Wpływ zróżnicowanego zasolenia wody oraz soli biogenicznych

Wpływ zróżnicowanego zasolenia wody oraz
stężenia soli biogenicznych zawierających
fosfor, azot i krzem na liczebność populacji
Heterosigma akashiwo, oraz ocena stopnia
adaptacji tego glonu w warunkach wód Morza
Bałtyckiego.
Autor: Magdalena Kownacka
Klasa: IIIE
Opiekun: mgr Katarzyna Kudela
Szkoła: XIV Liceum Ogólnokształcące w Gdyni
Streszczenie
Celem przeprowadzonych doświadczeń było zbadanie wpływu zróżnicowanego zasolenia
wody oraz rozpuszczonych w niej soli biogenicznych zawierających fosfor, azot i krzem na
liczebność populacji Heterosigma akashiwo oraz próba oceny adaptacji tego glonu do warunków
fizyczno - chemicznych wód Bałtyku Południowego.
Badania przeprowadziłam w laboratorium Morskiego Instytutu Rybackiego – Państwowego
Instytutu Badawczego w Gdyni.
Biorąc pod uwagę wyniki doświadczenia, można wywnioskować, że:
1) największe tempo wzrostu H. akashiwo zanotowano w próbie hodowanej na pożywce, w której
sole biogeniczne zostały dodane w stosunku Redfield’a. Natomiast najniższe tempo wzrostu
zanotowano w pożywce bez azotu, co świadczy o tym, że optymalne warunki dla wzrostu
liczebności H. akashiwo stwarza podłoże przygotowane w proporcji Redfield’a, zaś najbardziej
istotnym czynnikiem dla wzrostu populacji H. akashiwo jest wysoka zawartość azotanów w
środowisku;
2) w wodzie o temperaturze 15°C optymalnym zasoleniem dla rozwoju H. akashiwo jest 36 psu,
przy którym zaobserwowano najwyższą liczebność populacji badanego glonu;
3) w Zatoce Gdańskiej znajdują się warunki mogące stymulować wzrost H. akashiwo.
Wstęp
Heterosigma akashiwo (Y.Hada) Y.Hada ex Y.Hara & M.Chihara, 1987 jest morskim
przedstawicielem klasy Raphidophyceae, gromady Heterokontophyta [3]. Gatunek ten
charakteryzuje się tym że, niektóre jego szczepy są tolerancyjne na szeroki zakres zasolenia,
temperatury i oświetlenia wody, natomiast inne są wrażliwe na takie czynniki jak niska temperatura
czy słabe oświetlenie. Spowalniają one lub całkowicie hamują rozwój tych szczepów [5].
H. akashiwo występuje w wodach przybrzeżnych klimatu tropikalnego i umiarkowanego
(rys.1[9]), między innymi u wybrzeży Japonii, Nowej Zelandii, południowej Australii,
południowo-zachodnich wybrzeży Afryki, Florydy, w Zatoce Biskajskiej w estuarium rzeki
Nervion, w północnej Hiszpanii, u wybrzeży Norwegii, w Cieśninach Duńskich[5][10]. Glon
powoduje toksyczne zakwity, których skutkiem jest masowe śnięcie ryb [5]. Długość komórki
wynosi 18-28µm, a szerokość 12-18µm [1][3], (zdjęcie 1). Jest autotroficzną monadą posiadającą
od 10 do 25 żółto-brązowych, dyskoidalnych chloroplastów umieszczonych na obrzeżach komórki
oraz dwie wicie równej długości umożliwiające szybkie pływanie i nagłą zmianę kierunku
poruszania oraz ruch obrotowy wokół własnej osi[3]. W niesprzyjających warunkach komórki
mogą formować cysty. W środowiskach naturalnych czynnikami powodującymi degradację
zakwitów H. akashiwo są zarówno nagłe zamiany w fizycznych parametrach wody, jak również
wyżeranie ich przez orzęski i bruzdnice, a także ataki bakterii i wirusów [5].
Zbadałam wpływ zasolenia w zakresie 0-36 psu oraz różnego stężenia soli azotu, fosforu
i krzemu na rozwój H. akashiwo. Dokonałam oceny stopnia adaptacji tego glonu w warunkach wód
Morza Bałtyckiego, znajdujących się wzdłuż polskiej linii brzegowej.
Zdjęcie autora 1- komórki H.akashiwo
zakonserwowane płynem Lugola.
Materiały i metody
Praca badawcza obejmowała dwa doświadczenia:
Doświadczenie 1. Badanie tempa wzrostu Heterosigma akashiwo w wodzie o różnym
zasoleniu.
1. Kolejne etapy przygotowania pożywek o różnym zasoleniu :
1. W wodzie destylowanej
rozpuszczono sztuczną sól
morską, aby otrzymać następujące
zasolenia:
0; 7; 20; 30 i 36 psu.
Po przygotowaniu tych roztworów
sprawdzono wielkość zasolenia
konduktometrem
cc-401 Elmetron.
2. Podłoże bałtyckie
przygotowano na bazie naturalnej
wody morskiej pochodzącej
z Zatoki Gdańskiej (pobranej
z okolic bulwaru gdyńskiego),
która została przepuszczona przez
filtr o średnicy porów 0.2µm
w celu usunięcia wszelkich
organizmów i zanieczyszczeń.
3. Do pojemników z wodą o różnym
zasoleniu dodano pożywkę f/2
zawierającą w swoim składzie
roztwory soli biogenicznych
(18N:P:3Si)[2], metali śladowych
i witamin. Każdy wariant podłoża
przepuszczono przez filtr o średnicy
0.2µm do wysterylizowanych
litrowych butelek.
2. Zaszczepienie hodowli H. akashiwo odbyło się pod komorą laminarną .W tym celu do trzech
naczyń hodowlanych nalano po 20 ml z każdego wariantu pożywki i zaszczepiono je 2 ml wody,
w której znajdowało się 68*106 komórek z hodowli macierzystej.
Następnie zaszczepione pożywki inkubowano przez 20 dni w temperaturze 15°C
i przy oświetleniu 5-16µEinstein*sek-1*m-2 w cyklu 12 godzin jasnych i 12 godzin ciemnych.
Dla każdej próby badawczej wykonano po trzy powtórzenia.
3. Liczenie komórek odbywało się pod mikroskopem świetlnym Nikon Eclipse 80i za pomocą
hemocytometru, co drugi dzień hodowli. Aby policzyć komórki, unieruchomiono je płynem
Lugola.
Doświadczenie 2. Badanie tempa wzrostu Heterosigma akashiwo przy różnych stężeniach
soli biogenicznych.
W celu przeprowadzenia doświadczenia 2 na bazie roztworu o zasoleniu 30 psu przygotowano
8 wariantów podłoża, różniących się od siebie stężeniem soli biogenicznych
PODŁOŻA
1
1
Próba kontrolna
1
=> na pożywce
2
2
f/2 (wykonanej
bez
według recepty
azotu
Guillard& Ryther
`
(1962)[2])
3
4
5
Próby badawcze na bazie pożywki f/2
2
bez
fosforu
2
bez
krzemu
2
dodano
2x więcej
azotu
6
2
dodano
2x
więcej
fosforu
7
8
Substraty zostały dodane według
stosunku Redfield’a [8]
2
16N : P : 15Si
2
ale bez krzemu
(16N : P)
W badaniu do 10 ml pożywki dodano 1.6 ml wody w której było 30*106 komórek z hodowli
macierzystej, a czas inkubacji (przeprowadzonej w tych samych warunkach temperatury
i oświetlenia jak w doświadczeniu 1) trwał 14 dni. Zaszczepianie hodowli i liczenie komórek
odbyły się podobnie jak w doświadczeniu 1 Dla każdej próby badawczej wykonano trzy
powtórzenia.
Tempo wzrostu w obu doświadczeniach liczono według wzoru [4]: Ke=ln(N1//N0)/ t1 – t0,
w którym:
* Ke - tempo wzrostu [d-1]
* N0 - liczba komórek dnia poprzedniego
* N1 - liczba komórek dnia następnego
* t1 - czas [dzień następny]
* t0 - czas [dzień poprzedni]
Przeliczenia i wykresy wykonano za pomocą programu Microsoft Office Excel 2007.
Badane okazy Heterosigma akashiwo zostały udostępnione przez Morski Instytut Rybacki Państwowy Instytut Badawczy w Gdyni i pochodzą z kolekcji Scandinavian Culture Collection
of Algae & Protozoa. Hodowany szczep wywodzi się z północno-wschodnich wybrzeży Danii,
z okolic portu Aarhus. Pracę wykonywałam w laboratorium MIR - PIB, korzystałam
z konsultacji z panią mgr Janiną Kownacką.
ilość komórek w 1ml (*106)
Wyniki z doświadczenia 1
Wpływ zasolenia na rozwój Heterosigma akashiwo.
Średnia liczebność komórek ± odchylenie standardowe (n=3).
Wykres 1. Od dnia zero do dnia szóstego liczba
Wykres 1
komórek glonu spada, osiągając zero w ósmym
0 psu
30 psu - próba kontrolna
dniu.
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
20
dzień hodowli
ilość komórek w 1ml (*106)
Wykres 2
80
7 psu podłoże sztuczne
podłoże bałtyckie
30 psu - próba kontrolna
60
40
Zdjęcie autora 2- komórki H.akashiwo w zasoleniu 0 psu
po 2 i 6 dniach.
Wykres 2. W obydwu próbach badawczych
przedstawionych na wykresie początkowe
zagęszczenie komórek jest większe od ich
zagęszczenia w ostatnim dniu doświadczenia.
Tempo wzrostu w próbie badawczej hodowanej
na podłożu bałtyckim jest wyższe (wynosi -0,01d-1)
od tempa wzrostu w próbie badawczej hodowanej
na podłożu sztucznym (wynosi -0,63d -1) .
Zdjęcie autora 3komórki H.akashiwo
w zasoleniu 7 psu
po 2 dniach
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
20
ilość komórek w 1ml (*106)
dzień hodowli
Wykres 3
80
20 psu
Wykres3. Na początku doświadczenia zagęszczenie
populacji H. akashiwo maleje; wzrasta dopiero
od szóstego dnia. Populacja H. akashiwo lepiej
rozwija się w próbie kontrolnej niż w próbie
o zasoleniu 20 psu.
30 psu - próba kontrolna
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
20
dzień hodowli
ilość komórek w 1ml (*106)
Zdjęcie autora 4- komórki H.akashiwo w zasoleniu 30 psu po 2., 6, 12 dniach
Wykres 4. 2, 10, 12, 16 dnia zagęszczenie
hodowli o zasoleniu 36 psu było większe niż
w próbie kontrolnej, poza tym średnie tempo
wzrostu populacji H. akashiwo okazało się wyższe
niż w zasoleniu 36 psu (0.106d-1) i wyższe niż
w próbie kontrolnej (0.067d-1).
Wykres 4
100
36 psu
30 psu - próba kontrolna
80
60
40
20
0
0Wyniki
2 doświadczenia
4
6
8 2.10
12
14
16
20
dzień hodowli
Zdjęcie autora 5- komórki H.akashiwo w zasoleniu 36 psu po 2, 4., 12 dniach
Wyniki z doświadczenia 2
Rozwój Heterosigma akashiwo na pożywkach o różnym stężeniu soli biogenicznych.
Średnia liczebność komórek ± odchylenie standardowe (n=3).
Wykres 5
2,5E+09
f/2 - próba kontrolna
Red
Red bez Si
bez Si
ilość komórek w 1ml
2,0E+09
1,5E+09
1,0E+09
5,0E+08
0,0E+00
0
2
4
6
8
10
12
14
Wykres 5. Najwyższe tempo
wzrostu populacji zanotowano
w próbie hodowanej na pożywce,
w której substraty zostały dodane
w stosunku Redfield’a, bez krzemu
(Red bez Si) i wynosiło ono 0,15d-1.
Najniższe tempo wzrostu (0.09d-1)
zanotowano w próbie hodowanej
na standardowej pożywce f/2 bez
krzemu (bez Si).
Na wykresie we wszystkich
analizowanych wariantach liczba
komórek odnotowana ostatniego
dnia doświadczenia jest większa
od liczby w dniu zero.
dzień hodowli
Wykres 6
3,5E+09
f/2 - próba kontrolna
bez N
2x N
ilość komórek w 1ml
3,0E+09
2,5E+09
2,0E+09
1,5E+09
1,0E+09
5,0E+08
0,0E+00
0
2
4
6
8
10
12
14
Wykres 6. W hodowli na pożywce
z podwójną ilością azotu (2xN)
w porównaniu z próbą kontrolną
jest od 0.7 do 3.6 razy więcej
osobników. W populacji, która
rośnie na pożywce bez azotu
(bez N), jest mniej osobników
niż w populacji hodowanej
na pożywce f/2 i w populacji
rosnącej na pożywce z podwójnym
azotem. Wyjątek stanowi dzień
2. i 6., ponieważ w tym czasie
liczba komórek w próbie (bez N)
jest większa od ilości w próbie
kontrolnej.
dzień hodowli
Wykres 7. W hodowli na pożywce
z podwójną ilością fosforu (2xP)
w porównaniu z pożywką f/2 rośnie
zagęszczenie osobników w kolejnych
dniach hodowli i jest ono większe
niż w próbie kontrolnej aż do dnia 12.
Zaś 14. dnia hodowli zagęszczenie
komórek w próbie (2xP) gwałtownie
spada i jest mniejsze niż w próbie
kontrolnej.
W każdym wariancie końcowa liczba
komórek jest większa od ilości w dniu
zero.
Wykres 7
3,5E+09
f/2 - próba kontrolna
bez P
2x P
ilość komórek w 1ml
3,0E+09
2,5E+09
2,0E+09
1,5E+09.
1,0E+09
5,0E+08
0,0E+00
0
2
4
6
8
10
12
14
dzień hodowli
Dyskusja
Heterosigma akashiwo (Y.Hada) Y.Hada ex Y.Hara & M.Chihara, 1987
jest morskim przedstawicielem klasy Raphidophyceae gromady Heterokontophyta. Występuje
w wodach przybrzeżnych klimatu tropikalnego i umiarkowanego. Hodowany szczep,
na którym wykonano doświadczenie, pochodzi z północno-wschodnich wybrzeży Danii,
z okolic portu Aarhus, gdzie zasolenie wody wynosi w granicach od 20 do 26 psu, a panujący
klimat jest umiarkowany [6].
W pracy badawczej nad tym gatunkiem glona przeprowadzono dwa doświadczenia.
Pierwsze z nich dotyczyło badania wzrostu liczebności H. akashiwo w różnym zasoleniu
wody.
W pierwszej próbie badawczej H. akashiwo była hodowana w wodzie o zasoleniu
0 psu na pożywce f/2, w której stosunek azotu do fosforu do krzemu wynosi 18:1:3.
(wykres1). W tym zasoleniu komórki uległy całkowitej destrukcji na skutek znalezienia się w
środowisku hipotonicznym. Woda napływająca na zasadzie osmozy ze środowiska do
komórki spowodowała plazmolizę, która następnie doprowadziła do rozerwania komórek, co
widać na zdjęciu 2.
Podczas doświadczenia przy 7 psu, przeprowadzonego w dwóch wariantach:
na pożywce sztucznej i naturalnej wodzie bałtyckiej, zaobserwowano różnice w rozwoju
komórek H. akashiwo (wykres 2). H. akashiwo lepiej rozwija się w próbie hodowanej
na naturalnym podłożu bałtyckim niż w wodzie przygotowanej sztucznie o tym samym
zasoleniu. Można założyć, że w Bałtyku Południowym istnieją dodatkowe czynniki
stymulujące rozwój liczebności populacji glonu.
Przy 20 psu H. akashiwo rozwija się wolniej niż w próbie kontrolnej (wykres 3);
może to zastanawiać, ponieważ testowany szczep H.akashiwo pochodził z rejonu,
gdzie zasolenie wody znajduje się w przedziale 20-26 psu, a średnia temperatura wody latem
wynosi 16°C. Najprawdopodobniej komórki H.akashiwo w tym regionie rozwijają się w dni,
kiedy temperatura wody jest wyższa od średniej letniej. Martinez (2010) w swojej pracy
udowodniła, że im wyższa temperatura inkubacji, tym większe tempo wzrostu liczby
komórek tego glonu w danym zasoleniu [5].
Przy 36 psu przyrost H. akashiwo był większy niż w próbie kontrolnej
(wykres 4). Świadczy to o tym, że przy temperaturze wody 15°C taka wartość zasolenia
jest dla jego rozwoju optymalna.
Drugie doświadczenie dotyczyło wzrostu populacji H. akashiwo przy różnych
stężeniach soli biogenicznych. Wykres 5 przedstawia porównanie trzech różnych prób
badawczych w stosunku do próby kontrolnej, tj. dwa podłoża, w których sole biogeniczne
zostały dodane w stosunku Redfield’a (do jednego z wariantów dodano krzemu,
a w drugim komórki hodowane były na pożywce bez krzemu), trzecią próbą badawczą było
podłoże przygotowane według pożywki f/2 bez krzemu.
Stosunek Redfield’a wyraża w komórkach organizmów fitoplanktonowych relację
azotu do fosforu, a dla komórek zawierających krzem - do tego pierwiastka (16N:P:15Si).
Jako pierwszy ten stosunek wyznaczył i opisał amerykański oceanograf Alfred C. Redfield
w swoim artykule opublikowanym w 1934 r. Wyznaczył on ten stosunek na podstawie
zawartości pierwiastków w komórkach fitoplanktonu ze wszystkich regionów świata
i stwierdził jego zgodność z proporcją tych pierwiastków w wodzie morskiej.
Podczas doświadczenia zaobserwowano najwyższe tempo wzrostu populacji na
podłożu, do którego sole fosforu i azotu zostały dodane w stosunku Redfield’a i wyniosło
0,149 d-1, a najniższe odnotowano w próbie badawczej f/2 (bez Si) i osiągnęło wartość
0,087 d-1. Oznacza to, że do hodowli H. akashiwo bardziej trafną jest pożywka przygotowana
według proporcji Redfield’a. Biorąc pod uwagę fakt, że w pożywce (Red bez Si)
jest najwyższe tempo wzrostu, można wywnioskować, iż komórki H. akashiwo nie mają
w swojej budowie krzemu. Niemniej jednak, kiedy porównamy wzrost komórek hodowanych
na pożywce f/2 z hodowlą na pożywce f/2 bez krzemu, można stwierdzić, że wyższe
jest tempo wzrostu na pożywce f/2 z krzemem, co oznacza, że niewielka ilość krzemu może
być korzystna dla wzrostu liczby komórek tego glona.
Wykres 6 pokazuje, jaki wpływ na rozwój H. akashiwo mają różne ilości azotu.
W próbie badawczej bez tego pierwiastka ilość komórek ostatniego dnia eksperymentu
jest mniejsza od początkowej ich liczby, a tempo wzrostu, jako jedyne w doświadczeniu 2,
jest ujemne i wynosi -0,05 d-1. Natomiast w próbie z podwójną ilością azotu końcowa liczba
komórek jest znacznie wyższa niż na początku doświadczenia i w próbie kontrolnej.
Oznacza to, że azot jest niezbędny do wzrostu H. akashiwo.
Na wykresie 7 pokazano wpływ różnych ilości fosforu na rozwój H. akashiwo.
Przez cały czas doświadczenia, aż do dnia 14, liczba komórek w próbie z podwójną ilością
fosforu jest większa niż w próbie kontrolnej. Dopiero 14 dnia sytuacja odwraca się i liczba
komórek spada, a na dodatek jest mniejsza niż w próbie kontrolnej. Wynika z tego,
że komórki zużyły już zawarty w pożywce fosfor do wzrostu i procesów życiowych.
Porównując pożywkę, do której nie dodano fosforu, z pożywką bez azotu, możemy stwierdzić
że brak tego pierwszego pierwiastka nie wpływa tak bardzo na wzrost ilości komórek
jak niedobór azotu. Tempo wzrostu w próbie bez fosforu wynosi 0,06d-1 i jest o 0,01d-1
większe od tempa wzrostu komórek w próbie bez azotu. Natomiast tempo wzrostu w próbie
badawczej z podwójną ilością fosforu jest mniejsze od tempa wzrostu w próbie z podwójną
ilością azotu i wynosi 0,09 d-1.
Według moich badań najbardziej istotnym pierwiastkiem (spośród testowanych w tym
doświadczeniu) potrzebnym do rozwoju H.akashiwo jest azot, a najmniej istotnym jest krzem.
Miejscem w Morzu Bałtyckim (wzdłuż polskiej linii brzegowej), w którym występuje
najbardziej zbliżony stosunek azotu do fosforu do stosunku Redfield’a (16:1) i do stosunku
w pożywce f/2 (18:1) jest zewnętrzna Zatoka Gdańska, gdzie stosunek ten wynosi średnio
22:1. W pożywce z podwójną dawką azotu stosunek azotu do fosforu wynosi 36, i jest on
porównywalny z proporcją tych pierwiastków w Zatoce Pomorskiej (średnio 43,7:1).
Średnie zasolenie w Morzu Bałtyckim wynosi 7 psu [7]. Udowodnione zostało w
pracy opublikowanej przez Martinez (2010), że szczepy o szerokim zakresie tolerancji na
zasolenie są w stanie przetrwać w zasoleniu wynoszącym 5 psu, jednakże ilości zakwitowe
glon uzyskuje w zakresie tolerancji od 10 do 40 psu [5]. Biorąc pod uwagę warunki panujące
w Bałtyku Południowym, można wywnioskować, że gdyby taki szczep został zawleczony
na ten teren mógł by się on rozwijać, jednakże nie osiągnął by on wartości zakwitowej,
a tym samym nie spowoduje toksycznych zakwitów, które powodują masowe śnięcie ryb.
Podsumowując H. akashiwo nie zagraża ekosystemowi Morza Bałtyckiego.
Piśmiennictwo
1. Band-Schmidt C. J., Morquecho L., Hernandez-Becerril D. U., Reyes-Salinas A.,
Bravo-Sierra E., (2004). Raphidophyceans on the coasts of Mexico, Hydrobiologia, 515 (1–3), 79–89
2. Guillard, R.R.L. and J.H. Ryther. (1962). Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana
Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239.
3. Hara Y., Chihara M. (1987). Morphology, Ultrastructure and Taxonomy of the Raphidopycean Alga
Heterosigma akashiowo. The Botanical Magazine, Tokyo, 100:151-163.
4. Herndon J., Cochlan W. P., (2007). Nitrogen utilization by the raphidophyte Heterosigma akashiwo:
Growth and uptake kinetics in laboratory cultures. Harmful Algae 6:260-270.
5. Martinez R., Orive E., Laza- Martinez A., Seoane S. (2010). Growth response of six strains of
Heterosigma akashiwo to varying temperature, salinity and irradiance conditions. Journal of Plankton
Research 32:529-538.
6. Opracowanie zespołowe pod redakcją : Majewski A., Lauer Z. (1994). Atlas Morza Bałtyckiego,
Instytut Meteorologii i Gospodarki Wodnej w Gdyni.
7. Praca wspólna pod redakcją Miętos M., Łysiak- Pastuszak E., Krzymiński W. (2010) Bałtyk
Południowy - Charakterystyka wybranych elementów środowiska w 2005 roku. Instytut Meteorologii i
Gospodarki Wodnej. Oddział Morski w Gdyni.
8. Ptacnik R., Andersen T., Tamminem T. (2010). Performance of the Redfield Ratio and a Family of
Nutrient Limitation Indicators as Thresholds for Phytoplankton N vs. P Limitation. Ecosystems
13:1201-1214.
9. Smayda, T.J. (1998). Ecophysiology and bloom dynamics of Heterosigma akashiwo
(Raphidophyceae). In, D.M. Anderson, A.D. Cembella and G.M. Hallegraeff (eds.) Physiological
Ecology of Harmful Algal Blooms, NATO ASI Series G: Ecological Sciences, Vol. 41, Springer,
Berlin, pp. 113-131
10. Tyrrell J.V., Connell L.B., Scholin C.A. (2002). Monitoring for Heterosigma akashiwo using a
sandwich hybridization assay. Harmful Algae 1:205-214.