Enzymy użyteczne w analizie restrykcyjnej DNA. Podział na grupy.
advertisement
RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY INTRODUCTION • Recombinant DNA technology is the use of in vitro molecular techniques to isolate and manipulate fragments of DNA • In the early 1970s, researchers at Stanford University were able to construct chimeric molecules called recombinant DNA molecules – Shortly thereafter, it became possible to introduce such molecules into living cells – This achievement ushered in the era of gene cloning • Recombinant DNA technology and gene cloning have been fundamental to our understanding of gene structure and function GENE CLONING • The term gene cloning refers to the phenomenon of isolating and making many copies of a gene • The laboratory methods that are necessary to clone a gene were devised during the early 1970s – Since then, many technical advances have enabled gene cloning to become a widely used procedure in science Cloning Experiments Involve Chromosomal and Vector DNA • Cloning experiments usually involve two kinds of DNA molecules – Chromosomal DNA • Serves as the source of the DNA segment of interest – Vector DNA • Serves as the carrier of the DNA segment that is to be cloned – To prepare chromosomal DNA, the scientist has to • Obtain cellular tissue from the organism of interest • Break open the cells • Extract and purify DNA using a variety of biochemical techniques • The cell that harbors the vector is called the host cell – When a vector is replicated inside a host cell, the DNA that it carries is also replicated • The vectors commonly used in gene cloning were originally derived from two natural sources – 1. Plasmids – 2. Viruses – Commercially available plasmids have selectable markers • Typically, genes conferring antibiotic resistance to the host cell Cloning Experiments Involve Enzymes that Cut and Paste DNA • Insertion of chromosomal DNA into a vector requires the cutting and pasting of DNA fragments • The enzymes used to cut DNA are known as restriction endonucleases or restriction enzymes – These bind to specific DNA sequences and then cleave the DNA at two defined locations, one on each strand Figure 18.1 18-9 • Restriction enzymes were discovered in the 1960s and 1970s by Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans • Restriction enzymes are made naturally by many species of bacteria – They protect bacterial cells from invasion by foreign DNA, particularly that of bacteriophage • Currently, several hundred different restriction enzymes are available commercially Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-10 Restriction/Methylation Enzyme Eco RI Restriction Enzyme Single stranded “nick” • First restriction enzyme from Escherichia coli, so Eco R1 • Restriction enzymes bind to specific DNA sequences – These are typically palindromic • The sequence is identical when read in the opposite direction in the complementary strand • For example, the EcoRI recognition sequence is 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ • Some restriction enzymes digest DNA into fragments with “sticky ends” – These DNA fragments will hydrogen bond to each other due to their complementary sequences • Other restriction enzymes generate blunt ends – The enzyme NaeI This interaction is not stable because it involves only a few hydrogen bonds To establish a permanent connection, the sugar-phosphate backbones of the two DNA fragments must be covalently linked Add DNA ligase which covalently links the DNA backbones A recombinant DNA molecule ENZYMY RESTRYKCYJNE • Restryktazy (inaczej enzymy restrykcyjne, endonukleazy restrykcyjne) - to enzymy izolowane z bakterii, zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA (z reguły są to sekwencje palindromowe) i do przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA w ściśle określonym miejscu, w obrębie lub okolicy sekwencji rozpoznawanej. • Otrzymywane fragmenty DNA nie są losowe a w każdym prążku na żelu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. ENZYMY RESTRYKCYJNE • Z reguły różne enzymy rozpoznają odmienne sekwencje DNA. • Istnieją jednak wyjątki - tzw. izoschizomery - enzymy izolowane z różnych organizmów, ale rozpoznające te same sekwencje. • • Zdarza się także, że dwa enzymy wytwarzają takie same lepkie końce, mimo rozpoznawania różnych sekwencji DNA. Umożliwia to klonowanie DNA strawionego jednym enzymem w wektorze strawionym innym, dającym takie same lepkie końce. ENZYMY RESTRYKCYJNE • Nazewnictwo opiera się na literowych skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub lub typ, a kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie. 18-11 ENZYMY RESTRYKCYJNE ENZYMY RESTRYKCYJNE • Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi kompletnie 1mg DNA faga lambda (około 50 kb) w czasie 1 godz. w temperaturze 37°C. ENZYMY RESTRYKCYJNE Podział restryktaz według rodzaju wytwarzanych końców: • tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu; • lepkie końce - 3` lub 5`ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie, komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA, co pozwala na łączenie DNA w reakcji ligacji nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł. “Sticky” ends 5’ overhang (EcoRI) 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 5’-G-OH 3’-CTTAA-PO4 3’ overhang (PstI) 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ 5’-CTGCA-OH 3’-G-PO4 + PO4-AATTC-3’ HO-G-5’ + PO4-G-3’ HO-ACGTC-5’ + PO4-GGG-3’ HO-CCC-5’ “Blunt” ends 5’ overhang (SmaI) 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCC-OH 3’-GGG-PO4 ENZYMY RESTRYKCYJNE Modyfikacje końców : • tępych, poprzez dołączenie adaptorów (krótkich fragmentów DNA zakończonych z jednej strony na tępo z drugiej na lepko, specyficznie dla danej restryktazy) lub linkerów (krótkich fragmentów DNA zawierających określone miejsce restrykcyjne, zakończonych na tępo), przed dołączeniem tych ostatnich należy zmetylować genomowy DNA odpowiednią metylazą a po ligacji strawić DNA daną restryktazą uzyskując lepkie końce; • • lepkich, które mają cofniętą nić 3`; można je wypełnić przy pomocy fragmentu Klenowa polimerazy DNA E.coli i kompletu nukleotydów; • lepkich, które mają cofniętą nić 5`; można je wytępić obcinając wysunięty jednoniciowy DNA przy użyciu nukleazy MB, S1 lub polimerazy I E.coli wykorzystując jej aktywność egzonukleolityczną 3`-5`. ENZYMY RESTRYKCYJNE Podział restryktaz według sekwencji rozpoznawanej: • czwórkowe , rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech nukleotydów Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest dużo - co 256 pz. Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe fragmenty. • szóstkowe, rozpoznają sekwencję DNA złożoną z sześciu nukleotydów Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu nukleotydów występuje statystycznie co około 4096 pz w DNA, w którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zależności od organizmu, dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić eksperymentalnie. • ósemkowe, stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko. Frequency of cutting of recognition enzymes Sau 3A (GATC) cuts (¼)(¼)(¼)(¼) = once every 256 base pairs (assuming G/C = A/T, which is often does not) BamH1 (GGATCC) cuts (¼)(¼)(¼)(¼)(¼)(¼) = once every ~4Kb HindII (GTPyPuAC) cuts (¼)(¼)(½)(½)(¼)(¼) = once every ~1Kb • • • • • Enzymy restrykcyjne izolowane z różnych gatunków bakterii podzielono na trzy klasy (I, II i III) w zależności od: Liczby i organizacji wchodzących w ich skład podjednostek Wymagań dotyczących kofaktorów Mechanizmu enzymatycznego Specyficzności rozpoznawanej sekwencji Regulacji ekspresji genów kodujących enzymy Podział ten jest stale modyfikowany, uaktualniany w związku z odkrywaniem nowych systemów RM Typ I RM • • • • • • Jest najbardziej skomplikowanym systemem, złożonym z trzech podjednostek strukturalno-funkcjonalnych: Podjednostka S – rozpoznaje sekwencję DNA Podjednostka M – modyfikuje DNA Podjednostka R – aktywność restrykcyjna Podjednostki S i M tworzą m6A-metylazę DNA o stechiometrii M2S1, która rozpoznaje i modyfikuje DNA w obrębie określonej sekwencji Kompleks 3 podjednostek R2M2S1 jest enzymem restrykcyjnym (wymaga ATP) gdy napotka niezmodyfikowany DNA Cięcie następuje w różnych niezdefiniowanych odległościach od miejsca rozpoznania, zwykle kilkaset do kilku tysięcy par zasad Typ II RM • W zdefiniowanych warunkach posiadają wysoką specyficzność rozpoznawanej sekwencji • Dają powtarzalne produkty trawienia endonukleolitycznego • Nie wymagają ATP i S-adenozylo-L-metioniny, a jedynie jonów Mg • Aktywności metylazy i endonukleazy rozdziolone są między dwa odrębne białka kodowane przez różne geny • Rozpoznają krótkie najczęściej palindromiczne sekwencje 4-8 pz i trawią DNA w obrębie sekwencji rozpoznania lub w pewnej ściśle określonej odległości od niej • Wyróżnia się podtypy lub klasy w obrębie rodziny II Klasy typu II RM • II S (monomery w roztworze; rozpoznają asymetryczną sekwencję; cięcie w zdefiniowanej odległości od sekwencji rozpoznawanej, 1-20 pz; np. FokI – GGATGN9/13 • II E (rozpoznawane dwie sekwencje: w efektorze allosterycznym i właściwej sekwencji ciętej, np. NaeI – GCG/CGC) • II F (homotetramer, rozpoznaje dwie sekwencje, trawienie jednoczesne obu miejsc, np. NgoMIV – G/CCGGC • II T (heterodimer, rozpoznawana sekwencja asymetryczna, sekwencja palindromiczna, np. Bpu10I – CC/TNAGG Klasy typu II RM c.d. • II G (aktywność R i M w jednym łańcuchu polipeptydowym, cięcie poza sekwencją rozpoznania, stymulacja przez SAM, np. Eco57I - CTGAAGN14/16) • II B (trawienie po obu stronach rozpoznawanej sekwencji, aktywność R i M w jednym Łańcuchu polipeptydowym, np. BcgI – NN/N10CGAN6TGCN10/NN) • II M (rozpoznawana sekwencja zmetylowana, np. DpnI – GmA/TC) Typ III RM • Zbudowany z 2 podjednostek: M – modyfikującej i R – restrykcyjnej, występujących w stechiometrii R2M2 • Enzymy rozpoznają 5-6 pz, nie wykazujące symetrii wewnętrznej i trawią w odległości około 25 pz od miejsca rozpoznania • Wymagają do aktywności ATP i Sadenozylo-L-metioniny Enzymy użyteczne w analizie restrykcyjnej DNA. Podział na grupy. • enzymy należące do grupy "regularnych 6t-ek", np.: EcoRI, BamHI, BglII, PstI, HindIII • enzymy należące do grupy rozpoznających kilka specyficzności, np.: HincII - GT[PyPu]AC, AccI, AvaII, AflIII • enzymy należące do grupy rozpoznających nieciągłe sekwencje palindromowe, np.: BglI (GCCNNNN'NGGC), BstXI (CGANNNNN'NTGG) • enzymy rozpoznające specyficzną sekwencję, lecz przecinające DNA poza nią ("shiftery", klasa lI S), np.: FokI GGATGNNNNNNNNN(9)’ CCTACNNNNNNNNNNNNN(13)’ MboII GAAGANNNNNNNN(8)’ CTTCTNNNNNNN(7)’ Grupy enzymów pozostawiających komplementarne końce Istnieją grupy enzymów rozpoznające odmienne sekwencje lecz pozostawiające po trawieniu komplementarne końce DNA. Są one dostępne komercyjnie i dają duże możliwości w opracowaniu strategii wieloetapowego klonowania. Grupy enzymów pozostawiających komplementarne końce Najpopularniejsze pary enzymów pozostawiających komplementarne końce to: • BamHI G’GATC’C • BglII A’GATC’T • BstYI (XhoII) G/A’GATC’C/T • BclI T’GATC’A • Sau3AI ‘GATC’ Grupy enzymów pozostawiających komplementarne końce • • • • XbaI NheI SpeI AvrII T’CTAG’A G’CTAG’C A’CTAG’T C’CTAG’G • • • • SalI PaeR7I XhoI AvaI G’TCGA’C C’TCGA’G C’TCGA’G C’C/TCGG/A’G Izoschizomery • to enzymy pochodzące z różnych organizmów bakteryjnych, ale rozpoznające taką samą sekwencję i przecinające ją identycznie. Np.: SphI GCATG’C BbuI GCATG’C Neoschizomery • rozpoznają taką samą sekwencję DNA lecz przecinają ją w inny sposób. Uniemożliwia to łączenie (ligację) końców, więc podczas planowania ligacji nie można tego przeoczyć! Np.: Acc65I G’GTACC KpnI GGTAC’C SmaI XmaI CCC’GGG C’CCGGG BbeI EheI KasI NarI GGCGC’C GGC’GCC G’GCGCC GG’CGCC Problem dam/dcm metylacji DNA w komórkach E. coli Jeżeli sekwencje GATC lub CC A/T GG są częścią sekwencji rozpoznawanej, bądź enzym rozpoznaje i przecina taką sekwencję bezpośrednio, to fakt ten ma swoje konsekwencje, jeśli DNA jest otrzymywane w komórkach E. coli dam+ dcm+. W związku z metylacją adeniny w sekwencji GATC (dam) i wewnętrznej cytozyny w sekwencji CC A/T GG (dcm) w dzikich szczepach E. coli, należy brać pod uwagę wrażliwość danego enzymu restrykcyjnego na tego typu metylację substratu. Jeżeli zatem sekwencje GATC lub CC A/T GG nakładają się na sekwencje rozpoznawane, należy wiedzieć, że nie każde istniejące na danym DNA miejsce restrykcyjne dla odpowiedniego enzymu będzie cięte. Problem dam/dcm metylacji DNA w komórkach E. coli • Lista niektórych enzymów, których aktywność jest zależna od zmetylowanego DNA w sekwencji dam (podkreślono). Enzymy te nie trawią takich sekwencji: BclI TGAMTCA ClaI gAMTCGAT DpnII, MboI GAMTC HphI GGTGAMtc MboII GAAGAMtc NruI TCGCGAMtc XbaI TCTAGAMtc Problem dam/dcm metylacji DNA w komórkach E. coli • Lista enzymów dam niezależnych (niewrażliwych): BamHI GGAMTCC BglII AGAMTCT BstYI (A/G)GAMTC(C/T) PvuI CGAMTCG Sau3AI GAMTC Problem dam/dcm metylacji DNA w komórkach E. coli • Lista enzymów dcm zależnych wrażliwych (sekwencje dcm podkreślono): AvaII GG(A/T)CCM(a/t)gg BalI TGGCCMAgg EcoRII CCM(A/T)GG Sau96I GGNCCM(a/t)gg StuI AGGCCMTgg Problem dam/dcm metylacji DNA w komórkach E. coli • Lista enzymów niewrażliwvch na dcm metylację: BglI GCCM(A/T)GGNNGGC BstNI CCM(A/T)GG HaeIII GGCCM(a/t)gg KpnI GGTACCM(a/t)gg NarI GGCGCCM(a/t)gg Warunki trawienia a niespecyficzna aktywność (ang. star activity) • Jeżeli przeprowadza się trawienie w warunkach znacznie odbiegających od optymalnych dla danego enzymu, to często zdarza się, że obserwujemy niespecyficzne cięcia. • Dzieje się tak, ponieważ w tych warunkach enzym rozpoznaje sekwencje różniące się od sekwencji specyficznej (kanonicznej), np. o jedną zasadę. • W przypadku EcoRI, dla którego sekwencją kanoniczną jest GAATTC takie zmienione przecinane sekwencje to np. CAATTC, GAATTG, GTATTC itp. Warunki trawienia a niespecyficzna aktywność (ang. star activity) • • • • • • Do czynników mogących wywołać rozluźnioną specyficzność enzymu zalicza się: 1. stężenie glicerolu powyżej 5% 2. obecność DMSO, etanolu, glikolu etylenowego 3. zbyt niską siłę jonową mieszaniny reakcyjnej 4. zbyt wysokie pH 5. obecność innych niż Mg2+ jonów dwuwartościowych metali (np.: Mn, Cu, Zn, Fe, Co, Ca) 6. zbyt wysokie stężenie enzymu w próbce. Lista enzymów modyfikujących niezbędnych do klonowania • zestaw enzymów restrykcyjnych • fragment Klenowa polimerazy DNA I - tworzenie tępych końców przez wypełnianie cofniętych końców 3' • polimeraza DNA T4 - tworzenie tępych końców przez usuwanie jednoniciowych końców 3' lub wypełnianie cofniętych końców 3' • kinaza polinukleotydowa T4 - fosforylacja końców 5' • ligaza DNA T4 - łączenie końców DNA • nukleaza mung bean - tworzenie tępych końców przez usuwanie jednoniciowych lepkich końców • RNazaA - degradacja RNA • alkaliczna fosfataza - usuwanie grup fosforanowych z końców 5' Polimerazy DNA • DNA Polimeraza I (polimeraza Kornberga) Większość komercyjnych preparatów tego enzymu otrzymano z E. coli lizogennej fagiem l/polA. Enzym ten jest polipeptydem o masie cząsteczkowej 109 kDa, mającym trzy różne aktywności: 1) DNA polimerazy oraz 2) egzonukleazy 3’-5’ i 3) egzonukleazy 5’-3’. W reakcji z dwuniciowym DNA (dsDNA) i przy nadmiarze dNTP aktywność egzonukleazy 3‘-5‘ jest zwykle maskowana przez aktywność polimerazy 5‘-3'. Właściwości: (1) 5‘-3' DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do swojej aktywności matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) i startera DNA lub RNA z końcem 3'-OH. (2) 5-3' egzonukleaza, degradująca dwuniciowy DNA (dsDNA) lub hybrydy DNA/RNA jod końca 5'-P. (3) 3‘-5' egzonukleaza, degradująca dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy DNA (ssDNA) od końca 3'-OH. Zastosowanie: (1) Znakowanie DNA metodą przesunięcia pęknięć (ang. nick translation) (2) Synteza nici cDNA w połączeniu z RNaząH. Polimerazy DNA • DNA Polimeraza I (fragment Klenowa) Źródłem tego enzymu jest produkt proteolizy polimerazy Kornberga subtilizyną. Enzym ten jest także otrzymywany z rekombinanta E. coli syntetyzującego to białko z zmienionego genu polA. Ma masę cząsteczkową 75 kDa i brak mu aktywności 5’-3' egzonukleazy. Właściwości: (1) 5‘-3‘ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz startera DNA lub RNA z końcem 3'- OH. (2) 3‘-5' egzonukleaza, degradująca dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy DNA (ssDNA) od końca 3‘-OH. Zastosowanie: (1) Wypełnianie i znakowanie dwuniciowego DNA (dsDNA) z 5‘ jednoniciowym, lepkim końcem (2) Znakowanie ssDNA metodą wydłużania startera (ang. random priming) (3) Synteza drugiej nici cDNA (4) Synteza komplementarnej nici w mutagenezie miejscowo-specyficznej (5) Synteza sond ssDNA (6) Znakowanie DNA metodą przesunięcia pęknięć (ang. nick translation) Polimerazy DNA • DNA Polimeraza faga T4 Źródłem tego enzymu są bakterie E. coli zakażone fagiem T4 lub rekombinant E. coli syntetyzujący to białko z sklonowanego genu polimerazy T4. DNA polimeraza z faga T4 jest pojedynczym polipeptydem o masie cząsteczkowej 114 kDa, i brak jej aktywności egzonukleazy 5‘-3'. Więc jest funkcjonalnie podobny do fragmentu Klenowa, przy czym polimeraza T4 posiada bardziej aktywną egzonukleazę 3‘-5'. Właściwości: (1) 5‘-3' DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) i starter DNA lub RNA z końcem 3'-OH. (2) 3‘-5' egzonukleaza, degradująca od końca 3'-OH dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy DNA (ssDNA). Aktywność 3’-5' egzonukleazy polimerazy DNA T4 umożliwia enzymowi przeprowadzać reakcje wymiany z cząsteczkami dsDNA posiadającymi tępe lub 3' wiszące końce. Zastosowanie: (1) Wypełnianie i znakowanie dwuniciowego DNA (dsDNA) z 5' jednoniciowym, lepkim końcem (2) Znakowanie dsDNA przez reakcję wymiany (3) Wypełnianie luk w DNA w mutagenezie miejscowo-specyficznej z krótkimi oligonukleotydami (4) Wykrywanie dimerów tyminowych Polimerazy DNA • DNA Polimeraza faga T7 Źródłem tego enzymu są bakterie E. coli zakażone fagiem T7. DNA polimeraza faga T7 jest dimerem złożonym z produktu genu 5 faga T7 (84 kDa) i tioredoksyny E. coli. Produkt genu 5 posiada aktywność polimerazy/egzonukleazy, a białko E. coli ściśle wiąże kompleks z matrycą DNA, zapobiegając wczesnej dysocjacji podczas syntezy komplementarnej nici. Enzym ten jest funkcjonalnie podobny do fragmentu Klenowa, lecz charakteryzuje się szybszym stopniem syntezy DNA (300 nt/s). Właściwości: (1) 5‘-3‘ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz startera DNA lub RNA z końcem 3'-OH. (2) 3‘-5' egzonukleaza, degradująca od końca 3'-OH dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy DNA (ssDNA). Zastosowanie: Używany alternatywnie z fragmentem Klenowa, szczególnie w tych przypadkach, które wymagają dużej szybkości syntezy i dobrego wiązania z matrycą. Polimerazy DNA • DNA Polimeraza Taq Źródłem tego enzymu są bakterie Thermus aquaticus YT1 lub rekombinant E. coli. Enzym ten jest funkcjonalnie podobny do DNA polimerazy I E. coli. Cenną jego właściwością jest termostabilność w zakresie temperatur od 37°C do 94°C, a optimum działania wykazuje przy 80°C. Właściwości: (1) 5‘-3‘ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) oraz startera DNA lub RNA z końcem 3'-OH (2) 5‘-3' egzonukleaza, degradująca od końca 5'-P dwuniciowy DNA (dsDNA) lub hybryd DNARNA. Zastosowanie: (1) Amplifikacja DNA przez łańcuchową reakcję polimery (ang. Polimerase Chain Reaction PCR) (2) W sekwencjonowaniu DNA metodą Sangera Odwrotne transkryptazy Źródłem są kurczęta zainfekowane wirusem AMV (ang. Avian Myeloblastosis Virus) lub rekombinant E. coli z wklonowanym genem AMVpol. Odwrotna transkryptaza AMV jest to białko dimeryczne złożone z podjednostek o masach cząsteczkowych 62 i 94 kDa. Mała podjednostka jest proteolitycznym produktem dużej podjednostki. Właściwości: (1) 5‘-3' DNA- lub RNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) lub jednoniciowego RNA (ssRNA) oraz startera DNA lub RNA z końcem 3'-OH. (2) 5’-3’ i 3’-5’ aktywność egzonukleazy, specyficznej dla RNA w hybrydzie DNA/RNA. (3) Aktywność DNA endonukleazy. Zastosowanie: (1) Synteza pierwszej nici cDNA (2) Sekwencjonowanie RNA (3) Sekwencjonowanie DNA, szczególnie dla regionów bogatych w G+C (4) Szukanie drugorzędowych struktur RNA (5) Znakowanie 3' końców fragmentów DNA Polimerazy RNA • RNA Polimeraza E. coli Holoenzym polimerazy RNA izolowanej z E. coli składa się z 4 podjednostek: 2a, b i b'. Jest on zdolny do elongacji transkryptów, lecz nie do wydajnej inicjacji transkrypcji. Dla inicjacji transkrypcji potrzebna jest piąta podjednostka - s. Właściwości: DNA-zależna polimeraza RNA rozpoznaje różne sekwencje promotorowe podobne do sekwencji consensus i syntetyzuje RNA aż do sekwencji terminatorowej. Zastosowanie: (1) Transkrypcja genów z właściwych promotorów in vitro (2) Synteza znakowanego RNA • RNA Polimeraza faga SP6 Źródłem enzymu są bakterie Salmonella typhimurium LT2 zakażone fagiem SP6 lub rekombinant E. coli. RNA polimeraza faga SP6 jest polipeptydem o masie cząsteczkowej 96 kDa. Promotor SP6 jest bardzo wydajny i specyficznie rozpoznawany przez polimerazę SP6. Wektory zawierające promotor SP6 mogą syntetyzować mikrogramowe ilości RNA. Polimeraza SP6 nie kończy syntezy przy nacięciach matrycy. Właściwości: DNA-zależna polimeraza RNA, wysoce specyficzna w stosunku do promotora SP6. Zastosowanie: (1) Produkcja antysensownego RNA; (2) Synteza mRNA w translacji in vitro, (3) Otrzymywanie znakowanego RNA; (4) Sekwencjonowanie RNA Polimerazy RNA • RNA Polimeraza faga T3 Źródłem enzymu jest rekombinant E. coli zawierający plazmid z wklonowanym genem polimerazy RNA T3 pod kontrolą promotora lacUV5. Jest to polipeptyd o masie cząsteczkowej około 100 kDa. Enzym jest bardzo specyficzny do promotorów T3. Właściwości: DNA-zależna polimeraza RNA, wysoce specyficzna w stosunku do promotora T3. Zastosowanie: Synteza transkryptów RNA pod kontrolą promotora T3, zastosowanie podobne jak RNA polimerazy SP6. • RNA Polimeraza faga T7 Źródłem enzymu jest rekombinant E. coli zawierający plazmid z wklonowanym genem RNA polimerazy T7 pod kontrolą promotora lacUV5. RNA polimeraza T7 jest polipeptydem o masie cząsteczkowej 98 kDa. Enzym jest bardzo specyficzny dla promotorów T7. Wektor zawierający promotor T7 może być zastosowany do otrzymania 30 mg transkryptu RNA z 1 mg DNA matrycowego w ciągu 30 min. Właściwości: DNA-zależna polimeraza RNA, wysoce specyficzna dla promotora T7. Zastosowanie: Synteza transkryptów RNA z sekwencji ligowanych pod kontrolę promotora T7, zastosowanie podobne do RNA polimerazy SP6. Nukleazy • Nukleaza Bal31 Źródłem są bakterie Alteromonas espejiana Bal31. Jest to zewnątrzkomórkowa nukleaza, wysoce zależna od sekwencji, w dużych rozcieńczeniach jest funkcjonalna tylko aktywność endonukleazy dla jednoniciowego DNA (ssDNA). Właściwości: (1) 3'—>5' egzonukleaza, która progresywnie usuwa nukleotydy z końca 3'-OH cząsteczek ssDNA lub dsDNA mających zarówno kohezyjne jak i tępe końce. (2) Endodeoksyrybonukleaza z dużą specyficznością dla ssDNA. (3) Kombinacja aktywności (1) i (2) dająca enzymowi Bal31 możliwość progresywnwgo skracania cząsteczek dsDNA. (4) Niewydajna rybonukleaza. Zastosowanie (1) Kontrolowane cięcie cząsteczek dsDNA usuwające zbędne sekwencje przed klonowaniem (2) Tworzenie zachodzących subklonów do sekwencjonowania DNA (3) Mapowanie restrykcyjne (4) Mapowanie drugorzędowych struktur DNA Nukleazy • Nukleaza SI Źródłem jest Aspergillus oryzae. Enzym jest glikozylowanym, cynkowym metaloproteidem o masie cząsteczkowej 32 kDa, wysoce termostabilnym. Właściwości: Endonukleaza specyficzna dla ssDNA, bardziej aktywna dla ssDNA, niż ssRNA Zastosowanie: (1) Analiza hybryd DNA-RNA (mapowanie nukleazą SI) w celu lokalizacji intronów i miejsc terminacji transkrypcji (2) Usuwanie lepkich końców w celu tworzenia cząsteczek z tępymi końcami (3) Otwieranie struktur "szpilki od włosów" (ang. hairpins) tworzonych podczas syntezy cDNA • Nukleaza Mung Bean Źródłem jest fasola Vigna radiata. Funkcjonalnie nukleaza Mung Bean podobna jest do nukleazy SI, lecz cechuje się o wiele mniejszą aktywnością do tworzenia nacięć w dsDNA i cięcia nienaruszonej nici naprzeciw nacięcia. Właściwości: Endonukleaza specyficzna dla ssDNA, bardziej aktywna dla ssDNA niż ssRNA Zastosowanie: (1) Stosowana alternatywnie w stosunku do nukleazy SI, gdy cięcie dwuniciowych cząsteczek stanowi problem (2) Stosowana do usuwania lepkich końców dwuniciowego DNA Nukleazy • Nukleaza PI Źródłem jest Penicillium citrinum. Nukleaza PI jest glikozylowanym, cynkowym metaloproteidem o masie cząsteczkowej 24 kD. Właściwości: Niespecyficzna fosfodiesteraza, działająca zarówno jako endonukleaza jak i egzonukleaza. Jest bardziej aktywna w stosunku do ssDNA i ssRNA, lecz wykazuje również znaczącą aktywność wobec dsDNA i dsRNA Zastosowanie: (1) W sekwencjonowaniu RN A. (2) Możliwość alternatywnego wykorzystania zamiast nukleazy SI lub Mung Bean do cięcia ssDNA lub ssRNA, jednak z powodu wysokiej aktywności w stosunku do dsDNA lub dsRNA jest mało użyteczna do tych celów. • Rybonukleaza A Źródłem jest trzustka wołowa. Jest to bardzo aktywna i stabilna o masie cząsteczkowej 13,7 kDa. Większość preparatów jest zanieczyszczona DNazami, które mogą być inaktywowane przez gotowanie w 100°C przez 15 min. RNaza A jest nieglikozylowaną formą standardowej rybonukleazy trzustkowej. Właściwości: Endorybonukleaza, przecinająca fosfodiestrowe wiązanie 3’ przy pirymidynach. Nie wykazuje żadnej aktywności w stosunku do DN Zastosowanie: (1) Usuwanie RNA z preparatów DNA (2) Mapowanie punktowych mutacji w DNA i RNA Nukleazy • Rybonukleaza H Źródłem jest rekombinantowy szczep E. coli zawierający plazmid z genem RNazy H. Rybonukleaza H jest to białko monomeryczne o masie cząsteczkowej 15,5 kDa. Właściwości: Endorybonukleaza, specyficzna do RNA w hybrydach DNA-RNA Zastosowanie: (1) Synteza komplementarnej nici cDNA (2) Usuwanie ogonów poli(A) z mRNA (3) Wykrywanie hybryd DNA-RNA (4) Badanie starterów RNA w syntezie DNA (5) Miejscowo-specyficzne cięcie hybrydyzowanego RNA z krótkimi oligonukleotydami Nukleazy • Deoksyrybonukleaza I Źródłem jest trzustka wołowa. Jest to glikoproteid o masie cząsteczkowej 31 kDa, zwykle otrzymywany jako mieszanina izoenzymów. Właściwości: Endodeoksyrybonukleaza, degradująca ssDNA i dsDNA przez preferencyjne cięcie 5‘ pirymidyn, dająca mono- i oligonukleotydy o przeciętnej wielkości 4 nt. Zastosowanie: (1) Wprowadzanie nacięć do dsDNA przed znakowaniem metodą przesunięcia pęknięć (ang. nick translation) (2) Eksperymenty typu ochrony przed cięciem DNazą i "footprinting„ w celach lokalizacji miejsc wiązania białek z DNA (3) Usuwanie DNA podczas preparowania RNA (4) Wykrywanie regionów transkrypcyjnie aktywnych w chromatynie (5) Usuwanie matrycy DNA po transkrypcji in vitro (6) Tworzenie zachodzących na siebie subklonów w sekwencjonowaniu DNA Nukleazy • Nukleaza S7 Źródłem są bakterie Staphylococcus aureus. Nukleaza S7 jest aktywna zarówno w stosunku do DNA jak i RNA. W przypadku DNA wykazuje preferencje do ssDNA i regionów dsDNA bogatych w pary AT. Właściwości: Endonukleaza, aktywna w stosunku do DNA i RNA, zarówno jedno- jak i dwuniciowego Zastosowanie: (1) Przygotowanie mRNA-zależnej syntezy białek z lizatów króliczych retikulocytów (2) Trawienie chromatyny w celu przygotowania nukleosomów • Endonukleaza T7 Źródłem są bakterie E, coli zakażone fagiem T7 lub rekombinant E. coli eksprymujący gen 3 faga T7. Endonukleaza T7 jest to specyficzny do ssDNA enzym, aktywny w neutralnym i zasadowym pH. Ma on słabą aktywność wobec dsDNA (1% aktywności w porównaniu z aktywnością do ssDNA). Właściwości: Endonukleaza, specyficzna dla ssDNA Zastosowanie: (1) Badanie złożonych struktur dsDNA (2) Eksperymenty typu "footprinting" do lokalizacji miejsc wiązania białek z DNA Nukleazy • Egzonukleaza I Źródłem są bakterie E. coli. Egzonukleaza I jest to białko monomeryczne o masie cząsteczkowej 55 kDa. Właściwości: 3‘-5' egzodeoksyrybonukleaza, specyficzna dla ssDNA Zastosowanie: (1) Badanie aktywności helikaz DNA (2) Endonukleolityczne cięcie ssDNA • Egzonukleaza VII Źródłem są bakterie E. coli HMS 137. Egzonukleaza ta atakuje zarówno końce 5' jak i 3' ssDNA tworząc w wyniku cięcia oligonukleotydy. Właściwości: 3‘-5' i 5‘-3' egzodeoksyrybonukleaza, specyficzna do ssDNA Zastosowanie: Mapowanie egzonów. Egzonukleaza VII nie posiada aktywności endonukleolitycznej, może więc być stosowana w mapowaniu transkryptów w celu odróżnienia pętli ssDNA od wiszących ssDNA w hybrydach DNA-RNA. Egzonukleaza VII nie ma zastosowania dla tępo zakończonych fragmentów dsDNA. Nukleazy • Egzonukleaza III Źródłem są bakterie E. coli BE 257 lub SR 80 z termicznie indukowalnym genem sklonowanym w plazmidzie. Egzonukleaza III jest to białko monomeryczne o masie cząsteczkowej 28 kDa o wielu aktywnościach. Egzonukleaza jest nieaktywna w stosunku do ssDNA lub dsDNA z lepkimi końcami 3' wielkości 4 nt lub więcej. Właściwości: (1) 3‘-5' egzodeoksyrybonukleaza, specyficzna dla dsDNA z końcami 3'OH; (2) 3’ fosfataza, usuwająca grupy fosforanowe z końców 3’ ssDNA lub dsDNA; (3) Endodeoksyrybonukleaza, specyficzna dla nukleotydów w których zasada purynowa lub pirymidynowa została nacięta; (4) Endorybonukleaza, specyficzna do RNA w hybrydach RNA-DNA. Zastosowanie: (1) Tworzenie zachodzących na siebie subklonów w sekwencjonowaniu DNA; (2) Znakowanie tępych końców dsDNA, w połączeniu z działaniem fragmentu Klenowa; (3) Delecje sekwencji terminalnych w fragmentach dsDNA, w połączeniu z działaniem endonukleazy specyficznej do ssDNA; (4) Techniki mutagenezy Enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych • Fosfataza alkaliczna Źródłem jest jelito cielęce (fosfataza CIP, ang. Calf Intestine Phosphatase) lub E. coli (fosfataza BAP, ang. Bacterial Alkaline Phosphatase). Jest to dimeryczny glikoproteid, złożony z dwóch identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej 69 kDa. Zawiera cztery atomy cynku na cząsteczkę. CIP może być inaktywowany termicznie przez inkubację w 68°C, natomiast BAP jest w tych warunkach stabilny. BAP jest również oporny na ekstrakcję fenolową. Właściwości: 5' fosfataza, usuwająca 5' grupę fosforanową z ssDNA i dsDNA, ssRNA i dsRNA, z deoksyrybonukleotydotrifosforanów i rybonukleotydotrifosforanów Zastosowanie: (1) Defosforylacja dsDNA w celu uniemożliwienia autoligacji (2) Defosforylacja DNA i RNA do znakowania końców 5‘ za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 (3) Jako składnik w systemie immunodetekcji Enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych • Kinaza Polinukleotydowa T4 Źródłem są bakterie E. coli zakażone fagiem T4 lub rekombinant E. coli. Kinaza polinukleotydowa jest tetramerem, złożonym z identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej 33 kDa. Aktywność fosfatazy jest wyrażana w stosunku do ssDNA i dsDNA, ssRNA i dsRNA i również 3'- deoksyrybonukleotydomonofosforanów i 3'rybonukleotydomonofosforanów. Właściwości: (1) 5' kinaza, przenosząca g-fosforan z ATP na koniec 5'-OH cząsteczek ssDNA, dsDNA, ssRNA lub dsRNA (2) 3' fosfataza, usuwająca grupy fosforanowe z końców 3' cząsteczek ssDNA, dsDNA, ssRNA lub dsRNA Zastosowanie: (1) Znakowanie końców 5' DNA lub RNA, szczególnie przed reakcjami sekwencjonowania metodą Maxama-Gilberta, enzymatycznym sekwencjonowaniem RNA, mapowaniem restrykcyjnym i " footprintingem" (2) Fosforylowanie syntetycznych oligonukleotydów (3) Usuwanie grup fosforanowych z końców 3'. Enzymy modyfikujące końce fragmentów kwasów nukleinowych • Terminalna Deoksynukleotydylo Transferaza (TdT) Źródłem enzymu jest trzustka cielęca. Terminalna deoksynukleotydylo transferaza jest białkiem dimerycznym, złożonym z dwóch niejednakowych podjednostek o masach cząsteczkowych 80 i 26 kDa. TdT może również polimeryzować rybonukleotydy, ale z małą wydajnością. Właściwości: Matryco-zależna polimeraza DNA, dosyntetyzująca deoksynukleotydy do końców 3'-OH na ssDNA lub dsDNA. (1) W przypadku ssDNA lub dsDNA z lepkimi końcami 3' o długości co najmniej 2nt: (2) W przypadku dsDNA z tępymi końcami Zastosowanie: (1) Tworzenie homopolimerowych ogonów na końcach fragmentów (2) Znakowanie końców 3' znakowanym 3'-dNTP, 3'-NTP lub dideoksy-NTP Topoizomerazy • DNA topoizomeraza I Źródłem enzymu jest trzustka cielęca. DNA topoizomeraza I jest pojedynczym polipeptydem o masie cząsteczkowej 105 kDa. Właściwości: Typ I topoizomeraz relaksuje superzwinięte DNA przez nacięcie pojedynczej nici w szkielecie cukrowo-fosforanowym. Aktywność topoizomerazy I jest także odpowiedzialna za: (1) tworzenie kolistych katenatów dsDNA, (2) wiązanie cząsteczek ssDNA z końcami 5'-OH innej cząsteczki ssDNA lub cząsteczki dsDNA. Zastosowanie: (1) Badanie budowy nukleosomów; (2) Badanie struktur DNA wyższego rzędu • DNA topoizomeraza II (DNA gyraza) Źródłem tego enzymu są bakterie Micrococcus luteus. DNA topoizomeraza II jest białkiem multimerycznym, złożonym z identycznych podjednostek. Do swej aktywności wymaga ATP. Właściwości: Typ II topoizomeraz wprowadza negatywne superskręty do CCC DNA poprzez nacięcie dwóch nici i następnie ponowne połączenie wiązaniem fosfodiestrowym Zastosowanie: Wprowadzanie superskrętów do plazmidów i innych cząsteczek CCC DNA. Białka wiążące się z DNA • Białko wiążące się z jednoniciowym DNA (SSB) Źródłem są bakterie E. coli, a także ich rekombinant. SSB jest białkiem tetramerycznym, złożonym z identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej 18.9 kDa. Wiąże się kooperatywnie z ssDNA , lecz nie z dsDNA. Zastosowanie: (1) Techniki mutagenezy (2) Uwidacznianie ssDNA w mikroskopii elektronowej (3) Badanie aktywności DNA helikazy, w połączeniu z działaniem egzonukleazą I (4) Stymulacja przejścia genomów fagowych z ssDNA do dsDNA (5) Stymulacja aktywności DNA polimerazy • Białko genu 32 faga T4 Źródłem są bakterie E. coli zakażone potrójnym mutantem faga T4, defektywnym dla genów 33, 35 i 58-61, a także nadprodukujący rekombinant E. coli. Produkt genu 32 jest białkiem wiążącym się z ssDNA, stymulującym aktywność DNA polimerazy T4 (510 razy). Białko to wiąże się również do ssRNA, lecz z 10-1000 razy niższą efektywnością. Zastosowanie: (1) Stymulacja aktywności DNA polimerazy T4 w replikacji matrcy ssDNA (2) Uwidacznianie ssDNA w mikroskopii elektronowej (3) Techniki miejscowo-specyficznej mutagenezy (4) Rozpoznawanie uszkodzonego DNA Białka wiążące się z DNA • Białko RecA Źródłem są bakterie E. coli lub jej rekombinant. Białko RecA jest wymagane w homologicznej rekombinacji genetycznej i w systemach naprawy DNA. Właściwości: (1) Białko wiążące się z ssDNA (2) DNA-zależna ATPaza Zastosowanie: (1) Techniki mutagenezy (2) Uwidacznianie ssDNA w mikroskopii elektronowej (3) Do rzadkiego i precyzyjnego cięcia dużych cząsteczek DNA metodą trawienia w "Pięcie Achillesa" (ang. Achilles' Heel Cleavage) Tworzenie nowych miejsc restrykcyjnych przez łączenie końców DNA • • • • Nowe miejsca restrykcyjne w zrekombinowanym DNA mogą powstawać w miejscu ligacji naturalnych końców DNA bądź po wypełnieniu ich fragmentem Klenowa polimerazy DNA I: powstanie nowego miejsca przypadkowo: SspI/ClaI (Klenow) - AAT/CGAT odtworzone ClaI (ATCGAT) ClaI (Klenow)/SspI - ATCG/ATT odtworzone ClaI EcoRV/ClaI (Klenow) - GAT/CGAT odtworzone ClaI dam-zależne (gATCGAT) EcoRI (Klenow)/PvuII - GAATT/CTG odtworzone EcoRI (GAATTC) Tworzenie nowych miejsc restrykcyjnych przez łączenie końców DNA powstanie nowego miejsca w sposób zamierzony: • (np. w sytuacji konieczności zlikwidowania starego miejsca restrykcyjnego i wykreowanie nowego [uzupełnianie fragmentem Klenowa polimerazy DNA I]: • EcoRI/EcoRI - GAATT/AATTC XmnI (GAANNNNTTC) • HindIII/HindIII - AAGCT/AGCTT NheI (GCTAGC) • TaqI/TaqI - TCG/CGA NruI (TCGCGA) ENZYMY RESTRYKCYJNE Zastosowania: • Konstrukcja map restrykcyjnych. Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi, stosowanymi pojedynczo, w kombinacjach oraz w ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu, można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Mapa restrykcyjna to obraz cząsteczki DNA, na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach. ENZYMY RESTRYKCYJNE Zastosowania: • Klonowanie i obróbka DNA. DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z wektorem. W ten sposób tworzone są zrekombinowane plazmidy czyli plazmidy zawierające sklonowany DNA, który można później poddawać różnym manipulacjom przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych. • Badanie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP). ENZYMY RESTRYKCYJNE Metody alternatywne fragmentowania DNA - mechaniczna fragmentacja DNA (bardzo rzadko stosowane): • Shearing przy użyciu strzykawki z igłą. Stopień fragmentacji zależy od grubości igły i ilości przepuszczeń. Uzyskuje się fragmenty zakończone na tępo, ponieważ nici DNA pękają zwykle naprzeciwko siebie. Różnorodność powstałych fragmentów jest bardzo duża gdyż pęknięcie może nastąpić w dowolnym miejscu. • Sonikacja. Preparat DNA poddaje się działaniu ultradźwięków. Powodują one pękanie nici. Odpowiedni stopień fragmentacji można uzyskać dobierając eksperymentalnie warunki i czas sonikacji. LIGAZY DNA • LIGAZY - trwale łączą pocięte fragmenty. LIGAZY DNA LIGAZY DNA • Ligazy DNA katalizują formowanie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcem hydroksylowym 3` a końcem fosforowym 5` DNA. Pozwala to na reperowanie jednoniciowych przerw w dupleksie DNA, łączenie fragmentów restrykcyjnych posiadających homologiczne lepkie czy też nawet tępe końce. • Dwa najczęściej stosowane enzymy to ligaza DNA E.coli i ligaza DNA z faga T4. Tylko ta ostatnia jest w stanie wydajnie łączyć tępe końce, nawet w normalnych warunkach reakcji. Wadą jest jej mniejsza specyficzność rozpoznawania struktury końców, co daje większe tło w doświadczeniach spowodowane nieprawidłowymi ligacjami. This is termed a hybrid vector Note: In this case, the b-globin gene was inserted into the plasmid It is also possible for any other DNA fragment to be inserted into the plasmid And it is possible for the plasmid to circularize without an insert This is called a recircularized vector This step of the procedure is termed transformation, when plasmid vectors are used, and transfection, when a viral vector is introduced into a host cell Cells that are able to take up DNA are called competent cells • All bacterial colonies growing on the plate had to have picked up the vector and its ampR gene – But how to differentiate between the colonies that have a circularized vector from those with a hybrid vector? – Well, this is where the lacZ gene comes into play • In the hybrid vector, the chromosomal DNA inserts into the lacZ gene, thereby disrupting it – By comparison, the recircularized vector has a functional lacZ gene • But how is the functionality of the lacZ gene determined? Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-17 • The growth media contains two relevant compounds: – IPTG (isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside) • A lactose analogue that can induce the lacZ gene – X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside) • A colorless compound that is cleaved by b-galactosidase into a blue dye – The color of bacterial colonies will therefore depend on whether or not the b-galactosidase is functional • If it is, the colonies will be blue • If not, the colonies will be white – In this experiment • Bacterial colonies with recircularized vectors form blue colonies • While those with hybrid vectors form white colonies Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-18 • The net result of gene cloning is to produce an enormous amount of copies of a gene – During transformation, a single bacterial cell usually takes up a single copy of the hybrid vector – Amplification of the gene occurs in two ways: • 1. The vector gets replicated by the host cell many times – This will generate a lot of copies per cell • 2. The bacterial cell divides approximately every 30 minutes – This will generate a population of many million overnight • Recombinant DNA technology is not only used to clone genes – Sequences such as telomeres, centromeres and highly repetitive sequences can be cloned as well Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-19 The First Gene Cloning Experiment • This was accomplished by Stanley Cohen, Annie Chang, Herbert Boyer, and Robert Helling in 1973 • Several important discoveries led to their ability to clone a gene – DNA ligase covalently links DNA fragments together – EcoRI produces sticky ends when digesting DNA • Cohen et al realized that it is possible to create recombinant DNA molecules using – EcoRI then DNA ligase Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-20 • They chose a plasmid for their vector Tetracycline resistance – The plasmid was designated pSC101 • The insertion of the gene will occur at the lone EcoRI site • As source of the gene, they obtained a second plasmid – They called it pSC102 • One of the three EcoRI fragments is expected to carry the KanR gene Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display Kanamycin resistance 18-21 The Hypothesis – A piece of DNA carrying a gene can be inserted into a plasmid vector using recombinant DNA techniques • If this recombinant plasmid is introduced into a bacterial host cell, it will be replicated and transmitted to daughter cells, producing many copies of the recombinant plasmid Testing the Hypothesis Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-22 Figure 18.3 18-23 Figure 18.3 18-24 Figure 18.3 18-25 Figure 18.3 18-26 Figure 18.3 18-27 The Data Density Gradient Centrifugation Single peak A single plasmid with intermediate density; NOT a mixture of two plasmids Control Experiment pSC102 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display pSC101 18-28 The Data Gel Electrophoresis This band corresponds to pSC101 • The results of lane 4 are consistent with the idea that pSC105 is formed by the insertion of one fragment from pSC102 into the single EcoRI site of pSC101. Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display This band is also found in pSC102 18-29 • The recombinant plasmid is shown here • This experiment showed it is possible to create recombinant DNA molecules and to propagate them in bacterial cells – This hallmark achievement ushered in the era of gene cloning Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-30 cDNA • To clone DNA, one can start with a sample of RNA – The enzyme reverse transcriptase is used • Uses RNA as a template to make a complementary strand of DNA • DNA that is made from RNA is called complementary DNA (cDNA) – It could be single- or double-stranded Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-31 polyA tail Figure 18.4 18-32 • From a research perspective, an important advantage of cDNA is that it lacks introns • This has two ramifications – 1. It allows researchers to focus their attention on the coding sequence of a gene – 2. It allows the expression of the encoded protein • Especially, in cells that would not splice out the introns properly (e.g., a bacterial cell) Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-33 Restriction Mapping • Sometimes, it is necessary to obtain smaller clones from a large chromosomal DNA insert – This process is termed subcloning • Cloning and subcloning require knowledge of the locations of restriction enzyme sites in vectors and hybrid vectors • A common approach to examine the locations of restriction sites is known as restriction mapping Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-34 Figure 18.5 18-35 Used for fragment size comparison Figure 18.5 18-36 • The restriction map can be deduced by comparing the sizes of DNA fragments obtained from the single, double and triple digestions 4,363 bp Figure 18.5 • Another way to obtain a restriction map is via DNA sequencing – Computer programs can scan the DNA sequence of the hybrid vector and identify restriction enzyme sites Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-37 Polymerase Chain Reaction • Another way to copy DNA is a technique called polymerase chain reaction (PCR) – It was developed by Kary Mullis in 1985 • Unlike gene cloning, PCR can copy DNA without the aid of vectors and host cells Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-38 • The starting material for PCR includes – 1. Template DNA • Contains the region that needs to be amplified – 2. Oligonucleotide primers • Complementary to sequences at the ends of the DNA fragment to be amplified • These are synthetic and about 15-20 nucleotides long – 3. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) • Provide the precursors for DNA synthesis – 4. Taq polymerase • DNA polymerase isolated from the bacterium Thermus aquaticus • This thermostable enzyme is necessary because PCR involves heating steps that inactivate most other DNA polymerases Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-39 Figure 18.6 Binding of the primers to the DNA is called annealing • PCR is carried out in a thermocycler, which automates the timing of each cycle • All the ingredients are placed in one tube • The experimenter sets the machine to operate within a defined temperature range and number of cycles 18-40 Figure 18.6 • The sequential process of denaturing-annealingsynthesis is then repeated for many cycles With each successive cycle the relative amount of this type of DNA fragment increases. Therefore, after many cycles, the vast majority of DNA fragments only contain the region that is flanked by the two primers • A typical PCR run is likely to involve 20 to 30 cycles of replication – This takes a few hours to complete • After 20 cycles, a DNA sample will increase 220-fold (~ 1 million-fold) • After 30 cycles, a DNA sample will increase 230-fold (~ 1 billion-fold) 18-41 • The PCR reaction amplify a specific DNA segment – For this type of experiment, a researcher must have prior knowledge about the sequence of the template DNA • This, in order, to construct the synthetic primers • PCR can also be used to amplify chromosomal DNA semispecifically or nonspecifically – 1. Semispecific approach • Primers recognize a repetitive DNA sequence found at several sites within the genome – Therefore, many different DNA fragments will be amplified – 2. Nonspecific approach • A mixture of primers with many different random sequences is used – These will anneal randomly throughout the genome and amplify most of the chromosomal DNA Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-42 • PCR is also used to detect and quantitate the amount of RNA in living cells – The method is called reverse transcriptase PCR (RT-PCR) • RT-PCR is carried out in the following manner – RNA is isolated from a sample – It is mixed with reverse transcriptase and a primer that will anneal to the 3’ end of the RNA of interest – This generates a single-stranded cDNA which can be used as template DNA in conventional PCR – RT-PCR is extraordinarily sensitive • It can detect the expression of small amounts of RNA in a single cell Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-43 DETECTION OF GENES AND GENE PRODUCTS • Molecular geneticists usually want to study particular genes within the chromosomes of living species – This presents a problem, because chromosomal DNA contains thousands of different genes – The term gene detection refers to methods that distinguish one particular gene from a mixture of thousands of genes • Scientists have also developed techniques to identify gene products – RNA that is transcribed from a particular gene – Protein that is encoded in an mRNA Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-44 DNA Libraries • A DNA library is a collection of thousands of cloned fragments of DNA – When the starting material is chromosomal DNA, the library is called a genomic library – A cDNA library contains hybrid vectors with cDNA inserts Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-45 Cleave DNA with restriction enzyme Figure 18.7 18-46 Figure 18.7 18-47 • In most cloning experiments, the ultimate goal is to clone a specific gene • For example, suppose that a geneticist wishes to clone the rat b-globin gene – Only a small percentage of the hybrid vectors in a DNA library would actually contain the gene – Therefore, geneticists must have a way to distinguish those rare colonies from all the others • This can be accomplished by using a DNA probe in a procedure called colony hybridization Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-48 The filter is treated with detergent (SDS) to permealize the bacteria NaOH is added to denature the DNA A radioactively labeled probe that is complementary to the b-globin gene is then added Figure 18.8 18-49 • But how does one obtain the probe? – If the gene of interest has been already cloned, a piece of it can be used as the probe – If not, one strategy is to use a probe that likely has a sequence similar to the gene of interest • For example, use the rat b-globin gene to probe for the b-globin gene from another rodent – What if a scientist is looking for a novel type of gene that no one else has ever cloned from any species? • If the protein of interest has been previously isolated, amino acid sequences are obtained from it • The researcher can use these amino sequences to design short DNA probes that can bind to the protein’s coding sequence Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-50 Southern Blotting • Southern blotting can detect the presence of a particular gene sequence within a mixture of many – It was developed by E. M. Southern in 1975 • Southern blotting has several uses – 1. It can determine copy number of a gene in a genome – 2. It can detect small gene deletions that cannot be detected by light microscopy – 3. It can identify gene families – 4. It can identify homologous genes among different species Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-51 • Prior to a Southern blotting experiment, the gene of interest, or a fragment of a gene, has been cloned – This cloned DNA is labeled (e.g., radiolabeled) and used as a probe – The probe will be able to detect the gene of interest within a mixture of many DNA fragments Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-52 a) The steps in Southern blotting b) The transfer step An alternative type of transfer uses a vaccuum or nylon Figure 18.9 18-53 a) The steps in Southern blotting A common labeling method is the use of the radioisotope 32P Conditions of high temperature or high salt concentrations Probe DNA and chromosomal fragment must be nearly identical to hybridize The filter is placed in a solution containing a labeled probe The binding can be done under conditions of low or high stringency Excess probe is washed away and the filter is exposed to X-ray film Temperature and/or ionic strength are lower Probe DNA and chromosomal fragment must be similar but not necessarily identical to hybridize Gene of interest is found only in single copy in the genome Figure 18.9 Gene is member of a gene family composed of three distinct members 18-54 Northern Blotting • Northern blotting is used to identify a specific RNA within a mixture of many RNA molecules – It was not named after anyone called Northern! • Northern blotting has several uses – 1. It can determine if a specific gene is transcribed in a particular cell type • Nerve vs. muscle cells – 2. It can determine if a specific gene is transcribed at a particular stage of development • Fetal vs. adult cells – 3. It can reveal if a pre-mRNA is alternatively spliced Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-55 • Northern blotting is rather similar to Southern blotting • It is carried out in the following manner – – – – RNA is extracted from the cell(s) and purified It is separated by gel electrophoresis It is then blotted onto nitrocellulose or nylon filters The filters are placed into a solution containing a radioactive probe – The filters are then exposed to an X-ray film • RNAs that are complementary to the radiolabeled probe are detected as dark bands on the X-ray film Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-56 Figure 18.10 • Smooth and striated muscles produce a larger amount of tropomyosin mRNA than do brain cells – This is expected because tropomyosin plays a role in muscle contraction • The three mRNAs have different molecular weights – This indicates that the pre-mRNA is alternatively spliced Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-57 Western Blotting • Western blotting is used to identify a specific protein within a mixture of many protein molecules – Again, it was not named after anyone called Western! • Western blotting has several uses – 1. It can determine if a specific protein is made in a particular cell type • Red blood cells vs. brain cells – 2. It can determine if a specific protein is made at a particular stage of development • Fetal vs. adult cells Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-58 • Western blotting is carried out as such – Proteins are extracted from the cell(s) and purified – They are then separated by SDS-PAGE • They are first dissolved in the detergent sodium dodecyl sulfate – This denatures proteins and coats them with negative charges • The negatively charged proteins are then separated by polyacrylamide gel electrophoresis – They are then blotted onto nitrocellulose or nylon filters – The filters are placed into a solution containing a primary antibody (recognizes the protein of interest) – A secondary antibody, which recognizes the constant region of the primary antibody, is then added • The secondary antibody is also conjugated to alkaline phosphatase – The colorless dye XP is added • Alkaline phosphatase converts the dye to a black compound – Thus proteins of interest are indicated by dark bands 18-59 • Figure 18.11 shows the results of a Western blot for the b-globin polypeptide • This experiment indicates that b-globin is made in red blood cells but not in brain or intestinal cells Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-60 Techniques that Detect the Binding of Proteins to DNA • Researchers often want to study the binding of proteins to specific sites on a DNA molecule – For example, the binding to DNA of transcription factors • To study protein-DNA interactions, the following two methods are used – 1. Gel retardation assay • Also termed band shift assay – 2. DNA footprinting Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-61 • The technical basis for a gel retardation assay is this: – The binding of a protein to a fragment of DNA retards its rate of movement through a gel Lower mass and therefore fast migration Higher mass and therefore slow migration Figure 18.12 • Gel retardation assays must be performed under nondenaturing conditions – Buffer and gel should not cause the unfolding of the proteins not the separation of the double helix Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-62 • DNA footprinting was described originally by David Galas and Albert Schmitz in 1978 – They identified a DNA site in the lac operon that is bound by the lac repressor • This DNA site is, of course, the operator • The technical basis for DNA footprinting is this: – A segment of DNA that is bound by a protein will be protected from digestion by the enzyme DNase I • Figure 18.13 shows a DNA footprinting experiment involving RNA polymerase holoenzyme Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-63 Did not contain RNA pol holoenzyme Figure 18.13 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-64 In the absence of RNA pol holoenzyme, a continuous range of sizes occurs No bands in this range RNA pol holoenzyme is bound to this DNA region, and thus protects it from DNase I Figure 18.13 Thus RNA pol holoenzyme binds to an 80-nucleotide region (from -50 to +30) Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-65 ANALYSIS & ALTERATION OF DNA SEQUENCES • Analyzing and altering DNA sequences is a powerful approach to understanding genetics – A technique called DNA sequencing enables researchers to determine the base sequence of DNA • It is one of the most important tools for exploring genetics at the molecular level – Another technique known as site-directed mutagenesis allows scientists to change the sequence of DNA • This too provides information regarding the function of genes Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-66 DNA Sequencing • During the 1970s two DNA sequencing methods were devised – One method, developed by Alan Maxam and Walter Gilbert, involves the base-specific cleavage of DNA – The other method, developed by Frederick Sanger, is known as dideoxy sequencing • The dideoxy method has become the more popular and will therefore be discussed here Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-67 • The dideoxy method is based on our knowledge of DNA replication with a twist – DNA polymerase connects adjacent deoxynucleotides by covalently linking the 5’–P of one and the 3’–OH of the other (Refer to Fig. 11.10) – Nucleotides missing that 3’–OH can be synthesized Figure 18.14 2’, 3’-dideoxyadenosine triphosphate • Sanger reasoned that if a dideoxynucleotide is added to a growing DNA strand, the strand can no longer grow – This is referred to as chain termination Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-68 • Prior to DNA sequencing, the DNA to be sequenced must be obtained in large amounts – This is accomplished using cloning or PCR techniques • In many sequencing experiments, the target DNA is cloned into the vector at a site adjacent to a primer annealing site • In the experiment shown in Figure 18.15, the vector DNA is from a virus called M13 – After cloning, the viral DNA is introduced into the host cell – There it will produce single-stranded DNA as part of its life cycle • If double-stranded DNA is used as the template, it must be denatured at the beginning of the experiment Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-69 Figure 18.15 The newly-made DNA fragments can be separated according to their length by running them on an acrylamide gel They can then be visualized as bands when the gel is exposed to X-ray film Many copies of the primer, template DNA and radiolabeled dNTPs are mixed together They are then divided into four tubes, each containing a low concentration of a different dideoxynucleotide Sequencing ladder 18-70 • An important innovation in the method of dideoxy sequencing is automated sequencing – It uses a single tube containing all four dideoxyribonucleotides – However, each type (ddA, ddT, ddG, and ddC) has a differentcolored fluorescent label attached – After incubation and polymerization, the sample is loaded into a single lane of a gel Figure 18.16 Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-71 • The procedure is automated using a laser and fluorescent detector • The fragments are separated by gel electrophoresis – Indeed, the mixture of DNA fragments are electrophoresed off the end of the gel • As each band comes off the bottom of the gel, the fluorescent dye is excited by the laser – The fluorescence emission is recorded by the fluorescence detector • The detector reads the level of fluorescence at four wavelengths Figure 18.16 18-72 Site-Directed Mutagenesis • Analysis of mutations can provide important information about normal genetic processes – Therefore, researchers are constantly looking for mutant organisms • Mutations can arise spontaneously, or be induced by mutagens • Researchers have recently developed techniques to make mutations within cloned DNA Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-73 • One widely-used method is known as in vitro sitedirected mutagenesis – It allows the alteration of a DNA sequence in a specific way – The site-directed mutant can then be introduced into a living organism • This will allow the researchers to see how the mutation affects – The expression of a gene – The function of a protein – The phenotype of an organism • Mark Zoller and Michael Smith developed a protocol for the site-directed mutagenesis of DNA cloned in a viral vector Copyright ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display 18-74 Figure 18.17 The vector is the M13 virus which produces a single-stranded DNA as part of its life cycle Can be identified by DNA sequencing and used for further studies Depending on which base is replaced, the mutant or original sequence is produced 18-75
