Sposób otrzymywania nowego typu roślin, zdolnych do wiązania

(12) OPIS PATENTOWY (19)PL
RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(21)Numer zgłoszenia.
(22)
Data zgłoszenia:
(13) B1
309470
09.04.1993
(8 6) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
09.04.1993, PCT/HU93/00020
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(
(30)
5
4
)
(8 7) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego.
Pierwszeństwo:
(73)
Zgłoszenie ogłoszono:
O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.06.1997 WUP 06/97
B1
PL 171864
7
Uprawniony z patentu:
Piacfejlesztési Alapitvány, Budapeszt, HU
Varga Szilard Sandor, Budaors, HU
(72)
(74)
( 5
A01H 4/00
À 0 1 H 17/00
Sposób otrzymywania nowego typu roślin,
zdolnych do wiązania azotu również w swoich liściach
07.08.1995 BUP 16/95
(45)
(51)Int.C l.6:
28.10.1993, WO93/20685,
PCT Gazette nr 26/93
10.04.1992,HU, P01218/92
(43)
(11) 171864
Twórca wynalazku:
Szilard S. Varga, Budaörs, HU
Pełnomocnik:
W ierzchoń Jan, JAN W IERZCH O Ń &
PARTNERZY, Biuro Patentów i Znaków Towarowych Sp.c.
) 1. Sposób otrzymywania nowego typu roślin, zdolnych do wiązania azotu również w
swoich liściach, przez szczepienie bakteriami i następnie kultywowanie otrzymanej kultury
w temperaturze 15-35°C, znamienny tym, że roślinę protoplasty, komórki, tkanki, zarodki
lub organy, hodowane lub poddane obróbce in vitro szczepi się bakteriami z rodziny
Azotobacteraceae, i tak otrzymaną kulturę następnie kokultywuje się, w razie potrzeby
rozmnaża się i/lub regeneruje się całą roślinę w warunkach in vitro na pożywce zawierającej
azot i główne źródło/a węgla, wykorzystywanego tylko przez komórki roślinne oraz ewentualnie inne substancje uzupełniające.
Sposób otrzymywania nowego typu roślin,
zdolnych do wiązania azotu również w swoich liściach
Zastrzeżenia
patentowe
1. Sposób otrzymywania nowego typu roślin, zdolnych do wiązania azotu również w
swoich liściach, przez szczepienie bakteriami i następnie kultywowanie otrzymanej kultury w
temperaturze 15-35°C, znamienny tym, że roślinę protoplasty, komórki, tkanki, zarodki lub
organy, hodowane łub poddane obróbce in vitro szczepi się bakteriami z rodziny Azotobactera
ceae, i tak otrzymaną kulturę następnie kokultywuje się, w razie potrzeby rozmnaza się i/lub
regeneruje się całą roślinę w warunkach in vitro na pożywce zawierającej azot i główne źródło/a
węgla, wykorzystywanego tylko przez komórki roślinne oraz ewentualnie inne substancje
uzupełniające.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się bakterie ze szczepu Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia i Derxia należące do rodziny Azotobacteraceae.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do inokulacji wykorzystuje się komórki,
cysty lub inne formy bakterii, częściowo lub całkowicie pozbawione ścian komórkowych.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło węgla stosuje się laktozę,
maltozę, galaktozę, cellobiozę, skrobię, rafinozę i/lub sorbit, które są przyswajalne tylko przez
komórki roślinne.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że główne źródło/a węgla dostarcza się do
pożywki w koncentracjach co najmniej 10 g/l, korzystnie w koncentracjach 20-40 g/l.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku bakterii pozbawionych ścian
komórkowych główne źródło/a węgla dostarcza się do pożywki w koncentracjach 0,35-0,75 M.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wartość pH pożywki utrzymuje się, w
przypadku szczepów Azotobacter, Azomonas lub Derxia, w granicach 5,5-9,5, a w przypadku
bakterii ze szczepu Beijerinckia w granicach 3,0-9,5.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku użycia szczepów Azotobacter
i Azomonas używa się, jako inne domieszki, CaCCO3 w koncentracji do 0,5 g/l i/lub CaCl2 w
koncentracji do 0,2 g/l.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako inne domieszki stosuje się dodatkowe
źródło/a węgla, korzystnie sacharozę lub glukozę poza tym witaminy, aminokwasy i substancje
wzrostowe (regulatory) roślin.
***
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowego typu roślin, zdolnych do
wiązania azotu również w swoich liściach.
Znane jest, że azot jest czynnikiem ograniczonym w uprawie roślin, ponieważ dostarczanie
azotu poprzez sztuczne nawożenie, pomimo że jest ono efektywne, jest bardzo kosztowne i
nadzwyczaj szkodliwe dla środowiska naturalnego. Nowa koncepcja uprawy, zyskująca coraz
szersze rozpowszechnienie na świecie, koncepcja "rozwoju możliwego do zachowania" zamiast
stosowania zewnętrznych źródeł, preferuje wykorzystanie zasobów wewnętrznych. Zgodnie z
tym, zamiast stosowania nawozów sztucznych, celowe jest wykorzystać możliwości kryjące się
w biologicznym wiązaniu azotu do zabezpieczenia roślinom potrzebnej jego ilości [Plant and
Soil, 141, 1-12 (1992)]. Do wiązania azotu z atmosfery zdolne są jednak tylko pewne prokarioty
(diazotrofy). Tak zwane aerobowe bakterie, które są zdolne do efektywnego wiązania azotu także
przy atmosferycznych koncentracjach tlenu, należące do szczepów Azomonas, Azotobacter,
Bijerinekia i Derxia z rodziny Azotobacteracea [Bergey’s Manual of Determinative Bacterology,
8th ed., 1974, p.253, Baltimore: Williams and Wilkinsjnie potrafią jednak w sposób naturalny
171 864
3
wcielać się w wewnętrzne przestrzenie tkanek roślinnych [Azotobacteraceae: the Taxonomy and
Ecology of the Aerobic Nitrogen-fixing Bacteria. Academic Press, New York(1979)] i tam
rozmnożyć się, chociaż udowodniono, że są one zdolne do pokrycia zapotrzebowania pewnych
roślin w azot poprzez osadzanie się na korzeniach lub zewnętrznych powierzchniach liści [J.Gen.
Microbiol. 71 , 103-116 (1972); J.Gen. Appl. Microbiol. 25 , 261-271 (1979); Can. J. Bot.69,
2296-2298 (1991)] Tak zwane diazotrofy mikroaerofilowe, wiążące azot przy niskim poziomie
tlenu, są tylko zdolne do tworzenia endosymbiozy w przestrzeniach międzykomórkowych
[Nitrogen-fixing Bacteria in Nonleguminous Crop Plants, 84-88, (1987) Sci.Tech. Publishers/Spring-Verlag, Madison, WI) i do wiązania gazu N 2 w korzeniach, daleko od miejsc w
których zachodzi proces fotosyntezy.
Dotychczas zostały przeprowadzone dwa doświadczenia na kokultywację Azotobactera i
komórek roślinnych w warunkach in vitro:
W pierwszym doświadczeniu [Nature 252, 393-395 (1974)] kokultywowano adenin-auto
trofowy zmutowany szczep Azotobacter vinelandii z komórkami marchwi, na pożywce zawierającej sacharozę a pozbawionej azotu, albo zawierającą azot w niewystarczającej ilości do
wzrostu komórek. Tak powstałe kultury kallusa mieszanego rosły przez 18 miesięcy i wykazały
zdolność wiązania azotu jak również można było zaobserwować bakterie między żyjącymi
komórkami rośliny.
Jednak sposób ten miał wiele wad i niedogodności ponieważ użyto w doświadczeniu
autotrofowego mutanta, z gatunku Azotobacter, trudnego do izolacji z powodu dużej liczby
chromosomów [J.Bacteriol., 138 , 871-877 (1979)]; kultury rosły bardzo wolno; system jest
niestabilny w obecności azotu; nie udało się regenerować roślin; możność zastosowania sposobu
jest ograniczona do paru, intensywnie badanych gatunków, z powodu malej ilości szczepów
autotrofowych.
W drugim przypadku [Z. Pflanzenphysiol.,95, 141-147 (1979)] bakterie przerosły tkankę
roślinną, niszcząc ją, dlatego to nie było możliwości wyhodowania rośliny zdolnej do wiązania
azotu 1 do dłuzszej hodowli.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest opracowanie takiego sposobu, który wyeliminuje
znane i powyżej opisane wady i niedogodności i który w prosty sposób stworzy możliwość do
wyhodowania w warunkach in vitro takiej rośliny, która zawierałaby w swoich przestrzeniach
wewnętrznych bakterie z rodziny Azotobacteraceae, i która zdolna by była do wiązania azotu
również w swoich liściach.
Przedmiotem wynalazku jest stwierdzenie, że wprowadzenie do wewnętrznych przestrzeni
roślin drogą in vitro i osiedlenie się tam, szybko rosnących i zdolnych do wiązania azotu przy
poziomie tlenu atmosferycznego, heterotrofów i prototrofów należących do rodziny Azotobacteraceae, jest możliwe przy takim poziomie składników odżywczych , który jest optymalny do
hodowli tkanek w warunkach in vitro, ale nie jest najkorzystniejszą koncentracją dla roślinypartnera.
Stwierdziliśmy mianowicie, że stosując takie składniki odżywcze, komórki roślinne i
bakteryjne mogą rozwijać się równomiernie i harmonijnie, podczas gdy na pożywkach tradycyjnych używanych w hodowli kultury tkanek roślinnych w warunkach in vitro, bakterie rozwijają
się bardzo szybko i przerastają tkanki rośliny-gospodarza i niszczą ją.
Następnie, przedmiotem wynalazku jest stwierdzenie, że równomierny wzrost dwóch
partnerów w warunkach in vitro zapewnia źródło/a węgla, które ulega przemianie materii tylko
w roślinach to znaczy jest metabolizowany tylko przez komórki roślinne, i jako produkt
przemiany materii zużytkowany jest do wzrostu bakterii w stopniu potrzebnym do ich równoległego rozwoju.
Stwierdzenie to jest dlatego zaskakujące, ponieważ w kokultywacji wzrost kultur roślinnych odbywa się kosztem takich źródeł węgla, które są słabo wykorzystywane przez roślinne
komórki, i które są używane w większości przypadków w badaniach przemiany materii, a bardzo
rzadko w kulturach in vitro.
Następną podstawą wynalazku jest stwierdzenie, że dla obiektów roślinnych, kokultywo
wanych z bakteriami wiążącymi azot, jest również niezbędne zapewnienie optymalnego źródła
azotu w pożywce, po to, aby z kultur z dużym prawdopodobieństwem rozwijało się jak najwięcej
4
171 864
całych roślin, co oznacza, że dla uformowania symbiozy in vivo nie jest potrzebna symbioza in
vitro, a cel ten może zostać osiągnięty drogą niesymbiotycznej kokultywacji. Powyższe stwierdzenie jest dlatego zaskakujące, ponieważ do tej pory panował pogląd, według którego, w
podobnych kokultywacjach kulturom roślinnym powinno się zapewnić pożywki bez azotu lub
z niską jego zawartością, po to, aby wzrost tkanek roślinnych był uzależniony od wiązania azotu
przez bakterie.
Na końcu, podstawą wynalazku jest stwierdzenie, że bakterie ze szczepu Azotobacter,
Azomonas, Beijerinckia i Derxia mogą być użyte do wyhodowania nowej rośliny wiążącej azot.
Jest to dlatego zaskakujące, ponieważ zgodne z naszą dotychczasową wiedzą, te tzw. wolnoży
jące bakterie nie osiedlają się w wewnętrznych przestrzeniach roślin w warunkach in vivo i nie
są skłonne do tak ścisłej asocjacji w warunkach naturalnych [Azotobacteraceae: the Taxonomy
and Ecology of the Aerobic Nitrogen-fixing Bacteria, Academic Press, New York (1979)].
Rozszerzenie symbioz wiążących azot na nowe gatunki roślin może być dokonane nie
tylko poprzez dalszy rozwój dotychczas znanych naturalnych symbioz lub ścisłych asocjacji
endofitów [Plant Soil, 141 , 13-39, (1992)].
Na podstawie powyższych stwierdzeń przedmiotem wynalazku jest sposób wyhodowania
rośliny zdolnej do wiązania azotu również w swoich liściach. Zgodnie z wynalazkiem, roślinne
protoplasty, komórki, tkanki, zarodki lub organy hodowane i/lub traktowane w warunkach in
vitro inokulujemy z bakteriami z rodziny Azotobacteraceae i tak otrzymane kultury kokultywu
jemy w warunkach in vitro w temperaturze od 15 do 30°C, w przypadkach pożądanych
rozmnażamy je i/lub regenerujemy całą roślinę na pożywce zawierającej azot i główne źródła
węgla, zużywane tylko przez rośliny, jak również, jeśli zajdzie potrzeba, i inne składniki, przy
tej samej temperaturze.
Gatunki z rodzaju Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia i Derxia należące do rodziny
Azotobacteraceae są raczej użyte jako bakterie heterotroficzne, zdolne do wiązania azotu przy
atmosferycznym poziomie tlenu.
Do szczepienia korzystnie używamy komórek wegetatywnych i cyst bakterii pozbawionych częściowo lub całkowicie ścian komórkowych
Jako główne źródło/a węgla stosujemy głównie laktozę, maltozę, galaktozę, cellobiozę,
skrobię, rafinozę i/lub sorbit, które jest/są wykorzystywane tylko przez komórki roślinne. Te
główne źródło/a węgla celowo jest dodawać do pożywki w koncentracji przynajmniej 10 g/l,
korzystniej w koncentracji 20-40 g/l. W przypadku bakterii pozbawionych częściowo lub
całkowicie ścian komórkowych główne źródło/a węgla celowo jest używać w koncentracji
0,35-0,75 M.
W sposobie według wynalazku wartość odczynu kwasowego (pH) pożywki korzystnie jest
przybliżyć do wartości pH optymalnej do wzrostu bakterii. W przypadku bakterii należących do
szczepu Azotobacter, Azomonas i Derxia wartość ta równa się 5,5-9,5, natomiast dla bakterii ze
szczepu Beijerinckia 3,0-9,3.
W sposobie według wynalazku, w danym przypadku, w okresie kokultywacji, dodatkowe
zapotrzebowanie na Ca+2, niezbędne do wzrostu niektórych gatunków ze szczepu Azotobacter i
Azomonas, korzystnie jest pokrywać przez dodanie do pożywki CaCO3 w koncentracji 0,1-0,5
g/l i/lub CaCl2 w koncentracji 0,05-0,2 g/l.
Do wyhodowania rośliny wiążącej azot i do jej rozmnażania korzystne jest używać metod
in vitro stosowanych w hodowli protoplastów, komórek, kallusa, tkanek, zarodków i liściem jak
i w mikrorozmnażaniu.
W sposobie według wynalazku korzystne jest stosowanie składników takich jak sacharoza
i glukoza, które są wykorzystywane przez bakterie również jako "dodatkowe" źródła węgla jak
i witaminy, aminokwasy i substancje wzrostowe przyspieszające wzrost.
Rysunek pierwszy przedstawia zdjęcie spod mikroskopu elektronowego pokazujące powiększone 16000 razy komórki Azomonas agilis osiadłe w przestrzeniach międzykomórkowych
w szypułkach marchwi.
Rysunek drugi przedstawia zdjęcie spod mikroskopu elektronowego, które przedstawia
komórki bakterii Azomonas insignis osiadłe w przestrzeniach międzykomórkowych liści marchwi powiększone 18000 razy.
171 864
5
Główne zalety sposoby wynalazku.
a) Roślina wyhodowana tym sposobem jest zdolna do wiązania azotu również w liściach
i dlatego nie wymaga ona, albo w bardzo małym stopniu, nawożenia azotem.
b) Mogą być użyte w jednakowym stopniu bakterie autotroficzne i prototroficzne.
c) Można stosować tradycyjne metody in vitro.
d) Zapewnia jednocześnie zrównoważony wzrost rośliny i bakterii.
e) Endosymbioza roślina-bakteria może być stosunkowo szybko osiągnięta.
f) W sposobie można użyć jakąkolwiek roślinę i każdą część rośliny.
g) Powołana do życia symbioza może być szybko rozmnożona przy pomocy metody in
vitro, szczególnie przy pomocy mikrorozmnażania.
h) Efektywność nowej, wiążącej azot rośliny, można zwiększyć poprzez zastosowanie
bakterii-mutanta produkującego w nadmiarze nitrogenazę i/lub wydzielającą w dużej
ilości przyswojony azot.
Wynalazek ilustrują, nieograniczając jego zakresu, następujące przykłady:
P r z y k ł a d I. Po wymyciu resztek sacharozy zawiesinę komórek marchwi szczepiliśmy
zawiesiną komórek (106- 108 komórek/ml; komórki wegetatywne i cysty) bakterii Azotobacter
vinelandii (DSM 87), następnie tak otrzymaną mieszaninę komórek umieściliśmy na pożywce
agarowej MS [(Physiol.Plant. 15, 473-494, (1962)] zawierającą 2,4-dichlorfenoksy-kwas octowy (2,4D), hormon roślinny sprzyjający powstawaniu kallusa, w koncentracji 0,5 mg/l oraz
laktozę w ilości 30 g/l jako jedynie źródło węgla i sole mineralne (pH=6,2). Kultury hodowano
w temperaturze od 17 do 22°C. Tak powstałe kallusy przesadziliśmy na podobną pożywkę MS
tylko pozbawioną 2,4 D i dalej hodowaliśmy w podobnych warunkach.
W ten sposób otrzymane całe rośliny wysadziliśmy do ziemi i po 2 miesiącach, po
uprzednim wysterylizowamu powierzchni liści (0,2% HgCl2, 1,5 minut) i homogenizowaniu,
oznaczyliśmy zawartość bakterii w liściach. Jeden gram świeżych liści zawierał 104-105 bakterii.
Doświadczenie powtórzyliśmy na tej samej MS pożywce z tą różnicą, ze pożywka nie zawierała
2,4 D. Zawiesinę komórek roślinnych szczepiliśmy bakteriami Azotobacter vinelandii (DSM 87)
i umieściliśmy na pożywce agarowej MS nie zawierającej 2,4 D i hodowaliśmy je w temperaturze
17-22°C. Tak otrzymane rośliny były analizowane tak samo jak rośliny otrzymane z kallusa
wyrastającego na pożywce zawierającej hormon 2,4 D.
Zawartość bakterii w liściach zasadniczo była taka sama (104- 105 bakterii/g świeżej masy
liści). Wiązanie azotu w liściach badano metodą redukcji acetylenu w atmosferze zawierającej
objętościowo 10% acetylenu bez sterylizacji powierzchni (755 mmoli CaH4/g świeżej masy
liści/24 godziny) lub po wysterylizowaniu powierzchni liści (530 mmoli C 2H 4/g świeżej masy
liści/24 godziny). Liście były inkubowane przez 14 godzin na świetle (1200 lux) i przez 10 godzin
w ciemności przy temperaturze 25°C. Pożywka zawierała 0,1 g/l CaCO3 jako dodatkowe źródło Ca2+.
P r z y k ł a d E. Kallus marchwi uzyskiwano w podobny sposób jak zostało to opisane w
przykładzie nr I, stosując w tym przypadku komórki Azomonas agilis (DSM 375), następnie był
on kokultywowany i regenerowano z niego roślinę na pożywce zawierającą jako główne źródło
węgla laktozę w ilości 30 g/l i sacharozę w ilości 0,1 g/i jako dodatkowe źródło węgla (pH=7,3)
w temperaturze 27-32°C.
Ilość osiadłych bakterii w zregenerowanych roślinach wykazaliśmy przy pomocy mikroskopu elektronowego licząc bakterie po uprzedniej sterylizacji powierzchni rośliny (105- 106
bakterii/g świeżej masy korzeni; 106- 107 komórek bakterii/g świeżej masy liści).
Rysunek 1 przedstawia zdjęcia spod mikroskopu elektronowego gdzie jedynką oznaczono
przestrzeń międzykomórkową, dwójką osiadły w niej mikroorganizm, trójką natomiast chloroplasty komórek. Po uprzedniej sterylizacji powierzchniowej 1 gram liści redukował 278 nmoli
acetylenu do etylenu, natomiast 1 gram korzeni 266 nmoli w ciągu jednego dnia.
P r z y k ł a d III. Zawiesinę komórek marchwi szczepiliśmy komórkami bakterii Azomonas
insignis (ATCC-12523) w podobny sposób jak w przykładzie nr I. Pożywka zawierała jako
główne źródło węgla galaktozę w ilości 30 g/l i glukozę w ilości 2,5 g/l jako dodatkowe źródło
węgla (pH=8,3; 27-33°C; CaCl2 0,1 g).
Zawartość bakterii w zregenerowanej roślinie była wykazana przy pomocy mikroskopu
elektronowego (105 bakterii/g świeżej masy liści) i była mierzona również aktywność wiązania
6
171 864
azotu (430 nmoli C2H4/g świeżej masy liści po jednym dniu inkubacji). Rysunek nr 2 przedstawia
zdjęcie wykonane mikroskopem elektronowym gdzie jedynką oznaczono przestrzeń międzykomórkową, dwójką osiadły w niej mikroorganizm, trójką natomiast chloroplasty komórek
roślinnych.
P r z y k ł a d IV. Kultury pędów tytoniu, w miejscu nacięć, szczepiliśmy komórkami
Azolobacter paspali (ATCC 23833) pozbawionych ścian komórkowych (forma L) i inkubowano
na pożywce zawierającej penicilinę G w koncentracji 100 ppm i stabilizującą pożywkę glukozę
w koncentracji 0,5 M. Tak otrzymane kultury hodowano przez 2 miesiące na pożywce zawierającej maltozę w koncentracji 0,5 M i penicilinę (pH=7,3; CaCO3 0,25 g).
Następnie kultury były hodowane na pożywce pozbawionej peniciliny G i z obniżoną
koncentracją maltozy do 10 g/l. Po wysadzeniu roślin,po uprzedniej powierzchniowej sterylizacji, oznaczyliśmy aktywność wiązania azotu w liściach (800 nmoli C 2H 2 /g świeżej masy liści/24
godziny).
P r z y k ł a d V. Zawiesinę komórek marchwi szczepiliśmy zawiesiną komórek bakterii
Beijerinckia mobilis (DSM 2326) tak jak w przykładzie nr I i kultury te kokultywowano na
pożywce zawierającą laktozę w ilości 40 g/l (pH=5,4, bez dodatku Ca 2+). Aktywność wiązania
azotu w liściach zregenerowanej rośliny wykazano testem redukcji acetylenu (180 nmoli C 2H 2/g
świeżej masy liści/24 godzin).
P r z y k ł a d VI. Po szczepieniu komórek marchwi zawiesiną komórek Derxia gumnosa
(ATCC 15994) w sposób opisany w przykładzie nr III (pH=7,2) aktywność wiązania azotu w
liściach zregenerowanej rośliny była wykazana testem redukcji acetylenu.
171 864
Fig. 2
171 864
Fig.
1
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz.
Cena 2,00 zł