bakteryjnej do drugiej, wymagający bezpośredniego kontaktu obu komórek. Transfer
koniugacyjny plazmidów jest zaliczany do najistotniejszych procesów HGT (ang. horizontal
gene transfer). Proces koniugacji można podzielić na dwa etapy:
• przygotowanie DNA plazmidu do transferu koniugacyjnego tzw. funkcje Dtr (ang. DNA
transfer and replication)
• powstanie
tzw.
„mostu
koniugacyjnego”
czyli
fuzji
błon
miedzy
dawcą
a biorcą u bakterii gramujemnych a w przypadku bakterii gramdodatnich tworzenie
agregatów koniugacyjnych, tzw. funkcje Mpf (ang. mating pair formation)
DNA jest przekazywany jednokierunkowo w postaci jednoniciowego odcinka DNA dawcy
o polarności 5’J3’. Powstały na skutek przecięcia nici wolny koniec 5’ pozostaje
przytwierdzony do błony komórkowej w pobliżu połączenia partnerów. Do biorcy
wprowadzana jest tylko jedna nić DNA (ta, która ulega przecięciu), stanowi ona matrycę do
syntezy nici komplementarnej, czego efektem jest odtworzenie plazmidu w komórce biorcy.
Wolny koniec 3’-OH stanowi starter do syntezy komplementarnej nici w komórce dawcy wg
modelu RC.
Plazmid koniugacyjny (Tra+) - plazmid zawierający w obrębie swojej cząsteczki zespół
genów warunkujących kompletny proces koniugacji. Duże rozmiary (kilkadziesiąt kb)
plazmidów koniugacyjnych utrudniają ich stosowanie jako wektorów.
11
Plazmid mobilizowalny (Tra- Mob+) – plazmid, który posiada w swojej cząsteczce geny
warunkujące jedynie metabolizm DNA. Aby możliwe było przekazanie DNA wymagana jest
obecność innego plazmidu koniugacyjnego tzw. plazmidu mobilizującego (syn. plazmid
pomocniczy; ang. helper).
Celem ćwiczenia jest wprowadzenie plazmidowego DNA do komórek dwóch
gatunków bakterii: E. coli (Gammaproteobacteria) i P. versutus (Alphaproteobacteria)
na drodze transformacji chemicznej i elektroporacji oraz koniugacji. Na podstawie
wyników ćwiczenia studenci określą zakres gospodarzy wprowadzanych plazmidów.
Część praktyczna:
Szczepy i plazmidy wykorzystywane na zajęciach:
E. coli TG1 - F’ [traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15] supE44 hsdΔ5 Δ(lac- proAB
P. versutus UW225 - RifR
A. Transformacja metodą rubidowo-wapniową (Kushner, 1978)
1. Nocną hodowlę E. coli odmłodzono a następnie inkubowano z wytrząsaniem w temp.
37 oC do osiągnięcia logarytmicznej fazy wzrostu (ok. 1,5 godz.).
2. 1,5 ml hodowli odwirować w probówce Eppendorfa w 4 oC, 12 tys. obr./min, 10 min
3. Usunąć podłoże i ponownie dodać 1,5 ml hodowli do probówki i odwirować j.w.
4. Usunąć dokładnie supernatant, osad bakterii zawiesić w 1 ml Roztworu I, a następnie
odwirować j.w.
5. Usunąć dokładnie supernatant, a uzyskany osad zawiesić w 0,2 ml Roztworu II.
6. Zawieszone bakterie inkubować 10-15 min. w lodzie.
7. Dodać 3 μl DNA plazmidowego (pTAV320/202, pABW3Ec, pABW3Pv lub pBGS18) i
(UWAGA) mieszaninę ligacyjną z ćwiczeń 3 do E. coli S17-1 kontynuować
inkubację w lodzie przez kolejne 10-15 min.
8. Inkubować mieszaninę bakterii przez 50 sekund w temp. 43 oC (szok termiczny).
9. Szybko dodać 1 ml podłoża LB i inkubować przez ok. 30 min w temperaturze 37 oC
bez wytrząsania.
10. Mieszaninę komórek zagęścić przez wirowanie - uzyskany osad zawiesić w 100 μl LB
i wysiać całość na szalki z podłożem selekcyjnym LA+Km.
11. Inkubować 24 godz. w 37 oC (E. coli) bądź 48 godz. w temp 30 oC (P. versutus).
Roztwór I
10 mM MOPS pH 7,0
10 mM RbCl
Roztwór II
100 mM MOPS pH 6,5
50 mMCaCl2
10 mM RbCl
12
B. Elektroporacja
1. Odpowiednio przygotowaną do elektroporacji porcję komórek wyjąć z zamrożenia
(- 70 oC) i umieścić na 30 min w lodzie.
2. Do porcji komórek (40 μl) dodać 2 μl DNA (pTAV320/202, pABW3Ec, pABW3Pv lub
pBGS18) i kontynuować inkubacje przez kolejne 10 min.
3. Mieszaninę przenieść do schłodzonej kuwety do elektroporacji (szczelina 2 mm),
umieścić kuwetę w saneczkach Bio-Rad Gene Pulser , i przepuścić impuls
elektryczny – 2,5 kV, 25 μF (E. coli - 200Ω, P. versutus - 400Ω).
4. Po elektroporacji mieszaninę komórek zawiesić w 1 ml świeżego LB i przenieść do
nowej probówki Eppendorfa.
5. Zawiesinę bakterii inkubować w 30 oC w przypadku, P. versutus, lub 37 oC, w
przypadku E. coli, przez 1 godz. bez wytrząsania.
6. Hodowlę zagęścić przez wirowanie, zawiesić w 100 μl LB i wysiać na szalki z
podłożem selekcyjnym LA+Km.
7. Inkubować w 30 oC lub 37 oC przez 24-48 godz.
C. Koniugacja trójrodzicielska
Biorca: P. versutus UW225; Dawca: E. coli TG1 z plazmidem pABW3 (Kmr)
Szczep z plazmidem pomocniczym: E. coli z plazmidem pRK2013 (Kmr)
1. Odwirować 1,5 ml nocnej hodowli P. versutus UW225, E. coli TG1 (pABW3) oraz E.
coli TG1 (pRK2013).
2. Zebrać supernatant, a uzyskany osad zawiesić w 1,5 ml RF i odwirować 5 min 12 tys.
obr./min.
3. Zebrać supernatant, a osad zawiesić w 1,5 ml roztworu fizjologicznego (RF).
4. Zmieszać zawiesiny bakteryjne trzech szczepów w stosunku 1:1:2 (dawca:szczep
pomocniczy:biorca), po czym wysiać 100 μl mieszaniny na szalkę z podłożem LA.
5. Inkubować w 30 oC przez 24 godz.
UWAGA: Studenci otrzymują szalkę LB z murawką zmieszanych szczepów dawcy,
biorcy i szczepu pomocniczego i wykonują eksperyment od punktu 7.
6. Na płytkę z murawką bakteryjna nanieść 2 ml RF i zmyć warstwę bakterii za pomocą
głaszczki.
7. Zawiesinę komórek przenieść do probówki Eppendorfa.
8. Kolejne rozcieńczenia (100, 10-1, 10-2 i 10-3) wysiać na szalkę z LB+Rif+Km
9. Inkubować 48 godz. w 30 oC.
Na zajęciach nr 5 - Podsumowanie wyników transformacji, elektroporacji i koniugacji.
13
CZĘŚĆ II
MOLEKULARNA CHARAKTERYSTYKA SYSTEMÓW
KODUJĄCYCH TOKSYNĘ I ANTYTOKSYNĘ
14
Ćwiczenie nr 5
Analiza organizacji genetycznej systemu addykcyjnego - izolacja
RNA do RT-PCR
Systemy addykcyjne, nazywane również systemami trucizna-antidotum (TA), kodowane są
zwykle na plazmidach niskokopiowych. Niekiedy plazmid koduje jednocześnie kilka
systemów tego typu, np. plazmidy F i R1. Najczęściej są to układy dwugenowe, w których
gen kodujący antidotum jest zlokalizowany przed genem trucizny.
Wszystkie dotychczas poznane systemy trucizna-antidotum mają podobny mechanizm
działania. Na plazmidzie kodowana jest zarówno trucizna jak i antidotum, które łączą się
dając nieaktywny kompleks. Jeżeli po podziale powstanie komórka bezplazmidowa to jest
ona eliminowana z populacji na drodze posegregacyjnego zabijania (ang. postsegregational
cell killing). Jest to możliwe ponieważ wraz z „odziedziczoną” cytoplazmą trafiają do komórek
potomnych oba produkty systemu, a białko trucizny jest o wiele bardziej stabilne niż
antidotum. Brak konstytutywnej produkcji antidotum w komórce bezplazmidowej powoduje,
że trucizna może oddziaływać na specyficzny cel komórkowy, co ostateczne prowadzi do
efektu bakteriostatycznego lub bakteriobójczego.
Celem niniejszych zajęć jest izolacja RNA do RT-PCR, który wykaże czy geny
tworzące badany system addykcyjny są zorganizowane w operon.
Część praktyczna:
IZOLACJA I ELEKTROFOREZA RNA
A. Izolacja RNA
1. Osad z 4,5 ml hodowli nocnej E. coli DH5α (pBGS-SXT) zawiesić w 1 ml TRIzolu i
inkubować przez 5 min w temp. pokojowej.
2. Dodać 0,2 ml chloroformu i dokładnie wymieszać.
3. Po 15-minutowej inkubacji w temp. pokojowej, próbki zwirować w mikrowirówce przez
15 min w temp. 4°C przy 12000 obr./min.
4.
Do zebranego supernatantu dodać 0,5 ml izopropanolu i wymieszać.
5.
Po 10-minutowej inkubacji w temp. pokojowej próbę ponownie zwirować (8 min,
12000 obr./min, 4°C).
6. Osad RNA przemyć 75 % etanolem, zwirować (5 min, 12000 obr./min, 4°C),
wysuszyć i zawiesić w 50 μl H2O zawierającej pirowęglan dietylu (DEPC)
7. Próby inkubować przez 10 min w temp. 55-60°C.
B. Przygotowanie żelu agarozowego z 2,2 M formaldehydem
1. 1,5 g agarozy rozpuścić w 75 ml wody zawierającej DEPC, w temp. 100°C.
2. Po jej schłodzeniu do temp. ok. 55°C dodać 10 ml stężonego buforu do elektroforezy
RNA (10 x MOPS) oraz 9 ml formaldehydu.
15
3. Po wylaniu, żel pozostawić na 1 godz. w temp. pokojowej, a następnie przeprowadzić
5-minutową elektroforezę wstępną w buforze do elektroforezy RNA (1 x MOPS), przy
napięciu 5 V/cm.
C. Przygotowanie próbek RNA do elektroforezy
Próbki przygotować przez zmieszanie:
(a) 2 µl RNA,
(b) 2 µl stężonego buforu do elektroforezy RNA (10 x MOPS),
(c) 4 µl formaldehydu,
(d) 10 µl formamidu,
(e) 1 µl bromku etydyny.
Próbki inkubować 60 min w temp. 55°C. Po schłodzeniu próbki zwirować (3 min,
12000 obr./min, 4°C), a następnie dodać 2 µl buforu obciążającego. Na żel nanieść po 10 μl
preparatu.
D. Elektroforeza RNA
Elektroforezę RNA prowadzić w 1,5 % żelu agarozowym z 2,2 M formaldehydem, w buforze
z 1 x MOPS, przy napięciu 5 V/cm, przez 2 godz. w temp. pokojowej. Po rozdziale
elektroforetycznym RNA analizować w świetle UV o długości fali 300 nm.
Szczep i plazmid wykorzystywane na zajęciach:
RNA będzie izolowany ze szczepu E. coli TG1 niosącego plazmid pBGS-SXT (plazmid
pBGS18 z wklonowanym w miejsce SmaI modułem addykcyjnym pochodzącym z
transpozonu koniugacyjnego SXT).
Rys. 2. Mapa genetyczna plazmidu pBGS18-SXT.
16
Ćwiczenie nr 6
Analiza organizacji genetycznej systemu addykcyjnego – RT-PCR
Wszystkie scharakteryzowane dotychczas moduły addykcyjne tworzą dwu lub trzy genowe
operony. Wykazano, że system addykcyjny z transpozonu koniugacyjnego SXT koduje dwa
geny i niesie dwa promotory (P1 i P2). Nie można jednak wykluczyć, iż geny te tworzą
operon, natomiast obecność dodatkowego wewnętrznego promotora P2, położonego przed
genem antidotum, jest konieczna aby zapewnić zbalansowane ilości białek badanego
systemu. W celu zbadania czy oba geny są kodowane na policistronowym mRNA nalęży
przeprowadzić syntezę cDNA na matrycy mRNA, aby następnie wykonać PCR z
wykorzystaniem odpowiednio zaprojektowanych par starterów.
Rys. 3. Schemat RT-PCR.
Celem niniejszych zajęć jest sprawdzenie czy geny tworzące badany system
addykcyjny są zorganizowane w operon.
Część praktyczna:
A. Usuwanie DNA z próbek RNA poprzez trawienie DNazą pozbawioną RNaz
Próbki przygotowywano przez zmieszanie:
(a) 5 µl RNA,,
(b) 2 µl 10 x buforu do DNazy,
(c) 1 µl DNazy (1u/µl),
(d) 12 µl H2O zawierającej DEPC.
Mieszaninę inkubowano przez 45 min w temp. 37°C. Następnie reakcję zatrzymywano przez
dodanie 1 µl 25 mM EDTA i 15-minutową inkubację w 65°C. Próby schładzano w lodzie i
zamrażano w -70°C.
B. Synteza cDNA na matrycy RNA i usuwanie RNA (RT-PCR)
1. Próbki przygotowywać przez zmieszanie:
(a) 10 µl preparatu całkowitego RNA traktowanego DNazą,
(b) 4 µl startera GP1SXT2 (o stężeniu 1 pmol/µl),
(c) 1,5 μl H2O zawierającej DEPC.
2. Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 70°C, a następnie przez 1 min w temp. 4°C.
17
3. Po krótkim zwirowaniu dodać:
(d) 2,5 µl 10 x buforu PCR,
(e) 2,5 µl 25 mM MgCl2,
(f) 1 µl 10 mM mieszaniny dNTP,
(g) 2,5 µl 0,1 M DTT.
4. Po wymieszaniu i zwirowaniu próby inkubować (w termocyklerze) kolejno w: 70°C przez
2 min, 65°C przez 1 min, 60°C przez 1 min, 55°C przez 1 min, 50°C przez 1 min i 45°C przez
1 min.
5. Próby zworteksować, zwirować i dodać:
(h) 1 µl odwrotnej transkryptazy Super Script II RT.
6. Próby inkubować w następujących warunkach:
42°C przez 50 min,
5 x cykl 50°C – 1 min, 53°C – 1 min, 56°C – 1 min,
70°C przez 15 min.
37°C HOLD
7. Po schłodzeniu mieszaniny reakcyjnej do 37°C, do prób dodać:
(i) 1µl RNase Mix,
po czym inkubować w 37°C przez 30 min w celu strawienia RNazą utworzonych dupleksów
RNA:DNA i pozostałości całkowitego RNA. Następnie próby zwirowywać i inkubować w
lodzie.
C. Synteza drugiej nici DNA (PCR)
1. Próbki do syntezy drugiej nici DNA przygotować przez zmieszanie:
(a) 31,5 µl dejonizowanej H2O,
(b) 5 µl 10x buforu PCR,
(c) 3 µl 25 mM MgCl2,
(d) 1 µl 10 mM mieszaniny dNTP,
(e) 2 µl 10 µM startera LTSXT,
(f) 2 µl 10 µM startera RP2SXT lub 2RASXTER,
(g) 5 µl matrycy (RNA, cDNA lub DNA),
(h) 0,5 µl [5 u/µl] polimerazy Taq.
2. Następnie przeprowadzić reakcję PCR w następujących warunkach:
95°C przez 5 min,
95°C przez 30 sec,
58°C przez 30 sec (gradient +/- 1°C, para LTSXT/RP2SXT w
temp.57°C, para LTSXT/2RASXTER w temp. 58°C),
72°C przez 45 sec,
(etapy b-d powtórzyć w 20 cyklach)
72°C przez 10 min
4°C HOLD.
3. Przeprowadzić analizę elektroforetyczną produktów PCR w 2% żelu agarozowym.
18
Ćwiczenie nr 7
Oznaczanie aktywności promotorów systemów addykcyjnych (TA)
oraz badanie interakcji białek sytemów TA z wykorzystaniem
bakteryjnego układu dwuhybrydowego
Rys. 4. Schemat operonu laktozowego:
A) podczas indukcji,
B) podczas inhibicji.
19
Rys. 5. Bakteryjny układ dwuhybrydowy (Di Lallo i wsp., 2002).
Celem ćwiczenia jest określenie aktywności promotorów wyodrębnionych z różnych
systemów addykcyjnych typu tad-ata poprzez utworzenie fuzji z genami struktury
operonu laktozowego w odpowiednim do tego celu wektorze oraz zbadanie interakcji
białka toksyny i antytoksyny z wykorzystaniem bakteryjnego układu
dwuhybrydowego.
20
Część praktyczna:
Pkt.
1
2
Badanie aktywności promotorów
systemów
addykcyjnych.
Założyć hodowlę nocną szczepu E. coli
DH5Δlac niosącego plazmid pRS551 lub
zrekombinowany
plazmid
pRS551/promotor.
10 ml podłoża LB+odpowiedni antybiotyk
zaszczepić
odpowiednią
objętością
hodowli nocnej, tak aby przy długości fali
λ = 600 nm OD wynosiło około 0,05
Badanie interakcji białka toksyny i
antidotum systemu addykcyjnego.
Założyć hodowlę nocną szczepu E. coli R721
niosącego
odpowiednie
układy
dwuplazmidowe do badania interakcji białek.
10 ml podłoża LB + Ap(50 μg/ml) + Km (30
μg/ml) + IPTG (0,1 mM) zaszczepić
odpowiednią objętością hodowli nocnej, tak
aby przy długości fali λ = 600 nm OD wynosiło
około 0,05
3
Odmłodzone hodowle należy inkubować z wytrząsaniem w temp. 37 οC przez około 2
godz., aż do osiągnięcia OD = 0,28 - 0,7 przy długości fali λ = 600 nm.
4
Następnie hodowle należy wstawić do lodu na 10 min. i powtórnie zmierzyć absorbancję
przy długości fali λ = 600 nm.
5
Do probówki o pojemności 2 ml należy dodać kolejno:
hodowlę
100 μl
chloroform
100 μl
bufor Z
900 μl
SDS 0,1 %
50 μl
----------------------------------RAZEM
1150 μl
6
Mieszaninę należy zworteksować przez około 10 sec.
7
Następnie mieszaninę należy inkubować przez 5 min. w temp. 28 οC, po czym należy
dodać 200 μl ONPG (4
mg/ml). Po dodaniu ONPG należy rozpocząć pomiar czasu.
8
Mieszaninę należy dalej inkubować w temp. 28 οC aż do pojawienia się żółtego koloru.
9
Po zażółceniu mieszaniny reakcyjnej należy zatrzymać reakcję poprzez dodanie 0,5 ml 1
M Na2CO3. Po
zatrzymaniu reakcji należy zakończyć pomiar czasu.
10
Próby zwirować przez około 15 sec.
11
Przeprowadzić pomiar OD przy długości fali λ = 550 nm i 420 nm.
12
Obliczyć siłę promotora korzystając ze wzoru:
1000 x (A420 - 1,75 x A550)
T x V x A600
gdzie: T – czas w minutach; V – objętość hodowli użyta do oznaczenia (0,1 ml).
21
Szczep i plazmid wykorzystywane na zajęciach:
E. coli DH5Δlac - deoR thi1 relA1 supE44 endA1 gyrA96 recA1 hsdR17Δ (argF,lac)U169
NalR
Rys. 6. Mapa genetyczna plazmidu pRS551.
22
Ćwiczenie nr 8
Badanie efektu toksycznego wywołanego przez trucizny różnych
systemów addykcyjnych oraz zdolności antidotum do jego
odwracania
Rys. 7. Schemat organizacji genetycznej i regulacji ekspresji operonu araBAD E. coli.
(A) Trzy geny strukturalne araA, araB i araD są transkrybowane z promotora PBAD i kodują
odpowiednio: kinazę L-rybulozy, izomerazę L-arabinozy i epimerazę L-rybulozo-5fosforanu. Powyżej promotora znajduję się region I z którym wiąże się AraC aktywując
transkrypcję w obecności arabinozy oraz miejsce wiązania białka receptorowego CRP.
Ponadto wyróżniono dwa operatory O1 i O2, z którymi wiąże się białko AraC hamując
transkrypcję. Gen araC kodujący białko aktywatora jest transkrybowany z promotora Pc,
który jest ułożony rozbieżnie w stosunku do PBAD.
(B) Mechanizm działania AraC przy braku i
(C) w obecności arabinozy (wg Schleif, 2000, zmodyfikowane).
Celem ćwiczenia jest zbadanie efektu toksycznego wywołanego przez indukowaną
obecnością arabinozy nadprodukcję białka toksyny kodowanego przez system
addykcyjny oraz zdolności antidotum do odwrócenia ewentualnego efektu
toksycznego.
Część praktyczna:
1. Założyć hodowlę nocną szczepu E. coli MC1000 niosącego zrekombinowany plazmid
pCF430/toksyna
ewentualnie
układ
dwuplazmidowy
pCF430/toksyna
+pNDM220/antidotum.
2. 40 ml świeżego podłoża LB+Tc(+Ap) zaszczepić odpowiednią objętością hodowli
nocnej, tak aby przy długości fali λ = 600 nm OD wynosiło 0,07.
23
3. Odmłodzoną hodowlę należy inkubować z wytrząsaniem w temp. 37 οC przez 40 min,
a następnie zmierzyć absorbancję przy długości fali λ = 600 nm.
4. Do całości hodowli dodać 400 μl arabinozy.
5. Po 40 min zmierzyć absorbancję przy długości fali λ = 600 nm Następnie należy
rozdzielić hodowlę na połowy (po 20 ml), dodać do jednej hodowli 100 μl IPTG i
kontynuować inkubację z wytrząsaniem w temp. 37 οC.
6. Przez następne 2 godz., co 40 min., należy pobierać próby i mierzyć absorbancję
przy długości fali λ = 600 nm.
Po zakończeniu eksperymentu należy wyznaczyć krzywą zmian OD w czasie.
Szczep i plazmidy wykorzystywane na zajęciach:
E. coli MC1000 - F- araD139 delta(ara, leu)7697 delta(lac)chi74 galU- galK- rpsL
Rys. 8. Plazmidy wykorzystane do badania wpływu toksyny na komórki bakteryjne
oraz odwrócenia efektu toksycznego w obecności antidotum.
24
CZĘŚĆ III
IDENTYFIKACJA I ANALIZA FUNKCJONALNYCH
ELEMENTÓW TRANSPOZYCYJNYCH
25
Ćwiczenie nr 9
Identyfikacja elementów
wektorów pułapkowych
transpozycyjnych
z
wykorzystaniem
Elementy transpozycyjne (TE; ang. transposable elements) są najliczniejszą grupą
elementów genetycznych występujących w formie zintegrowanej z genomem. TE to
segmenty DNA zdolne do przemieszczania się z jednego miejsca genomu w inne (w obrębie
jednego lub między różnymi replikonami) w wyniku transpozycji. Ze względu na stopień
złożoności struktury genetycznej, TE dzielimy na: (i) sekwencje insercyjne (IS – ang. insertion
sequence) oraz (ii) transpozony (Tn). Sekwencje insercyjne są najprostszymi elementami
transpozycyjnymi kodującymi jedynie informację genetyczną niezbędną do własnej
transpozycji. Transpozony są bardziej rozbudowanymi strukturami, które dodatkowo mogą
kodować geny wpływające na fenotyp gospodarza.
Do identyfikacji funkcjonalnych TE skonstruowano specjalne narzędzia, wektory
pułapkowe, które umożliwiają nie tylko identyfikację elementów transpozycyjnych in vivo, ale
również potwierdzają ich aktywność transpozycyjną. Wektory pułapkowe są plazmidami
wahadłowymi, zawierającymi kasety selekcyjne umożliwiające obserwację zajścia zdarzenia
transpozycyjnego w ich obrębie.
Rys. 9. Wektor pułapkowy pEBB10. (A) Organizacja genetyczna. Zaznaczono
poszczególne elementy strukturalne plazmidu: rep – system replikacyjny pBBR1; mob –
system mobilizacyjny; Tcr – kaseta oporności na tetracyklinę. Kolorem zielonym wyróżniono
kasetę selekcyjną sacB; (B) Zasada działania kasety sacB.
Wektor pEBB10 (Rys. 9) niesie gen sacB, który pierwotnie pochodzi z Bacillus
subtilis. Wektor ten powstał na bazie mobilizowalnego plazmidu pBBR1MCS-3 (Tcr) o
szerokim zakresie gospodarza, w którym sklonowano kasetę sacB wyodrębnioną z plazmidu
pDS132. Produkt genu sacB w obecności w podłożu sacharozy powoduje rozkład tego cukru
do toksycznych dla komórki bakteryjnej lewanów (Rys. 9B). Wzrost komórek na podłożu z
26
sacharozą możliwy jest tylko w przypadku inaktywacji genu sacB. Inaktywacja genu sacB
może być spowodowana zdarzeniem transpozycyjnym (insercją elementu transpozycyjnego),
ale również mutacjami punktowymi lub delecjami w obrębie genu. Mutacje takie powodują
pojawienie się mutantów sacB, w których plazmidy pułapkowe nie będą niosły insertu.
Niewątpliwie korzystną cechą kasety jest możliwość „wychwytywania” przypadkowych TE,
bez względu na ich potencjalny fenotyp i właściwości.
I. Identyfikacja elementów transpozycyjnych w szczepie Paracoccus
aminophilus JCM7686R z wykorzystaniem wektora pułapkowego pEBB10.
A. Identyfikacja elementów transpozycyjnych:
1. Wektor pEBB10 wprowadzono drogą koniugacji trójrodzicielskiej do szczepu
Paracoccus aminophilus JCM7686R (Rifr). Mieszaninę konigacyjną wysiano na podłoże
selekcyjne (LA + tetracyklina 1μg/ml). Obecność plazmidów w transkoniugantach
potwierdzano za pomocą analizy elektroforetycznej.
2. Wysiej odpowiednie rozcieńczenia nocnych hodowli Paracoccus aminophilus
JCM7686R z wprowadzonym wektorem pułapkowym pEBB10 na wcześniej wylane
podłoża selekcyjne. Rozcieńczenia (w LB) przygotowuje 1 grupa. Inkubacja szalek w
30oC, 48 godzin.
Podłoże
selekcyjne
Wysiewane rozcieńczenia hodowli nocnej
10-4
KONTROLA
LA + Tc (1μg/ml)
SELEKCJA
LA + Tc (1μg/ml)
+ sacharoza 10%
100
10-1
10-2
10-5
10-6
10-7
10-3
3. W celu określenia częstości transpozycji policz kolonie uzyskane po inkubacji szalek i
uzupełnij powyższą tabelę.
4. Do dalszej analizy z klonów wyrosłych na podłożu selekcyjnym (LA + Tc 1μg/ml)
wybrano losowo 50, które przesiano na szalki z odpowiednim podłożem.
5. Założono nocne hodowle wybranych klonów.
6. Wyizoluj plazmidowy DNA z dwóch wybranych klonów za pomocą minilizy alkalicznej
(przepis – Ćwiczenia 2). Otrzymasz zwirowane osady bakterii z 1,5 ml hodowli nocnej.
Jedna grupa izoluje DNA z kontroli - Paracoccus aminophilus JCM7686R z
wprowadzonym pEBB10 z podłoża kontrolnego LA + Tc 1μg/ml.
7. Analiza elektroforetyczna wyizolowanego DNA w 0,8% żelu agarozowym
zastosowaniem kontroli w postaci pustego wektora pułapkowego pEBB10.
z
27
B. Lokalizacja miejsca integracji elementów transpozycyjnych w kasecie selekcyjnej sacB.
Rys. 10. Kaseta selekcyjna sacB i zaplanowane do niej komplementarne pary
starterów. Strzałki poziome oznaczają pary starterów umożliwiające określenie lokalizacji
insertu (elementu transpozycyjnego) w obrębie kasety selekcyjnej.
1. Amplifikacja DNA w reakcji PCR (wg Sambrook i Russel, 2001)
1 reakcja
H2O
Bufor
x10
MgSo4
Bufor Q
(glicerol)
dNTP
10mM
Matryca
(miniliza)
Startery
12,9 μl
2,5 μl
2,5 μl
5 μl
0,5 μl
0,5 μl
0,5 μl
Polimeraza
DNA
Taq
25 μl
0,1 μl
2. Określenie wielkości otrzymanych produktów PCR w 0,8% żelu agarozowym.
D. Sekwencjonowanie DNA wybranych elementów transpozycyjnych.
28
Ćwiczenia nr 10 i 11
Identyfikacja elementów transpozycyjnych
wektorów pułapkowych cd
z
wykorzystaniem
II. Określenie liczby kopii zidentyfikowanego TE i jego lokalizacja w genomie
Paracoccus aminophilus JCM7686R
W celu określenia liczby kopii zidentyfikowanego elementu transpozycyjnego, całkowity DNA
Paracoccus aminophilus JCM7686R strawiono enzymem BamHI, który trawi w obrębie
analizowanego TE. Produkty trawienia należy rozdzielić na 0,8% żelu, a następnie
przetransferować na membranę nylonową i dokonać analizy hybrydyzacyjnej z
wykorzystaniem sondy zamplifikowanej w reakcji PCR, która stanowi wyznakowany
dioksygeniną (DIG) fragment DNA zawierający analizowany TE (wg skryptu).
III. Rozpowszechnienie zidentyfikowanego TE w wybranych szczepach z
rodzaju Paracoccus
Rozpowszechnienie analizowanego TE zostanie zbadane w wybranych szczepach z rodzaju
Paracoccus poprzez analizę hybrydyzacyjną z wykorzystaniem metody Dot-Blot. Użyta
sonda będzie zamplifikowanym w reakcji PCR fragmentem DNA zawierającym analizowany
TE i wyznakowanym DIG. Należy dokonać transferu odpowiednio przygotowanego
całkowitego DNA wybranych szczepów Paracoccus na membranę nylonową metodoą DotBlot (wg skryptu).
analizowany
szczep
sygnał (+)/
brak
sygnału (-)
P.
aminophilus
P.
aestuarii
P.
haeundaensis
P.
halophilus
P.
koreensis
P.
marcusii
P.
pantotrophus
Izolacja całkowitego DNA (Chen i Kuo, 1993)
Bufor lizujący TESO:
– 40 mM Tris, pH 8,0
– 20 mM octan sodu
– 1 mM EDTA
– 1% SDS
Roztwór NaCl
5M NaCl
1.
Odwiruj cztery porcje po 1,5 ml hodowli nocnej wybranego szczepu Paracoccus sp.
(3 min, 12 tys. rpm).
2.
Otrzymany osad zawieś w 200 μl buforu lizującego TESO przez silne pipetowanie.
3.
Dodaj 66 μl 5M NaCl.
4.
Dokładnie zworteksuj (~ 1 min).
29
5.
Zwiruj (4 ºC, 10 min, 12 tys. rpm).
6.
Zbierz supernatant (z dwóch porcji do jednego eppendorfa, powinno być w każdej
probówce ~ 450 μl lizatu).
7.
Dodaj równą objętość mieszaniny fenol:chloroform (1:1).
8.
Zworteksuj (~ 1 min).
9.
Zwiruj (5 min, 12 tys. rpm).
10. Zbierz fazę wodną (górną) do nowego eppendorfa i dodaj równą objętość
chloroformu.
11. Zworteksuj (~1 min).
12. Zwiruj (5 min, 12 tys. rpm).
13. Do zebranego supernatantu (faza górna) dodaj 0,1 objętości roztworu III do minilizy i
2 objętości EtOH 96%.
14. Wytrącaj DNA (30 min, -20 ºC).
15. Odwiruj wytrącony DNA (4 ºC, 20 min, 14 tys. rpm).
16. Zlej supernatant i dwukrotnie przemyj osad EtOH 70% (70 μl).
17. Dokładnie usuń supernatant (tak aby alkohol nie pozostawał na ściankach). Wysusz
osad przez wstawienie otwartych probówek do termostatu na 37ºC.
18. Po wysuszeniu osad zawieś w 75 μl buforu TE (pH 8,0).
Hybrydyzacja DNA-DNA i immunodetekcja wyznakowanego DNA (wg Sambrook
i Russel, 2001, zmodyfikowana).
TRANSFER CIŚNIENIOWY DNA NA MEMBRANĘ NYLONOWĄ
1)
Żel do transferu dokładnie odpłukać w destylowanej wodzie.
2)
Wyciąć membranę nylonową, o powierzchni nieco większej niż żel. Przygotować 2
bibuły Watmann tej samej wielkości co membrana. Pracować w rękawiczkach.
Membrany nie należy wyjmować z papieru ochronnego.
3)
Na płycie aparatu do transferu ułożyć 2 warstwy bibuły Watmann 3MM nawilżone w
wodzie. Usunąć pęcherzyki powietrza.
4)
Na bibułach ułożyć zwilżoną wodą membranę (usunąć papierki osłonowe).
5)
Tak przygotowaną membranę przykryć plastikową maskownicą.
6)
Na membranie jednym ruchem ułożyć żel, tak aby wszystkie „ścieżki” zmieściły się w
otworze maskownicy i mogły ulec transferowi na membranę.
30
7)
Dokręcić pokrywę aparatu do transferu i podłączyć pompę.
8)
Powierzchnię żelu zalać buforem do depurynacji.
9)
Prowadzić transfer przez 20 min.
10) Zebrać bufor do depurynacji. Powierzchnię żelu zalać buforem elucyjnym.
11) Prowadzić transfer 40 min.
12) Po zakończonym transferze zebrać roztwór elucyjny, wyłączyć pompę, zdjąć żel
maskownicę.
13) Membranę z DNA przełożyć na czysty kawałek bibuły Watmann 3 MM i wysuszyć w
temperaturze pokojowej.
BUFORY DO TRANSFERU CIŚNIENIOWEGO
Roztwór do depurynacji
Stężenie
końcowe
0,25 N HCl
Przygotowanie 50 ml
12 N HCl
1,04 ml
Dopełnić wodą do 50 ml.
Roztwór elucyjny (do transferu)
Stężenie
końcowe
0,4 M NaOH
0,6 M NaCl
Przygotowanie 500 ml
2 M NaOH
5 M NaCl
100 ml
60 ml
Dopełnić wodą do 500 ml.
HYBRYDYZACJA
Przygotowanie sondy DNA
1) 1μg DNA zawiesić w 16μl H2O (może być to DNA wyizolowane „kitem” zawieszone w
H2O).
2) DNA denaturować 10 min w 96 oC.
3) Schłodzić w lodzie.
4) Dodać 4 μl mieszaniny DIG High Prime.
5) Inkubować 12 h w 37 oC.
Tak przygotowaną sondę można przechowywać w -20 oC.
31
UWAGA: przed dodaniem
denaturować, jak w p. 2.
sondy
do
roztworu
hybrydyzacyjnego
należy
ją
Prehybrydyzacja i hybrydyzacja
1) Membranę nylonową „zapiec” w świetle UV - z obu stron po 3 min.
2) Membranę włożyć do butelki do hybrydyzacji (stroną z DNA skierowaną do wnętrza
butelki).
3) Dodać roztwór prehybrydyzacyjny (usunąć pęcherzyki powietrza pojawiające się
między powierzchnią szkła i membrany).
4) Tak przygotowaną butelkę z membraną umieścić w piecu hybrydyzacyjnym na 2-24
godz w 68 oC.
5) Po zakończeniu etapu prehybrydyzacji, zlać roztwór prehybrydyzacyjny.
UWAGA: do roztworu hybrydyzacyjnego należy dodać zdenturowaną sondę.
6) Dodać roztwór hybrydyzacyjny, podobnie jak w poprzednim wypadku, starać się
uniknąć utworzenia pęcherzyków powietrza.
7) Tak przygotowaną butelkę z membraną umieścić w piecu hybrydyzacyjnym na 2-24
godz w 68 oC.
Wizualizacja
1) Usunąć roztwór hybrydyzacyjny z butelki. Wyjąć membranę i przełożyć do czystego
pojemnika i umieścić na kołysce laboratoryjnej.
2) Membranę płukać 2 razy przez 5 min w 250 ml roztworu A (2xSSC, 0,1% SDS).
3) Membranę płukać 2 razy przez 15 min w temperaturze 68 oC w roztworze B (0,1xSSC,
0,1% SDS) ogrzanym do temperatury 68 oC.
Immunodetekcja
4) Membranę przemyć (płukanie ok. 1 min) w buforze do przemywań.
5) Membranę zablokować poprzez płukanie przez 30 min 100 ml buforu B2.
6) Przeciwciała rozcieńczyć w buforze B2 w stosunku 1:5000 (20 ml B2 + 4 μl
przeciwciał).
7) Zlać bufor B2, membranę inkubować przez 30 min w roztworze przeciwciał.
8) Membranę przemyć 2 razy płucząc przez 15 min w buforze B1. Na tym etapie są
usuwane niezwiązane przeciwciała.
9) Przygotować roztwór wywołujący 10 ml B3 + 200 μl NBT/BCIP.
32
10) Zlać B1, zdjąć pojemnik z membraną z bujawki. Inkubować membranę w roztworze
wywołującym, w ciemności, nie mieszając. Czas inkubacji może wynosić od 1 min
do 16 godz.
11) Wywoływanie zatrzymać poprzez przełożenie membrany do buforu TE.
BUFORY DO HYBRYDYZACJI
Bufor prehybrydyzacyjny
Stężenie
końcowe
5xSSC
1% BSS
0,1% sarkozyl
0,02% SDS
-------
Przygotowanie
20xSSC
10% BSS
10% sarkozyl
10% SDS
dH2O
5,5 ml
2,2 ml
215 μl
44 μl
13,8 ml
Bufor hybrydyzacyjny
Stężenie
końcowe
5xSSC
1% BSS
0,1% sarkozyl
0,02% SDS
-------
Przygotowanie
20xSSC
10% BSS
10% sarkozyl
10% SDS
dH2O
1 ml
400 μl
40 μl
8 μl
2,6 ml
Roztwór A
Stężenie
końcowe
2xSSC
0,1% SDS
Przygotowanie 500 ml
20xSSC
10% SDS
50 ml
5 ml
Dopełnić wodą do 500 ml.
Roztwór B
Stężenie
końcowe
0,1xSSC
0,1% SDS
Przygotowanie 500 ml
20xSSC
10% SDS
2,5 ml
5 ml
Dopełnić wodą do 500 ml.
33
Bufor B1
Stężenie
końcowe
0,1 M kwas
maleinowy
0,15 M NaCl
Przygotowanie 5000 ml
kwas maleinowy
58 g
NaCl
43,58 g
Dopełnić wodą do 4500 ml, ustawić pH 7,5 za pomocą NaOH. Uzupełnić wodą do 5000 ml.
BSS (Blocking Stock Solution) 10%
10g BSS rozpuścić w 100 ml B1
Bufor B2
Stężenie
końcowe
1 % BSS
B1
Przygotowanie 300 ml
10% BSS
B1
30 ml
270 ml
Bufor B3
Stężenie
końcowe
100 mM Tris HCl
100 mM NaCl
50 mM MgCl2
Przygotowanie 500 ml
1 M Tris HCl pH 9,5
2,5 M NaCl
1 M MgCl2
20 ml
8 ml
10 ml
Dopełnić wodą do 500 ml.
Bufor TE
Stężenie
końcowe
10 mM Tris HCl
1 mM EDTA
Przygotowanie 100 ml
1 M Tris HCl pH 8
0,5 M EDTA pH 8l
1 ml
0,2 ml
Dopełnić wodą do 100 ml.
Bufor do przemywań
0,3 g Tween 20 rozpuścić w 100 ml roztworu B1
34
Hybrydyzacja DNA-DNA techniką „DOT-BLOT”
Przygotowanie membrany
Do 100 μl preparatu całkowitego DNA ze szczepu Paracoccus sp. dodaj 1/10 objętości 3M
NaOH. Próby inkubuj w 65 oC przez 30 minut w termobloku. Następnie schłodź je w lodzie i
dodaj 1 objętość 2M octanu amonu. Tak przygotowane próby nanieś na wcześniej wyciętą
membranę nylonową (9 x 12 cm) nasączoną 6xSSC przy użyciu aparatu dot-blot.
Przygotowaną w ten sposób membranę hybrydyzuj z wcześniej przygotowaną sondą
wyznakowaną dioksygeniną.
A
B
Rys. 11. A. Aparat do transferu dot blot firmy Bio-Rad. B. Przygotowanie do transferu –
układ składania poszczególnych części aparatu (wg. Bio-Dot microfiltration apparatus;
Instruction Maual; Bio-Rad).
35
Bibliografia:
Birnboim, H. C., and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombination plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513-1519.
Chen, W., and Y. Kuo. 1993. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative
bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Res. 21:2260
Di Lallo G., P. Ghelardini i L. Paolozzi. 2002. Two hybrid assay in Escherichia coli K12. W:
M. Blot (wyd), Procaryotic Genomics. Birkhauser Verlag, Berlin.
Kushner, S. R. 1978. An improved method for transformation of E. coli with ColE1 derived
plasmids. W: H. B. Boyer, i S. Nicosia (wyd.), Genetic engineering. Elsevier/North-Holland,
Amsterdam.
Sambrook, J., and D. W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
36