Diagnostyka molekularna w medycynie i przemyśle spożywczym

Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny
Centrum Doskonałości ChemBioFarm
Katedra Mikrobiologii
Ul. Narutowicza 11/12
80-952 Gdańsk
Kierownik Katedry:
prof. dr hab. Józef Kur
Tel. 58 347 24 06
Fax. 58 347 18 22
[email protected]
http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Mikrobiologia/mikro.htm
Katedra Mikrobiologii - Skład osobowy
Pracownicy
prof. dr hab. Józef Kur – kierownik, tel. 347-23-02, [email protected]
dr inż. Paweł Sachadyn – adiunkt, tel.347-24-06, [email protected]
dr inż. Radosław Pladzyk – adiunkt, tel. 347-18-22, [email protected]
dr Elżbieta Hiszczyńska-Sawicka – adiunkt, tel. 347-16-05, [email protected]
dr Beata Krawczyk– adiunkt, tel. 347-23-83, [email protected]
dr inż. Hubert Cieśliński –adiunkt, tel. 347-18-22, [email protected]
dr inż. Rafał Piątek – adiunkt, tel. 347-16-05, [email protected]
dr Beata Zalewska – asystent, tel. 347-16-05, [email protected]
mgr inż. Marta Wanarska – asystent, tel. 347-26-18, [email protected]
Doktoranci
mgr inż. Marcin Olszewski, tel. 347-18-22, molsza.wp.pl
mgr inż. Paweł Filipkowski, tel. 347-26-18, [email protected]
mgr inż. Katarzyna Bury, tel. 347-16-05, [email protected]
mgr inż. Lucyna Holec, tel. 347-16-05, [email protected]
mgr inż. Artur Gąsior, tel. 347-16-05, [email protected]
mgr inż. Marta Mróz, tel. 347-18-22, [email protected]
mgr inż. Anna Długołęcka, tel. 347-18-22, [email protected]
mgr inż. Krzysztof Lewandowski, tel. 347-23-83, [email protected]
Antygeny rekombinowane
1. System ekspozycji powierzchniowej sekwencji antygenowych
- Escherichia coli Dr-BAM
• Skonstruowany szczep E. coli Dr-BAM zawiera zmodyfikowany
operon dra pozwalający na ekspresję chimerycznych fimbrii Dr.
Pojedyncza komórka bakteryjna na powierzchni posiada setki
struktur fimbrialnych typu Dr. Każda fimbria jest homopolimerem
zbudowanym z tysięcy kopii białka podjednostkowego DraE.
• Stworzony
bakteryjny
system
ekspozycji
sekwencji
antygenowych bazuje na wykorzystaniu białka DraE jako nośnika
heterogennych sekwencji antygenowych. Pozwala on na silną
amplifikację na powierzchni bakterii wybranej sekwencji
peptydowej poprzez jej umieszczenie w obrębie struktury białka
DraE stanowiącego podjednostkę budulcową fimbrii Dr.
Antygeny rekombinowane
2. Potencjalne możliwości zastosowania systemu ekspozycji
powierzchniowej Escherichia coli Dr-BAM
• Konstrukcja szczepów E. coli eksprymujących fimbrie Dr
eksponujące wybraną sekwencję antygenową - badania z
wykorzystaniem całych komórek bakteryjnych.
• Produkcja chimerycznych fimbrii Dr celem uzyskania wysoce
immunogennego materiału białkowego do produkcji przeciwciał
skierowanych przeciwko eksponowanej sekwencji peptydowej.
• Wykorzystanie chimerycznych fimbrii Dr jako bezpieczna
rekombinantowa szczepionka skierowana przeciwko patogenowi
z którego wywodzi się dana sekwencja epitopowa.
Antygeny rekombinowane
3. Zalety systemu ekspozycji powierzchniowej sekwencji
antygenowych Escherichia coli Dr-BAM
• Prosty i szybki proces konstrukcji rekombinantowego szczepu
E. coli eksprymującego określoną sekwencję peptydową.
• Możliwość ekspozycji różnych hydrofilowych sekwencji
antygenowych o wielkości od kilku do kilkunastu aminokwasów.
• Bardzo prosta i wydajna metoda izolacji dużych ilości
chimerycznych fimbrii Dr nie wymagająca zaawansowanych
technik chromatograficznych.
• Bardzo wysoka immunogenność struktur fimbrialnych Dr gwarancja uzyskania wysokiej odpowiedzi immunologicznej
przeciwko eksponowanej sekwencji antygenowej.
Antygeny rekombinowane
4. Zalety systemu ekspozycji powierzchniowej E. coli Dr-BAM
• Fimbrie Dr są strukturami unikalnymi tylko dla specyficznego
uropatogennego szczepu E. coli Dr+ - nie występują na powierzchni
komercyjnie dostępnych szczepów przeznaczonych do klonowania
oraz ekspresji.
• Poznanie na poziomie molekularnym mechanizmu tworzenia
fimbrii Dr oraz znajomość struktury białka DraE - potencjalna
możliwość dalszej adaptacji układu dla specyficznych zastosowań.
Literatura podstawowa:
1. Zalewska B, Piatek R, Konopa G, Nowicki B, Nowicki S, Kur J. Chimeric Dr fimbriae with a herpes simplex virus
type 1 epitope as a model for a recombinant vaccine. Infect Immun. 71:5505-13.
2. Piątek R, Zalewska B, Kolaj O, Ferens M, Nowicki B, Kur J. Molecular aspects of biogenesis of Escherichia coli Dr
Fimbriae: characterization of DraB-DraE complexes.
Infect Immun. 73:135-45.
Antygeny rekombinowane
5. Usługi świadczone w temacie powierzchniowej ekspozycji
sekwencji antygenowych w układzie Dr-BAM
• Konstrukcja szczepu E. coli Dr-BAM kodującego białko DraE z
wprowadzoną określoną sekwencją antygenową.
• Ustalenie optymalnych warunków produkcji chimerycznych
fimbrii Dr niosących określoną sekwencję antygenową.
• Produkcja i oczyszczanie chimerycznych fimbrii Dr.
• Uzyskanie przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko
sekwencji antygenowej.
Kontakt:
prof. dr hab. Józef Kur; [email protected]; tel. 347 23 02
dr Beata Zalewska; [email protected]; tel.: 347 16 05
dr inż. Rafał Piątek; [email protected]; tel.: 347 16 05
mgr inż. Katarzyna Bury; [email protected]; tel.: 347 16 05
Immunodiagnostyka toksoplazmozy – antygeny
rekombinowane
Toxoplasma gondii:


kosmopolityczny pierwotniak polikseniczny
bezwzględny pasożyt wewnątrzkomórkowy wywołujący toksoplazmozę
Toksoplazmoza:

choroba szeroko rozpowszechniona na całym świecie (liczba osób seropozytywnych w
Polsce wynosi około 60%)


wrodzona – istotny problem będący przyczyną aborcji lub wad wrodzonych u dzieci
systematyczne badania prenatalne (nie wykonywane obecnie w Polsce) odgrywałyby bardzo
istotną rolę we wczesnej identyfikacji zarażeń pasożytem oraz leczeniu
Testy diagnostyczne:

obecnie w stosowanych testach diagnostycznych wykorzystuje się głównie antygeny
natywne, a rekombinantowe białka antygenowe mogą być alternatywnym źródłem
antygenów
Prowadzone badania:


produkcja rekombinantowych białek antygenowych T. gondii w bakteryjnych systemach
ekspresyjnych Escherichia coli
oszacowanie przydatności otrzymanych antygenów w immunodiagnostyce
Oferta wdrożeń:
Prosty, szybki, czuły i tani serologiczny test
diagnostyczny różnicujący toksoplazmozę
ostrą i przewleką
Kontakt:
prof. dr hab. Józef Kur; [email protected]; tel. 347 23 02
mgr inż. Lucyna Holec; mgr inż. Artur Gąsior
Białka SSB-podobne Deinococcaceae i Thermaceae
– jako uniwersalne narzędzia w biologii molekularnej
Białka SSB-podobne:

Wiążą się z jednoniciowym DNA
Potencjalne zastosowanie w nauce i przemyśle:





Jako „wzmacniacz” reakcji PCR, multipleks PCR
Reakcje odwrotnej transkrypcji (RT)
Techniki analityczne, separacja DNA
Rekcje sekwencjonowania trudnych matryc
Inne techniki z zastosowaniem jednoniciowego DNA i RNA
Prowadzone badania:



Produkcja białek w bakteryjnym systemie ekspresyjnym Escherichia coli
Oczyszczanie, badanie właściwości
Otrzymywanie na skale komercyjną
Oferta szkoleń:
Oferta wdrożeń:
Precyzyjnie regulowane i kontrolowane w
czasie rzeczywistym hodowle
mikroorganizmów w bioreaktorze 5l.
Komercyjne preparaty w/w białek SSB
Kontakt:
prof. dr hab. Józef Kur; [email protected]; tel. 347 23 02
mgr inż. Olszewski Marcin ([email protected]) - termostabilne białka SSB Thermus aquaticus i T. thermophilus
mgr inż Filipkowski Paweł ([email protected]) – termostabilne i mezofilne białka z Deinococcus radiodurans, D.
geothermalis, D. radiopugnans
Zastosowanie białek TaqSSB i
TthSSB
Inne techniki
wykorzystujące
ssDNA i RNA
Reakcje PCR
Reakcje
multipleks PCR
Legenda:
Zastosowanie dowiedzione
Zastosowanie potencjalne
Reakcje
sekwencjonowania
trudnych matryc
Reakcje odwrotnej
transkrypcji (RT)
Techniki analityczne
- separacja DNA
Przykład użycia białka TaqSSB w reakcji PCR amplifikacji poddano fragment genu CMV
Wynik reakcji PCR w 2% żelu agarozowym
barwionym bromkiem etydyny. Reakcji
PCR podanno fragment genu CMV, który
amplifikowano w obecności białka TaqSSB,
jak i bez niego. U góry zaznaczono ilość
cząsteczek DNA (pCDNA21/CMV)
dla
każdej amplifikowanej próbki.
Termostabilne białko MutS jako narzędzie do wykrywania mutacji punktowych
MutS-SYBR-GOLD
MutS chroni niekomplementarne
DNA przed nukleazami
Retardacja DNA przez
MutS
MutS opóźnia migrację
niekomplementarnego DNA
Fuzyjne białka MutS
MutS - rozpoznaje niekomplemetarność w DNA.
Domena reporterowa - dostarcza silny sygnał.
mikropłytka
domena
reporterowa
MutS
DNA badane
fluorescencja = ochrona = mutacja
Oznaczenie w jednej
probówce, 360 ng DNA 200700 bp
1-3 g histag-MutS
niekomplementarnego DNA
opóźniane przez MutS
Bezbarwny
substrat
Immobilizowana
sonda
1-3 g histag-MutS,
50-200 ng produktu PCR
Oferta ekspertyz:
Oferta wdrożeń:
Komputerowa analiza sekwencji
nukleotydowych,
projektowanie układów do
diagnostyki PCR
Rekombinantowe szczepy do produkcji
białka histag- MutS
oraz fuzji MutS z GFP i -galaktozydazą
Kontakt:
dr inż. Paweł Sachadyn ([email protected])
dr inż. Anna Stanisławska-Sachadyn ([email protected])
Barwny produkt
hydrolizy
 Potencjalna możliwość detekcja mutacji
w genomowym DNA bez amplifikacji PCR
Diagnostyka molekularna w medycynie i przemyśle
spożywczym

Metody genotypowe identyfikacji i różnicowania bakterii w badaniach mikrobiologicznych w oparciu
o techniki PCR

Od ponad 10 lat w rutynowej diagnostyce chorób infekcyjnych wzrasta zastosowanie testów
opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych, takich jak PCR. Pozwala to na szybką diagnozę o
wysokim stopniu czułości i specyficzności.
Potencjalne zastosowanie:


wykrywanie i identyfikacja czynników infekcyjnych
rozwiązywanie problemów epidemiologicznych w oparciu o technikę ADSRRS-fingerprinting
Prowadzone badania:



konstrukcja kitu diagnostycznego opartego o technikę ADSRRS-fingerprinting
opracowywanie testów diagnostycznych do identyfikacji patogenów roznoszonych przez kleszcze
dla przesiewowych badań epidemiologicznych środowiska, oceniających stan zagrożenia tymi
patogenami dla ludzi
różnicowanie gatunków Borrelia burgdorferii sensu lato (B. burgdorferii sensu stricto, B.afzelii,
B.garini) oraz B.valaisiana i B.lusitaniae techniką recA-PCR/RFLP (nowa metoda szybkiej
identyfikacji gatunków należących do rodzaju Borrelia)
Kontakt:
Oferta szkoleń:
Oferta wdrożeń:
W zakresie technik biologii
molekularnej w badaniach
epidemiologicznych zakażeń
szpitalnych
Kity diagnostyczne w zakresie
przedstawionych badań
prof. dr hab. Józef Kur; [email protected]; tel. 347 23 02
dr Beata Krawczyk ([email protected]) - ADSRRS, recA-PCR/RFLP
mgr inż. Krzysztof Lewandowski ([email protected] ) - ADSRRS
Termostabilna β-D-galaktozydaza Pyrococcus woesei
oraz zimnolubna β-D-galaktozydaza
Pseudoalteromonas sp. 22b-produkcja i zastosowanie
Enzymy te:



katalizują reakcję hydrolizy wiązań β-1,4-glikozydowych
katalizują reakcję transglikozylacji
najbardziej znanym substratem tych enzymów jest cukier mleczny – laktoza
Potencjalne zastosowanie w przemyśle:




produkcja bezlaktozowego mleka i jego przetworów dla ludzi nie tolerujących laktozy
synteza oligosacharydów stosowanych jako probiotyczne dodatki do żywności
produkcja syropu glukozowo-galaktozowego dla na potrzeby przemysłu spożywczego
produkcja bezlaktozowej serwatki, składnika nowoczesnych pasz zwierzęcych
Prowadzone badania:



produkcja enzymu w bakteryjnym systemie ekspresyjnym Escherichia coli
produkcja enzymu w drożdżowym systemie ekspresyjnym Pichia pastoris
oczyszczanie, badanie właściwości i immobilizacja enzymu
Oferta szkoleń:
Klonowanie i ekspresja genów
w bakteryjnym i drożdżowym
systemie ekspresji.
Oferta wdrożeń:
Rekombinantowy szczep
Pichia pastoris do produkcji
β-D-galaktozydazy P. woesei.
Kontakt:
prof. dr hab. Józef Kur; [email protected]; tel. 347 23 02
mgr inż. Marta Wanarska ([email protected]) - Termostabilna β-D-galaktozydaza Pyrococcus woesei
dr inż. Hubert Cieśłiński ([email protected]) - zimnolubna β-D-galaktozydaza Pseudoalteromonas sp. 22b
PONADTO OFERUJEMY
Szkolenia w zakresie nowoczesnych technik
biologii molekularnej
 Projektowanie i wykonywanie
mikrobiologicznych testów diagnostycznych w
oparciu o technikę PCR
 Projektowanie i wykonywanie układów
ekspresyjnych E. coli i Pichia pastoris do
produkcji wybranych białek.
ZAPRASZAMY PAŃSTWA DO WSPÓŁPRACY
