PL/EP 1655032 PL/EP 1655032 T3

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
(96)
TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(19)
PL
Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
04.08.2004 04766900.7
(97)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
(11)
PL/EP 1655032
(13)
T3
(51) Int. Cl.
A61K31/53
A61K31/675
A61K31/185
A61P25/28
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
07.10.2009 Europejski Biuletyn Patentowy 2009/41
EP 1655032 B1
(54) Tytuł wynalazku:
Zastosowanie o-ATP lub BBG, antagonistów P2X7, do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia
rozsianego
(30) Pierwszeństwo:
ES20030001853
04.08.2003
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
10.05.2006 Europejski Biuletyn Patentowy 2006/19
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
31.03.2010 Wiadomości Urzędu Patentowego 03/2010
(73) Uprawniony z patentu:
UNIVERSIDAD DEL PAIS VASCO-EUSKAL HERRIKO UNIBERSITATEA, Leioa, ES
(72) Twórca (y) wynalazku:
PL/EP 1655032
T3
MATUTE ALMAU Carlos, LEIOA, ES
ALBERDI ALFONSO Elena, GETXO, ES
DOMERCQ GARCIA Maria, BILBAO, ES
PEREZ SAMARTIN Alberto, SOPELANA, ES
PEREZ CERDA Fernando, BILBAO, ES
TORRE MARTINEZ Iratxe, AMURRIO, ES
SANCHEZ GOMEZ Maria Victoria, GETXO, ES
(74) Pełnomocnik:
Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o.
rzecz. pat. Kiciak Krzysztof
02-770 Warszawa 130
skr. poczt. 37
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw
dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą
wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP 1 655 032 B1
Opis wynalazku
DZIEDZINA WYNALAZKU
5
[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny stwardnienia rozsianego, jak również zastosowania
substancji antagonistycznych wobec receptorów P2X7 obecnych w oligodendrocytach, do leczenia
wspomnianych chorób, a także kompozycji, które mogą zawierać wspomniane antagonisty.
TŁO WYNALAZKU
[0002] Stwardnienie rozsiane (SM) stanowi najbardziej powszechną chorobę demielinującą układu ner-
10
wowego. Na świecie dotyka ona półtora miliona ludzi, zaś jej objawy pojawiają się ogólnie u młodych
dorosłych, a zatem jej następstwa są bardzo poważne zarówno w aspektach osobistych, jak i ekonomiczno-społecznych.
[0003] Uważa się, że podatność na SM jest skutkiem nieznanych czynników genetycznych i środowiskowych. Częstość występowania choroby leży między 50 a 100 osób na 100000 mieszkańców obszarów
15
wysokiego ryzyka, które są zlokalizowane głównie w północnej części półkuli północnej, w Europie i
Ameryce. Ryzyko zapadnięcia na SM jest zwiększone 10-20-krotnie u krewnych w pierwszym stopniu
pokrewieństwa pacjentów, a współwystępowanie między bliźniakami jednojajowymi (jednakowymi genetycznie) jest zwiększone o 30%-50%, zaś u bliźniaków dwujajowych wzrasta tylko do 2%-5%. Podatność
genetyczna nie jest scharakteryzowana. Dotychczas zebrane dowody mogą świadczyć, że polega ona na
20
jakimś polimorfizmie genów, które kodują ludzkie antygeny leukocytów (HLA), glikoproteinę mieliny
oligodendrocytów (MOG), oraz innych genów z chromosomów 10 i 15.
[0004] Badacze SM zgadzają się co do tego, że ma ono dwie fazy, początkową fazę zapalną o naturze
autoimmunologicznej, i drugą fazę postępującego zwyrodnienia nerwów. W pierwszej aktywowane
limfocyty T przekraczają barierę krew-mózg, a kiedy już znajdą się w ośrodkowym układzie nerwowym,
25
uwalniają cytokiny prozapalne, które wyzwalają kaskadę immunologiczną, która kończy się zniszczeniem
mieliny i śmiercią oligodendrocytów. Wiedza o pewnych szczegółach procesu autoimmunologicznego
stała się przydatna do opracowania środków o charakterze immunomodulacyjnym, których skuteczności
terapeutyczne są bardzo skromne. Nie stworzono jednak leku, który opóźniałby lub zatrzymywałby
postęp fazy zwyrodnienia nerwów tej choroby, która podąża drogą postępującego pogorszenia stanu
30
neurologicznego i utraty czynności, a którą cechuje pojawienie się ciężkich demielinujących zmian
chorobowych w substancji białej z masową utratą oligodendrocytów, atrofią i ciężkim uszkodzeniem
aksonów. Dotychczas opisano różne cele dla interwencji podczas fazy zapalnej stwardnienia rozsianego
(Zamvil i Steinman, 2003, Neuron 38, 685-688). Między nimi znajdują się te, które są skierowane na
zmniejszenia zapalenia układu nerwowego, rozpoczynanego przez aktywację leukocytów T swoistych
35
wobec mieliny, które sprzyjają reakcji autoimmunologicznej szczególnie przeciwko składnikom mieliny,
wnikają do tkanku ośrodkowego układu nerwowego i są uwalniane w cytokinach prozapalnych, takich jak
interferon γ i czynnik martwicy nowotworów α. Immunomodulator interferon β, zatwierdzony do leczenia
hamującego-nawracającego stwardnienia rozsianego, zapobiega także oddziaływaniom komórkowym,
1
EP 1 655 032 B1
które prowadzą do wnikania aktywowanych limfocytów T przez śródbłonek naczyń. Inne sposoby
leczenia w fazie testów klinicznych skierowane są na zatrzymanie aktywności cytokin prozapalnych i/lub
przyspieszenie aktywności cytokin przeciwzapalnych. Niedawne badanie (Youssef i in., 2002, Nature
420, 78-84) wykazało, że lek atorwastatyna, stosowany do leczenia hipercholesterolemii, stanowi także
5
mocny immunomodulator, który zapobiega lub cofa przewlekłe doświadczalne alergiczne zapalenie
mózgu i rdzenia (EAE) drogą zwiększania wydzielania cytokin przeciwzapalnych i hamowania wytwarzania cytokin prozapalnych. Receptory purynergiczne stanowią typ receptora błonowego aktywowany
przez puryny pozakomórkowe, takie jak ADP i ATP, i który pośredniczy w różnych działaniach
biologicznych, takich jak modulacja aktywności neuronalnej, uwalnianie neurotransmiterów, glikogenoliza,
10
kurczliwość ścian naczyniowych, albo pewne procesy immunologiczne, itp. Receptory purynergiczne klasyfikuje się w dwóch dużych grupach o nazwach P1, dla których aktywacja zachodzi za pośrednictwem
adenozyny, oraz P2, dla których ligandami endogennymi są puryny ATP i ADP oraz pirymidyny UTP i
UDP. Receptory P1 przekazują sygnał do wnętrza komórki przez białka G, i zależnie od ich charakteru
cząsteczkowego, biochemicznego lub farmakologicznego dzielone są na cztery podgrupy: A1, A2A, A2B i
15
A3. Z kolei P2 dzielone są na jonotropowe (P2X) i metabotropowe (P2Y) (Barnard i in., 1997; Ralevic i
Burnstock, 1998).
[0005] W ostatnich latach wykazano, że receptory purynergiczne, poza udziałem w przekazywaniu
sygnałów typowych dla neurotransmisji, pośredniczą także w działaniu na komórki glejowe (Rathbone i
in., 1999). W rzeczywistości, wyrażanie receptorów purynergicznych w ośrodkowym układzie nerwowym
20
nie jest ograniczone tylko do neuronów, ale także obejmuje glej (Dunn i in., 2001; Franke i in., 2001a;
Stevens i in., 2002). W szczególności, przekazywanie sygnałów purynergicznych w astrocytach i
mikrogleju działa jako środek komunikacji glej-glej i glej-neuron (Fields i Stevens, 2000). Także niektóre
bardzo niedawne badania wykazują obecność receptorów funkcyjnych w oligodendrocytach in vitro
(Stevens i in., 2002), co wskazuje na odpowiedni udział w funkcjach typowych dla tego typu komórek. W
25
szczególności, Stevens i in. (2002) pokazują, że adenozyna uwalniania z aksonów wskutek aktywności
elektrycznej hamuje proliferację prekursorów gleju skąpodrzewiastego, stymuluje ich różnicowanie i
sprzyja tworzeniu mieliny.
[0006] Przekazywanie sygnału przez receptory purynergiczne jest także ważna dla żywotności komórek
w odpowiedzi na procesy patologiczne w mózgu (przegląd w publikacji Abbracchio i Burnstock, 1998).
30
Tak więc, są one zaangażowane w odpowiedzi glejowej na uszkodzenie nerwu (Franks i in., 2001b;
James i Butt, 2001), i w odpowiedzi naprawy ośrodkowego układu nerwowego przy pomocy wytwarzania
czynników trofowych w astrocytach (Ciccarelli i in., 2001). Z kolei, obecność ektonukleotydaz, które
rozkładają ATP na adenozynę, stanowi element ochrony nerwów w niedokrwieniu (Braun i in., 1998),
podczas gdy ATP powoduje śmierć komórek glejowych (Honda i Kohsaka, 2001).
35
[0007] Wiedza o zaangażowaniu układu purynergicznego w stwardnieniu rozsianym jest bardzo
ograniczona. Te informacje wskazują, że istnieją zmiany aktywności 5'-nukleotydazy, enzymu, który
rozkłada ATP na adenozynę. Ta aktywność jest wyższa w hodowanych przez kilka dni komórkach
jednojądrzastych krwi u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (Armstrong i in., 1988). Z kolei obszary
ośrodkowego układu nerwowego, gdzie powstają zmiany chorobowe typowe dla stwardnienia rozsianego,
2
EP 1 655 032 B1
mają niższą aktywność nukleotydazy (Ansari i in., 1978), co może dawać wyższe stężenia ATP
pozakomórkowego i zwiększoną aktywację receptorów purynergicznych P2.
[0008] Nowość niniejszego wynalazku polega na dokonanym przez część twórców odkryciu, że
podawanie określonej ilości pewnych antagonistów receptorów P2X7, wybranych spośród BBG lub
5
utlenionego ATP (dalej o-ATP), selektywnego inhibitora receptorów P2X7, powoduje ustępowanie
objawów choroby.
STRESZCZENIE WYNALAZKU
[0009] Problem do rozwiązania przez niniejszy wynalazek stanowi otrzymanie szeregu związków do
leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego.
10
[0010] Rozwiązanie przedstawione w niniejszym dokumencie opiera się na zdolności receptorów
purynergicznych P2X7 do zatrzymywania rozwoju wyżej wymienionej choroby w badaniach in vivo jak
również in vitro.
Wynalazek jest zilustrowany w przykładzie, gdzie opisano przeprowadzone przez twórców badania, w
których z jednej strony wykazano, że oligodendrocyty w hodowlach wyrażają na swojej powierzchni
15
receptory P2X7, a z drugiej, że ich aktywacja przy użyciu ATP powoduje wzrost stężenia wapnia w
cytosolu i, jeżeli stymulacja jest przedłużana, na koniec powoduje śmierć komórek. Podobnie, opisano
badania, w których wykazano w modelach in vivo i in vitro stwardnienia rozsianego, że leczenie
antagonistami receptorów purynergicznych P2X7 spowalnia rozwój choroby.
Zatem, jeden aspekt wynalazku odnosi się do zastosowania antagonistów receptorów P2X7, wybranych
20
spośród BBG lub o-ATP, do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego.
ZWIĘZŁY OPIS FIGUR
[0011]
Figura 1 pokazuje właściwości elektrofizjologiczne receptorów P2X w hodowanych oligodendrocytach.
Aktywacja wyżej wymienionych receptorów daje prąd wejściowy, który może zostać zwiększony pod
25
nieobecność jonów dwuwartościowych. Krzywe dawka-odpowiedź dla naturalnego antygenu endogennego, ATP, oraz jego analogów, takich jak BzATP, wskazują, że właściwości odpowiedzi są podobne
do właściwości odpowiedzi rekombinowanych receptorów P2X7 wyrażanych w układach heterologicznych.
Figura 2 pokazuje, że zarówno ATP jak i BzATP dają podwyższony wzrost stężenia wapnia wewnątrz-
30
komórkowego, któremu zapobiega obecność PPADS, antagonisty P2X i P2Y o szerokim zakresie
działania, a także eliminowanie wapnia ze środowiska pozakomórkowego. Widać też, że odpowiedzi
zwiększają się w obecności propofolu i są hamowane przez o-ATP, selektywnego antagonistę receptorów
P2X7.
Figura 3 pokazuje, że stosowanie ATP lub BzATP przez 15 minut powoduje śmierć oligodendrocytów w
35
hodowli. Śmierć zależy od wapnia, gdyż jego eliminacja z pożywek hodowlanych prowadzi do niewywoływania jej. Antagonista o szerokim zakresie działania, PPADS, ma zdolność zapobiegania jej, jeżeli jest
podawany jednocześnie z agonistami.
3
EP 1 655 032 B1
Figura 4 pokazuje, że przy pomocy selektywnego antagonisty P2X7, o-ATP, można zapobiec śmierci
gleju skąpodrzewiastego powodowanej przez ATP.
Figura 5 pokazuje wyrażanie in situ receptorów P2X w oligodendrocytach nerwu wzrokowego przy pomocy technik immunohistochemicznych stosujących przeciwciała swoiste. Zaobserwowano, że receptory
5
P2X2, P2X4 i P2X7 (zielone) występują bardzo obficie w oligodendrocytach (czerwonych) nerwu
wzrokowego. Barwa żółta wskazuje zachodzenie obu barw na siebie, a więc wyżej wymienione receptory
są obficie wyrażane w oligodendrocytach. W taki sam sposób jasne jest, że nie są one wyrażane bardzo
licznie w astrocytach.
Figura 6 pokazuje jak powolny wlew (1 μl/godzinę) BzATP (100 mM) powoduje zmiany chorobowe w
10
nerwie wzrokowym, w którym można zauważyć uszkodzenie tkanki z astroglejozą i mikroglejozą, jak
również zanik mieliny w uszkodzonym obszarze i rozpadanie się aksonów.
Figura 7 pokazuje, że szczury, u których indukowano EAE, mają ciężkie objawy neurologiczne, które
obejmują porażenie kończyn, a nawet śmierć. Jednak leczenie przy użyciu o-ATP przed wystąpieniem
objawów powoduje niemal całkowity zanik objawów.
15
Figura 8 pokazuje jak po dwunastu dniach od wywołania EAE, podawanie o-ATP powoduje zniknięcie
objawów neurologicznych powodowanych przez chorobę.
Figura 9 pokazuje, że przy EAE nie zmieniają się znacznie poziomy receptorów P2X2, jednak drastycznie
spadają poziomy receptorów P2X7. Wskazuje to, że następuje utrata komórek, które je wyrażają, głównie
oligodendrocytów.
20
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
[0012] Pierwszy aspekt wynalazku odnosi się do zastosowania antagonistów receptorów purynergicznych P2X7 do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego. Autoimmunizacja wymaga
aktywacji precyzyjnej kaskady procesów w komórkach układu immunologicznego. Jedna część tych
komórek, makrofagi i limfocyty, wyraża receptory P2X1, P2X2, P2X5 i P2X7, i aktywacja tych ostatnich
25
powoduje uwalnianie cytokin prozapalnych takich jak czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α) oraz IL-1β,
jak również apoptozę przez mechanizmy, które wciąż nie zostały scharakteryzowane (Burnstock, 2002,
Arteriorscler. Thromb. Vasc. Biol. 22, 364-373). Jednak dokładne funkcje, w których pośredniczą
receptory P2X w układzie immunologicznym, wciąż nie są dobrze zrozumiane. Właśnie to wyrażanie
receptorów P2X w komórkach układu immunologicznego sprawia, że zastosowanie antagonistów
30
receptorów P2X jest przydatne do leczenia chorób autoimmunologicznych.
[0013] Wśród antagonistów receptorów P2X są takie, które nazywa się antagonistami o szerokim
zakresie działania dzięki faktowi, że mogą się one wiązać do kilku różnych spośród rodziny receptorów
P2X, chociaż przy różnych powinowactwach wobec każdego z nich; oraz inne, które są selektywne
wobec grupy receptorów z rodziny P2X.
35
[0014] Następujące wzory przedstawiają niektóre z tych antagonistów receptorów P2X o szerokim
zakresie działania. Tylko związki o wzorze VII i IX stanowią część niniejszego wynalazku.
4
EP 1 655 032 B1
CHO
HO
Me
N
N
O
N
PO3Na2
NaO3S
SO3Na
(I)
CHO
HO
Me
N
N
O
N
PO3Na2
SO3Na
NaO3S
(II)
NaO3S
O
N
H
SO3Na
NaO3S
SO3Na
O
N
H
NaO3S
Me
Me
O
NH
HN
SO3Na
O
O
N
H
5
N
H
(III)
SO3Na
Me
N
NH2
SO3Na
OH
OH
NaO3S
N
N
N
Me
SO3Na
(IV)
5
NH2
EP 1 655 032 B1
O
NaO3S
H
N
HN
O
H
N
NH
SO3Na
O
NaO3S
SO3Na
SO3Na
SO3Na
(V)
SO3Na
H
N
NaO3S
H
N
NaO3S
HN
H
N
H
N
O
O
NaO3S
H
N
O
O
O
SO3Na
(VI)
CH2CH3
NCH2
SO3
CH3
-
CH3
C
CH3CH2O
NH
NCH2
CH2CH3
SO3Na
5
SO3Na
SO3Na
NaO3S
SO3Na
HN
SO3Na
H
N
NaO3S
O
O
NH
O
O
N
H
N
H
(VIII)
6
H
N
O
SO3Na
SO3Na
SO3Na
EP 1 655 032 B1
[0015] Następujące wzory przedstawiają selektywne antagonisty receptorów P2X:
NH2
N
O
O
N
( xNa )
O
N
N
HO P O P O P O CH2CHOCH
OH
OH
OH H C C H
O
O
(IX)
N
N
N
O
O
N
S
Me
O
O
S
O
O
N
5
(X)
CHO
HO
Me
PO(ONa)2
SO3Na
O
N
N N
NO2
SO3Na
(XI)
7
EP 1 655 032 B1
O
NH2
SO3H
Cl
N
O
N
H
N
H
N
N
SO3H
HN
SO3H
(XII)
[0016] Związki poprzednio przedstawione wzorami strukturalnymi to:
■ PPADS (sól tetrasodowa kwasu pirydoksalofosforano-6-azofenylo-2',4'-disulfonowego) (I)
5
■ izoPPADS (sól tetrasodowa pirydoksalofosforano-6-azofenylo-1',4'-disulfonowego) (II)
■ Suramina (sól heksasodowa kwasu 8,8'-[karbonylobis[imino-3,1-fenylenokarbonyloimino(4-metylo-3,1fenyleno)karbonyloimino]]bisnaftaleno-1,3,5-trisulfonowego) (III)
■ błękit Evansa (sól tetrasodowa kwasu 6,6'-[(3,3'-dimetylo[1,1'-bifenylo]-4,4'-diylo)bis[4-amino-5hydroksy-1,3-naftalenodisulfonowego]) (IV)
10
■ NF023 (sól heksasodowa kwasu 8,8'-[karbonylobis[imino-3,1-fenylenokarbonyloimino]bis-1,3,5-naftalenotrisulfonowego] (V)
■ NF279 [sól heksasodowa kwasu (8,8'-[karbonylobis(imino-4,1-fenylenokarbonyloimino-4,1-fenylenokarbonyloimino))bis(1,3,5-naftalenotrisulfonowego] (VI)
■ CBB-G (błękit brylantowy Coomassie G) (VII)
15
■ NF449 (sól oktasodowa kwasu 4,4',4",4"'-(karbonylobis(imino-5,1,3-benzenotriilobis(karbonyloimino)))tetrakis-benzeno-1,3-disulfonowego) (VIII)
■ o-ATP (sól sodowa adenozyno-5-trifosforanu, utleniona nadjodanem) (IX)
■ KN-62 (ester kwasu 4-[(2S)-2-[(5-izochinolinylosulfonylo)metyloamino]-3-okso-3-(4-fenylo-1-piperazynylo)propylo]fenyloizochinolinosulfonowego) (X)
20
■ PPNDS (sól tetrasodowa pirydoksalo-5'-fosforano-6-(2'-naftylazo-6'-nitro-4',8'-disulfonianu) (XI)
■ RB2 (kwas 1-amino-4-[[4-[[4-chloro-6-[[3 (lub 4)-sulfofenylo]amino]-1,3,5-triazyn-2-ylo]amino]-3-sulfofenylo]amino]-9,10-dihydro-9,10-diokso-2-antracenosulfonowy) (XII)
[0017] Poza tymi wymienionymi wcześniej istnieją inne antagonisty o szerokim zakresie działania takie
25
jak MRS2220 (cykliczny pirydoksyno-α4,5-monofosforano-6-azo-fenylo-2',5'-disulfonian), Ip51 (sól pentapotasowa P1,P5-diinozyno-5-pentafosforanu) o TNP-ATP (sól mono-litowa 2',3'-O-2,4,6-trinitrofenyloadenozyno-5'-trifosforanu), jak również selektywne, takie jak, na przykład, HMA (5-(N,N-heksametyleno)amiloryd).
[0018] IC50 dla niektórych z powyższych związków w odniesieniu do różnych podgrup receptorów PX2
zestawiono w Tabeli 1.
8
EP 1 655 032 B1
Tabela 1- IC50 antagonistów P2X w odniesieniu do każdego z podtypów receptorów P2X
Podtypy P2X
P2X1
P2X2
P2X3
P2X4
Antagonisty:
IC50 (μM)
PPADS: 1-5
PPADS: 2
PPADS: 1
Suramina:
1-5
Suramina:
1-5
Suramina: 3
Suramina:
178
NF023: 0,21
NF023: 63
NF023: 29
NF023: > 100
NF279: 002
NF279: 0,77
NF279: 1,6
NF279: > 30
P2X5
PPADS: 27,5 PPADS: 2,6
Suramina: 4
P2X6
P2X7
PPADS:
> 100
PPADS: 4,2
Suramina:
> 100
Suramina: 4
NF279: 2,8
KN-62: 0,015
Błękit
Evansa:
1-400
Błękit
Evansa:
1-400
izoPPADS:
1-5
Błękit
Evansa:
1-400
Błękit
Evansa:
1-400
Błękit
Evansa:
1-400
Błękit
Evansa:
1-400
Błękit
Evansa:
1-400
izoPPADS: 1
RB-2: 1
HMA: 4,5
o-ATP 5
Ip51: 0,003
Ip51: 3
MRS2220: 10
MRS2220: 58
NF449: 0,01
NF449:
<0,006
BBG: > 10
BBG: 0,01
TNP-ATP: 15
TNP-ATP:
> 30
PPNDS:
0,015
TNP-ATP:
0,001
TNP-ATP: 1
TNP-ATP:
0,001
[0019] W korzystnym wariancie wykonania, jeden z wyżej wymienionych antagonistów stanowi selektywny antagonista receptorów P2X7, o-ATP. W badaniach, które przeprowadzili twórcy (patrz przykład
5
dalej), wykazano, że ten związek jest szczególnie przydatny do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów
stwardnienia rozsianego dzięki względnej ważności obecności receptorów P2X7 w oligodendrocytach w
porównaniu z innymi receptorami P2X.
[0020] Korzystny inhibitor o szerokim zakresie działania stanowi BBG. Korzystny wariant wykonania
rozważa kompozycję farmaceutyczną, która zawiera co najmniej o-ATP, selektywnego antagonistę
10
receptorów P2X7.
[0021] W następującym przykładzie opisano szczegółowo przeprowadzone przez twórców badania,
które ilustrują podstawę wynalazku.
9
EP 1 655 032 B1
PRZYKŁAD
I- PROCEDURY DOŚWIADCZALNE
Hodowle oligodendrocytów
[0022] Hodowle komórkowe nerwu wzrokowego noworodka szczura (P12) prowadzono zgodnie z usta5
lonymi procedurami, które dostosowano i wprowadzono do laboratorium zgodnie z niedawnym opisem
(Matute i in., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8830-8835).
Pomiary elektrofizjologiczne w oligodendrocytach in vitro
[0023] Pomiary elektrofizjologiczne wykonywano na hodowlach 2- do 5-dniowych, i zgodnie z zaleceniami podanymi w poprzednich pracach (Patneau i in. 1994, Neuron 12: 357-371). Komórki mierzono w
10
komorze, która umożliwiała zmienianie środowiska pozakomórkowgo przy pomocy stałego przepływu
(0,5-1 mL/min). Elektrody rejestrujące stanowiły kapilary szklane, które zawierały określone roztwory
zgodne ze stężeniami jonów w cytoplazmie. Badanie odpowiedzi za pośrednictwem receptorów purynergicznych prowadzono techniką "whole-cell plaster-clamp", mierząc prądy wytwarzane przez zewnętrzne
nanoszenie selektywnych agonistów i antagonistów wyżej wymienionych receptorów.
15
Pomiar poziomów wapnia w cytosolu w hodowlach oligodendrocytów
[0024] Stężenie wapnia w cytosolu określano sposobem Grynkiewicza i in. (1985; J. Biol. Chem. 260,
3440-3450). Oligodendrocyty traktowano przy użyciu 5 mM Fura-2/AM, a następnie przemywano i
obserwowano pod mikroskopem inwersyjnym Zeissa wyposażonym w monochromator, obiektyw
imersyjny 40X, wysokorozdzielczą kamerę cyfrową Orca, i oprogramowanie AquaCosmos (Hamamatsu
20
Photonics). Badano zmiany poziomów wapnia w cytosolu w odpowiedzi na agonisty i antagonisty, w
obecności i pod nieobecność wapnia pozakomórkowego. Kalibrację przeprowadzono na koniec badań
przy pomocy kolejnego nanoszenia jonomycyny i EGTA, i stężenie wapnia szacowano stosując pomiar
stosunku dla 340/380 nm.
Doświadczenia na wydzielonym nerwie wzrokowym
25
[0025] Od młodych dorosłych szczurów pobierano nerwy, i perfundowano przez 30 min w sztucznym
płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF) nasyconym tlenem przez barbotowanie 95% tlenu i 5% CO2, w
warunkach porównywalnych do opisanych dla oligodendrocytów w hodowli (Fern i Möller, 2000, J.
Neurosci. 20:34-42). Następnie inkubowano je z agonistami i antagonistami receptorów purynergicznych
na różny okres czasu. Później, nerwy perfundowano przez 1 do 24 godzin przy użyciu normalnego aCSF
30
nasyconego tlenem. Po upływie tego czasu oceniano uszkodzenie histologicznie, jak twórcy opisali dla in
vivo (Matute, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10229-10234), i analizowano zmiany biochemiczne,
które leżą u podstaw tego uszkodzenia.
Metody immunochemiczne w hodowlach oligodendrocytów, nerwu wzrokowego i tkanki nerwowej
zwierząt doświadczalnych
35
[0026] Do badania obecności znaczników linii gleju skąpodrzewiastego, składników mieliny, astrocytów i
mikrogleju stosowano handlowe przeciwciała. Techniki obejmowały immunocytochemię, immunohisto10
EP 1 655 032 B1
chemię i odbitki immunologiczne (Western blot), które wszystkie są opisane szczegółowo (patrz na
przykład, Domercq i in., 1999, Eur. J. Neurosci. 11, 2226-2236)
Nanoszenie substancji na nerw wzrokowy in vivo
[0027] Doświadczenia na nerwie wzrokowym przeprowadzono na królikach (rasy nowozelandzki biały)
5
które, dzięki swojej wielkości, pozwalają na lepsze manipulacje w chirurgii doświadczalnej. Stosowana
była procedura taka jak opisano poprzednio (Matute, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 10229-10234).
Agonisty receptorów purynergicznych nanoszono przy użyciu mikropomp osmotycznych, które uwalniały
małe ilości substancji rozpuszczonej przez ustalony czas. Później wpływ tego nanoszenia na nerw
oceniano przy pomocy zestawu znaczników oligodendrocytów i ich bezpośrednich przodków, mieliny,
10
całości aksonów, astroglejozy i mikroglejozy.
Wprowadzenie doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE)
[0028] Użyto szczurów rasy Lewis, które immunizowano podskórnie zasadowym białkiem mieliny w
tylne łapy (100 mikrogramów/zwierzę w 100 mikrolitrach) i adiuwantem Freunda z 5,5 mg/ml mykobakterii
gruźlicy H37Ra. Rdzeń kręgowy ekstrahowano, gdy zwierzęta miały objawy choroby (12-14 dni po
15
immunizacji) i przy użyciu technik immunochemicznych (immunoblot i immunohistochemicznych) analizowano wyrażanie receptorów purynergicznych.
II- WYNIKI
Charakterystyka prądów przy udziale receptorów P2X w oligodendrocytach
[0029] ATP (1 mM) indukuje prąd wejściowy, który nie ulega odczuleniu w większości badanych
20
oligodendrocytów (77,3 % ± 7,9; n = 47; Fig. 1a). Analog ATP, 2',3'-O-(4-benzoilo-4-benzoilo) (BzATP,
100 μM), który stanowi antagonistę receptorów P2X o szerokim zakresie działania, lecz o wyższym
powinowactwie wobec receptora P2X7 (Ralevic & Burnstock, 1998), także indukował podobne
odpowiedzi (Fig. 1a). Z drugiej strony, α,β-metyleno-ATP (α,β-Me-ATP, 100 μM), selektywny agonista
P2X1, P2X3 i heteromerów P2X2/3, nie wytwarzał prądów w oligodendrocytach. Zaobserwowano, że
25
amplituda prądów wytwarzanych przez ATP i BzATP zależy od stężenia odpowiedniego agonisty (Fig.
1a) (EC50 = 8,77 mM i 0,52 mM, odpowiednio). Podobnie, można ocenić, że nieobecność Mg2+ i Ca2+,
które zwiększają stężenie ATP4-, postaci aktywnej receptorów P2X, zwiększa odpowiedzi 4-10-krotnie
(Fig. 1a).
[0030] Z kolei PPADS, antagonista o szerokim zakresie działania (100 μM), zupełnie blokował prądy
30
indukowane przez ATP (Fig. 1). Natomiast utleniony ATP (o-ATP), preferencyjny antagonista receptorów
P2X7, częściowo blokuje prądy ATP. Z kolei, Cu2+ (1 mM), który stanowi selektywny inhibitor receptorów
P2X7 (Virginio i in., 1997), zmniejsza prądy ATP, zaś propofol (60 μM), czynnik wzmacniający receptory
P2X4, nie zmienia tych prądów. Te wyniki wskazują, że receptory P2X obecne w oligodendrocytach mają
elektrofizjologiczne właściwości zgodne z przeważającym występowaniem podjednostki P2X7.
35
Aktywacja receptorów P2X zwiększa poziomy Ca2+ w cytosolu
[0031] [Ca2+]i monitorowano po naniesieniu ATP i BzATP w celu scharakteryzowania skutków aktywacji
receptorów P2X na oligodendrocytach. Te komórki odpowiadają na ATP (10 μM) gwałtownym wzrostem
11
EP 1 655 032 B1
podstawowego [Ca2+]i (250 ± 65 nM) w cytosolu do 1200 ± 468 nM (Fig. 2a). Te odpowiedzi są
hamowane w obecności PPADS (50 μM) i pod nieobecność Ca2+ w roztworze do inkubacji. Te wyniki
wskazują, że wzrosty [Ca2+]i są skutkiem wchodzenia Ca2+ przez błonę plazmatyczną, a nie skutkiem
uwalniania go z depozytów wewnątrzkomórkowych.
5
[0032] Bz-ATP (0,01-1 mM) także aktywuje wchodzenie Ca2+ do oligodendrocytów w sposób zależny
od dawki (Fig. 2b, d). Ten efekt znika pod nieobecność pozakomórkowego Ca2+ i jest blokowany przez
PPADS (Fig. 2b, d). Te wyniki sugerują, że receptory P2X, które zawierają podjednostkę P2X7, stanowią
główne mediatory odpowiedzi na ATP. Zgodnie z tym poglądem, o-ATP, selektywny agonista P2X7 (1
mM) (Fernandez i in., 2001), zmniejsza wzrost [Ca2+] indukowany przez Bz-ATP o 63 ± 8 (Fig. 2d, e). Z
10
kolei propofol (60 μM), który wyzwala odpowiedzi za pośrednictwem P2X4 (Tomioka i in., 2000), sprzyja
wzrostowi [Ca2+]i wytwarzanemu przez 0,1 i 1 mM ATP odpowiednio w 60% ± 22 i 77% ± 34 (Fig. 2c, d).
Zatem natywne receptory P2X, które zawierają P2X4, także przyczyniają się do indukowanego przez
ATP wchodzenia wapnia do oligodendrocytów.
Aktywacja receptorów P2X indukuje zależną od Ca2+ śmierć gleju skąpodrzewiastego
15
[0033] We wszystkich testowanych stężeniach ATP (0,01-1 mM), u 15-27% oligodendrocytów
następowała śmierć, która jest hamowana w obecności 50 μM PPADS i po usunięciu Ca2+ z pożywki do
hodowli (Fig. 3a). W taki sam sposób agonista Bz-ATP powodował toksyczność podobną do ATP (Fig.
3b). Inne agonisty receptorów purynergicznych takie jak ATP-γ-S, który stanowi analog bardziej trwały niż
ATP, oraz α,β-meATP, są także toksyczne dla oligodendrocytów, co wyklucza możliwość, że metabolity
20
ATP mogą być środkami powodującymi toksyczność po aktywowaniu receptorów różnych od P2X. W
sumie testy toksyczności pokazały, że oligodendrocyty są wrażliwe na aktywację receptorów P2X przez
ATP i jego analogi.
Oligodendrocyty wyrażają receptory P2X w oligodendrocytach in vitro i in situ
[0034] Analiza immunohistochemiczna wyrażania receptorów P2X przy użyciu swoistych przeciwciał w
25
hodowlach zróżnicowanych oligodendrocytów (GalC+/MBP+) pokazuje, że te komórki mają głównie
podjednostki P2X2, P2X4 i P2X7 (patrz Tabela 2).
Tabela 2. Wyrażanie receptorów P2X w hodowlach oligodendrocytów.
Podjednostka
Wyrażanie
P2x1
+/-
P2x2
++
P2x3
---
P2x4
++
P2x5
+/-
P2x6
+/-
P2x7
++
[0035] Ten profil wyrażania jest spójny z właściwościami elektrofizjologicznymi i charakterystyką
30
toksyczności obserwowaną w tych hodowlach. Także, rozmieszczenie podjednostek obserwowane in
vitro także odpowiada temu, które obserwuje się in situ w nerwie wzrokowym (Tabela 3) przy pomocy
podwójnego znaczenia podjednostek i przeciwciał swoistych wobec linii komórkowych gleju skąpodrzewiastego i astrogleju (Fig. 5).
12
EP 1 655 032 B1
Tabela 3. Rozmieszczenie receptorów P2X w oligodendrocytach w nerwie wzrokowym szczura
Podjednostka
P2X1
P2X2
P2X3
P2X4
P2X5
P2X6
P2X7
Rozmieszczenie
-
+++
-
+++
+
-
+++
Te wyniki histochemiczne potwierdzono metodą Western blot (immunoprzeniesienia).
ATP zabija oligodendrocyty in situ
5
[0036] W celu określenia, czy ATP jest toksyczny dla oligodendrocytów w preparacie tkanki nerwowej
bez dysocjacji, całe nerwy wzrokowe pobrane od dorosłych szczurów perfundowano sztucznym płynem
mózgowo-rdzeniowym z ATP (100 μM) przez 3 h. W tych warunkach uzyskano ponad trzykrotny wzrost
liczby komórek, które wykazywały kondensację jądrową, w porównaniu z nerwami kontrolnymi perfundowanymi bez ATP (Fig. 5). Zniszczone komórki znajdują się na osi podłużnej nerwu i stanowią część
10
międzypęczkowych rzędów oligodendrocytów. Stymulacja przy użyciu ATP w obecności PPADS (10 μM)
zapobiega śmierci oligodendrocytów.
[0037] Następnie, agonisty ATP-γ-S i BzATP wlewano na nerw wzrokowy, stosując pompy osmotyczne,
które uwalniały bardzo małe ilości substancji rozpuszczonej przez 3 dni. Badanie histologiczne nerwów 7
dnia po rozpoczęciu nanoszenia wykazało uszkodzenie tkanki w obszarze ograniczonym do bliskości
15
kaniuli (Fig. 6). Ta strefa miała także intensywną gliozę, brak mieliny i zniszczenie aksonów (Fig. 6). W
sumie te wyniki wskazują, że aktywacja P2X zabija oligodendrocyty in situ i że zmiany chorobowe in vivo
mają właściwości typowe dla płytek stwardnienia rozsianego.
Blokowanie P2X7 polepsza objawy ruchowe ostrego i przewlekłego EAE
[0038] Badano działania antagonisty o szerokim zakresie działania PPADS i bardziej selektywnego o-
20
ATP przy wyłączaniu i włączaniu przebiegu EAE indukowanego przez immunizację szczurów rasy Lewis
zasadowym białkiem mieliny. Szczury immunizowane wykazywały oznaki niedoborów ruchowych około
10 dni po wstrzyknięciu i osiągały maksimum w 14 dniu (Fig. 7). Leczenie przy pomocy PPADS (30
mg/kg, dwa razy dziennie) od 7 do 14 dni po wstrzyknięciu nie polepszyło objawów lub przebiegu
choroby. Z drugiej strony stosowanie o-ATP (1 i 5 mg/kg, co 12 h) przez ten sam okres zmniejszyło lub
25
zapobiegło wystąpieniu objawów typowych dla EAE (Fig. 7).
[0039] Później, oceniano skuteczność o-ATP przy polepszaniu objawów EAE w modelu przewlekłymnawracającym-ustępującym. W tym celu szczury DA immunizowano syngenicznym rdzeniem kręgowym,
przy czym po 7-9 dniach od wstrzyknięcia obserwowano wystąpienie ciężkich niedoborów neurologicznych, które swój pierwszy szczyt osiągnęły około 11 dnia. Leczenie przy pomocy o-ATP (2,5 mg/kg,
30
co 12 h), kiedy ustaliło się maksimum natężenia objawów, zmniejszyło objawy, a także wyeliminowało
objawy typowe dla fazy przewlekłej (Fig. 8).
[0040] W celu zrozumienia mechanizmu działania, przez który o-ATP polepsza prognozę EAE, stosując
metodę Western blot oceniano poziomy receptorów P2X7, na które działa korzystna postać tego leku w
rdzeniu kręgowym lędźwiowo-krzyżowym, obszarze najbardziej dotkniętym w tej chorobie doświad-
35
czalnej. Twórcy wynalazku stwierdzili, że poziomy tej podjednostki były zmniejszone o połowę u zwierząt
poddanych EAE, i że te poziomy wracały do poziomów kontrolnych u tych zwierząt z EAE, które
13
EP 1 655 032 B1
potraktowano o-ATP (Fig. 9). Te wyniki wskazują, że leczenie przy pomocy o-ATP chroni przed
umieraniem te komórki, które wyrażają P2X7, a zatem oligodendrocyty, które stanowią główny typ
komórek, które wyrażają tę podjednostkę w rdzeniu kręgowym.
III- DYSKUSJA
5
[0041] Pokazane poprzednio wyniki pokazały po raz pierwszy, że oligodendrocyty mają receptory P2X.
Podobnie podane są w szczegółach elektrofizjologiczne, farmakologiczne i cząsteczkowe właściwości
tych receptorów, jak również ich zwiększona przepuszczalność dla wapnia. Ta ostatnia właściwość
powoduje, że oligodendrocyty mogą być wrażliwe na intensywny i/lub długotrwały bodziec za pośrednictwem tych receptorów, jak wykazano dla glutamergicznych receptorów w tej populacji komórek
10
(Matute i in., 2001, Trends Neurosci. 24, 224-230). Wrażliwość oligodendrocytów na sygnały przenoszone za pośrednictwem receptorów P2X stanowi jedną z przyczyn zniszczenia tkanki nerwowej, która
leży u podstaw choroby doświadczalnej, EAE, modelu stwardnienia rozsianego. Na koniec, blokowanie
receptorów P2X7 aż do wyłączenia choroby drastycznie zmniejsza objawy neurologiczne w ostrej EAE, i
poprawia wynik i prognozę w przewlekłej EAE, kiedy objawy się ustaliły.
15
[0042] Opisany niniejszym wynalazek stanowi środek do leczenia stwardnienia rozsianego, choroby, na
którą nie ma skutecznych sposobów leczenia, które spowalniałoby lub zatrzymywało jej postęp. Drogi
interwencji, które spowodowały opracowanie leków w fazie testów klinicznych lub do stosowania jako leki
do leczenia stwardnienia rozsianego mają mechanizmy działania, które regulują funkcjonowanie układu
immunologicznego. Fakt, że blokowanie P2X7 może zapobiegać objawom ostrego EAE, modelu SM,
20
który naśladuje fazę zapalną/autoimmunologiczną choroby, wskazuje, że te leki mogą w rzeczywistości
być mocnymi środkami immunomodulującymi, które mogą zapobiegać autoimmunizacji, co wyłącza SM i
inne choroby. Na koniec, antagonisty receptorów P2X7, będąc środkami chroniącymi przed śmiercią
oligodendrocyty, populację komórek, która doznaje największego zniszczenia w SM, mają wielki potencjał
terapeutyczny w fazie zwyrodnienia nerwów tej choroby, fazie, która ciągnie się przez całe dziesięciolecia
25
i w której pacjenci cierpią na postępujące pogorszenie, które przebiega z zaburzeniami ruchowymi i
czuciowymi, powodując inwalidztwo.
ODNOŚNIKI
[0043]
- Abbracchio, M. P. i Burnstock, G. (1998) Purinergic signalling: pathophysiological roles. Jpn. J.
30
Pharmacol. 78: 113-145.
- Ansari KA, Rand A, Loch JA (1978) Biochemical and immunological studies with human optic and
olfactory tracts J. Neuropathol. Exp. Neural 37:756-67
- Armstrong MA, Shah S, Hawkins SA, Bell AL, Roberts SD (1988) Reduction of monocyte 5'-nucleotidase activity by gamma-interferon in multiple. Ann Neural 24:12-6
35
- Barnard, E. A., Simon, J. i Webb, T. E. (1997). Nucleotide receptors in the nervous system. An
abundant component using diverse signal transduction mechanisms. Mol. Neurobiol. 15: 103-129.
- Braun, N., Zhu, Y., Krieglstein, J., Clumsee, C. i Zimmermann, H. (1998). Upregulation of the enzyme
chain hydrolysing extracellular ATP after transient forebrain ischemia in the rat. J. Neurosci. 18: 489114
EP 1 655 032 B1
4900.
- Ciccarelli, R. Ballerini, P., Sabatino, G., Rathbone, M. P., D'Onofrio, M.. Caciagli, F. i Iorio, P. (2001).
Involvement of astrocytes in purine-mediated reparative processes in the brain. Int. J. Dev. Neurosci. 19:
395-414.
5
- Dunn, P.M., Zhong, Y. i Burnstock, G. (2001). P2X receptors in peripheral neurons. Prog. Neurobiol.
65:107-134.
- Fields, R.D. i Stevens, B. (2000). ATP: an extracellular signalling molecule between neurons and glia.
Trends Neurosci. 23: 625-633.
- Franke, H., Grosche, J., Schädlich, H., Krügel, U., Allgaier, C. i Illes, P. (2001a). P2X receptor
10
expression on astrocytes in the nucleus accumbens of rats. Neuroscience 108: 421-429.
- Franke, H., Krugel, U., Schmidt, R., Grosche, J., Reichenback, A. i Illes, P. (2001b). P2 receptor-types
involved in astrogliosis in vivo. Brit. J. Pharmacol. 134: 1180-1189.
- Honda, S. i Kohsaka, S. (2001). Regulation of microglial cell function by ATP. Nihon Shinke 21: 89-93.
- James, G. i Butt, A. M. (2001). Changes in P2Y and P2X purinoceptors in reactive glia following axonal
15
degeneration in the rat optic nerve. Neurosci. Lett. 212: 33-36.
- Matute C, Alberdi E, Domercq M, Pérez-Cerdá F, Pérez-Samartin A i Sanchez-Gomez MV (2001) The
link between excitotoxicity and demyelinating diseases. Trends Neurosci. 24, 224-230.
- Matute C, Alberdi E, Ibarretxe G i Sánchez-Gómez MV (2002) Excitotoxicity in glial cells. Eur. J.
Pharmacol 447: 239-246.
20
- Queiroz, G., Gebicke-Haerter, P. J., Schobert, A., Starke, K. i von Kugelgen, I. (1997). Release of ATP
from cultured rat astrocytes elicited by glutamate receptor activation. Neuroscience 78: 1203-1208.
- Ralevic, V. i Burnstock, G. (1998) Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50: 413-492.
- Rathbone, M. P., Meddlemiss, P. J., Gysbers, J. W., Andrew, C., Herman, M. A., Reed, J. K., Ciccarelli,
R. Di Iorio, P. i Caciagli, F. (1999). Trophic effects of purines in neurons and glia. Prog. Neurobiol. 59:
25
663-690.
- Stevens, B, Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V. i Fields, R. D. (2002) Adenosine: a neuron-glial transmitter
promoting myelination in the CMS in response to action potentials. Neuron 36: 855-868.
- Zamvil, S.S. i Steinman L. (2003) Diverse targets for intervention during inflammatory and neurodegenerative phases of multiple sclerosis. Neuron 38, 685-688.
30
Zastrzeżenia patentowe
1.
35
Zastosowanie o-ATP lub BBG, antagonisty receptorów purynergicznych P2X7, do wytwarzania
leku do leczenia fazy zwyrodnienia nerwów stwardnienia rozsianego, u ssaków, włącznie z człowiekiem.
15
EP 1 655 032 B1
16
EP 1 655 032 B1
17
EP 1 655 032 B1
18
EP 1 655 032 B1
5
19
EP 1 655 032 B1
20
EP 1 655 032 B1
21
EP 1 655 032 B1
5
22
EP 1 655 032 B1
23
EP 1 655 032 B1
5
24