Paulina Smyda - IHAR

Ziemniak Polski 2012 nr 2
1
Hodowla i genetyka
METODY ELIMINACJI WIRUSÓW
Z ROŚLIN IN VITRO ZIEMNIAKA
mgr Paulina Smyda
IHAR – PIB, Oddział w Młochowie, ul. Platanowa 19, 05-831 Młochów
e-mail: [email protected]
ośliny rozmnażające się wegetatywnie, do których należy ziemniak
uprawny (Solanum tuberosum L.),
łatwo kumulują wirusy w różnych częściach
rośliny, w tym w bulwach. W wyniku tego
rośliny rozmnażane z bulw z każdym rokiem
są coraz bardziej porażone wirusami. Choroby wirusowe osłabiają wigor roślin oraz
obniżają odporność ziemniaka na inne patogeny, co prowadzi do obniżenia plonu i jakości bulw (Nascimento i in. 2003, Wang i in.
2008, Mahmoud i in. 2009). Dlatego też
ważne jest, aby materiał służący do rozmnożeń, szczególnie sadzeniaki, był wolny od
wirusów.
Zdrowy materiał można uzyskać poprzez
uwalnianie od wirusów zainfekowanych roślin. Do znanych metod uwalniania roślin
należy kultura in vitro merystemów wierzchołkowych połączona z termo-, chemo- i/lub
krioterapią (Mellor, Stace-Smith 1970; Mahmoud i in. 2009). Kultury in vitro pozwalają
na szybkie namnożenie materiału roślinnego
oraz poddanie roślin odpowiedniej terapii,
prowadzącej do otrzymania zdrowych roślin
o każdej porze roku (Nascimento i in. 2003).
Najlepsze rezultaty daje zastosowanie co
najmniej dwóch z wyżej wymienionych technik.
R
Kultura merystemów
Rośliny przed wprowadzeniem do kultur in
vitro są sprawdzane w testach ELISA pod
kątem porażenia wirusami Y (PVY), M
(PVM), X PVX), S (PVS) i liściozwoju (PLRV)
ziemniaka. Sprawdzana jest także obecność
wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka
(PSTVd) i bakterii Clavibacter michiganen-
sis, które są patogenami kwarantannowymi.
Obecność patogenów kwarantannowych na
ogół eliminuje formy z dalszej pracy. Spośród testowanych roślin wybiera się te, które
są wolne od wirusów lub mają najniższą
koncentrację wirusów. Z tych roślin pobiera
się pędy wierzchołkowe i poddaje je sterylizacji powierzchniowej w celu ochrony przed
infekcjami. Tak przygotowane rośliny wprowadza się w warunki in vitro.
Jedną z najlepszych metod odwirusowywania zainfekowanych roślin jest kultura
merystemów wierzchołkowych ziemniaka,
którą można poprzedzić termo- lub chemoterapią (Nascimento i in. 2003, Awan i in.
2007). Kultura merystemów wierzchołkowych pędu jest pierwszą, najwcześniej stosowaną techniką eliminacji wirusów z roślin.
Merystem wierzchołkowy pędu jest to mały, szczytowy jego obszar, który składa się z
drobnych, szybko dzielących się komórek. W
tych częściach rośliny nie ma wirusów lub
ich koncentracja jest bardzo mała. Technika
uwalniania roślin oparta na kulturze merystemów jest prosta, jednak ma pewne ograniczenia. Jest metodą długotrwałą, ponieważ
czas regeneracji roślin wynosi od 6 do 8 tygodni. Izolowane merystemy muszą być
bardzo małe (nie większe niż 0,3 mm), ponieważ efektywność eliminacji wirusów jest
proporcjonalna do ich wielkości (Wang i in.
2006). W pracy tej wymagana jest duża precyzja w izolacji merystemów pod binokularem, gdyż drobne uszkodzenia mają wpływ
na procent zregenerowanych merystemów
wierzchołkowych (Dewi, Slack 1994).
Termoterapia kultur in vitro
2
Ziemniak Polski 2012 nr 2
Termoterapia w celu eliminacji wirusów polega na traktowaniu roślin wysoką temperaturą przez określony czas (Kryszczuk 1999).
Traktowanie roślin in vitro ziemniaka temperaturą 33-45oC przez ok. 2 tygodnie eliminuje kilka wirusów, głównie PLRV, PVY i wirus
A (PVA), oraz niektóre systemiczne bakterie.
Proces termoterapii rozpoczyna się od namnożenia porażonych wirusami roślin in vitro
w drodze kultury wierzchołków i pąków bocznych pędów na pożywce regeneracyjnej
MS (Murashige-Skooga). Po czterech tygodniach kultury rośliny in vitro przenosi się do
komory fitotronowej, w której przez dwa tygodnie są poddawane wysokiej temperaturze, czyli termoterapii. Po termoterapii z roślin izoluje się merystemy wierzchołkowe
wielkości 1 mm i umieszcza na pożywce MS
wzbogaconej hormonami roślinnymi.
Na efektywność termoterapii największy
wpływ mają takie czynniki jak temperatura,
czas trwania oraz wrażliwość genotypu na
stres termiczny (Kryszczuk 1999). Rośliny
niektórych genotypów na działanie wysokiej
temperatury reagują stresem termicznym,
pojawiają się na nich nekrozy lub dochodzi
do zamierania całych roślin. Dlatego warunki
termoterapii, czyli czas oraz wysokość temperatury, należy dostosować indywidualnie
do poszczególnych genotypów.
Ograniczeniem termoterapii jest jej czasochłonność i brak wrażliwości niektórych
wirusów (PVM, PVS, PVX) na wysokie temperatury. Dodanie do pożywki związków
zwiększających tolerancję roślin na wysoką
temperaturę (kwasu salicylowego lub nadtlenku wodoru) indukuje termotolerancję i
może zwiększyć przeżywalność roślin poddanych procesowi termoterapii (Lopez-Delgado i in. 1998, Lopez-Delgado i in. 2004).
W niektórych przypadkach wzrost temperatury wywołuje jedynie zmniejszenie koncentracji wirusów w tkance roślinnej, a nie ich
eliminację (Paet i in. 1990).
Chemoterapia
Coraz częściej stosowaną metodą uwalniania roślin ziemniaka od wirusów jest chemoterapia. Jest to metoda uzupełniająca w stosunku do termoterapii. W chemoterapii wykorzystuje się antymetabolity – związki chemiczne, naturalne lub syntetyczne, blokujące
metabolizm wirusów oraz substancje induku-
jące odporność na dane wirusy. Najczęściej
wykorzystuje się analogi nukleotydów blokujące syntezę wirusowego RNA lub DNA (Nascimento i in. 2003). Antymetabolitem najbardziej znanym i najczęściej stosowanym
do eliminacji wirusów z roślin ziemniaka jest
rybawiryna (RBV). Jest to inhibitor replikacji
wirusów ziemniaka, zwłaszcza PVM, PVS i
PVX. Zaletą tej metody jest jej prostota.
Chemoterapia połączona z kulturą merystemów wierzchołkowych może całkowicie eliminować wirusy X i Y ziemniaka (Klein,
Livingston 1983). Związki antywirusowe są
dodawane do pożywki w czasie trwania kultury. Efektywność działania rybawiryny może
ulec osłabieniu, gdy koncentracja wirusa w
roślinie jest wysoka lub gdy roślina jest zainfekowana kilkoma wirusami (Griffiths i in.
1990; Dewi, Slack 1994).
Najlepszym sposobem eliminacji wirusów
z roślin ziemniaka jest połączenie obydwu
technik, termoterapii i chemoterapii, prowadzonych w warunkach in vitro (Griffiths i in.
1990, Nascimento i in. 2003).
Krioterapia
Krioterapia merystemów wierzchołkowych to
stosunkowo nowa technika uwalniania roślin
od wirusów, oparta na technice zamrażania
merystemów w ciekłym azocie o temperaturze -196oC (Wang, Valkonen 2009). Po potraktowaniu zainfekowanych merystemów
ciekłym azotem odmraża się je, a następnie
regeneruje (Wang i in. 2009). W zregenerowanych roślinach nie ma wirusów lub ich
koncentracja jest obniżona. Technika ta nie
jest skomplikowana i można jednocześnie
uwolnić od wirusów dużą liczbę próbek. Zoptymalizowana procedura krioterapii pozwala
na efektywne uwalnianie roślin ziemniaka od
wirusów, szczególnie od PVY i PLRV (Wang
i in. 2009). Efektywność regeneracji roślin z
merystemów po krioterapii wynosi od 10 do
85% w zależności od genotypu (Wang i in.
2006, Smyda 2011) i może być niższa w
porównaniu z regeneracją z kultury merystemów. Jednak liczba roślin uwolnionych od
wirusów metodą krioterapii jest większa, 83-95% dla PLRV i PVY, niż w metodzie kultur
merystemów – 56-62% dla tych samych wirusów (Wang i in. 2006).
Ziemniak Polski 2012 nr 2
Zastosowanie metod odwirusowywania
roślin w oddziale IHAR-PIB w Młochowie
W Młochowie prowadzi się prace mające na
celu uwalnianie od wirusów cennych genotypów ziemniaka. Po uwolnieniu genotypy te
zabezpiecza się w banku genów in vitro i/lub
zostają one wprowadzone do ciekłego azotu
i w takich warunkach są długoterminowo
przechowywane (kriokonserwacja). Rośliny
ziemniaka uwalnia się od wirusów w kulturach merystemów za pomocą uzupełniających się metod termo- i chemoterapii.
Wprowadzone do kultur in vitro rośliny wyselekcjonowanych genotypów namnaża się na
pożywce MS. Po uzyskaniu odpowiedniej
liczby kopii roślin przystępuje się do procesu
termoterapii. Czterotygodniowe, ukorzenione
rośliny (ok. 20 z genotypu) umieszcza się w
komorze fitotronowej z regulowaną temperaturą na 2 tygodnie. W czasie termoterapii
wprowadza się fotoperiod: w ciągu dnia (16
godzin) temperatura wynosi 37oC, a podczas
ośmiogodzinnej nocy jest obniżona do 35oC.
Po zakończeniu termoterapii z roślin izoluje
się merystemy wierzchołkowe i umieszcza je
na pożywce MS wzbogaconej hormonami
roślinnymi. Zregenerowane rośliny dzieli się
na dwie kopie i ukorzenia na pożywce MS.
Po ok. 4 tygodniach przeprowadza się test
serologiczny ELISA w celu wykrycia wirusów. W wypadku stwierdzenia nieobecności
któregokolwiek z wirusów w roślinie jej kopia
zostaje przekazana do banku genów in vitro.
Jeżeli nie uzyskano roślin wolnych od wirusów, stosuje się kolejny cykl termoterapii.
Ponieważ w wyniku termoterapii usuwane
są głównie PLRV i PVY, po cyklu termoterapii przeprowadza się proces chemoterapii,
skierowany szczególnie na PVM, PVS i PVX.
Jako środek przeciwwirusowy wykorzystuje
się rybawirynę. Na pożywce MS z dodatkiem
rybawiryny następuje namnożenie materiału
roślinnego. Po 4 tygodniach izoluje się merystemy wierzchołkowe i umieszcza na pożywce MS z hormonami. Po ukorzenieniu
dzieli się każdą z roślin na dwie kopie. Po
ok. 4 tygodniach przeprowadza się test ELISA i podobnie jak to ma miejsce w termoterapii zdrowe rośliny zostają wprowadzone do
banku genów in vitro.
W ostatnim czasie, stosując połączone
metody termo- i chemoterapii, uwolniono od
3
wirusów 24 genotypy ziemniaka i zabezpieczono je w kolekcji in vitro. Proces uwalniania roślin ziemniaka od wirusów wymaga
ciągłej optymalizacji metod, uwzględniania
indywidualnych reakcji poszczególnych genotypów, by zwiększyć efektywność terapii i
uzyskać oczekiwane efekty.
Literatura
1. Awan A. R., Mughal S. M., Iftikhar Y., Khan H. Z.
2007. In vitro elimination of potato leaf roll polerovirus
from potato varieties. – Eur. J. Sci. Res. 18: 155-164;
2. Dewi I. S., Slack S. A. 1994. Therapy cycling to
eliminate high-titered, multiple virus infection in vitro
potato plantlets. – Bull. Agron. 22(2): 35-43; 3. Griffitths H. M., Slack S. A., Dodds J. H. 1990. Effect of
chemical and heat therapy in virus concentrations in
vitro potato plantlets. – Can. J. Bot. 68: 1515-1521;
4. Klein R. E., Livingston C. H. 1983. Eradication of
potato viruses X and S from potato shoot tip cultures
with ribavirin. – Phytopathology 65: 826-828; 5. Kryszczuk A. 1999. Termoterapia i kultura merystemów jako
jedna z metod uzyskiwania roślin ziemniaka wolnych
od wirusów. – Biul. IHAR 212: 151-157; 6. Lopez-Delgado H., Dat J. F., Foyer C. H., Scott I. M. 1998.
Induction of thermotolerance in potato microplants by
acetylsalicylic acid and H2O2. – J. Exp. Bot. 49(321):
713-720; 7. Lopez-Delgado H., Mora-Herrera M. E.,
Zavaleta-Mancera H. A., Cadena-Hinojosa M., Scott
I. M. 2004. Salicylic acid enhanced heat tolerance and
Potato Virus X (PVX) elimination during thermotherapy
of potato microplants. – Am. J. Potato Res. 81: 171-176; 8. Mahmoud S. Y. M., Hosseny M. H., Abdel-Ghaffar M. H. 2009. Evaluation of some therapies to
eliminate potato Y potyvirus from potato plants. – Int. J.
Virol. 5(2): 64-76; 9. Mellor F. C., Stace-Smith R.
1970. Virus strain differences in eradication of potato
virus X and S. – Phytopathology 60: 1587-1590;
10. Nascimento C. L., Pio-Ribeiro G., Willadino L.,
Andrade G. P. 2003. Stock indexing and potato virus
Y elimination from potato plants cultivated in vitro. –
Sci. Agric. 60(3): 525-530; 11. Paet C. N., Zamora A.
B. 1990. Efficacy of thermotherapy and group culture
of isolated potato meristems for elimination of single
and mixed infections of Potato Virus Y, Potato Virus S
and Potato Leaf Roll Virus. – Philipp J. Crop Sci. 15(2):
113-118; 12. Smyda P. 2011. Zastosowanie kriokonserwacji do przechowywania zasobów genowych
ziemniaka. – Ziemn. Pol. 2: 12-15; 13. Wang Q., Liu
Y., Xie Y., You M. 2006. Cryotherapy of potato shoot
tips for efficient elimination of Potato Leafroll Virus
(PLRV) and Potato Virus Y (PVY). – Potato Res. 49:
119-129; 14. Wang Q., Cuellar W. J., Rajamäki M-L.,
4
Ziemniak Polski 2012 nr 2
Hirata Y., Valkonen J. P. T. 2008. Combined thermotherapy and cryotherapy for efficient virus eradication:
relation of virus distribution, subcellular changes, cell
survival and viral RNA degradation in shoot tips. – Mol.
Plant Path. 9(2): 237-250; 15. Wang Q. C., Panis B.,
Engelmann F., Lambardi M., Valkonen J. P. T. 2009.
Cryotherapy of shoot tips: a technique for pathogen
eradication to produce healthy planting materials and
prepare healthy plant genetic resources for cryopreservation. – Ann. Appl. Biol. 154: 351-363;
16. Wang Q., Valkonen J. P. T. 2009. Cryotherapy of
shoot tips: novel pathogen eradication method. –
Trends Plant Sci. 14(3): 119-122